KR102173640B1 - 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 체세포로부터 제작된 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(iPS-MSC) 또는 그 조건 배지를 포함하는 자가면역질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 본 발명이 제공하는 약학적 조성물은 조직으로부터 직접 분리된 중간엽 줄기세포에 비해 우수한 면역 제어 및 항염증 효과를 가지며, 공급이 용이하여 류마티스 관절염과 같은 자가면역 질환의 예방 및 치료에 효과적이다.

Description

역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 {Composition for preventing or treating inflammatory disease comprising induced pluripotent stem cell derived mesenchymal stem cell}

본 발명은 면역 조절능이 향상된 중간엽 줄기세포 및 이의 용도에 관한 것으로서, 구체적으로 조직에서 직접 분리된 중간엽 줄기세포에 비해 우수한 면역 조절능을 가지는 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(iPS-MSC)와 이를 포함하는 면역관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

면역체계는 해로운 외부물질인 항원으로부터 신체를 보호하는 역할을 한다. 이러한 항원의 종류로는 박테리아, 바이러스, 독소, 암세포, 다른 사람 혹은 동물의 혈액과 조직이 이에 해당된다. 면역체계는 이러한 해로운 물질에 반응하여 이를 제거하기 위하여 항체를 생산한다. 그러나 자가 면역에 이상이 생긴 경우, 면역체계는 자신의 건강한 신체 장기와 해로운 항원을 구분하지 못하여, 정상적인 조직을 파괴하게 되며, 이러한 반응으로 인해 야기되는 자가 면역 질환 (Autoimmune disease)이 발생하게 된다. 자가 면역에 이상이 생긴 경우에는 신체의 정상적인 조직을 대상으로 반응이 일어나게 된다. 자가면역 이상의 원인은 확실치 않으나, 박테리아와 같은 미생물 또는 약물이 자가 면역 질환에 걸리기 쉬운 유전자를 가지고 태어난 사람들에게 병을 유발하는 것이라는 가설이 있다.

자가면역 치료를 위해 다수의 화학적 및 생물학적 면역치료 방법이 개발되었다. 전형적 치료방법은 스테로이드 같은 화학제 또는 항-면역 세포항체를 이용하여 신체의 면역반응을 전체적으로 약화시키는 것이다. 예를 들어 CD22, CD20, CD19, CD74 또는 HLA-DR 항원에 결합하는 항체를 투여하여, B 세포의 정상기능을 포함한 신체의 전체적 면역반응을 약화시키는 것이다.

대한민국 공개특허공보 제2008-0109705호는 면역억제는 이 증가된 간엽줄기세포 매개 자가유래 수지상 세포에 관한 것으로, T-세포 억제능이 향상된 수지상 세포 및 이의 자가면역질환 용도를 개시한다. 미국특허 제 7,074,403호는 B 세포를 표적으로 하는 항체를 이용한 자가면역 질환의 치료법에 관한 것으로, B-세포 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 개시한다. 미국특허 제7,735,592호는 다른 대상체 유래의 세포를 사용한 면역질환 치료용 세포 조성물에 관한 것으로, 항-CD3, 항-CD28 항체로 코팅된 T 세포 조성물를 개시한다. 종래 자가 면역질환 치료는 신체의 전반적 면역시스템을 약화시키는 것으로, 외부의 침입에 대응할 수 있는 신체의 면역기능을 전반적으로 떨어뜨려 다른 질환에 걸리게 하는 부작용을 초래하였다.

한편, 중간엽 줄기세포 (Mesenchymal Stem Cell; MSC)는 지방세포, 뼈세포 및 연골세포와 같은 여러 세포계통으로 분화할 수 있는 골수를 포함하는 전신에 존재하는 줄기세포이다. 중간엽 줄기세포는 인간, 마우스, 쥐, 개, 염소, 토끼 및 고양이를 포함하는 다수의 종으로부터 분리되었다. 최근 중간엽 줄기세포가 in vitro 및 in vivo에서 여러 T 림프구 활성을 억제하여 면역조절능력을 발휘한다는 보고가 있으며, 중간엽 줄기세포의 원활한 공급을 위해 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPS)를 이용하는 방법이 제시되어 왔으나, 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포와 직접 분리된 중간엽 줄기세포이 면역 조절능의 차이에 대해서는 충분한 연구가 이루어지지 않고 있다.

본 발명자들은 건강한 사람에게서 분리된 세포에서 유도된 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(iPS-MSC)의 면역 조절능을 연구한 결과, 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC)에 비해 iPS-MSC의 면역 조절능이 우수함을 밝혀 iPS-MSC를 이용한 자가면역질환 또는 염증성 질환의 치료용 조성물 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은, 직접 분리된 MSC에 비해 면역 조절능이 향상된 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(iPS-MSC)와 이를 유효성분으로 포함하는 세포치료제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 직접 분리된 MSC에 비해 면역 조절능이 향상된 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(iPS-MSC)를 포함하는, 자가면역질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은, 직접 분리된 MSC에 비해 면역 조절능이 향상된, 역분화 줄기세포로부터 유도된 중간엽 줄기세포(iPS-MSC), iPS-MSC 배양액, 또는 세포가 제거된 iPS-MSC 배양액을 유효성분으로 포함하는 세포치료제, 또는 자가면역질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 명세서에서, "역분화 줄기세포"는 "유도줄기세포","유도만능줄기세포"또는 "iPS(induced pluripotent stem cell)"와 혼용되어 사용될 수 있으며. 체세포, 단핵구(monocyte) 등 분화가 이루어진 세포를 리프로그래밍하여 다시 다분화능(pluripotent)을 가지는 줄기세포로 유도된 세포를 의미한다.

본 명세서에서, "세포 치료제"란 세포와 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가 (autologous), 동종 (allogenic), 이종 (xenogenic) 세포를 체외에서 증식ㆍ선별하거나 여타한 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 말한다. 미국은 1993년부터, 우리나라는 2002년부터 세포치료제를 의약품으로 관리하고 있다. 이러한 세포치료제는 크게 두 분야로 분류할 수 있으며 그 첫 번째는 조직재생 혹은 장기기능 회복을 위한 "줄기세포 치료제"이며, 두 번째는 생체 내 면역반응의 억제 혹은 면역반응의 항진 등 면역반응 조절을 위한 면역세포 치료제로 분류할 수 있다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 일 예는 면역 조절능이 향상된, 예를 들면 항염증인자가 증가되고 염증 인자가 감소된, 정상세포에서 유도된 유도만능줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(iPS-MSC)를 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 일 예는 면역 조절능이 향상된 정상세포에서 유도된 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(iPS-MSC)를 포함하는 세포 치료제에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 일 예는 면역 조절능이 향상된 정상세포에서 유도된 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(iPS-MSC)를 포함하는 자가면역질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(iPS-MSC)는, 포유동물에서 분리된 세포에서 유도된 역분화 줄기세포에서 유래된다는 점에서, 조직에서 직접 분리된 MSC, 예를 들면 골수유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC), 또는 배아 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cell driven from Embryonic stem cell, ES-MSC)와 구별된다. 본 발명의 일 예에서, 상기 iPS-MSC는 정상인으로부터 분리된 세포에서 유래한 것일 수 있다.

일반적으로 "중간엽 줄기세포 (Mesenchymal Stem Cell; MSC)"는 골수(bone marrow), 혈액, 진피 및 골막에서 직접 분리되어 얻어지는 줄기세포로서, 다양한 세포, 예컨대 지방세포, 연골세포 및 뼈세포 등으로 분화할 수 있는 전능성 (pluripotent) 또는 다능성(multipotent) 세포를 의미한다. 일반적으로 조직에서 직접 얻어지는 중간엽 줄기세포는, 포유동물, 바람직하게는, 인간의 중간엽 줄기세포 소스, 예컨대, 혈액 또는 골수로부터 중간엽 줄기세포를 분리하는 단계 (상기 골수는 경골, 대퇴골, 척수 또는 장골로부터 추출할 수 있다.); 분리된 세포를 적합한 배지에서 배양하는 단계; 및 배양과정에서 부유 세포를 제거하고 배양 플레이트에 부착된 세포들을 계대 배양하여, 최종적으로 구축된 중간엽 줄기세포를 수득하는 단계를 통하여 얻을 수 있다.

상기 조직 유래 중간엽 줄기 세포는 제대 유래 중간엽 줄기 세포, 제대혈 유래 중간엽 줄기 세포, 골수 유래 중간엽 줄기 세포, 지방 유래 중간엽 줄기 세포, 근육 유래 중간엽 줄기 세포, 신경 유래 중간엽 줄기 세포, 피부 유래 중간엽 줄기 세포, 양막 유래 중간엽 줄기 세포, 및 태반 유래 중간엽 줄기 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 iPS-MSC는 조직에서 직접 분리된 MSC에 비해 면역조절능이 향상된 특성을 가지며, 예를 들면 항염증인자가 증가되고 염증 인자가 감소된 특성을 가진다. 상기 면역조절능의 향상 정도는 염증성 지수(R)로 평가할 수 있으며, 상기 염증성 지수(R)는 항염증성 사이토카인의 발현량 대비 염증성 사이토카인 발현량으로 표현된다(하기 수학식 1). 구체적으로, 염증성 지수의 수치가 낮을수록, 면역조절능이 증가한 것으로 평가된다. 본 발명에 따른 iPS-MSC의 염증성 지수는 조직으로부터 직접 분리된 중간엽줄기세포의 염증성 지수 100%를 기준으로 40% 이하로 표시될 수 있다.

본 발명에 따른 iPS-MSC는 직접 분리된 MSC에 대해 항염증성 사이토카인 대비 염증성 사이토카인의 비율을 평가하고자 하는 경우, iPS-MSC 와 직접 분리된 MSC는 활액 세포와 접촉하여 공조배양하는 경우와 활액 세포없이 단독배양하는 경우로 구분하여 표시할 수 있으며, 두 가지 배양의 경우에 iPS-MSC의 비율과 직접 분리된 MSC의 비율간의 배수비로 표현할 수 있다. 상기 공조배양 및 단독 배양 모두에서, iPS-MSC의 염증성 지수가 조직으로부터 직접 분리된 MSC의 염증성 지수보다 적은 수치를 가지며, 이는 iPS-MSC가 조직에서 직접 분리한 MSC에 비해 우수한 항염증 효과를 가짐을 나타낸다.

[수학식 1]

염증성 지수(R) = 염증성 사이토카인 발현량(pg/ml)/ 항염증성 사이토카인의 발현량 (pg/ml)

상기 사이토카인의 발현량은 통상의 기술자가 목적에 따라 당업계에 알려져 있는 방법을 자유롭게 선택하여 사이토카인 발현량 측정에 사용할 수 있으며, 예를 들어, 효소결합면역침강분석(Enzyme linked immunosorbent assay; ELISA), 유세포분석법(Flow cytometry), 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR), 및 공촛점 현미경(confocal Microscopy)으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 방법을 선택하여 측정될 수 있다.

상기 염증성 사이토카인은 당업계에 공지된 염증성 사이토카인이라면 제한없이 선택될 수 있다. 예를 들어, 염증성 사이토카인은 TNF-a(tumor necrosis factor alpha), IL-1b(interleukin 1 beta), IL-2, IL-6, IL-8, 및 IL-17로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 IL-6, IL-8 및 IL-17로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 항염증성 사이토카인은 당업계에 공지된 항염증성 사이토카인이라면 제한 없이 선택될 수 있다. 예를 들어, TNF-b(tumor necrosis factor beta), IL-4, IL-10 및 IL-13으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 TNF-b 또는 IL-10, 더욱 바람직하게는 IL-10일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 iPS-MSC를 활액 세포없이 단독배양하는 경우, 상기 iPS-MSC의 염증성 지수(R)는, 0.00001 내지 15, 0.0001 내지 15, 0.001 내지 15, 0.01 내지 15, 0.00001 내지 10, 0.0001 내지 10, 0.001 내지 10, 0.00001 내지 8, 0.0001 내지 8, 0.001 내지 8, 0.00001 내지 6, 0.0001 내지 6, 또는 0.001 내지 6일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 iPS-MSC를 활액 세포없이 단독배양하는 경우, 상기 iPS-MSC의 염증성 지수(R)는, 조직에서 직접 분리된 MSC (예, BM-MSC)의 염증성 지수 100%를 기준으로, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 1% 이하, 0.5% 이하, 0.3% 이하, 0.2% 이하, 0.1% 이하, 0.01% 이하 또는 0.001% 이하일 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 iPS-MSC를 활액 세포없이 단독배양하는 경우, 상기 iPS-MSC의 염증성 지수는, 조직에서 직접 분리된 MSC (예, BM-MSC)의 염증성 지수를 100%를 기준으로, IL-6/IL-10의 발현 비율(R)은 0.3%이하, 0.2% 이하, 0.15% 이하, 0.10% 이하, 0.01% 이하, 0.07% 이하, 0.05% 이하, 0.03% 이하, 0.01% 이하, 또는 0.001% 이하 범위의 수치를 나타내고, IL-8/IL-10 의 발현 비율(R)은 30%이하, 25% 이하, 20% 이하, 17% 이하, 15% 이하, 13% 이하 또는 10% 이하 범위의 수치를 나타낼 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, iPS-MSC 또는 직접 분리된 MSC를 단독 배양한 경우, iPS-MSC의 염증성 지수는, IL-6/IL-10 (p<0.01) 및 IL-8/IL-10 (p<0.05)의 발현량 비율이 골수유래 줄기세포 (BM-MSC)와 비교하여 통계적으로 유의하게 낮은 수치를 나타냈다. 즉, iPS-MSC는 염증성 지수, 예를 들면 IL-6/IL-10　비율은, BM-MSC의 수치를 100%로 두었을 때 약 0.053%의 수치를 나타내었고, IL-8/IL-10 비율은 BM-MSC의 수치를 100%로 두었을 때 약 15% 수준으로 나타났다. 상기 실험결과를 고려할 때, iPS-MSC가 BM-MSC에 비해 항염증 효과가 현저히 뛰어남을 확인할 수 있다.

본 발명에 따른 iPS-MSC와 BM-MSC의 염증성 지수를 비교하였을 때, iPS-MSC의 IL-6/IL-10의 비율값은 p 값이 0.01 이하이면서 염증성 지수 값이 1 이하 및/또는 IL-8/IL-10의 비율값은 p값이 0.05 이하이면서 염증성 지수 값이 10 이하일 수 있다.

본 발명에 따른 iPS-MSC를 활액 세포와 접촉하는 경우, 예를 들어 활액세포와 중간엽 줄기세포의 공조배양 또는 활액세포에 중간엽 줄기세포가 주입되는 경우, 상기 iPS-MSC의 사이토카인의 발현 비율(R)은, 0.001 내지 1.5, 0.01 내지 1.5, 0.1 내지 1.5, 0.2 내지 1.5, 0.3 내지 1.5, 0.001 내지 1.0, 0.01 내지 1.0, 0.1 내지 1.0, 0.2 내지 1.0, 0.3 내지 1.0, 0.001 내지 0.7, 0.01 내지 0.7, 0.1 내지 0.7, 0.2 내지 0.7, 또는 0.3 내지 0.7일 수 있다.

상기 항염증성 사이토카인 대비 염증성 사이토카인의 비율은 중간엽 줄기세포(MSC)가 활액 세포와 접촉하는 경우, 예를 들어 활액세포와 중간엽 줄기세포의 공조배양 또는 활액세포에 중간엽 줄기세포가 주입되는 경우, 직접 분리된 MSC의 사이토카인 발현 비율(R)을 100%으로 두었을 때, iPS-MSC의 사이토카인 발현 비율(R)은 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하 또는 5% 이상 15% 이하일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, iPS-MSC의 면역 조절능을 확인하기 위해 인간 단핵구 세포를 Th17 분화 조건으로 자극하여 iPS-MSC 또는 BM-MSC와 공조배양하였다. 그 결과 iPS-MSC와 공조배양한 경우, BM-MSC와 공조배양했을 때보다 세포 내 IL-17 생성량이 더 감소한 반면, Treg 마커의 양은 유의미한 차이가 없었다. 즉, 본 발명에 따른 iPS-MSC는 염증성 Th17세포 (IL-17생성)를 골수유래 줄기세포 (BM-MSC) 보다 더욱 억제하고, 반면 면역조절T세포 (Treg)는 유지함을 확인하였다. 또한, iPS-MSC 세포 배양액에서는 염증성 사이토카인인 IL-17 생성은 감소하고 항염증성 사이토카인인 IL-10은 더 증가함을 확인하였다. 세포 배양액의 IL-17과 IL-10의 양을 비교한 경우에도 iPS-MSC와 공조배양한 배양액 내의 IL-17 양은 BM-MSC의 공조배양액에서보다 더 큰 폭으로 감소하였으나, IL-10의 양은 iPS-MSC에서 큰 폭으로 증가하여, iPS-MSC가 BM-MSC에 비해 우수한 면역조절능 및 항염증 효과를 확인할 수 있었다. 즉, Th17 분화 조건 하에서 단핵구만을 배양한 경우, IL-17생성량이 증가하지만, MSC 존재 하에서는 IL-17양이 감소하고, 특히 iPS-MSC의 경우 단핵구 단독 배양시보다 IL-17 양성 세포의 수가 절반 가까이 줄어들어 BM-MSC에 비해 더 큰 감소폭을 보였다.

본 발명의 일 실시예에서 MSC와 류마티스 관절염 환자의 활액 세포를 Th17 분화 조건 하에서 공조배양한 경우, iPS-MSC가 없이 RA-SFMC만을 배양한 대조군에 비해, 염증성 사이토카인인 IL-17의 생성이 Th17 분화 조건으로 자극하지 않았을 때와 유사한 수준으로 감소하였으며, 반면에 Treg의 CD25+Foxp3+ 발현은 3배 이상 증가하였다. 즉, iPS-MSC를 처리한 경우, IL17 양성 세포의 수는 Th17 분화 조건 처리를 하지 않은 경우와 유사하였으며, Treg 세포의 비율은 급격히 증가하여, 류마티스 환자에 대한 우수한 면역조절 효과를 암시한다(실시예 4).

본 발명에 따른 iPS-MSC는 역분화 줄기세포에서 유래된 것으로서, 먼저 정상인의 혈액으로부터 세포, 예를 들면 단핵구를 얻고, 이를 단핵구 세포를 24-well plate에 vitronectin으로 코팅후 (BD BioCoat ??) 및 Sendai virus (SeV) (CytoTune®-iPS 2.0 Reprogramming kit, Life Technologies, Invitrogen)를 통해 역분화줄기세포 (iPS)를 제조하였다. 상기 역분화 줄기세포를 EB(embryo body)를 생성시키기 위해 콜로니 형태로 세포를 뜯어서 20% 우태아 혈청이 포함된 α-Minimum Eagle's Medium 배양액에서 b-FGF, rh TGF-b 사이토카인을 통해 분화시켜 iPS-MSC를 얻는다. 상기 단핵구에서 역분화 줄기세포를 제조하고, 역분화 줄기세포로부터 iPS-MSC 를 얻은 방법은 잘 알려져 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 iPS-MSC의 제조 방법은, (1)정상인의 혈액에서 단핵세포를 분리하고, Sendai virus (SeV), CytoTune®-iPS 2.0 Reprogramming kit 를 이용하여 역분화 줄기세포(iPS)를 제조하는 단계 및 (2) 상기 iPS를 EB(embryo body)를 생성시키기 위해 콜로니 형태로 세포를 뜯어서 20% 우태아 혈청이 포함된 α-Minimum Eagle's Medium 배양액에서 b-FGF, rh TGF-b 사이토카인을 통해 분화시켜 iPS-MSC를 제조하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 iPS-MSC를 제조하기 위한 역분화 줄기세포를 얻고자 하며, 상기 역분화 줄기세포는 단핵구 세포, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로부터 유래 것일 수 있다.

본 발명에서 "정상" 또는 "정상인"이란, 자가면역질환 또는 염증성 질환 환자가 아닌 개체 또는 사람을 의미하며, 자가면역질환 또는 염증성 질환의 발병 또는 진단 시점 이전의 상태를 포함한다.

상기 개체는 인간을 포함하는 인간, 원숭이 등의 영장류, 래트, 마우스 등의 설치류 등을 포함하는 포유동물, 바람직하게는 인간일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 염증성 질환은 사이토카인 매개성 염증성 질환이며, 상기 사이토카인 매개성 염증성 질환의 예는, 전신 홍반성 루프스, 하시모토 갑상선염, 제1형 당뇨, 갑상선기능저하증, 갑상선기능항진증, 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 건선, 크론병, 갑상선염, 및 궤양성 대장염으로 이루어진 군에서 선택된 1이상을 포함하는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 류마티스 관절염일 수 있다.

본 명세서에서 제공되는 약학 조성물은, 통상의 방법에 따라 제형화 된, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 또는 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 외용제, 좌제, 멸균 주사 용액, 이식용 제제 등의 비경구용 제형 등으로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 바람직하게는 비경구로 투여된다. 비경구로 투여되는 경우, 본 발명의 약학 조성물은 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입 및 복강 주입 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 적용되는 질환의 종류에 따라, 투여 경로가 결정되는 것이 바람직하다. 예컨대 타입 I 당뇨병에 적용되는 경우, 복강투여가 가장 바람직하고, 이는 투여된 수지상세포가 희석되지 않고 효과적으로 췌장으로 이동할 수 있기 때문이다. 또한, 본 발명의 약학 조성물이 관절염 환자에 적용되는 경우에는 정맥내 주사로 투여될 수 있지만, 가장 바람직하게는 국부적으로 관절내 주입으로 투여된다.

본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 수용자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 1 x 10³ 내지 1 x 10¹² 세포/kg 이다.

발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.

본 발명은 BM-MSC에 비해 면역 우수한 면역 조절능을 가지는, iPS-MSC를 포함하는 자가면역질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 직접 분리된 MSC에 비해 MSC의 공급이 용이하고, 직접 분리된 MSC에 비해 현저히 우수한 면역 조절 효과를 보여 류마티스 관절염을 비롯한 자가면역질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료에 활용될 수 있다.

도 1a는 정상인의 단핵구유래 유도만능줄기세포(hiPSC) 유래 중간엽 줄기세포(iMSC 또는 iPS-MSC로 표시됨)를 제조하는 과정에서 세포 외형의 변화를 나타낸 현미경 사진이다.
도 1b는 iPS-MSC가 외형적 특징 외에 MSC 특이적 마커를 정상적으로 발현하는지 확인한 그래프이다.
도 1c는 실시예 1의 방법으로 형성된 iPS-MSC가 직접 분리된 MSC와 마찬가지로 연골세포, 조골세포 및 지방세포로의 분화능을 가지는 지 확인하기 위해 각 분화 조건으로 유도 후 분화 완료된 세포를 염색하여 관찰한 사진이다.
도 2a 및 도 2b는 iPS-MSC와 BM-MSC의 염증성 사이토카인 및 항염증성 사이토카인의 생산량을 비교한 그래프이다.
도 3a 및 도 3b는 인간의 단핵구를 분리해 Th17 분화 조건으로 분화를 유도한 후 BM-MSC 또는 iPS-MSC와 함께 공조배양한 후, Th17세포에서 생산하는 IL-17과 Treg 세포 특이적 마커인 Foxp3+CD4+ 세포의 비율을 비교한 그래프이다.
도 3c는 Th17분화조건 하에서 인간 단핵구와 BM-MSC 또는 인간 단핵구와 iPS-MSC를 공조배양하였을 때 배양액 내 IL-17 및 IL-10의 양을 비교한 그래프이다.
도 4a 및 도 4b는 류마티스 관절염 환자로부터 분리한 활액세포를 Th17 분화 조건 하에서 iPS-MSC와 공조배양하여 Th17세포 또는 Treg 세포의 비율을 분석한 그래프이다.
도 5는 류마티스 관절염 환자로부터 분리한 활액세포와 BM-MSC 또는 iPS-MSC를 Th17분화조건 하에서 공조배양하여 염증반응에 관여하는 IL-17 및 IL-10의 양을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 권리범위를 제한하지 않는다.

실시예 1. 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(iPS_MSC)의 제작

1-1. 역분화 줄기세포(iPS)의 제작

면역 질환이 진단되지 않은 건강한 사람(이하 '정상인'이라 한다)의 혈액으로부터 단핵구를 분리하여 역분화 줄기세포 제작에 이용하였다. 구체적으로, 정상인의 혈액은 가톨릭 성모병원 정상인 기부자로부터 얻어 사용하였으며, 혈액10mL를 2,000rpm, 30분간 Ficoll Paque ?? PLUS (GE Healthcare)를 사용하여 원심 분리하여 단핵세포를 분리하였다.

분리된 단핵구는 StemSpan cc110이 보충 된 StemSpan ?? ACF (Stem Cell Technologies)에서 4 일 동안 배양되었다. 이후, 단핵구 세포를 24-well plate에 vitronectin으로 코팅후 (BD BioCoat ??) 및 Sendai virus (SeV) (CytoTune®-iPS 2.0 Reprogramming kit, Life Technologies, Invitrogen)를 통해 역분화줄기세포 (iPS)를 제조하였다. 배지는 iPS 콜로니가 형성 될 때까지 매일 바꾸었다. 수동 피킹 후, iPS 라인은 TeSR-E8 배지 (Stem Cell Technologies)에서 vitronectin (Life Technologies, Invitrogen)으로 코팅 된 플레이트에서 유지되었다. 형질 도입 후 12 일에 신생 iPS 콜로니를 개별적으로 골라 특성화를 위해 확대시켰다. 형질 도입 후 3 일부터 21 일까지 세포를 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하여 역분화 줄기세포를 얻었다.

1-2. 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(iPS-MSC)의 제작

실시예 1-1의 방법으로 얻은 역분화 줄기세포 (iPS)는 iMSC로 다시 분화하기 위해 1개의 100mm dish에서 100% confluence로 키운 iPS 세포를 PBS 세척한 후 1mg/ml type IV Collagenase용액을 100mm dish에 3ml 넣고 37℃, 10분 반응후, Media 6ml첨가후 1100rpm, 3분 원심분리 하였다. 6well ultra low attachment dishes에 100mm 1dish 당 2well에 3ml 배양액 20% α-Minimum Eagle's Medium (0.1mM nonessential amino acid(100x) gibco, 1 mM L-glutamine, 0.1mM 2-mercaptoethanol, 1% penicillin streptomycin)으로 resuspension후 b-FGF 1ng/ml로 자극하였다. 분화 4일째, EB outgrowth을 시키기 위해 1% Gelatin 코팅된 100mm dish에 rh TGF-b 자극하였다. 2일째 마다 같은 방법으로 배양액을 교체하면서 iPS-MSC를 배양하였다.

실시예 2: iPS-MSC의 세포 특성분석

2-1. iPS-MSC의 세포형태적 특성

실시예 1-2의 방법으로 제작된 iPS-MSC의 세포 외형, 줄기세포 마커의 발현 여부 및 다세포 분화능을 확인하여 그 결과를 도 1a 내지 도 1c에 나타내었다.

구체적으로, 현미경을 이용하여 iPS로부터 iPS-MSC로 변화하는 과정에서의 세포 형태 변화를 살폈다. 관찰을 위한 세포 시료는 iPS-MSC를 4주 정도 키운후 passage 5이상인 세포로 준비되었다.

도 1a는 정상인의 단핵구유래 유도만능줄기세포(hiPS) 유래 중간엽 줄기세포(iMSC 또는 iPS-MSC로 표시됨)를 제조하는 과정에서 세포 외형의 변화를 나타낸 현미경 사진이다. hiPS에서는 콜로니 형성이 두드러지게 나타났지만, iMSC에서는 이러한 콜로니의 모습이 관찰되지 않아, 외형적 변화가 관찰되었다.

2-2. iPS-MSC의 줄기세포 마커 발현 분석

이러한 iPS-MSC에 대해 MSC 마커로 알려져 있는 CD34, CD31, CD19, CD11, HALDR (Negative marker), CD44, CD73, CD105, CD90 (Positive marker)의 발현 여부를 조사하였다. 구체적으로 iMSC를 4주 정도 키운 후 passage 5 이상인 세포에서 flow cytomery로 확인하였다. 도 1b는 iPS-MSC가 외형적 특징 외에 MSC 특이적 마커를 정상적으로 발현하는지 확인한 그래프이다.

네거티브 마커로 알려져 있는 CD34, CD31, CD19, CD11 및 HALDR의 발현량 증가는 나타나지 않았으나, 포지티브 마커로 알려져 있는 CD44, CD73, CD105, 및 CD90가 검출되는 세포의 수는 증가하였다. 따라서, 실시예 1-2의 방법으로 유도된 iPS-MSC는 중간엽 줄기세포로서의 특징을 나타낸다.

2-3. iPS-MSC의 다세포 분화능 분석

본 발명의 iPS-MSC가 중간엽 줄기세포 특유의 다분화능을 가져 연골세포(chondrocyte), 조골세포(osteoblast), 및 지방세포(adipocyte)로 분화 가능 여부를 확인하였다. 구체적으로 safranin-O, alkaline phosphatase (ALP) 기질, 및 Oil Red O 염색을 수행후 Zeiss 현미경 (LSM 510 Meta, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 관찰하여 시각화하는 방법으로 수행하였다. 그 결과를 도 1c에 나타내었다. 도 1c에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 iPS-MSC는 연골세포, 조골세포, 및 지방세포로 분화할 수 있는 다분화능(multi-lineage differentiation)을 가짐을 확인하였다.

구체적으로, 도 1c는 실시예 1의 방법으로 형성된 iPS-MSC가 직접 분리된 MSC와 마찬가지로 연골세포, 조골세포 및 지방세포로의 분화능을 가지는 지 확인하기 위해 각 분화 조건으로 유도 후 분화 완료된 세포를 염색하여 관찰한 사진이다. 연골세포, 조골세포 및 지방세포 모두로의 분화가 확인되어 iPS-MSC가 직접 분리된 MSC와 동일한 기능을 함을 알 수 있다.

실시예 3. iPS-MSC의 항염 활성 평가

iPS-MSC의 항염증 효과를 확인하기 위해 염증성 사이토카인 또는 항염증성 사이토카인 발현량을 ELISA를 이용하여 확인하였다.

구체적으로, 실시예 1-2에서 제작된 iPS-MSC를 실험군으로 골수 유래 줄기세포(BM-MSC)를 대조군으로 하여, 100mm dish에서 90% confluence로 줄기세포를 키운 후에 수행하였다. 염증성 사이토카인 IL-6, IL-8, IL-2 및 항염증성 사이토카인 IL-10 및 TGF-b (R & D Systems, Minneapolis, MN, USA)에 따라 제조업체의 지시 사항을 따라 ELISA 마이크로 플레이트를 사용하여 흡광도 판독기 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) 405 nm에서 측정하여 ELISA를 수행하였다.

염증성 사이토카인 IL-6, IL-8, 및 항염증성 사이토카인 IL-10 및 TGF-b의 발현량을 측정하여 그 결과를 도 2a 및 도 2b에 나타내었다. 대조구로서 BM-MSC는 가톨릭세포치료 사업단으로부터 구입하여 사용하였다. 중간엽 줄기세포는 DMEM/F12 (Gibco)에 10% FBS와 antibiotics를 첨가하여 37℃, 5% 이산화탄소, 습도 95% 배양기에 배양하였다.

도 2a 및 도 2b는 iPS-MSC와 BM-MSC의 염증성 사이토카인 및 항염증성 사이토카인의 생산량을 비교한 그래프이다.

도 2a 및 도 2b에 나타낸 바와 같이, iPS-MSC에서는 염증성 사이토카인 중 IL-6과 IL-8의 발현량이 현저히 감소하였으나, 항염증성 사이토카인의 경우, IL-10과 TGF-b 모두 발현량에 유의미한 차이가 나타나지 않았다. 즉, IL-6 및 IL-8은 염증성 사이토카인, Il-10, TGF-b는 비염증성 사이토카인에 해당하며, 특히 염증성 사이토카인의 감소가 두드러짐을 확인할 수 있다.

항염증성 사이토카인 IL-10의 발현량 대비 IL-6 및 IL-8의 발현량 (pg/ml)을 측정하고 이의 비율을 항염증성 사이토카인의 발현량 대비 염증성 사이토카인의 발현량 비율(=염증성 사이토카인 발현량 / 항염증성 사이토카인의 발현량)로 계산하여 하기 표 1에 나타내었다. 하기 표 1은 iPS-MSC와 BM-MSC의 염증성 사이토카인 및 항염증성 사이토카인의 비율을 나타낸다.

면역계는 면역관용과 면역반응 두 가지가 시소와 같이 균형을 유지하며 적절히 조절되고 있다. 두 힘의 균형이 한쪽으로 치우치며 균형이 깨지는 경우에 면역학적 항상성이 붕괴되며, 이러한 면역학적 항상성의 붕괴는 다양한 형태의 면역학적 관련 질병 발병 원인이 된다. 이러한 면역학적 균형은 염증성과 항염증성 사이토카인에 의해 조절될 수 있다. iPS-MSC와 BM-MSC에서 항염증성 사이토카인의 발현량은 차이가 없으나, 항염증성 대비 염증성 사이토카인의 발현량 즉, IL-6/IL-10과 IL-8/IL-10 비율값이 iPS-MSC에서 BM-MSC와 비교하여 통계적으로 유의하게 감소되어 있으므로 면역학적 조절능이 뛰어남을 예측할 수 있다.

사이토카인	BM-MSC	iPS-MSC	iPS-MSC/BM_MSC	p value
IL-6/IL-10	19.9±3.4	0.01±0.01	0.0005	0.0014
IL-8/IL-10	33.4±14.2	5.0±0.5	0.1497	0.0272

상기 표 1에 의해 유도줄기세포 (iPS-MSC)에서 염증성 사이토카인과 항염증성 사이토카인의 비율을 비교하였을 때, IL-6/IL-10 (p<0.01) 및 IL-8/IL-10 (p<0.05)의 발현량 비율이 골수유래 줄기세포 (BM-MSC)와 비교하여 통계적으로 유의하게 감소되었다. 즉, iPS-MSC는 항염증성 사이토카인의 발현량 대비 염증성 사이토카인의 발현량 비율(=염증성 사이토카인 발현량 / 항염증성 사이토카인의 발현량)이 IL-6/IL-10　비율은, BM-MSC에 비해 1,990배 감소하였고, IL-8/IL-10 비율은 BM-MSC에 비해 약 6.7배 감소하였다. 상기 실험결과를 고려할 때, iPS-MSC가 BM-MSC에 비해 항염증 효과가 현저히 뛰어남을 예측할 수 있다.

실시예 3. iPS-MSC의 면역 조절능 확인

체내 면역 조절과 관련하여, Th17세포는 사이토카인 면역계를 교란시키는 IL-17을 생성하여, 관절염, 다발성 경화증, 건선, 및 염증성 장 질환 등의 여러 가지 자가면역질환에 관여하는 것으로 알려져 있다. 특이적인 사이토카인 IL-17을 많이 생산하는 Th17세포은 자가면역 질환인 류마티스 관절염 병인에서 동물모델과 인간세포 연구 결과들을 통해 직접적인 역할과 병원체에 대한 숙주 방어 또는 이상 면역반응 유도 등의 역할이 규명되어 있다. 반면, 면역조절 T세포(Treg)는 면역 반응을 억제하여, 체내의 과도한 면역 반응을 방지하는 역할을 한다.

본 발명의 iPS-MSC가 면역 조절능을 가지는 지 확인하기 위해, 정상인의 단핵구 세포를 Th17세포 분화 조건 (anti-CD3 (1 μg/ml; BD Biosciences), anti-CD28 (1 μg/ml; BD iosciences), IL-1β (20 ng/ml; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), IL-6 (20 ng/ml; R&D Systems), IL-23 (20 ng/ml; R&D Systems), neutralizing antibodies against interferon-gamma (IFN-γ; 2 μg/ml; R&D Systems), IL-4 (2 μg/ml; R&D Systems) 으로 자극하여 iPS-MSC 또는 BM-MSC와 RPMI 1640 medium 배지에 10% fetal calf serum (FCS), 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin, and 2 mM L-glutamine를 첨가하여, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 48시간 동안 공조배양하고, FACS를 이용하여 Th17세포에서 생성되는 IL-17 (도 3a 및 도 3b)과 면역조절 T 세포에서 생성되는 CD25+Foxp3+ 발현을 조사하고, 각 배양액에서 IL-17과 IL-10의 함량을 ELISA를 이용해 분석하였다(도 3c).

구체적으로, FACS 방법은, 세포 표면 염색 방법으로 단일 클론 항체 항 -CD4-PE / Cy7 (RPA-T4, IgG1, BioLegend, San Diego, CA, USA) 및 항 -CD25-APC (M-A251, IgG1, κ, BD Biosciences) 에 대하여 시행하였으며 세포내 염색법으로 세포를 씻어준 다음, 투과성으로 만들고, 단일 클론 항체 항-IL-17-PE (eBio64dec17, IgG1, κ, eBioscience, San Diego, CA, USA), 항-IFN-γ-FITC (4S.B3, IgG1, κ; eBioscience) 및 항-Foxp3-FITC (PCH101, IgG2a, κ; eBioscience) 항체와 함께 인큐베이션 하였다. 또한 적절한 isotype 항체를 준비하여 염색하였다. 유세포 분석기(FACS Calibur; Becton Dickinson, San Diego, CA)로 세포 내 사이토카인을 분석하였다.

또한, sandwich ELISA 방법은, Sandwich ELISA용 96 well plate (NUNC, Denmark)에 단클론성 IL-6, IL-8, IL-2, IL-10, TGF-b, IL-17 (R&D systems, USA)를 각각 4 ug/mL로 50 ul/well씩 넣고 4℃에서 밤새 반응시킨 다음 차단용액 (1% (w/v) BSA/ PBS (Phosphate-Buffered Saline), 0.05% (v/v) tween 20/PBS)을 200 uL/well씩 넣고 실온에서 2시간 반응시켰다. 대조군으로는 재조합 IL-6, IL-8, IL-2, IL-10, TGF-b, IL-17 (R&D, USA)를 이용 하여 각각 5 ng/mL∼78 pg/mL 농도를 측정하였다. 표준시료와 함께 측정할 분리한 환자 혈청을 50 uL/well씩 넣고 실온에서 2시간 반응시켰다. 반응용기를 세척용액 (0.05% (v/v)Tween 20/PBS)으로 4번 세척하고 biotinylated IL-6, IL-8, IL-2, IL-10, TGF-b, IL-17 항체를 200 ng/mL로 희석하여 50 uL/well씩 넣어 실온에서 2시간 반응시킨 후 세척용액으로 4번 세척하였다. 마지막으로는 Extravidin-Alkaline phosphatase conjugate (SIGMA, USA, #E2636)를 1：2,000으로 희석하여 50 uL/well씩 넣고 실온에서 2시간 반응시키고 세척 후 phosphate disodium salt hexahydrate (PNPP, Fluka)/Diethanolamine 용액(DEA, 97Ml, NaN3 0.2 g, MgCl2H2O 0.1 g, 1차 증류수 800 mL)을 1 mg/mL 농도로 녹여 50 uL/well씩 넣어 30분 후 0.2 M NaOH로 반응을 멈추고 405 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

도 3a 내지 3c에 분석 결과를 나타내었다. 도 3a 및 도 3b는 인간의 단핵구를 분리해 Th17 분화 조건으로 분화를 유도한 후 BM-MSC 또는 iPS-MSC와 함께 공조배양한 후, Th17세포에서 생산하는 IL-17과 Treg 세포 특이적 마커인 Foxp3+CD4+ 세포의 비율을 비교한 그래프이다.

도 3a 내지 도 3c에 나타낸 것과 같이, 본 발명에 따른 iPS-MSC는 염증성 Th17세포 (IL-17생성)를 골수유래 줄기세포 (BM-MSC) 보다 더욱 억제하고, 반면 면역조절T세포 (Treg)는 유지함을 확인하였다. 또한, iPS-MSC 세포 배양액에서는 염증성 사이토카인인 IL-17 생성은 감소하고 항염증성 사이토카인인 IL-10은 더 증가함을 확인하였다. 즉, Th17 분화 조건 하에서 단핵구만을 배양한 경우, IL-17생성량이 증가하지만, MSC 존재 하에서는 IL-17양이 감소하고, 특히 iPS-MSC의 경우 단핵구 단독 배양시보다 IL-17 양성 세포의 수가 절반 가까이 줄어들어 BM-MSC에 비해 더 큰 감소폭을 보였다. 도 3c는 Th17분화조건 하에서 인간 단핵구와 BM-MSC 또는 인간 단핵구와 iPS-MSC를 공조배양하였을 때 배양액 내 IL-17 및 IL-10의 양을 비교한 그래프이다. iPS-MSC와 공조배양한 경우 염증성 사이토카인인 IL-17의 양이 큰 폭으로 감소하였으며, 항염증성 사이토카인인 IL-10은 크게 증가하였다.

Th17 분화조건 및 각 MSC와 공조배양한 결과 IL-10 대비 IL-17의 비율을 표 2에 나타내었다. 구체적으로, Th17 분화 조건에서는 IL-17/IL-10 비가 2.3 수준이었으나, BM-MSC와 공조배양하였을 때에는 1.6 수준으로 떨어졌고, iPS-MSC에서는 0.5로 크게 감소하였다.

실시예 4. iPS-MSC의 류마티스 관절염의 SFMC 저해 효능 평가

4-1. 류마티스 환자 유래 활액 세포의 Th17 또는 Treg 세포 활성 조절 분석

류마티스 관절염은 관절 활막 내 세포들이 활성화되어 관절 조직 내로 침윤이 일어나면서 염증성 사이토카인의 증가에 의해 질병이 활성화되는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 iPS-MSC가 류마티스 관절염에 대한 질환 제어 효과를 가지는 지 확인하고자 하였다. 즉, 류마티스 관절염 환자의 활액에서 분리한 활액유래 단핵세포 (synovial fluid mononuclear cells from RA patients: RA SFMC)에서 iPS-MSC의 면역 조절능을 확인하기 위해, 류마티스 관절염 환자의 SFMC를 Th17세포 분화조건으로 자극 후 iPS-MSC와 공조배양을 하였을 때 Th17 세포에서 생성되는 사이토카인인 IL-17생성과 면역조절T세포 (Treg)에서 생성되는 마커인 CD25+Foxp3+ 발현을 FACs로 조사하였다.

구체적으로, 류마티스 관절염 환자의 활액은 가톨릭대학교 류마티스 내과로부터 얻었다. 류마티스 관절염 환자로부터 분리된 활액으로부터 실시예 1에 기재된 방법으로 단핵세포를 얻고 (RA SFMC; synovial fluid mononuclear cells from RA patients), 실시예 3에 기재된 바와 같이 Th17 분화 조건을 형성하여 iPS-MSC와 37℃, 5% CO₂ 조건에서 48시간 공조배양하였다. 상기 배양물로부터 Th17에서 형성된 IL-17 생성량과 면역조절 T세포(Treg)에서 생성되는 CD25+Foxp3+ 발현을, 실시예 3의 FACS과 실질적으로 동일한 방법으로 분석하여 그 결과를 도 4a 및 도 4b에 나타내었다.

도 4a 및 도 4b는 류마티스 관절염 환자로부터 분리한 활액세포를 Th17 분화 조건 하에서 iPS-MSC와 공조배양하여 Th17세포 또는 Treg 세포의 비율을 분석한 그래프이다.

도 4a, 및 도 4b에 나타낸 바와 같이, iPS-MSC와 RA-SFMC의 공조배양은, iPS-MSC가 없이 RA-SFMC만을 배양한 대조군에 비해, 염증성 사이토카인인 IL-17의 생성이 Th17 분화 조건으로 자극하지 않았을 때와 유사한 수준으로 감소하였으며, 반면에 Treg의 CD25+Foxp3+ 발현은 3배 이상 증가하였다. 즉, iPS-MSC를 처리한 경우, IL17 양성 세포의 수는 Th17 분화 조건 처리를 하지 않은 경우와 유사하였으며, Treg 세포의 비율은 급격히 증가하여, 류마티스 환자에 대한 우수한 면역조절 효과를 암시한다.

따라서 정상인 유래의 iPS-MSC가 실제 류마티스 관절염 환의 병인세포인 SFMC에 대해서도 면역조절능을 가진다는 사실을 확인할 수 있으며, 류마티스 관절염 질환에 대한 치료 효과를 환자 세포 수준에서 확인하였다.

실시예 5: iPS-MSC의 류마티스 관절염의 항염효능 평가

본 발명의 iPS-MSC가 골수 유래 MSC(BM-MSC)에 비해 류마티스 관절염의 염증 제어 효과가 우수한 지 확인하기 위해 염증성 사이토카인 IL-17과 항염증성 사이토카인 IL-10의 비율을 조사하였다.

구체적으로, 실시예 4-1과 동일한 방법으로 류마티스 관절염 환자로부터 활액을 얻어 단핵세포를 분리하였다. 상기 분리한 단핵 세포를 iPS-MSC 또는 BM-MSC와 함께 공조배양하고, 실시예 3의 ELISA와 실질적으로 동일한 방법으로 ELISA 분석을 수행하여 세포 내 사이토카인의 함량을 측정하고, 그 결과를 도 5 및 표 2에 나타내었다.

구분	미처리	BM-MSC 및 Th17 조건	iPS-MSC 및 Th17 조건
IL-17/IL-10	2.3±1.0	1.6±0.6 (p=0.08 vs Th17)	0.5±0.2 (p=0.02 vs Th17)

도 5는 류마티스 관절염 환자로부터 분리한 활액세포와 BM-MSC 또는 iPS-MSC를 Th17분화조건 하에서 공조배양하여 염증반응에 관여하는 IL-17 및 IL-10의 양을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 5에 나타낸 바와 같이, iPS-MSC에서 염증성 사이토카인인 IL-17의 양이 현저히 감소하고, 항염증성 사이토카인인 IL-10의 양이 BM-MSC 대비 현저히 증가하여 본 발명의 iPS-MSC가 BM-MSC에 비해 우수한 항염증 효과를 나타냄을 확인할 수 있다.

상기 표 2에 결과로부터, 류마티스 관절염 환자의 병인세포인 SFMC와 공조배양한 유도줄기세포 (iPS-MSC) 배양액에서 염증성 사이토카인과 항염증성 사이토카인의 비율을 비교하였을 때, IL-17/IL-10 (p<0.05 vs Th17 condition), IL-2/IL-10 (p<0.01 vs Th17 condition)의 비율이 통계적으로 유의하게 감소되어 있으며, 그러나 골수유래 줄기세포 (BM-MSC)는 IL-17/IL-10 (p>0.05 vs Th17 condition) ratio 값이 통계적으로 유의하게 감소시키지 못하였다.

Claims (10)

1. 면역 조절능이 향상된 역분화 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(iPS-MSC), 또는 상기 iPS-MSC의 배양물을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
   상기 iPS-MSC의 면역 조절능은, iPS-MSC의 염증성 지수가, 조직으로부터 직접 분리된 중간엽줄기세포의 염증성 지수 100%을 기준으로 40%이하로 표시되며, 상기 염증성 지수는 항염증성 사이토카인의 발현량 (pg/ml)에 대한 염증성 사이토카인 발현량(pg/ml)의 비율로 표시되며,
   상기 염증성 사이토카인은 TNF-a(Tumor necrosis factor alpha), IL-6, IL-8, 및 IL-17로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상인 것이고, 상기 항염증성 사이토카인은 IL-10인 것이며,
   상기 염증성 질환은 류마티스 관절염인, 조성물.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 염증성 사이토카인이 IL-6이고, 상기 항염증성 사이토카인이 IL-10일 때, iPS-MSC의 염증성 지수가 조직에서 직접 분리된 MSC의 염증성 지수 100%를 기준으로 0.3% 이하인, 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 염증성 사이토카인이 IL-8이고, 상기 항염증성 사이토카인이 IL-10일 때, iPS-MSC의 염증성 지수가 조직에서 직접 분리된 MSC의 염증성 지수 100%를 기준으로 30% 이하인, 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 iPS-MSC는 Th17 세포의 증식을 억제하는 것인, 약학 조성물.
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 제1항에 있어서, 상기 iPS-MSC는 정상 개체로부터 분리된 세포에서 유래한 것인, 조성물.
10. 제1항에 있어서, 상기 조직으로부터 직접 분리된 중간엽 줄기 세포는 제대 유래 중간엽 줄기 세포, 제대혈 유래 중간엽 줄기 세포, 골수 유래 중간엽 줄기 세포, 지방 유래 중간엽 줄기 세포, 근육 유래 중간엽 줄기 세포, 신경 유래 중간엽 줄기 세포, 피부 유래 중간엽 줄기 세포, 양막 유래 중간엽 줄기 세포, 및 태반 유래 중간엽 줄기 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 조성물.
    

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