JP6283347B2 - 成熟樹状細胞集団の製造方法 - Google Patents
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Description
[1]未成熟の樹状細胞を含有する細胞集団を、樹状細胞成熟化因子及びフィブロネクチンフラグメントの存在下で培養する工程を包含することを特徴とする、成熟した樹状細胞を含有する細胞集団の製造方法、
[2]樹状細胞成熟化因子が、下記1)〜3)からなる群より選択される、[1]記載の方法、
1)菌体製剤、
2)CD40アゴニスト、及び
3)腫瘍壊死因子−α及びインターロイキン−1βを含む樹状細胞成熟化カクテル、
[3]菌体製剤が、OK−432である、[2]記載の方法、
[4]フィブロネクチンフラグメントが、細胞接着ドメイン、ヘパリン結合ドメイン及びフィブロネクチン結合ドメイン部位からなる群より選択されるドメインを有する組換えポリペプチドである[1]〜[3]のいずれか1つに記載の方法、
[5]フィブロネクチンフラグメントが、CH−296及びIII1−Cから選択される組換えポリペプチドである[4]記載の方法、
[6]単球を含有する細胞集団より未成熟の樹状細胞を含有する細胞集団を調製する工程をさらに含む、[1]〜[5]のいずれか1つに記載の方法、
[7]未成熟の樹状細胞を含有する細胞集団を調製する工程が、単球を含有する細胞集団をGM−CSF及びIL−4の存在下で培養する工程である、[6]記載の方法、
[8]無血清培地を使用して培養を実施する、[1]〜[7]のいずれか1つに記載の方法、
[9][1]〜[8]のいずれか1つに記載の製造方法により得られる細胞集団、及び
[10][9]記載の細胞集団を含有する医薬、
に関する。
(1)成熟したDCを含有する細胞集団の製造方法
本発明の成熟したDCを含有する細胞集団の製造方法は、未成熟のDCを含有する細胞集団を、DC成熟化因子及びFNフラグメントの存在下で培養する工程を包含することを特徴とする。
本発明に使用する菌体製剤は、例えば、細菌由来製剤[OK−432、BCG(Bacillus Calmette Guerin)、Streptcoccus pyogenes、Corynebacterium parvum及びこれらの細胞壁骨格]、担子菌由来製剤(レンチナン、シゾフィラン、PSK等)、リポポリ多糖(LPS)を使用することができる。本発明にはOK−432を好適に使用できる。OK−432はA群3型溶血性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)の弱毒性自然変異株(Su株)をペニシリンで処理した細菌由来製剤の一般名である。本製剤はピシバニール(登録商標)の商品名で市販されている。本発明に使用する菌体製剤の添加量に特に限定はなく、使用される培地及び菌体製剤に応じて、適切な量を選択すればよい。特に本発明を限定するものではないが、菌体製剤は最終濃度が1〜1000ng/mL、好ましくは50〜200ng/mL程度になるように、特にOK−432を使用する場合、0.001〜1KE/mL、好ましくは0.005〜0.5KE/mL、さらに好ましくは0.01〜0.2KE/mLの終濃度で培地に添加される。
本発明の細胞集団は、前記(1)の方法により得られる細胞集団である。本発明の細胞集団は、成熟したDCを含有する。DCの成熟は、当該分野で公知の方法によって、細胞表面マーカー、産生するサイトカイン量又はDC特異的遺伝子の発現量でモニタリングすることができる。これらのモニタリングは、当該分野で通常のアッセイ(例えば、免疫組織化学、mRNA定量法など)を用いて実施することができる。さらに、酵素免疫定量(ELISA)法、Fluorescence Activated Cell Sorting(FACS、フローサイトメトリー)法などのアッセイにより、細胞表面マーカー及びサイトカイン産生量をモニタリングすることができる。本発明の細胞集団は、CD80、CD86及びHLA−DRが強陽性で、CD83を発現する細胞を含有する細胞集団である。さらに、本発明の細胞集団はIL−1β、IL−6、TNF−α、IL−12、IFN−γなどのサイトカインを産生する。特にIL−12の産生増強は、1型(Th−1)の免疫応答を強く促進する。成熟DCはまた、貪食による抗原取り込み能力を失う。貪食活性は、通常の取り込みアッセイによって測定することができる。
本発明の医薬は、前記(2)の細胞集団を含有することを特徴とする。本発明の医薬は、従来技術に従って、有効量の前記細胞集団を許容される担体と混合するなどして、経口/非経口製剤として製造することが出来る。本発明の医薬は、通常は、注射剤、懸濁剤、点滴剤等の非経口製剤として製造される。当該非経口製剤に含まれ得る担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液(例えば、D−ソルビトール、D−マンニトール、塩化ナトリウムなど)などの注射用の水性液を挙げることが出来る。また、例えば、緩衝剤(例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液)、無痛化剤(例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど)、安定剤(例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど)、保存剤、酸化防止剤、免疫抑制剤(ラパマイシンなど)、抗体製剤、細胞製剤(制御性樹状細胞)などと配合してもよい。さらに、必要に応じてサイトカインを添加してもよい。
(1)単球の調製
インフォームドコンセントが得られた健常人から調製したヒト末梢血単核細胞(PBMC)よりDynabeads Untouched Human Monocytes(ライフテクノロジーズ社製)を用いて、CD14陽性細胞(単球)を多く含む細胞集団を回収した。
実施例1−(1)で得られた細胞を、FBS(ライフテクノロジーズ社製)を最終濃度5%、ペニシリン−ストレプトマイシン(ライフテクノロジーズ社製)を最終濃度100U/mLとなるように添加したRPMI−1640培地(シグマアルドリッチ社製)(以下、FS培地と記載)に、1×106cells/mLとなるように懸濁した。さらに、この細胞懸濁液にGM−CSF(R&Dシステムズ社製)及びIL−4(R&Dシステムズ社製)をそれぞれ最終濃度100ng/mLとなるように添加し、細胞培養用12ウェルプレートにて37℃、5%CO2インキュベーターで樹状細胞誘導培養を開始した。培養2日後、培地を半量除き、GM−CSF及びIL−4をそれぞれ最終濃度100ng/mL含むFS培地を、除いた量と等量加えさらに3日間培養した。
フィブロネクチン(FN)フラグメントであるCH−296[レトロネクチン(登録商標)、タカラバイオ社製]、ヒト血漿由来フィブロネクチン(シグマアルドリッチ社製)をそれぞれ25μg/mLとなるようにPBS(ライフテクノロジーズ社製)に溶解し、表面未処理96ウェル平面プレート(ベクトン・ディッキンソン社製)の各ウェルに0.07mLずつ加え、4℃で3日間放置した後、37℃で4時間保持した。また、対照として溶媒(PBS)のみを表面未処理96ウェル平面プレートの各ウェルに0.07mL加え、4℃で3日間放置した後、37℃で4時間保持した。以下、FNフラグメントCH−296(レトロネクチン)を固定化したプレートをRNプレート、ヒト血漿由来FNを固定化したプレートをFNプレート、溶媒のみを使用したプレートをNTプレートと記載する。こうして調製したプレートは、溶液を除去しPBSで2回洗浄した後に使用した。
実施例1−(2)で調製した樹状細胞誘導培養後の細胞を500×g、8分間の遠心で回収し、DC成熟化因子としてOK−432(日本標準商品分類番号874299、中外製薬社製)を最終濃度0.05KE/mL含むFS培地に6.7×105cells/mLとなるように懸濁した。この細胞懸濁液0.15mLを実施例1−(3)で調製した各プレートにて37℃、5%CO2インキュベーターで2日間培養した。
実施例1−(4)で得られた培養細胞を、ウシ胎児血清を最終濃度1%、ペニシリン−ストレプトマイシンを最終濃度100U/mLとなるように添加したPBS(以下、1%FBS/PBS培地と記載)に懸濁し、下記の蛍光色素標識抗体をそれぞれ添加し4℃で20分間抗体反応を行った。その後、1%FBS/PBS培地で洗浄した細胞をフローサイトメーターFACS CantoII(ベクトン・ディッキンソン社製)での解析に供した。解析では前方散乱光(FSC)と側方散乱光(SSC)でミエロイド系列細胞にゲートを掛け、平均蛍光強度(MFI:Mean Fluorescence Intensity)としてGeo Meanの値により、細胞表面抗原の発現量を測定した。
(1)単球の調製
実施例1−(1)と同様の方法で行った。
実施例3−(1)で得られた細胞をFS培地に1.2×106cells/mLとなるように懸濁し、さらにGM−CSF及びIL−4をそれぞれ最終濃度100ng/mLとなるように添加し、細胞培養用12ウェルプレートにて37℃、5%CO2インキュベーターで樹状細胞誘導培養を開始した。培養3日後、培地を半量除き、GM−CSF及びIL−4をそれぞれ最終濃度100ng/mL含むFS培地を、除いた量と等量加えさらに3日間培養した。
FNフラグメントCH−296(レトロネクチン)を25μg/mLとなるようにPBSに溶解し、表面未処理48ウェル平面プレート(ベクトン・ディッキンソン社製)の各ウェルに0.3mL加え、4℃で3日間放置した後、37℃で4時間保持してRNプレートを調製した。また、対照として溶媒(PBS)のみを表面未処理48ウェル平面プレートの各ウェルに0.3mL加え、4℃で3日間放置した後、37℃で4時間保持してNTプレートを調製した。こうして調製したプレートは、溶液を除去しPBSで2回洗浄した後に使用した。
実施例3−(2)で調製した樹状細胞誘導培養後の細胞を500×g、8分間の遠心で回収し、DC成熟化因子としてOK−432を最終濃度0.05KE/mL含むFS培地に4.2×105cells/mLとなるように懸濁した。この細胞懸濁液0.5mLを実施例3−(3)で調製した各プレートにて37℃、5%CO2インキュベーターで2日間培養した。
実施例3−(4)で得られた培養上清を試料とし、Human Th1/Th2 11plex FlowCytomix Multiplex(eBioscience社製)を用い、フローサイトメーターFACS CantoIIにて、DCから産生される培養上清中のサイトカイン(IL−1β、TNF−α、IL−12、IFN−γ)量を測定した。解析はFlowCytomix Pro(eBioscience社製)を用いた。
(1)単球の調製
実施例1−(1)と同様の方法で行った。
ヒトAB血清(ロンザ社製)を最終濃度5%、ペニシリン−ストレプトマイシンを最終濃度100U/mLとなるように添加したRPMI−1640培地(以下、HS培地と記載)を使用した点以外、実施例1−(2)と同様の方法で行った。
RNプレート及びNTプレートを、実施例1−(3)と同様の方法で調製した。
実施例5−(2)で調製した樹状細胞誘導培養後の細胞を500×g、8分間の遠心で回収し、DC成熟化因子としてOK−432を最終濃度0.05KE/mL含むHS培地に4.0×105cells/mLとなるように懸濁した。この細胞懸濁液0.15mLを実施例5−(3)で調製した各プレートにて37℃、5%CO2インキュベーターで2日間培養した。
実施例5−(4)で得られた培養細胞を、実施例2と同様の方法で測定した。
(1)単球の調製
実施例1−(1)と同様の方法で行った。
細胞培養用24ウェルプレートを使用した点以外、実施例5−(2)と同様の方法で行った。
FNフラグメントCH−296(レトロネクチン)、ヒト血漿由来フィブロネクチン、フィブロネクチン断片III1―Cヒト(シグマアルドリッチ社製)を50μg/mLとなるようにPBSに溶解し、細胞培養用96ウェル平面プレート(コーニング社製)の各ウェルに0.07mL加え、4℃で3日間放置した後、37℃で4時間保持した。また、対照として溶媒(PBS)のみを細胞培養用96ウェル平面プレートの各ウェルに0.07mL加え、4℃で3日間放置した後、37℃で4時間保持した。以下、FNフラグメントIII1―Cを固定化したプレートをIIICプレートと記載する。こうして調製したプレートは、溶液を除去しPBSで2回洗浄した後に使用した。
実施例7−(2)で調製した樹状細胞誘導培養後の細胞を500×g、8分間の遠心で回収し、DC成熟化因子としてOK−432を最終濃度0.05KE/mL含むHS培地に3.0×105cells/mLとなるように懸濁した。この細胞懸濁液0.125mLを実施例1−(3)で調製した各プレートにて37℃、5%CO2インキュベーターで2日間培養した。
実施例7−(4)で得られた培養細胞の表面マーカーを、実施例2と同様の方法で測定した。
(1)単球の調製
実施例1−(1)と同様の方法で行った。
培地にHS培地を使用した点以外、実施例3−(2)と同様の方法で行った。
実施例3−(3)と同様の方法で行った。
実施例9−(2)で調製した樹状細胞誘導培養後の細胞を500×g、8分間の遠心で回収し、DC成熟化因子としてOK−432を最終濃度0.05KE/mL含むHS培地に3.4×105cells/mLとなるように懸濁した。この細胞懸濁液0.5mLを実施例9−(3)で調製した各プレートにて37℃、5%CO2インキュベーターで2日間培養した。
実施例9−(4)で得られた培養上清を試料とし、Human Th1/Th2 11plex FlowCytomix Multiplexを用い、フローサイトメーターFACS CantoIIにて、DCから産生される培養上清中のIL−6、TNF−α量を測定した。解析はFlowCytomix Proを用いた。
(1)単球の調製
実施例1−(1)と同様の方法で行った。
細胞培養用6ウェルプレートを使用し、細胞濃度を1.2×106cells/mLとした点以外、実施例5−(2)と同様の方法で行った。
FNフラグメントCH−296(レトロネクチン)の濃度を50μg/mLとし、固定化するプレートとして細胞培養用48ウェル平面プレートを使用した点以外、実施例3−(3)と同様の方法で行った。
実施例11−(2)で調製した樹状細胞誘導培養後の細胞を500×g、8分間の遠心で回収し、DC成熟化因子としてOK−432を最終濃度0.05KE/mL含むHS培地に5.0×105cells/mLとなるように懸濁した。この細胞懸濁液0.4mLを実施例11−(3)で調製した各プレートにて37℃、5%CO2インキュベーターで2日間培養した。
実施例11−(4)で得られた培養上清を試料とし、Human IL−12 p70 ELISA Ready−SET−Go!(eBioscience社製)を用いて、DCから産生される培養上清中のIL−12量を測定した。
(1)単球の調製
実施例1−(1)と同様の方法で行った。
培地にX−Vivo15(ロンザ社製)培地(以下、XV培地と記載)を使用した点以外、実施例7−(2)と同様の方法で行った。
実施例7−(3)と同様の方法で行った。
実施例13−(2)で調製した樹状細胞誘導培養後の細胞を500×g、8分間の遠心で回収し、DC成熟化因子としてOK−432を最終濃度0.05KE/mL含むXV培地に2.6×105cells/mLとなるように懸濁した。この細胞懸濁液0.125mLを実施例13−(3)で調製した各プレートにて37℃、5%CO2インキュベーターで2日間培養した。
実施例13−(4)で得られた培養細胞を、実施例2と同様の方法で測定した。
実施例13と同様の方法で単球の調製、樹状細胞への分化、固定化プレートの調製、固定化プレートでの樹状細胞の成熟化、の各操作を行った。
実施例15で得られた培養上清を試料として、実施例12と同様の方法でサイトカインを測定した。
(1)単球の調製
実施例1−(1)と同様の方法で行った。
細胞培養用24ウェルプレートとAIM−V(ライフテクノロジーズ社製)培地(以下、AM培地と記載)を使用し、細胞濃度を1.5×106cells/mLとした点以外、実施例1−(2)と同様の方法で行った。
固定化するプレートとして細胞培養用96ウェル平面プレート(ベクトン・ディッキンソン社製)を使用した点以外、実施例1−(3)と同様の方法で行った。
実施例17−(2)で調製した樹状細胞誘導培養後の細胞を500×g、8分間の遠心で回収し、DC成熟化因子としてOK−432を最終濃度0.05KE/mL含むAM培地に2.2×105cells/mLとなるように懸濁した。この細胞懸濁液0.125mLを実施例17−(3)で調製した各プレートにて37℃、5%CO2インキュベーターで2日間培養した。
実施例17−(4)で得られた培養上清を試料とし、Human IL−12(p70) FlowCytomix Simplex(eBioscience社製)を用い、フローサイトメーターFACS CantoIIにて、DCから産生される培養上清中のIL−12量を測定した。解析はFlowCytomix Proを用いた。
(1)単球の調製
実施例1−(1)と同様の方法で行った。
培地にCellGroDC(セルジェニックス社製)培地(以下、CG培地と記載)を使用した点以外、実施例7−(2)と同様の方法で行った。
固定化するプレートとして細胞培養用96ウェル平面プレート(ベクトン・ディッキンソン社製)を使用し、CH−296溶液を0.07mL添加した点以外、実施例11−(3)と同様の方法で行った。
実施例19−(2)で調製した樹状細胞誘導培養後の細胞を500×g、8分間の遠心で回収し、DC成熟化因子としてOK−432を最終濃度0.05KE/mL含むCG培地に2.2×105cells/mLとなるように懸濁した。この細胞懸濁液0.125mLを実施例19−(3)で調製した各プレートにて37℃、5%CO2インキュベーターで2日間培養した。
実施例19−(4)で得られた培養上清を試料とし、実施例12と同様の方法でサイトカインを測定した。
(1)単球の調製
実施例1−(1)と同様の方法で行った。
細胞濃度を2.1×106cells/mLとした点以外、実施例9−(2)と同様の方法で行った。
実施例1−(3)と同様の方法で行った。
実施例21−(2)で調製した樹状細胞誘導培養後の細胞を500×g、8分間の遠心で回収し、DC成熟化因子として、TNF―α、IL−1β、IL−6をそれぞれ最終濃度10ng/mLとPGE2を最終濃度2μg/mLとなるように、MCを含むHS培地に8.9×105cells/mLとなるように懸濁した。この細胞懸濁液0.15mLを実施例21−(3)で調製した各プレートにて37℃、5%CO2インキュベーターで2日間培養した。
実施例21−(4)で得られた培養細胞の表面マーカーを、実施例2と同様の方法で測定した。
(1)単球の調製
実施例1−(1)と同様の方法で行った。
培地にXV培地、AM培地又はCG培地を使用した点以外、実施例17−(2)と同様の方法で行った。
実施例17−(3)と同様の方法で行った。
DC成熟化因子として、TNF―α、IL−1β、IL−6をそれぞれ最終濃度10ng/mLとPGE2を最終濃度1μg/mLとなるように、MCを含むXV培地、AM培地又はCG培地を調製した。実施例21−(2)で調製した樹状細胞誘導培養後の細胞を500×g、8分間の遠心で回収し、それぞれの培地に2.2×105cells/mL、3.4×105cells/mL、3.9×105cells/mLとなるように懸濁し、0.125mLを実施例21−(3)で調製した各プレートにて37℃、5%CO2インキュベーターで2日間培養した。
実施例23−(4)で得られた培養細胞の表面マーカーを、実施例2と同様の方法で測定した。
Claims (6)
- 未成熟の樹状細胞を含有する細胞集団を、樹状細胞成熟化因子及びフィブロネクチンフラグメントの存在下で培養する工程を包含することを特徴とする、成熟した樹状細胞を含有する細胞集団の製造方法であって、該フィブロネクチンフラグメントが、CH−296及びIII 1 −Cから選択される組換えポリペプチドである、方法。
- 樹状細胞成熟化因子が、下記1)〜3)からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
1)菌体製剤、
2)CD40アゴニスト、及び
3)腫瘍壊死因子−α及びインターロイキン−1βを含む樹状細胞成熟化カクテル。 - 菌体製剤が、OK−432である、請求項2記載の方法。
- 単球を含有する細胞集団より未成熟の樹状細胞を含有する細胞集団を調製する工程をさらに含む、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
- 未成熟の樹状細胞を含有する細胞集団を調製する工程が、単球を含有する細胞集団をGM−CSF及びIL−4の存在下で培養する工程である、請求項4記載の方法。
- 無血清培地を使用して培養を実施する、請求項1〜5のいずれか1項記載の方法。
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