KR101087033B1

KR101087033B1 - 결핵균의 ｒｖ０６５２단백질을 이용한 수지상 세포의 성숙방법

Info

Publication number: KR101087033B1
Application number: KR1020100046354A
Authority: KR
Inventors: 박영민; 정인덕; 신성재; 김화중
Original assignee: 부산대학교 산학협력단; 충남대학교산학협력단
Priority date: 2010-05-18
Filing date: 2010-05-18
Publication date: 2011-11-25
Also published as: KR20110126865A

Abstract

본 발명은 수지상 세포를 성숙시키는 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는 결핵균의 Rv0652를 이용하여 미성숙 수지상 세포를 성숙 수지상 세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 의해 수지상 세포에 의한 신체의 면역 반응을 효과적으로 증강시킬 수 있다.

Description

결핵균의 ＲＶ０６５２단백질을 이용한 수지상 세포의 성숙방법{Maturation method using M. tuberculosis RV0652 protein for Dendritic cell}

본 발명은 수지상 세포를 성숙시키는 방법에 관한 것이다.

수지상 세포 또는 수상돌기 세포(dendritic cell, DC)는 포유동물의 면역계의 일부를 이루는 면역 세포이다. 이 세포들은 항원 물질을 처리하여 그것을 표면에 나타나게 함으로써 면역계의 다른 세포가 인식하게 하는 항원 발현 세포의 역할을 한다. 수지상 세포는 주로 피부(피부에 있는 세포를 특히 랑게르한스 세포라 부름), 코, 폐, 위 및 장의 내벽과 같이 외부 환경과 접하는 조직에 소량 존재한다. 그것들은 또한 혈액 중에서 미성숙한 상태로 발견될 수 있다. 일단 활성화되면 림프기관으로 이동하여 T 세포 및 B 세포와 상호작용하여 면역반응이 시작되게 한다. 특정 발달 단계에서 그것들은 수상돌기(dendrites)라고 하는 돌기를 뻗는다.

수지상 세포는 조혈 골수 전구세포(hemopoietic bone marrow progenitor cells)로부터 유래한다. 이 전구세포는 처음에는 미성숙 수지상 세포로 변화한다. 이 세포들은 높은 엔도시토시스 활성 및 T-세포 활성 능력을 특징으로 한다. 미성숙 수지상 세포는 주변에 있는 바이러스와 박테리아와 같은 병원체를 끊임없이 탐식한다. 이것은 TLR(toll-like receptor)와 같은 패턴 인식 수용체(pattern recognition receptor, PRR)를 통해서 가능하다. TLR은 병원체의 서브셋 상에서 발견되는 특정 화학적 특징을 인식한다. 미성숙 수지상 세포는 또한 살아있는 자가 세포로부터 니블링(nibbling)이라는 과정을 통해 약간의 세포막을 탐식한다. 일단 그것들이 현존하는 항원과 접하게 되면, 그것은 성숙 수지상 세포로 활성화되어 림프절로 이동한다. 미성숙 수지상 세포는 병원체를 탐식하고 자신의 단백질을 작은 조각들로 분해해서, 성숙하였을 때 이 조각들이 MHC 분자를 이용하여 그 세포 표면에 나타나게 된다. 동시에, 그것은 CD80(B7.1), CD86(B7.2), 및 CD40과 같이 T-세포 활성화에서의 공동-수용체로 작용하는 세포 표면 수용체를 증가시킨다. 그것들은 또한 수지상 세포가 혈류를 통해 비장으로 가거나 림프계를 통해 림프절로 이동하게 유도하는 주화성 수용체인 CCR7를 증가시킨다. 여기서 이 세포들은 항원 발현 세포로 작용한다: 그것들은 비항원성 특정 공동자극 신호와 함께 병원체에서 유래한 항원을 나타냄으로써 헬퍼 T-세포, 킬러 T-세포 뿐만 아니라, B 세포를 활성화시킨다.

모든 헬퍼 T-세포는 하나의 특정 항원에 대해 특이적이다. 오직 전문적인 항원 발현 세포(대식세포, B림프구 및 수지상세포)만이 맞는 항원이 존재할 때 나머지 헬퍼 T-세포를 활성화시킨다. 그러나 대식세포와 B림프구는 메모리 T-세포만 활성화시킬 수 있는 반면에 수지상 세포는 메모리 및 처녀(naive) T-세포를 모두 활성화시킬 수 있어서 가장 강력한 항원 발현 세포이다.

성숙 수지상 세포는 신체를 순환하는 백혈구인 단핵구로부터 유래할 수 있는데, 단핵구는 적절한 신호에 따라 수지상 세포로도 대식세포로도 바뀔 수 있다. 단핵구는 골수의 줄기세포에서 유래한다. 단핵구-유래 수지상 세포는 실험실에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 생성될 수 있다. PBMC를 조직 배양 플라스크에 심어서 단핵구가 부착되게 할 수 있는데 이 단핵구를 IL-4 및 GM-CSF(granulocyte-macrophage colony stimulating factor)로 처리함으로써 미성숙 수지상 세포로 분화시킬 수 있다. 이후에 TNFα로 처리하면 미성숙 수지상 세포가 성숙 수지상 세포로 분화된다.

수지상 세포는 흔치 않고 분리하기 어렵기 때문에 서로 다른 유형과 서브셋의 수지상 세포의 정확한 생성과 발달 및 그 상호관계에 대해서는 오직 대략적으로만 알려졌다. 수지상 세포는 신체의 다른 세포들과 끊임없는 소통을 한다. 이러한 소통은 세포 표면 단백질의 상호작용에 근거한 직접적인 세포 대 세포 접촉의 형태를 취할 수 있다. 예를 들면, 수지상 세포의 수용체 B7과 림프구의 CD28과의 상호작용을 들 수 있다.

그러나 세포 간 상호작용은 사이토카인을 통해서 떨어진 상태로도 일어날 수 있다. in vitro 실험에서 미생물 추출물에 의해 수지상 세포를 자극함으로써 수지상 세포가 빠르게 IL-12를 생산하게 했다. IL-12는 처녀 CD4 T 세포가 Th1 표현형이 되게 한다. 최적의 결과는 수지상 세포가 표면에 나타낸 항원에 대해 공격하도록 면역계를 활성화시키는 것이다.

수지상 세포에 의해 생산되는 사이토카인은 세포의 유형에 따라 다르다. 림프구성 수지상 세포는 다량의 타입-1 IFN을 생산할 수 있는데 그것은 더 많은 활성화된 대식 세포를 모아서 탐식작용을 가능하게 한다. 림프구성 수지상 세포는 중추와 말초 면역조절에 관여하고, 골수성 수지상 세포는 외래성 항원이나 감염에 대한 면역유도에 관여하는 것으로 알려져 있다. 따라서 수지상 세포가 정상 기능을 못할 경우 당뇨병, 류머티스성 관절염, 알러지성 과민반응과 같은 자가 면역 질환이 나타나거나 감염성 질환이나 암 발생에 대해 정상적인 면역반응이 일어나지 않게 된다.

암환자에서는 수지상 세포의 기능이 저하되어 있어 정상적 항암 면역능을 유도하는 것이 어렵다. 지금까지 수지상세포의 분화를 조절(활성화)하는 물질들(LPS, TNF-α, IL-1β)은 많이 알려져 있으나 생체독성의 부작용으로 생체에의 직접적인 응용에 문제가 많았다.

상기와 같이 수지상 세포는 신체 자체의 면역 기능을 높이는데 중요한 역할을 하고 있어, 수지상세포의 분화를 촉진하여 성숙시킴으로써 강력한 면역 반응을 일으키는 무독성의 면역조절제의 개발과 그 물질의 작용기전을 명확히 이해하는 것은 수지상 세포를 이용한 세포 면역 치료에 중요한 과제가 되고 있다.

본 발명자들은 상기와 같은 요구를 충족시키기 위하여 연구를 거듭한 결과 결핵균에서 유래한 Rv0652가 수지상 세포를 효과적으로 성숙시킨다는 사실을 발견했다.

따라서 상기와 같은 발명의 목적은 본 발명의 결핵균에서 유래한 Rv0652를 이용하여 미성숙 수지상 세포를 성숙시키는 방법에 의해 달성된다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 상세한 설명 및 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이다.

본 발명의 수지상 세포를 성숙시키는 방법에 의해 미성숙 세포가 성숙 수지상 세포로 잘 분화될 수 있어서 신체의 면역 반응을 효과적으로 활성화시킬 수 있다.

도 1은 실시예 2에 따른 본 발명의 Rv0652를 처리한 수지상 세포의 생존율 측정 실험의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 실시예 3에 따른 본 발명의 Rv0652를 처리한 수지상 세포의 보조자극인자와 MHC class I, II의 발현 분석 실험의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 실시예 4에 따른 본 발명의 Rv0652를 처리한 수지상 세포의 덱스트란-FITC 탐식능 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 실시예 5에 따른 본 발명의 Rv0652를 처리한 수지상 세포의 사이토카인(IL-6, IL-12, IL-1, TNF-α 및 IL-10) 분비 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 실시예 6에 따른 본 발명의 Rv0652를 처리한 수지상 세포의 CCR7 발현 정도 실험 결과를 나타낸 그래프이다. CON:대조군.
도 6은 실시예 7에 따른 본 발명의 Rv0652를 처리한 수지상 세포의 주화성 분석 실험의 결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 결핵균에서 유래한 Rv0652를 이용하여 미성숙 수지상 세포를 성숙시키는 방법을 제공한다.

상기 미성숙 수지상 세포는 종래 알려진 방법으로 채취하여 분화시킬 수 있다. 즉, 골수 세포 또는 단핵구에 GM-CSF 및 IL-4를 넣고 6일간 배양하여 미성숙 수지상 세포로 분화시킬 수 있다.

바람직하게는 상기 Rv0652는 E. coli에 발현시킨 재조합 Rv0652(rEC-Rv0652)이다. 더욱 바람직하게는 상기 재조합 Rv0652는 서열 5'-GGATCCATGGCAAAGCTC-3'의 정방향 프라이머 및 서열 5'-GAATTCCTTGACGGT-3'의 역방향 프라이머로 PCR 증폭시킨 후 발현시킨 것이다.

바람직하게는 상기 Rv0652를 넣고 24시간 배양하여 수지상 세포를 성숙시킨다. 또한 바람직하게는 수지상 세포의 배지에 Rv0652를 0.25~1 ㎍/ml의 용량으로 첨가하여 성숙시킨다.

Rv0652 단백질은 결핵균의 50S 리보솜 단백질 L7/L12이다. L7과 L12을 코딩하는 유전자는 Rv0652(rplL)로서 L7의 아미노 말단부위가 아세틸화된 것을 제외하고는 동일한 단백이다. 특히 이 단백질은 우리나라에서 흔히 분리되는 임상균주인 K-균주의 배양액에 표준균주에 비해 비교적 풍부히 존재하는 단백질이다. Rv0652 단백질의 계산된 분자량은 13.4-kDa이지만 실제 천연 분리 단백질은 15-kDa이며 대장균에서 발현된 단백은 22-kDa 정도였다. 이는 재조합 단백으로 발현되는 경우 폴리-His이 부착되어 분자량이 증가된 것으로 생각된다.

본 발명자들은 결핵균의 다른 단백질을 이용하여 수지상 세포를 효과적으로 성숙시킬 수 있다는 사실을 발견하고 Rv0652 단백질도 역시 수지상 세포를 성숙시킬 수 있을 것이라는 가정 하에 연구한 결과 본 발명을 완성시킨 것이다.

본 발명자들은 우선 수지상 세포를 성숙시키는 Rv0652의 효능 실험을 하기 전에 Rv0652의 수지상 세포에 대한 독성 실험을 하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이 수지상 세포에 Rv0652를 1 ㎍/ml까지 처리하여 아넥신-V로 염색하였는데 그 결과 1 ㎍/ml까지는 수지상 세포에 세포독성이 나타나지 않았으므로 1 ㎍/ml의 Rv0652는 수지상 세포에 독성이 없다고 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 Rv0652가 미성숙 수지상 세포를 성숙시키는지에 대한 실험을 했다. 수지상 세포가 성숙하면 보조자극인자와 MHC class I, II와 같은 분자의 발현이 현저히 증가하므로 수지상 세포에 Rv0652를 각각 0.25㎍/ml, 0.5 ㎍/ml의 농도로 처리한 후 24시간 동안 37℃에서 배양했다. 여기서 LPS를 양성 대조군으로 사용하여 Rv0652의 효과를 비교하였다. 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이 Rv0652는 수지상 세포의 표면 분자를 용량 의존적으로 증가시켰다. 그러므로 Rv0652는 수지상 세포의 표면 분자 변화에 영향을 끼침을 알 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에서는 Rv0652가 수지상 세포를 성숙시킨다는 것을 더욱 확실히 확인하기 위해서 수지상 세포가 항원을 포식하는 능력을 측정하였다. 수지상 세포는 미성숙한 상태에서는 포식 작용이 활발하지만 항원을 포식하여 성숙하게 되면 더 이상 탐식작용이 일어나지 않는다. 그러므로 성숙하게 된 수지상 세포일수록 항원 탐식 능력이 떨어지게 된다. 항원 탐식능력은 FITC로 염색된 덱스트란을 이용하여 실험하였다. 6일 동안 배양시킨 수지상 세포를 두 그룹으로 나누어서 하나는 Rv0652를 24시간 처리하고 하나는 처리하지 않았다. 상기 두 그룹의 수지상 세포에 FITC로 염색한 덱스트란을 처리한 뒤 다시 수지상 세포를 CD11c-PE로 염색하여 유세포분석기로 분석하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, Rv0652를 처리한 수지상 세포가 그렇지 않은 것보다 항원 포식 능력이 감소하였다. 이러한 점에서 Rv0652가 기능적인 면에서 수지상 세포를 성숙시킴을 알 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 Rv0652가 수지상 세포의 사이토카인 분비에 미치는 영향을 알아보기 위해 실험을 했다. 수지상 세포가 성숙하게 되면 분비하는 사이토카인 역시 변하게 된다. 그러므로 수지상 세포를 Rv0652로 처리했을 때 T-세포에 영향을 주는 전염증 또는 항염증성 사이토카인 분비의 변화에 영향을 주는지를 실험하였다. IL-12와 IL-10은 수지상 세포에서 분비되는 주요 사이토카인으로 각각 T 세포가 Th1과 Th2로 분화되는데 중요한 역할을 한다. 수지상 세포에서 분비되는 TNF-a, IL-6, IL-1β, IL-12p70, IL-10을 ELISA로 측정하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이 IL-12와 IL-10이 증가했고 전염증 사이토카인인 TNF-a, IL-6, IL-1β 또한 증가하였으므로, Rv0652가 수지상 세포를 성숙하게 하여 사이토카인의 양에 변화를 준다는 것을 알 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 Rv0652를 처리한 수지상 세포에서 CCL7의 발현이 어떻게 달라지는지 실험하였다. 수지상 세포가 성숙하게 되면 이동 능력이 증가하게 되므로 이동과 관련된 수용체를 수지상 세포가 성숙하였는지를 나타내는 지표로 이용할 수 있다. 수지상 세포의 이동 관련 수용체 중 CCL19와 반응하는 CCR7이 성숙 시에 증가하기 때문에 수지상 세포에 Rv0652를 처리한 것과 양성대조군으로 LPS를 처리한 것, 그리고 아무 처리도 하지 않은 음성 대조군을 CCR7-PE 및 CD11c-FITC로 염색하여 유세포측정기로 측정하였다. 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, Rv0652를 처리하였을 때 처리하지 않은 수지상 세포보다 CCR7의 수치가 증가하였으므로 Rv0652가 수지상 세포의 이동 능력을 증가시킨다고 할 수 있다.

이를 더욱 확실하게 확인하기 위하여 본 발명의 다른 실시예에서는 Rv0652로 처리한 수지상 세포의 CCR19에 대한 주화성을 실험하였다. CCR7의 결합 리간드는CCR19라는 점을 이용해 300ng/ml의 CCR19에 반응해서 이동하는 수지상 세포의 수를 측정한 결과 Rv0652로 처리한 수지상 세포가 음성 대조군에 비해서 더 많이 이동하였음을 알 수 있었다(도 6). 결론적으로 Rv0652는 수지상 세포를 성숙하게 만들어서 2차 림프기관으로 이동한 뒤 T 세포와 반응하는데 필요한 이동능력을 증가시킨다고 할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 더욱 쉽게 이해할 수 있도록 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

수지상 세포 및 Rv0652 준비

1. 1 수지상 세포의 분리 및 유도

수지상세포는 이전에 알려진 방법과 같이 마우스의 골수세포로부터 유도했다. 우선 C57BL/6마우스로부터 골수 채취용 주사를 이용해 골수를 채취하였다. 채취한 골수를 세척한 후 적혈구를 염화암모늄을 이용하여 제거하였다. 분리한 세포를 6-웰 플레이트에서 RPMI 1640(10% 열-불활화 FBS, 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신, 5×10^-5M 2-ME, 10mM HEPES (pH 7.4), 10 ng/ml GM-CSF, 10 ng/ml IL-4)를 첨가하여 배양하였다. 배양 후 3일과 5일째에는 부유 세포를 제거하고 새로운 배지를 첨가하였다.

이후에 기술될 실험들에서는 배양 6일째의 부착되지 않은 수지상 세포를 사용하였다. 일부 실험에서 CD11c⁺ 수지상세포를 항-CD11c(N418) 마이크로비드와 자기 세포 분류 시스템(Vario MACS: Miltenyi Biotec, Auburn, CA)를 이용하여 분리 후 사용하였다. LPS(E.coli 055:B 타입, Sigma)는 Rv0652에 대한 양성대조군으로 사용하였다.

1.2 Rv0652의 분리

결핵균(M. tuberculosis H37Rv, ATCC 27294)은 소톤 배지에 37℃, 5-6주간 표면 배양하여 균체를 수집하였다. 균체로부터 추출한 단백질은 10 mM KPB(인산칼륨 완충액, pH 7.0)로 1회 세척하고, 1 mM PMSF와 1 mM EDTA가 첨가된 10 mM KPB에 부유시켜 얼음 위에서 초음파(펄스 on/off 각 5초, 온도 4℃, 진폭 30%)로 30분 동안 파쇄하였다. 세포를 용해시킨 후 4℃에서 22,000 rpm으로 30분간 원심분리하여 파쇄되지 않은 균체를 제거하고 상층액은 0.45 μm 여과막(Millipore, Billerica, MA, USA)으로 1차 여과하고, 0.2 μm 필터로 2차 여과하여 멸균하였다. 여과된 추출액에 황산암모늄을 5% 농도가 되게 천천히 첨가한 후 20,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 불필요한 성분을 침전시켰다. 상층액에 다시 황산암모늄을 농도가 85%가 되도록 천천히 첨가한 후 20,000 rpm에서 30분 동안 원심분리 하였다. 침전된 단백질 펠렛은 10 mM NaCl이 첨가된 20 mM Tris-HCl(pH7.4) 완충액에 부유시킨 후 투석하고 -70℃에 보관하였다.

단백질의 농도는 우혈청 알부민(BSA)을 표준으로 하여 마이크로 BCA 단백질 검사 키트(Pierce, Rockford, IL, USA)를 이용하여 브래드포드법으로 측정하였다. 15% 폴리아크릴아미드를 사용하여 라엠리(Laemmli)의 불연속 완충액 시스템으로 단백질 분석을 위한 SDS-PAGE을 실시하였다. 전기영동 후 쿠마시블루로 염색하여 관찰하였고, 면역블롯을 수행했다. 전기영동으로 분리된 단백질을 니트로셀룰로스막에 전사한 후에 5% 탈지분유가 포함된 인산염 완충 식염수(PBS)로 차단하였다. 혈청을 100~200배 희석 후 37℃에서 1시간 반응시켰다. 2차 항체로는 HRP(horseradish peroxidase)-결합 항-인간 IgG(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 3000배 희석하여 사용하였다.

pH 4-7의 IPG 스트립(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 등전점 전기영동(isoelectric focusing)을 실시한 후 SDS-PAGE로 단백질을 분리하고 겔은 쿠마시블루로 염색하거나 면역블롯으로 분석하여 2차원 전기영동을 했다. 2차원 전기영동 후에 쿠마시블루로 염색한 겔에서 유의성 있는 부분(15-kDa 단백질)을 연세 프로테오믹 연구소(서울, 한국)에 의뢰하여 LC-MS/MS로 단백질을 동정하였다.

1.3 재조합 Rv0652 단백질 발현 및 정제

결핵균 게놈 DNA로부터 Rv0652 유전자를 증폭하기 위한 프라이머의 정방향 쪽에는 BamH I, 역방향 쪽에는 EcoRI 제한효소 위치를 넣었다. 정방향 프라이머의 서열은 5'-GGATCCATGGCAAAGCTC-3'이고, 역방향 프라이머의 서열은 5'-GAATTCCTTGACGGT-3'이었다. PCR 유전자 산물을 T-벡터(Promega, Madison, WI, USA)에 클로닝한 후 BamH1과 EcoRI으로 절단하고, 발현벡터인 pET28a에 삽입하였다. Rv0652 유전자가 삽입된 pET28a 벡터로 형질 전환시킨 E. coli BL-21을 600 nm에서의 흡광도(OD)가 0.4-0.6가 되도록 배양한 후에 1 mM의 이소프로필-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 첨가하고 하룻밤 동안 배양하였다. 발현된 단백질은 니켈-니트릴로트라이아세트산(Ni-NTA, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 아가로즈를 이용하여 제조사의 방법에 준하여 정제하였다. 최종적으로 정제한 재조합단백질은 SDS-PAGE로 분석하였다.

<실시예 2>

수지상 세포의 생존율 측정

LPS 또는 Rv0652로 자극한 수지상 세포의 세포 생존율을 측정하기 위해서, 수지상 세포를 200 ng/ml 농도의 LPS 또는 0.5㎍/ml 및 1.0㎍/ml의 Rv0652로 24시간 동안 처리 후에 5 ㎍ml^- ¹ 의 요오드화 프로피듐(propidium iodide, PI) 및 아넥신-V로 이중 염색하고 유세포분석기(flow cytometry)를 통해 분석하였다.그 결과를 도 1에 나타내었다.

<실시예 3>

보조자극인자와 MHC class I, II의 발현 분석

수지상 세포에 0.25㎍/ml 및 0.5㎍/ml 농도의 Rv0652 및 200 ng/ml 농도의 LPS를 각각 24시간 처리한 후 수지상 세포를 회수하였다. 비특이적인 결합을 억제하기 위하여 1 ㎍/ml의 Fcγ I/III(BD bioscience)을 4℃에서 20분간 처리한 후, 수지상 세포 분석을 위해 CD11c-FITC(BD bioscience)로 4℃에서 20분간 염색하였다. 추가적으로, 보조자극인자와 MHC분자의 발현 양상을 측정하기 위하여 항-CD80-PE(BD bioscience), 항-CD86-PE(BD bioscience), 항-MHC I 및 II-PE(BD bioscience)를 1 ㎍/ml씩 처리하여 4℃에서 30분간 염색했다. PBS 완충액(2% FBS와 0.01% 아지드 나트륨 함유)로 2회 세척하고, 1% 파라포름알데히드로 고정 후에 FACScallibur(Beckson Dikinson, USA)로 분석하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

<실시예 4>

수지상 세포의 덱스트란-FITC 탐식능 측정

수지상 세포의 엔도시토시스는 종래 알려진 방법에 의해 측정하였다.

각각 1 x 10⁶세포/ml의 수지상 세포를 포함하는 배지 1ml씩을 37℃와 0℃에서 평형화시킨 후, 각 평형화된 세포의 그룹을 각각 네 그룹으로 나누어서 0.5 ㎍/ml의 Rv0652, 1.0 ㎍/ml의 Rv0652 및 200 ng/ml 농도의 LPS를 첨가하고 나머지 하나는 음성 대조군으로 아무 처리도 하지 않고 24시간 동안 배양하였다. 각 그룹의 수지상 세포에 1 ㎍/ml의 플루오레신 결합 덱스트란(fluorescein-conjugated dextran, 분자량 40,000; Molecular Probes, Eugene, OR)을 1시간 동안 첨가하였다. 37℃와 0℃ 에서 각각 1시간 동안 배양한 후 콜드 스테이닝 완충액을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 그 다음 세포를 3회 세척한 후에 PE(Phycoerythrin)-결합 CD11c(BD bioscience)로 염색한 후에 FACSCalibur를 이용하여 덱스트란-FITC(Fluorescein isothiocyanate) 탐식능을 측정하였다. 덱스트란의 수지상 세포에 대한 비특이적 결합을 측정하기 위해서 4℃에서도 측정하였다. 그 결과를 도 3에 나타냈다.

<실시예 5>

Rv0652가 수지상 세포의 사이토카인 분비에 미치는 영향: IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-10 및 IL-12

수지상 세포에 실시예 4와 같이 Rv0652나 LPS를 24시간 처리한 후, 상층액을 IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-10 및 IL-12에 대한 ELISA 키트(BD PharMingen, USA)에 적용하여 사이토카인 분비를 측정하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

<실시예 6>

CCR7 발현정도 측정

수지상 세포에 실시예 4와 같이 Rv0652 및 LPS를 24시간 처리한 후 세포를 회수하였다. 비특이적인 결합을 억제하기 위하여 1 ㎍/ml의 Fcγ I/III을 4℃에서 20분간 처리한 후, 수지상 세포 분석을 위해 CD11c-FITC로 4℃에서 20분간 염색하였다. 그 다음 다시 항CCR7-PE처리하여 4℃에서 30분간 염색하였다. PBS 완충액 (2% FBS와 0.01% 아지드 나트륨 함유)로 2회 세척하고, 1% 파라포름알데히드로 고정 후에 FACScallibur (Beckson Dikinson, USA)로 분석하였다. 그 결과를 도 5에 도시하였다.

<실시예 7>

주화성 분석

정제된 수지상 세포를 24시간 동안 1㎍/ml의 Rv0652 및 200ng/ml의 LPS로 처리하거나 하지 않고(음성 대조군), 케모킨 CCL19 (300 ng/mL)에 반응하여 이동하는 것을 측정하였다. 트랜스웰 플레이트(세공 크기 8.0 ㎛; Corning, Acton, MA)의 아래쪽 챔버에는 500 ㎕의 CCL19를 포함하는 것과 포함하지 않는 무혈청(serum-free) 배지를 넣었다. 무혈청 배지에 재현탁된 수지상 세포(0.1 mL에 1 x 10⁵세포)를 트랜스웰 플레이트의 위쪽 챔버에 넣고 5% CO₂ 하에 37℃에서 3시간 동안 이동하도록 두었다. 아래쪽 챔버에서 거둔 이동한 수지상 세포의 수는 FACS(60-second counts)로 셌다. 그 결과를 도 6에 도시하였다.

이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

미성숙 수지상 세포에 결핵균의 Rv0652를 처리하여 성숙시키는 수지상 세포의 성숙 방법.
제1항에 있어서, 상기 Rv0652는 E. coli에 발현시킨 재조합 Rv0652(rEC-Rv0652)인 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 재조합 Rv0652는 유전자 서열 5'-GGATCCATGGCAAAGCTC-3'의 정방향 프라이머 및 서열 5'-GAATTCCTTGACGGT-3'의 역방향 프라이머로 PCR 증폭시킨 후 발현시켜 생산된 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 Rv0652를 넣고 24시간 배양하여 성숙시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 Rv0652는 미성숙 수지상 세포의 배지에 0.25~1 ㎍/ml의 용량으로 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.