KR20130103587A - 갈렉틴 9를 분비하는 세포, 그 제조 방법 및 그 용도 - Google Patents

갈렉틴 9를 분비하는 세포, 그 제조 방법 및 그 용도 Download PDF

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도시로 니키
도모히로 아리카와
소우이치 오오미즈
다케시 가도와키
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가르파마 컴퍼니 리미티드
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Abstract

갈렉틴 9에 기초하는 생리 활성을 발현할 수 있는 세포, 그 제조 방법 및 용도를 제공한다. 상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 세포는, 갈렉틴 9를 포함하는 세포이며, 상기 갈렉틴 9를 세포 표면에 발현하고 있는 것을 특징으로 한다.

Description

갈렉틴 9를 분비하는 세포, 그 제조 방법 및 그 용도 {GALECTIN 9-SECRETING CELL, AND PRODUCTION METHOD AND USE OF THE SAME}
본 발명은, 갈렉틴 9를 분비하는 세포, 그 제조 방법 및 그 용도에 관한 것이다. 예컨대, 본 발명은, Gal-9를 분비하는 CD4 T 세포 및 그 응용 기술에 관한 것이다.
갈렉틴 9(galectin 9; Gal-9)는, 갈렉틴 패밀리에 속하고, N- 또는 O-glycan의 β 갈락토시드에 결합하여 생리 활성을 발휘한다(비특허문헌 1). 갈렉틴 9는 T 세포 아포토시스 유도 인자(비특허문헌 2) 및 호산구 유주 인자(비특허문헌 3)로서 발견 동정되었지만, 그 이후, 현재까지 다방면에 걸친 활성이 보고되어 있다. T 세포에 관해서는, 갈렉틴 9는 Tim-3에 결합하여 Tim-3 양성 TH1 세포의 아포토시스를 유도하고, 과잉의 TH1 반응을 수속시킴으로써 자가 면역성의 염증을 억제한다(비특허문헌 4). TH17 세포는 자가 면역 질환, 알러지나 암 등, 여러가지 난치성 질환의 원인 또는 악화 인자의 하나라고 생각되고 있는 세포로, 이 세포에도 Tim-3이 발현하고 있다(비특허문헌 5∼6). 갈렉틴 9 투여는 TH17 세포를 감소시키고, 한편에서 염증 억제성의 Treg 세포를 증가시킨다(비특허문헌 7). 현재 시점에서, 이 TH17 세포 감소에 대한 Tim-3의 관여 및 메커니즘은 밝혀지지 않았다.
갈렉틴 9의 T 세포 이외에 대한 작용에는 전술한 호산구 유주 활성 이외에도 CD11bLy-6C 단구 타입 골수 유래 억제 세포의 유도(비특허문헌 8), CD11bLy-6G 호중구 타입 골수 유래 억제 세포의 유도(비특허문헌 9∼10)나 형질 세포양 수상 세포의 유도(비특허문헌 11), 비만 세포로부터의 탈과립 억제(비특허문헌 12) 등이 알려져 있다. 지금까지의 보고는 갈렉틴 9의 과잉 면역 억제 작용에 착안한 것이 많지만, 갈렉틴 9는 경우에 따라서는 면역을 증진시킨다. 갈렉틴 9는 단구나 수상 세포 상의 Tim-3에 결합하여 이들 세포를 활성화하고, 염증성 사이토카인 생성을 촉진한다(비특허문헌 13). 또 대식 세포에서 갈렉틴 9와 Tim-3이 상호작용하면 결핵균을 배제하는 면역이 증진된다(비특허문헌 14). 즉 갈렉틴 9는 면역을 양방향성으로 조정할 수 있다.
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전술한 바와 같은 갈렉틴 9의 활성의 해명은, 그 대부분이 재조합체 단백질을 투여ㆍ첨가함으로써 행해져 왔다. 예컨대, 갈렉틴 9 투여는, 마우스의 콜라겐 유도 관절염에 치료 효과를 발휘하고, Tim-3 양성 T 세포의 감소와 Treg 세포의 증가, 및 IFN-γ이나 IL-17 등의 염증성 사이토카인 생성을 억제한다(비특허문헌 7). 중요한 것으로, 갈렉틴 9 녹아웃(knockout) 마우스는 관절 류마티스 유도 자극에 고감수성이며, 야생형과 비교하여 Tim-3 양성 CD4 T 세포(TH1 및 TH17)의 증가와 Treg 세포의 감소가 보인다(비특허문헌 7). 이러한 성질은 재조합체 단백질을 투여하여 해명된 갈렉틴 9의 작용과 모순되지 않는다. 따라서 갈렉틴 9는 내재성의 면역 제어 인자로서 분비되어, 면역 밸런스를 조정하고 있는 것은 자명하다. 그러나, 생체내에서 갈렉틴 9를 분비하고, 또는 면역을 조정하고 있는 세포는 아직 동정되지 않았다.
Tim-3은 갈렉틴 9의 타겟으로서 가장 연구가 진행되어 있지만, 갈렉틴 9의 다채로운 활성 모두를 Tim-3으로 설명하는 것은 불가능하다. 실제로 현재까지 활성화 림프구의 접착 인자인 CD44, 인테그린이나 IgE가 갈렉틴 9의 타겟으로서 동정되어 있고, 이들 타겟을 통해 알러지성의 과잉 면역 억제나 암세포의 전이 억제가 일어난다(비특허문헌 12, 15∼16). 금후, 연구의 진전에 의해 타겟이 더욱 늘어나는 것을 예상하는 것은 어렵지 않다. 이와 같이 복수의 타겟에 상호작용하여 다채로운 활성을 나타내는 것은 많은 렉틴의 공통된 성질이다. 그런데 이상에 예를 든 갈렉틴 9의 타겟은 모두 세포막 상에 존재하고 있고, 세포 밖으로 분비된 갈렉틴 9가 이들 타겟에 결합하여 기능을 발휘하는 것은 말할 것도 없는 것으로 생각된다.
그런데, 갈렉틴 9는 시그널 펩티드를 갖지 않고, 기본적으로 세포질에 국재하고 있고, 세포질 또는 핵내에서의 역할도 보고되어 있다(비특허문헌 17∼18). 그러나, 전술한 세포막 상의 타겟 및 갈렉틴 9의 작용을 생각하면 갈렉틴 9의 적어도 일부는 분비될 것이다. 실제로 T 세포나 비만 세포에서 유래하는 주화 세포로부터 갈렉틴 9가 분비된다는 보고가 있지만(비특허문헌 12, 19), 그 분비 메커니즘은 전혀 밝혀지지 않았고, 또 주화 세포이기 때문에 생체내에서도 동계통의 세포로부터 동일한 분비가 행해진다는 확증은 없다. 무엇보다 갈렉틴 9를 발현하고 있는 세포가 반드시 그것을 분비한다고는 할 수 없는 것이, 갈렉틴 9 분비 세포의 동정을 현저하게 어렵게 하고 있다.
갈렉틴 9는 중요한 면역 제어 인자이며, 그 분비 세포를 동정할 수 있다면, 면역 밸런스를 알 수 있는 지표로서 유용하다고 생각되며, 예컨대 여러가지 면역 질환의 진단 또는 치료의 효과를 판정하는 대리 표지자(surrogate markers)가 될 수 있다. 또한 그 세포를 정제하는 기술과 조합함으로써 세포 요법에도 사용 가능하다고 생각되며, 자가 면역 질환, 알러지, 암 등의 난치성 질환 치료에 대한 응용도 상정된다.
이와 같이, 갈렉틴 9는, 다채로운 면역 제어 활성을 갖지만, 그 작용 메커니즘의 상세한 것은 밝혀지지 않은 부분이 많다. 또, 생체내에서 갈렉틴 9를 분비하고, 또는 면역 반응을 제어하고 있는 세포 등도 미동정이다. 갈렉틴 9에 의한 면역 제어의 상세한 것, 예컨대 TH17과 Treg 세포의 분화 제어의 상세한 것을 밝히는 것, 또는, 생체내에서 갈렉틴 9를 분비하고, 또는 면역 반응을 제어하는 세포 등의, 갈렉틴 9에 기초하는 생리 활성을 발현할 수 있는 세포의 동정이 요구되고 있다.
따라서, 본 발명은, 갈렉틴 9에 기초하는 생리 활성을 발현할 수 있는 세포, 그 제조 방법 및 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 세포는, 갈렉틴 9를 포함하는 세포로서, 상기 갈렉틴 9를 세포 표면에 발현하고 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 세포의 제1 제조 방법은, 동물에게 갈렉틴 9를 투여함으로써, 상기 동물에서의 적어도 일부의 세포의 세포 표면에 갈렉틴 9를 발현시키는 상기 본 발명의 세포의 제조 방법이다.
본 발명의 세포의 제2 제조 방법은, 동물의 세포를 갈렉틴 9의 존재하에 배양함으로써, 상기 동물의 세포의 세포 표면에 갈렉틴 9를 발현시키는 상기 본 발명의 세포의 제조 방법이다.
본 발명의 의약은, 상기 본 발명의 세포, 그 파쇄물 및 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 의약이다.
본 발명의 진단 방법은, 상기 본 발명의 세포, 그 파쇄물 및 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 이용하여, 피검 세포에서의 갈렉틴 9 또는 갈렉틴 9 결합성 물질의 유무를 진단하는 방법이다.
본 발명에 의한 질환의 치료 방법 또는 상기 질환에서 유래하는 증상의 경감 방법은, 상기 본 발명의 세포, 그 파쇄물 및 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 동물에게 투여하는 공정을 포함하는, 상기 동물의 질환의 치료 또는 상기 질환에서 유래하는 증상의 경감 방법이다.
본 발명의 면역 제어 방법은, 상기 본 발명의 세포를 동물에게 투여하여 상기 동물의 면역을 제어하는 면역 제어 방법이다.
본 발명의 세포 검출 방법은, 상기 본 발명의 세포의 세포 표면에 발현된 갈렉틴 9를 마커로서 검출함으로써, 상기 세포를 검출하는 방법이다.
본 발명에 의한, 동물의 질환 또는 상기 질환에서 유래하는 증상의 진단 방법은,
상기 본 발명의 세포를 포함하거나 또는 포함하지 않는 동물 조직에 있어서, 상기 본 발명의 세포 검출 방법에 의해, 상기 본 발명의 세포를 정성적 또는 정량적으로 검출하는 공정을 포함하는, 상기 동물의 질환 또는 상기 질환에서 유래하는 증상의 진단 방법이다.
본 발명에 의한 동물의 질환의 치료 효과의 판정 방법은,
상기 동물에 대하여 상기 질환의 치료를 행하는 공정과,
상기 치료의 전후에 있어서, 각각, 본 발명에 의한 상기 동물의 질환 또는 상기 질환에서 유래하는 증상의 진단 방법에 의해, 상기 질환 또는 상기 질환에서 유래하는 증상을 진단하는 공정과,
상기 치료의 전후에서의 상기 진단 결과를 대비하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의한 세포의 분리 방법은, 상기 본 발명의 세포를 포함하는 동물 조직에 있어서, 상기 본 발명의 세포 검출 방법에 의해 상기 세포를 검출하고, 검출된 상기 세포를, 상기 동물 조직중의 다른 세포로부터 분리하는 세포의 분리 방법이다.
본 발명에 의하면, 상기와 같이, 갈렉틴 9에 기초하는 생리 활성을 발현할 수 있는 세포, 그 제조 방법 및 용도를 제공할 수 있다.
도 1은 실시예에서의 래트 콜라겐 유도 관절염 모델에서의 인간 안정화 갈렉틴 9의 치료 효과를 나타낸 도면이다. (a)의 스케줄에 따라서 Lewis rat(♀, 6∼7주령)를 감작하여, 발의 부기가 현저해진 초회 감작으로부터의 14일째부터 표시 용량의 인간 안정화 갈렉틴 9(또는 컨트롤로서 PBS)를 피하 투여하고, 발의 부기를 경시적으로 모니터했다. (b)는, 3회/주 투여의 결과를 나타내는 그래프이다. (c)는, 1회의 투여량을 0.6 mg/kg으로 고정하고, 1회/주 또는 2회/주로 투여했을 때의 결과를 나타내는 그래프이다. (b) 및 (c)에 있어서, 횡축은 초회 감작시로부터의 경과일수를 나타내고, 종축은 발의 용적의 증가율(%)을 나타낸다. 「Vehicle」은, 대조 실험으로서 용매만(인간 안정화 갈렉틴 9의 투여 없이)으로 행한 결과를 나타내고, 「non-arthritis」는, 관절염이 발증하지 않은 래트의 측정 결과를 나타낸다.
도 2는 실시예에서의, 인간 안정화 갈렉틴 9의 래트에서의 체내 동태 시험 결과를 나타내는 그래프이다. 즉, 도 2는, Lewis rat(♀, 6∼7주령)에 표시 용량의 인간 안정화 갈렉틴 9를 1회 피하 투여하여, 혈장중의 인간 안정화 갈렉틴 9를 특이적 ELISA로 측정한 결과를 나타낸다. 횡축은 경과시간을 나타내고, 종축은 혈장중의 인간 안정화 갈렉틴 9 농도를 나타낸다.
도 3은 실시예에서의, 마우스 MOG 유도성 실험적 알러지성 뇌염(EAE)에 대한 갈렉틴 9 작용을 나타낸 도면이다. (a) 암컷 C57BL/6J 마우스(WT)와 동계통의 갈렉틴 9 녹아웃 마우스(Gal-9 KO)에서의 경시적인 EAE 임상 스코어의 그래프이다. 횡축은 면역 감작후의 경과시간을 나타내고, 종축은 임상 스코어를 나타낸다. (b) 감작후 20주째의 마우스(WT와 Gal-9 KO(Gal-9-/-)) 척수의 헤마톡실린/에오신 염색과, 항 CD3 항체에 의한 면역 염색의 조직 현미경 사진이다. (c) 감작후 20주째의 EAE 감작 야생형 마우스(WT), EAE 감작 갈렉틴 9 녹아웃 마우스(Gal-9 KO) 및 주령을 맞춘 미감작 마우스(Naive)로부터 각각 조제한 서혜부 림프절의 세포를, CD4, CD25, IL-17 및 Foxp3 항체로 염색한 결과를 나타낸 도면이다. 도면 중, 「Naive」는 나이브 T 세포를 나타낸다. (d) CD4+CD62L+ 나이브 T 세포를 야생형 마우스(WT) 및 갈렉틴 9 녹아웃 마우스(Gal-9 KO)의 비장 세포로부터 조제하고, 항 CD3 항체를 코팅한 96-웰 플레이트 중에서 항 CD28 항체를 첨가하여 배양(No skewed), 또는 인간 TGF-β1, 마우스 IL-2 및 마우스 IL-6을 더 첨가하여 배양하여, TH17 세포 분화를 유도한(TH17 skewed) 결과를 나타내는 그래프이다. 보다 구체적으로는, 96시간 배양후의 배양 상청 중의 IL-17A 농도를 ELISA로 정량한 결과를 나타낸다. (e) 상기 (d)에서 배양 상청을 추출한 후에 남은 세포 내의 IL-10 mRNA량을 리얼타임 RT-PCR법으로 정량한 결과를 나타내는 그래프이다. (f) 상기 (a)의 계에서 암컷 C57BL/6J 마우스에게 EAE를 발증시켜, 감작후 14일째와 16일째에 인간 안정화 갈렉틴 9를 피하 투여(컨트롤군에 PBS를 투여)하고, 감작 19일째까지 임상 스코어를 기록하고, 그 후 마우스 척수를 헤마톡실린/에오신으로 조직 염색한 결과를 나타낸 도면이다. 그래프 중, 횡축은 면역 감작후의 경과시간을 나타내고, 종축은 임상 스코어를 나타낸다.
도 4는 실시예에서의, 갈렉틴 9에 의한 TH17 세포 분화 억제가, Tim3/Gal-9 상호작용에 의존하는지의 여부를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다. (a) 도 3의 (d)의 방법으로 나이브 T 세포에 TH17 세포 분화 유도 자극을 96시간 부여하고, 인간 안정화 갈렉틴 9(30 nM)를 표시의 기간 첨가하여 배양 상청 중의 IL-17A 농도를 ELISA로 정량한 결과를 나타낸다. 횡축은 갈렉틴 9에 의한 처리 시간을 나타내고, 종축은 IL-17A 농도를 나타낸다. (b) 인간 안정화 갈렉틴 9 존재하에 TH17 세포 분화 유도 자극을 24시간 부여하고, IL-17F, IL-21, IL-22 및 IL23R mRNA 발현을 리얼타임 RT-PCR법으로 정량한 결과를 나타내는 그래프이다. (c) 나이브 T 세포를 TH17 분화 유도 자극하에 24시간 배양한 경우(TH17 skewed)와, 동일한 분화 유도 자극에서 TGF-β1 및 IL-6을 제외한 경우(No skewed)의 플로우 사이타머트리(flow cytometry)에 의한 CD4+Tim-3+ 세포의 해석(좌측)과 Tim-3 중화 항체 존재하에 인간 안정화 갈렉틴 9에 의한 TH17 분화 유도 억제 분석을 행한 결과(우측)를 나타내는 그래프이다. (d) 나이브 T 세포를 TH17 분화 유도 자극하에 96시간 배양후, 인간 안정화 갈렉틴 9를 첨가하여 아포토시스를 일으킨 Tim-3 양성 세포(TH17 세포)를 플로우 사이타머트리로 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 실시예에 있어서, 갈렉틴 9에 의한 TH17 분화 유도 억제에, N-결합형 당쇄(carbohydrate chain)와 O-결합형 당쇄 중 어느 것이 관여하는지를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다. (a) TH17 분화 유도 분석을 인간 안정화 갈렉틴 9와 표시 농도의 락토스(갈렉틴 저해제) 존재하에 행한 결과를 나타낸다. 락토스의 컨트롤에는 수크로스를 이용했다. 횡축은 락토스 또는 수크로스의 농도를 나타내고, 종축은 IL-17A의 농도를 나타낸다. (b) (a)의 TH17 분화 유도 분석을 N-글리코실레이션 저해제의 swainsonine(2 ㎍/ml) 또는 O-글리코실레이션 저해제의 Benzyl N-acetyl-α-D-galactosaminide(Benzyl-α-GalNAc, 2 mM) 중에서 행한 결과를 나타내는 그래프이다. 횡축은 swainsonine 또는 Benzyl-α-GalNAc의 농도를 나타내고, 종축은 IL-17A의 농도를 나타낸다.
도 6은 실시예에 있어서, TH1, TH2 및 TH17 세포 분화에 미치는 Gal-9의 효과를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. (a) 나이브 T 세포를 TH1, TH2 또는 TH17로 분화 유도하는 분석계(assay system)에 인간 안정화 갈렉틴 9(또는 컨트롤로서 PBS)를 첨가하여, 각각의 분화를 각 TH 서브 타입에 특이적인 mRNA 발현으로 정량한 결과를 나타낸다. No skewed는 TCR 자극만인 경우. (b) 상기 (a)의 안정화 갈렉틴 9 존재하에 TH17 분화 유도를 행한 세포의 IFN-γ 및 IL-4 mRNA의 발현을 나타낸다.
도 7은 실시예에 있어서, 갈렉틴 9에 의한 TH17/Treg 밸런스 조정이 IL-2에 의존하는지의 여부를 조사한 결과를 나타낸 도면이다. (a) 나이브 T 세포에 인간 안정화 갈렉틴 9(또는 컨트롤로서 PBS)를 첨가하여, TH17 분화 유도 조건하에 배양한 세포의 CD4+CD25+ 세포의 비율을 플로우 사이타머트리로 측정한 결과를 나타내는 도면이다. (b) 상기 (a)의 CD4+CD25+Foxp3+ 세포의 비율을 나타내는 도면이다. (c) 나이브 T 세포에 인간 안정화 갈렉틴 9(컨트롤은 PBS) 및 표시 농도의 IL-2를 첨가하여, TH17 분화 유도 조건하에 배양하여, 배양 상청 중의 IL-17A 농도를 ELISA로 정량한 결과. (d) 상기 (c)의 조건으로 배양했을 때의 Treg 세포(CD4+CD25+Foxp3+ 세포)의 비율을 플로우 사이타머트리로 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. (e) 나이브 T 세포에 인간 안정화 갈렉틴 9(컨트롤은 PBS)를 첨가하여, TH17 분화 유도 조건하에 배양한 후, PMA와 이오노마이신 및 brefeldin A 존재하에 더 배양하여, CD4 양성 세포중의 IL-17+Foxp3- 세포와 IL-17-Foxp3+ 세포의 비율을 플로우 사이타머트리로 측정한 결과를 나타내는 도면이다. (f) 나이브 T 세포를 상기 (e)의 조건으로 배양하여, 각 시점에서 CD25 및 Foxp3의 mRNA 발현을 리얼타임 RT-PCR로 정량한 결과를 나타내는 그래프이다. 횡축은 경과시간을 나타내고, 종축은 발현량을 나타낸다.
도 8은 실시예에서의, 세포 표면에 갈렉틴 9를 발현하는 CD4 양성 T 세포(THGAL9)의 확인(동정)을 나타내는 도면이다. (a) 나이브 T 세포를 도 6a의 각 조건 및 미자극(No stim)으로 배양하여, 배양 상청 중의 갈렉틴 9 농도를 ELISA로 정량한 결과를 나타낸다. TCR 자극만인 경우는 No skewed로 표기했다. (b) 나이브 T 세포를 TH17로 분화 유도하는 조건(TH17 skewed; TCR 자극에 더하여 IL-2, TGF-β1 및 IL-6 자극) 또는 그것으로부터 IL-6을 제외한 것(TGF-β1 alone), 또는 그것으로부터 TGF-β1을 제외한 것(IL-6 alone) 또는 TCR 자극만인 경우(No skewed)의 각 조건으로 배양후에 상청 중의 갈렉틴 9를 ELISA로 정량한 결과를 나타낸다. (c) 나이브 T 세포에 인간 안정화 갈렉틴 9(또는 컨트롤로서 PBS)를 첨가하여, 미자극(No stim), TCR 자극만(No skewed) 및 TH17 분화 유도 자극 조건하에서 배양한 후, 상청 중의 갈렉틴 9를 ELISA로 정량한 결과를 나타낸다. (d) 상기 (c)의 세포를 이용하여 갈렉틴 9 mRNA량을 리얼타임 RT-PCR로 정량한 결과를 나타낸다. (e) 상기 (a)의 각 조건으로 배양한 세포의, 세포 표면 갈렉틴 9와 CD25를 염색하여 플로우 사이타머트리로 측정한 결과를 나타낸다. (f) 상기 (e)의 No skewed 조건으로 배양한 세포를 세포 표면 갈렉틴 9 양성(Gal-9+)과 음성(Gal-9-)으로 나눠 소팅하고, 갈렉틴 9 mRNA를 리얼타임 RT-PCR로 정량한 결과(좌측) 및 이들 세포를 고정화/세포막 침투화후에 항갈렉틴 9 항체로 염색하여 세포의 전체 갈렉틴 9를 염색했을 때의 플로우 사이타머트리에 의한 측정 결과를 나타낸다.
도 9는 실시예에 있어서, THGAL9의 기능을 조사한 결과를 나타낸다. (a) 마우스 비장 세포로부터 조제한 나이브 T 세포(좌측)를, 세포 표면 갈렉틴 9 양성(THGAL9 세포 : Gal-9+TH)과 음성(non-THGAL9 : Gal-9-TH)로 소팅하고(중앙측), 각각을 TCR 자극하여 배양 상청 중에 분비된 갈렉틴 9를 ELISA로 정량한 결과(우측)를 나타낸다. (b) 상기 세포의 사이토카인 mRNA 발현을 리얼타임 RT-PCR로 조사한 결과를 나타낸다. (c) 나이브 T 세포를 TH17 분화 유도 자극하에 배양후, THGAL9 세포(Gal-9+TH) 또는 non-THGAL9(Gal-9-TH) 세포와 1 : 1의 비로 혼합하고, 그 후에는 TCR 자극만을 부여하여 공배양하여, 배양 상청 중의 IL-17A를 ELISA로(좌측), Foxp3 mRNA의 발현을 리얼타임 RT-PCR로 정량(우측)한 결과를 나타낸다. (d) 상기 공배양을, 갈렉틴 9의 저해제, 락토스(또는 컨트롤로서 수크로스) 존재하에 행하고, 배양 상청 중의 IL-17A 농도를 ELISA로 정량한 결과를 나타낸다. (e) 상기 (c)의 공배양을 IL-10 중화 항체 또는 TGF-β 중화 항체 존재하에 행한 결과를 나타낸다. (f) 나이브 T 세포를 IL-10 또는 인간 안정화 갈렉틴 9 존재하에 TH17 분화 유도 자극하여, 배양 상청 중의 IL-17A 농도를 ELISA로 정량한 결과를 나타낸다.
도 10은 실시예에 있어서, CD25+THGAL9로부터의 갈렉틴 9, IL-10 및 TGF-β1의 생성을 조사한 결과를 나타내는 그래프이다. (a) 나이브 CD4 T 세포를 TCR 자극하에 배양하여, 소팅에 의해 CD25+THGAL9, CD25+non-THGAL9 및 CD25-non-THGAL9로 분리후, 각각의 세포를 TCR 자극하에 더 배양하여, 배양 상청 중의 갈렉틴 9 농도를 ELISA로 정량한 결과를 나타낸다. (b) 상기 (a)의 세포의 IL-10 및 TGF-β1 발현을 리얼타임 RT-PCR에 의해 정량한 결과를 나타낸다.
도 11은 실시예에 있어서, THGAL9 세포가 갈렉틴 9 첨가에 의해 유도되는 것을 조사한 결과를 나타내는 그래프이다. (a) 나이브 CD4 T 세포에 인간 안정화 갈렉틴 9(또는 컨트롤로서 PBS)를 첨가하여, 미자극(No stim), TCR 자극만(Neutral) 또는 TH17 분화 유도 자극 조건하(Th17 skewed)에 배양한 후, 세포 표면의 갈렉틴 9, CD25의 발현을 플로우 사이타머트리법으로 조사한 결과를 나타낸다. (b) 나이브 CD4 T 세포를 IL-10 중화 항체, IL-10R 중화 항체 또는 TGF-β 중화 항체의 존재하에 TCR 자극하여, THGAL9 세포의 출현을 플로우 사이타머트리법으로 조사한 결과를 나타낸다. (c) 나이브 CD4 T 세포에 IL-10 또는 인간 안정화 갈렉틴 9를 첨가하여, TCR 자극하에 배양한 후, THGAL9 세포의 출현을 플로우 사이타머트리법으로 조사한 결과를 나타낸다.
도 12는 실시예에 있어서, THGAL9와 Tr1에 높은 유사성이 있는 것을 검증한 결과를 나타낸 도면이다. (a) 나이브 CD4+ T 세포를 세포 표면 갈렉틴 9를 염색하고, 이미 알려진 Tr1 세포 마커인 LAP, NKG2D, LAG-3 및 CTLA-4의 각 항체로 염색하여, 플로우 사이타머트리법으로 조사한 결과를 나타낸다. (b) 나이브 CD4+ T 세포를 TCR 자극하고, CD25 양성이 된 T 세포 집단에서 (a)와 동일한 염색 및 Foxp3 염색을 행하여, 플로우 사이타머트리법으로 조사한 결과를 나타낸다. (c) (b)에서 조제한 세포를 세포 표면의 갈렉틴 9, Tim-3 및 CD25의 발현을 플로우 사이타머트리법으로 조사한 결과를 나타낸다. (d) 나이브 CD4+ T 세포를 IL-27 첨가에 의한 Tr1 세포 분화 자극하에 배양한 후, PMA와 이오노마이신으로 더 자극하여, 배양 상청 중의 IL-10을 ELISA로 정량한 결과를 나타낸다. (e) 상기 (d)의 배양 상청 중의 갈렉틴 9를 ELISA로 정량한 결과를 나타낸다. (f) 상기 (d)의 PMA/이오노마이신 처리를 brefeldin A(10 ㎍/ml) 존재하에 행하여 세포 내부에 IL-10을 축적시키고, 세포 표면의 갈렉틴 9와 세포 내의 IL-10을 염색하여 플로우 사이타머트리법으로 측정한 결과를 나타낸다.
도 13은 실시예에 있어서, 갈렉틴 9 녹아웃 마우스에서는 Tr1 마커를 갖는 세포가 감소하는 것을 조사한 결과를 나타낸다. (a) 갈렉틴 9 녹아웃 마우스와 야생형 마우스의 비장 세포에서의 CD4, NKG2D, LAG-3, LAP, CTLA-4의 발현을 플로우 사이타머트리법으로 측정한 결과를 나타낸다. (b) 갈렉틴 9 녹아웃 마우스와 야생형 마우스의 나이브 CD4 T 세포를 TCR 자극만(No skewed) 또는 TH17 분화 유도 자극 조건하(Th17 skewed)에 배양하여, IL-10 mRNA의 발현을 리얼타임 RT-PCR로 조사한 결과를 나타낸다. (c) (b)의 No skewed 조건으로 배양한 세포를 brefeldin A(10 ㎍/ml) 존재하에 PMA/이오노마이신 처리를 행하고, 세포 내부에 축적된 IL-10을 염색하여 플로우 사이타머트리법으로 측정한 결과를 나타낸다.
도 14는 실시예에 있어서, 인간 TH17/Treg 분화에 대한 갈렉틴 9의 작용을 조사한 결과 및 인간 THGAL9 세포를 동정한 결과를 나타낸다. (a) 건강한 성인 4명으로부터 얻은 말소혈 CD4+ T 세포에 인간 안정화 갈렉틴 9(또는 컨트롤로서 PBS)를 첨가하고, TCR 자극하 또는 미자극으로 배양하여 CD25 양성 세포를 플로우 사이타머트리법으로 측정한 결과를 나타낸다. (b) 상기 (a)세포의 CD25+Foxp3+ 비율을 플로우 사이타머트리법으로 측정한 결과를 나타낸다. (c) 인간 CD4+ T 세포에 인간 안정화 갈렉틴 9(또는 컨트롤로서 PBS)를 첨가하고, TH17 세포 분화 유도 자극하에 배양하여, 배양 상청 중의 IL-17을 ELISA로 정량한 결과를 나타낸다. (d) 인간 CD4+ T 세포를 TCR 자극하, 또는 미자극으로 배양하고, 세포 표면의 갈렉틴 9와 CD25를 염색하여 플로우 사이타머트리법으로 측정한 결과를 나타낸다. (e) 인간 CD4+ T 세포를 TCR 자극하 배양한 후, 소팅에 의해 세포 표면 갈렉틴 9 양성(CD25+THGAL9)과 음성(CD25+non-THGAL9)으로 분리하여, 각각을 TCR 자극하에 더 배양후, 상청 중의 갈렉틴 9를 ELISA로 정량, 각 사이토카인 mRNA 발현을 리얼타임 RT-PCR로 측정한 결과를 나타낸다.
도 15는 심각한 복막염 모델인, 맹장 결찰 천자법(cecal ligation and puncture : CLP)의 처치를 한 마우스를 예시하는 사진이다.
도 16은 실시예에 있어서, 인간 안정화 갈렉틴 9의 심각한 복막염 모델에서의 유효성을 조사한 결과를 나타내는 그래프이다. 맹장 결찰 천자법(cecal ligation and puncture : CLP)에 의해 복막염을 발증시켜, 경시적으로 생존율을 조사했다. (a) C57BL/6J 야생형 마우스(WT)와 마우스 갈렉틴 9의 트랜스제닉 마우스(Gal-9 Tg)의 비교를 나타낸다. (b) WT 마우스에게 CLP와 동시에 인간 안정화 갈렉틴 9(30 ㎍/마우스; 또는 컨트롤로서 PBS)를 1회 정맥내 투여했을 때의 생존율을 나타낸다. (c) WT 마우스에게 CLP 처치를 하고, 그 24시간후에 인간 안정화 갈렉틴 9(30 ㎍/마우스; 또는 컨트롤로서 PBS)를 1회 정맥내 투여했을 때의 생존율을 나타낸다. (d) WT 마우스에게 CLP 처치를 하고, 그 24시간후에 인간 안정화 갈렉틴 9(30 ㎍/마우스; 또는 컨트롤로서 PBS)를 1회 피하 투여했을 때의 생존율을 나타낸다. (e) 누드 마우스에게 CLP와 동시에 인간 안정화 갈렉틴 9(30 ㎍/마우스; 또는 컨트롤로서 PBS)를 1회 피하 투여했을 때의 생존율을 나타낸다. 각 도면에 있어서, 횡축은 CLP 처치후의 경과일수를 나타내고, 종축은 생존율을 나타낸다.
도 17은 실시예에 있어서, CLP 마우스에게 인간 안정화 갈렉틴 9를 투여함으로써 발생하는 사이토카인 밸런스의 변화를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 17은, WT 마우스에게 CLP와 동시에 인간 안정화 갈렉틴 9(30 ㎍/마우스; 또는 컨트롤로서 PBS)를 1회 정맥내 투여하고, 그 24시간후에 취출한 비장 세포를 24시간 배양하여, 배양 상청 중의 사이토카인을 ELISA로 정량한 결과를 나타낸다. 종축은 사이토카인의 농도를 나타낸다.
도 18은 실시예에 있어서, CLP 마우스에게 인간 안정화 갈렉틴 9를 투여함으로써 유도되는 세포 표면 갈렉틴 9 양성 세포를 조사한 결과를 나타낸다. WT 마우스에게 CLP와 동시에 인간 안정화 갈렉틴 9(30 ㎍/마우스; 또는 컨트롤로서 PBS)를 1회 정맥내 투여하고, 그 24시간후에 취출한 비장 세포의 세포 표면 CD3ε, NK1.1, GL-3 및 세포 표면 갈렉틴 9의 발현을 각 항체로 염색하여 플로우 사이타머트리법으로 측정한 결과. CD3+NK1.1+ : NKT 세포, CD3-NK1.1+ : NK 세포, CD3+GL-3+ : γσ T 세포. THGAL9 세포는 CD3+NK1.1-Gal-9+ 및 CD3+GL-3-Gal-9+의 분획에 포함된다. 도 18 중의 「Spleen cells from CLP mouse」는, 「CLP 마우스로부터 취출한 비장 세포」를 의미한다.
도 19는 이미 알려진 바와 같이 인간 안정화 갈렉틴 9를 암을 가지고 있는 마우스에게 투여하면 생존율이 상승하지만, 그 때에 발생하는 면역 세포의 변화 및 이들 세포 표면의 갈렉틴 9 발현을 실시예에 있어서 조사한 결과를 나타낸다. 마우스 섬유육종 Meth A를 이미 알려진 방법(비특허문헌 32)에 따라서 복강내에 도입하고, 그 직후로부터 인간 안정화 갈렉틴 9를 3회/주 투여(30 ㎍/마우스)했다. Meth A 이식으로부터 7일후에 복강내 세포와 비장 세포를 취출하여 표시의 세포 표면 마커를 염색하여, 플로우 사이타머트리법으로 측정한 결과를 나타낸다. (a) 복강 세포 중 CD4 양성 세포를 CD25와 세포 표면 갈렉틴 9 발현으로 전개한 결과. 인간 안정화 갈렉틴 9 투여에 의해 세포 표면에 갈렉틴 9를 발현한 세포의 비율이 현저하게 증가하고, 한편 CD25+Gal-9-는 감소했다. CD25+Gal-9- 세포는, 암에 대한 면역을 억제한다고 생각되는 Treg를 포함하는 세포 집단이다. (b) 복강 세포 중 CD8 양성 세포를 CD25와 세포 표면 갈렉틴 9 발현으로 전개한 결과를 나타낸다. 인간 안정화 갈렉틴 9 투여에 의해 세포 표면에 갈렉틴 9를 발현한 CD8 세포의 비율이 현저하게 증가하고 있다. (c) 인간 안정화 갈렉틴 9를 투여한 Meth A 암을 가지고 있는 마우스의 비장 세포를 PDCA-1, CD11c 및 세포 표면 갈렉틴 9로 염색하여, 플로우 사이타머트리법으로 측정한 결과를 나타낸다. 형질 세포양 수상 세포 : pDC, pDC양 대식 세포 : pDC-Mφ, 고전적 수상 세포 : cDC, 및 수상 세포나 대식 세포와 상이한 세포 : nonDCMφ(도면 중에서는, 「other spleen cells」)의 각각에서 세포 표면 갈렉틴 9 발현 레벨을 비교했다.
도 20은 실시예에 있어서, 인간 안정화 갈렉틴 9의 자연 발증성 자가 면역 질환 모델에서의 유효성을 조사한 결과를 나타낸다. MRL/MpJUmmCrj-1pr/1pr 마우스는 전신성 에리테마토데스의 모델로서 범용되는 자연 발증성 자가 면역 질환 모델이다. 이 마우스(♀, 8주령)에게 인간 안정화 갈렉틴 9를 표시 용량으로 3회/주의 스케줄로 22주령까지 복강내 투여하여, 경시적으로 뒷다리 발바닥 부종 용적 측정(주 1회), 체중 측정(주 3회), 뇨중 단백 농도 측정(주 1회)을 행했다. 본 도면에서는 뇨단백 농도 변화(a)와 체중 변화(b)를 조사한 결과를 나타낸다. 도 20의 (a)에 있어서, 횡축은 투여후의 경과주수를 나타내고, 종축은 뇨중 단백 농도를 나타낸다. 모든 데이터는, 소정의 각 시점에서의 n=7∼10의 동물의 평균치를 나타낸다. 통계적인 차이는, 쌍방향의 ANOVA를 이용하여 분석하고, 그룹간의 차이는, 본페로니의 posttests를 이용하여 평가했다(*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001). 도 20의 (b)에 있어서, 횡축은 투여후의 경과일수를 나타내고, 종축은 체중 증가량을 나타낸다. 모든 데이터는, 소정의 각 시점에서의 n=6∼8의 동물의 평균치±SEM을 나타낸다. 통계적인 차이는, 쌍방향의 ANOVA를 이용하여 분석하고, 그룹간의 차이는, 본페로니의 posttests를 이용하여 평가했다(*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001).
도 21은 도 20의 실험에서의 뒷다리 발바닥 부종 용적 변화(a)와, 실험 종료시(22주령째)의 헤마토크릿 치(b)를 조사한 결과를 나타낸다. 도 21의 (a)에 있어서, 횡축은 투여후의 경과주수를 나타내고, 종축은 뒷다리 발바닥 부종 용적 변화를 나타낸다. 모든 데이터는, 소정의 각 시점에서의 n=6∼10의 동물의 평균치±SEM을 나타낸다. 통계적인 차이는, 쌍방향의 ANOVA를 이용하여 분석하고, 그룹간의 차이는, 본페로니의 posttests를 이용하여 평가했다(*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001). 도 21의 (b)에 있어서, 횡축은 인간 안정화 갈렉틴 9 투여 용량을 나타내고, 종축은 실험 종료시(22주령째)의 헤마토크릿 치를 나타낸다. 모든 데이터는, 소정의 각 시점에서의 n=6∼8의 동물의 평균치±SEM을 나타낸다. 통계적인 차이는, 쌍방향의 ANOVA를 이용하여 분석하고, 그룹간의 차이는, 던네트의 다중 비교 검정을 이용하여 평가했다(*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001).
도 22는 실시예에 있어서, 인간 안정화 갈렉틴의, 항체 생성에 미치는 영향을 조사한 결과를 나타낸다. 양(羊)적혈구(SRBC)를 마우스에게 투여하면 양적혈구에 대한 IgM 항체 생성이 현저하게 야기되므로, 이 시스템은 약물의 항체 생성에 미치는 영향을 조사하는 목적으로 범용된다. C57BL/6J 마우스(♀)에게 SRBC를 복강내 투여하고, 그 직후에 인간 안정화 갈렉틴 9(30 ㎍/마우스) 또는 컨트롤로서 PBS를 1회 복강내 투여했다. 각각의 시점에서, 3-5 마리의 마우스로부터 채혈 및 비장 적출을 행하여 항체 생성 및 B 세포를 조사했다. (a) SRBC 특이적인 IgM 농도, (b) 모든 IgM 농도, (c) 모든 IgG 농도를 각각의 특이적인 ELISA로 조사한 결과를 나타낸다. (d) MRL/MpJUmmCrj-1pr/1pr 마우스(♀, 8주령)에게 30 ㎍/마우스의 인간 안정화 갈렉틴 9 또는 컨트롤로서 PBS를 3회/주 투여하여, 7일째에 채혈했다. 혈청중의 항이중가닥(anti-double-stranded) DNA 항체(대표적인 자가 항체) 농도를 특이적인 ELISA로 측정한 결과를 나타낸다. 도면 중, 「Days after SRBC injection」은, SRBC 복강내 투여후의 경과일수를 의미한다.
도 23은 실시예에서의, 비장 세포에 포함되는 Germinal center B 세포의 플로우 사이타머트리법에 의한 해석 방법을 나타낸다. 비장 세포를 항 CD19 항체와 항 GL-7 항체로 염색하고, CD19+GL-7+의 세포 집단을 Germinal center B 세포로 했다. Germinal center B 세포를 구성하는 Centrocyte와 Centroblast는 세포의 크기가 상이하며, Centroblast쪽이 큰 것이 알려져 있다. 따라서 Germinal center B 세포 집단을 FSC와 SSC로 전개하여, 세포의 크기에 상관하는 FSC에서 약 350 부근을 기준으로 2개의 세포 집단으로 분리하여, 임시로 각각 Centrocyte와 Centroblast로 했다. 각각의 CXCR4 발현을 조사한 바, Centroblast에서 높은 발현이 확인되었다. 이것은 공지의 Centroblast와 Centrocyte의 성질에 일치한다. 따라서 이후의 해석에서 Centrocyte와 Centroblast를 분리하여 해석할 필요가 있을 때에는 본 도면에 나타낸 방법, 즉 CD19+GL-7+의 세포 집단을 FSC와 SSC로 전개하여 분리하는 방법으로 행했다.
도 24는 실시예에 있어서, 갈렉틴 9가 B 세포에도 작용하는 것을 조사한 결과를 나타낸다. C57BL/6J 마우스(♀) 또는 갈렉틴 9 녹아웃 마우스에게 SRBC를 복강내 투여하고, 그 직후에 인간 안정화 갈렉틴 9(30 ㎍/마우스) 또는 컨트롤로서 PBS를 1회 복강내 투여했다. 각각의 시점에서, 3-5 마리의 마우스로부터 채혈 및 비장 적출을 행하여, B 세포를 도 23에 나타낸 플로우 사이타머트리법에 의해 조사한 결과를 나타낸다. (a) SRBC 투여후 4일째의 플로우 사이타머트리법에 의한 해석 결과의 일례를 나타낸다. (b) Germinal center B 세포(GC B cell), Centroblast 및 Centrocyte수의 경시 변화를 나타낸다. 「Day post immunization」은, 면역 감작후의 경과일수를 의미한다. (c) SRBC 투여후 4일째의 Germinal center B 세포(GC B cell), Centroblast 및 Centrocyte수를 나타낸다. 갈렉틴 9 녹아웃 마우스(Gal-9 KO)에는 SRBC 투여후에 PBS를 투여했다.
도 25는 실시예에 있어서, B 세포의 세포 표면에 갈렉틴 9가 발현하고 있는 것을 조사한 결과를 나타낸다. (a) SRBC 투여 7일째의 비장 세포를, 도 23에 나타낸 플로우 사이타머트리법으로 Germinal center B 세포와 그 밖의 B 세포로 분리하여, 각각의 세포 집단의 세포 표면 갈렉틴 9 발현을 조사한 결과를 나타낸다. (b) (a)의 Germinal center B 세포를 도 23에 나타낸 플로우 사이타머트리법으로 다시 Centrocyte와 Centroblast로 분리하여, 각각의 세포 집단의 세포 표면 갈렉틴 9 발현을 조사한 결과를 나타낸다. (c) 도 24의 (B)에서 조사한 Germinal center B 세포의 세포 표면 갈렉틴 9 발현을 조사한 결과를 나타낸다. SRBC 투여에 의해 세포 표면에 갈렉틴 9를 발현한 Germinal center B 세포의 비율은 증가했지만, 인간 안정화 갈렉틴 9를 투여하더라도 그 비율에 변화는 없었다.
도 26은 실시예에 있어서, 항체 생성 자극하의 비장 세포 중 헬퍼 T 세포의 서브 타입과, 각각의 세포 표면 갈렉틴 9 발현을 해석한 결과를 나타낸다. 전술한 바와 같이 갈렉틴 9는 항체 생성 및 B 세포에도 작용한다. 생체내에서 B 세포의 분화, 항체 생성은 헬퍼 T 세포에 제어되고 있고, 특히 Follicular B helper T cells(TFH)라고 불리는 CD4 양성 세포의 역할이 크다고 하고 있다. 따라서, SRBC 투여전(Day0)과 투여 7일째(Day7)의 마우스 비장 세포를 CD4 및 TFH의 마커라고 일컬어지는 CXCR5 및 ICOS에서 염색하여, 각각의 세포 집단의 세포 표면 갈렉틴 9 발현을 플로우 사이타머트리법에 의해 조사했다. (a) CD4 양성 세포를 CXCR4와 ICOS 발현으로 전개한 도트 플롯의 예와, CXCR4와 ICOS 발현으로 4분할한 각 세포 집단의 세포 표면 갈렉틴 9 발현을 나타낸다. (b) 각각의 세포 집단의 비율의 경시 변화를 나타낸다. (c) 인간 안정화 갈렉틴 9 투여에 의해 각각의 CD4 양성 세포의 비율이 변화하는지 어떤지를 조사한 결과를 나타낸다. (d) 각각의 세포 집단의 세포 표면 갈렉틴 9 양성 비율이 SRBC 투여후에 상승하는 결과를 나타낸다. (e) 각각의 세포 집단의 세포 표면 갈렉틴 9의 발현량(MFI)이 SRBC 투여후에 상승하는 결과를 나타낸다. 도면 중, 「Days after SRBC injection」은, SRBC 복강내 투여후의 경과일수를 의미한다.
도 27은 인간 안정화 갈렉틴 9 투여에 의해 발생하는 작용을 모식적으로 예시하는 도면이다.
도 28은 실시예에서의, 갈렉틴 9 개변체(variant) 재조합 단백질의 전기 영동도이다.
도 29는 실시예에 있어서, 갈렉틴 9 투여가 LLC 암을 가지고 있는 마우스의 생존을 연장하고, 그 때에 pDC양 대식 세포가 증가한 것을 나타낸 도면이다. (a) 마우스 폐암 유래 종양 세포주 LLC를 복강 접종한 마우스에게, 30 ㎍의 인간 안정화 갈렉틴 9(또는 컨트롤로서 PBS)를, 3회/주로 암을 가지고 있을 때부터 복강내 투여했을 때의 생존율을 조사한 결과를 나타내는 그래프이다. 횡축의 「Days after tumor inoculation」은 종양 접종후의 일수를 의미한다. 종축의 「Percent survival」은 생존율을 나타낸다. (b) LLC 접종 7일후의 복강내 세포를 대식 세포 마커(Ly-6C 및 F4/80), 수상 세포 마커(CD11c) 및 형질 세포양 수상 세포 마커(PDCA-1)의 항체로 염색하여, 플로우 사이타머트리로 해석한 결과를 나타낸다.
도 30은 실시예에 있어서, 갈렉틴 9가 시험관 내에서 M-CSF에 의한 CD11c 양성 세포의 분화를 Tim-3 비의존적으로 촉진한 것을 나타낸 도면이다. (a) 마우스 골수 세포를 GM-CSF 또는 M-CSF 중에서 7일간 배양하여 수상 세포로의 분화를 촉진하여 수상 세포의 마커의 하나인 CD11c의 발현을 조사했다. 안정화 갈렉틴 9(30 nM)의 분화에 미치는 영향을 조사한 결과를 나타낸다. (b) (a)의 분화 분석을 갈렉틴 9의 저해제인 락토스(컨트롤에는 수크로스) 또는 Tim-3의 중화 항체 중에서 행한 결과를 나타낸다.
도 31은 실시예에 있어서, 갈렉틴 9와 M-CSF에 의해 분화된 CD11c 양성 세포가 pDC양 대식 세포의 전구체 세포인 것을 확인한 결과를 나타낸 도면이다. (a) 도 30의 M-CSF 또는 M-CSF와 갈렉틴 9로 7일간 배양한 세포를 표시의 대식 세포 및 수상 세포 마커의 항체로 염색하여, 플로우 사이타머트리법으로 해석한 결과를 나타낸다. 회색으로 칠해진 히스토그램은 아이소타입 컨트롤, 회색의 실선이 M-CSF에 의해 분화시킨 대식 세포를 표시의 항체로 염색한 것, 검은색의 실선이 M-CSF와 갈렉틴 9에 의해 분화시킨 대식 세포를 표시의 항체로 염색한 것. (b) 상기 세포의 전사 인자 mRNA 발현을 리얼타임 RT-PCR로 해석하여, β2 마이크로글로불린 또는 글리세르알데히드 3인산 디히드로게나아제의 mRNA 발현으로 표준화한 결과를 종축에 나타낸다. 각각 샘플수는 4로 통계 해석을 행하고 있다. (c) 상기 세포의 Toll-like 리셉터 mRNA 발현을 리얼타임 RT-PCR로 해석하고, β2 마이크로글로불린 또는 글리세르알데히드 3인산 디히드로게나아제의 mRNA 발현으로 표준화한 결과(Relative mRNA level : 상대적인 RNA 레벨)를 종축에 나타낸다. 각각 샘플수는 4로 통계 해석을 행하고 있다. (d) 상기 세포에 표시의 Toll-like 리셉터 아고니스트를 첨가하여 6시간후의 IFN-α와 IFN-β mRNA 발현을 리얼타임 RT-PCR로 해석하고, β2 마이크로글로불린 또는 글리세르알데히드 3인산 디히드로게나아제의 mRNA 발현으로 표준화한 결과를 종축에 나타낸다. 각각 샘플수는 4로 통계 해석을 행하고 있다. 횡축의 「Stimulated with」는, 어떤 아고니스트(또는 대조로서의 PBS)로 자극했는지를 의미한다.
도 32는 실시예에 있어서, 갈렉틴 9와 M-CSF에 의해 분화된 CD11c 양성 세포가 LPS 자극에 의해 pDC양 대식 세포로 성숙한 것을 나타낸 도면이다. (a) 도 30의 방법으로 M-CSF와 갈렉틴 9에 의해 분화된 대식 세포를 LPS 중에서 24시간 배양하고(컨트롤은 PBS), CD11c, PDCA-1, F4/80 및 Ly-6C의 발현을 플로우 사이타머트리법에 의해 해석한 결과를 나타낸다. (b) 도 30의 방법으로 M-CSF와 갈렉틴 9에 의해 분화된 대식 세포를 LPS 중에서 6시간 또는 24시간 배양하고, 표시의 mRNA 발현을 리얼타임 RT-PCR로 해석한 결과(Relative mRNA level : 상대적인 RNA 레벨)를 종축에 나타낸다. (c) 도 30의 방법으로 M-CSF와 갈렉틴 9에 의해 분화시킨 대식 세포를 LPS로 24시간 배양한(컨트롤은 PBS) 후, I-A/I-E의 발현을 플로우 사이타머트리법으로 해석한 결과의 일례를 나타낸다. 회색의 히스토그램은 아이소타입 컨트롤, 파선의 히스토그램이 PBS 컨트롤, 실선의 히스토그램이 LPS 자극. LPS 처리군과 컨트롤 PBS군(각각 n=4)에서, I-A/I-E 양성 세포의 비율을 막대 그래프로 나타내어, 통계 해석한 결과를 나타낸다.
도 33은 실시예에 있어서, LPS 자극에 의해 보다 성숙한 표현계를 갖게 된 pDC양 대식 세포의 기능을 조사한 결과를 나타낸 도면이다. (a) 도 32의 (a)의 방법으로 LPS 자극을 부여함으로써 성숙시킨 pDC양 대식 세포에 횡축에 표시한 각 TLR 아고니스트(컨트롤은 PBS)를 첨가하고, 18시간 배양한 배양 상청 중의 IFN-α와 IFN-β를 ELISA로 조사한 결과를 나타낸다. 종축은 농도를 나타낸다. 샘플수는 각 4로 통계 해석하고 있다. ***P<0.001. (b) 도 32의 (a)의 방법으로 LPS 자극을 부여함으로써 성숙시킨 pDC양 대식 세포가 NK 세포를 활성화하여 항암 활성을 높이는 것을 조사한 결과를 나타낸다. 좌측 도면 횡축에 표시한 NK는 마우스 림프종 Yac-1 세포와 마우스로부터 조제한 나이브 NK 세포 공배양(Yac-1 : NK = 1 : 30)한 경우, NK+pDC-Mφ는 Yac-1, 나이브 NK 및 성숙한 pDC양 대식 세포를 1 : 30 : 60의 비율로 공배양한 경우, (-)는 Yac-1 단독 배양의 결과로, 각각 5시간 배양후에 세포사를 일으킨 Yac-1 세포의 비율을 플로우 사이타머트리법으로 해석하여 종축에 나타냈다. 샘플수는 각각 4로 통계 해석하고 있다. ***P<0.001. 우측 도면은 나이브 NK 세포와 성숙한 pDC양 대식 세포를 5시간 공배양한 후에 NK 세포의 Granzyme B와 Perforin 발현을 플로우 사이타머트리법으로 조사한 결과를 나타낸다. 샘플수는 각각 4로 통계 해석하고 있다. *P<0.05.
이하, 본 발명에 관해 더욱 상세히 설명한다. 단, 본 발명은 이하의 설명에 의해 한정되지 않는다.
본 발명자들은 예의 연구를 하여, 갈렉틴 9에 의한 면역 제어의 상세한 것을 명확하게 하는 것, 그 중에서도 TH17과 Treg 세포의 분화 제어의 상세한 것과, 생체내에서 갈렉틴 9를 분비하여, 면역 반응을 제어하는 세포의 동정에 주력했다. 이런 가운데 본 발명자들은, 갈렉틴 9를 분비하는 신규의 CD4 양성 T 세포(THGAL9 세포)를 동정하는 것에 성공하여, 이 세포가 TH17과 Treg 세포의 분화를 제어하는 것을 밝혔다. 또한 본 발명자들은 in vitro에 있어서 THGAL9 세포가 갈렉틴 9의 첨가로 증가하는 것을 발견했다. THGAL9 세포는, 세포 표면에 갈렉틴 9를 발현하고 있을 뿐만 아니라, 이미 알려진 Tr1 세포 마커도 발현하고 있고, 또 IL-10을 분비한다는 점에서 현시점에서 정의되는 Tr1 세포와 동일 또는 그 부분 집단일 가능성이 시사되었다. 그 경우, 갈렉틴 9는 Tr1 세포의 마커로서도 유용하고, Tr1 세포의 정제와 그 치료로의 응용도 매우 중요해진다. 또한, 본 발명에 있어서, 「세포 표면」은 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, 세포막의, 세포 외부를 마주하는 측의 표면을 말한다. 즉, 갈렉틴 9를 세포 표면에 발현하고 있는 상태란, 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, 갈렉틴 9를 세포막 또는 그 표면에 발현하고 있고, 갈렉틴 9의 전체 또는 일부를 세포밖에 노출시키고 있는 상태를 말한다.
본 발명자들은, 자가 면역 질환 모델의 하나인 마우스 EAE 모델을 이용하여 갈렉틴 9에 의한 TH17 세포 분화 억제와 Treg 세포 분화 촉진은 IL-2에 의존하지만 Tim-3에는 의존하지 않는 것을 밝혔다. 한편, 갈렉틴 9는, 분화된 Tim-3 양성 TH17 세포에 Tim-3 의존적인 아포토시스를 유도했다. 본 발명자들은, CD4 양성 T 세포 중에, 갈렉틴 9를 세포 표면에 발현한 집단이 있는 것을 발견했다. 이하에 있어서, 갈렉틴 9를 세포 표면에 발현한 CD4 양성 T 세포를 「THGAL9 세포」라고 하는 경우가 있다. THGAL9 세포를 TCR로 자극하면, 예컨대, CD25의 발현 상승에 이어서 갈렉틴 9나 IL-10을 분비하는 것이 가능하다. Treg 세포도 IL-10을 분비하는 경우가 있지만, THGAL9 세포는 Treg의 마커인 Foxp3을 발현하지 않아, Treg 세포와는 상이한 세포라고 생각되었다. THGAL9는 이미 알려진 IL-10 생성 타입 1 제어성 T 세포(Tr1 세포) 마커를 전부 발현했다. 그런데, 이들 Tr1 마커는, TCR 자극을 받은 대부분의 CD25 양성 CD4 세포가 발현 유도하기 때문에 Tr1의 결정적인 마커는 아니었다. 흥미롭게도 THGAL9 이외의 CD4+ T 세포도 세포 내부에는 THGAL9와 동등량의 갈렉틴 9를 발현했다. THGAL9 세포를 TH17 세포 분화에 커미트(commit)한 나이브 T 세포와 공배양하면 IL-17의 생성을 억제하고, Treg 세포를 증가시켰다. 이러한 작용은 재조합체 갈렉틴 9와 동일하며, 생체내에서 갈렉틴 9의 분비를 통한 면역 제어를 행하는 세포가, THGAL9 세포인 것이 강하게 시사되었다. 또, 인간에게도 동일한 성질을 갖는 THGAL9 세포가 존재하는 것이 시사되었다. 이상의 지견은, 세포 표면의 갈렉틴 9는 Tr1의 우수한 마커이며, 나아가 THGAL9 세포는 자가 면역 질환, 알러지 질환이나 종양, 그 밖의 질환 치료에 직접 또는 간접적으로 사용 가능한 매우 유용한 세포인 것을 나타내는 것이다.
또한, 본 발명자들은, THGAL9 세포에 의한 TH17 세포 분화 억제는 갈렉틴 9의 저해제에 의해 억제되지만, IL-10이나 TGF-β 저해제에서는 억제되지 않는 것을 나타내어, 본 억제에 있어서는 갈렉틴 9가 활성의 본체인 것을 밝혔다.
또한, 본 발명자들은, CD4 양성 T 세포 이외의 다른 T 세포, γδT 세포, 내츄럴 킬러 세포(NK 세포), B 세포 등에 있어서도, 마찬가지로, 세포 표면에 갈렉틴 9를 발현하고 있는 세포가 존재하는 것을 발견하여, 본 발명의 세포를 발명하였다. 본 발명의 세포는, 전술한 바와 같이, 갈렉틴 9를 포함하는 세포로서, 상기 갈렉틴 9를 세포 표면에 발현하고 있는 것을 특징으로 하며, 그 외에는 특별히 한정되지 않는다.
본 발명의 세포가 갈렉틴 9를 세포 표면에 발현하고 있는 것은, 본 발명의 세포가 갈렉틴 9를 분비하는 세포인 것을 증명하고 있는 것이라고 생각된다. 즉, 세포 내부의 갈렉틴 9가 분비되어 세포 외부에 배출되는 과정에서, 세포 표면에서의 갈렉틴 9 발현이 관찰된다고 생각된다. 단, 이 설명은, 가능성이 있는 메커니즘의 하나를 나타내는 것이며, 본 발명의 세포는 이 설명에 의해 한정되지 않는다.
본 발명의 세포(THGAL9 세포 등)는, 예컨대, 자가 면역 질환, 알러지 질환이나 종양, 그 밖의 질환 치료에 직접 또는 간접적으로 사용 가능한 매우 유용한 세포이며, 예컨대, 면역 제어를 하여 병의 예방ㆍ치료에 유용하고, 또, 예컨대, 감염증 대책, 면역 질환, 장기 이식 등의 의료 분야, 나아가, 분석, 바이오 등의 분야에 이용하는 시약 등으로서도 유용하다.
또한, 본 발명에 있어서 「갈렉틴 9」란, 천연(야생형) 갈렉틴 9에만 한정되지 않고, 예컨대, 천연(야생형) 갈렉틴 9와 실질적으로 동등한 활성을 갖는 갈렉틴 9 개변체(배리언트) 등이어도 좋다. 갈렉틴 9 개변체는, 예컨대, 갈렉틴 9의 당쇄 인식 부위가 보유하는, 특정한 당쇄에 대하여 특이적으로 결합한다고 하는 활성 또는 그것과 유사한 활성(본 활성 중에는 정성적인 활성 및/또는 정량적인 활성이 포함되어도 좋음)을 제공하는 물질이어도 좋다. 갈렉틴 9(야생형 갈렉틴 9)는, 예컨대, 특정한 세포에 대하여 아포토시스 유도 활성을 갖지만, 본 발명에 있어서, 상기 갈렉틴 9 개변체는 야생형 갈렉틴 9가 갖는 아포토시스 유도 활성 또는 그것과 유연(類緣)한 활성을 갖는 것이어도 좋고, 갈렉틴 9가 갖는 생물 활성이 개변 또는 수식되어 있는 것이어도 좋은데, 이는 어떤 경우에는 바람직하다. 본 발명에 있어서, 갈렉틴 9 개변체란, 생물 활성을 갖는 시약으로서, 임상 검사의 분야, 분석의 분야, 또는 의학 또는 의약 등의 분야에서, 야생형 갈렉틴 9와 동등 또는 야생형 갈렉틴 9보다는 바람직한 성질을 나타내는 것이어도 좋다.
본 발명에 있어서 「갈렉틴 9 개변체」는, 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, 특허문헌 1에 기재된 갈렉틴 9 개변체 등이어도 좋고, 보다 구체적으로는, 예컨대 이하와 같다. 갈렉틴 9 개변체는, 예컨대, 야생형 갈렉틴 9 또는 그것과 실질적으로 동등한 활성을 갖는 단백질의 링크 펩티드 또는 그 근방 영역이 개변되어 있는 단백질 또는 그의 염, 야생형 갈렉틴 9 또는 그것과 실질적으로 동등한 활성을 갖는 단백질의 링크 펩티드 또는 그 근방 영역의 아미노산 서열에 있어서 1개 또는 그 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 야생형 갈렉틴 9와 비교하여 적어도 링크 펩티드에 대한 분해 감수성이 개질되어 있는 등의 개변이 실시된 단백질 또는 그의 염, 야생형 갈렉틴 9와 실질적으로 동등한 활성을 갖는 단백질이고 또한 갈렉틴 9의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상의 상동성, 또는 적어도 75% 이상의 상동성, 또는 적어도 80% 이상의 상동성, 또는 적어도 85% 이상의 상동성, 또는 적어도 90% 이상의 상동성, 또는 적어도 95% 이상의 상동성을 갖는 단백질 또는 그의 염, (1) 야생형 갈렉틴 9의 N 말단측의 당쇄 인식 영역(NCRD) 또는 그것과 실질적으로 동등한 활성을 갖는 폴리펩타이드와 (2) 야생형 갈렉틴 9의 C 말단측의 당쇄 인식 영역(CCRD) 또는 그것과 실질적으로 동등한 활성을 갖는 폴리펩타이드를, (3) 야생형 갈렉틴 9의 링크 펩티드의 아미노산 서열에 있어서 1개 또는 그 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어진 개변 링크 펩티드를 통해 결합되어 있는 단백질 또는 그의 염 등이어도 좋다.
바람직한 양태에서는, 갈렉틴 9 개변체는, 예컨대, (1) 야생형 갈렉틴 9의 NCRD로서 하기 서열번호 7에 나타나 있는 아미노산 서열 또는 그 서열에 있어서 1개 또는 그 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 것, 또는, 하기 서열번호 7에 나타나 있는 아미노산 서열에 대하여 적어도 70% 이상의 상동성, 또는 적어도 75% 이상의 상동성, 또는 적어도 80% 이상의 상동성, 또는 적어도 85% 이상의 상동성, 또는 적어도 90% 이상의 상동성, 또는 적어도 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 가지고, 또한, 락토스 결합능을 갖는 것으로서, (2) 야생형 갈렉틴 9의 CCRD로서 하기 서열번호 8에 나타나 있는 아미노산 서열 또는 그 서열에 있어서 1개 또는 그 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 것, 또는, 하기 서열번호 8에 나타나 있는 아미노산 서열에 대하여 적어도 70% 이상의 상동성, 또는 적어도 75% 이상의 상동성, 또는 적어도 80% 이상의 상동성, 또는 적어도 85% 이상의 상동성, 또는 적어도 90% 이상의 상동성, 또는 적어도 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 가지고, 또한, 락토스 결합능을 갖는 것으로서, (3) 상기 (1)과 (2)를 결합하고 있는 링크 영역으로서 하기 서열번호 9에 나타나 있는 아미노산 서열 또는 그 서열에 있어서 1개 또는 그 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 것이고, 바람직하게는 매트릭스 메탈로프로테아제 등의 단백질 분해 효소에 대하여 네이티브한(야생형의) 갈렉틴 9보다 안정화되어 있는 것을 들 수 있다. 상기 링크 영역(3)으로는, 하기 서열번호 9에 나타나 있는 아미노산 서열 중의 아미노산 잔기가 1개 이상(예컨대, 1∼2개, 바람직하게는 3∼4개, 더욱 바람직하게는 5∼6개, 더욱 바람직하게는 7∼8개, 특히는 1∼9개 등) 결실되어 있는 결실 유연체, 상기 아미노산 잔기의 1개 이상(예컨대, 1∼9개, 바람직하게는 1∼8개, 더욱 바람직하게는 1∼6개, 더욱 바람직하게는 1∼4개, 특히는 1∼2개 등)이 다른 잔기로 치환되어 있는 치환 유연체, 1개 이상(예컨대, 1∼60개, 바람직하게는 1∼40개, 더욱 바람직하게는 1∼20개, 더욱 바람직하게는 1∼10개, 특히는 1∼5개 등)의 아미노산 잔기(단, 하기 서열번호 10 및 11에 나타나 있는 아미노산 서열 중 하기 서열번호 9에 나타나 있는 아미노산 서열을 제외한 부분으로 나타낸 것은 제외함)가 부가되어 있는 부가 유연체도 포함한다. 대표적인 경우, 상기 링크 영역(3)으로는, 하기 서열번호 9에 나타나 있는 아미노산 서열을 HM, RIP 또는 임의의 2 아미노산의 서열로 치환한 것 등을 들 수 있다. 아미노산의 치환, 결실 또는 삽입은, 폴리펩티드의 생리적인 특성이나 화학적인 특성에 큰 변화를 생기지 않게 하는 것일 수도 있고, 어떤 경우에는 바람직한 변화를 주는 것일 수 있다. 상기 아미노산 서열 중의 아미노산의 치환체로는, 그 아미노산이 속하는 곳의 클래스 중의 다른 아미노산류에서 선택할 수 있다. 예컨대, 비극성(소수성) 아미노산으로는, 알라닌, 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 트립토판, 메티오닌 등을 들 수 있고, 극성(중성)으로는, 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 글루타민 등을 들 수 있고, 양(陽)전하를 갖는 아미노산(염기성 아미노산)으로는, 아르기닌, 리신, 히스티딘 등을 들 수 있고, 음(陰)전하를 갖는 아미노산(산성 아미노산)으로는, 아스파라긴산, 글루타민산 등을 들 수 있다.
또, 상기 링크 영역(3)으로는, 하기 서열번호 10 또는 11에 나타나 있는 아미노산 서열을, 하기 서열번호 9에 나타나 있는 아미노산 서열 부분을 제외하고, HM, RIP 또는 임의의 2 아미노산의 서열로 치환한 것, 하기 서열번호 10 또는 11에 나타나 있는 아미노산 서열 중 하기 서열번호 9에 나타나 있는 아미노산 서열 부분을 제외하고 그 중의 6 아미노산을 남기고, 그 이외의 잔기를 삭제한 것 등을 들 수 있다. 또, 상기 링크 영역(3)으로는, 하기 서열번호 10 또는 11에 나타나 있는 아미노산 서열 중의 아미노산 잔기(단, 예컨대 하기 서열번호 9에 나타나 있는 아미노산 서열 부분을 제외하고, 또는, 하기 서열번호 10의 경우, 하기 서열번호 11에 나타나 있는 아미노산 서열 부분을 제외해도 좋음)가 1개 이상(예컨대, 1∼5개, 바람직하게는 3∼10개, 더욱 바람직하게는 5∼15개, 더욱 바람직하게는 7∼20개, 특히는 1∼32개 등) 결실되어 있는 결실 유연체, 상기 아미노산 잔기의 1개 이상(예컨대, 1∼9개, 바람직하게는 1∼8개, 더욱 바람직하게는 1∼6개, 더욱 바람직하게는 1∼4개, 특히는 1∼2개 등)이 다른 잔기로 치환되어 있는 치환 유연체, 1개 이상(예컨대, 1∼60개, 바람직하게는 1∼40개, 더욱 바람직하게는 1∼20개, 더욱 바람직하게는 1∼10개, 특히는 1∼5개 등)의 아미노산 잔기(단, 하기 서열번호 10 및 11에 나타나 있는 아미노산 서열 중 하기 서열번호 9에 나타나 있는 아미노산 서열을 제외한 부분으로 나타내는 것은 제외)가 부가되어 있는 부가 유연체도 포함한다.
예컨대, 천연(야생형)의 인간 갈렉틴 9 단백질의 특징인 도메인 구조 또는 당 결합능이 유지되고 있는 상기 변이체는, 모두 본 발명에 포함된다. 또 본 발명의 펩티드 또는 폴리펩티드는 천연의 인간 갈렉틴 9 단백질과 실질적으로 동등한 1차 구조 콘포메이션(conformation) 또는 그 일부를 갖고 있는 것도 포함되어도 좋다고 생각되고, 또한 천연의 것과 실질적으로 동등한 생물학적 활성을 갖고 있는 것도 포함되어도 좋다고 생각된다. 또한 천연적으로 생기는 변이체의 하나일 수도 있다. 본 발명에 있어서, 인간 유래의 단백질(또는 펩티드 또는 폴리펩티드)은, 예컨대, WO02/37114A1의 서열표의 SEQ ID NO : 1∼3로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열에 대하여, 60%, 경우에 따라서는 70%보다 높은 상동성을 갖고 있는 것을 들 수 있고, 보다 바람직하게는 그것에 대하여, 80% 또는 90% 이상의 상동 아미노산 서열을 갖는 것을 들 수 있다. 본 발명에 있어서, 인간 유래의 단백질의 일부의 것이란, 상기 인간 유래의 단백질의 일부의 펩티드(즉, 상기 단백질의 부분 펩티드)이며, 본 발명의 갈렉틴 9 단백질과 실질적으로 동등한 활성을 갖는 것이라면 어느 것이어도 좋다. 예컨대, 상기 본 발명의 단백질의 부분 펩티드는, 상기 인간 갈렉틴 9의 구성 아미노산 서열 중 적어도 5개 이상, 바람직하게는 20개 이상, 더욱 바람직하게는 50개 이상, 보다 바람직하게는 70개 이상, 더 바람직하게는 100개 이상, 어떤 경우에는 200개 이상의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 들 수 있고, 바람직하게는 그들은 연속된 아미노산 잔기에 대응하는 것이거나, 또는, 예컨대 상기 WO02/37114A1의 서열표의 SEQ ID NO : 1∼3 중 어느 하나로 나타내는 아미노산 서열 중 대응하는 영역에 대한 상동성에 관해, 상기와 동일한 상동성을 갖는 것을 들 수 있다.
(서열번호 7)
Figure pct00001

(서열번호 8)
Figure pct00002

(서열번호 9)
Figure pct00003

(서열번호 10)
Figure pct00004

(서열번호 11)
Figure pct00005

본 발명에 있어서, 갈렉틴 9 개변체의 활성과 야생형(천연) 갈렉틴 9의 활성이 「실질적으로 동등」이란, 예컨대, 상기 갈렉틴 9 개변체가 천연형 갈렉틴 9의 당쇄 인식 활성을 유지하고 있는 것을 말한다. 다른 관점에서는, 갈렉틴 9 개변체의 활성과 야생형(천연) 갈렉틴 9의 활성이 「실질적으로 동등」이란, 예컨대, 단백질의 활성, 보다 구체적으로는, 예컨대, 소정의 세포 상해 활성, 아포토시스 유기 활성, 항염증 활성, 항알러지 활성, 면역 조절 활성, 당쇄 결합 활성, 생리적인 활성, 생물학적인 활성이 실질적으로 동일하다는 것을 의미한다. 또한, 그 용어의 의미 중에는, 실질적으로 동질의 활성을 갖는 경우를 포함하고 있어도 좋고, 상기 실질적으로 동질의 활성으로는, 결합 활성, 세포 상해 활성, 아포토시스 유기 활성 등을 들 수 있다. 상기 실질적으로 동질의 활성이란, 이들 활성이 성질적으로 동질인 것을 나타내고, 예컨대, 생리적으로, 약리학적으로 또는 생물학적으로 동질인 것을 나타낸다. 예컨대, 결합 활성, 세포 상해 활성, 아포토시스 유기 활성 등의 활성이, 동등(예컨대, 약 0.001∼약 1000배, 바람직하게는 약 0.01∼약 100배, 보다 바람직하게는 약 0.1∼약 20배, 더욱 바람직하게는 약 0.5∼약 2배)한 것이 바람직하지만, 이들 활성의 정도, 단백질의 분자량 등의 양적인 요소는 상이해도 좋다.
본 발명의 그 밖의 목적, 특징, 우수성 및 본 발명이 갖는 관점은, 이하의 기재로부터 당업자에게는 명백할 것이다. 그러나, 이하의 기재 및 구체적인 실시예 등의 기재를 포함한 본건 명세서의 기재는 본 발명의 바람직한 양태를 나타내는 것이며, 설명을 위해서만 나타내고 있는 것이라는 것을 이해하기 바란다. 본 명세서에 개시한 본 발명의 의도 및 범위내에서, 여러가지 변화 및/또는 개변(또는 수식)을 이루는 것은, 이하의 기재 및 본 명세서의 그 밖의 부분으로부터의 지식에 의해, 당업자에게는 용이하게 명백할 것이다. 본 명세서에서 인용되고 있는 모든 특허문헌 및 참고문헌은, 설명의 목적으로 인용되고 있는 것이며, 이들은 본 명세서의 일부로서 그 내용은 여기에 포함시켜 해석되어야 하는 것이다.
본 발명에서는 갈렉틴 9를 세포 표면에 발현하는 CD4 양성 T 세포를 발견하고, 그것이 갈렉틴 9를 분비하여 TH17 세포와 Treg 세포의 밸런스를 제어하는 것을 발견하여 THGAL9 세포로 명명했다. THGAL9 세포는 IL-10을 생성하는 것 및 세포 표면에 Latency-associated peptide(LAP), NKG2D, lymphocyte activation gene-3(LAG-3), Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4(CTLA-4)를 발현하고 있는 점에서, Foxp3 음성의 억제성 T 세포, 즉 Tr1 세포(비특허문헌 20∼22)와 동일 또는 그 부분 집단일 가능성이 시사되었다.
Tr1 세포는 형질 세포양 수상 세포에 의해 유도되는 면역 관용에 중요한 역할을 하는 세포이며(비특허문헌 20, 23∼25, 15∼18), in vitro에서는 나이브 CD4+ T 세포를 IL-27 또는 Vitamin D3/dexamethasone의 존재하에 TCR 자극을 부여함으로써 유도된다(비특허문헌 26∼29). Tr1 세포의 세포 표면 마커로서 전술한 LAP, NKG2D, LAG-3, CTLA-4가 알려져 있지만, 이들은 IL-10을 생성하지 않는 CD4+CD25+ 세포에도 발현하고 있기 때문에, 신뢰할만한 Tr1 세포 마커는 그 기능의 본체라고 생각되고 있는 억제성 사이토카인 IL-10의 높은 발현이다. 그런데 IL-10의 생성은 Tr1 세포뿐만 아니라 Treg 세포를 포함하는 다른 세포군에도 보이기 때문에, 확정적인 마커는 될 수 없고(비특허문헌 30∼31), 또 세포 내에 존재하는 IL-10의 발현을 지표로, 살아있는 채로 세포를 간편하게 정제하는 기술도 존재하지 않는 것은, Tr1 연구 및 그 응용을 어렵게 하고 있다.
본 발명에서는, 전술한 바와 같이, 세포 표면에 갈렉틴 9를 발현하는 THGAL9 이외의 면역 세포도 발견했다. 이들 세포군에 관해서도 THGAL9 세포와 마찬가지로 진단의 대리 표지자로서, 또는 세포 표면의 갈렉틴 9를 이용하여 정제하여 세포 요법에 응용할 가능성이 시사된다.
본 발명은, 갈렉틴 9를 분비하는 세포 및 그 응용 기술을 제공한다. 예컨대, 본 발명은, Gal-9와 IL-10을 분비하는 타입 1 제어성 T 세포 및 그 응용 기술을 제공한다. 본 발명은, 갈렉틴 9를 분비할 수 있는 신규 T 세포(THGAL9 세포)를 동정하고, 그것을 이용 가능하게 하는 기술을 제공하고 있다. 상기 THGAL9 세포를 이용하여, TH17 세포와 Treg 세포의 분화를 제어하는 기술도 제공한다. THGAL9 세포는, 세포 표면에 갈렉틴 9를 발현하고 있을 뿐만 아니라, 예컨대, 기지의 Tr1 세포 마커도 발현하고, 또 IL-10을 분비할 수 있다. 본 발명에서는, 갈렉틴 9를 Tr1 세포의 마커로서 이용하여, 상기 Tr1 세포를 정제하고 그것을 치료에 대한 응용에 이용하는 기술도 제공한다. 본 발명에서는, THGAL9 세포를 TCR로 자극하여, CD25의 발현 상승, 갈렉틴 9나 IL-10의 분비 유도를 행하는 기술을 제공한다. 또, 본 발명에서는, THGAL9 세포를 TH17 세포 분화에 커미트한 나이브 T 세포와 공배양함으로써, IL-17의 생성을 억제하거나, 및/또는, Treg 세포를 증가시키는 기술도 제공하고 있다. 본 발명은, 또 생체내에서 THGAL9 세포로 면역 제어를 행하는 기술을 제공한다. 또, 본 발명은, 세포 표면의 갈렉틴 9를 마커로서 사용하여, 제어성 면역 세포를 분별하는 세포 분별 기술이나, 나아가, 세포 표면의 갈렉틴 9를 마커로서 사용하여, IL-10 생성 타입 1 제어성 T 세포(Tr1 세포)를 분별하는 Tr1 세포 분별 기술을 제공한다.
본 발명에서 발견된 세포, 예컨대, THGAL9 세포는, 생물 활성을 갖는 시약으로서, 진단제, 치료제 등으로서, 임상 검사의 분야, 분석의 분야, 또는 의학 또는 의약 등의 분야에서 유용하다.
본 발명의 세포(예컨대, THGAL9 세포)를, 생체(동물)의 조직으로부터 분리(또는 단리)하는 방법은, 특별히 한정되지 않고, 당업자라면, 본원 명세서 및 도면의 기재, 그리고 본원 출원시의 기술 상식에 기초하여, 과도한 시행착오없이 행할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 세포(예컨대, THGAL9 세포)를 생체(동물)의 조직으로부터 분리(또는 단리)하는 방법은, 후술하는 실시예에 기재된 바와 같이, 세포를 항갈렉틴 9 항체로 염색하고, 소팅에 의해 분리(또는 단리)하는 방법이어도 좋다.
본 발명의 세포(예컨대, THGAL9 세포)의 제조 방법도 특별히 한정되지 않고, 예컨대, 이미 본 발명의 세포를 갖고 있는 동물의 조직으로부터 본 발명의 세포를 분리(또는 단리)하는 방법이어도 좋다. 또, 이것에 더하여, 또는 이것 대신에, 본 발명의 세포의 제조 방법은, 갈렉틴 9를 세포 표면에 발현하지 않은 세포의 세포 표면에 갈렉틴 9를 발현시켜 본 발명의 세포로 변환하는 공정을 포함하고 있어도 좋다. 이 공정은, 예컨대 생체내(in vivo)에서 행할 수도 있고, 생체외(in vitro)에서 행할 수도 있다. 생체내(in vivo)에서 행하는 방법으로는, 예컨대, 본 발명의 상기 제1 제조 방법과 같이, 동물에게 갈렉틴 9를 투여함으로써, 상기 동물에서의 적어도 일부의 세포의 세포 표면에 갈렉틴 9를 발현시키는 방법이어도 좋다. 생체외(in vitro)에서 행하는 방법으로는, 예컨대, 본 발명의 상기 제2 제조 방법과 같이, 동물의 세포를 갈렉틴 9의 존재하에 배양함으로써, 상기 동물의 세포의 세포 표면에 갈렉틴 9를 발현시키는 방법이어도 좋다. 또, 본 발명의 상기 제2 제조 방법은, 예컨대, 상기 동물의 세포가, 세포 표면에 갈렉틴 9를 발현하고 있는 세포를 포함하고, 상기 동물의 세포를 갈렉틴 9의 존재하에 배양함으로써, 세포 표면에 갈렉틴 9를 발현하고 있는 세포의 비율을 증가시키는, 본 발명의 세포의 제조 방법이어도 좋다.
본 명세서에서 사용한 용어 「진단제」란, 본 발명에서의 진단에 있어서 사용하는 하나 또는 그 이상의 그 진단 행위에 기여하는 임의의 약제를 말한다. 이러한 것의 진단에 대한 사용은, 갈렉틴 9 생성 세포의 존재를 결정하기 위한 방법 또는 갈렉틴 9 결합성 물질을 제시하는 세포의 존재를 결정하기 위한 방법을 포함하는 것이어도 좋다. 진단제로는, 예컨대, 세포 표면에 갈렉틴 9를 발현하는 세포 또는 그 세포 호모제네이트로 이루어진 군에서 선택된 것을 함유하는 것을 들 수 있다.
본 명세서에서 사용한 용어 「치료제」란, 본 발명에서의 치료에 있어서 사용하는 하나 또는 그 이상의 그 치료 행위를 달성하거나 또는 달성하는 데 기여하는 임의의 약제이어도 좋다. 예컨대, 치료제가 세포 표면에 갈렉틴 9를 발현하는 세포 또는 그 세포 호모제네이트인 경우, 그 약제는 포유동물에 투여할 수 있다. 상기 치료제는, 단독으로, 또는 다른 약제(예컨대, 갈렉틴 9 개변체의 투여와 함께 사용되고 또한 특정한 종양 또는 자가 면역 등에 대한 그 밖의 공지의 처치법에 사용되는 약물, 또는 포유동물에서의 갈렉틴 9의 발현을 용이하게 행할 수 있는 유전자 송달 비히클 등)와 조합하여, 그 치료 목적을 달성하는 것이어도 좋다. 예컨대, 상기 치료제는, 다른 목적을 위해 개발된 갈렉틴 9 개변체를 포함하는 것이어도 좋고, 나아가, 갈렉틴 9의 아고니스트, 갈렉틴 9 활성을 수식 또는 조절하는 약물을 포함하는 것이어도 좋고, 예컨대, 유기 저분자 화합물 또는 물질, 펩티드, 펩티드양 화합물 또는 물질, 갈렉틴 9 개변체 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드, 갈렉틴 9 개변체 폴리펩티드, 프로테아제에 대하여 네이티브한 갈렉틴 9보다 안정화되어 있는 갈렉틴 9 개변체의 키메라체 또는 변이체 등을 발현하고 또한 형질 전환된 세포이어도 좋다.
본 명세서에서 「환자」란, 살아있는 생물로 임의의 치료 또는 예방 처치 가능한 것을 가리켜도 좋고, 진핵 생물을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 예컨대, 환자인 진핵 생물로는 척추 동물이어도 좋다. 따라서, 예컨대, 환자는 바람직하게는 포유동물이다. 포유동물로는, 예컨대 인간을 들 수 있다.
본 발명의 치료제 및/또는 진단제의 일반적 제조 및 사용법을 이하에 설명한다. 하나의 양태에서는, 본 발명은, 갈렉틴 9가 보유하는 생리 활성 또는 생물 활성의 부족 또는 결여에 기인하는 질환ㆍ병ㆍ이상 상태를 처치하는 기술을 제공한다. 상기 처치 기술로는, 예컨대, 본 발명의 세포(예컨대, THGAL9 세포 등) 함유 치료제를 제공하는 공정 및/또는 상기 질환 등을 갖는 포유동물에게 유효량의 본 발명의 세포(예컨대, THGAL9 세포 등) 함유 치료제를 투여하는 공정 등을 들 수 있다. 본 발명의 세포(예컨대, THGAL9 세포 등)는, 악성 종양 세포에 대한 세포 상해 활성, 악성 종양 세포에 대한 아포토시스 유도 활성, 악성 종양 세포에 대한 항종양 활성(항암 활성), 활성화 T 세포의 아포토시스 유도 활성, 특히 CD4 양성 T 세포의 아포토시스 유도 활성, 면역 조절 활성, 항염증 작용, 항알러지 작용을 발휘하도록 사용해도 좋고, 항종양제(항암제), 항알러지제, 면역 조절제, 자가 면역 질환용제, 항염증제 및 부신 피질 스테로이드 호르몬 대체 용제로서 기대할 수 있다.
상기 처치 기술은, 활성화 T 세포가 현저한 자가 면역 질환을 처치하는 방법을 포함한다. 「자가 면역 질환」 및 「자가 면역」이란 모두 포유동물에서의 자가 면역에 의해 특징지어지는 장애(이것은, 자가 성분에 대한 면역계의 응답)를 말한다. 자가 면역 응답은, 임상적 징후를 나타내는 증상으로 진전할 수 있는 것이다. 엄밀하게 말하면, 이식 거절은 자가 면역 반응은 아니지만, 환자가 증상적으로 세포, 조직 또는 기관을 치환하거나 또는 이식하는 외과 수술을 받는 경우, 동종 이식을 받는 몸은, 외래 이식에 대하여 면역학적으로 반응한다. 종의 하나의 멤버로부터 다른 종으로의 세포, 조직 또는 기관의 동종 이식중에, 수용체(레시피언트)에서는 이식된 세포, 조직, 또는 기관을 거절하기에 충분한 면역 응답이 생기는 경우에는 「이식 거절」이 발생하는 것이다.
본 발명의 방법 및 치료제에 의해 처치할 수 있는 「종양」의 예로는, 악성 종양이 포함되어 있어도 좋고, 예컨대, 전이를 하는 종양은 악성 종양이며, 일반적으로 그 악성 종양은 상피성과 비상피성인 것이 있다고 하며, 어떤 경우에는, 암, 육종, 백혈병 등으로 구분하여 생각되는 경우도 있지만, 단순히 「암」이라고 칭한 경우, 일반적으로는 악성 종양을 가리키는 경우가 많다. 본 명세서에서 「암」이란, 넓은 의미로 해석해도 좋으며, 단순히 상피성의 악성 종양으로 해석해서는 안된다. 본 명세서에 있어서 「암」이란, 상피성 악성 종양 및 비상피성 악성 종양(종양 형성성인 것도 비형성성인 것도 포함)을 포함하고 있어도 좋고, 피부암(멜라노마를 포함해도 좋음), 유방암, 난소암, 자궁암, 고환 악성 종양, 전립선암, 방광암, 신장암, 갑상선암, 인두ㆍ후두암, 설암, 상악암, 식도암, 위암, 결장ㆍ직장암, 폐ㆍ기관지암, 간암(간세포암, 간내 담관암을 포함), 간외 담관ㆍ담낭암, 췌장암, 백혈병, 악성 림프종, 형질 세포종, 골육종, 연골육종, 평활근육종, 횡문근육종, 지방육종, 섬유육종, 악성 혈관종, 악성 혈관 내피종, 뇌종양(뇌수막종, 신경교종, 성상세포종 등을 포함) 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않고, 본 발명의 세포(예컨대, THGAL9 세포 등)를 사용함으로써 바람직한 결과를 얻을 수 있는 것, 나아가 본 발명의 세포(예컨대, THGAL9 세포 등)가 관여하여 어떠한 생리적 또는 생물학적인 응답을 얻을 수 있는 것은 포함되어도 좋다고 이해되어야 한다.
본 발명의 방법 및 치료제에 의해 처치할 수 있는 「자가 면역 질환」의 예로는, 다발성 경화증, 하시모토 갑상선염, 전신성 에리테마토데스(SLE), 굿페스쳐(Goodpasture) 증후군, 천포창, 리셉터 자가 면역, 자가 면역 용혈성 빈혈, 자가 면역 혈소판 감소성 자반병, 변형성 관절증, 만성 관절염 류마티스, 항콜라겐 항체에 의한 강피증(schleroderma), 복합화 결합 조직병, 다발성 근염, 악성 빈혈, 특발성 애디슨병, 자발성 불임증, 사구체 신염, 수포성류 천포창, 아드레날린 작용성 약물 내성, 만성 활성 간염, 원발성 담즙성 간경변, 자가 면역 베이스의 내분비선 부전, 백반, 맥관염, 심근경색 후유증(post-myocardial infarction), 심장 천공 증후군, 담마진, 아토피성 피부염, 자가 면역 베이스의 천식, 자가 면역 베이스의 염증성 반응, 육아종증 장애, 강직성(alkylizing) 척추염, 연쇄구균 감염후(poststreptococcal) 사구체 신염, 자가 면역 용혈성 빈혈, 뇌염, 림프종에 대한 2차적 자가 면역 반응, 변성 장애, 위축성 장애 등을 들 수 있다. 리셉터 자가 면역을 나타내는 자가 면역 질환으로는, 예컨대, 그레이브스병, 중증 근무력증, 인슐린 내성증 등을 들 수 있다. 아드레날린성 약물 내성의 자가 면역 질환으로는, 예컨대, 천식 및 낭포성 섬유증 등을 들 수 있다.
본 발명에서의 다른 자가 면역 질환으로는, 예컨대, 동물 모델이 존재하는 것을 들 수 있고, 예컨대, 쉐그렌 증후군(자가 면역 누선염(dacryodentis) 또는 면역 매개 타액선염), 자가 면역 심근염, 원발성 담즙성 간경변(PBC), 염증성 심장병, 수은 유도성 신(腎)자가 면역, 인슐린 의존성 당뇨병(I형 당뇨병 또는 IDD), 흉선 절제술후 자가 면역, 중추신경계(CNS) 탈수(脫髓) 장애, CNS 낭창, 수면 발작, 면역 매개 PNS 장애, 변형성 관절증, 만성 관절염 류마티스, 포도막염, 수질(髓質) 낭포성 섬유증, 자가 면역 용혈성 질환, 자가 면역 맥관염, 난소 자가 면역 질환, 강피증(scleroderma) 등을 들 수 있다. 중추신경계(CNS) 탈수 장애에 의해 특징지어지는 자가 면역 질환으로는, 예컨대, 다발성 경화증(MS) 등을 들 수 있다. 말초 신경계(PNS) 자가 면역 질환은, 예컨대 길랑바레 증후군(GBS)이어도 좋다.
본 발명은, 암 등의 악성 종양을 포함하는 종양, 알러지성 질환, 염증, 면역 이상, 활성화 림프구(특히는 활성화 T 세포를 들 수 있고, 또 활성화 B 세포를 포함하고 있어도 좋음)를 포함하는 자가 면역 질환 등의 질환이나 병을 앓고 있는 포유동물을, 본 발명의 세포(예컨대 THGAL9 세포 등), 그 파쇄물 및 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 치료제(예컨대, 치료 활성 성분으로서 본 발명의 세포(예컨대, THGAL9 세포 등) 또는 상기 세포 자극제 등을 포함하는 조성물)의 투여에 의해 처치하는 방법을 개시하는 것이다. 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 처치될 수 있는 자가 면역 질환으로는, 임의의 자가 면역 질환 또는 이식 거절(예컨대, 본 명세서 중에 열거되는 자가 면역 질환을 포함하지만, 이들에 한정되지 않음)을 들 수 있다.
본 발명에 관하여, 암 등의 악성 종양 세포를 포함하는 종양 세포에 대하여 세포 상해 작용을 얻거나, 항알러지 작용을 얻거나, 항염증 작용을 얻거나, 면역 이상을 정상화시키거나, 활성화 림프구(특히는 활성화 T 세포를 포함하고 있어도 좋음)에 대하여 아포토시스를 유도시키는 경우도, 상기 자가 면역의 경우와 마찬가지로 이해되어야 한다.
본 발명의 세포(예컨대, THGAL9 세포 등), 그 파쇄물 및 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 것은, 항종양제, 항알러지제, 면역 조절제, 자가 면역 질환용 제제, 항염증제, 부신피질 스테로이드 호르몬과 동일한 활성을 이용하는 약제로서 유망하고, 다음에 나타낸 바와 같은 병적 증상 및 질환에 대하여 유용한 생물 활성을 나타낸다고 생각된다.
염증성 질환에는, 각 장기에서 일어나는 여러가지 급성 및 만성 염증, 알러지성 및 자가 면역성의 염증, 감염증 등이 있다.
급성 및 만성 질환으로는, 폐렴에서는, 예컨대, 기관지염, 기관지 폐렴, 간질성 폐렴, 폐장염, 세기관지염이나 급성 종격염 등을 들 수 있고, 또한 그 밖의 장기의 염증, 예컨대, 심외막염, 심내막염, 심근염, 구내염, 구각염, 편도염, 인두염, 후두염, 식도염, 복막염, 급성 위염, 만성 위염, 급성 장염, 충수염, 허혈성 대장염, 약물성 대장염, 직장염, A형 간염, B형 간염, C형 간염, 극증 간염, 만성 간염 등의 여러가지 급성 및 만성 간염이나 간경변, 담낭염, 급성 췌염, 만성 췌염, 또 급성 및 만성 신염, 막성 신염, 사구체 신염, IgA 신증 등이나, 여러가지 방광염, 뇌수염, 유선염, 피부염, 표층 각막염, 건성 각결막염, 여러가지 중이염이나 비염, 부비강염이나 비용(nasal polyp) 등, 치육염, 치주염, 치주위염 등, 여러가지 다양한 염증이 포함된다.
또, 본 발명의 세포(예컨대, THGAL9 세포 등), 그 파쇄물 및 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 것은, 예컨대, 신경성 염증(예컨대, 신경성 위염, 신경성 방광염 등)에도 효과를 발휘할 수 있다. 예컨대, 갈렉틴 9는 캡사이신 유도 신경성 피부 염증 모델에 있어서, 그 염증 반응에 대한 강한 억제 효과가 보였다. 캡사이신은 말초 신경을 자극함으로써, 신경성 염증이나 통증을 야기하는 물질이다. 캡사이신은, 지각 신경 C 섬유 말단에 저장되어 있는 신경 펩티드인 섭스턴스 P의 유리 자극 작용을 갖는다. 섭스턴스 P는 비만 세포로부터 히스타민을 유리시키는 작용을 가지며, 그 결과 혈관이 확장되고, 부종이 생긴다. 또, 유리된 히스타민에 의해 지각 신경이 자극을 받아, C 섬유 말단으로부터 섭스턴스 P가 방출되고, 그 주위의 비만 세포에 작용하여, 더욱 히스타민을 유리시킨다고 하는 증강 사이클이 성립한다. 갈렉틴은 이 병태 형성의 억제 작용을 갖는다.
또한, 캡사이신은, 감각 신경 종말의 통증 수용 센서인 캡사이신 수용체(바닐로이드 리셉터)에 결합하여 통증을 야기한다. 통증은 화학적 자극(산 등), 열자극(열탕 등)이나 지나친 기계적 자극(타박 등)에 의해 감각 신경 종말이 활성화됨으로써 야기되고, 캡사이신 수용체는 이러한 자극에 의한 통증에도 관여하고 있다. 따라서, 갈렉틴 9가 캡사이신 수용체에 의한 신경 종말의 활성화를 억제하는 것이 시사되어, 암이나 염증에 따른 통증의 경감 등, 진통 작용에 대한 가능성도 기대할 수 있다.
알러지성 염증 질환에는, 전신성 아나필락시스, 기관지 천식, 과민성 폐렴, 화분증, 알러지성 비염, 알러지성 결막염, 면역 복합체가 일으키는 알러지성 질환, 혈관 신경성 부종 등을 들 수 있다.
또, 자가 면역성의 염증(자가 면역 질환)에는, 전신성(만성 관절 류마티스, 전신성 에리테마토데스(에리테마토데스), 결절성 다발성 동맥염, 강피증, 다발성 근염ㆍ피부근염, 쉐그렌 증후군, 베체트병 등), 신경계(다발성 경화증, 중증 근무력증, HAM(HTLV-1 척수증), 근위축성 측삭 경화증 등), 내분비성(바세도우병, 하시모토병, 1형 당뇨병 등), 혈액(특발성 혈소판 감소성 자반병, 자가 면역성 용혈성 빈혈, 재생 불량성 빈혈 등), 호흡기(사르코이도시스, 폐섬유증 등), 소화관(궤양성 대장염, 크론병 등), 간장(자가 면역성 간염, 원발성 담즙성 간경변, 원발성 경화성 담관염, 자가 면역성 담관염 등), 신ㆍ요로계(항호중구 세포질 항체 관련 신염, 혈관염, 굿패스쳐 증후군, 항사구체 기저막 항체병 등) 등이 있다.
감염증은, 병원체가 생체의 세포ㆍ조직ㆍ장기를 상해함으로써 생기는 질환의 총칭이다. 또한, 감염증에 관해서는, 감수 : 마찌나미 리쿠오, 편집 : 하타 준이치, 사카모토 아쯔히코, 「표준병리학(제2판)」, 의학서원, 2002년 3월 15일 발행을 참고로 할 수 있다. 인간에게 감염증을 가져오는 병원체에는, 1) 세균(스피로헤타, 클라미디아, 리케차를 포함), 2) 바이러스, 3) 진균, 4) 식물(조류(藻類)), 5) 원충, 6) 기생충(흡충, 촌충, 선충), 7) 절지 동물이 있다. 각 병원체가 가져오는 주요 질환에는, 세균성 감염증(콜레라, 페스트, 대장균 감염증 등), 스피로헤타 감염증(렙토스피라증 등), 클라미디아 감염증(앵무병 등), 리케차 감염증(발진 티푸스, 파상풍 등), 바이러스성 감염증(대상포진, 바이러스성 출혈열, 광견병 등), 진균증(칸디다증, 크립토콕쿠스증, 아스페르질루스증 등), 원충성 질환(아메바 이질, 말라리아, 톡소플라즈마증 등), 기생충(흡충증, 선충증 등), 기타, 마이코플라즈마 감염증(마이코플라즈마 폐렴 등), 마이코박테리아 감염증(결핵, 비정형 항산균증 등)을 들 수 있다.
암 및 육종에 관해서는, 뇌종양(다형성 교아종 등), 척수 종양, 상악동암, 췌액선암, 치육암, 설암, 구순암, 상인두암, 중인두암, 하인두암, 후두암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 흉막 종양, 암성 복막염, 암성 흉막염, 식도암, 위암, 대장암, 담관암, 담낭암, 췌장암, 간암, 신장암, 방광암, 전립선암, 음경암, 정소 종양, 부신암, 자궁경부암, 자궁체암, 질암, 외음부암, 난소암, 섬모상피종, 악성 골종양, 연부 육종, 유방암, 피부암, 악성 흑색종, 기저 세포종, 백혈병, 골수화성을 수반하는 골수섬유증, 악성 림프종, 호지킨병, 형질세포종, 신경교종 등을 들 수 있다.
본 발명에 의하면, 예컨대, 전술한 바와 같이, 상기 본 발명의 세포를 포함하거나 또는 포함하지 않는 동물 조직에 있어서, 상기 본 발명의 세포 검출 방법에 의해, 상기 본 발명의 세포를 정성적 또는 정량적으로 검출함으로써, 동물의 질환 또는 상기 질환에서 유래하는 증상을 진단할 수 있다. 상기 동물의 질환은, 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, 전술한 각 질환을 들 수 있다. 또, 본 발명에 의하면, 예컨대, 전술한 바와 같이, 동물의 질환의 치료 효과의 판정 방법은, 상기 동물에 대하여 상기 질환의 치료를 행하는 공정과, 상기 치료의 전후에 있어서 각각, 본 발명에 의한 상기 동물의 질환 또는 상기 질환에서 유래하는 증상의 진단 방법에 의해 상기 질환 또는 상기 질환에서 유래하는 증상을 진단하는 공정과, 상기 치료의 전후에서의 상기 진단 결과를 대비하는 공정을 포함하는 방법에 의해, 동물의 질환의 치료 효과를 판정할 수 있다. 상기 동물의 질환은 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 전술한 각 질환을 들 수 있다.
실시예
이하에 실시예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 이 실시예는 단순히 본 발명의 설명을 위해, 그 구체적인 양태의 참고를 위해 제공되고 있는 것이다. 이러한 예시는 본 발명의 특정한 구체적인 양태를 설명하기 위한 것이지만, 본원에서 개시하는 발명의 범위를 한정하거나, 또는 제한하는 것을 나타내는 것은 아니다. 본 발명에서는, 본 명세서의 사상에 기초하는 여러가지 실시형태가 가능한 것은 이해되어야 한다.
이하의 실시예는, 당업자라면, 해당 실시예에서의 상세한 기재 및 본원 출원시의 기술 상식에 기초하여, 과도한 시행착오 없이 실시할 수 있다. 또, 이하의 실시예에 있어서, 관찰된 현상이 발생하는 메커니즘의 고찰을 나타내고 있는 경우는, 그 메커니즘은, 가능성의 하나를 나타내는 것으로서, 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
〔실험 재료 및 방법〕
이하에, 특히 중요한 실험 재료 및 방법의 상세한 것을 기재한다.
(재조합체 갈렉틴 9)
본 실시예에서 이용한 재조합체 갈렉틴 9는, 모두 인간 안정화 갈렉틴 9(G9NC(null))이며, 이미 알려진(비특허문헌 12, 33, 특허문헌 1) 방법에 준하여 조제했다. 표품은 SDS-PAGE 및 쿠마시 브릴리언트블루 염색에 의한 단백질 순도 검정으로 95% 이상, 또 리물루스(Limulus) 비탁 동태 시험에 의한 엔도톡신 혼입량은 1 mg 인간 안정화 갈렉틴당 0.1 ng 이하였다. 또, 인간 안정화 갈렉틴 9의 마우스 Tim-3에 대한 결합 친화성은 마우스 갈렉틴 9와 동등하다. 몰농도의 계산은 분자량 33065로 하여 행했다.
또한, 특허문헌 1에 기재된, 인간 안정화 갈렉틴 9(G9NC(null))의 조제 방법은 하기와 같다.
(A) 갈렉틴 9 개변체 발현 벡터의 구축
발현 벡터의 제작에는,
(1) Jurkat 세포의 poly(A)+RNA 분획으로 조제한 cDNA
(2) pET-11a 벡터(STRATAGENE)
(3) PCR용 프라이머 :
Figure pct00006
를 사용했다.
Jurkat 세포(T 세포 유래 세포)는, 아메리칸ㆍ타입ㆍ컬쳐ㆍ컬렉션(ATCC)으로부터 입수했다. 셀라인은, 10% FCS를 첨가한 RPMI-1640 배지(Sigma, 세인트루이스, 미국) 중에서 5% CO2의 조건하 37℃로 유지했다. Jurkat 세포로부터의 total RNA의 추출은 다음과 같이 하여 행했다. 즉, 10% FBS를 포함하는 RPMI-1640 배지를 이용하여 배양한 Jurkat 세포를 원심하여 수집한다. 10 ml의 PBS로 세포를 2번 세정한다. 세정한 세포의 침전에, 세포 2×108개당 15 ml의 ISOGEN(상품명 : NIPPON GENE)을 첨가하고, 메뉴얼(NIPPON GENE)에 따라서 total RNA를 추출한다. total RNA로부터의 poly(A)+RNA의 정제와 cDNA 합성은, 다음과 같이 하여 행했다. 즉, Jurkat 세포로부터 추출한 total RNA를, 1 mg/ml의 농도가 되도록 DEPC 처리수에 용해한다. PolyATtract mRNA Isolation System(상품명 : Promega)을 이용하고, 메뉴얼에 따라서 total RNA로부터 poly(A)+RNA를 정제한다. 정제한 poly(A)+RNA를 5 ㎍/20 ㎕의 농도가 되도록 DEPC 처리수에 용해한다. First-Strand cDNA Synthesis Kit(상품명 : Amersham Biosciences)를 이용하고, 메뉴얼에 따라서 5 ㎍의 poly(A)+RNA로부터 cDNA를 합성한다(프라이머에는 Not I-d(T)18을 사용한다).
다음으로, 하기 스킴에 나타내는 순서로 pET-11a 벡터의 NdeI-BamHI site에 갈렉틴 9의 N-말단측 당쇄 결합 도메인(N-terminal carbohydrate recognition domain, NCRD)과 C-말단측 당쇄 결합 도메인(CCRD)을 삽입하여, 링커 펩티드를 결여한 개변형 갈렉틴 9(G9NC(null))의 발현 벡터를 제작했다.
Figure pct00007

우선, 갈렉틴 9 cDNA로부터 각각 (1) 인간 갈렉틴 9의 C-말단측 CRD에 대응하는 cDNA와 (2) 인간 갈렉틴 9의 N-말단측 CRD에 대응하는 cDNA를 취득했다. 즉, cDNA로부터 PCR용 프라이머 : G9CCRD5+G9CCRD6을 이용하여 인간 갈렉틴 9의 C-말단측 CRD에 대응하는 cDNA(G9CCRD)를 증폭시켰다. G9CCRD를 제한 효소(NdeI+BamHI)로 절단한 후, 동일한 제한 효소로 처리한 pET-11a 벡터에 삽입하여 pET-G9CCRD를 얻었다. PCR은, KOD DNA polymerase kit(TOYOBO Code No. KOD-101)를 사용하여 행했다. PCR Reaction mixture(dNTP mix, 25 mM MgCl2, 10×Buffer, KOD DNA polymerase(0.05 u), 프라이머 및 주형 cDNA)를 이하와 같은 PCR의 사이클의 조건으로 반응시켰다 : 94℃에서 2분 처리한 후, 사이클(98℃에서 15초, 다음에 65℃에서 2초, 그리고 74℃에서 30초 처리)을 25회 행하고, 마지막으로 4℃에서 반응을 정지했다. PCR 증폭된 단편의 벡터로의 삽입은, Ligation high kit(TOYOBO Code No. LGK-101)를 사용하여 행했다. 반응은, 인서트 : 벡터의 몰비를 약 5 : 1로 혼합하고, 그 총 DNA 용액(체적)량의 1/2 (체적)량의 시약 Ligation high를 첨가하여 혼합하여 행했다. 16℃에서 16시간(O/N) 반응시킴으로써 삽입했다.
한편, 상기 갈렉틴 9 cDNA로부터 PCR용 프라이머 : G9NCRD1+G9NCRD6을 이용하여 인간 갈렉틴 9의 N-말단측 CRD에 대응하는 cDNA(G9NCRD)를 증폭시켰다. G9NCRD를 제한 효소(NdeI)로 절단한 후, 얻어진 단편을 동일한 제한 효소(NdeI)로 처리하고, 또한 탈인산화한 pET-G9CCRD에 삽입하여 pET-G9NC(null)를 얻었다. PCR 증폭 및 벡터로의 삽입은 상기와 동일하게 하여 행했다. pET-G9NC(null)는, 인간의 M형 갈렉틴 9의 제149번째의 Pro로부터 제177번째의 Ser까지의 29개의 아미노산 서열을 His-Met 서열로 치환한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코드하고 있다. 즉, 하기 서열번호 5로 나타내는 염기 서열을 갖는 것이며, 하기 서열번호 6으로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코드하고 있다.
(서열번호 5)
Figure pct00008
Figure pct00009

(서열번호 6)
Figure pct00010
Figure pct00011

(B) 갈렉틴 9 개변체 재조합 단백질의 발현 및 정제
상기 공정(A)에서 얻어진 발현용 플라스미드 벡터 pET-G9NC(null)를 대장균(BL21(DE3))에 도입했다. 도입은 일렉트로포레이션법에 의해 행했다. 즉, competent BL21(DE3)과 플라스미드 벡터 수용액을 혼합하여, 1.8 kV의 전압에서의 일렉트로포레이션법에 의해 트랜스펙션을 행했다.
재조합 단백질의 발현은, 대장균을 2%(w/v) 글루코오스 및 100 ㎍/ml 암피실린 함유 2×YT 배지중에서 배양하고, 600 nm에서의 흡광도가 0.7에 도달한 시점에서 0.1 M 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드를 첨가(최종 농도, 0.1 mM)하여, 재조합 단백질의 발현을 유도하여 행했다. 20℃에서 18시간 배양한 후, 원심에 의해 균체를 수집하여, 10 mM Tris-HCl(pH 7.5), 0.5 M NaCl, 1 mM DTT, 1 mM PMSF에 현탁했다. 현탁액을 10분간 음파 처리한 후, 10%(w/v) Triton X-100을 가하여(최종 농도, 1%) 4℃에서 30분간 교반했다. 15,000×g으로 30분간 원심하여, 얻어진 상청액 중의 재조합 단백질을, 락토스-아가로스를 이용한 어피니티 크로마토그래피에 의해 정제했다. 엔도톡신의 제거에는 셀파인 ET 클린 L(Chisso社)을 이용하고, 엔도톡신이 제거된 것은 톡시노미터를 이용한 리물루스 비탁 키네틱법에 의해 확인했다.
그 결과, 순도가 높은 표품이 비교적 높은 수율로 얻어졌다. 얻어진 재조합 단백질의 전기 영동의 결과를 도 28에 나타낸다. SDS-PAGE 조건은 다음과 같다 : Gel, Acrylamide-BIS(12% gel), 전기 영동용 버퍼, 25 mM Tris-192 mM 글리신-0.1% SDS, 영동 조건, 180 V, 45 min., 염색, CBB, 60℃/30 min. 전기 영동 샘플은, Strata CleanTM Resin(Stratagene)에 흡착시키고, 1×sample buffer(62.5 mM Tris-HCl, Ph 6.8, 2%(w/v) SDS, 5%(W/V) 2-ME, Glycerol)로 0.2 mg/ml로 조정하여, 98℃/3 min.의 열처리후 레인당 약 2 ㎍의 단백량으로 전기 영동을 했다. 정제된 G9NC(null)는, 4℃에서 600일간 이상 안정적으로 보존할 수 있었다.
(항체)
세포의 염색에는 이하의 항체를 이용했다. 항마우스 CD4-FITC 항체(Becton Dickinson 또는 eBioscience, San Diego, CA), 항마우스 Tim-3-PE 항체(eBioscience), 항마우스 갈렉틴 9-Alexa488 항체(클론 108A2, Galpharma), 항마우스 갈렉틴 9-PE 항체(클론 108A2, Biolegend), 항마우스 CD25-APC 항체(Biolegend), 항마우스 Foxp3-APC 항체(eBioscience), 항인간/마우스 LAP-PE 항체(R&D Systems), 항마우스 NKG2D-PE 항체(Biolegend), 항마우스 LAG-3-PE 항체(Biolegend), 항마우스 CTLA-4-PE 항체(Biolegend), 항마우스 IL-17 항체(FACS용), 항마우스 PDCA-1-APC 항체(Biolegend), 항마우스 CD11c-Alexa488 항체(Biolegend), 항마우스 CD19 항체(Biolegend), 항마우스 GL-7 항체(Biolegend), 항마우스 CXCR4 항체(Biolegend), 항마우스 ICOS-PE 항체(eBiosciences), 항마우스 CXCR5-APC 항체(BD Pharmingen), 항인간 갈렉틴 9-Alexa488 항체(클론 9M1-3, Galpharma), 항인간 CD4-FITC 항체(Biolegend), 항인간 CD4-PE 항체(Biolegend), 항인간 CD25-APC 항체(Biolegend), 항인간/마우스 Foxp3-PE 항체(Biolegend), 항마우스 IL-10 항체(Biolegend), 항마우스 IL-10 중화 항체(R&D Systems), 항마우스 IL-10R 중화 항체(R&D Systems), 항마우스 TGF-β 중화 항체(R&D Systems).
(그 밖의 시약)
아포토시스 측정에는 Annexin V-EGFP Apoptosis Detection kit(Medical & Biological Laboratories, Nagoya, Japan)를 이용했다. 세포 내부 항원의 염색에는 BD Cytofix/Cytoperm Kit(Becton Dickinson)를 이용하여 세포의 고정화 및 세포막 침투화를 행했다. 이들 키트는 메이커가 제공한 사용 설명서에 따라서 이용했다.
(플로우 사이타머트리)
염색한 세포의 측정은 FACS Calibur(Becton Dickinson)를 이용하여 행하고, 데이터의 해석에는 FlowJo software(Tree Star, Ashland, OR)를 이용했다. 세포의 분취가 필요할 때에는 FACS Aria(Becton Dickinson)를 이용했다.
(ELISA)
인간 갈렉틴 9 농도의 정량은 이미 알려진 방법에 따라서 행했다(비특허문헌 34).
마우스 갈렉틴 9 농도의 정량은 이미 알려진 방법(비특허문헌 16)에 준하여, 이하의 3점을 개량하여 행했다. 첫번째는 플레이트에 코트하는 항마우스 갈렉틴 9 항체를 클론 108A2(Galpharma)로 변경한 점, 두번째는 검출용의 항체에 비오틴라벨한 항마우스 갈렉틴 9 폴리클로날 항체(Galpharma)를 이용한 점, 세번째는 검출용 항체의 변경에 따라서 3차 항체 대신 서양 고추냉이 퍼옥시다아제 표지한 스트렙타아비딘(Endogen)을 이용하여 발색 반응을 행한 점이다. 이 계는 마우스 갈렉틴 9를 특이적으로 검출하고, 측정 샘플 중에 인간 안정화 갈렉틴 9가 30 nM으로 첨가되어 있어도 반응하지 않는다. 마우스 또는 인간 IL-17A, 마우스 TNF-α, 마우스 IL-12, 마우스 IFN-γ, 마우스 IL-13의 검출은 각각 적당한 DuoSet(R&D Systems)를, 마우스 IL-10의 검출에는 Mouse IL-10 ELISA MAX Standard(Biolegend)를, 항마우스 SRBC IgM의 검출에는, Mouse Anti-SRBC IgM ELISA Kit(Life Diagnostics), 마우스 총 IgM 항체 및 마우스 총 IgG 항체의 검출은 각각 Mouse Total IgM ELISA Kit와 Mouse Total IgG ELISA Kit(모두 Bethyl)를, 항 dsDNA 항체의 검출은 레비스 항 dsDNA-마우스 ELISA KIT(Shibayagi)를 이용하여, 각각 메이커가 제공한 사용 설명서에 따라서 행했다.
(동물)
C57BL/6J 마우스 및 MRL/MpJUmmCrj-1pr/1pr 마우스는 일본 찰스리버(Yokohama, Japan)로부터, 동계통의 갈렉틴 9 녹아웃 마우스 및 마우스 갈렉틴 9 트랜스제닉 마우스는 Galpharma(Takamatsu, Japan)로부터 입수했다. Lewis계 래트(LEW/Ssn)는 일본 SLC(Hamamatsu, Japan)로부터 입수했다. 실험에 이용하는 마우스에게는 12시간마다의 주야 리듬과 자유롭게 채식ㆍ채수할 수 있는 통상의 환경을 부여하여, 국법과 국제지침에 준거한 인도적인 배려하에 사육했다. 또 본 연구 프로토콜은 카가와대학 실험동물위원회의 승인을 받았다.
이하에 실험 방법을 설명한다.
〔마우스 나이브 T 세포의 단리와 배양〕
CD4+ CD62L+ 나이브 T 세포는 8∼10주령의 수컷 C57BL/6J 마우스로부터 얻은 비장 세포로부터 CD4+ CD62L+ T cell Isolation Kit(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)를 이용하고, 메이커가 제공한 사용 설명서에 따라서 단리하여, 순도 94% 이상의 나이브 T 세포를 얻었다. 나이브 T 세포를 10%의 가열 비동화 처리한 소태아 혈청 및 penicillin G(10 IU/ml, Sigma-Aldrich)와 streptomycin(100 ㎍/ml, Sigma-Aldrich)을 포함하는 RPMI 1640(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 배지중에 현탁하고, 항 CD3 항체를 1 ㎍/ml의 농도로 코팅한 96-well 플레이트(Becton Dickinson)에 2×105 cells/0.1 ml/well의 밀도로 파종하여 항 CD28 항체(2 ㎍/ml, Becton Dickinson)를 첨가후에 72-96시간 37도의 CO2 인큐베이터 내에서 배양했다. TH17 세포 분화 유도에는 이 계 중에 인간 TGF-β1(3 ng/ml, R&D systems), 마우스 IL-2(5 ng/ml, R&D systems) 및 마우스 IL-6(20 ng/ml, R&D systems)을 첨가했다. TH1 세포 분화 유도에는 마우스 IL-12(10 mg/ml, R&D systems) 및 항 IL-4 항체(10 ㎍/ml, Becton Dickinson)를, TH2 세포 분화 유도에는 마우스 IL-4(20 mg/ml, R&D systems) 및 항 IL-12 항체(10 ㎍/ml, Becton Dickinson)를 첨가했다. Tr1 분화에는 항 CD3 항체를 10 ㎍/ml의 농도로 코팅한 96-well 플레이트를 이용하여, 2 ㎍/ml의 항 CD28 항체와 25 ng/ml의 IL-27 존재하에 나이브 T 세포를 3일간 배양했다. 또 실험에 따라서는 인간 안정화 갈렉틴 9(30 nM), 락토스(3, 10, 30 mM), 수크로스(3, 10, 30 mM), 항 Tim-3 중화 항체(10 ㎍/ml, eBioscience)나 래트 IgG2a(10 ㎍/ml, eBioscience) 등을 첨가하여 배양했다.
〔THGAL9 세포의 TH17 세포 분화에 대한 작용〕
CD25 음성 THGAL9(세포 표면에 갈렉틴 9를 발현하고 있는 CD25-CD4+ T 세포)와 non-THGAL9 세포(세포 표면 갈렉틴 9-CD25-CD4+ T 세포)는 소팅으로 단리했다(세포 순도 97% 이상). 한편, 나이브 T 세포를 TH17 분화 유도 조건하에서 6시간 배양하여 TH17로의 분화를 커미트시킨 후에 회수하여, CD25 음성 THGAL9 또는 non-THGAL9 세포와 1 : 1(5×104 cells : 5×104 cells)의 비로 혼합하고, 그 후에는 TCR 자극만으로 90시간 배양했다. 갈렉틴 9의 작용을 저해하기 위해서는, 계 중에 30 mM의 락토스를 첨가했다.
〔인간 CD4 T 세포의 단리와 배양〕
말초혈 단핵 세포는 건강한 성인의 말초혈을 비중 분리액(림포세팔, Nakalai Tesque, Kyoto, Japan)에 중층하고, 메이커가 제공한 사용 설명서에 따라서 원심 분리하여 단리했다. 얻어진 말소혈 단핵 세포로부터 CD4+ T Cell Isolation Kit II(Miltenyi Biotec)를 이용하고, 메이커가 제공한 사용 설명서에 따라서 CD4 T 세포를 단리했다. CD4+ T 세포를 TCR 자극하기 위해서는, 마우스 나이브 T 세포의 배양과 마찬가지로, 세포를 10%의 가열 비동화 처리한 소태아 혈청 및 penicillin G와 streptomycin을 포함하는 RPMI 1640 배지중에 현탁하고, 항 CD3 항체를 1 ㎍/ml의 농도로 코팅한 96-well 플레이트에 2×105 cells/0.1 ml/well의 밀도로 파종하여 항 CD28 항체(2 ㎍/ml, Becton Dickinson)를 첨가후에 96시간 배양했다.
이 배양 세포로부터 인간 THGAL9 세포 및 인간 non-TH17 세포를 분리하기 위해서는 세포를 항인간 갈렉틴 9-Alexa488 항체(클론 9M1-3, Galpharma)로 염색하고, FACS Aria를 이용하여 소팅했다. 소팅후의 세포 순도는 97% 이상이었다. 세포는 상기 TCR 자극하에서 96시간 더 배양하여 실험에 이용했다. 인간 CD4+ T 세포의 TH17 세포로의 분화 유도는 이미 알려진(비특허문헌 35) 방법을 이용했다. 간결하게는, 상기 TCR 자극에 더하여 인간 IL-2(5 ng/ml, R&D systems)를 이용하고, 또한 인간 IL-1β(50 ng/ml, R&D systems) 또는 동 IL-1β와 IL-6의 조합, 또는 동 IL-1β와 마우스 IL-23(50 ng/ml, R&D systems)의 조합 자극하에 9일간 배양했다.
〔리얼타임 RT-PCR〕
mRNA의 정량은 이미 알려진 것에 준하여 리얼타임 RT-PCR법으로 행하고, 증폭시킨 핵산의 염색에 SYBR Green I를, 측정에는 ABI PRISM 7000 sequence detector(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 이용했다(비특허문헌 36). 프라이머는 다카라바이오(Otsu, Japan)로부터 구입했다. 특정한 mRNA 발현량은 동방법에 의해 정량된 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)의 mRNA 발현량을 내부 표준으로 하여 그 비로 나타냈다.
〔통계 해석〕
데이터의 통계 해석에는 해석 소프트 Prism(Graphpad software)을 이용하고, nonparametric two-tailed Mann-Whitney법, Logrank test법 및 2-way ANOVA법 등에 의해 통계적인 유의차의 유무를 판정하여, p<0.05를 유의로 했다. 막대 그래프 또는 절선 그래프의 데이터는 모두 Mean±SEM(n>3)이다.
〔실험 결과와 고찰〕
〔인간 안정화 갈렉틴 9는 래트 관절염에 지속적인 치료 효과를 나타낸다〕
도 1에 래트 콜라겐 유도성 관절염에서의 인간 안정화 갈렉틴 9의 치료 효과를 나타낸다. 감작에 이용하는 콜라겐 용액은 이하의 요령으로 준비 조정했다. 소(牛)타입 II 콜라겐(BCII; Collagen Research Center)과 Muramyl dipeptide(MDP; Peptide Institute)를 각각 1.6 mg/ml과 0.4 mg/ml가 되도록 혼합하고, 그것과 동일한 체적의 incomplete Freund's adjuvant(IFA; Difco)를 첨가하고 혼합하여 유화했다. 이 콜라겐 용액을 Lewis rat(♀, 6∼7주령) 1마리당 1 ml를 등의 피내에 투여했다(Day0). 투여는 적어도 10개소/래트에 분산하여 행했다. 7일째에 동일하게 조제한 콜라겐 용액 0.3 ml/래트를 꼬리 기저부에 부스터 투여했다. 안정화 갈렉틴 9는 부스터 투여후 7일째부터 표시의 용량ㆍ스케줄로 피하 투여했다(a). 관절염 발증에 따르는 발의 종창의 측정은 2명의 관찰자가 각각 독립적으로 plethysmometer(Muromachi Kikai Co., Ltd)를 이용하여 행했다. 양 뒷다리의 체적의 합계를 경시적으로 측정하여, 초기값부터의 변화 비율(%)로 나타냈다. 인간 안정화 갈렉틴 9를 본 모델에 있어서 주 3회 피하 투여하면, 이미 발증한 관절의 부종을 용량 의존적으로 축소하여, 0.06 mg/kg으로 거의 완전한 치료 효과를 나타냈다(b). 다음으로 투여량을 0.6 mg/kg에 고정하여 주 1회와 주 2회 투여로 치료 효과를 비교한 바, 양자 모두 거의 동등한 치료 효과를 나타냈다(c). 피하 주사에 의해 약효가 지속되는 예는 잘 알려져 있고, 예컨대 항체약에서는 피하 투여하면 서서히 혈중에 방출되기 때문에, 전신 투여와 비교하여 체내에 보다 길게 순환한다.
〔인간 안정화 갈렉틴 9 피하 투여에서의 체내 동태〕
따라서 안정화 갈렉틴 9 피하 투여시의 체내 동태를 조사했다. Lewis rat(♀, 6∼7주령)에 표시의 용량의 인간 안정화 갈렉틴 9를 1회 피하 투여하고, 투여전(0분), 투여후 5분, 15분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 16시간, 24시간, 48시간 및 72시간에 경시적으로 혈장 채혈하여, 혈중 안정화 갈렉틴 9 농도를 특이적인 ELISA에 의해 측정했다. ELISA의 1차 항체는 항인간 갈렉틴 9 모노클로날 항체 9S2-3을 이용했다. 이 항체는 갈렉틴 9의 N 말측의 당쇄 인식 도메인을 인식하고, SDS로 변성한 인간 갈렉틴 9에는 반응하지 않는 점에서, 정확한 입체 구조의 단백질을 인식한다고 생각된다. 한편, 2차 항체에는 항인간 갈렉틴 9CT 토끼 폴리클로날 항체를 이용했다. 이 항체는 토끼를 인간 갈렉틴 9의 C 말측의 당쇄 인식 도메인으로 면역하여 조제하고, 다른 갈렉틴에 대한 교차 반응은 흡수 제거하였다. 또 본 ELISA는 마우스 및 래트의 갈렉틴 9에 교차하지 않는다. 즉 본 ELISA는 분해ㆍ변성을 받지 않은 완전한 인간 안정화 갈렉틴 9를 측정할 수 있다.
혈중 인간 안정화 갈렉틴 9 농도를 바탕으로 모멘트 해석 소프트웨어(타바타 켄지, 후지사와약품공업, 쿄토대학 대학원 약학연구과에서 제공)를 사용하여, 모멘트 해석법에 의한 약물 동태 해석을 행했다. 그 결과, 도 2 및 표 2에 나타낸 바와 같이, 혈중의 안정화 갈렉틴 9 농도는 매우 낮고, 앞서 관절염 모델에서 충분한 치료 효과를 나타낸 0.6 mg/kg 투여에서는 혈중 최고 농도가 0.943 ng/ml, t1 /2이 7.6시간, MRT가 12.5시간이었다. In vitro의 IL-17 생성 억제에 있어서는 안정화 갈렉틴 9의 효과가 보이는 것이 10 nM(약 0.3 ㎍/ml) 이상의 농도가 필요하고, 30 nM(약 1 ㎍/ml)에서 통계적 유의차가 보였다(비특허문헌 7). 즉 혈중에 나온 인간 안정화 갈렉틴 9가 약효를 나타낸다고는 생각되지 않고, 아마도 투여 부위 및 림프관ㆍ림프절을 경유하는 비교적 고농도인 동안에 면역계 세포에 영향을 미치고 있다고 생각된다. 또 투여후 신속히 체내로부터 배출되는 것은 본 실험 및 다른 체내 동태 시험에서 확인되고 있다. 즉 안정화 갈렉틴 9의 지속된 약효는 투여시로부터 짧은 동안에 작용을 받은 세포가 담당하고 있어, 안정화 갈렉틴 9의 직접적인 작용은 아니라고 생각된다. 생체내에는 갈렉틴 9를 생성ㆍ방출하여 면역을 제어하고 있는 세포가 존재하고 있는 것은, 상기 배경 기술에 있어서 설명한 바와 같이 자명하지만 그 동정은 매우 어렵다. 갈렉틴 9를 분비하여 면역을 제어하고 있는 세포를 동정하는 것은, 갈렉틴 9의 작용 메커니즘의 상세한 것을 해명하는 것과 함께 중요한 과제이며, 그것을 달성하는 것은 의학ㆍ산업에 대한 큰 공헌이 된다.
〔갈렉틴 9는 EAE를 억제하는 내재성 인자이다〕
도 3에, MOG 유도성 실험적 알러지성 뇌염(EAE)에 대한 갈렉틴 9의 치료 효과를 나타낸다. 이 모델에서의 뇌염 발증은 Th17 의존적인 것이 알려져 있다. (a) EAE 발증에는 암컷 C57BL/6J 마우스(WT) 또는 동계통의 갈렉틴 9 녹아웃 마우스(Gal-9 KO)를 이용했다. 300 ㎍의 Mycobacterium tuberculosis(H37RA, Difo)를 첨가한 CFA 중에 조제한 150 ㎍의 MOG(35-55) 펩티드를 마우스에게 피하 투여하여 감작하고, 그 동일 및 2일후에 200 ng의 pertussis toxin(List Biological Laboratory)를 정맥 투여하고, 경시적으로 임상 스코어를 육안으로 관찰하여 기록했다. 임상 스코어는 이하의 기준에 의해 판정했다.
임상 스코어 0 : 이상 없음
임상 스코어 1 : 꼬리의 긴장 저하
임상 스코어 2 : 뒷다리의 부전 대마비
임상 스코어 3 : 뒷다리의 대마비
임상 스코어 4 : 사지 마비
임상 스코어 5 : 빈사 또는 사망
(b) 감작후 20주째의 상기 마우스 척수의 헤마톡실린/에오신 염색과, 항 CD3 항체에 의한 면역 염색. 야생형(WT)과 비교하여 갈렉틴 9 녹아웃 마우스(Gal-9-/-)의 척수에는 세포의 침윤과 조직 파괴가 현저하게 보였다. 침윤 세포의 대부분은 CD3 양성인 것에서 T 세포라고 생각된다.
(c) 감작후 20주째의 EAE 감작 야생형 마우스(WT), EAE 감작 갈렉틴 9 녹아웃 마우스(Gal-9 KO) 및 주령을 맞춘 미감작 마우스(Naive)로부터 비장 세포를 조제하여, CD4, CD25, IL-17 및 Foxp3 항체로 염색했다. 갈렉틴 9 녹아웃 마우스에서는 야생형에 비하여 CD4+CD25+IL-17+ 세포가 유의하게 증가했고, 한편 CD4+CD25+Foxp3+ 세포는 유의하게 감소했다.
(d) 나이브 T 세포를 야생형 마우스(WT) 및 갈렉틴 9 녹아웃 마우스(Gal-9 KO)의 비장 세포로부터 조제하고, 항 CD3 항체를 코팅한 96-well plate(Becton Dickinson)에 2×105 cells/0.1 ml/well의 밀도로 파종하여 항 CD28 항체(2 ㎍/ml, Becton Dickinson)를 첨가후에 96시간 배양했다(No skewed). TH17 세포 분화 유도에는 이 계 중에 인간 TGF-β1(3 ng/ml, R&D systems), 마우스 IL-2(5 ng/ml, R&D systems) 및 마우스 IL-6(20 ng/ml, R&D systems)을 첨가한 조건으로 96시간 배양했다(TH17 skewed). 각각의 세포 배양 상청 중의 IL-17A 농도를 ELISA로 정량한 바, TH17 분화 유도 자극에 의해 IL-17A 발현은 현저하게 유도되지만, 그 유도는 야생형에 비하여 갈렉틴 9 녹아웃 마우스가 유의하게 높았다.
(e) 상기에서 배양 상청을 추출후에, 남은 세포 내의 IL-10 mRNA량을 리얼타임 RT-PCR법으로 정량했다. IL-10 mRNA 발현량은 동일한 방법에 의해 측정된 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)의 시그널을 내부 표준으로 하여, 그 비로 나타냈다. IL-10 mRNA 발현 레벨은 No skewed, TH17 skewed 모두 갈렉틴 9 녹아웃 마우스가 야생형에 비하여 유의하게 낮았다.
(f) 전술한 (a)의 계에서 야생형 암컷 C57BL/6J 마우스에게 EAE를 발증시키고, 감작후 14일째와 16일째에 인간 안정화 갈렉틴 9를 0.3 ㎍/마우스 또는 3 ㎍/마우스로 피하 투여했다. 컨트롤군에는 PBS를 투여했다. 감작 19일째까지 임상 스코어를 기록하고, 그 후 마우스의 척수를 헤마톡실린/에오신 염색했다. 인간 안정화 갈렉틴 9 투여는 0.3 ㎍/마우스의 투여로 임상 스코어를 저하시키는 경향을 나타내고, 3 ㎍/마우스에서는 통계적으로 유의한 임상 스코어 저하를 나타냈다(p<0.05, 2-way ANOVA법).
갈렉틴 9 녹아웃 마우스에서는, 야생형의 마우스에게 비하여 MOG(33-55)로 유도한 실험적 알러지성 뇌염(EAE)의 증상이 보다 심각하고 또한 지속되었다(도 3a). 야생형 마우스에서는 EAE 발증으로부터 20주후의 국소에 CD3 양성 세포의 침윤은 거의 보이지 않지만, 녹아웃 마우스에서는 CD3 양성 세포의 침윤이 분명했다(도 3b). 발증후 20주째에서의 녹아웃 마우스의 비장에서는 야생형에 비하여 IL-17을 생성하는 CD4+CD25+ 세포의 증가와 Foxp3 양성 세포의 감소가 관찰되었다(도 3c). 또한 녹아웃 마우스의 나이브 T 세포(CD4+CD62L+CD25-)로 TH17을 분화 유도하면 야생형의 세포를 이용하는 것과 비교하여 IL-17 생성이 명확하게 상승했지만(도 3d), 한편 IL-10 mRNA 발현은 녹아웃 마우스에서 저하되었다(도 3e). 따라서 갈렉틴 9의 EAE 모델에서의 치료 효과를 검토한 바, 증상이 현저해지는 면역후 14일부터 갈렉틴 9를 주 2회 피하 투여하면, 0.3 ㎍이라도 임상 증상 및 조직학적 소견이 명확하게 개선되었다(도 3f).
이러한 결과는 갈렉틴 9는 내재성의 면역 제어 인자로서 Th17/Treg 밸런스를 조정하고 있는 것을 나타내고 있고, 이미 알려진 마우스 관절염의 실험 결과로부터 인출된 귀결(비특허문헌 7)이 EAE에 있어서 더욱 확인ㆍ검증된 것이 된다.
〔갈렉틴 9에 의한 TH17 세포 분화 억제는 Tim3에 의존하지 않는다〕
도 4에는, 갈렉틴 9가, Tim3/Gal-9 상호 작용에 의존하지 않고 TH17 세포 분화를 억제하는 효과를 나타낸다.
(a) 도 3의 (d)의 방법으로, C57BL/6J 마우스로부터 조제한 CD4+ CD62L+ 나이브 T 세포에 TH17 세포 분화 유도 자극을 부여했다. 자극 개시시를 0시간으로 하여, 도면에 나타낸 각각의 기간 30 nM의 인간 안정화 갈렉틴 9 또는 컨트롤로서 PBS 존재하에 배양했다. 그 후, 세포를 배지로 세정하고, TH17 세포 분화 유도 자극을 계속했다. 96시간째의 배양 상청을 추출하여, 배지중의 IL-17 농도를 전술한 ELISA로 정량했다. TH17 세포 분화 유도의 0∼18시간에 인간 안정화 갈렉틴 9가 존재하면, TH17 세포 분화는 현저하게 억제되었다. 한편 분화 유도전 24시간의 인간 안정화 갈렉틴 9 처리는 무효였다.
(b) 전술한 30 nM 인간 안정화 갈렉틴 9를 TH17 세포 분화 유도 개시로부터 24시간 첨가한 세포 및 컨트롤로서 PBS를 첨가한 세포의 IL-17F, IL-21, IL-22 및 IL23R mRNA 발현을 리얼타임 RT-PCR법으로 정량했다. 인간 안정화 갈렉틴 9에 의해, 이들 모든 mRNA 발현이 유의하게 저하되었다.
(c) 나이브 T 세포를 TH17 분화 유도 자극하에 24시간 배양하여(TH17 skewed), CD4+Tim-3+ 세포를 플로우 사이타머트리로 측정했다. 동분화 유도 자극으로부터 TGF-β1 및 IL-6을 제외한 조건으로 24시간 배양한 나이브 T 세포를 컨트롤로 했다(No skewed). 어느 것에서도 Tim-3의 발현 세포는 거의 검출되지 않았다. 또 전술한(a : 0∼96) 조건으로 인간 안정화 갈렉틴 9에 의한 TH17 분화 유도 억제 시험을 행하고, 인간 안정화 갈렉틴 9 존재시에 항 Tim-3 중화 항체(10 ㎍/ml, αTim-3) 또는 아이소타입 컨트롤 항체(10 ㎍/ml, IgG2a)를 첨가했다. 배양 96시간째의 상청 중의 IL-17A를 ELISA로 정량한 바, 항 Tim-3 항체에 의한 인간 안정화 갈렉틴 9의 작용 억제는 보이지 않았다.
(d) 나이브 T 세포를 TH17 분화 유도 자극하에 96시간 배양후, 분화된 TH17 세포를 포함하는 세포 집단에 인간 안정화 갈렉틴 9(30 nM)를 첨가하여, 4시간후에 아포토시스를 일으킨 Tim-3 양성 세포, 즉, TH17을 플로우 사이타머트리로 검출했다. 인간 안정화 갈렉틴 9 첨가시에 항 Tim-3 항체(10 ㎍/ml, αTim-3) 또는 아이소타입 컨트롤 항체(10 ㎍/ml, IgG2a)를 첨가한 조건으로도 실험을 행했다. 인간 안정화 갈렉틴 9에 의해 TH17 세포의 아포토시스가 유도되고, 그 효과는 항 Tim-3 항체에 의해 유의하게 억제되었다. 이 결과는, 분화된 TH17 세포는, Tim-3 의존적으로 갈렉틴 9에 의해 아포토시스의 유도를 받는 것을 시사한다.
IL-17 생성은 나이브 T 세포를 항 CD3 항체 코팅한 플레이트 중에서 항 CD28 항체, IL-2, TGF-β1 및 IL-6으로 자극하고, 4일간 배양하면 강하게 유도된다. 이 TH17 분화 유도계에 30 nM의 갈렉틴 9를 첨가한 결과, 분화 개시로부터 18시간까지의 갈렉틴 9 처치에 의해 IL-17 생성은 현저하게 억제되고, 최초의 24시간 갈렉틴 9 처리를 행하면 4일간을 통한 갈렉틴 9 처리와 동등한 IL-17 생성 억제 효과를 나타냈다(도 4a). 이것에 반하여, TH17 분화 유도전 24시간전 처치에서는 억제 효과는 없었다(도 4a). TH17의 분화에 관련된 IL-17F, IL-21, IL-22 및 IL-23R의 mRNA 레벨을 검토한 바, TH17 분화 개시로부터 24시간 갈렉틴 9 처치를 행한 경우에는 IL-17A 뿐만 아니라 이들 모든 TH17 관련 유전자의 발현이 억제되어 있고(도 4b), 그 때문에 TH17 세포 분화가 억제될 가능성이 시사되었다. 갈렉틴 9는 Tim-3의 리간드이고, Tim-3 발현 TH1 세포와 상호 작용하여 아포토시스를 유도한다(비특허문헌 4). TH17 세포에도 Tim-3의 발현이 보고되어 있기 때문에(비특허문헌 5∼6), 갈렉틴 9에 의한 TH17 분화 억제에 Tim-3이 관여하고 있을 가능성을 검토했다. 그런데 갈렉틴 9가 분화 억제 작용을 나타내는 TH17 세포 분화 유도 개시로부터 24시간째에서는 Tim-3 발현 세포는 거의 검출되지 않고(도 4c), 또 갈렉틴 9에 의한 TH17 분화 억제는 Tim-3 중화 항체를 첨가하더라도 해제되지 않았다(도 4c). 한편 분화 유도 4일째에서는 5∼10%의 T 세포가 Tim-3을 발현하고 있고, 이 TH17 세포는 갈렉틴 9로 아포토시스를 일으키고, 항 Tim-3 중화 항체는 그것을 유의하게 억제했다(도 4d). 이러한 결과는, 갈렉틴 9에 의한 TH17 세포 분화 억제에는 Tim-3의 관여는 없지만, Tim-3을 발현하고 있는 활성화 TH17 세포의 아포토시스 유도에는 Tim-3이 관여하고 있는 것을 강하게 시사한다.
〔갈렉틴 9에 의한 TH17 분화 유도 억제에는 O-결합형 당쇄가 관여한다〕
도 5에, 갈렉틴 9에 의한 TH17 분화 유도 억제에는 N-결합형 당쇄가 아니라, O-결합형 당쇄가 관여하는 것을 시사하는 결과를 나타낸다.
(a) 나이브 T 세포를 TH17 분화 유도 자극 조건하에서 배양하고, 최초의 24시간에 인간 안정화 갈렉틴 9(30 nM) 또는 컨트롤로서 PBS를 첨가했다. 그 24시간 동안에 갈렉틴의 저해제인 락토스를 3 mM, 10 mM 또는 30 mM의 농도로 첨가하여, 96시간후에 배양 상청 중의 IL-17A 농도를 정량했다. 락토스의 컨트롤로는 갈렉틴 9에 작용을 갖지 않는 수크로스를 이용했다. 인간 안정화 갈렉틴 9에 의한 억제 작용은 락토스에 의해 농도 의존적으로 소실된 것으로부터, 인간 안정화 갈렉틴 9의 렉틴 활성이 TH17 분화 억제에 필요하다는 것이 시사되었다.
(b) 전술한 (a)의 조건으로, 이번에는, 락토스 대신 N-글리코실레이션 저해제의 swainsonine(2 ㎍/ml) 또는 O-글리코실레이션 저해제의 Benzyl N-acetyl-α-D-galactosaminide(Benzyl-α-GalNAc, 2 mM)를 첨가했다. 96시간후에 배양 상청 중의 IL-17A 농도를 정량한 바, swainsonine에서는 인간 안정화 갈렉틴 9의 효과가 유의하게 잔존했었지만, Benzyl-α-GalNAc에서는 인간 안정화 갈렉틴 9의 효과에 유의차가 보이지 않게 되었다. 이 결과는 갈렉틴 9에 의한 TH17 분화 억제에는 O-글리코실레이션을 받은 당단백이 관여하고 있는 것을 암시한다.
갈렉틴 9에 의한 TH17 세포 분화 억제를 갈렉틴 9의 저분자 리간드인 락토스 존재하에 행한 바, TH17 분화 억제 효과는 첨가하는 락토스의 농도 의존적으로 감소했지만, 갈렉틴 9에 결합하지 않은 수크로스는 전혀 영향을 주지 않았다(도 5a). 이 결과는 TH17 분화 억제에는 갈렉틴 9의 렉틴 활성이 필요하고, 타겟 세포가 발현하는 다당에 결합하여 작용하는 것을 시사하고 있다. 따라서 갈렉틴 9의 타겟이 O-글리칸인지 N-글리칸인지를 좁혀가기 위해, O-글리칸의 저해제 Benzyl-α-GalNAc 및 N-글리칸의 저해제 swainsonine를 이용한 바, 갈렉틴 9에 의한 TH17 분화 억제 활성은 Benzyl-α-GalNAcniyotte에 의해 유의하게 억제되었다(도 5b). 지금까지 갈렉틴 9에 의한 아포토시스 유도에는 N-글리칸이 중요하다는 것이 알려져 있었지만(비특허문헌 4, 37), TH17 세포 분화 억제에는 O-글리칸이 중요하다는 것이 암시되었다.
〔갈렉틴 9에 의한 TH1, TH2 및 TH17 세포 분화에 대한 작용〕
도 6에는, TH1, TH2 및 TH17 세포 분화에 미치는 Gal-9의 효과를 나타낸다.
(a) 나이브 T 세포에 30 nM의 인간 안정화 갈렉틴 9(또는 컨트롤로서 PBS)를 첨가하여, TH1, TH2, TH17의 각 분화 유도 자극, 또는 항 CD3 항체 및 항 CD28 항체에 의한 TCR 자극만(No skewed)의 각각의 조건하에 96시간 배양후, 각 TH 서브 타입에 특이적인 mRNA 발현을 리얼타임 RT-PCR로 정량했다. 인간 안정화 갈렉틴 9는 TH1 및 TH2 세포에 특이적인 mRNA의 발현에 영향을 주지 않고, 유일하게 TH17 세포에 특이적인 IL-17A 및 RORγt의 mRNA 발현을 유의하게 억제했다.
(b) 상기 실험의 TH17 분화 유도 조건에서의 IFN-γ와 IL-4 mRNA를 측정한 바, 어느 것도 인간 안정화 갈렉틴 9에 의한 발현의 변화는 보이지 않았다. TH17 분화는 이러한 사이토카인에 의해 억제되는 것이 알려져 있지만, 갈렉틴 9의 작용은 이러한 사이토카인 발현을 상승시키기 위한 것은 아니라는 것이 시사되었다.
갈렉틴 9에 의한 헬퍼 T 세포 분화 억제는 TH17 세포에 특이적이고, IL-12에 의한 TH1 세포 분화나 IL-4에 의한 TH2 세포 분화에 대해서는 무효이며, TH1, TH2, TH17 각각의 분화 특이적인 전사 인자의 발현에 있어서도 갈렉틴 9로 억제되는 것은 TH17의 전사 인자 RORγ만이었다(도 6a). 또 TH1이나 TH2로의 분화가 증강된 경우에는 TH17 세포 분화가 억제되는 것이 알려져 있지만(비특허문헌 38), 갈렉틴 9를 첨가한 TH17 분화 유도계에 있어서 IFN-γ나 IL-4의 mRNA는 증강되지 않았고, 따라서 TH1이나 TH2의 증강은 가능성으로부터 배제되었다(도 6b).
〔갈렉틴 9는 IL-2 의존적으로 IL-17 생성을 억제하고, 또 CD25와 Foxp3 발현을 증강시킨다〕
도 7은, 갈렉틴 9에 의한 CD25와 Foxp3 발현 상승은 IL-2에 의존한다고 하는 결과를 나타낸다.
(a) 나이브 T 세포에 30 nM의 인간 안정화 갈렉틴 9를 첨가하여(또는 컨트롤로서 PBS), TH17 분화 유도 조건하에 24시간 배양하면 인간 안정화 갈렉틴 9 첨가에 의해 CD4+CD25+ 세포의 비율이 유의하게 상승하고, 이것은 CD25 mRNA의 상승에도 반영되었다.
(b) 상기 (a)의 조건으로 96시간 배양후에 CD4+CD25+Foxp3+ 세포의 비율을 조사하면, 안정화 갈렉틴 9의 첨가에 의해 유의하게 상승했다.
(c) 나이브 T 세포에 30 nM의 인간 안정화 갈렉틴 9(컨트롤은 PBS) 및 도면에 나타낸 농도의 IL-2를 첨가하여, TH17 분화 유도 조건하에 96시간 배양하여, 배양 상청 중의 IL-17A 농도를 정량했다. 갈렉틴 9에 의한 IL-17A 생성 억제 작용은 IL-2 존재하에서만 발휘되었다. 한편 IL-2 단독에서도 IL-17A 생성 억제 경향은 보였지만 그 작용은 약하고, 100 ng/ml IL-2에 있어서도 통계적인 유의차는 없었다.
(d) 상기 (c)의 조건으로 96시간 배양한 세포중의 Treg 세포의 비율을 측정했다. 안정화 갈렉틴 9에 의해 CD4+CD25+Foxp3+ 세포, 즉 Treg 세포가 증가하는 것은 IL-2를 첨가한 경우에 한정되었다.
(e) 나이브 T 세포에 30 nM의 인간 안정화 갈렉틴 9를 첨가(컨트롤은 PBS)하여, TH17 분화 유도 조건하에 96시간 배양한 후, PMA(50 ng/ml)와 이오노마이신(1 ㎍/ml) 및 brefeldin A(10 ㎍/ml) 존재하에 6시간 더 배양했다. CD4 양성 세포중의 IL-17+Foxp3- 세포와 IL-17-Foxp3+ 세포의 비율을 플로우 사이타머트리로 측정하면, 갈렉틴 9는 IL-17+Foxp3- 세포의 감소와 IL-17-Foxp3+ 세포의 증가를 유도했다.
(f) 나이브 T 세포를 상기 (e)의 조건으로 배양하여, 도면에 나타낸 각 시점에서 CD25 및 Foxp3의 mRNA 발현을 리얼타임 RT-PCR로 정량했다. CD25의 발현은 TH17 분화 유도 자극 개시 24시간만에 상승했지만, Foxp3의 상승에는 72시간을 요했다. 어느 것의 mRNA 발현도 안정화 갈렉틴 9 첨가에 의해 유의하게 상승했다.
갈렉틴 9는 TH17 세포 분화 유도 조건으로 CD4+CD25+ 세포의 증가와 CD25의 mRNA 레벨을 증가시키고(도 7a), TH17 세포 분화 조건에도 불구하고 CD4+CD25+Foxp3+ 세포를 증가시킨 것으로부터(도 7b), 갈렉틴 9에는 강력한 Treg 세포 분화 유도 작용이 있는 것이 시사되었다. CD25의 리간드인 IL-2는, TH17 세포 분화를 억제한다고 보고되어 있고(비특허문헌 39), 실제로 본 실시예에서 이용하고 있는 TH17 세포 분화 유도계에 있어서도 IL-2는 농도 의존적으로 IL-17 생성을 억제했지만 IL-2 단독의 효과는 약하고(도 7c), 갈렉틴 9의 첨가에 의해 상승적으로 높아졌다(도 7c). 또 갈렉틴 9에 의한 Foxp3 발현 증강은 IL-2 존재하에서만 유도되었다(도 7d). TH17 세포 분화 유도에 의해 CD25 양성 CD4 세포중의 약 7%가 Foxp3-IL-17A+, 약 25%가 Foxp3+IL17A- 세포가 되지만, 갈렉틴 9를 첨가하면 Foxp3-IL-17A+ 세포가 약 2%로 감소하고, 한편 Foxp3+IL17A- 세포는 약 50%로 증가했다(도 7e). 이 계에서의 CD25의 발현은 분화 유도후 24시간후부터 증강되지만 Foxp3 발현 증강에는 72시간을 요하여, 모두 갈렉틴 9에 의해 발현량이 상승되었다(도 7f).
〔세포 표면 Gal-9 양성 세포의 동정〕
도 8에는, 세포 표면에 갈렉틴 9를 발현하는 TH 세포의 동정을 행한 결과를 나타낸다.
(a) 나이브 T 세포를 도 6a의 각 조건, 및 미자극(No stim)으로 96시간 배양하여, 배양 상청 중의 갈렉틴 9 농도를 ELISA로 정량했다. 갈렉틴 9의 분비는, TCR 자극만(No skewed), TH1 및 TH2 세포로의 분화 조건에서는 상승했지만, TH17로의 분화 조건에서는 억제되었다.
(b) 나이브 T 세포를 TH17로 분화 유도하는 계에는 TCR 자극에 더하여 IL-2, TGF-β1 및 IL-6이 첨가되어 있다. 이 완전계(TH17 skewed)로부터 IL-6을 제외한 것(TGF-β1 alone), TGF-β1을 제외한 것(IL-6 alone) 및 TCR 자극만(No skewed)의 각 조건으로 96시간 배양후의 상청에 포함되는 갈렉틴 9를 ELISA로 정량했다. IL-6의 첨가에 의해 갈렉틴 9 농도는 현저하게 저하되었다. 한편 TGF-β1의 첨가에도 갈렉틴 9의 농도를 저하시키는 경향이 보였지만 유의차는 없었다.
(c) 나이브 T 세포에 30 nM의 인간 안정화 갈렉틴 9(또는 컨트롤로서 PBS)를 첨가하여, 미자극(No stim), TCR 자극만(No skewed) 및 TH17 분화 유도 자극 조건하에서 각각 96시간 배양한 후, 상청 중의 갈렉틴 9를 ELISA로 정량했다. ELISA는 마우스 갈렉틴 9에 특이적이고, 첨가한 30 nM의 인간 안정화 갈렉틴 9의 영향을 받지 않는다. 인간 안정화 갈렉틴 9는 이러한 조건으로 배양한 나이브 T 세포로부터의 갈렉틴 9 분비를 상승시켰다.
(d) 상기 (c)의 세포를 이용하여 갈렉틴 9 mRNA량을 리얼타임 RT-PCR로 정량했지만, 도면 중의 각 조건의 세포에 있어서 통계적 유의차는 보이지 않았다.
(e) 한편, 상기 (a)의 세포 표면의 갈렉틴 9와 CD25를 염색하여 플로우 사이타머트리로 측정한 바, 세포 표면에 갈렉틴 9를 발현하는 세포의 비율은 미자극에서는 CD4 양성 세포의 2% 미만이지만, TH1, TH2 분화 유도 자극하, 또는 TCR 자극하에 약 4%로 상승했다. 한편 TH17 분화 유도 조건에서는 2% 미만에 그쳤다. 각 분화 자극에 의한 세포 표면 갈렉틴 9 양성 세포의 비율은 갈렉틴 9의 분비와 매우 일치하고 있다.
(f) 상기 세포를 세포 표면 갈렉틴 9 양성과 음성으로 소팅하여 나누고, 갈렉틴 9 mRNA를 리얼타임 RT-PCR로 정량한 바, 양자에 통계적인 차는 보이지 않았다. 또 이들 세포를 고정화/세포막 침투화후에 항갈렉틴 9 항체로 염색하여 세포가 함유하는 모든 갈렉틴 9를 염색하여 플로우 사이타머트리에 의해 측정했지만, 이 경우에도 양 세포에 차는 보이지 않았다.
지금까지 나타낸 바와 같이 갈렉틴 9의 첨가는 TH17 분화를 강력하게 억제한다. 또 이미 보고되어 있는 바와 같이 TCR만의 자극시나, TH1이나 TH2로의 세포 분화 조건은 TH17 세포 분화를 억제한다. 따라서 이러한 조건으로 배양한 나이브 T 세포의 배양 상청중 갈렉틴 9 농도를 조사한 바, TH1 및 TH2 세포로의 분화 조건에 있어서 그 농도는 높고, TH17 세포 분화 조건에서는 억제되었다(도 8a). TH17 세포 분화 유도에는 TGF-β와 IL-6을 필요로 하지만, IL-6이 갈렉틴 9의 분비 억제를 일으키고 있는 것을 알 수 있다(도 8b). 이미 나타낸 바와 같이 TH17 세포 분화 조건에 있어서도 재조합체 갈렉틴 9를 첨가하면 TH17 분화가 억제되지만, 이 갈렉틴의 첨가에 의해 내재성 갈렉틴 9의 분비도 증강되었다(도 8c). 참고로, 첨가한 재조합체 갈렉틴 9는 인간형이며, 마우스 세포에도 생리 활성을 나타내지만 배양 상청 중의 갈렉틴 9 측정에 이용하는 ELISA에서는 검출되지 않는다. 또 갈렉틴 9의 분비량에 차가 있음에도 불구하고 갈렉틴 9의 mRNA량은 TH17 유도 조건하와 비유도 조건에서 유의한 차를 나타내지 않았다(도 8d).
이러한 결과에서 No skewed, TH1이나 TH2 분화 유도계에는 갈렉틴 9를 분비하는 세포가 존재하고 있는 것을 알 수 있다. 갈렉틴 9는 시그널 펩티드를 갖지 않아, 그 분비 메커니즘에 관해서는 완전히 명확하지 않지만, 그 국재 장소인 세포질로부터 직접, 또는 어떠한 수송 장치를 통하여 세포막을 통과하는 것은 틀림없다고 생각된다. 발명자들은 갈렉틴 9를 분비하는 세포에는 세포 표면에 분비의 중간 상태의 갈렉틴 9를 검출할 수 있지 않을까라고 생각하여, 항갈렉틴 9 항체를 이용하여 세포를 염색했다. 그 결과, 세포 표면에 갈렉틴 9 발현하는 세포 집단을 검출하는 것에 성공했다. 그런데, 이 갈렉틴 9 염색은 락토스 존재하에 행했다. 갈렉틴 9는 세포 표면에 수많이 존재하는 당지질이나 당단백질에 결합하기 때문에, 분비된 갈렉틴 9가 2차적으로 세포 표면에 결합한 것과, 목적으로 하는 세포를 구별하기 위해서이다. 예비 검토의 결과, 30 mM의 락토스는 2차적인 갈렉틴 9의 세포에 대한 결합을 완전히 억제하고, 한편 항원 항체 반응에는 영향을 주지 않는 것을 확인하고, 세포 표면의 갈렉틴 9 염색시에는 항상 30 mM 락토스를 첨가했다. TCR 자극전의 나이브 T 세포의 2% 미만은 세포 표면에 갈렉틴 9를 발현하고 있고, 당연히 그 대부분은 CD25- 세포이다(도 8e). TCR 자극은 CD25+ 세포를 증가시키지만, 동시에 갈렉틴 9 양성 세포도 증가시켜, CD25+ 세포 집단의 약 10%로 상승했다(도 8e). 이에 비해, TH17 세포 분화 유도 조건에서는 CD25+ 세포도 CD25+Gal-9+ 세포도 분명히 감소했다(도 8e). 각각의 TH 세포 분화계에서의 갈렉틴 9 분비(도 8a)와 세포 표면에 갈렉틴 9를 발현하는 세포의 비율(도 8e)은 매우 상관하고 있어, 갈렉틴 9를 분비하는 세포는 이들 세포 표면에 갈렉틴 9를 발현하고 있는 세포 집단인 가능성이 강하게 시사되었다. 갈렉틴 9를 분비하는 세포는 갈렉틴 9를 고발현하고 있을 가능성이 높다고 생각하여, CD4+CD25+ T 세포를, 세포 표면의 갈렉틴 9 발현의 유무로, 플로우 사이타머트리법을 이용하여 분리 정제하고, 각각의 갈렉틴 9 mRNA량을 Real time RT-PCR로 조사했지만, 예상과 반대로 양자에 유의한 차는 보이지 않았다(도 8f). 또 각각의 세포를 세포막 침투화 키트(BD Cytofix/Cytoperm)를 이용하여 세포 내외에 존재하는 모든 갈렉틴 9를 염색한 바, 갈렉틴 9의 발현에 차는 보이지 않았다(도 8f). 이러한 결과는 도 8d와도 매우 일치하지만, 세포 표면의 갈렉틴 9 발현과 분비의 관계에 관해서는 또 다른 실험으로 증명이 필요해졌다. 이후, 갈렉틴 9를 세포 표면에 발현하고 있는 CD4 T 세포를 THGAL9로 가칭한다.
〔THGAL9 세포의 활성〕
도 9에는, THGAL9는 TCR 자극에 의해 갈렉틴 9를 분비하여, IL-10 및 TGF-β를 발현 상승하는 것, 및 THGAL9는 TH17/Treg 밸런스를 제어하는 결과를 나타낸다.
(a) 마우스 비장 세포로부터 나이브 T 세포를 조제하고, 또한 세포 표면 갈렉틴 9 양성 세포(THGAL9 세포 : Gal-9+TH)와 음성 세포(non-THGAL9 : Gal-9-TH)를 소팅에 의해 분취했다. 각각의 세포를 TCR 자극(항 CD3 항체 코트 플레이트 중에서 항 CD28 항체를 첨가)의 유무의 조건하 96시간 배양하고, 배양 상청에 분비된 갈렉틴 9를 ELISA로 정량했다. THGAL9 세포만 TCR 자극에 의해 갈렉틴 9 분비가 유도되었다.
(b) 상기 세포의 사이토카인 mRNA 발현을 리얼타임 RT-PCR로 조사했다. THGAL9 세포는 non-THGAL9 세포와 비교하여 IL-10 및 TGF-β의 발현이 높고, 한편 IL-4 및 IL-17A의 발현은 낮았다.
(c) 나이브 T 세포를 TH17 분화 유도 자극하에 6시간 배양후, THGAL9 세포(Gal-9+TH) 또는 non-THGAL9(Gal-9-TH) 세포와 1 : 1의 비로 혼합하고, 그 후에는 TCR 자극만 부여하여 90시간 공배양했다. 배양 상청에 분비된 IL-17A를 ELISA로 정량하고, 한편 Foxp3 mRNA의 발현은 리얼타임 RT-PCR로 정량했다. THGAL9 세포의 첨가에 의해 IL-17A 분비가 억제되고, 한편 Foxp3의 발현은 상승했다.
(d) 상기 공배양을, 갈렉틴 9를 길항 저해하는 30 mM의 락토스(또는 컨트롤로서 수크로스) 존재하에 행했다. 락토스 첨가에 의해 THGAL9 세포에 의한 IL-17A 생성 억제는 해제되었다. 이 결과는, THGAL9 세포는 억제성 사이토카인 IL-10이나 TGF-β를 생성하고 있지만 TH17 분화 억제에 있어서는 갈렉틴 9가 필수적인 작용을 하고 있는 것을 시사한다.
(e) THGAL9에 의한 TH17 분화 억제 작용에 IL-10과 TGF-β의 관여가 낮은 것을 증명하기 위해, 전술한 (c)의 THGAL9는 공배양에 의한 TH17 억제계에 IL-10 및 TGF-β의 중화 항체를 각각 10 ㎍/ml의 농도로 첨가한 바, 이들 중화 항체는 THGAL9의 작용을 저해하지 않았다.
(f) 또한 IL-10의 관여를 밝히기 위해 전술한 (c)의 분석계에 재조합 IL-10을 첨가하여 IL-17 생성에 대한 작용을 조사했다. 조사한 범위의 농도에 있어서 IL-10은 통계적으로 유의한 억제 효과를 나타내지 않았다.
도 8에서 발견한 세포 표면에 갈렉틴 9를 발현하는 CD4 T 세포를 THGAL9로 가칭하고, 이것이 갈렉틴 9를 분비하여 TH17/Treg 밸런스를 제어하는 세포라고 가정했지만, 한편, THGAL9는 그것 이외의 T 세포와 비교하여 유의하게 높은 갈렉틴 9를 발현하고 있는 것은 아니었다(도 8f). 도 9에서는 THGAL9를 소팅으로 정제하고, 그 성질을 조사함으로써 THGAL9가 실제로 갈렉틴 9를 방출하는 것을 발견했다. THGAL9는 억제성 사이토카인인 IL-10, TGF-β도 고발현하고 있고, 한편 IL-4, IL-17의 발현은 유의하게 낮았다. 또한 THGAL9가 TH17을 억제하고 Treg 분화를 촉진하는 것을 공배양 실험에 의해 증명했다. THGAL9가 고발현하는 IL-10은 억제성 사이토카인의 대표격으로, TH17 분화를 억제한다고 하는 보고도 있지만(비특허문헌 40), 적어도 도 9에서 이용한 분석계에 있어서 TH17 분화 유도를 억제하는 약효의 본체는 대부분 갈렉틴 9인 것이 저해제를 이용한 실험(d, e) 및 재조합 IL-10을 이용한 실험(f)에서 나타났다. 그런데 THGAL9로부터 분비된 갈렉틴 9의 배양 상청중 농도는, 도 9a의 실험 결과에서는 150 pg/ml 정도이고, 안정화 갈렉틴 9를 이용하여 약효가 보이는 농도(30 nM : 1 ㎍/ml)보다 훨씬 낮다. 아마도 THGAL9는 타겟 세포에 매우 근접한 상태, 또는 접착한 상태로 파라크린 또는 세포 표면의 갈렉틴 9를 이용하여 상호 작용하여, 타겟 세포에 작용하고 있는 것은 아닌가라고 생각된다. 갈렉틴 9는 고농도에 있어서는 많은 세포에 세포사를 유도한다. 따라서 과도한 분비는 위험하며, THGAL9는 타겟 세포에 컨택트하여 인식한 후에 갈렉틴 9에 의한 제어를 행하고 있을 것으로 예상된다.
도 10에는, CD25+THGAL9는 TCR 자극에 의해 IL-10과 TGF-β1을 생성하는 결과를 나타낸다.
(a) 나이브 CD4 T 세포를 TCR 자극하에 96시간 배양하고, 소팅에 의해 CD25+THGAL9, CD25+non-THGAL9 및 CD25-non-THGAL9로 분리한다. 각각의 세포를 다시 TCR 자극하에 96시간 배양하고, 배양 상청 중의 갈렉틴 9를 ELISA로 정량했다.
(b) 상기 (a)의 세포의 IL-10 및 TGF-β1 발현을 리얼타임 RT-PCR에 의해 정량했다.
그 결과, THGAL9 세포를 TCR 반복 자극하면 갈렉틴 9 분비량의 증가와 IL-10 및 TGF-β의 mRNA 발현 레벨의 증가가 관찰되었다.
〔THGAL9는 안정화 갈렉틴 9 첨가로 증가한다〕
도 11에는 THGAL9가 안정화 갈렉틴 9 첨가에 의해 증가하는 결과를 나타낸다.
(a) 도 8의 (c)의 세포를 CD25와 세포 표면 갈렉틴 9로 염색하여, 플로우 사이타머트리법으로 측정한 결과를 나타낸다. 인간 안정화 갈렉틴 9의 첨가는 미자극의 naive CD4 T 세포에도 작용하여, Gal-9+CD25- 세포를 증가시켰다. TH17 분화 유도 조건에서는 THGAL9가 감소하지만(도 8e), 안정화 갈렉틴 9 첨가에 의해 THGAL9의 비율은 유의하게 상승했다. 또 갈렉틴 9를 많이 분비하는 Gal-9+CD25+ 세포의 비율도 TCR 자극 의존적으로 인간 안정화 갈렉틴 9 첨가가 유의하게 상승시켰다. 한편, 안정화 갈렉틴 9 첨가는 Gal-9-CD25+ 세포의 비율도 TCR 자극 의존적으로 상승시켰다. 이 세포 집단에는 Treg이 포함되어 있고, 갈렉틴 9의 Treg 분화 촉진 작용의 결과라고 생각된다.
(b) THGAL9는 갈렉틴 9에 더하여 IL-10, TGF-β를 생성한다. 이러한 사이토카인이 TCR 자극에 의한 THGAL9의 증가에 관여하고 있을 가능성을 조사하기 위해, 나이브 CD4 T 세포를 IL-10 중화 항체, IL-10R 중화 항체 또는 TGF-β 중화 항체의 존재하에 TCR 자극하여, THGAL9 세포의 출현을 플로우 사이타머트리법으로 조사한 결과를 나타낸다. 이들 사이토카인의 중화는 THGAL9의 증가에 전혀 영향을 주지 않았다.
(c) IL-10은 억제성의 T 세포인 Tr1의 분화를 촉진하는 것이 알려져 있고, THGAL9의 증가에도 영향을 미칠 가능성이 고려되고, (b)의 결과에서 적어도 TCR 자극에 의한 THGAL9의 증가에 있어서는 IL-10의 관여는 낮다고 생각되었다. 따라서 이번에는 나이브 CD4 T 세포에 IL-10(또는 컨트롤로서 인간 안정화 갈렉틴 9)을 첨가하고, TCR 자극하에 배양하여 THGAL9 세포의 출현을 플로우 사이타머트리법으로 조사한 결과가, 본 실험계에 있어서 IL-10에 의한 THGAL9의 증가는 보이지 않았다.
〔THGAL9 세포와 Tr1 세포의 비교〕
도 12에는 THGAL9 세포와 Tr1 세포의 비교를 행한 결과를 나타낸다. IL-10 생성 타입 1 제어성 T 세포(Tr1 세포)는 여러 경우에서 면역을 제어하고 있고, Tr1 세포를 이용한 자가 면역 질환이나 암치료에 관한 가능성도 논의되고 있다. 이 Tr1 세포에는 현재 몇개의 마커가 제창되어 있지만, 이 세포의 가장 현저한 특징은 대량으로 IL-10을 분비하는 것에 있다. 본 발명자들이 발견한 THGAL9 세포도 IL-10을 생성하고 있는 점에서, Tr1 세포와의 비교를 행했다. 지금까지 보고되어 있는 마우스의 Tr1 세포 마커에는 LAP(비특허문헌 21), NKG2D(비특허문헌 20), LAG-3(비특허문헌 22) 및 CTLA-4(비특허문헌 41)가 있다. 또 Treg과는 대조적으로 Tr1 세포는 Foxp3을 발현하지 않는다고 생각되고 있다(비특허문헌 42∼43). 따라서 나이브 CD4+ T 세포의 TCR 자극 전후에, Tr1 세포 마커 발현을 검토했다.
(a) 나이브 CD4+ T 세포를 이미 알려진 Tr1 세포 마커인 LAP, NKG2D, LAG-3 및 CTLA-4로 염색하고, THGAL9 세포와의 관련을 플로우 사이타머트리법으로 조사했다. CD25-THGAL9 세포는 이들 모든 Tr1 세포 마커를 발현했지만, CD25-non-THGAL9 세포에는 발현이 보이지 않았다.
(b) 이들 세포를 TCR 자극하여, CD25 양성이 된 T 세포 집단에서 동일한 측정을 행하면, 거의 모든 CD25 양성 CD4 세포가 Tr1 마커를 발현하게 되었다.
(c) (b)의 세포를 세포 표면 갈렉틴 9와 Tim-3으로 염색한 결과를 나타낸다. THGAL9에는 Tim-3 발현이 없는 것이 나타났다.
(d, e, f) 나이브 CD4+ T 세포를 IL-27(25 ng/ml)의 존재하 또는 비존재하에 TCR 자극을 가하고, 3일간 배양하여 Tr1로의 분화 유도를 촉진했다. 3일후의 배양 상청을 일부 회수하여 IL-10(d) 및 갈렉틴 9 농도(e)를 ELISA에 의해 정량했다. 남은 세포는 brefeldin A(10 ㎍/ml) 존재하에 PMA(50 ng/ml)과 이오노마이신(1 ㎍/ml)으로 4시간 자극하고, 세포 내부의 IL-10과 세포 표면의 갈렉틴 9로 염색하여 플로우 사이타머트리법으로 측정했다(f).
TCR 자극전의 CD25-THGAL9 세포는, 이미 알려져 있는 Tr1 세포 마커 전부를 발현했지만, 세포 표면에 갈렉틴 9를 발현하지 않는 CD25-CD4+ Non-THGAL9 세포에는 발현이 보이지 않았다(도 12a). 그 결과는 THGAL9와 Tr1이 서로 매우 비슷한 세포인 것을 나타내고 있다. 한편, TCR 자극에 의해 CD25를 발현한 세포에서는, 발현량에는 차이가 있지만 대부분의 세포가 상기 Tr1 세포 마커를 발현하게 되었다(도 12b). 원래 Tr1 마커로서 알려져 있는 이들 마커는 세포의 활성화 마커이기도 하여, TCR 자극을 받은 세포에서는 양의 다소는 있지만 발현이 보이는 것은 오히려 당연하다고 생각된다. 또 THGAL9 세포에는 Foxp3이 발현하고 있지 않아, Treg와는 상이한 세포인 것이 확인되었다(도 12b). 또 THGAL9에는 Tim-3의 발현도 보이지 않았다(도 12c). THGAL9와 Tr1은 유사한 성질을 갖고 있어, THGAL9는 Tr1과 동일 또는 그 부분 집단일 가능성이 시사되었다. 따라서 Tr1의 분화 인자의 하나인 IL-27 존재하에 나이브 T 세포를 TCR 자극하에 3일간 배양한 바, IL-27을 첨가함으로써 IL-10 및 갈렉틴 9 분비가 유의하게 높아지는 것이 나타났다(도 12d, e). 또한 분화 유도후의 세포를 세포 표면 갈렉틴 9 양성과 음성으로 나눠, 각각의 IL-10 발현량을 비교한 바, 갈렉틴 9 양성의 세포 집단의 약 절반이 IL-10을 발현하고 있고, 한편 갈렉틴 9 음성의 세포 집단에서는 20% 이하였다(도 12f). 이번 결과는 THGAL9가 Tr1과 매우 닮은 성질의 세포인 것을 나타냈다. 실제로 현재의 Tr1의 정의를 THGAL9는 만족하고 있고, 그 의미에 있어서 Tr1의 부분 집단이라고 할 수 있다. 지금까지 Tr1의 면역 제어 활성은 그 대부분이 IL-10에 의존한다고 생각되어 왔지만, 도 9에서 나타낸 바와 같이 TH17/Treg의 밸런스 제어에 있어서는 IL-10이 아니라 갈렉틴 9가 필수이다. 그런데 Tr1의 유도법을 나타낸 중에는 고농도 IL-10을 이용한 방법도 있지만, 그 경우에는 수주간의 배양이 필요하다. 도 11c에 있어서 IL-10의 첨가로 THGAL9의 증가를 조사했을 때에는 96시간의 배양이며, IL-10의 효과가 발휘되기 위해서는 단시간이었을 가능성도 고려된다.
도 13에서는 THGAL9와 Tr1의 관계를 더욱 명확하게 위해, 갈렉틴 9 녹아웃 마우스에서 Tr1 마커를 갖는 세포를 조사했다.
(a) 갈렉틴 9 녹아웃 마우스와 야생형 마우스의 비장 세포를 CD4 및 NKG2D, LAG-3, LAP 또는 CTLA-4로 염색하여, 플로우 사이타머트리법으로 측정한 결과를 나타낸다. 갈렉틴 9 녹아웃 마우스에서는 Tr1 마커 양성 세포의 비율이 야생형과 비교하여 감소했다.
(b) 갈렉틴 9 녹아웃 마우스와 야생형 마우스의 나이브 CD4 T 세포를 TCR 자극만(No skewed) 또는 TH17 분화 유도 자극 조건하(Th17 skewed)에 배양하여, IL-10 mRNA의 발현을 리얼타임 RT-PCR로 조사한 결과를 나타낸다. 갈렉틴 9 녹아웃 마우스에서는 IL-10 생성이 유의하게 감소했다.
(c) (b)의 No skewed 조건으로 배양한 세포를 brefeldin A(10 ㎍/ml) 존재하에 PMA(50 ng/ml)와 이오노마이신(1 ㎍/ml) 처리를 4시간 행하고, 세포 내부에 축적된 IL-10을 염색하여 플로우 사이타머트리법으로 측정한 결과를 나타낸다. 갈렉틴 9 녹아웃 마우스에서는 IL-10 양성 세포가 유의하게 감소하고 있었다.
이러한 결과는, 모두, THGAL9와 Tr1이 서로 매우 비슷한 세포이며, 현재의 Tr1 정의에 있어서는 THGAL9가 Tr1과 동일 또는 그 부분 집단인 것을 나타내는 것이다.
하기 표 1에, 각 장기에서의 CD4 양성 T 세포중의 세포 표면 갈렉틴 9 양성 세포(THGAL9)의 비율을 조사한 결과를 나타낸다. 하기 표 1 중 「Organs」는 「장기」를 의미한다. 「Thymus」는 「흉선」을 의미한다. 「LN」은 림프절을 의미한다. 「Spleen」은 「비장」을 의미한다. 「Peyer's patch」는 「페이에르판」을 의미한다. 「PBMC」는 「말초혈 단핵구」를 의미한다. 「Phenotype」는 「표현형(Phenotype)」을 의미한다. 「cells」는 「세포」를 의미한다. Thymus(흉선)에 있어서는 T 세포의 대부분이 CD4와 CD8의 이중 양성의 미숙한 상태이기 때문에, 여기서는 CD4 SP(CD4 단양성)의 T 세포에만 착안했다. 또한, THGAL9 세포의 존재를 여러가지 림프 기관에서 조사한 바, 흉선의 CD4 단양성 세포의 약 1/4, 림프절, 비장, 말소혈 및 페이에르판에서 유래한 CD4+CD25- T 세포의 각 4%, 7%, 15% 및 7%였다.
Figure pct00012
〔인간 TH17/Treg 분화에 대한 갈렉틴 9의 작용과 인간 THGAL9 세포의 동정〕
인간과 마우스의 면역계가 동일하지 않다는 것은 잘 알려져 있기 때문에, 본 연구에서의 마우스 및 마우스의 세포를 이용하여 해명한 갈렉틴 9의 기능이 인간에게도 적용된다는 보증은 없다. 인간이라도 갈렉틴 9가 TH17/Treg 밸런스 제어를 행하는 것, 및 인간에게도 THGAL9 세포가 존재하고 있다는 것을 확인하는 것이 임상 응용을 고려하는 데에 있어서 필수이다. 도 14에는, 인간 T 세포에 대한 갈렉틴 9의 작용과 THGAL9 세포를 동정한 결과를 나타낸다.
(a) 건강한 성인 4명으로부터 얻은 말소혈 CD4+ T 세포에 인간 안정화 갈렉틴 9(30 nM) 또는 컨트롤로서 PBS를 첨가하여, TCR 자극하 96시간 배양했다. CD25를 염색하여 플로우 사이타머트리법으로 측정했다.
(b) 상기 (a)의 세포를 CD25 및 Foxp3으로 염색하여, 각각의 발현을 플로우 사이타머트리법으로 측정했다.
(c) 인간 CD4+ T 세포에 인간 안정화 갈렉틴 9(30 nM) 또는 컨트롤로서 PBS를 첨가하고, TH17 세포로의 분화 유도 자극하에 9일간 배양하여, 배양 상청 중의 IL-17 농도를 ELISA로 정량했다.
(d) 인간 CD4+ T 세포를 TCR 자극하, 또는 미자극으로 96시간 배양하고, 세포 표면의 갈렉틴 9와 CD25를 염색하여 플로우 사이타머트리법으로 측정했다.
(e) 인간 CD4+ T 세포를 TCR 자극하 96시간 배양한 후, 소팅에 의해 세포 표면에 갈렉틴 9 양성 세포(CD25+THGAL9)와 음성 세포(CD25+non-THGAL9)로 분취했다. 각각을 TCR 자극하에 96시간 더 배양하여, 배양 상청 중의 갈렉틴 9를 ELISA로 정량하고, 한편 도면에 나타낸 각 사이토카인 mRNA 발현을 리얼타임 RT-PCR로 측정했다.
인간 말소혈로부터 얻은 CD4+ T 세포를 갈렉틴 9 존재하에 배양한 바, 갈렉틴 9에 의해 CD25 양성 세포와 CD25+Foxp3+ 세포의 비율이 증가하고, 그 증가는 TCR 자극에 의해 더욱 증강되었다(도 10a∼b). 이어서, 인간 TH17 분화 유도계에 갈렉틴 9를 첨가하여, IL-17의 방출을 지표로 TH17 분화를 조사한 바, 갈렉틴 9에 의해 IL-17 분비는 억제되었다(도 10c). 이러한 지견은 마우스 세포에서 해명된 갈렉틴 9의 기능과 동등하다. 또한, 건강한 성인의 말소혈 중에는, 세포 표면에 갈렉틴 9를 발현하는 CD4+CD25- T 세포가 1-4% 존재하고 있고, 이것을 TCR 자극하면 세포 표면에 갈렉틴 9를 발현하는 CD4+CD25+ T 세포가 현저하게 증가했다(도 10d). 이 세포는 세포 표면에 갈렉틴 9를 발현하지 않는 CD4+CD25+ T 세포와 비교하여 유의하게 많은 갈렉틴 9를 분비하여, IL-10 및 TGF-β의 mRNA 발현도 높았다(도 10e). 한편 IL-2 및 INF-γ의 mRNA 발현에는 유의차가 없고, IL-4 및 IL-17 mRNA 발현은 오히려 세포 표면에 갈렉틴 9를 발현하는 세포에 있어서 낮은 값을 나타냈다(도 10e). 이러한 결과에서, 갈렉틴 9의 기능은 인간과 마우스에서 동등하며, 인간에 있어서도 THGAL9 세포가 존재하고 있는 것이 분명해졌다.
본 실시예에 의하면, THGAL9가, 갈렉틴 9를 분비하여, TH17/Treg 밸런스를 조정하는 세포로서 기능할 수 있는 것이 확인되었다. 갈렉틴 9의 작용이 마우스에 있어서도 인간에 있어서도 동일하다는 것은, 갈렉틴 9, 특히 안정화 갈렉틴 9의 임상 응용에 있어서는 매우 중요한 지견이다. 또한 THGAL9가 인간에게도 존재하고 있는 것이 나타났다는 것에서, 갈렉틴 9에 의한 면역 제어는 동물의 종을 초월하여 잘 보존되어 있다고 생각된다. THGAL9는 세포 표면의 갈렉틴 9에서 검출할 수 있기 때문에, 도 9a에서 나타낸 바와 같이, 세포를 살아 있는 채로 단리 정제하는 것이 가능하고, 이 세포를 이용한 응용 기술의 개발도 용이하다. 또한 THGAL-9는 안정화 갈렉틴 9 첨가로 증가하는 것이 나타나, 앞으로 여러가지 응용에 유용하다고 생각되는, 세포를 in vitro에서 증가시키는 기술의 하나도 발견했다. THGAL9 이외의 T 세포도 동등한 갈렉틴 9를 발현하고 있음에도 불구하고 그것을 분비하지 않는다. THGAL9만 갈렉틴 9를 분비할 수 있는 것은, 이 세포에 존재하는 분비 메커니즘에 따른 것으로 생각되고, 그것을 제어할 수 있다면, 면역 제어의 새로운 방법도 될 수 있다. THGAL9의 발견은, 갈렉틴 9 분비 메커니즘의 해명에도 중요한 공헌이 된다고 생각된다. 예컨대 THGAL9와 그것 이외의 T 세포를 이용한 망라적인 발현 프로파일링을 mRNA 레벨이나 단백 레벨로 행하는 것이 방법으로서 생각된다. 또 THGAL9는 면역 밸런스를 간접적으로 알 수 있는 대리 표지자로서 이용할 수 있을 가능성도 있고, 예를 들면 여러가지 면역성 질환, 암, 감염증 등의 진단이나 이들에 대한 감수성의 진단 또는 약제의 효과를 조사하는 지표로서이다.
〔THGAL9 이외의 세포 표면에 갈렉틴 9를 발현하는 세포〕
인간 안정화 갈렉틴 9 투여는 전술한 자가 면역 질환 모델 이외에도 여러가지 병태 모델에 있어서 약효를 나타내는 것이 나타나 있다. 이러한 경우에 있어서도 투여한 갈렉틴 9가 계기가 되어, THGAL9 갈렉틴 9를 포함하는 갈렉틴 9 분비 세포가 유도되어 있을 가능성이 있다. THGAL9는 세포 표면에 갈렉틴 9를 발현하는 세포로서 동정되고, 그것이 갈렉틴 9 분비능을 갖는 것이 확인되었다. 발명자들은 세포 표면의 갈렉틴 9는 분비의 중간체로서 검출되어 있다고 생각하고 있고, 따라서 세포 표면의 갈렉틴 9 발현을 지표로 THGAL9 이외의 갈렉틴 9 발현 세포를 탐색할 수 있을 것으로 예상된다. 적어도 세포 표면에 노출되어 있는 것은 이미 세포막을 트랜스로케이트한 결과이며, 넓은 의미로는 분비되어 있는 것이 된다. 따라서 여러가지 병태 모델에 있어서 세포 표면에 갈렉틴을 발현한 세포군의 존재를 조사했다.
〔복막염 모델에서의 안정화 갈렉틴 9의 작용과 그 때 유도되는 세포 표면 갈렉틴 9 발현 세포〕
도 15에는 심각한 복막염 모델인 맹장 결찰 천자법에 의한 복막염(cecal ligation and puncture : CLP)의 처치를 한 마우스를 나타낸다. 여기서는 BALB/c 마우스를 이용하고 있다. G21의 니들을 이용하여 결찰한 맹장에 구멍을 뚫고, 그 후의 생존을 경시적으로 조사하는 모델이다.
도 16에는 인간 안정화 갈렉틴 9 투여의 CLP에서의 유효성을 조사한 결과를 나타낸다. 이 지견은 오카야마대학 의학부, 마쯔가와 아키히로 교수에 의한 것이며, 이미 학회 등에서 발표되어 있기 때문에 여기서는 결과의 개략을 설명한다. CLP에 의해 복막염을 발증시켜 경시적으로 생존율을 조사했다. (a) C57BL/6J 야생형 마우스(WT)와 마우스 갈렉틴 9의 트랜스제닉 마우스(Gal-9 Tg)의 비교. (b) WT 마우스에게 CLP와 동시에 인간 안정화 갈렉틴 9(30 ㎍/마우스; 또는 컨트롤로서 PBS)를 1회 정맥내 투여했을 때의 생존율. (c) WT 마우스에게 CLP 처치를 하고, 그 24시간 후에 인간 안정화 갈렉틴 9(30 ㎍/마우스; 또는 컨트롤로서 PBS)를 1회 정맥내 투여했을 때의 생존율. (d) WT 마우스에게 CLP 처치를 하고, 그 24시간후에 인간 안정화 갈렉틴 9(30 ㎍/마우스; 또는 컨트롤로서 PBS)를 1회 피하 투여했을 때의 생존율. (e) 누드 마우스에게 CLP와 동시에 인간 안정화 갈렉틴 9(30 ㎍/마우스; 또는 컨트롤로서 PBS)를 1회 피하 투여했을 때의 생존율.
안정화 갈렉틴 9는 이 심각한 복막염에 대하여도 CLP 직후 또는 CLP로부터 24시간 후의 1회 투여로 마우스의 생존율을 유의하게 연장했다. 그러나, 이 효과는 누드 마우스에서는 보이지 않았다는 점에서(도 16e), 안정화 갈렉틴 9가 T 세포를 통해 작용하고 있는 것이 강하게 시사되었다.
도 17에는 CLP후 24시간의 마우스로부터 비장 세포를 취출하여 24시간 배양하고, 배양 상청 중의 사이토카인 농도를 조사한 결과를 나타낸다. 이것도 오카야마대학 의학부, 마쯔가와 아키히로 교수 등에 의해 학회 등에서 이미 알려져 있는 것이다. 안정화 갈렉틴 9 투여한 마우스 비장 세포에서는 TNF-α, IL-12, IL-10의 생성이 저하되고, 한편 IL-17의 생성이 상승했다. 지금까지 자가 면역 질환 모델에 있어서 갈렉틴 9는 IL-17을 저하시키는 작용을 나타냈지만 여기서는 상승시켰다. 갈렉틴 9는 양방향성의 면역 조정 인자이며, 경우에 따라, 또는 세포에 따라 작용이 상이하다. 예컨대 자가 면역 질환에 있어서 TNF-α를 억제하지만, 한편 단구나 수상 세포에 작용하여 TNF-α 생성을 자극하는 것은 이미 알려져 있고(비특허문헌 13), IL-17에 있어서도 경우에 따라 갈렉틴 9의 방향성이 변하는 것을 예상하는 것은 어렵지 않다. TNF-α, IL-12, IL-17 등의 염증성 사이토카인은 미생물 배제에 작용하는 한편, 과도한 염증 야기에 의해 조직 파괴도 일으킨다. 상세한 메커니즘은 밝혀지지 않았지만, 안정화 갈렉틴 9 투여가 생존율을 향상시키고 있는 사실은, 여기에서 보여진 사이토카인 밸런스의 변화가 복막염하에서의 생존에 유리하게 작용하고 있다고 생각된다. 갈렉틴 9 복막염(또는 패혈증)에 있어서도 중요한 작용을 하고 있는 것은 자명하다.
도 18은 CLP 24시간후의 비장 세포를 CD3, NK1.1, GL-3 및 세포 표면 갈렉틴 9로 염색하여, 플로우 사이타머트리법으로 해석한 결과를 나타낸다. 안정화 갈렉틴 9 투여에 의해 세포 표면 갈렉틴 9 발현 세포가 증가하고 있다. 특히 눈에 띈 증가를 보인 것은 NKT 세포(CD3+NK1.1+), THGAL9를 포함하는 세포 집단(CD3+NK1.1- 및 CD3+GL-3-), γδT 세포(CD3+GL3+)이다. 특히 NKT 세포, NK 세포 및 γδT 세포는 적어도 이 모델에 있어서는, 그 거의 전부가 세포 표면 갈렉틴 9 양성인 것이 처음으로 나타났다. 이들 세포는 THGAL9와 마찬가지로, 갈렉틴 9에 의해 면역을 제어하고 있을 가능성이 매우 높다. 이들 세포를 이입하는 것이 심각한 복막염 치료에 유용하다는 것이 시사된다.
도 19는 체내에 암을 가지고 있는 마우스에게 안정화 갈렉틴 9를 투여하여, 그 때의 세포 표면 갈렉틴 9 양성 세포를 조사한 결과를 나타낸다. 이미 알려진 바와 같이 안정화 갈렉틴 9 투여는 마우스 섬유 육종 Meth A를 복강내에 이식한 마우스에게 투여하면 생존을 연장한다(비특허문헌 32). 그 방법에 따라서 Meth A를 복강내에 도입하고, 그 직후부터 인간 안정화 갈렉틴 9를 3회/주로 복강내 투여(30 ㎍/마우스)했다. Meth A 이식으로부터 7일후에 복강내 세포와 비장 세포를 취출하여 표시의 세포 표면 마커를 염색하고, 플로우 사이타머트리법으로 측정한 결과를 나타낸다.
(a) 복강 세포 내 CD4 양성 세포를 CD25와 세포 표면 갈렉틴 9 발현으로 전개한 결과를 나타낸다. 인간 안정화 갈렉틴 9 투여에 의해 세포 표면에 갈렉틴 9를 발현한 세포의 비율이 현저하게 증가하고, 한편 CD25+Gal-9-는 감소했다. CD25+Gal-9- 세포는 암에 대한 면역을 억제한다고 생각되는 Treg를 포함하는 세포 집단이다.
(b) (a)의 세포 내 CD8 양성 세포를 CD25와 세포 표면 갈렉틴 9 발현으로 전개한 결과를 나타낸다. 인간 안정화 갈렉틴 9 투여에 의해 세포 표면에 갈렉틴 9를 발현한 CD8 세포의 비율이 현저하게 증가했다.
(c) 인간 안정화 갈렉틴 9를 투여한 Meth A 암을 가지고 있는 마우스의 비장 세포를 PDCA-1, CD11c 및 세포 표면 갈렉틴 9로 염색하여, 플로우 사이타머트리법으로 측정한 결과를 나타낸다. 형질 세포양 수상 세포 : pDC, pDC양 대식 세포 : pDC-Mφ, 고전적 수상 세포 : cDC, 및 수상 세포나 대식 세포와 상이한 세포 : nonDCMφ의 각각에서 세포 표면 갈렉틴 9 발현 레벨을 비교했다. pDC양 대식 세포는 급성 폐장애의 모델에 있어서 그것을 세포 이입하면 증상을 억제하는 것이 나타나 있다(비특허문헌 44). 이 경우에도 pDC양 대식 세포가 분비하는 갈렉틴 9가 효과의 주체를 이루고 있는 것이 예상된다.
이 암을 가지고 있는 모델에 있어서도 투여한 안정화 갈렉틴 9가 약효를 나타낼 때에 전술한 바와 같이 세포 표면에 갈렉틴 9를 발현한 세포가 출현하고 있다. 이들 세포의 이입이 암치료에 유용하다는 것이 시사되고, 또 이들 세포를 마커로서 암의 진행이나 치료의 효과를 진단할 수 있을 가능성이 시사된다.
도 20∼21은 인간 안정화 갈렉틴 9의 자연 발증성 자가 면역 질환 모델에서의 유효성을 조사한 결과를 나타낸다. MRL/MpJUmmCrj-1pr/1pr 마우스는 전신성 에리테마토데스의 모델로서 범용되는 자연 발증성 자가 면역 질환 모델이다. 이 마우스(♀, 8주령)에게 인간 안정화 갈렉틴 9를 표시의 용량으로 3회/주의 스케줄로 22주령까지 복강내 투여하고, 경시적으로 뒷다리 발바닥 부종 용적 측정(주 1회 ; 도 1과 마찬가지로 PLETHYSMOMETER를 이용하여 측정), 체중 측정(주 3회), 뇨중 단백 농도 측정(주 1회)을 행했다. 고용량 30 ㎍/마우스에서는 뇨단백 농도(도 20a), 체중 변화(도 20b), 뒷다리 발바닥 부종 용적 변화(도 21 a)와, 실험 종료시(22주령째)의 헤마토크릿 치(도 21b)의 전부에 있어서 통계적으로 유의한 치료 효과를 나타냈다. 전신성 에리테마토데스는 매우 심각한 자가 면역 질환이며, 과거 50년간 고용량의 스테로이드 투여 이외의 치료 선택지가 없었다. 이 질환은 자가 항체의 생성이 현저하고, 따라서 항체 생성을 억제하는 치료법이 해결책이라고 생각되어 왔다. 2011년에 FDA로부터 인가된 belimumab는 B 세포를 억제하는 항체이며, 이 질환 치료의 타겟으로서 B 세포 및 자가 반응성 항체의 생성 억제가 중요하다는 것이 임상 연구에 의해 증명되었다.
도 22는 안정화 갈렉틴 9의 항체 생성에 대한 작용을 조사한 결과를 나타낸다. 전술한 바와 같이 안정화 갈렉틴 9는 전신성 에리테마토데스의 모델 마우스에 유효성을 나타내기 때문에, 항체 생성 및 B 세포 억제에 작용하고 있을 가능성이 시사된다. 따라서 항체 생성에 대한 약물의 효과를 조사할 때 범용되는 양적혈구(SRBC) 투여에 의한 항양적혈구 IgM 항체 생성계를 이용하여, 안정화 갈렉틴 9의 작용을 조사했다. C57BL/6J 마우스(♀)에게 SRBC를 복강내 투여하고, 그 직후에 인간 안정화 갈렉틴 9(30 ㎍/마우스) 또는 컨트롤로서 PBS를 1회 복강내 투여했다. 각각의 시점에서, 3-5마리의 마우스로부터 채혈 및 비장 적출을 행하여 항체 생성 및 B 세포를 조사했다. 그 결과, 인간 안정화 갈렉틴 9 투여에 의해 SRBC 특이적인 IgM의 농도는 저하되었지만(a), 총 IgM 농도(b), 총 IgG 농도(c)에는 통계적인 변화를 주지 않는다는 것이 판명되었다. 또한 MRL/MpJUmmCrj-1pr/1pr 마우스(♀, 8주령)에게 30 ㎍/마우스의 인간 안정화 갈렉틴 9 또는 컨트롤로서 PBS를 3회/주 투여하고, 7일째에 채혈하여, 혈청중의 항이중가닥 DNA 항체(자가 면역성 항체의 대표) 농도를 조사한 바, 안정화 갈렉틴 9 투여에 의해 항이중가닥 DNA 항체가 유의하게 억제되는 것을 알 수 있다. 이러한 작용은 항체 생성의 본체인 B 세포에 안정화 갈렉틴 9가 작용하고 있을 가능성을 시사하는 것이다.
도 23에는 B 세포 해석 방법을 나타낸다. 비장 세포의 CD19와 GL-7을 염색하여 플로우 사이타머트리법으로 전개하면, Germinal center B 세포(CD19+GL-7+)와 그것 이외의 B 세포(CD19+GL-7-)로 나누어진다. 또한 Germinal center B 세포를 FSC값에 따라서 세포의 크기에 따라 분리하면 비교적 큰 세포인 Centroblast와 비교적 작은 세포인 Centrocyte로 분리할 수 있다. 이 FSC에 의한 Centroblast와 Centrocyte의 분리는, 각각이 CXCR4 고발현, 저발현인 보고와 매우 일치하고 있어, 이후의 해석에 채택했다.
도 24는 도 22의 마우스로부터 적출한 비장 세포를 경시적으로 조사한 것이다. 안정화 갈렉틴 9 투여후 4일째에 Germinal center B 세포가 감소하고 있어, Centroblast와 Centrocyte가 함께 감소하고 있는 것을 알 수 있다(a, b). 또 갈렉틴 9 녹아웃 마우스에게 SRBC를 투여하고, 4일째에 비장 세포를 해석하면, Germinal center B 세포, Centroblast 및 Centrocyte의 양자 모두 야생형과 비교하여 많았다. 이것은 안정화 갈렉틴 9 투여로부터 상정되는 생체내에서의 갈렉틴 9의 작용과 모순되지 않는다. 즉 갈렉틴 9는 생체내에 있어서도 B 세포 및 항체 생성을 억제하고 있는 인자인 것이 시사되었다. 따라서 B 세포 및 항체 생성을 마이너스로 제어하기 위해 갈렉틴 9를 분비하는 세포가 존재하는 것이다.
도 25에서는 우선 B 세포의 세포 표면 갈렉틴 9 발현을 조사했다. 그 결과 B 세포는 Germinal center B 세포도, 그것 이외의 B 세포도 모두 세포 표면에 갈렉틴 9를 발현하고 있어, Germinal center B 세포에 있어서 그 발현이 높다는 것을 알 수 있다(a). 또 Germinal center B 세포 중에서는 Centroblast가 세포 표면 갈렉틴 9 발현이 높다는 것을 알 수 있다(b). 한편, Germinal center B 세포에서 조사하는 한, 안정화 갈렉틴 9 투여는 세포 표면의 갈렉틴 9 발현에 영향을 주지 않지만, SRBC에 의한 감작에 따라서는 세포 표면 갈렉틴 9 발현 세포의 비율이 상승한다는 것을 알 수 있다.
B 세포의 성숙에는 CD4 T 세포가 깊게 관여하고 있고, 특히 Follicular B helper T cells(TFH)이라고 불리는 CD4 양성 세포의 역할이 크다고 한다. 따라서, 도 26에서는 SRBC 투여 7일째의 마우스 비장 세포를 CD4 및 TFH의 마커라고 일컬어지는 CXCR5 및 ICOS로 염색하여, 각각의 세포 집단의 세포 표면 갈렉틴 9 발현을 플로우 사이타머트리법에 의해 조사했다. (a∼d)에 나타낸 바와 같이 이들 CD4 T 세포의 세포 표면 갈렉틴 9 발현 레벨은 다양하다. 특히 높은 발현을 나타낸 것은 ICOS-CXCR5+의 CD4 양성 세포와 ICOS+CXCR5-의 CD4 양성 세포이다. 이들 세포가 갈렉틴 9를 분비하여 항체 생성을 제어하고 있을 가능성이 나타났다.
이들 세포 표면에 갈렉틴 9를 발현하고 있는 세포군은 전신성 에리테마토데스를 포함하는 자가 면역 질환 치료나 진단에 유용할 가능성이 나타났다.
도 27에서는, 인간 안정화 갈렉틴 9 투여에 의한 작용을 모식적으로 예시하여 정리했다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 인간 안정화 갈렉틴 9를 피하 투여하면 그 약리 효과는 지속된다. 그러나, 도 2에 나타낸 바와 같이 투여후에 혈중에 나타나는 농도는 매우 낮아, 적어도 면역 제어에 있어서 약효를 갖지 않을 가능성이 높다. 피하 투여한 투여 부위 및 림프관ㆍ림프절의 경유시에는 보다 높은 농도로 존재하고 있다고 생각되고, 그 때 면역 세포에 작용을 주고 있을 가능성이 고려된다. 그런데, 도 2에 나타낸 바와 같이, 투여한 인간 안정화 갈렉틴 9는 신속하게 체내로부터 배출되기 때문에, 고농도의 갈렉틴 9에 작용을 받은 면역 세포가 안정화 갈렉틴 9의 배출후에 그것 대신 면역 제어를 행하고 있을 가능성이 고려된다. 본 발명에 있어서, 발명자들은 갈렉틴 9를 세포 표면에 발현하고, 또한 그것을 분비하여 TH17/Treg 밸런스를 조정하는 신규 세포 THGAL9를 발견했다. 또한 THGAL9는 인간 안정화 갈렉틴 9 첨가에 의해 증가하는 것도 발견했다. 즉 투여된 인간 안정화 갈렉틴 9는, 그 직접 작용 외에 THGAL9를 유도하고, 그 유도된 THGAL9가 국소로 갈렉틴 9를 필요한 용량 분비하여 각종 세포에 작용한다고 생각된다. 이것은 안정화 갈렉틴 9의 면역 제어 활성이 지속되는 것을 모순없이 설명한다. 발명자들은 세포 표면 갈렉틴 9는 분비의 중간 상태라고 생각하고, 세포 표면 갈렉틴 9 발현을 지표로 하여, THGAL9 이외의 갈렉틴 9를 분비하는(가능성이 있는) 여러가지 세포 집단을 발견했다. 이들 세포는 THGAL9와 같이 갈렉틴 9를 분비함으로써 면역을 조정하고 있다고 생각된다.
〔갈렉틴 9 투여는 LLC 암을 가지고 있는 마우스의 생존을 연장하고, 그 때 pDC양 대식 세포가 증가한다〕
도 19의 (c)에 나타낸 바와 같이, 발명자들은 고전적 수상 세포(cDC), 형질 세포양 수상 세포(pDC), 및 pDC양 대식 세포가 세포 표면에 갈렉틴 9를 발현하고 있는 것을 Meth A 암을 가지고 있는 마우스 모델에서 얻어진 세포를 이용하여 나타냈다. 또한, 본 실시예에서는, 다른 암종에서의 검토예를 나타낸다. 즉, 도 29에 나타낸 바와 같이, 갈렉틴 9 투여가 체내에 암을 가지고 있는 마우스의 생존을 연장하고, 그 때에 pDC양 대식 세포가 증가했다.
(a) C57BL/6(♀, 7∼10주령)에 마우스 폐암 유래 종양 세포주 LLC를 5×105 세포복강에 접종하고(Day0), 당일부터 인간 안정화 갈렉틴 9를 30 ㎍, 3회/주로 복강내 투여(컨트롤은 PBS)했을 때의 생존율 변화를 경시적으로 조사한 결과를 나타낸다. 횡축(Days after tumor inoculation)은 LLC 접종후의 일수를, 종축(Percent survival)은 생존율을 퍼센트로 나타내고 있다. 통계 해석은 로그 랭크 검정에 의해 행했다.
(b) (a)의 7일째의 복강 세포를 CD11c, PDCA-1, Ly-6C 및 F4/80의 항체로 염색하여, 플로우 사이타머트리법으로 해석한 결과를 나타낸다. 갈렉틴 9 투여군에서는 pDC 마커인 CD11c와 PDCA-1을 발현하고 있고, 또한 대식 세포 마커인 Ly-6C 또는 F4/80을 발현하고 있는 세포, 즉 pDC양 대식 세포의 비율이 유의하게 상승했다. pDC양 대식 세포가 갈렉틴 9에 의한 생존 연장에 관여하고 있는 것이 예상된다. 각 그룹 5마리의 마우스를 이용하여 Mean±SEM로 나타내고 있다. ***P<0.001.
〔갈렉틴 9는 시험관 내에 있어서 M-CSF에 의한 CD11c 양성 세포의 분화를 Tim-3 비의존적으로 촉진한다〕
도 30에 나타낸 바와 같이, 본 실시예에 있어서, 갈렉틴 9는, 시험관 내에 있어서 M-CSF에 의한 CD11c 양성 세포의 분화를 Tim-3 비의존적으로 촉진했다.
(a) 마우스의 대퇴골 및 경골로부터 골수 세포를 선별하고, 10%의 소태아 혈청과 항생 물질을 포함하는 RPMI-1640 배지중에서 2시간 배양하여 접착 세포(성숙 대식 세포)를 제거했다. 남은 골수 세포를 GM-CSF(Peprotech, 20 ng/ml) 또는 M-CSF(R&D systems, 20 ng/ml)를 포함하는 배지중에서 7일간 배양하고, 이번에는 비접착 세포를 세정하여 제거하고, 접착 세포를 플로우 사이타머트리로 해석했다. 접착 세포의 >95%는 F4/80과 CD11b 이중 양성이라는 점에서, 성숙한 대식 세포라고 판정되었다. 그 세포에서의 CD11c의 발현이, 분화중에 부여한 인간 안정화 갈렉틴 9(30 nM)에 의해 어떻게 영향을 받는지를 조사한 결과를 나타낸다. 갈렉틴 9는 GM-CSF에 의해 분화된 대식 세포의 CD11c 발현에는 영향을 미치지 않았지만, M-CSF에 의해 분화된 대식 세포의 CD11c 발현을 상승시켰다.
(b) (a)의 M-CSF에 의한 분화 분석을 갈렉틴 9의 저해제인 락토스(30 mM) 또는 컨트롤로서 수크로스(30 mM)의 존재하에 행한 결과와, Tim-3 중화 항체(eBiosciences, RMT-3-23, 10 ㎍/ml) 또는 아이소타입 컨트롤 항체(eBiosciences, 10 ㎍/ml) 중에서 행한 결과를 나타낸다. 락토스는 갈렉틴 9에 의한 CD11c 발현 상승을 저해했지만, Tim-3의 중화 항체는 CD11c 발현 상승에 영향을 미치지 않았다. Tim-3은 갈렉틴 9의 타겟으로서 가장 잘 알려진 분자이지만, 본 실험의 갈렉틴 9에 의한 CD11c 발현 상승에 있어서는 관여가 없는 것이 시사되었다.
〔갈렉틴 9와 M-CSF에 의해 분화된 CD11c 양성 세포는 pDC양 대식 세포의 전구체 세포이다〕
도 30에서, 갈렉틴 9는 M-CSF에 의해 분화되는 대식 세포의 CD11c 발현을 상승시키는 점에서, 대식 세포를 수상 세포로 분화시키고 있을 가능성이 시사되었다. 이미 알려진 바와 같이 갈렉틴 9는 인간 말초혈 단핵구의 고전적 수상 세포로의 분화를 촉진한다(Dai, S.Y. et al, J Immunol, 2005 175 : 2974-81). 따라서, 본 실시예에서는, 얻어진 세포의 표현형을 상세히 조사했다. 그 결과를 도 31에 나타낸다.
(a) 플로우 사이타머트리법에 의한 해석에서는 갈렉틴 9에 의해 B220, I-A/I-E 발현이 상승하고, 한편 CD14 발현이 감소되는 것을 알았다. 한편 대식 세포의 마커로서 범용되는 F4/80은 갈렉틴 9의 첨가에 상관없이 고발현하고 있어, 대식 세포의 표현계를 유지하고 있다.
(b) 전사 인자 mRNA를 리얼타임 RT-PCR로 해석한 바, 수상 세포의 분화에 필요로 되는 IRF4 및 IRF8이 갈렉틴 9에 의해 상승했다. 또 pDC의 전구 세포에 발현하고 있다고 하는 SpiB가 갈렉틴 9에 의해 상승하고 있고, 성숙 pDC의 전사 인자 E2-2를 억제한다고 하는 Id2도 갈렉틴 9 첨가에 의해 상승했다.
(c) 또한 TLR7, TLR8 및 TLR9의 mRNA도 갈렉틴 9 첨가에 의해 상승했다.
(d) M-CSF와 갈렉틴 9 존재하에 7일간 분화시킨 대식 세포에 표시의 TLR 아고니스트를 첨가하여, 6시간 배양한 후에 IFN-α와 IFN-β mRNA 발현을 리얼타임 RT-PCR로 측정한 결과를 나타낸다. 이용한 아고니스트는 각각 LPS(100 ng/ml, Sigma) : TLR4 아고니스트, R848(5 ㎍/ml, Imgenex) : TLR7/8 아고니스트, CpG(TypeA CpG ODN1585, 10 ㎍/ml, Invivogen) : TLR9 아고니스트이다. 성숙한 pDC라면 이들 TLR 아고니스트 자극에 의해 타입 1 인터페론을 고발현하겠지만, 높은 상승은 보이지 않았다.
이러한 결과, M-CSF와 인간 안정화 갈렉틴 9에 의해 분화된 대식 세포는 pDC에 가까운 표현형을 나타내지만 성숙한 pDC에는 이르지 않고, 따라서 pDC양 대식 세포의 전구체라고 생각된다. 갈렉틴 9는 대식 세포를 pDC양 대식 세포로 분화 유도하는 것이 시사되었다.
〔갈렉틴 9와 M-CSF에 의해 분화된 CD11c 양성 세포는 LPS 자극에 의해 pDC양 대식 세포로 성숙한다〕
도 32에 나타낸 바와 같이, 갈렉틴 9와 M-CSF에 의해 분화된 CD11c 양성 세포는, LPS 자극에 의해 pDC양 대식 세포로 성숙했다.
(a) 지금까지의 결과로부터, 갈렉틴 9는 M-CSF에 의해 분화된 대식 세포를 pDC양 대식 세포의 전구체라고 생각되는 표현계의 세포로 분화시키는 것이 나타났다. 그 세포에 LPS 자극을 부여함으로써 pDC양 대식 세포로 분화가 진행되는지의 여부를 검토했다. 도 30의 방법으로 M-CSF와 갈렉틴 9에 의해 분화된 대식 세포를 100 ng/ml의 LPS(컨트롤은 PBS) 중에서 24시간 배양하여 CD11c, Ly-6C 및 F4/80의 발현을 플로우 사이타머트리법으로 해석한 결과를 나타낸다. 샘플수는 각각 4로 통계 해석하고 있다. LPS 자극에 의해 pDC의 표현형인 CD11c와 PDCA-1 이중 양성 세포의 비율이 상승하고, 한편 대식 세포의 표현형인 Ly-6C 및 F4/80의 발현도 상승했다. 이것은 LPS 자극에 의해 전구체로부터 성숙도가 높은 pDC양 대식 세포로 분화가 진행된 결과라고 생각된다.
(b) 도 30의 방법으로 M-CSF와 갈렉틴 9에 의해 분화된 대식 세포를 100 ng/ml의 LPS(컨트롤은 PBS) 중에서 6시간 또는 24시간 배양하여, 표시의 mRNA 발현을 리얼타임 RT-PCR로 측정한 결과를 나타낸다. mRNA 발현량은 β2 마이크로글로불린 또는 글리세르알데히드 3인산 디히드로게나아제의 mRNA 발현으로 표준화하여, 종축에 나타냈다. 샘플수는 각각 4로 통계 해석하고 있다. **P<0.01, ***P<0.001. pDC를 특징짓는 타입 1형 인터페론의 발현에 필수적인 전사 인자인 IRF7이 LPS 자극에 의해 현저하게 상승했다. 또 성숙한 pDC에 고발현하고 있다고 하는 E2-2는 LPS를 6시간 처리함으로써 현저하게 상승하고, 24시간후에는 반대로 저하되었다. * P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.
(c) 도 30의 방법으로 M-CSF와 갈렉틴 9로 분화시킨 대식 세포를 100 ng/ml의 LPS로 24시간 배양하여(컨트롤은 PBS), I-A/I-E의 발현을 플로우 사이타머트리법으로 해석한 결과의 일례를 나타낸다. 회색의 히스토그램은 아이소타입 컨트롤, 파선의 히스토그램이 PBS 컨트롤, 실선의 히스토그램이 LPS 자극. LPS 처리군과 컨트롤 PBS군(각각 n=4)에서, I-A/I-E 양성 세포의 비율을 막대 그래프에 나타내고, 통계 해석한 결과를 나타낸다. I-A/I-E의 발현은 LPS 자극에 의해 상승했다. *P<0.05.
이러한 결과, 갈렉틴 9에 의해 pDC양 대식 세포의 전구체라고 생각되는 세포로 분화된 대식 세포는 LPS 자극에 의해 보다 성숙한 pDC양 대식 세포의 표현형을 나타내는 것이 확인되었다.
도 32에서는, 갈렉틴 9에 의해 분화된 pDC양 대식 세포 전구체가 LPS 자극에 의해 성숙한 pDC양 대식 세포의 표현형이 되는 것을 나타냈다. 또한, 그 성숙형 pDC양 대식 세포의 기능을 조사했다. 그 결과를 도 33에 나타낸다.
(a) pDC는 타입 1형 인터페론을 고발현하는 것이 알려져 있기 때문에, In vitro에서 성숙시킨 pDC양 대식 세포가 타입 1형 인터페론의 대표인 IFN-α와 IFN-β를 분비하는지의 여부를 ELISA로 검토했다. 도 32의 방법으로 LPS 자극을 24시간 가한 pDC양 대식 세포에 횡축에 표시한 TLR 아고니스트(컨트롤은 PBS)를 첨가하고, 18시간 배양한 배양 상청 중의 IFN-α와 IFN-β의 농도를 PBL Interferon Source로부터 구입한 특이적 ELISA 키트에 의해 정량하고, 농도를 종축에 나타냈다. 샘플수는 각각 4로 통계 해석했다. ***P<0.001. 이용한 TRL 아고니스트 농도는 LPS : 100 ng/ml, R848 : 5 ㎍/ml, CpG : 10 ㎍/ml이다. 그 결과 IFN-β의 생성은 확인되고, 그 발현이 R848(TLR7/8 아고니스트)에 의해 컨트롤보다 상승하는 것이 나타났다.
(b) In vitro에서 성숙시킨 pDC양 대식 세포가 항암 작용을 나타내는 것을 조사한 결과를 나타낸다. 암세포로서 마우스 림프종 YAC-1 세포를 이용했다. 이 세포를 세포막을 염색하는 색소 DIOC18(3)(3, 39-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate, Sigma)로 염색하고, 여기에 30배의 세포수의 나이브 NK 세포를 공배양한 경우, 및 나이브 NK 세포에 더하여 그 2배 세포수의 In vitro에서 분화시킨 성숙 pDC양 대식 세포를 더하여 공배양한 경우에서 Yac-1 세포의 세포사를 조사했다. 나이브 NK 세포는 마우스 비장 세포로부터 MACS Anti-DX5 beads(Miltenyi Biotech)를 이용하여 정제했다. 공배양은 5시간 행하고, 그 후 요오드화프로피듐으로 사세포를 염색하여, DIOC18 (3) 양성 세포(총 Yac-1 세포)의 몇퍼센트가 세포사하고 있는지를 플로우 사이타머트리법에 의해 해석했다. 컨트롤로서 Yac-1 단독 배양도 행했다(횡축(-)의 샘플). 각 샘플수는 4로 통계 해석하고 있다. ***P<0.001. 그 결과 In vitro에서 성숙시킨 pDC양 대식 세포는 NK 세포에 의한 항암 활성을 유의하게 상승시켰다. NK 세포에 의한 항암 활성은 그것이 내포하고 방출하는 세포 장애성 단백질인 Granzyme B와 Perforin의 작용이 크다. 따라서 In vitro에서 성숙시킨 pDC양 대식 세포와 NK 세포를 전술한 비율로 5시간 공배양하고, 세포를 Cytofix/Cytoperm 용액(BD Biosciences)을 이용하여 고정화ㆍ침투화하고, 항 Granzyme B 항체(Clone 16G6, eBiosciences)와 항 Perforin 항체(Clone eBioMAK-D, eBiosciences)로 염색하여, 플로우 사이타머트리법으로 해석한 결과를 나타낸다. 컨트롤은 NK 세포 단독 배양(도면 중 횡축 - 로 표시). 샘플수는 각각 4로 통계 해석하고 있다. 그 결과 In vitro에서 성숙시킨 pDC양 대식 세포는 NK 세포의 Granzyme B 및 Perforin 발현을 상승시킨다는 것을 알 수 있다.
이러한 결과에서, 갈렉틴 9는 pDC양 대식 세포로의 분화를 촉진하는 것이 In vitro에서 확인되고, 그 세포를 LPS로 성숙시키면, NK 세포의 활성화를 통한 항암 작용을 촉진하는 것이 나타났다. 도 29에 나타낸 바와 같이 갈렉틴 9를 투여하면 암을 가지고 있는 마우스의 생존을 연장하고, 그 때에는 pDC양 대식 세포가 증가한다. pDC양 대식 세포는 도 33에 나타낸 바와 같은 NK 세포의 활성화 등을 통해 생체의 항암 작용을 높이고 있다고 생각되고, 그것이 암을 가지고 있는 마우스의 생존 연장의 하나의 원인이라고 생각된다.
〔참고예〕
하기 표 2는, 인간 안정화 갈렉틴 9의 혈중 동태(도 1)의 결과에 기초하여, 모멘트 해석법으로 각종 약물 동태 파라미터를 해석한 결과를 나타낸다. 하기 표 2 중, 「Model Independent Pharmacokinetic Analysis」는 「독립된 약물 동태 해석 모델」을 의미한다. 「Dose」는 인간 안정화 갈렉틴 9의 용량을 의미한다. 「Cmax」는 최고 혈중 농도를 의미한다. 「Tmax」는 최고 혈중 농도 도달 시간을 의미한다. 「AUC」는 혈중 농도 곡선 하 면적을 의미한다. 「t1/2」는 반감기를 의미한다. 「MRT」는 평균 체류 시간을 의미한다. 「CLtot」는 전신 클리어런스를 의미한다.
Figure pct00013
이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 세포(예컨대, THGAL9 세포 등)는, 예컨대, 생체내에서 갈렉틴 9의 분비를 통한 면역 제어를 행함으로써, 자가 면역 질환, 알러지 질환, 종양, 그 밖의 질환의 치료 또는 상기 질환에서 유래하는 증상의 경감 등에 이용할 수 있다. 또, 본 발명의 세포는, 예컨대, 세포 표면 갈렉틴 9가 갈렉틴 9와 IL-10을 분비하는 타입 1 제어성 T 세포(Tr1 세포)를 동정하는 우수한 마커인 것에 의해, 상기 마커를 사용하여 Tr1 세포를 분리하는 등에 응용할 수 있다.
또한, 본 발명은, 상기 설명 및 전술한 실시형태와 실시예의 기재에 한정되지 않고, 특허청구범위로부터 일탈하지 않는 한 임의의 개변 및 변형이 가능하다.
SEQUENCE LISTING <110> GALPHARMA Co., Ltd. <120> Cell Secreting Galectin-9, Method for Manufacturing and Use Thereof <130> TF11056WO <150> JP2010-274467 <151> 2010-12-09 <160> 11 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 1 cgtcctcata tggccttcag cggttcccag 30 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 2 cgaccgcata tgctggaagc tgatgtagga cag 33 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 3 cgtcctcata tgactcccgc catcccacct atg 33 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 4 cgaccgggat ccctatgtct gcacatgggt cag 33 <210> 5 <211> 891 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Polynucleotide for galectin-9 mutein <220> <221> CDS <222> (1)..(891) <223> <400> 5 atg gcc ttc agc ggt tcc cag gct ccc tac ctg agt cca gct gtc ccc 48 Met Ala Phe Ser Gly Ser Gln Ala Pro Tyr Leu Ser Pro Ala Val Pro 1 5 10 15 ttt tct ggg act att caa gga ggt ctc cag gac gga ctt cag atc act 96 Phe Ser Gly Thr Ile Gln Gly Gly Leu Gln Asp Gly Leu Gln Ile Thr 20 25 30 gtc aat ggg acc gtt ctc agc tcc agt gga acc agg ttt gct gtg aac 144 Val Asn Gly Thr Val Leu Ser Ser Ser Gly Thr Arg Phe Ala Val Asn 35 40 45 ttt cag act ggc ttc agt gga aat gac att gcc ttc cac ttc aac cct 192 Phe Gln Thr Gly Phe Ser Gly Asn Asp Ile Ala Phe His Phe Asn Pro 50 55 60 cgg ttt gaa gat gga ggg tac gtg gtg tgc aac acg agg cag aac gga 240 Arg Phe Glu Asp Gly Gly Tyr Val Val Cys Asn Thr Arg Gln Asn Gly 65 70 75 80 agc tgg ggg ccc gag gag agg aag aca cac atg cct ttc cag aag ggg 288 Ser Trp Gly Pro Glu Glu Arg Lys Thr His Met Pro Phe Gln Lys Gly 85 90 95 atg ccc ttt gac ctc tgc ttc ctg gtg cag agc tca gat ttc aag gtg 336 Met Pro Phe Asp Leu Cys Phe Leu Val Gln Ser Ser Asp Phe Lys Val 100 105 110 atg gtg aac ggg atc ctc ttc gtg cag tac ttc cac cgc gtg ccc ttc 384 Met Val Asn Gly Ile Leu Phe Val Gln Tyr Phe His Arg Val Pro Phe 115 120 125 cac cgt gtg gac acc atc tcc gtc aat ggc tct gtg cag ctg tcc tac 432 His Arg Val Asp Thr Ile Ser Val Asn Gly Ser Val Gln Leu Ser Tyr 130 135 140 atc agc ttc cag cat atg act ccc gcc atc cca cct atg atg tac ccc 480 Ile Ser Phe Gln His Met Thr Pro Ala Ile Pro Pro Met Met Tyr Pro 145 150 155 160 cac ccc gcc tat ccg atg cct ttc atc acc acc att ctg gga ggg ctg 528 His Pro Ala Tyr Pro Met Pro Phe Ile Thr Thr Ile Leu Gly Gly Leu 165 170 175 tac cca tcc aag tcc atc ctc ctg tca ggc act gtc ctg ccc agt gct 576 Tyr Pro Ser Lys Ser Ile Leu Leu Ser Gly Thr Val Leu Pro Ser Ala 180 185 190 cag agg ttc cac atc aac ctg tgc tct ggg aac cac atc gcc ttc cac 624 Gln Arg Phe His Ile Asn Leu Cys Ser Gly Asn His Ile Ala Phe His 195 200 205 ctg aac ccc cgt ttt gat gag aat gct gtg gtc cgc aac acc cag atc 672 Leu Asn Pro Arg Phe Asp Glu Asn Ala Val Val Arg Asn Thr Gln Ile 210 215 220 gac aac tcc tgg ggg tct gag gag cga agt ctg ccc cga aaa atg ccc 720 Asp Asn Ser Trp Gly Ser Glu Glu Arg Ser Leu Pro Arg Lys Met Pro 225 230 235 240 ttc gtc cgt ggc cag agc ttc tca gtg tgg atc ttg tgt gaa gct cac 768 Phe Val Arg Gly Gln Ser Phe Ser Val Trp Ile Leu Cys Glu Ala His 245 250 255 tgc ctc aag gtg gcc gtg gat ggt cag cac ctg ttt gaa tac tac cat 816 Cys Leu Lys Val Ala Val Asp Gly Gln His Leu Phe Glu Tyr Tyr His 260 265 270 cgc ctg agg aac ctg ccc acc atc aac aga ctg gaa gtg ggg ggc gac 864 Arg Leu Arg Asn Leu Pro Thr Ile Asn Arg Leu Glu Val Gly Gly Asp 275 280 285 atc cag ctg acc cat gtg cag aca tag 891 Ile Gln Leu Thr His Val Gln Thr 290 295 <210> 6 <211> 296 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polynucleotide for galectin-9 mutein <400> 6 Met Ala Phe Ser Gly Ser Gln Ala Pro Tyr Leu Ser Pro Ala Val Pro 1 5 10 15 Phe Ser Gly Thr Ile Gln Gly Gly Leu Gln Asp Gly Leu Gln Ile Thr 20 25 30 Val Asn Gly Thr Val Leu Ser Ser Ser Gly Thr Arg Phe Ala Val Asn 35 40 45 Phe Gln Thr Gly Phe Ser Gly Asn Asp Ile Ala Phe His Phe Asn Pro 50 55 60 Arg Phe Glu Asp Gly Gly Tyr Val Val Cys Asn Thr Arg Gln Asn Gly 65 70 75 80 Ser Trp Gly Pro Glu Glu Arg Lys Thr His Met Pro Phe Gln Lys Gly 85 90 95 Met Pro Phe Asp Leu Cys Phe Leu Val Gln Ser Ser Asp Phe Lys Val 100 105 110 Met Val Asn Gly Ile Leu Phe Val Gln Tyr Phe His Arg Val Pro Phe 115 120 125 His Arg Val Asp Thr Ile Ser Val Asn Gly Ser Val Gln Leu Ser Tyr 130 135 140 Ile Ser Phe Gln His Met Thr Pro Ala Ile Pro Pro Met Met Tyr Pro 145 150 155 160 His Pro Ala Tyr Pro Met Pro Phe Ile Thr Thr Ile Leu Gly Gly Leu 165 170 175 Tyr Pro Ser Lys Ser Ile Leu Leu Ser Gly Thr Val Leu Pro Ser Ala 180 185 190 Gln Arg Phe His Ile Asn Leu Cys Ser Gly Asn His Ile Ala Phe His 195 200 205 Leu Asn Pro Arg Phe Asp Glu Asn Ala Val Val Arg Asn Thr Gln Ile 210 215 220 Asp Asn Ser Trp Gly Ser Glu Glu Arg Ser Leu Pro Arg Lys Met Pro 225 230 235 240 Phe Val Arg Gly Gln Ser Phe Ser Val Trp Ile Leu Cys Glu Ala His 245 250 255 Cys Leu Lys Val Ala Val Asp Gly Gln His Leu Phe Glu Tyr Tyr His 260 265 270 Arg Leu Arg Asn Leu Pro Thr Ile Asn Arg Leu Glu Val Gly Gly Asp 275 280 285 Ile Gln Leu Thr His Val Gln Thr 290 295 <210> 7 <211> 148 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Ala Phe Ser Gly Ser Gln Ala Pro Tyr Leu Ser Pro Ala Val Pro 1 5 10 15 Phe Ser Gly Thr Ile Gln Gly Gly Leu Gln Asp Gly Leu Gln Ile Thr 20 25 30 Val Asn Gly Thr Val Leu Ser Ser Ser Gly Thr Arg Phe Ala Val Asn 35 40 45 Phe Gln Thr Gly Phe Ser Gly Asn Asp Ile Ala Phe His Phe Asn Pro 50 55 60 Arg Phe Glu Asp Gly Gly Tyr Val Val Cys Asn Thr Arg Gln Asn Gly 65 70 75 80 Ser Trp Gly Pro Glu Glu Arg Lys Thr His Met Pro Phe Gln Lys Gly 85 90 95 Met Pro Phe Asp Leu Cys Phe Leu Val Gln Ser Ser Asp Phe Lys Val 100 105 110 Met Val Asn Gly Ile Leu Phe Val Gln Tyr Phe His Arg Val Pro Phe 115 120 125 His Arg Val Asp Thr Ile Ser Val Asn Gly Ser Val Gln Leu Ser Tyr 130 135 140 Ile Ser Phe Gln 145 <210> 8 <211> 146 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Thr Pro Ala Ile Pro Pro Met Met Tyr Pro His Pro Ala Tyr Pro Met 1 5 10 15 Pro Phe Ile Thr Thr Ile Leu Gly Gly Leu Tyr Pro Ser Lys Ser Ile 20 25 30 Leu Leu Ser Gly Thr Val Leu Pro Ser Ala Gln Arg Phe His Ile Asn 35 40 45 Leu Cys Ser Gly Asn His Ile Ala Phe His Leu Asn Pro Arg Phe Asp 50 55 60 Glu Asn Ala Val Val Arg Asn Thr Gln Ile Asp Asn Ser Trp Gly Ser 65 70 75 80 Glu Glu Arg Ser Leu Pro Arg Lys Met Pro Phe Val Arg Gly Gln Ser 85 90 95 Phe Ser Val Trp Ile Leu Cys Glu Ala His Cys Leu Lys Val Ala Val 100 105 110 Asp Gly Gln His Leu Phe Glu Tyr Tyr His Arg Leu Arg Asn Leu Pro 115 120 125 Thr Ile Asn Arg Leu Glu Val Gly Gly Asp Ile Gln Leu Thr His Val 130 135 140 Gln Thr 145 <210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Thr Gln Thr Val Ile His Thr Val Gln Ser Ala Pro Gly Gln Met Phe 1 5 10 15 Ser <210> 10 <211> 61 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Asn Pro Arg Thr Val Pro Val Gln Pro Ala Phe Ser Thr Val Pro Phe 1 5 10 15 Ser Gln Pro Val Cys Phe Pro Pro Arg Pro Arg Gly Arg Arg Gln Lys 20 25 30 Pro Pro Gly Val Trp Pro Ala Asn Pro Ala Pro Ile Thr Gln Thr Val 35 40 45 Ile His Thr Val Gln Ser Ala Pro Gly Gln Met Phe Ser 50 55 60 <210> 11 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Pro Pro Gly Val Trp Pro Ala Asn Pro Ala Pro Ile Thr Gln Thr Val 1 5 10 15 Ile His Thr Val Gln Ser Ala Pro Gly Gln Met Phe Ser 20 25

Claims (62)

  1. 갈렉틴 9를 포함하는 세포로서,
    상기 갈렉틴 9를 세포 표면에 발현하고 있는 것을 특징으로 하는 세포.
  2. 제1항에 있어서, T 세포인 세포.
  3. 제2항에 있어서, CD4 양성 T 세포인 세포.
  4. 제3항에 있어서, 여포성 B 헬퍼 T 세포(Follicular B helper T cells : TFH)인 세포.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, T 세포 수용체(TCR)로 자극함으로써, CD25의 발현량이 상승하고, 또한, 갈렉틴 9 및 인터류킨 10(IL-10)의 적어도 하나를 분비하는 세포.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, Foxp3을 발현하지 않는 세포.
  7. 제2항에 있어서, γδT 세포인 세포.
  8. 제1항에 있어서, 내츄럴 킬러 세포(NK 세포)인 세포.
  9. 제1항에 있어서, B 세포인 세포.
  10. 제1항에 있어서, NKT 세포인 세포.
  11. 제1항에 있어서, 고전적 수상 세포(cDC)인 세포.
  12. 제1항에 있어서, 형질 세포양 수상 세포(pDC)인 세포.
  13. 제1항에 있어서, pDC양 대식 세포(pDC-Mφ)인 세포.
  14. 동물에게 갈렉틴 9를 투여함으로써, 상기 동물에서의 적어도 일부의 세포의 세포 표면에 갈렉틴 9를 발현시키는, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 세포의 제조 방법.
  15. 동물의 세포를 갈렉틴 9의 존재하에 배양함으로써, 상기 동물의 세포의 세포 표면에 갈렉틴 9를 발현시키는, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 세포의 제조 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 동물의 세포가, 세포 표면에 갈렉틴 9를 발현하고 있는 세포를 포함하고,
    상기 동물의 세포를 갈렉틴 9의 존재하에 배양함으로써, 세포 표면에 갈렉틴 9를 발현하고 있는 세포의 비율을 증가시키는, 세포의 제조 방법.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동물이 포유류인 제조 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 포유류가 인간인 제조 방법.
  19. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 세포, 그 파쇄물 및 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 의약.
  20. 제19항에 있어서, 갈렉틴 9의 생리 활성 또는 생물 활성의 부족 또는 결여에 기인하는 질환의 치료 또는 증상의 경감에 이용하는 의약.
  21. 제19항에 있어서, 갈렉틴 9 또는 갈렉틴 9 결합성 물질을 포함하는 세포의 유무의 진단에 이용하는 진단제인 의약.
  22. 제19항에 있어서, 면역 조절제인 의약.
  23. 제19항에 있어서, 항종양제인 의약.
  24. 제23항에 있어서, 상기 종양이 악성 종양인 의약.
  25. 제24항에 있어서, 상기 악성 종양이 상피성 악성 종양인 의약.
  26. 제24항에 있어서, 상기 악성 종양이 비상피성 악성 종양인 의약.
  27. 제26항에 있어서, 상기 비상피성 악성 종양이, 종양 형성성의 비상피성 악성 종양 및 종양 비형성성의 비상피성 악성 종양의 적어도 하나인 의약.
  28. 제24항에 있어서, 상기 악성 종양이, 피부암, 멜라노마, 유방암, 난소암, 자궁암, 고환 악성 종양, 전립선암, 방광암, 신장암, 갑상선암, 인두ㆍ후두암, 설암, 상악암, 식도암, 위암, 결장ㆍ직장암, 폐ㆍ기관지암, 간암, 간세포암, 간내 담관암, 간외 담관ㆍ담낭암, 췌장암, 백혈병, 악성 림프종, 형질 세포종, 육종, 골육종, 연골육종, 평활근육종, 횡문근육종, 지방육종, 섬유육종, 악성 혈관종, 악성 혈관내피종, 뇌종양, 뇌수막종, 신경교종 및 성상세포종으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인 의약.
  29. 제19항에 있어서, 항알러지제인 의약.
  30. 제19항에 있어서, 자가 면역 질환용 제제인 의약.
  31. 제19항에 있어서, 항염증제인 의약.
  32. 제19항에 있어서, 부신피질 스테로이드 호르몬 대체용 제제인 의약.
  33. 제19항에 있어서, 세포, 조직, 또는 기관의 이식에 따르는 거절 반응의 억제제인 의약.
  34. 제19항에 있어서, 패혈증의 치료 또는 증상의 경감에 이용하는 의약.
  35. 제19항에 있어서, 감염증의 치료 또는 증상의 경감에 이용하는 의약.
  36. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 세포, 그 파쇄물 및 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 이용하여, 피검 세포에서의 갈렉틴 9 또는 갈렉틴 9 결합성 물질의 유무를 진단하는 방법.
  37. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 세포, 그 파쇄물 및 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 동물에게 투여하는 공정을 포함하는, 상기 동물의 질환의 치료 또는 상기 질환에서 유래하는 증상의 경감 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 동물이 포유류인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 포유류가 인간인 방법.
  40. 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환이, 갈렉틴 9의 생리 활성 또는 생물 활성의 부족 또는 결여에 기인하는 질환인 방법.
  41. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환이 면역의 이상에 기인하는 질환인 방법.
  42. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환이 자가 면역성 질환인 방법.
  43. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환이 종양인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 종양이 악성 종양인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 악성 종양이 상피성 악성 종양인 방법.
  46. 제44항에 있어서, 상기 악성 종양이 비상피성 악성 종양인 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 비상피성 악성 종양이, 종양 형성성의 비상피성 악성 종양 및 종양 비형성성의 비상피성 악성 종양의 적어도 하나인 방법.
  48. 제44항에 있어서, 상기 악성 종양이, 피부암, 멜라노마, 유방암, 난소암, 자궁암, 고환 악성 종양, 전립선암, 방광암, 신장암, 갑상선암, 인두ㆍ후두암, 설암, 상악암, 식도암, 위암, 결장ㆍ직장암, 폐ㆍ기관지암, 간암, 간세포암, 간내 담관암, 간외 담관ㆍ담낭암, 췌장암, 백혈병, 악성 림프종, 형질 세포종, 육종, 골육종, 연골육종, 평활근육종, 횡문근육종, 지방육종, 섬유육종, 악성 혈관종, 악성 혈관내피종, 뇌종양, 뇌수막종, 신경교종 및 성상세포종으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인 방법.
  49. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환이 알러지성 질환인 방법.
  50. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환이, 세포, 조직, 또는 기관의 이식에 따르는 거절 반응인 방법.
  51. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환이 패혈증인 방법.
  52. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환이 감염증인 방법.
  53. 제37항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환에서 유래하는 증상이 염증인 방법.
  54. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 세포를 동물에게 투여하여 상기 동물의 면역을 제어하는 면역 제어 방법.
  55. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 세포의 세포 표면에 발현된 갈렉틴 9를 마커로서 검출함으로써 상기 세포를 검출하는 방법.
  56. 제55항에 있어서, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 세포가 IL-10 생성 타입 1 제어성 T 세포(Tr1 세포)인 세포 검출 방법.
  57. 제55항에 있어서, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 세포가 제어성 면역 세포인 세포 검출 방법.
  58. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 세포를 포함하거나 또는 포함하지 않는 동물 조직에 있어서, 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항에 기재된 세포 검출 방법에 의해, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 세포를 정성적 또는 정량적으로 검출하는 공정을 포함하는, 상기 동물의 질환 또는 상기 질환에서 유래하는 증상의 진단 방법.
  59. 동물의 질환의 치료 효과의 판정 방법으로서,
    상기 동물에 대하여, 상기 질환의 치료를 행하는 공정과,
    상기 치료의 전후에 있어서, 각각, 제58항에 기재된 진단 방법에 의해, 상기 질환 또는 상기 질환에서 유래하는 증상을 진단하는 공정과,
    상기 치료의 전후에서의 상기 진단 결과를 대비하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기 동물의 질환의 치료 효과의 판정 방법.
  60. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 세포를 포함하는 동물 조직에 있어서, 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항에 기재된 세포 검출 방법에 의해 상기 세포를 검출하고, 검출된 상기 세포를, 상기 동물 조직중의 다른 세포로부터 분리하는 세포의 분리 방법.
  61. 제60항에 기재된 세포의 분리 방법에 의해 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 세포를 상기 동물 조직으로부터 분리하는 공정을 포함하는, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 세포의 제조 방법.
  62. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 제60항에 기재된 세포의 분리 방법에 의해 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 세포를 상기 동물 조직으로부터 분리하는 공정을 더 포함하는 제조 방법.
KR1020137017492A 2010-12-09 2011-12-09 갈렉틴 9를 분비하는 세포, 그 제조 방법 및 그 용도 KR20130103587A (ko)

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