JP5717116B2 - 抗原特異的ヒトTh17細胞を調整する方法 - Google Patents
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DCは生体内で最も強力な抗原提示細胞で、ナイーブT細胞を分化させて特定の抗原に反応するエフェクターT細胞や、メモリーT細胞を誘導できる唯一の細胞である(非特許文献1)。すなわち、外来抗原に対し新しい免疫を作り出すことの出来る細胞がDCである。体内では、DCが常に体内を循環し抗原を補足してリンパ節に移行し、T細胞に抗原提示を行って生体の自己免疫の管理や外来抗原、異常細胞の排除に関わっている。
Thサブセットは、主にTh1細胞、Th2細胞、およびTh17細胞に分類され、それぞれの産生するサイトカインによって同定され、生体内の細胞性免疫反応、および液性免疫反応を決定する。その他に、それらの免疫を抑制する抑制性T細胞が存在する。近年発見されたTh17細胞は、IL-17を産生するCD4陽性CD45RO陽性T細胞として特徴づけられ、感染免疫、また、自己免疫性疾患や慢性炎症性疾患の病態に関与するといわれている(非特許文献3)。
炎症時に出現するDCを炎症性DCと呼んでいる。単球サブセットには、2種類が同定されており、CCR2陽性、CD14強陽性、CD16弱陽性の単球および、CCR2陰性、CD14弱陽性、CD16強陽性の単球がある(非特許文献5)。前者は、炎症が生じると炎症組織に遊走されるので炎症性単球と呼ばれ、炎症性DCに分化する。後者は、恒常的に組織を巡回していると考えられている。CCR2ノックアウトマウスでは自己免疫性疾患や慢性炎症性疾患の発症が抑制されるため、炎症組織に遊走さる炎症性単球が自己免疫形成に重要であると考えられている。
自己免疫性疾患や慢性炎症性疾患は未だ原因不明であり治療法に苦慮しているが、近年、ある特定の分子を標的とした抗体治療の成果が注目されている(非特許文献14)。関節リウマチの治療として開発された抗TNF製剤(インフレキシマブなど)、悪性リンパ腫治療薬として抗CD20製剤(商品名;リツキシマブ)、乳がん治療薬の抗Her2抗体(トラスツズマブ)などは臨床でこれまでにない治療効果を発揮し、それに続く抗体製剤が次々と研究開発されてきている。現在のところ、炎症性サイトカインに対する抗体療法の開発は進んでいる。上記の理由からTh17細胞そのものを標的とした特異的抗体が発見されれば、該抗体療法は興味深い自己免疫治療となるであろう。
結核は以前不治の病として恐れられていた細菌であるが、衛生環境の整備と化学療法の発達によりあまり脅威ではないとされている。しかし、世界的にみると発展途上国を中心に年間300万人の人々が命を失い、超耐性結核菌の出現で再び不治の病として復活する兆しが現れている。もし、強力な超耐性結核菌が世界的に蔓延するような事態になれば、極めて憂慮する事態を想定しなければならない。Th17細胞は結核感染防に関ることが明らかにされ、結核感染に対抗する治療法としてTh17細胞を誘導する樹状細胞療法の可能性がある(非特許文献15)。
癌組織においては抑制性T細胞が癌組織の中に存在し、癌細胞に対する抗体やCTLの攻撃を防いでいるといわれている(非特許文献16)。この事実は癌の免疫細胞療法の大きな障害になっており、抑制性T細胞の抑制が有望な癌治療の手法と成り得ることが示されている。Th17細胞が癌治療に有効な治療法であるかどうかに関しての研究は未だに行われていないが、Th17細胞にはCTL、NK細胞、NKT細胞を活性化・増殖させるとともに、抑制性T細胞を抑制する活性を持つIL-21を産生する(非特許文献17)。もし、この特性をうまく活用できれば、Th17細胞、またはIL-21を産生する免疫細胞を用いた癌の免疫療法の可能性は期待できる。また、最近、C-type lectinで誘導されるTh1細胞、Th17細胞を介して抗腫瘍活性が誘導されることが明らかにされた(非特許文献18)。
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項1
ヒト樹状細胞とヒトナイーブCD4陽性T細胞を混合培養することによって、ヒトナイーブCD4陽性T細胞から、Th17細胞を誘導する方法。
項2
ヒトナイーブCD4陽性T細胞を、ヒト樹状細胞と混合培養する前に、前処理して活性化させることを特徴とする、項1に記載のTh17細胞を誘導する方法。
項3
ヒトナイーブCD4陽性細胞の前処理が、抗CD3抗体またはPHAの存在下で培養することを特徴とする処理である、項1または項2に記載の、Th17細胞を誘導する方法。
項4
ヒト樹状細胞として
(A)ヒト単球をTNF、IFN-α、IL-15またはIL-4からなる群より選ばれる、少なくとも一種類の生理活性物質と、GM-CSFとを共に37〜40℃の条件下で培養することによって、前駆樹状細胞に誘導する工程と、
(B)上記工程(A)で得られた該前駆樹状細胞を、病原体成分または人工的な免疫賦活化成分の刺激によって成熟させることにより、ヒト単球由来樹状細胞に誘導する工程、
によって作製されたヒト樹状細胞を用いることを特徴とする、項1〜3のいずれかに記載の、Th17細胞を誘導する方法。
項5
ヒト単球由来樹状細胞とヒトナイーブCD4陽性T細胞の混合培養において、両細胞の細胞数の比率が5:1〜1:5であることを特徴とする、項1〜4のいずれかに記載の、Th17細胞を誘導する方法。
項6
ヒト樹状細胞とヒトナイーブCD4陽性T細胞の混合培養において、抗IL-4抗体、抗IFN-γ抗体、抗TGFβ抗体、IL-1、IL-6、IL-15、IL-23または、PGE2からなる群より選ばれる、少なくとも一種類の生理活性物質を含む培養液中にて培養することを特徴とする、項1〜5のいずれかに記載の、Th17細胞を誘導する方法。
項7
Th17細胞の細胞集団比率が、全細胞集団の30%以上を占めることを特徴とする、項1〜6のいずれかに記載の、Th17細胞を誘導する方法。
項8
Th17細胞が、IL-17、IL-21またはIL-22産生細胞からなる群より選ばれる、少なくとも一種類の生理活性物質を産生する細胞であることを特徴とする、項1〜7のいずれかに記載の、Th17細胞を誘導する方法。
項9
Th17細胞が、自己の樹状細胞に対して高い抗原特異性を有することを特徴とする、項1〜8いずれかに記載の、Th17細胞を誘導する方法。
項10
項1〜9に記載の方法によって作製したTh17細胞をクローニングする方法。
項11
Th17細胞の細胞集団比率を、全細胞集団の50〜100%に増大させ、かつ維持する方法。
TNFを用いて作成したヒト単球樹状細胞によるTh17細胞の誘導の実例
ヒトTh17細胞を誘導する樹状細胞は以下のように調整した。ヒト末梢血単核白血球を抗CD14抗体付着磁気ビーズ(MACS)にて単球を単離する(純度>99%)。単球にGM-CSFおよびTNFをそれぞれ10 ng/ml加えて、CO2インキュベーターにて38℃、5日間培養した。その後、3回洗浄した後、MDPを10 μg/ml、BCGを1 μg/mlを添加して37℃、3日間培養した。
実施例2
Th17細胞の細胞集団の増幅
上記のようにBCG刺激した樹状細胞によってナイーブCD4陽性T細胞からTh17細胞を誘導した。よりTh17細胞の比率を高めるため、Th17細胞を含んだT細胞(1x102 個/ml)を非自己の単球2x104 個/ウェルを1日培養した96ウェルの培養プレートに加えて抗ヒトIFN-γ抗体、抗ヒトIL-4抗体、および抗ヒトCD3抗体(OKT3)をそれぞれ10 μg/ml、さらにIL-1、IL-6、IL-7、およびIL-15をそれぞれ10 ng/mlの存在下で培養した。約2週間後に培養上清を採取し、ELISA(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)にてIL-17の濃度の最も高いウェル(IL-17濃度1.03 ng/ml)を選択した。Th17細胞に、GM-CSFを加えた後、アロタイプの単球から作製したマクロファージを加えIL-1、IL-6、IL-7、IL-15をそれぞれ10 ng/ml、PGE2を10 μg/mlで、または抗ヒトIFN-γ抗体を10 μg/mlで添加して継代培養した。培養中のTh17細胞は約70%を維持した。
BCG刺激ヒト単球樹状細胞により作製されたTh17細胞のBCGに対する反応の実例。
本発明の樹状細胞は上述のように、新しく発見されたTh17細胞の誘導に関わる分子を解明する上で貴重な研究試料となる。遺伝子解析等で知り得た樹状細胞が発現する物質、すなわち細胞膜タンパク質、サイトカインなどは、抗体作製や人工タンパク質合成技術によって自己免疫性疾患に向けた治療薬の開発に好ましく思われる。誘導される該T細胞も、特異的な産生物質を同定することで、同様な疾患への治療薬の開発に好ましく思われる。より具体的には、TNFと関連性の強い関節リウマチ、クローン病、乾癬といった自己免疫性疾患、IFN-αと関連性の強いsystemic loops erythematosus(SLE)といった自己免疫性疾患が知られており(参考文献19)、それぞれTNFを用いて作成した樹状細胞およびT細胞が前者の自己免疫性疾患、およびIFN-αを用いて作製した樹状細胞およびT細胞が後者の自己免疫性疾患に好ましく思われる。
Claims (8)
- ヒト樹状細胞とヒトナイーブCD4陽性T細胞を混合培養することによって、ヒトナイーブCD4陽性T細胞から、Th17細胞を誘導する方法であって、該ヒトナイーブCD4陽性T細胞を、該ヒト樹状細胞と混合培養する前に、前処理して活性化させることを特徴とし、該ヒトナイーブCD4陽性細胞の前処理が、抗CD3抗体の存在下で培養することを特徴とする処理である方法。
- ヒト樹状細胞として
(A)ヒト単球をTNF、IFN−α、IL−15またはIL−4からなる群より選ばれる、少なくとも一種類の生理活性物質と、GM−CSFとを共に37〜40℃の条件下で培養することによって、前駆樹状細胞に誘導する工程と、
(B)上記工程(A)で得られた該前駆樹状細胞を、病原体成分または人工的な免疫賦活化成分の刺激によって成熟させることにより、ヒト単球由来樹状細胞に誘導する工程、によって作製されたヒト樹状細胞を用いることを特徴とする、請求項1に記載の、Th17細胞を誘導する方法。 - ヒト単球由来樹状細胞とヒトナイーブCD4陽性T細胞の混合培養において、両細胞の細胞数の比率が5:1〜1:5であることを特徴とする、請求項1又は2に記載の、Th17細胞を誘導する方法。
- ヒト樹状細胞とヒトナイーブCD4陽性T細胞の混合培養において、抗IL−4抗体、抗IFN−γ抗体、抗TGFβ抗体、IL−1、IL−6、IL−15、IL−23または、PGE2からなる群より選ばれる、少なくとも一種類の生理活性物質を含む培養液中にて培養することを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載の、Th17細胞を誘導する方法。
- Th17細胞の細胞集団比率が、全細胞集団の30%以上を占めることを特徴とする、請求項1〜4のいずれかに記載の、Th17細胞を誘導する方法。
- Th17細胞が、IL−17、IL−21またはIL−22産生細胞からなる群より選ばれる、少なくとも一種類の生理活性物質を産生する細胞であることを特徴とする、請求項1〜5のいずれかに記載の、Th17細胞を誘導する方法。
- Th17細胞が、自己の樹状細胞に対して高い抗原特異性を有することを特徴とする請求項1〜6のいずれかに記載の、Th17細胞を誘導する方法。
- 請求項1〜7のいずれかに記載の方法によって作製したTh17細胞をクローニングする方法。
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