CN103379921A

CN103379921A - 使用羊膜来源的贴壁细胞治疗脊髓损伤和外伤性脑损伤

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Publication number: CN103379921A
Application number: CN2011800680828A
Authority: CN
Inventors: 斯图尔特·阿博特; 詹姆士·W·爱丁格; 亚历山大·弗兰茨基; 弗拉基米尔·扬科维奇; 亚历山大·卡普鲁诺维斯基; 克利斯登·拉巴左; 埃里克·劳; 毕涛·梁; 罗伯特·J·哈黎里
Original assignee: Anthrogenesis Corp
Current assignee: Clarity Acquisition II LLC
Priority date: 2010-12-17
Filing date: 2011-12-15
Publication date: 2013-10-30
Also published as: CA2821811A1; KR20140003473A; EP2651452A4; JP2014507389A; AU2011343738A1; US20120201787A1; EP2651452A1; MX2013006592A; WO2012083023A1

Abstract

本发明提供使用来自羊膜的细胞及其细胞群，在此称为“羊膜来源的贴壁细胞”（“AMDAC”），治疗脊髓和外伤性脑损伤的方法。

Description

使用羊膜来源的贴壁细胞治疗脊髓损伤和外伤性脑损伤

本申请要求2010年12月17日提出的美国临时申请第61/424,596号的优先权，其公开内容在此全文引入作为参考。

1.技术领域

本发明提供，使用来自羊膜和这样的细胞的及其细胞群处理脊髓和外伤性脑损伤，在此称为“羊膜来源的贴壁细胞”（AMDAC”）。

2.背景

中枢神经系统（CNS）损伤代表一个重要的医学问题。居住在美国的大约300,000人患有脊髓损伤（SCI），并且每年大约10,000-14,000个新增SCI病例被诊断。SCI通常导致脊柱创伤，例如由于骨或者盘移位压迫脊髓的结果。发生SCI可能没有明显椎骨折，例如，由于供应脊髓的血液损失和脊柱断裂而没有脊髓损伤。

外伤性脑损伤（TBI）是全世界青年人中残疾和死亡的主要原因之一。例如，在军事形势下，大脑损伤例如由直接碰撞、穿透物体（例如子弹和弹片）、和由爆炸引起的冲击波造成。

3.概述

本发明提供一种治疗患有CNS（例如，脊髓损伤或者外伤性脑损伤）的个体的方法，包括给患有CNS损伤的个体施用单或多剂量的羊膜来源的贴壁细胞（“AMDAC”）。

一方面，本发明提供一种治疗患有或者遭受与脊髓损伤（SCI）有关的症状或者病况或者症候群的个体的方法，包括向所述的个体施用治疗有效量的AMDAC或者AMDAC条件培养基，其中治疗有效量是足以引起所述的脊髓损伤的一种或多种症状可检测的改善，或者减轻其一种或多种症状进展的数量。

在一些实施方式中，在损伤1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、13、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50天或者更多天以内，或者在CNS损伤之后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更多年以内向所述的个体施用治疗有效量的AMDAC或者AMDAC条件培养基。

在一个具体的实施方式中，CNS损伤是脊髓损伤（SCI）。在一些实施方式中，脊髓损伤直接由创伤引起。在一些实施方式中，脊髓损伤由骨碎片或者盘材料压迫引起。在一些实施方式中，脊髓损伤发生在颈椎、胸椎、腰椎、或者骶椎的一处或多处。在一些实施方式中，脊髓损伤是对颈髓、胸髓、腰髓、脊髓圆锥、枕骨部的一种或多种，或者马尾的一束或多束神经损伤。

在一些实施方式中，本发明提供治疗与CNS损伤相关的疾病、障碍或者病况的方法。在一些实施方式中，与CNS损伤相关的疾病、障碍或者病况是由脊髓损伤导致的脊髓休克。在一些实施方式中，与CNS损伤相关的疾病、障碍或者病况是由脊髓损伤导致的神经性休克。在一些实施方式中，与CNS损伤相关的疾病、障碍或者病况是由脊髓损伤导致的自主神经反射异常。在一些实施方式中，与CNS损伤相关的疾病、障碍或者病况是由脊髓损伤导致的水肿。在一些实施方式中，与CNS损伤相关的疾病、障碍或者病况选自由中央脊髓综合征、布朗-塞卡尔综合征、前脊髓综合征、脊髓圆锥综合症和马尾综合症。

在一些实施方式中，施用的治疗有效量的AMDAC或者AMDAC条件培养基是以足以引起脊髓损伤的一种或多种下列症状可检测的改善或者进展减缓的数量：在脊髓的颈、胸、腰或者骶节段的运动功能、感觉功能或者运动和感觉功能的丧失或损伤。在一些实施方式中，脊髓损伤的一种或者多种症状包括：手臂，躯干，腿或者盆腔内器官的运动功能、感觉功能或者运动和感觉功能的丧失或损伤。在一些实施方式中，脊髓损伤的一种或者多种症状包括C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8、T9、T10、T11、T12、L1、L2、L3、L4或者L5的一个或多个皮区麻木。

在本发明提供的治疗SCI的一些实施方式中，所述方法还包括向所述的个体施用第二治疗剂。在一些实施方式中，所述的第二治疗剂是皮质类固醇，神经保护剂，免疫调节剂或者免疫抑制剂剂，或者抗凝血剂。

在本发明提供的治疗方法的另一个具体实施方式中，与CNS损伤相关的疾病、障碍或者病况是外伤性脑损伤。在一些实施方式中，外伤性脑损伤是对额叶，顶叶，枕叶，颞叶，脑干或者小脑的损伤。在一些实施方式中，外伤性脑损伤是轻度外伤性脑损伤。在一些实施方式中，外伤性脑损伤是中度到重度外伤性脑损伤。

在一些实施方式中，施用的治疗有效量的AMDAC或者AMDAC条件培养基是足以引起轻度外伤性脑损伤的一种或多种下列症状可检测的改善或者进展减缓的数量：头痛，记忆问题，思考困难，记忆问题，注意力障碍，情绪波动和挫折，疲劳，视力障碍，失忆，注意力分散，睡眠障碍，头晕/失去平衡，易怒，情绪困扰，感情抑郁，癫痫，恶心，嗅觉丧失，光和声音敏感，情绪易变、迷失或者混乱，或者思维缓慢。

在一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC，或者给药的AMDAC条件培养基是足以引起一个可检测的进展的改善或者进展的减缓的数量，一种或多种对严重的外伤性脑损伤适度的下列症状：注意力困难，注意力集中困难，注意力分散，记忆困难，行动迟缓，意识模糊，持续言语，冲动，语言处理障碍，言语和语言障碍，不理解所讲的话（感觉性失语症），讲话困难和困难理解（表达性失语症），言语不清，说话非常快的或非常缓慢，阅读障碍，和书写障碍，对触觉、温度、运动、肢体位置和细微区别的解释困难，困难将感官印象整合或者模拟成心理意义的数据，部分或者完全丧失视力，眼部肌无力和重影（复视），视觉模糊，判断距离障碍，无意识眼球运动（眼球振颤），畏光（恐光症），听力减弱或丧失，耳鸣（tinnitus），声音敏感性增加，嗅觉丧失或减弱（嗅觉缺失），味觉丧失或减弱，癫痫，与癫痫相关的惊厥，身体麻痹/痉挛，慢性疼痛，大和/或小便失禁，睡眠障碍，失去耐力，胃口变化，体温调节异常，月经障碍，社会情感障碍，依赖行为，缺乏感情能力，缺乏动力，易怒，攻击性，抑郁，去抑制，或者缺乏意识。

在本发明提供的治疗TBI的一些实施方式中，所述方法还包括向所述的个体施用第二治疗剂。在一些实施方式中，所述的第二治疗剂是抗癫痫药，抗抑郁剂，金刚烷胺，哌醋甲酯，溴隐亭，卡马西平或者阿米替林。

在本发明提供的治疗CNS损伤（例如，脊髓损伤或者外伤性脑损伤）的一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC或者AMDAC条件培养基通过选自由下列的途径向所述的个体施用：静脉内、动脉内、腹腔内、脑室内、胸骨内、颅内、肌肉内、滑膜内、眼内、玻璃体内、脑内、侧脑室内、鞘内、骨髓输液、膀胱内、透皮、脑池内、硬膜外、腰椎穿刺、小脑延髓池或者皮下给药。在一些实施方式中，其中治疗有效量的AMDAC或者AMDAC条件培养基直接施用到所述个体的损伤部位。

在一个具体实施方式中，根据本发明所述的方法治疗的TBI由非缺血性事件导致或者引起。在另一个具体实施方式中，根据本发明所述的方法治疗的TBI不是血肿或者不由血肿导致。在另一个具体实施方式中，根据本发明所述的方法治疗的TBI不是在头颅上由外力引起的血肿。在另一个具体实施方式中，根据本发明所述的方法治疗的TBI不是由遭受TBI的个体的大脑内或者大脑周围的血流中断引起。

在某些实施方式中，本发明提供抑制个体中CNS损伤（例如，脊髓损伤或者外伤性脑损伤）的促炎性反应的方法，包括使与CNS损伤有关或者作为其部分的T细胞（例如，CD4⁺T淋巴细胞或白细胞）与AMDAC（例如，本发明所述的AMDAC）接触。在一个具体实施方式中，炎性反应是Th1反应或者Th17反应。在一个具体实施方式中，所述接触可检测地降低Th1细胞成熟。在所述方法的具体实施方式中，所述接触可检测地降低由所述T细胞产生一种或多种白介素-1β（IL-1β）、IL-12、IL-17、IL-21、IL-23、肿瘤坏死因子α（TNFα）和/或γ干扰素（IFNγ）。在所述方法的另一个具体实施方式中，所述的接触增强或者上调调节T细胞（Treg）表现型。在另一个具体实施方式中，所述的接触下调树突细胞（DC）和/或巨噬细胞表达标记物（例如，CD80、CD83、CD86、ICAM-1、HLA-II），所述的标记物促进Th1和/或Th17免疫反应。在一个具体实施方式中，所述的T细胞也与IL-10接触，例如外源IL-10或者不由T细胞产生的IL-10（例如，重组IL-10）。在另一个实施方式中，本发明提供降低巨噬细胞产生促炎症因子的方法，包括使巨噬细胞与有效量的AMDAC接触。在另一个实施方式中，本发明提供上调耐受性细胞和/或细胞因子（例如从巨噬细胞产生）的方法，包括使免疫系统细胞与有效量的AMDAC接触。在一具体实施方式中，与活化巨噬细胞不接触所述的AMDAC相比，所述的接触导致活化巨噬细胞可检测地产生更多的IL-10。在另一个实施方式中，本发明提供上调抗炎T细胞或者增加其数量的方法，包括使免疫系统细胞与有效量的AMDAC接触。

在一个实施方式中，本发明提供一种抑制个体中CNS损伤相关的Th1反应的方法，包括向所述的个体施用有效量的AMDAC，其中所述的有效量是导致个体中CNS损伤相关的Th1反应发生可检测的减少的数量。在另一个实施方式中，本发明提供抑制个体中CNS损伤相关的Th17反应的方法，包括向所述的个体施用有效量的AMDAC，其中所述的有效量是导致个体中Th17反应发生可检测的减少的量。在这些方法的具体实施方式中，所述的给药可检测地降低通过所述个体中的T细胞或者抗原呈递细胞（例如，DC、巨噬细胞或单核细胞）产生淋巴毒素-1α（LT-1α）、IL-1β、IL-12、IL-17、IL-21、IL-23、TNFα和/或IFNγ的一种或多种。在所述方法的另一个具体实施方式中，所述的接触增强或者上调调节T细胞（Treg）。在另一个实施方式中，所述的接触调节（例如，降低）个体中树突细胞（DC）和/或巨噬细胞产生标记物，所述的标记物促进Th1或者Th17反应（例如，CD80、CD83、CD86、ICAM-1、HLA-II）。在另一个具体实施方式中，所述方法包括对所述的个体另外施用IL-10。

另一方面，本发明提供AMDAC，如本发明所述，所述的AMDAC已经基因改造成表达一种或多种抗炎细胞因子。在一个具体实施方式中，所述的抗炎细胞因子包括IL-10。

本发明所述的AMDAC可通过细胞和遗传标记物的不同组合鉴定。在一个具体实施方式中，例如，AMDAC通过逆转录酶聚合酶链式反应（RT-PCR）测定是OCT-4^–。在另一个实施方式中，AMDAC经测定流式细胞术测定是CD49f⁺。在又一个实施方式中，AMDAC经RT-PCR和流式细胞术测定分别是OCT-4^–和CD49f⁺。在另一个实施方式中，AMDAC经免疫定位（例如，流式细胞术）测定是CD49f⁺、CD105⁺和CD200⁺。在另一个实施方式中，AMDAC经RT-PCR测定是OCT-4^–和经免疫定位（例如，流式细胞术）测定是CD49f⁺、CD105⁺和CD200⁺。在另一个具体实施方式中，所述的AMDAC经免疫定位（例如，流式细胞术）测定对于VEGFR1/Flt-1（血管内皮生长因子受体1）和/或CD309（也称为血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）/KDR）阳性。在另一个具体实施方式中，所述的AMDAC经流式细胞术测定是CD90⁺和CD117^–，和/或经RT-PCR测定是HLA-G^–。在另一个具体实施方式中，所述的AMDAC经RT-PCR测定是OCT-4^–和HLA-G^–，并且经流式细胞术测定是CD49f⁺、CD90⁺、CD105⁺，和CD117^－。在另一个具体实施方式中，任何上述的AMDAC经免疫定位（例如，流式细胞术）测定还是CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD98⁺、Tie-2⁺（促血管生成素受体）、TEM-7⁺（肿瘤内皮标记物7）、CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–、CD143^–、CD146^–，或CXCR4^–（趋化因子（C-X-C模序）受体4）的一种或多种。在另一个具体实施方式中，任何上述的AMDAC经免疫定位（例如，流式细胞术）测定另外还是CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD98⁺、Tie-2⁺、TEM-7⁺、CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–、CD143^–、CD146^–和CXCR4^–。

在另一个具体实施方式中，AMDAC经短期神经分化法（参见，例如，下文第5.12.1节）测定是GFAP⁺。在另一个具体实施方式中，AMDAC短期神经分化法（参见，例如，下文第5.12.1节）测定是β-微管蛋白III（Tuj1）⁺。在另一个具体实施方式中，AMDAC是OCT-4^–、GFAP⁺和β-微管蛋白III（Tuj1）⁺。在另一个具体实施方式中，本发明所述的AMDAC是CD200⁺、CD105⁺、CD90⁺和CD73⁺。在另一个具体实施方式中，本发明所述的AMDAC是CD117^–并且没有使用CD117抗体选择。在另一个具体实施方式中，本发明所述的AMDAC是CD146^–并且没有使用CD146抗体选择。在另一个具体实施方式中，本发明所述的AMDAC经RT-PCR和/或免疫定位（例如，流式细胞术）测定是OCT-4^–并且在VEGF诱导下不表达CD34。在另一个具体实施方式中，本发明所述的AMDAC经短期神经分化法测定（参见，例如下文第5.12.1节）是神经原的。在另一个具体实施方式中，本发明所述的AMDAC过体外软骨潜能分析测定（参见，例如下文第5.12.3节）是非软骨形成的。在另一个具体实施方式中，本发明所述的AMDAC通过成骨表型分析法测定是非成骨性的（参见，例如下文第5.12.2节）。在另一个具体实施方式中，本发明所述的AMDAC在培养长达6周后（例如，2周、4周或者6周）是非成骨性，所述培养在DMEM中在pH值7.4（高糖）中进行，随时补充100nM地塞米松，10mMβ-甘油磷酸酯，50μML-抗坏血酸-2-磷酸酯，其中骨生成使用冯库萨染色法、茜素红染色法，或者通过例如RT-PCR检测骨桥蛋白、骨钙蛋白、骨粘连蛋白和/或骨唾液蛋白的存在进行评价。

在另一个具体实施方式中，任何上述的AMDAC另外还：（a）经免疫定位（例如，流式细胞术）测定表达CD9、CD10、CD44、CD54、CD98、CD200、Tie-2、TEM-7、VEGFR1/Flt-1或者VEGFR2/KDR（CD309）的一种或多种；（b）经免疫定位（例如，流式细胞术）测定不表达CD31、CD34、CD38、CD45、CD133、CD143、CD144、CD146、CD271、CXCR4、HLA-G或VE-钙粘蛋白的一种或多种；（c）经RT-PCR测定不表达SOX2；（d）表达以下一种或多种mRNA：ACTA2、ADAMTS1、AMOT、ANG、ANGPT1、ANGPT2、ANGPTL1、ANGPTL2、ANGPTL4、BAI1、c-myc、CD44、CD140a、CD140b、CD200、CD202b、CD304、CD309、CEACAM1、CHGA、COL15A1、COL18A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、连接蛋白-3、CSF3、CTGF、CXCL12、CXCL2、DNMT3B、ECGF1、EDG1、EDIL3、ENPP2、EPHB2、FBLN5、F2、FGF1、FGF2、FIGF、FLT4、FN1、FST、FOXC2、半乳糖凝集素-1、GRN、HGF、HEY1、HSPG2、IFNB1、IL8、IL12A、ITGA4、ITGAV、ITGB3、KLF-4、MDK、MMP2、MYOZ2、NRP2、PDGFB、PF4、PGK1、PROX1、PTN、SEMA3F、SERPINB5、SERPINC1、SERPINF1、TGFA、TGFB1、THBS1、THBS2、TIE1、TIMP2、TIMP3、TNF、TNNC1、TNNT2、TNFSF15、VASH1、VEGF、VEGFB、VEGFC或者VEGFR1/FLT1；（e）产生一种或多种蛋白质CD49d、连接蛋白-43、HLA-ABC、β2-小球蛋白、CD349、CD318、PDL1、CD106、半乳糖凝集素-1、ADAM17、血管紧张素原前体、细丝蛋白A、α-辅肌动蛋白1、巨蛋白、巨噬细胞乙酰化LDL受体I和II、辅肌动蛋白受体IIB型前体、Wnt-9蛋白质、胶质细胞原纤维酸性蛋白、星形细胞、肌球蛋白结合蛋白C，或者肌球蛋白重链、非肌肉A型；（f）分泌血管内皮细胞生长因子（VEGF）、肝细胞生长因子（HGF）、白介素-8（IL-8）、单核细胞趋化蛋白-3（MCP-3）、FGF2、卵泡抑素、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR或者半乳糖凝集素-1的一种或多种进入AMDAC生长的培养基；（g）与相同数量的骨髓来源的间质干细胞相比以更高的水平表达以下一种或多种微RNAs：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92或miR-296；（h）与相同数量的骨髓来源的间质干细胞相比以更低水平表达以下一种或多种微RNAs：miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b或者miR-16；（i）表达以下一种或多种miRNAs：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b或者miR-16；或者（j）与在21%O₂下培养时表达CD202b、IL-8或者VEGF相比，当在低于大约5%O₂中培养时表达增加水平的CD202b、IL-8或者VEGF的一种或多种。在一个更具体的实施方式中，所述的AMDAC经RT-PCR测定是OCT-4^–，并且经免疫定位（例如，流式细胞术）测定是CD49f⁺、HLA-G^–、CD90⁺、CD105⁺、CD117^–和CD200⁺。在另一个具体实施方式中，所述的AMDAC经RT-PCR测定是OCT-4^–，并且经免疫定位（例如，流式细胞术）测定是CD49f⁺、HLA-G^–、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–，并且其中所述的AMDAC另外还：（a）经免疫定位（例如，流式细胞术）测定表达CD9、CD10、CD44、CD54、CD98、CD200、Tie-2、TEM-7、VEGFR1/Flt-1或者VEGFR2/KDR（CD309）；（b）经免疫定位（例如，流式细胞术）测定不表达CD31、CD34、CD38、CD45、CD133、CD143、CD144、CD146、CD271、CXCR4、HLA-G和VE-钙粘蛋白；（c）经RT-PCR测定不表达SOX2；（d）经RT-PCR测定表达以下mRNA：ACTA2、ADAMTS1、AMOT、ANG、ANGPT1、ANGPT2、ANGPTL1、ANGPTL2、ANGPTL4、BAI1、c-myc、CD44、CD140a、CD140b、CD200、CD202b、CD304、CD309、CEACAM1、CHGA、COL15A1、COL18A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、连接蛋白-3、CSF3、CTGF、CXCL12、CXCL2、DNMT3B、ECGF1、EDG1、EDIL3、ENPP2、EPHB2、FBLN5、F2、FGF1、FGF2、FIGF、FLT4、FN1、FST、FOXC2、半乳糖凝集素-1、GRN、HGF、HEY1、HSPG2、IFNB1、IL8、IL12A、ITGA4、ITGAV、ITGB3、KLF-4、MDK、MMP2、MYOZ2、NRP2、PDGFB、PF4、PGK1、PROX1、PTN、SEMA3F、SERPINB5、SERPINC1、SERPINF1、TGFA、TGFB1、THBS1、THBS2、TIE1、TIMP2、TIMP3、TNF、TNNC1、TNNT2、TNFSF15、VASH1、VEGF、VEGFB、VEGFC或者VEGFR1/FLT1；（e）产生蛋白质CD49d、连接蛋白-43、HLA-ABC、β2-小球蛋白、CD349、CD318、PDL1、CD106、半乳糖凝集素-1、ADAM17、血管紧张素原前体、细丝蛋白A、α-辅肌动蛋白1、巨蛋白、巨噬细胞乙酰化LDL受体I和II、辅肌动蛋白受体IIB型前体、Wnt-9蛋白质、胶质细胞原纤维酸性蛋白、星形细胞、肌球蛋白结合蛋白C，和/或肌球蛋白重链、非肌肉A型；（f）分泌VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、卵泡抑素、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR和半乳糖凝集素-1进入AMDAC生长的培养基；（g）与相同数量的骨髓来源的间质干细胞相比以更高的水平表达下列微RNAs：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92和miR-296；（h）与相同数量的骨髓来源的间质干细胞相比以更低水平表达下列微RNAs：miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b和miR-16；（i）表达下列miRNAs：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b和miR-16；或者（j）与在21%O₂下培养时表达CD202b、IL-8或者VEGF相比，当在低于大约5%O₂中培养时表达增加水平的CD202b、IL-8或者VEGF。

在其它实施方式中，例如，羊膜来源的贴壁细胞附着于组织培养塑料，并且经RT-PCR测定进行30个循环，例如与合适的对照细胞系对比，例如胚胎癌来源的干细胞系（例如，NTERA-2，例如，来自美国模式培养物保藏所，ATCC编号CRL-1973），所述细胞是OCT-4^–。在一个具体实施方式中，所述细胞经RT-PCR测定是OCT-4^–，并且经免疫定位（例如，流式细胞术）测定是VEGFR1/Flt-1⁺（血管内皮生长因子受体1）和/或VEGFR2/KDR⁺（血管内皮生长因子受体2，也称为激酶插入域受体）。在另一个具体实施方式中，所述细胞经RT-PCR测定是OCT-4^–，并且经免疫定位（例如，流式细胞术）测定是CD49f⁺（整合素-α6⁺）。在一个具体实施方式中，所述细胞经RT-PCR测定是OCT-4^–，并且经RT-PCR测定是HLA-G^–。在另一个具体实施方式中，所述细胞经RT-PCR测定是OCT-4^–，并且经免疫定位（例如，流式细胞术）测定是CD90⁺、CD105⁺、或者CD117^–。在一个更具体的实施方式中，所述的OCT-4^–细胞是CD90⁺、CD105⁺和CD117^–。在另一个具体实施方式中，例如通过RT-PCR进行30个循环测定，所述细胞是OCT-4^–，并且不表达SOX2。

在另一个实施方式中，所述的OCT-4^–细胞经免疫定位（例如，流式细胞术）测定为CD29⁺、CD73⁺、ABC-p⁺、和CD38^－的一种或多种。

在另一个具体实施方式中，经免疫定位（例如，流式细胞术）测定，所述的OCT-4^–羊膜来源的贴壁细胞还是一种或多种CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD98⁺、Tie-2⁺（促血管生成素受体），TEM-7⁺（肿瘤内皮标记物7），CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–、CD143^–（血管紧张素-I-转化酶，ACE），CD146^–（黑色素瘤细胞粘附分子），CXCR4^–（趋化因子（C-X-C模序）受体4）。在一个更具体的实施方式中，经免疫定位（例如，流式细胞术）测定，所述的羊膜来源的贴壁细胞是CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD98⁺、Tie-2⁺，TEM-7⁺、CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–、CD143^–、CD146^–、以及CXCR4^–。在另一个更具体的实施方式中，本发明提供的羊膜来源的贴壁细胞经RT-PCR测定是OCT-4^–；并且经免疫定位（例如，流式细胞术）测定是VEGFR1/Flt-1⁺和/或VEGFR2/KDR⁺；以及经免疫定位（例如，流式细胞术）测定是CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–和/或Tie-2^–的一种或多种或全部。在一个具体实施方式中，所述的羊膜来源的贴壁细胞在PCR扩增下，例如＞20个循环，例如20-30个循环，比具有等价细胞数量的NTERA-2细胞少表达至少2log的OCT-4mRNA。在另一个具体实施方式中，经免疫定位（例如，流式细胞术）测定，所述的OCT-4^–细胞还是VE-钙粘蛋白^–（CD144^–）。在另一个具体实施方式中，经免疫定位（例如，流式细胞术）测定，所述的OCT-4^–细胞还是CD105⁺和CD200⁺阳性。在另一个具体实施方式中，例如，经免疫定位（例如，流式细胞术）检测，在暴露于1到100ng/mL VEGF（血管内皮细胞生长因子）4到21天之后，所述的OCT-4^–细胞不表达CD34。

在另一个实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞附着于组织培养塑料，并且经RT-PCR测定是OCT-4^–和SOX-2^–。在又一个实施方式中，所述的细胞经流式细胞术测定是CD90⁺、CD105⁺和CD117^–。在一个具体实施方式中，经流式细胞术测定所述的OCT-4^–、SOX-2^–羊膜来源的贴壁细胞还是HLA-G^–或CD271^–。在一个更具体的实施方式中，经RT-PCR测定所述的细胞是OCT-4^–和SOX-2^–；并且经流式细胞术测定是CD90⁺、CD105⁺、CD117^–、CD271^–和HLA-G^–。

在任何上述AMDAC的另一实施方式中，除此之外，所述细胞附着于组织培养塑料，并且为VEGFR2/KDR⁺（CD309）阳性。

在另一实施方式中，本发明公开的羊膜来源的贴壁细胞附着于组织培养塑料，经RT-PCR测定，例如，>20个循环，例如20-30个循环，为OCT-4^–，并且经免疫定位（例如，流式细胞术）测定是VEGFR2/KDR⁺、CD9⁺、CD54⁺、CD105⁺、CD200⁺或VE-钙粘蛋白^–的一种或多种。在一个具体的实施方式中，经RT-PCR测定，例如，>20个循环，例如20-30个循环，所述细胞是OCT-4^–，并且经免疫定位（例如，流式细胞术）测定为VEGFR2/KDR⁺、CD9⁺、CD54⁺、CD105⁺、CD200⁺、和VE-钙粘蛋白^–。在另一个具体实施方式中，例如，经免疫定位（例如，流式细胞术）检测，在暴露于1到100ng/mL VEGF中4到21天之后，所述细胞不表达CD34。

在另一个实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞是OCT-4^–、CD49f⁺、HLA-G^–、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–。在一个更具体的实施方式中，经免疫定位（例如，流式细胞术）测定所述细胞CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD98⁺、Tie-2⁺、TEM-7⁺、CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–、CD143^–、CD146^–（黑色素瘤细胞粘附分子）或者CXCR4^–的一种或多种。在一个更具体的实施方式中，经免疫定位（例如，流式细胞术）测定，所述的细胞是CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD98⁺、Tie-2⁺、TEM-7⁺、CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–、CD143^–、CD146^–和CXCR4^–。在另一个具体实施方式中，所述细胞经免疫定位（例如，流式细胞术）测定是VEGFR1/Flt-1⁺和/或VEGFR2/KDR⁺；并且经免疫定位（例如，流式细胞术）测定是CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–和/或Tie-2⁺的一种或多种。在另一个具体实施方式中，经免疫定位（例如，流式细胞术）测定所述细胞还是VEGFR1/Flt-1⁺、VEGFR2/KDR⁺、CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–和Tie-2⁺。

在另一个实施方式中，RT-PCR例如30个循环测定本发明公开的羊膜来源的贴壁细胞不表达一种或多种下列mRNA：ANGPT4、ANGPTL3、BGLAP、CD31、CD34、CDH5、CXCL10、DLX5、FGF4、FLT3、HLA-G、IFNG、LECT1、LEP、MMP-13、NANOG、巢蛋白、PLG、POU5F1、PRL、PROK1、SOX2、TERT、TNMD，和/或XLKD1。在另一个实施方式中，经流式细胞术测定，羊膜来源的贴壁细胞不组成性表达恒定链、HLA-DR-DP-DQ、CD6或者CD271中的一种或多种，即，羊膜来源的贴壁细胞在正常的、不经刺激的条件下一般不表达这些标记物。

在一个具体实施方式中，经RT-PCR和/或端粒重复扩增法（TRAP）测定，本发明所述的AMDAC是端粒酶^–。在另一个具体实施方式中，RT-PCR例如30个循环测定本发明所述的AMDAC不表达端粒酶逆转录酶（TERT）的mRNA。在另一个具体实施方式中，本发明所述的AMDAC经RT-PCR测量是NANOG^–。在另一个具体实施方式中，RT-PCR例如30个循环测定本发明所述的AMDAC不表达NANOG的mRNA。在一个具体实施方式中，本发明所述的AMDAC是（性别决定区Y）-box2（SOX2）^–。在另一个具体实施方式中，RT-PCR例如30个循环测定本发明所述的AMDAC不表达SOX2的mRNA。

本发明更进一步提供分离的细胞群，所述细胞群包括羊膜来源的贴壁细胞，其中所述细胞群在本发明公开的治疗方法中是治疗有效的。所述细胞群可包括如本发明公开的任何羊膜来源的贴壁细胞，其通过标记物的任意组合进行描述。在具体的实施方式中，在所述的群中至少大约50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或者99%的细胞是这种羊膜来源的贴壁细胞。在其它具体实施方式中，在包括羊膜来源的贴壁细胞的分离的细胞群中至少25%、35%、45%、50%、60%、75%、85%或更多的细胞不是OCT-4⁺。

在某些实施方式中，本发明提供的治疗方法还包括向所述的个体施用第二类细胞。在具体的实施方式中，分离的羊膜来源的贴壁细胞群另外还包括第二类细胞，例如，干细胞或者祖细胞。在具体的实施方式中，本发明公开的AMDAC包括所述群中至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、80%、85%、90%、95%或者98%的细胞。在其它具体实施方式中，在包括羊膜来源的贴壁细胞和第二类细胞的细胞群中至少25%、35%、45%、50%、60%、75%、85%或更多细胞不是OCT-4⁺。在一个具体实施方式中，第二类细胞包含在胎盘血、脐血、天然骨髓或者其它组织中或者从中分离。在一个更具体的实施方式中，所述的第二类细胞是胚胎干细胞，从外围血分离的干细胞，从胎盘血分离的干细胞，从胎盘灌注液分离的干细胞，从胎盘组织分离的干细胞，从脐血分离的干细胞，脐带血干细胞（例如，来自脐带基质或者华尔通胶的干细胞），骨髓来源的间质干细胞，间充质干细胞，造血干细胞或者祖细胞，例如，CD34⁺细胞，成体干细胞，脂肪干细胞，诱导多能干细胞，等等。在另一个更具体的实施方式中，所述的第二类细胞包括所述群中至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或者50%的细胞。

在另一个具体实施方式中，任何上述的AMDAC或者第二类细胞被或者已经被培养增殖。在另一个具体实施方式中，任何上述的细胞都来自所述的细胞培养物，其已被传代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次或者更多。在另一个具体实施方式中，任何上述的细胞都来自培养物，其在培养物中倍增至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或至少50次，或更多。

在其它实施方式中，本发明公开的治疗方法包括给受影响的个体以组合物形式（例如药物组合物）施用AMDAC。在具体的实施方式中，所述组合物是基质或者支架，例如天然的组织基质或者支架，例如，永久或者可降解的脱细胞组织基质或者支架；或者合成基质或者支架。在一个更具体的实施方式中，所述的基质或者支架形成珠、管形式或者其它三维形式的形状。在另一个更具体的实施方式中，所述的基质是脱细胞的组织基质。在另一个具体实施方式中，所述组合物包括一种或多种本发明提供的分离的羊膜来源的贴壁细胞，或者包括羊膜来源的贴壁细胞的细胞群，其溶于生理学可接受的溶液中，例如，盐溶液，培养基等等。

在本发明提供的治疗方法的另一个具体实施方式中，所述细胞通过注射向所述个体给药。在另一个具体实施方式中，所述细胞通过静脉内输注向所述的个体给药。在该治疗方法的另一个具体实施方式中，所述细胞通过植入所述个体向所述个体施用如上所述的包括羊膜来源的贴壁细胞的基质或者支架。

本发明提供的分离的羊膜来源的贴壁细胞和细胞群不是诸如描述于美国专利号7,255,879或美国专利申请公开号2007/0275362的分离的胎盘干细胞或细胞群。本发明提供的分离的羊膜来源的贴壁细胞也不是内皮祖细胞、羊膜上皮细胞、滋养层、滋养层细胞、胚胎生殖细胞、胚胎干细胞、从胚胎内细胞团获得的细胞、或从胚胎性腺嵴获得的细胞。

本发明使用的术语“大约”表示例如在所述数字或数值的10％以内。

本发明使用的术语“干细胞”定义了任何给定细胞群的功能属性，其能够大量增殖，例如，可达大约40次群倍增数，但不必无限增殖，并且能分化（例如体外分化）成多种细胞类型。

本发明使用的术语“祖细胞”定义了任何给定细胞群的功能属性，其能够大量增殖，例如，可达大约40次群倍增数，但不必无限增殖，并且能分化（例如体外分化）成有限的细胞类型，其与干细胞相比一般更有限。

本发明使用的术语“来源的（derived）”表示从中分离的或用其它方式纯化的。例如，羊膜来源的贴壁细胞分离自羊膜。术语“来源的”涵盖了培养于直接从组织（例如羊膜）中分离的细胞，以及培养或扩增自初级分离物的细胞。

本发明使用的“免疫定位”表示在例如流式细胞术、荧光激活细胞分选、磁性细胞分选、原位杂交、免疫组织化学等方法中使用免疫蛋白（例如抗体或其片段）对化合物（例如细胞标记物）进行检测。

本发明使用的术语“分离的细胞”表示基本上与例如该细胞从中来源的羊膜的其它细胞或者组织分离的细胞。在例如收集和/或培养细胞期间，如果干细胞与之天然关联的细胞至少大约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或至少99％被从所述细胞中去除，则该细胞是“分离的”。

本发明使用的术语“分离的细胞群”表示基本上与例如该细胞群从中来源的羊膜或胎盘的其它细胞或组织分离的细胞群。在例如收集和/或培养羊膜来源的贴壁细胞期间，如果所述细胞群与之天然关联的细胞或者所述细胞群从中来源的细胞至少大约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或至少99％被从该细胞群中去除，则认为该细胞群是“分离的”。

当一种特殊标记物例如通过免疫定位，例如通过流式细胞术，或者例如通过RT-PCR可从背景中检出时，则细胞对于该特殊标记物是“阳性的”。例如，如果在细胞上可检测出CD105明显高于背景的量（相对于，例如同型对照），则该细胞被描述为对于CD105是阳性的。在例如抗体-介导检测的情形下，“阳性的”作为特定的细胞表面标记物存在的一种暗示，意为该标记物可用抗体检测，例如，标记物特异性的荧光标记物的抗体；“阳性的”还表示细胞携带该标记物，其含量可以在例如细胞计数器中产生信号，其能够在背景中检测到。例如，细胞是“CD105⁺”，则其中细胞被可检测地标记物了CD105特异性抗体，并且来自抗体的信号可检测地高于对照（例如，背景）。相反，在相同语境下，“阴性的”意为相对于背景而言细胞表面标记物使用其特异性抗体无法检测。例如，细胞是“CD34^–”，则其中细胞没有被CD34特异性抗体可检测地标记物。除非本发明另有说明，否则分化抗原簇（“CD”）标记物均使用抗体进行检测。例如，如果OCT-4的mRNA可使用例如30个循环的RT-PCR进行检测，则可以确定存在OCT-4，且细胞是OCT-4⁺。

4.附图的简要说明

图1显示了羊膜来源的贴壁细胞和NTERA-2细胞的干细胞相关基因表达。

图2显示了羊膜来源的贴壁细胞（AMDAC）的细胞表面的TEM-7表达。

图3A-3D显示了羊膜来源的贴壁细胞对选定的血管生成蛋白质的分泌。图3A：通过传代6次的AMDAC（n=3）的金属蛋白酶-1（TIMP-1）、TIMP-2、血小板生成素、血管内皮细胞生长因子（VEGF）和VEGF D的组织抑制剂的分泌。图3B：通过传代6次的AMDAC（n=3）的血管生成素、内皮生长因子（EGF）、上皮嗜中性激活肽78（ENA-78）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）以及生长调节的致癌基因α（GRO）的分泌。图3C：通过传代6次的AMDAC（n=3）的γ-干扰素（IFNγ）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、白介素6（IL-6）、IL-8和瘦素的分泌。图3D：通过传代6次的AMDAC（n=3）的单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、血小板源生长因子（PDGF）－BB、胎盘生长因子（P1GF）、RANTES和转化生长因子β（TGF-β）的分泌。

图4阐明了AMDAC在体外抑制T细胞增殖的能力。NHDF：人类新生儿皮肤成纤维细胞。AMDAC、NHDF左侧的条形图：与缺乏AMDAC或者NHDFs相比的CD4⁺T细胞抑制。AMDAC、NHDF右侧的条形图：与缺乏AMDAC或者NHDFs相比的CD8⁺T细胞抑制。Y轴：与缺乏AMDAC或者NHDFs时T细胞增殖相比由AMDAC或者NHDFs所致的抑制百分比。

图5阐明了AMDAC条件培养基诱导的对T细胞产生TNF-α的抑制作用。Y轴：与缺乏AMDAC或者NHDFs的情况下TNF-α的产生相比，大体积T细胞在AMDAC或者NHDFs存在下产生TNF-α的抑制百分比。

图6显示了AMDAC对Th1T细胞的抑制作用。培养皿T细胞基数：缺乏AMDAC的情况下的Th1T细胞百分比。100K、75K、50K、25K：分别在100,000、75,000、50,000和25,000的AMDAC存在下的Th1T细胞百分比。

图7显示了AMDAC以剂量依赖的方式对Th17T细胞的抑制作用。100K、80K、60K、40K：Th17T细胞（不存在AMDAC）在分别用100,000、80,000、60,000和40,000的AMDAC共培养之后保留的百分比。

图8显示了AMDAC对FoxP3Treg细胞的增加。基线：在缺乏AMDAC的情况下FoxP3Treg细胞占全部T细胞的百分比。100K、75K、50K、25K：分别在100,000、75,000、50,000和25,000的AMDAC存在下的FoxP3Treg细胞百分比。

图9A-9C描述了通过CD86和HLA-DR表达测试的DC群的流式细胞术结果。全部：SSC：侧向散射光栅。细胞类型：单独的树突细胞（DC），或者CD＋AMDAC。LPS＋IFN-γ：用细菌脂多糖和γ干扰素刺激（＋）或者不刺激（－）的细胞。图9A：用抗-CD86-藻红蛋白（PE）标记物的DC。图9B：用抗-HLA-DR-PerCP Cy5.5标记物的DC。图9C：用抗-IL-12-PE（Y-轴）和抗-CD11c-FITC标记物的DC。

图10描述了细菌脂多糖（LPS）诱导的树突细胞（DCs）对肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白介素12（IL-12）的产生的抑制作用。对于每种情况（IL-12或者TNF-α的产生），左列是在LPS和γ干扰素（IFN-γ）存在下由DCs产生细胞因子的量，并且右列是在LPS、IFN和AMDAC存在下由DCs产生细胞因子的量。“□－”表明DCs未经LPS或者IFN-γ诱导的条件。每种条件的右侧数值表明在每种条件下由DC产生IL-12或者IFN-γ的皮克数。

图11描述了AMDAC-介导的对自然杀伤细胞（NK）细胞增殖的抑制作用。X轴：用（左侧条形图）或者不用（右侧条形图）AMDAC的NK细胞前体的培养天数。Y轴：标明培养的每天的NK细胞数。

图12描述了AMDAC抑制NK细胞的细胞毒性。X轴：用NK细胞和K562细胞（人永生化骨髓性白血病细胞系）作为靶标共培养物中每孔的AMDAC数。Y轴：NK细胞毒性百分比，计算公式为：（1－样品中K562细胞总数÷不含NK细胞的对照中K562细胞总数）×100。

5.详细说明

5.1治疗CNS损伤的方法

本发明提供一种治疗患有CNS损伤（例如，脊髓损伤或者外伤性脑损伤）的个体的方法，包括给患有CNS损伤的个体施用单或多剂量的羊膜来源的贴壁细胞（“AMDAC”）。治疗这种个体的方法，以及AMDAC的施用方法，单独或者与其它疗法相结合，在下面详细讨论。

5.1.1脊髓损伤（SCI）的治疗

本发明提供治疗具有或者遭受脊髓损伤（SCI）相关的症状或者病况或者症候群的个体的方法，包括向所述的个体施用治疗有效量的AMDAC或者AMDAC条件培养基，其中治疗有效量是足以引起所述脊髓损伤的一种或多种症状的可检测到的改善，或者减缓其一种或多种症状的进展的数量。如本发明所使用的，“一种或多种症状”包括客观可测量的参数，例如炎症程度、免疫反应、与愈合过程相关的损伤部位的基因表达、损伤部位结痂的质量和程度、患者的运动和感觉功能的改善等等，以及主观可测量的参数，例如患者的幸福感、患者对运动和感觉功能改善的感受、对SCI相关的疼痛或者不舒服的减轻的感受等等。

脊髓损伤是对脊髓的一种损害，所述损害导致正常的运动、感觉、或者自主功能暂时或者永久的改变。SCI包括称为四肢瘫痪（以前称为四肢麻痹）和截瘫的病况。因此，在本发明提供的治疗SCI的方法的一些实施方式中，具有或者遭受脊髓损伤的症状或者其相关的病况或者症候群的个体是四肢瘫痪或者截瘫的患者。

四肢瘫痪是指对颈区脊髓的损伤，其特点在于脊髓的颈节段的运动和/或感觉功能由于该段椎管内神经元的损伤而损害或者丧失。四肢瘫痪导致手臂以及躯干、腿和盆腔内器官的功能损害。它不包括臂丛损害或者对椎管外的外周神经的损伤。

截瘫是指脊髓的胸部、腰部或者骶（而不是颈）节段的运动和/或感觉功能的损害或者丧失，椎管内神经元的继发性损害。由于截瘫，手臂功能是备用的，但是取决于损伤的水平，躯干、腿和盆腔内器官可能被包括在内。该术语用于指马尾和脊髓圆锥损伤，但不表示腰骶丛损害或者对椎管外的外周神经的伤害。

SCI的常见原因包括但不限于机动车事故、坠落、暴力、运动创伤、血管疾病、肿瘤、传染病况、椎关节强硬、医源性损伤（特别是脊椎注射和硬膜外导管植入后）、继发性骨质疏松椎骨骨折和发育障碍。

在某些实施方式中，脊髓损伤可能由例如钝力损伤、压迫、移位等导致。在某些实施方式中，脊髓被完全切断。在某些其它实施方式中，脊髓被损害但未完全切断，例如部分切断。在其它实施方式中，脊髓被压迫，例如，通过对脊柱骨格结构的损害，一个或多个椎骨与其它椎骨移位、炎症或者邻近组织肿胀，等等。

在一个实施方式中，脊髓损伤位于一个或多个颈椎。在另一个实施方式中，脊髓损伤位于一个或多个胸椎。在另一个实施方式中，脊髓损伤位于一个或多个腰椎。在另一个实施方式中，脊髓损伤位于一个或多个骶椎。在某些实施方式中，脊髓损伤在脊椎C1、C2、C3、C4、C5、C6或者C7；或者在脊椎T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8、T9、T10、T11或者T12；或者在脊椎L1、L2、L3、L4或者L5。在某些其它实施方式中，脊髓损伤是在C1和C2之间；在C2和C3之间；在C3和C4之间；在C4和C5之间；在C5和C6之间；在C6和C7之间；在C7和T1之间；在T1和T2之间；在T2和T3之间；在T3和T4之间；在T4和T5之间；在T5和T6之间；在T6和T7之间；在T7和T8之间；在T8和T9之间；在T9和T10之间；在T10和T11之间；在T11和T12之间；在T12和L1之间；在L1和L2之间；在L2和L3之间；在L3和L4之间；或者在L4和L5之间出脊柱的脊髓根。在某些实施方式中，所述损伤是在颈髓。在其它实施方式中，所述损伤是在胸髓。在其它实施方式中，所述脊髓损伤是在腰骶髓。在某些其它实施方式中，所述脊髓损伤是在脊髓圆锥。在某些其它实施方式中，所述CNS损伤是对马尾中一束或多束神经的损伤。在另一个实施方式中，所述脊髓损伤是在枕骨部。

在某些实施方式中，脊髓损伤的一种症状是一个或多个皮区（即，给定脊髓水平分布神经的一片皮肤）麻木。在具体的实施方式中，脊髓损伤的症状是一个或多个皮区C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8、T9、T10、T11、T12、L1、L2、L3、L4或者L5麻木。

脊髓休克是在损伤水平以下脊髓功能的生理（而不是解剖的）反射短暂性受抑制病况，伴随相关的所有感觉运动功能丧失。已观察到，由于儿茶酚胺的释放导致初始血压升高，随后低血压。观察到驰缓性麻痹，包括肠和膀胱，以及阴茎异常勃起持续发展。这些症状倾向于持续数小时到数天，直到损伤水平以下的反射弧重新开始发挥作用（例如，球海绵体肌反射、肌牵张反射[MSR]）。因此，在所述方法的具体实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起SCI导致的脊髓休克的一种或多种症状产生可检测的改善的数量，所述症状包括但不限于部分或者全部感觉运动功能丧失、高血压、低血压症、驰缓性麻痹（例如，肠和膀胱）以及阴茎异常勃起症。

神经性休克已被低血压症、心动过缓和体温降低三联体证明。休克倾向于更常发生在T6以上的损伤中，继发性T1－L2的交感神经流出道的中断和不受控制的迷走神经紧张，导致血管阻力减小，与血管扩张相关。神经性休克与脊柱和低血容量性休克不同，其倾向于与心动过速有关。因此，在治疗SCI的方法的一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起SCI导致的神经性休克的一种或多种症状发生可检测的改善的数量，所述症状包括但不限于低血压症、心动过缓、体温降低、血管阻力减小和血管扩张。

自主神经反射异常（AD）是大面积失衡反射交感神经放电的一种症状，其发生于SCI患者的内脏交感神经流出道（T5-T6）以上。AD发生在脊髓休克反射返回的阶段之后。在主要的内脏流出道以上受损伤的个体可能发展成AD。在损伤以下，完整的外围感觉神经传送神经冲动，在脊髓丘脑和后柱上传刺激位于脊髓中间外侧灰质的交感神经元。在SCI以上来自大脑血管运动中枢的受抑制的流出道增加，但不能通过SCI的阻断以下。这种大量的交感流出道引起释放各种神经递质（去甲肾上腺素、多巴胺-b-羟化酶、多巴胺），引起竖毛，皮肤苍白，和严重的动脉血管收缩。后果是在损伤水平以上的血压和血管舒张突然升高。患者通常具有由疼痛敏感的脑血管舒张引起的头痛。因此，在治疗SCI的方法的一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起由SCI导致的自主神经反射异常的一种或多种症状的可检测地改善的数量，包括但不限于在受损伤水平以上的竖毛，皮肤苍白，严重的动脉血管收缩，血压升高和血管舒张。

在治疗SCI的方法的一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起由SCI导致的水肿的一种或多种症状可检测地改善的数量。在这种方法的一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起由直接创伤的破坏引起的SCI的一种或多种症状可检测地改善的数量。在这种方法的一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起由骨碎片压迫引起的SCI的一种或多种症状可检测地改善的数量。在这种方法的一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起由盘材料压迫引起的SCI的一种或多种症状可检测地改善的数量。

本发明提供的治疗SCI的方法也提供治疗具有或者遭受其它类型SCI的症状或者其有关的病况或者症候群的个体，包括但不限于中央脊髓综合征、布朗-塞卡尔综合征、前脊髓综合征、脊髓圆锥综合症和马尾综合症。

中央脊髓综合征经常与颈部损伤有关并且导致上肢比下肢更弱，伴随骶神经感觉备用。因此，在治疗SCI的方法的具体实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起中央脊髓综合征的一种或多种症状可检测地改善的数量，包括但不限于上肢比下肢更弱，伴随骶神经感觉备用。

布朗-塞卡尔综合征经常与脊髓半切术损害有关，引起相对较大的同侧本体感觉和运动损伤，伴随对侧的痛觉和温度敏感性的丧失。因此，在治疗SCI的方法的具体实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起布朗-塞卡尔综合征的一种或多种症状可检测地改善的数量，包括但不限于同侧本体感觉和运动损伤，伴随对侧的痛觉和温度敏感性的丧失。

前脊髓综合征经常与引起运动功能以及痛觉和温度敏感性的可变丧失的损害有关，保留本体感觉。因此，在治疗SCI的方法的具体实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起由前脊髓综合症的一种或多种症状可检测地改善的数量，包括但不限于运动功能以及痛觉和温度敏感性的可变丧失。

脊髓圆锥综合症与导致无反射性膀胱、肠和下肢的骶和腰神经根损伤有关，而骶节段偶尔可能显示保留反射（例如，球海绵体肌和排尿反射）。因此，在治疗SCI的方法的具体实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起由脊髓圆锥综合症的一种或多种症状可检测地改善的数量，包括但不限于无反射性膀胱、肠和下肢。

马尾综合症由椎管中的腰骶神经根的损伤所致，其导致无反射性膀胱、肠和下肢。因此，在治疗SCI的方法的具体实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起由马尾综合症的一种或多种症状可检测地改善的数量，包括但不限于无反射性膀胱、肠和下肢。

在某些实施方式中，用于检测SCI的一种或多种症状、病况或者症候群的改善，或者严重程度的降低，或者进展的减缓的特定技术，对于本发明提供的治疗SCI的方法并不关键。在某些实施方式中，SCI的一种或多种症状、病况或者症候群的所述改善或者进展的减缓的评价方法根据本领域专业人员的判断确定。在某些实施方式中，SCI的一种或多种症状、病况或者症候群的所述改善或者进展的减缓的评价方法根据本领域专业人员的判断结合所述个体的主观经验确定。

在一些实施例方式中，所述脊髓损伤的一种或多种症状的改善，其一种或多种症状进展的减缓根据脊髓损伤的神经病学和功能分类的国际标准检测。脊髓损伤的神经病学和功能分类的国际标准由美国脊髓损伤协会（ASIA）出版，是一个广泛接受的系统，其基于神经病学功能的系统的运动和感觉检查描述脊髓损伤的水平和程度。参见International Standards For Neurological Classification OfSpinal Cord Injury，J Spinal Cord Med.26Suppl1:S50-6（2003），其公开的内容全文引入作为参考。

在特定的实施方式中，所述脊髓损伤的一种或多种症状的改善，其一种或多种症状进展的减缓根据使用下列分类的ASIA病损分级（由Frankel分级修订）来检测：

A－完全损伤：骶段S4-S5.4无感觉或者运动功能保留。“完全”是指在最低的骶段缺乏感觉和运动功能。

B－不完全损伤：在低于神经平面和延伸到骶段S4-S5保留感觉功能，无运动功能。“不完全”是指低于损伤平面（包括最低的骶段）保留感觉或者运动功能。

C－不完全损伤：在低于神经平面保留运动功能，并且低于神经平面的大部分关键肌肉具有肌肉分级小于3。

D－不完全损伤：低于神经平面保留运动功能，并且低于神经平面的大部分关键肌肉具有肌肉分级大于或等于3。

E－正常：感觉和运动功能正常。

因此，在本发明提供的治疗SCI的方法的一个具体实施方式中，治疗有效量的AMDAC是根据ASIA病损分级（AIS）足以引起病损降低的量。在一些实施方式中，所述的降低是病损减少1、2、3、4或者5级，其中一级对应于一个级别的改善，例如，病损从D级降低到E级。在一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是根据AIS足以将个体分级从ASIA A转化为ASIA B、ASIAC、ASIAD或者ASIA E的数量。在一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是根据AIS足以将个体分级从ASIA B转化为ASIAC、ASIA D或者ASIA E的数量。在一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是根据AIS足以将个体分级从ASIA C转化为ASIA D或者ASIA E的数量。在一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是根据AIS足以将个体分级从ASIA D转化为ASIA E的数量。

在一些实施方式中，所述脊髓损伤的一种或多种症状的改善，其一种或多种症状进展的减缓通过测量患者的肌力来检测。在一些实施方式中，肌肉力量可使用以下医学研究委员会（MRC）0-5级进行分级：

5－正常力量

4⁺－可对抗阻力做次最大运动

4－可对抗阻力做适度运动

4^－－可对抗阻力做轻微运动

3－可对抗重力但不能对抗阻力做运动

2－可在无重力下运动

1－轻微运动

0－没有运动

测试SCI患者的下列关键肌肉，并且表示出相应的损伤平面：

C5－肘屈肌（二头肌，肱肌）

C6－腕伸肌（桡侧腕伸长和缩短肌）

C7－肘伸肌（三头肌）

C8－中指指屈肌（屈指深肌）

T1－小指外展肌（小指展肌）

L2－髋部屈肌（髂腰肌）

L3–膝伸肌（股四头肌）

L4－踝背曲肌（胫骨前肌）

L5－长趾伸肌（拇趾长伸肌）

S1－踝跖屈肌（腓肠肌，比目鱼肌）

因此，在本发明提供的一个治疗SCI的方法的具体实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起肌肉力量根据MRC分级增加1、2、3、4或者5个点的数量。例如，在一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起从作为SCI结果的没有运动的肌肉恢复到具有轻微运动，可在无重力下运动，可对抗重力但不能对抗阻力做运动，可对抗阻力做轻微运动，可对抗阻力做适度运动，可对抗阻力做次最大运动或者正常力量的肌肉的数量。在一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起从作为SCI结果的仅具有轻微运动的肌肉恢复到可在无重力下运动，可对抗重力但不能对抗阻力做运动，可对抗阻力做轻微运动，可对抗阻力做适度运动，可对抗阻力做次最大运动或者正常力量的肌肉的数量。在一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引从作为SCI结果的仅具有可在无重力下运动的肌肉恢复到可对抗重力但不能对抗阻力做运动，可对抗阻力做轻微运动，可对抗阻力做适度运动，可对抗阻力做次最大运动或者正常力量的肌肉的数量。在一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起从作为SCI结果的仅具有可对抗重力但不能对抗阻力做运动的肌肉恢复到可对抗阻力做轻微运动，可对抗阻力做适度运动，可对抗阻力做次最大运动或者正常力量的肌肉的数量。在一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起从作为SCI结果的仅具有可对抗阻力做轻微运动的肌肉恢复到可对抗阻力做适度运动，可对抗阻力做次最大运动或者正常力量的肌肉的数量。在一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起从作为SCI结果的仅具有可对抗阻力做适度运动的肌肉恢复到可对抗阻力做次最大运动或者正常力量的肌肉的数量。在一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起从作为SCI结果的仅具有可对抗阻力做次最大运动的肌肉恢复到正常力量的肌肉的数量。

在一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起个体的肱二头肌肌力量增加1、2、3、4或者5个点的数量。在一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起个体的肱肌肌力量增加1、2、3、4或者5个点的数量。在一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起个体的桡侧腕伸长和缩短肌肌力量增加1、2、3、4或者5个点的数量。在一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起个体的肱三头肌肌力量增加1、2、3、4或者5个点的数量。在一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起个体的屈指深肌肌力量增加1、2、3、4或者5个点的数量。在一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起个体的小指展肌力量增加1、2、3、4或者5个点的数量。在一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起个体的髂腰肌肌力量增加1、2、3、4或者5个点的数量。在一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起个体的四头肌肌力量增加1、2、3、4或者5个点的数量。在一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起个体的胫骨前肌力量增加1、2、3、4或者5个点的数量。在一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起个体的长伸肌肌力量增加1、2、3、4或者5个点的数量。在一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起个体的腓肠肌或者比目鱼肌肌力量增加1、2、3、4或者5个点的数量。

在一些实施方式中，所述脊髓损伤的一种或多种症状的改善，其一种或多种症状进展的减缓通过感觉测试来检测。感觉测试可以在下列水平进行：

C2－枕骨隆突

C3－锁骨上窝

C4－肩锁关节顶部

C5－肘窝后侧

C6－拇指

C7－中指

C8－小指

T1－肘前窝内侧

T2－腋尖

T3－第三肋间隙（IS）

T4－乳头线的第四IS

T5－第五IS（在T4和T6之间）

T6－在剑胸骨水平的第六IS

T7－第七IS（在T6和T8中间）

T8－第八IS（在T6和T10中间）

T9－第就IS（在T8和T10中间）

T10－第十IS或者肚脐

T11－第十一IS（T10和T12之间）

T12－腹股沟韧带的中点

L1－在T12和L2之间的中点

L2－大腿的前侧中部

L3－股骨内侧髁

L4－内踝

L5－第三跖趾关节的脚背

S1－足跟外侧

S2－腘窝的中线

S3－坐骨结节

S4-5－肛周区（作为1级）

轻触和针刺的感觉评分如下：

0－缺乏感觉

1－受损或者感觉过敏

2－完整

如果患者不能区分锋利的针尖和钝刀片，给0分。因此，在本发明提供的治疗方法的具体实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起对应于C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8、T9、T10、T11、T12、L1、L2、L3、L4、L5、S1、S2、S3、S4和S5中一种或多种的感觉得分增加1分或者2分的量。

在一些实施方式中，所述脊髓损伤的一种或多种症状的改善，其一种或多种症状进展的减缓通过监控患者的日常生活功能来检测。在本发明提供的治疗SCI的方法的一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起患者日常生活活动的功能改善的数量。在一些实施方式中，功能独立性评测（FIM）被用于评价患者的功能改善。FIM集中在6个功能类别：自我护理，括大约肌控制，转移，行走，交流和社会认知。在每个类别中，评估两种或多种具体的活动/项目，总共18个项目。例如，6个活动项目（进食，梳理，沐浴，穿上衣，穿裤子和如厕）组成自我护理。18个项目中的每一项依据功能独立性使用7级进行评价：

独立（不需要人力帮助）：

7=完全独立：活动通常安全地进行，不需修改、辅助设备或者帮助，并且在合理时间内完成。

6=有条件的独立：活动需要辅助设备和/或超过合理的时间和/或不能安全地进行。

依赖（需要别人监护或者身体上的帮助）：

5=监护或者准备：不需要身体上的帮助，但需要提示，哄劝或者准备。

4=最小接触帮助：个体最多需要轻触的帮助，并且在活动中需要付出75%或更多的努力。

3=适度的帮助：个体需要多于轻触的帮助，并且在活动中需要付出50±75%的努力。

2=最大的帮助：个体在活动中需要付出25±50%的努力。

1=完全帮助：个体在活动中需要付出0±25%。

因此，FIM总得分（所有项目相加）评价安全问题项目中的残疾程度以及依赖他人和技术设备的程度。类别得分情况和项目得分准确描述SCI影响最大的日常生活的具体方面。本发明提供的治疗SCI的方法的一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起患者的功能根据FIM评级增加1、2、3、4、5或者6个点的数量。在一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起作为SCI的后果需要完全帮助的个体回复到只需要适度的帮助，只需要最小接触帮助，只需要监护或者准备，或者有条件独立或者完全独立的数量。在一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起作为SCI的后果需要适度的帮助的个体回复到只需要最小接触帮助，只需要监护或者准备，或者有条件独立或者完全独立的数量。在一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起作为SCI的后果需要最小接触帮助的个体回复到只需要监护或者准备，或者有条件独立或者完全独立的数量。在一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起作为SCI的后果需要监护或者准备的个体回复到有条件独立或者完全独立的数量。在一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起作为SCI的后果有条件独立的个体回复到完全独立的数量。

具有或者遭受SCI的一种症状的个体可在损伤进展期间的任何时候用多个AMDAC治疗，并且可选择地，使用一种或多种治疗剂。例如，所述个体可在损伤之后立即治疗，或者在损伤的1、2、3、4、5、6天以内，或者在损伤的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、13、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50天或者更多天以内，或者在损伤之后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或者更多年以内。个体在损伤的临床病程期间可以一次或者多次治疗。在所述治疗方法的具体实施方式中，所述的AMDAC在脊髓损伤的一种或多种症状发展的21天以内向所述的个体给药。在所述治疗方法的另一个具体实施方式中，所述的AMDAC在脊髓损伤的一种或多种症状发展的14天以内向所述的个体给药。在所述治疗方法的另一个具体实施方式中，所述的AMDAC在脊髓损伤的一种或多种症状发展的7天以内向所述的个体给药。在所述治疗方法的另一个具体实施方式中，所述的AMDAC在脊髓损伤的一种或多种症状发展的48小时内向所述的个体给药。在另一个具体实施方式中，所述的AMDAC在脊髓损伤的一种或多种症状发展的24小时内向所述的个体给药。在另一个具体实施方式中，所述的AMDAC在脊髓损伤的一种或多种症状发展的12小时以内向所述的个体给药。在另一个具体实施方式中，所述的AMDAC在脊髓损伤的一种或多种症状发展的3小时以内向所述的个体给药。

在本发明的某些实施方式中，所述个体是动物，优选哺乳动物，更优选非人灵长类动物。在某些实施方式中，所述个体是人类患者。所述个体可以是雄性或者雌性受试者。在某些实施方式中，所述个体是非人类动物，例如，奶牛、绵羊、山羊、马、犬、猫、家兔、大鼠或者小鼠。

用于治疗SCI的AMDAC可以是本发明公开的任何AMDAC。在一个具体实施方式中，AMDAC是OCT-4^–（OCT-4阴性，OCT-4也称为POU5F1或者八聚体结合蛋白4）。在另一个具体实施方式中，AMDAC是OCT-4^–以及VEGFR1/Flt-1⁺（血管内皮生长因子受体1）和/或VEGFR2/KDR⁺（血管内皮生长因子受体2，也称为激酶插入域受体）。在另一个具体实施方式中，AMDAC是OCT-4^–和CD49f⁺（整合素-α6⁺）。在另一个具体实施方式中，AMDAC是OCT-4^–以及HLA-G^–。在另一个具体实施方式中，AMDAC是OCT-4^–以及CD90⁺、CD105⁺或者CD117^–。在另一个具体实施方式中，AMDAC是OCT-4^–、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–。在另一个具体实施方式中，AMDAC是OCT-4^–并且不表达SOX2。在另一个具体实施方式中，AMDAC是GFAP⁺。在另一个具体实施方式中，AMDAC是β-微管蛋白III（Tuj1）⁺。在另一个具体实施方式中，AMDAC是OCT-4^–、GFAP⁺和β-微管蛋白III（Tuj1）⁺。在另一个具体实施方式中，用于治疗SCI的AMDAC是OCT-4^–、CD200⁺、CD105⁺和CD49f⁺。在另一个具体实施方式中，用于治疗SCI的AMDAC是CD200⁺、CD105⁺、CD90⁺和CD73⁺。在另一个具体实施方式中，用于治疗SCI的AMDAC是CD117^–并且不使用CD117抗体筛选。在另一个具体实施方式中，用于治疗SCI的AMDAC是CD146^–并且不使用CD146抗体筛选。在另一个具体实施方式中，用于治疗SCI的AMDAC是OCT-4^–并且用VEGF诱导后不表达CD34。在另一个具体实施方式中，用于治疗SCI的AMDAC经短期神经分化试验（参见，例如下文第5.12.1节）确定是神经源性的。在另一个具体实施方式中，用于治疗SCI的AMDAC通过体外软骨潜能分析法（参见，例如下文第5.12.3节）确定是非软骨形成的。在另一个具体实施方式中，用于治疗SCI的AMDAC通过成骨表型分析法（参见，例如下文第5.12.2节）确定是非成骨性的。

在一个具体实施方式中，用于治疗SCI的AMDAC经RT-PCR和/或TRAP分析法确定是端粒酶^–。在另一个具体实施方式中，用于治疗SCI的AMDAC经RT-PCR例如30个循环测定不表达端粒酶逆转录酶（TERT）的mRNA。在另一个具体实施方式中，用于治疗SCI的AMDAC经RT-PCR测定是NANOG^–。在另一个具体实施方式中，用于治疗SCI的AMDAC经RT-PCR例如30个循环测定不表达NANOG的mRNA。在一个具体实施方式中，用于治疗SCI的AMDAC是（性别决定区Y）-逻辑框2（SOX2）^–。在另一个具体实施方式中，用于治疗SCI的AMDAC经RT-PCR例如30个循环测定不表达SOX2的mRNA。在另一个具体实施方式中，用于治疗SCI的AMDAC通过成骨表型分析法（参见，例如下文第5.12.2节）确定不是成骨性的。在另一个具体实施方式中，用于治疗SCI的AMDAC通过软骨潜能分析法（参见，例如下文第5.12.3节）确定不是软骨形成的。在另一个具体实施方式中，用于治疗SCI的AMDAC通过成骨表型分析法（参见，例如下文第5.12.2节）确定不是成骨性的，并且通过软骨潜能分析法（参见，例如下文第5.12.3节）确定不是软骨形成的。

在一个实施方式中，所述个体给药剂量为大约3亿的AMDAC。然而，剂量可根据所述个体的身体特点例如体重而变化，并且可在每剂量100万到100亿AMDAC，优选在每剂量1000万和10亿之间，或者在每剂量1亿和5亿AMDAC之间的范围内变化。所述的给药优选静脉内，但可以是通过任何医学可接受的活细胞给药途径，例如，静脉内、动脉内、腹腔内、脑室内、胸骨内、颅内、肌肉内、滑膜内、眼内、玻璃体内（例如，其中有眼部受累）、脑内、侧脑室内（例如，其中有神经或者大脑受累）、鞘内、骨髓输液、膀胱内、透皮、脑池内、硬膜外、或者皮下注射。在具体的实施方式中，通过团注射或者输注给药直接进入脊髓损伤部位，例如通过腰椎穿刺。

在一个实施方式中，AMDAC来自细胞库。在一个实施方式中，AMDAC的一个剂量包含在一个血袋或者类似的袋子内，其适合于团注射或者导管给药。

AMDAC或者AMDAC条件培养基可以单一剂量或者多剂量给药。当AMDAC以多次剂量给药时，所述剂量可以是旨在减轻SCI的一种或多种急性症状的治疗方案的一部分，或者可以是旨在减轻SCI的严重程度的长期治疗方案的一部分。

本发明提供的用于治疗SCI的方法进一步包括通过施用治疗有效量的AMDAC，与在治疗SCI的过程中使用的一种或多种疗法或者治疗方法结合来治疗SCI。所述的一种或多种其它疗法可以应用在AMDAC给药之前，与之同时，或者之后。在一些实施方式中，所述的一种或多种其它疗法包括应用治疗性脊柱牵引。治疗性脊柱牵引在应用沿脊柱的纵轴方向的力（通常是重力）的基础上，使用手工或者机械力拉伸并移动脊柱。如果颈部或者颈段断裂，牵引可以矫正并使脊柱减压。

在其它实施方式中，一种或多种其它疗法包括外科脊柱稳定术，例如，通过插入螺杆和螺母以使脊柱正确地排列或者使相邻椎骨汇合以加强脊椎，促进骨再生，并且降低将来进一步脊髓损伤的可能性。在其它实施方式中，一种或多种其它疗法包括康复（例如，重复的随意运动训练，力量训练等等），其能够促进新的局部CNS连接的形成。在其它实施方式中，一种或多种其它疗法包括特定神经或者肌肉的功能性电刺激（FES），例如，辅助呼吸的膈神经的FES；促进膀胱和肠道功能的骶神经根的FES；改善手臂或者手功能，以及站立或者行走功能的四肢肌肉的FES。

本发明还提供治疗患有或者遭受SCI的一种症状的个体的方法，包括向所述的个体施用多个AMDAC和一种或多种治疗剂，所述的AMDAC足以引起所述脊髓损伤的一种或多种症状、病况或症候群可检测的改善，或者其一种或多种症状、病况或者症候群进展的减缓。在一个实施方式中，所述的治疗剂是皮质类固醇。在其它实施方式中，所述的治疗剂是抗凝血剂，例如肝素。在其它实施方式中，所述的治疗剂是神经保护剂。在一些实施方式中，所述的神经保护剂是甲泼尼龙琥珀酸钠（MPSS），GM-1（Sygen），加环利定（GK-11），促甲状腺激素释放激素，美满霉素（米诺环素），锂盐或者促红细胞生成素（EPO）。

在其它实施方式中，所述的治疗剂或者Rho拮抗剂，例如，Cethrinr，肌苷，咯利普兰，ATI-355（NOGO），软骨素酶，氨吡啶（4－氨基吡啶）或者加巴喷丁。在另一个实施方式中，所述的治疗剂是免疫调节剂或者免疫抑制剂，例如，环孢菌素A。在其它实施方式中，所述的治疗剂是与AMDAC共给药的所述第二细胞群。在一些实施方式中，所述的第二细胞群是自体巨噬细胞，骨髓基质细胞，鼻腔的嗅觉鞘细胞，胚胎的嗅觉的皮质细胞或者许旺氏细胞群。

5.1.2外伤性脑损伤（TBI）的治疗

本发明还提供治疗患有或者遭受外伤性脑损伤（TBI）的一种症状的个体的方法，包括向所述的个体施用治疗有效量的AMDAC或者AMDAC条件培养基，其中治疗有效量是足以引起所述外伤性脑损伤的一种或多种症状可检测的改善或者其一种或多种症状的进展可检测的减缓的数量。如本发明所使用的，“一种或多种症状”包括客观可测量的参数，例如炎症程度，免疫反应，受伤部位的基因表达等等，所述基因表达与受伤部位的愈合过程，结疤的质量和程度，患者的运动、感觉和认知功能的改善相关；以及主观可测量的参数，例如患者的幸福感，患者对运动，感觉和认识功能改善的感受，与TBI有关的痛或者不舒适的减轻的感受，等等。

TBI，是作用于颅骨和颅内容物的外部机械力对大脑的非退化的，非先天的损伤，其可能导致认知，身体和心理功能的永久性或者暂时性损害，伴随意识病况的相关的减弱或者改变。TBI可临床表现为从脑震荡到昏迷和死亡。

在治疗TBI的方法的一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起初级TBI（即在创伤一刻发生的外伤性脑损伤）的一种或多种症状可检测地改善的数量。在一些实施方式中，初级TBI是病灶损伤，例如，颅骨骨折，裂伤，挫伤或者贯通伤。在一些实施方式中，初级TBI是弥漫性的，例如，弥漫性轴索损伤。

在治疗TBI的方法的一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起由初级TBI导致的继发性损伤的一种或多种症状可检测地改善的数量，所述的继发性损伤在创伤后立即发生并产生可能持续一段时间的效果。TBI的继发性损伤类型可归因于初级损伤作用的进一步细胞损伤。继发性损伤可以在大脑的初始创伤之后发展数小时或者数天。

本发明提供的用于治疗TBI的方法也包括对大脑特定区域遭受的TBI损伤的治疗。在一些实施方式中，本发明提供的治疗TBI的方法对于治疗额叶（位于前额），顶叶（位于头的近后部和顶部），枕叶（位于最后部，头的背面），颞叶（位于头的侧面耳朵上方），脑干（位于大脑内深处）和小脑（位于颅底）的损伤是有用的。

在本发明提供的治疗TBI的方法的一个具体实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起额叶损伤的一种或多种症状改善的数量，所述症状包括但不限于，身体各部分简单运动的丧失（麻痹），不能安排需要完成多步骤任务的复杂运动的顺序，例如煮咖啡（顺序），丧失与他人互动的自然性，丧失思维的灵活性，单一想法的持续性（持续性），不能专注于任务（专心），情绪改变（情绪不稳定），社会行为的改变，个性的改变，解决问题困难，或者不能语言表达（布罗卡氏失语症）。

在本发明提供的治疗TBI的方法的一个具体实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起顶叶损伤的一种或多种症状改善的数量，所述症状包括但不限于，不能一次专注于多个物体，不能给物体命名（命名不能症），不能找出书写的单词（书写不能症），阅读障碍（失读症），描绘物体困难，区分左右困难，做数学困难（计算困难），缺乏对某些身体部位和/或周围空间的意识（失用症），其导致自我护理困难，不能集中视觉注意或者困难使眼和手协调。

在本发明提供的治疗TBI的方法的一个具体实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起枕叶损伤的一种或多种症状改善的数量，包括但不限于，视觉缺陷（视野缺口），定位环境中的物体困难，识别颜色困难（颜色失认症），产生幻觉，视错觉（不能准确看见物体），词盲（不能识别单词），不能识别绘制物体，不能识别物体的运动（运动失认症），或者阅读和书写困难。

在本发明提供的治疗TBI的方法的一个具体实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起颞叶损伤的一种或多种症状改善的数量，所述症状包括但不限于，识别面容困难（人面失认症），理解言语困难（韦尼克氏失语症），对选择性专注于所见和所听事物的干扰，识别和以言语表达物体困难，短期记忆丧失，长期记忆的中断，对性行为兴趣的增加和减少，不能分类物体（归类），持久说话（表现出右叶损害），或者增加攻击行为。

在本发明提供的治疗TBI的方法的一个具体实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起脑干损伤的一种或多种症状改善的数量，所述症状包括但不限于，肺活量减少（对于讲话是重要的），吞咽食物和水困难（吞咽困难），对环境的组织和感知困难，平衡和运动困难，头晕和恶心（眩晕），或者睡眠困难（失眠，睡眠呼吸暂停）。

在本发明提供的治疗TBI的方法的一个具体实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起颅底损伤的一种或多种症状改善的数量，所述症状包括但不限于，协调精细动作的能力丧失，行走能力的丧失，伸手抓物体的能力丧失，震颤，头晕（眩晕），言语不清（断续言语），或者不能做快速运动。

本发明提供的用于治疗TBI的方法也包括治疗从轻度到重度范围的TBI损伤。如果意识丧失和/或障碍和定向障碍短于30分钟，外伤性脑损伤（TBI）可以被归类为轻度。因此，在一些实施方式中，本发明提供向患有TBI的个体施用有效剂量的AMDAC的给药方法，其中所述的有效剂量是足以例如引起轻度TBI的一种或多种症状可检测地改善，其严重程度降低，或者其进展减缓的AMDAC量，所述症状包括但不限于，认知问题，例如头痛，记忆问题，注意力缺陷，情绪波动和挫折，疲劳，视力障碍，失忆，注意力/专注力不良，睡眠障碍，头晕/失去平衡，易怒，情绪困扰，感情抑郁，癫痫，恶心，嗅觉丧失，对光和声音敏感，情绪改变，迷失或困惑，或者思维缓慢。

在具体的实施方式中，有效剂量是足以治疗脑震荡的AMDAC量，例如，引起脑震荡的一种或多种症状可检测地改善，其严重程度降低，或者其进展减缓，所述症状包括但不限于，意识模糊或者感觉晕眩，笨拙，言语不清，恶心或者呕吐，头痛，平衡问题或者头晕，视觉模糊，对光敏感，对噪音敏感，滞缓，耳鸣，行为或者个性改变，集中困难，或者失忆。在一些实施方式中，脑震荡是1级（轻度）脑震荡，其特征在于没有意识的丧失合脑震荡症状持续不少于数分钟。在一些实施方式中，脑震荡是2级（中度）脑震荡，其特征在于没有意识丧失和脑震荡症状持续超过15分钟。在一些实施方式中，脑震荡是3级（重度）脑震荡，其特征在于意识丧失至少几秒钟。

在一些实施方式中，本发明提供对患有TBI的个体施用有效剂量的AMDAC的给药方法，其中所述的有效剂量是足以例如引起中度到重度TBI的一种或多种症状可检测地改善，其严重程度降低，或者其进展减缓的AMDAC量，所述症状包括但不限于，认知障碍例如注意力困难、注意力集中，注意力分散，记忆，信息处理速度，意识模糊，持续言语，冲动，语言处理，言语和语言，不理解所讲的话（感觉性失语症），讲话困难和理解困难（表达性失语症），言语不清，讲话非常迅速或者非常缓慢，阅读障碍，书写障碍；感觉缺陷，例如对触觉、温度、运动、肢体位置或者细微区别的解释困难；知觉缺陷，例如难于将感官印象整合或者模拟成心理意义的数据；视觉缺陷，包括视力部分或者完全丧失，眼部肌无力和重影（复视），视觉模糊，判断距离障碍，无意识眼球运动（眼球振颤），畏光（恐光症）；听力缺陷，包括听力减弱或丧失，或者耳鸣（耳鸣），或者声音敏感性增加；嗅觉缺陷，包括嗅觉丧失或者减弱（嗅觉缺失症）；味觉损伤或者减弱；癫痫，包括与癫痫相关的惊厥，其可分为几种类型并且可包括意识、感官知觉或者运动动力的中断；身体变化，包括身体麻痹/痉挛；慢性疼痛，大小便失禁，睡眠障碍，失去耐力，胃口变化，体温调节异常，和月经障碍；社会情感障碍，包括依赖行为，缺陷感情能力，缺陷动力，易怒，攻击性，抑郁，去抑制，或者没有/缺乏意识。

在一个实施方式中，本发明提供对患有TBI的个体施用有效剂量的AMDAC的给药方法，其中所述的有效剂量是足以例如引起以上列出的TBI的一种或多种症状可检测地改善，其严重程度降低，或者其进展减缓的AMDAC量。在某些实施方式中，用于检测一种或多种症状、病况或症候群的改善，其严重程度的降低，或者其进展减缓的特定技术，对于本发明提供的治疗TBI的方法不重要。在某些实施方式中，SCI的一种或多种症状的所述改善或者进展减缓的评价根据本领域专业人员的判断确定。在某些实施方式中，TBI的一种或多种症状的所述改善或者进展减缓的评价根据本领域专业人员的判断结合该主体的主观经验确定。

在一些实施方式中，所述TBI的一种或多种症状的改善，或者其一种或多种症状的进展的减缓，根据格拉斯哥昏迷量表（GCS）检测。GCS定义在损伤48小时以内TBI的严重程度如下：

睁眼

自然睁眼=4

语言吩咐睁眼=3

疼痛剌激睁眼=2

无反应=1

运动反应

按吩咐运动=6

对疼痛刺激定位运动=5

对疼痛刺激肢体回缩运动=4

对疼痛刺激异常屈曲（去皮层病况）=3

对疼痛刺激异常伸展（去脑病况）=2

无反应=1

言语反应

对人、地点和日期有条理=5

可交谈但答非所问=4

只能说出不适当的单词=3

发不能理解的声音=2

无反应=1

根据GCS得分（在48h以内）TBI的严重程度如下：

植物人病况的TBI=低于3（以睡眠觉醒周期为特点；可唤醒，但没有与环境的相互作用；对疼痛刺激没有定位反应）

重度的TBI=3–8（以昏迷为特点：无意识病况；无有意义的反应，无自发活动）

中度的TBI=9－12（以意识丧失超过30分钟为特点；可能或者可解决的身体或者认知损害；患者可能受益于康复）

轻度TBI=13–15（以精神病况（意识模糊，定向障碍或者记忆丧失）短暂改变为或者意识丧失低于30分钟为特点）

因此，在本发明提供的治疗TBI的方法的一个具体实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起足以引起患者的GCS得分增加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或者更多点的数量。在一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起根据GCS关于睁眼增加1、2或者3个点的数量。在一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起根据GCS关于运动反应增加1、2、3、4或者5个点的数量。在一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起根据GCS关于言语反应增加1、2、3或者4个点的数量。在一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以将创伤严重程度从植物人病况TBI相应的水平降低到重度、中度或者轻度TBI相应的水平的数量。在一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以将创伤严重程度从重度TBI相应的水平降低到中度或者轻度TBI相应的水平的数量。在一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以将创伤严重程度从中度TBI相应的水平降低到轻度TBI相应的水平的数量。

在一些实施方式中，所述TBI的一种或多种症状的改善，其一种或多种症状的进展的减缓，根据Ranchos Los Amigos评分检测。Ranchos Los Amigos评分根据以下评分标准测量意识、认知、行为和与环境相互作用的级别：

I级：没有反应

II级：一般反应

III级：定位反应

IV级：意识模糊－躁动

V级：意识模糊－反应不适当

VI级：意识模糊－反应适当

VII级：自主病况－反应适当

VIII级：目的明确－反应适当

因此，在本发明提供的治疗TBI的方法的一个具体实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以引起根据Ranchos Los Amigos评分患者的得分增加1、2、3、4、5、6或者7级的数量。在一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以将受试者的意识、认知、行为和与环境相互作用从没有反应相应的级别提高到一般反应，定位反应，意识模糊躁动，意识模糊不适当反应，意识模糊适当反应，自主适当反应或者目的明确适当反应的级别的数量。在一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以将受试者的意识，认知，行为和与环境相互作用从一般反应相应的级别提高到定位反应，意识模糊躁动，意识模糊不适当反应，意识模糊适当反应，自主适当反应或者目的明确适当反应相应的级别的数量。在一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以将受试者的意识，认知，行为和与环境相互作用从定位反应相应的级别提高到意识模糊躁动相应的级别，意识模糊不适当反应，意识模糊适当反应，自主适当反应或者目的明确适当反应相应的级别的数量。在一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以将受试者的意识，认知，行为和与环境相互作用从意识模糊躁动相应的级别提高到意识模糊不适当反应，意识模糊适当反应，自主适当反应或者目的明确适当反应相应的级别的数量。在一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以将受试者的意识，认知，行为和与环境环境相互作用从意识模糊不适当反应相应的级别提高到意识模糊适当反应，自主适当反应或者有目的明确适当反应相应的级别的数量。在一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以将受试者的意识，认知，行为和与环境环境相互作用从意识模糊适当反应提高到自主适当反应或者目的明确适当反应相应的级别的数量。在一些实施方式中，治疗有效量的AMDAC是足以将受试者的意识，认知，行为和与环境环境相互作用从自主适当反应相应的级别提高到目的明确适当反应相应的级别的数量。

患有或者遭受TBI的一种症状的个体可以在损伤进展期间的任何时间用多个AMDAC和可选择地一种或多种治疗剂治疗。例如，所述个体在损伤之后可以立即治疗，或者在损伤的1、2、3、4、5、6天以内，或者在损伤的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50天以内或者以上，或者在损伤之后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或者更多年以内。所述个体可以在损伤的临床病程期间被治疗一次或者多次。在所述治疗方法的具体实施方式中，所述AMDAC在外伤性脑损伤的一种或多种症状发展的21天以内被施用到所述个体。在所述治疗方法的另一个具体实施方式中，所述AMDAC在外伤性脑损伤的一种或多种症状发展的14天以内被施用到所述个体。在所述治疗方法的另一个具体实施方式中，所述AMDAC在外伤性脑损伤的一种或多种症状发展的7天以内被施用到所述个体。在所述治疗方法的另一个具体实施方式中，所述AMDAC在外伤性脑损伤的一种或多种症状发展的48小时以内被施用到所述个体。在另一个具体实施方式中，所述AMDAC在外伤性脑损伤的一种或多种症状发展的24小时以内被被施用到所述个体。在另一个具体实施方式中，所述AMDAC在外伤性脑损伤的一种或多种症状发展的12小时以内被施用到所述个体。在另一个具体实施方式中，所述AMDAC在外伤性脑损伤的一种或多种症状发展的3小时以内被施用到所述个体。

在本发明的某些实施方式中，所述个体是动物，优选哺乳动物，更优选非人灵长类动物。在某些实施方式中，所述个体是人类患者。所述个体可以是雄性或者雌性受试者。在某些实施方式中，所述受试者是非人类动物，例如，母牛，绵羊，山羊，马，犬，猫，家兔，大鼠或者小鼠。

在TBI治疗中有用的AMDAC可以是本发明公开的任何AMDAC。在一个具体实施方式中，所述AMDAC是OCT-4^–（OCT-4阴性，也称为POU5F1或者八聚体结合蛋白4）。在另一个具体实施方式中，所述AMDAC是OCT-4^–和VEGFR1/Flt-1⁺（血管内皮生长因子受体1）和/或VEGFR2/KDR⁺（也称为激酶的血管内皮生长因子受体2插入域受体）。在另一个具体实施方式中，所述AMDAC是OCT-4^–和CD49f⁺（整合素-α6⁺）。在另一个具体实施方式中，所述AMDAC是OCT-4^–以及HLA-G^–。在另一个具体实施方式中，所述AMDAC是OCT-4^–以及CD90⁺、CD105⁺或者CD117^–。在另一个具体实施方式中，所述AMDAC是OCT-4^–、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–。在另一个具体实施方式中，所述AMDAC是OCT-4^–并且不表达SOX2。在另一个具体实施方式中，所述AMDAC是GFAP⁺。在另一个具体实施方式中，所述AMDAC是β-微管蛋白III（Tuj1）⁺。在另一个具体实施方式中，所述AMDAC是OCT-4^–、GFAP⁺和β-微管蛋白III（Tuj1）⁺。在另一个具体实施方式中，在TBI治疗中有用的AMDAC是OCT-4^–、CD200⁺、CD105⁺和CD49f⁺。在另一个具体实施方式中，在TBI治疗中有用的AMDAC是CD200⁺、CD105⁺、CD90⁺和CD73⁺。在另一个具体实施方式中，在TBI治疗中有用的AMDAC是CD117^–并且不使用CD117抗体筛选。在另一个具体实施方式中，在TBI治疗中有用的AMDAC是CD146^–并且不使用CD146抗体筛选。在另一个具体实施方式中，在TBI治疗中有用的AMDAC是OCT-4^–并且在VEGF诱导后不表达CD34。在另一个具体实施方式中，在TBI治疗中有用的AMDAC通过短期神经分化试验测定是神经源性的（参见，例如下文第5.12.1节）。在另一个具体实施方式中，在TBI治疗中有用的AMDAC通过体外软骨潜能分析测定是非软骨形成的（参见，例如下文第5.12.3节）。在另一个具体实施方式中，在TBI治疗中有用的AMDAC通过成骨表型分析法测定是非成骨性的（参见，例如下文第5.12.2节）。

在一个具体实施方式中，在TBI治疗中有用的AMDAC通过RT-PCR和/或TRAP分析法测定是端粒酶^–。在另一个具体实施方式中，在TBI治疗中有用的AMDAC通过RT-PCR例如30个循环测定不表达端粒酶逆转录酶（TERT）的mRNA。在另一个具体实施方式中，在TBI治疗中有用的AMDAC经RT-PCR测定是NANOG^–。在另一个具体实施方式中，在TBI治疗中有用的AMDAC通过RT-PCR例如30个循环测定不表达NANOG的mRNA。在一个具体实施方式中，在TBI治疗中有用的AMDAC是（性别决定区Y）-逻辑框2（SOX2）^–。在另一个具体实施方式中，在TBI治疗中有用的AMDAC通过RT-PCR例如30个循环测定不表达SOX2的mRNA。在另一个具体实施方式中，在TBI治疗中有用的AMDAC通过成骨表型分析法测定不是成骨性的（参见，例如下文第5.12.2节）。在另一个具体实施方式中，在TBI治疗中有用的AMDAC通过软骨形成潜能分析法测定不是软骨形成的（参见，例如下文第5.12.3节）。在另一个具体实施方式中，在TBI治疗中有用的AMDAC通过成骨表型分析法测定不是成骨性的（参见，例如下文第5.12.2节），并且通过软骨形成潜能分析法测定不是软骨形成的（参见，例如下文第5.12.3节）。

在一个实施方式中，所述个体被施用大约3亿AMDAC的剂量。然而，剂量可根据个体的身体特点例如体重而变化，并且每剂量的范围可从100万到100亿AMDAC之间，优选每剂量的范围在1000万和10亿之间，或者每剂量的范围在1亿和5亿AMDAC之间。所述的给药优选静脉内，但可以通过对活细胞给药的任何医学可接受的途径，例如，静脉内、动脉内、腹腔内、脑室内、胸骨内、颅内、肌肉内、滑膜内、眼内、玻璃体内（例如，其中有眼部受累），脑内、侧脑室内（例如，其中有神经或者大脑受累）、鞘内、骨髓输液、膀胱内、透皮、脑池内、硬膜外、或者皮下注射。在具体的实施方式中，通过团注射或者输注直接进入外伤性脑损伤部位给药，例如，通过小脑延髓池。

AMDAC或者AMDAC条件培养基可以单一剂量或者多剂量给药。其中AMDAC多剂量给药时，所述剂量可以是旨在缓解TBI的一种或多种急性症状的治疗方案的一部分，或者可以是旨在降低TBI严重程度的长期治疗方案的一部分。

本发明提供的用于治疗TBI的方法还包括通过施用治疗有效量的AMDAC组合用于治疗TBI过程中的一种或多种疗法或者治疗方法来治疗TBI。一种或多种其它疗法可在AMDAC之前，与之同时，或者在其后使用。在一些实施方式中，一种或多种其它疗法包括手术治疗。在一些实施方式中，螺栓或者ICP（颅内压）监测装置可设置在颅内以监测脑室内压力。在一些实施方式中，如果颅腔内有出血，这可被手术清除或者引流，并且出血血管或者组织可在施用AMDAC之前，与之同时，或者在其后被手术修复。在严重情况下，如果脑组织有肿胀和损害，在施用AMDAC之前，与之同时，或者在其后部分可被手术清除以给活的脑组织让出地方。在一些实施方式中，一种或多种其它疗法包括使用机械通风，其支持呼吸并且帮助头内压力稳定下降。

本发明还提是治疗患有或者遭受TBI的一种症状的个体的方法，包括向所述个体施用足以引起所述外伤性脑损伤的一种或多种症状可检测的改善，或者其一种或多种症状进展减缓的多个AMDAC，以及一种或多种治疗剂。例如，AMDAC可以与药物治疗组合给药，以使个体镇静并且使其处于药物诱导的昏迷，从而使躁动和继发性损伤减到最小。在一些实施方式中，如果所述个体有癫痫，癫痫预防药物可在疗程早期和稍后给予。在一些实施方式中，控制痉挛的药物可在患者恢复功能时使用。另外，药物可以用来改善注意力和精力集中（例如，金刚烷胺和哌醋甲酯，溴隐亭和抗抑郁药），或者控制攻击行为（例如，卡马西平和阿米替林）。

在一个具体实施方式中，根据本发明所述的方法治疗的TBI由非缺血事件导致或者引起。在另一个具体实施方式中，根据本发明所述的方法治疗的TBI不是血肿或者不由导致血肿。在另一个具体实施方式中，根据本发明所述的方法治疗的TBI不是由作用于头颅上的外力引起的血肿。在另一个具体实施方式中，根据本发明所述的方法治疗的TBI不是由遭受TBI的个体的大脑内或者周围的血流中断引起。

5.2使用羊膜来源的贴壁细胞抑制由CNS损伤引起或者与之相关的炎症反应

另一方面，本发明提供一种治疗患有CNS损伤的个体的方法，包括抑制由所述CNS损伤引起或者与之相关的炎症反应。本发明提供通过使所述免疫细胞与多个本发明所述的羊膜来源的贴壁细胞（AMDAC）接触，调节（例如抑制）一种免疫细胞或者数种免疫细胞的活性（例如增殖）的方法。羊膜来源的贴壁细胞介导的免疫调节（例如免疫抑制）例如对于CNS损伤有利，其中炎症在所述CNS损伤的早期或者慢性期起重要作用。

在一个实施方式中，本发明提供抑制个体中由对所述个体的CNS损伤（例如，脊髓损伤或者外伤性脑损伤）引起或者与之相关的免疫反应的方法，包括使多种个体免疫细胞与多个羊膜来源的贴壁细胞接触足够长时间，以使所述的羊膜来源的贴壁细胞可检测地抑制免疫反应，其中所述的羊膜来源的贴壁细胞在例如混合淋巴细胞反应（MLR）分析或者回归试验中可检测地抑制T细胞增殖。

羊膜来源的贴壁细胞是例如在本发明其它地方描述的羊膜来源的贴壁细胞（参见第5.4部分）。用于免疫抑制的羊膜来源的贴壁细胞可以来源于或者从单个胎盘的羊膜或者多个胎盘的羊膜获得。用于免疫抑制的羊膜来源的贴壁细胞也可来源于单一物种，例如，计划接受的物种或者其免疫功能将被降低或者抑制的免疫细胞物种，或者来源于多个物种。

在此方法和本发明公开的方法的情形下，“免疫细胞”表示免疫系统的任何细胞，特别是T细胞和自然杀伤（NK）细胞。因此，在此方法的各种实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞与多种免疫细胞接触，其中所述的多种免疫细胞是或者包括，多个T细胞（例如，多个CD3⁺T细胞、CD4⁺T细胞和/或CD8⁺T细胞），和/或自然杀伤细胞。在此方法的情形下，“免疫反应”可以是免疫细胞对通常由免疫细胞接受的刺激产生的任何反应，例如，对抗原存在的反应。在各种实施方式中，免疫反应可以是对CNS损伤（例如，脊髓损伤或者外伤性脑损伤）反应的T细胞增殖（例如、CD3⁺T细胞、CD4⁺T细胞和/或CD8⁺T细胞）。免疫反应也可以是NK细胞的任何活化，树突细胞的成熟，等等。免疫反应也可以是局部，组织或者器官特异性，或者一类或多类免疫细胞活性的全身性作用，例如，免疫反应可以是炎症，形成炎症相关的瘢痕组织，等等。

在本文情形下“接触”包括将羊膜来源的贴壁细胞和免疫细胞一起置于单一容器中（例如，培养皿，烧瓶，小药瓶，等等），或者体内，例如，在相同的个体中（例如，哺乳动物，例如，人）。在一个优选实施方式中，所述接触持续足够的时间，并且使足够数量的羊膜来源的贴壁细胞和免疫细胞接触，其中免疫细胞的免疫功能的改变是可检测的。更优选，在各种实施方式中，与没有羊膜来源的贴壁细胞存在下的免疫功能相比，所述的接触足以抑制免疫功能（例如，对抗原反应中的T细胞增殖）至少50%，60%，70%，80%，90%或者95%。这种抑制在体内的情形下可以通过体外试验测定（见下）；即，根据特定数量的羊膜来源的贴壁细胞和接受个体中的免疫细胞数，体外试验中的抑制程度可以推断出所述个体中的抑制程度。

在某些实施方式中，本发明提供使用羊膜来源的贴壁细胞在体外调节一种或多种类型的免疫细胞中多个细胞的免疫反应或者活动的方法。使羊膜来源的贴壁细胞和多种免疫细胞接触可包括使羊膜来源的贴壁细胞和免疫细胞在相同的物理空间结合，以致于多个羊膜来源的贴壁细胞的至少一部分与多个免疫细胞的至少一部分相互作用；保持羊膜来源的贴壁细胞和免疫细胞在具有共同培养基的独立物理空间中；或者可包括使来自一种细胞的培养基或者羊膜来源的贴壁细胞或免疫细胞的培养液与其它类型的细胞接触（例如，从羊膜来源的贴壁细胞的培养液获得的培养基与在所述培养基中再悬浮的分离的免疫细胞）。在一个具体实施方式中，所述接触在混合淋巴细胞反应（MLR）中进行。在另一个具体实施方式中，所述接触在回归试验或者拍打T细胞反应（BTR）试验中进行。

例如，这种接触可发生在设计成确定特定的多个羊膜来源的贴壁细胞免疫调节（例如，免疫抑制）程度的实验设置中。例如，这种实验设置可以是混合淋巴细胞反应（MLR）或回归试验。执行MLR和回归分析的过程是本领域众所周知的。参见，例如Schwarz，“The Mixed Lymphocyte Reaction:An In Vitro Test for Tolerance”，J.Exp.Med.127（5）:879-890（1968）；Lacerda等，“Human Epstein-Barr Virus（EBV）-Specific Cytotoxic T Lymphocytes Home Preferentially to and Induce SelectiveRegressions of Autologous EBV－Induced B Lymphoproliferations in XenograftedC.B-17Scid/Scid Mice”，J.Exp.Med.183:1215-1228（1996）。在一个优选的实施方式中，MLR在多个羊膜来源的贴壁细胞与多个免疫细胞（如淋巴细胞，例如，CD3⁺，CD4⁺和/或CD8⁺T淋巴细胞）接触中进行。

MLR可用于测定多个羊膜来源的贴壁细胞的免疫抑制能力。例如，多个羊膜来源的贴壁细胞可以在包括使CD4⁺或者CD8⁺T细胞，树突细胞（DC）和羊膜来源的贴壁细胞以大约10:1:2的比例结合的MLR中测试，其中T细胞被一种染料例如CFSE染色，所述染料分配进入子细胞，并且其中T细胞被允许增殖大约6天。与在存在CD和不存在羊膜来源的贴壁细胞的情况下T细胞增殖相比，如果在羊膜来源的贴壁细胞存在下在6天中T细胞增殖可检测地降低，所述的多个羊膜来源的贴壁细胞是免疫抑制的。在这种MLR中，羊膜来源的贴壁细胞从培养基中解冻或者收获。大约20,000羊膜来源的贴壁细胞悬浮在100μl培养基（RPMI1640，1mM HEPES缓冲液，抗生素，和5%混合人血清）中，并且允许附在加样孔底2小时。从全外周血单核细胞Miltenyi磁珠分离CD4⁺和/或CD8⁺T细胞。所述细胞被CFSE染色，并且每孔加入总共100,000个T细胞（单独CD4⁺T细胞，单独CD8⁺T细胞，或者等量的CD4⁺和CD8⁺T细胞）。使孔内体积达到200μl，然后进行MLR。

因此，在一个实施方式中，本发明提供抑制免疫反应的方法，包括使多个免疫细胞与多个羊膜来源的贴壁细胞一段时间，足以使所述的羊膜来源的贴壁细胞在混合淋巴细胞反应（MLR）试验或者回归试验中可检测地抑制T细胞增殖。在一个实施方式中，用于MLR的所述羊膜来源的贴壁细胞代表来自更大群羊膜来源的贴壁细胞的羊膜来源的贴壁细胞样品或者等份。

从不同的胎盘或者相同胎盘的不同组织获得的羊膜来源的贴壁细胞群，在其调节免疫细胞活性的能力方面可能不同，例如其在抑制T细胞活性或者增殖或者NK细胞活性方面的能力不同。因此在使用之前确定羊膜来源的贴壁细胞的特定群的免疫抑制能力是合乎需要的。这种能力可以例如通过在MLR或者回归试验中测试羊膜来源的细胞群样品确定。在一个实施方式中，MLR用于测试所述样品，确定测试中由于羊膜来源的贴壁细胞的免疫抑制程度，那么所述的免疫抑制程度可归因于羊膜来源的细胞群制备的样品。因此，所述的MLR可用作一种确定羊膜来源的贴壁细胞的特定细胞群抑制免疫功能的绝对和相对能力的方法。所述MLR的参数可以不同，以提供更多数据或者最好地确定羊膜来源的贴壁细胞样品免疫抑制的能力。例如，因为在分析中羊膜来源的贴壁细胞的免疫抑制视乎与羊膜来源的贴壁细胞的数量大致呈比例增加，在一个实施方式中，所述的MLR可用两个或多个羊膜来源的贴壁细胞进行，例如，1x10³、3x10³、1x10⁴和/或3x10⁴个羊膜来源的贴壁细胞每反应。分析中与T细胞的数量有关的羊膜来源的贴壁细胞的数量也可改变。例如，虽然可以使用相对更多数量的羊膜来源的贴壁细胞或者T细胞，分析中羊膜来源的贴壁细胞和T细胞可以例如大约100:1到大约1:100的任意比例存在，优选大约1:5。

回归试验或者BTR试验可以相似的方式应用。

因此，本发明提供使用羊膜来源的贴壁细胞在体内调节一种或者多种类型免疫细胞的免疫反应或者活性的方法，例如，由CNS损伤（例如，脊髓损伤或者外伤性脑损伤）引起或者与之相关的免疫反应。羊膜来源的贴壁细胞和免疫细胞可以例如在接受多个羊膜来源的贴壁细胞的个体中接触。其中所述接触在个体中进行，在一个实施方式中，对于所述个体来说所述接触是在外源羊膜来源的贴壁细胞（即，羊膜来源的贴壁细胞不是来自于该个体或者该个体相关的羊膜）和内源多个免疫细胞之间。在具体的实施方式中，个体内的免疫细胞是CD3⁺T细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞和/或NK细胞。

相对于所述个体中已知或者预计的免疫细胞（例如T细胞）数量，羊膜来源的贴壁细胞可以按从大约10:1到大约1:10，优选大约1:5的比例向所述个体给药。然而，多个羊膜来源的贴壁细胞可以按（在非限制实施例中）大约10,000:1，大约1,000:1，大约100:1，大约10:1，大约1:1，大约1:10，大约1:100，大约1:1,000或者大约1:10,000的比例向所述的个体施用。通常，大约1x10⁵到大约1x10⁸个羊膜来源的贴壁细胞每接受者千克体重，优选是大约1x10⁶到大约1x10⁷个羊膜来源的贴壁细胞每接受者千克体重可被施用以产生免疫抑制作用。在各种实施方式中，向所述的个体或者受试者施用的多个羊膜来源的贴壁细胞包括至少大约或者不超过1x10⁵、3x10⁵、1x10⁶、3x10⁶、1x10⁷、3x10⁷、1x10⁸、3x10⁸、1x10⁹、3X10⁹个羊膜来源的贴壁细胞，或者更多。

所述的羊膜来源的贴壁细胞也可与一种或多种第二类干细胞（例如来自骨髓的间质干细胞）一起给药。这种第二类干细胞可以与羊膜来源的贴壁细胞按例如大约1:10到大约10:1的比例施用给个体。

为了便于使所述的羊膜来源的贴壁细胞和体内免疫细胞接触或者接近，所述的羊膜来源的贴壁细胞可以通过任何能有效使所述的羊膜来源的贴壁细胞和免疫细胞彼此接触的途径向所述个体给药。例如，羊膜来源的贴壁细胞可以通过例如静脉内、肌内、腹腔内、眼内、肠道外、鞘内，或者直接进入器官（例如，胰）向所述的个体给药。对于体内给药来说，所述的羊膜来源的贴壁细胞可以配制成药物组合物，如下文第5.8.1节所述。

免疫抑制的方法还可包括加入一种或多种免疫抑制剂，尤其是在体内的情形下。在一个实施方式中，多个羊膜来源的贴壁细胞在个体中与体内多个免疫细胞接触，并且包括一种免疫抑制剂的组合物被施用给所述的个体。免疫抑制剂在本领域是众所周知的并且包括例如抗-T细胞受体抗体（单克隆或者多克隆，或者抗体片段或者其衍生物），抗-IL-2受体抗体（例如，巴利昔单抗（

）或者达利珠单抗（ZENAPAX）

），抗T细胞受体抗体（例如，莫罗单抗-CD3），硫唑嘌呤，皮质类固醇，环孢菌素，他克莫司，霉酚酸酯，西罗莫司，神经钙调蛋白抑制剂等等。在一个具体实施方式中，所述的免疫抑制剂对巨噬细胞炎症蛋白（MIP）-1α或者MIP-1β的一种中和抗体。优选地，抗-MIP-1α或者MIP-1β抗体以足以引起所述个体中MIP-1α和/或MIP-1β的数量可检测地减少的量给药。

除了抑制T细胞增殖外，羊膜来源的贴壁细胞对免疫系统的细胞具有其它抗炎作用，其在治疗CNS损伤（例如，脊髓损伤或者外伤性脑损伤）中可能是有利的。例如，羊膜来源的贴壁细胞（例如在体外或者在体内）当施用于所述的个体时降低Th1和/或Th17T细胞亚群介导的免疫反应。另一方面，本发明提供在体内或者体外抑制促炎症反应（例如，Th1反应或者Th17反应）的方法，包括使T细胞（例如，CD4⁺T淋巴细胞或者白细胞）与羊膜来源的贴壁细胞（即，本发明所述的羊膜来源的贴壁细胞）接触。在一个具体实施方式中，所述的接触可检测地降低Th1细胞成熟。在该方法的具体实施方式中，所述的接触通过所述的T细胞或者通过抗原产生细胞可检测地降低一种或多种淋巴毒素-1α（LT-1α）、白介素1β（IL-1β）、IL-12、IL-17、IL-21、IL-23、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和/或γ干扰素（IFN-γ）的产生。在该方法的另一个具体实施方式中，所述的接触增强或者上调调节T细胞（Treg）表现型和/或降低树突细胞（DC）和/或巨噬细胞的生物分子（例如，CD80、CD83、CD86，ICAM-1，HLA-II）表达，所述生物分子促进Th1和/或Th17反应。在一个具体实施方式中，所述的T细胞也与IL-10接触，例如，外源IL-10或者不由所述的T细胞产生的IL-10，例如，重组IL-10。

在另一个实施方式中，本发明提供降低巨噬细胞产生促炎症因子的方法，包括使巨噬细胞与有效量的羊膜来源的贴壁细胞接触。在另一个实施方式中，本发明提供增加耐受性细胞数量，提高免疫细胞的耐受性功能和/或上调耐受性细胞因子（例如，来自巨噬细胞）的方法，包括使免疫系统细胞与有效量的羊膜来源的贴壁细胞接触。在一个具体实施方式中，与不接触所述的羊膜来源的贴壁细胞的活化巨噬细胞相比，所述的接触引起活化巨噬细胞可检测地产生更多IL10。在另一个实施方式中，本发明提供上调或者增加抗炎症T细胞数量的方法，包括使免疫系统细胞与有效量的羊膜来源的贴壁细胞接触。

在一个实施方式中，本发明提供抑制患有或者遭受CNS损伤（例如，脊髓损伤或者外伤性脑损伤）的一种症状的个体的Th1反应的方法，包括向所述的个体施用有效量的羊膜来源的贴壁细胞，其中所述的有效量是导致所述个体中Th1反应可检测地减少的数量。在另一个实施方式中，本发明提供抑制患有或者遭受CNS损伤反应（例如，脊髓损伤或者外伤性脑损伤）的一种症状的个体的Th17反应的方法，包括向所述的个体施用有效量的羊膜来源的贴壁细胞，其中所述的有效量是导致所述个体中Th17反应可检测地减少的数量。在这些方法的具体实施方式中，所述的给药通过所述个体中的T细胞或者抗原呈递细胞可检测地降低IL-1β、IL-12、IL-17、IL-21、IL-23、TNFα和/或IFNγ中的一种或多种的产生。在此方法的另一个具体实施方式中，所述的接触增强或者上调调节T细胞（Treg）表现型，或者调节所述个体中树突细胞（DC）和/或巨噬细胞产生标记物，其促进Th1或者Th17反应。在另一个具体实施方式中，该方法包括向所述个体另外施用IL-10。

另一方面，本发明提供如本发明所述的羊膜来源的贴壁细胞，其已经进行基因工程而表达一种或多种抗炎症细胞因子。在一个具体实施方式中，所述的抗炎症细胞因子包括IL-10。

5.3羊膜来源的贴壁细胞

通常，羊膜来源的贴壁细胞在表观上与成纤维细胞或间质细胞有些相似，其具有大致为成纤维样的形状。该细胞附着于细胞培养物表面，例如，组织培养塑料。在本发明公开的任何AMDAC的某些实施方式中，所述细胞是人类细胞。

本发明提供的AMDAC展示出将其区别于其它羊膜来源或胎盘来源的细胞的细胞标记物。在本发明所述的AMDAC的每个实施例的某些实施方式中，AMDAC是分离的。

在一个实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞经RT-PCR测定是OCT-4^–（八聚体结合蛋白4）。在另一个具体实施方式中，例如经免疫定位（例如，流式细胞术）测定OCT-4^–羊膜来源的贴壁细胞是CD49f⁺。在另一个具体实施方式中，经RT-PCR测定所述的OCT-4^–细胞是HLA-G^–。在另一个具体实施方式中，经免疫定位（例如，流式细胞术）测定，所述的OCT-4^–细胞是VEGFR1/Flt-1⁺（血管内皮生长因子受体1）和/或VEGFR2/KDR⁺（血管内皮生长因子受体2）。在一个具体实施方式中，与相同数量的NTERA-2细胞和RNA扩增循环相比，OCT-4^–羊膜来源贴壁细胞经例如20个循环少表达至少2log的PCR扩增的OCT-4mRNA。在另一个具体实施方式中，例如经免疫定位（例如，流式细胞术）测定，所述的OCT-4^–细胞是CD90⁺、CD105⁺或者CD117^–。在一个更具体的实施方式中，经免疫定位（例如，流式细胞术），所述的OCT-4^–细胞是CD90⁺、CD105⁺和CD117^–。在一个更具体的实施方式中，例如经免疫定位（例如，流式细胞术）测定，所述细胞是OCT-4^–或者HLA-G^–，并且还是CD49f⁺、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–。在一个更具体的实施方式中，例如经免疫定位（例如，流式细胞术）测定，所述细胞是OCT-4^–、HLA-G^–、CD49f⁺、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–。在另一个具体实施方式中，例如经RT-PCR进行30个循环测定，所述OCT-4^–细胞不表达SOX2。因此，在一个具体实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞经免疫定位（例如，流式细胞术）测定是OCT-4^–、CD49f⁺、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–，并且经RT-PCR进行例如30个循环测定是SOX2^–。

在一个具体实施方式中，本发明所述的AMDAC通过例如短期神经分化试验（参见，例如下文第5.12.1节）是GFAP⁺。在另一个具体实施方式中，AMDAC通过例如短期神经分化试验（参见，例如下文第5.12.1节）是β-微管蛋白III（Tuj1）⁺。在另一个具体实施方式中，所述AMDAC是OCT-4^–、GFAP⁺和β-微管蛋白III（Tuj1）⁺。在另一个具体实施方式中，所述AMDAC是OCT-4^–、CD200⁺、CD105⁺，和CD49f⁺。在另一个具体实施方式中，所述AMDAC是CD200⁺、CD105⁺、CD90⁺和CD73⁺。在另一个具体实施方式中，本发明所述的AMDAC和/或AMDAC细胞群是CD117^–并且不经CD117抗体筛选。在另一个具体实施方式中，本发明所述的AMDAC和/或AMDAC细胞群是CD146^–并且不经CD146抗体筛选。在另一个具体实施方式中，本发明所述的AMDAC经RT-PCR和/或免疫定位（例如，流式细胞术）测定是OCT-4^–，并且用VEGF诱导后经RT-PCR和/或免疫定位（例如，流式细胞术）测定不表达CD34。在另一个具体实施方式中，本发明所述的AMDAC通过短期神经分化试验（参见，例如下文第5.12.1节）是神经源性的。在另一个具体实施方式中，本发明所述的AMDAC通过体外软骨潜能分析（参见，例如下文第5.12.3节）测定是非软骨形成的。在另一个具体实施方式中，本发明所述的AMDAC通过成骨表型分析（参见，例如下文第5.12.2节）测定是非成骨性的。在另一个具体实施方式中，在培养最高达6周（例如，2周、4周、或者6周）以后本发明所述的AMDAC是非成骨性，所述培养在DMEM中在pH值7.4（高糖）中进行，随时补充100nM地塞米松，10mMβ-甘油磷酸酯，50μML-抗坏血酸-2-磷酸酯，其中骨生成用冯库萨染色法；茜素红染色法；或者通过例如RT-PCR检测骨桥蛋白、骨钙蛋白、骨粘连蛋白和/或骨唾液蛋白的存在进行评价。

在另一个实施方式中，例如通过免疫定位（例如流式细胞术测定，所述的OCT-4^–细胞是CD29⁺、CD73⁺，ABC-p⁺和CD38^–中的一种或多种。

在另一个具体的实施方式中，例如，OCT-4^–AMDAC例如经免疫定位（例如，流式细胞术）测定可能还是CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD98⁺、TEM-7⁺（肿瘤内皮标记物7）、CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–、CD143^–（血管紧张素I转化酶，ACE）、CD146^–（黑色素瘤细胞粘附分子），或者CXCR4^–（趋化因子（C-X-C模序）受体4）中的一种或多种，或者经RT-PCR测定是HLA-G^–。在一个更具体的实施方式中，所述的细胞例如，经免疫定位（例如，流式细胞术）测定是CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD98⁺、Tie-2⁺、TEM-7⁺、CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–、CD143^–、CD146^–和CXCR4^–，并且经RT-PCR测定是HLA-G^–。在另一个实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞例如经免疫定位（例如，流式细胞术）测定是CD31^–、CD34^–、CD45^–、和/或CD133^–中的一种或多种。在一个具体实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞经RT-PCR测定是OCT-4^–；经免疫定位（例如，流式细胞术）测定是VEGFR1/Flt-1⁺和/或VEGFR2/KDR⁺；并且例如经免疫定位（例如，流式细胞术）测定是CD31^–、CD34^–、CD45^–、和/或CD133^–中的一种或多种或全部。

在另一个具体实施方式中，所述AMDAC经免疫定位（例如，流式细胞术）测定还是VE-钙粘蛋白^–。在另一个具体实施方式中，单独或者与其它标记物结合，所述的OCT-4^–细胞经免疫定位（例如，流式细胞术）测定还是CD105⁺和CD200⁺。在另一个具体实施方式中，经免疫定位（例如，流式细胞术）检测，所述细胞在暴露于1到100ng/mL VEGF中4到21天后不表达CD34。在更具体的实施方式中，经免疫定位（例如，流式细胞术）检测，所述细胞在暴露于25到75ng/mL VEGF中4到21天后，或者暴露于50ng/mL VEGF中4到21天后不表达CD34。在更具体的实施方式中，经免疫定位（例如，流式细胞术）检测，所述细胞在暴露于1、2.5、5、10、25、50、75或者100ng/mL VEGF中4到21天后不表达CD34。在更具体的实施方式中，所述细胞在暴露于1到100ng/mL VEGF中7到14天（例如7天）不表达CD34。

在具体的实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞经RT-PCR测定是OCT-4^–，和经免疫定位（例如，流式细胞术）测定是VE-钙粘蛋白^–、VEGFR2/KDR⁺、CD9⁺、CD54⁺、CD105⁺和/或CD200⁺中的一种或多种。在一个具体实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞经RT-PCR测定是OCT-4^–，和经免疫定位（例如，流式细胞术）测定是VE-钙粘蛋白^–、VEGFR2/KDR⁺、CD9⁺、CD54⁺、CD105⁺和/或CD200⁺。在另一个具体实施方式中，经免疫定位（例如，流式细胞术）检测，所述细胞例如在暴露于1到100ng/mL VEGF中4到21天之后不表达CD34。

在另一个实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞是OCT-4^–、CD49f⁺，HLA-G^–、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–。在一个更具体的实施方式中，所述的细胞经免疫定位（例如，流式细胞术）测定是CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD98⁺、Tie-2⁺、TEM-7⁺、CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–、CD143^–、CD146^–、或者CXCR4^–中的一种或多种。在更具体的实施方式中，所述的细胞经免疫定位（例如，流式细胞术）测定是CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD98⁺、Tie-2⁺、TEM-7⁺、CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–、CD143^–、CD146^–和CXCR4^–。在另一具体的实施方式中，所述的细胞经免疫定位（例如，流式细胞术）测定还是VEGFR1/Flt-1⁺和/或VEGFR2/KDR⁺；并且经免疫定位（例如，流式细胞术）测定是CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–、和/或Tie-2^–中的一种或多种。在另一个具体实施方式中，所述细胞经免疫定位（例如，流式细胞术）测定还是VEGFR1/Flt-1⁺、VEGFR2/KDR⁺、CD31–、CD34^–、CD45^–、CD133^–和Tie-2。

在另一个实施方式中，OCT-4^–羊膜来源的贴壁细胞还是CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD49f⁺、CD54⁺、CD90⁺、CD98⁺、CD105⁺、CD200⁺、Tie-2⁺、TEM-7⁺、VEGFR1/Flt-1⁺、和/或VEGFR2/KDR⁺（CD309⁺）中的一种或多种或全部；或者经免疫定位（例如，流式细胞术）测定还是CD31^–、CD34^–、CD38^–、CD45^–、CD117^–、CD133^–、CD143^–、CD144^–、CD146^–、CD271^–、CXCR4^–、HLA-G^–、和/或VE-钙粘蛋白^–中的一种或多种或全部，或者经RT-PCR测定还是SOX2^–。

在某些实施方式中，分离的组织培养塑料粘附的羊膜来源的贴壁细胞是CD49f⁺。在一个具体实施方式中，所述的CD49f⁺细胞经免疫定位（例如，流式细胞术）测定还是CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD90⁺、CD98⁺、CD105⁺、CD200⁺、Tie-2⁺、TEM-7⁺、VEGFR1/Flt-1⁺和/或VEGFR2/KDR⁺（CD309⁺）中的一种或多种或全部；或者经免疫定位（例如，流式细胞术）测定还是CD31^–、CD34^–、CD38^–、CD45^–、CD117^–、CD133^–、CD143^–、CD144^–、CD146^–、CD271^–、CXCR4^–、HLA-G^–、OCT-4^–和/或VE-钙粘蛋白^–中的一种或多种或全部，或者经RT-PCR测定是SOX2^–。

在某些其它实施方式中，分离的组织培养塑料粘附的羊膜来源的贴壁细胞是HLA-G^–、CD90⁺和CD117^–。在具体的实施方式中，所述的HLA-G^–、CD90⁺和CD117^–细胞经免疫定位（例如，流式细胞术）测定还是CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD49f⁺、CD54⁺、CD98⁺、CD105⁺、CD200⁺、Tie-2⁺、TEM-7⁺、VEGFR1/Flt-1⁺和/或VEGFR2/KDR⁺（CD309⁺）中的一种或多种或全部；或者经免疫定位（例如，流式细胞术）测定是CD31^–、CD34^–、CD38^–、CD45^–、CD133^–、CD143^–、CD144^–、CD146^–、CD271^–、CXCR4^–、OCT-4^–和/或VE-钙粘蛋白^–中的另外一种或多种或全部；或者经RT-PCR测定是SOX2^–。

在另一个实施方式中，分离的羊膜来源的贴壁细胞经RT-PCR例如在标准培养条件下30个循环测定，不组成性表达以下的mRNA：促血管生成素4（ANGPT4），促血管生成素样蛋白3（ANGPTL3），2型钙粘蛋白5（CDH5），骨γ-羧基谷氨酸（gla）蛋白（BGLAP），CD31，CD34，趋化因子（C-X-C模序）配体10（CXCL10），远端缺失的同源框5（DLX5），血纤维蛋白α链（FGA），成纤维细胞生长因子4（FGF4），FMS－样酪氨酸激酶3（FLT3），HLA-G，干扰素γ（IFNG），白细胞来源的趋化因子1（LECT1），瘦素（LEP），基质金属蛋白酶13（MMP-13），NANOG，巢蛋白，血纤维蛋白溶酶原（PLG），POU5F1（OCT-4），催乳素（PRL），前动力蛋白1（PROK1），（性别决定区Y）-逻辑框2（SOX2），端粒酶逆转录酶（TERT），腱调蛋白（TNMD），和/或胞外连结域1（XLKD1）。

在其它实施方式中，分离的羊膜来源的贴壁细胞或者羊膜来源的贴壁细胞群表达以下的mRNA：ARNT2，神经生长因子（NGF），脑源性神经营养因子（BDNF），胶质源性神经营养因子（GDNF），神经营养因子3（NT-3），NT-5，缺氧诱导因子-1α（HIF1A），缺氧诱导蛋白2（HIG2），血红素加氧酶（去环化）1（HMOX1），细胞外超氧化物歧化酶[Cu－Zn]（SOD3），过氧化氢酶，转化生长因子β1（TGFB1），转化生长因子β1受体（TGFB1R），以及肝细胞生长因子受体（HGFR/c-met）

另一方面，本发明提供分离的细胞群，例如，分离的羊膜细胞群或者胎盘细胞群，或者基本上分离的AMDAC群，包括本发明所述羊膜来源的贴壁细胞。所述的细胞群可以是同质细胞群，例如，细胞群的至少大约90%，95%，98%或者99%是羊膜来源的贴壁细胞。所述的细胞群可以是异质的，例如，所述的细胞群最多大约10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%或者80%的群细胞是羊膜来源的贴壁细胞。然而，分离的所述细胞群不是组织（即羊膜）。

在一个实施方式中，本发明提供包括AMDAC的分离的细胞群，例如，基本上单一来源的AMDAC的细胞群，或者关于所述AMDAC是混合来源的细胞群，其中所述的AMDAC附着于组织培养塑料，并且其中所述的AMDAC经RT-PCR测定是OCT-4^–。在一个具体实施方式中，所述的AMDAC例如经免疫定位（例如，流式细胞术）或者RT-PCR测定是CD49f⁺或者HLA-G^–。在另一个具体实施方式中，在所述细胞群中的所述AMDAC经免疫定位（例如，流式细胞术）测定是VEGFR1/Flt-1⁺和/或VEGFR2/KDR⁺，其中所述的分离的细胞群不是羊膜或者羊膜的膜或者其它组织。在一个更具体的实施方式中，所述细胞群中的AMDAC经RT-PCR测定是OCT-4^–、和/或HLA-G^–，并且经免疫定位（例如，流式细胞术）测定是VEGFR1/Flt-1⁺和/或VEGFR2/KDR⁺。在另一个具体实施方式中，所述AMDAC是CD90⁺、CD105⁺或者CD117^–。在一个更具体的实施方式中，所述AMDAC是CD90⁺、CD105⁺和CD117^–。在一个更具体的实施方式中，所述AMDAC是OCT-4^–、CD49f⁺、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–。在另一个具体实施方式中，例如经RT-PCR30个循环测定，AMDAC不表达SOX2。在一个更具体实施方式中，所述群包括AMDAC，其中所述的AMDAC经免疫定位（例如，流式细胞术）测定是OCT-4^–、HLA-G^–、CD49f⁺、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–，并且例如经RT-PCR测定30个循环不表达SOX2^–。

在另一个具体实施方式中，所述细胞群中的所述AMDAC经免疫定位（例如，流式细胞术）测定是CD90⁺、CD105⁺或者CD117^–。在一个更具体的实施方式中，所述AMDAC经免疫定位（例如，流式细胞术）测定是CD90⁺、CD105⁺和CD117^–。在一个更具体的实施方式中，所述AMDAC例如经RT-PCR测定是OCT-4^–或者HLA-G，并且经免疫定位（例如，流式细胞术）测定还是CD49f⁺、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–。在一个更具体的实施方式中，所述细胞群中的AMDAC是OCT-4^–、HLA-G^–、CD49f⁺、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–。在另一个具体实施方式中，所述AMDAC例如经RT-PCR30个循环测定不表达SOX2。在一个更具体的实施方式中，因此，所述AMDAC经免疫定位（例如，流式细胞术）测定是OCT-4^–、CD49f⁺、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–，并且经RT-PCR测定例如30循环是SOX2^–。在一个更具体实施方式中，所述AMDAC是OCT-4^–或者HLA-G^–，并且还是CD49f⁺、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–。在一个更具体的实施方式中，所述AMDAC是OCT-4^–、HLA-G^–、CD49f⁺、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–。

在另一个实施方式中，所述的细胞群中的羊膜来源的贴壁细胞附着于组织培养塑料，经RT-PCR测定是OCT-4^–，并且经免疫定位（例如，流式细胞术）测定是VEGFR1/Flt-1⁺和/或VEGFR2/KDR⁺，并且经免疫定位（例如，流式细胞术）测定还是CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD98⁺、Tie-2⁺、TEM-7⁺、CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–、CD143^–、CD146^–、或者CXCR4^–中的一种或多种，或者经RT-PCR测定是HLA-G^–，并且其中所述的分离的细胞群不是羊膜。在另一个实施方式中，本发明提供包括羊膜来源的贴壁细胞的分离的细胞群，其中所述细胞附着于组织培养塑料，其中所述细胞经RT-PCR测定是OCT-4^–，并且经免疫定位（例如，流式细胞术）测定还是VEGFR1/Flt-1⁺和/或VEGFR2/KDR⁺，其中在4到21天暴露于1到100ng/mL VEGF之后，所述细胞经免疫定位（例如，流式细胞术）测定不表达CD34，并且其中所述分离的细胞群不是羊膜。

在任何上述实施方式的一个具体实施方式中，所述细胞群中至少大约50%，60%，70%，80%，90%，95%，98%或者99%的所述细胞是所述的羊膜来源的贴壁细胞，其通过如上所述的细胞标记物的任意组合描述或者表征。

在另一个实施方式中，任何上述的细胞群包括羊膜来源的贴壁细胞，当在细胞外基质蛋白（例如胶原蛋白I型和IV型）或者血管生成因子（例如血管内皮生长因子（VEGF）、上皮生长因子（EGF）、血小板源性生长因子（PDGF）或者碱性成纤维细胞生长因子（bFGF））存在下，在例如胎盘胶原蛋白或者MATRIGEL^TM的底物中培养至少4天和最多达14天，其形成芽或者管状结构。

在某些实施方式中，本发明提供一种表达下列一种或者多种或者全部RNA的细胞或者细胞群，其中所述分离的细胞群中至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或者98%的细胞是羊膜来源的贴壁细胞：ACTA2（肌动蛋白，α2，平滑肌，主动脉）、ACTC1（肌动蛋白，α心肌1）、ADAMTS1（ADAM金属肽酶血小板反应蛋白I型模序1）、AMOT（血管动蛋白）、ANG（血管生成素）、ANGPT1（促血管生成素1）、ANGPT2、ANGPTL1（促血管生成素样1）、ANGPTL2、ANGPTL4、BAI1（大脑特异性血管生成抑制剂1）、c-myc、CD44、CD140a、CD140b、CD200、CD202b、CD304、CD309、CEACAM1（癌胚抗原相关的细胞粘附分子1）、CHGA（嗜铬粒蛋白A）、COL15A1（胶原蛋白，XV型，α1）、COL18A1（胶原蛋白，XVIII型，α1），COL4A1（胶原蛋白，IV型，α1）、COL4A2（胶原蛋白，IV型，α2）、COL4A3（胶原蛋白，IV型，α3）、连接蛋白-43、CSF3（集落刺激因子3（粒细胞），CTGF（结缔组织生长因子），CXCL12（趋化因子（CXC模序）配体12（基质细胞来源的因子1））、CXCL2、DNMT3B（DNA(胞嘧啶-5-)-甲基转移酶3β）、ECGF1（胸苷磷酸化酶）、EDG1（内皮细胞分化基因1）、EDIL3，（EGF样重复区和盘状结构I样模序3）、ENPP2（外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶2）、EPHB2（EPH受体B2）、FBLN5（FIBULIN5）、F2（凝血因子II（凝血酶））、FGF1（酸性成纤维细胞生长因子）、FGF2（碱性成纤维细胞生长因子）、FIGF（c-fos诱导的生长因子（血管内皮生长因子D））、FLT4（fms相关的酪氨酸激酶4）、FN1（纤维连接蛋白1）、FST（卵泡抑素）、FOXC2（叉头框C2（MFH-1，间质叉头1））、卵泡抑素、半乳糖凝集素-1、GRN（颗粒体蛋白）、HGF（肝细胞生长因子）、HEY1（YRPW相关多毛/增强子断裂1）、HSPG2（硫酸乙酰肝素蛋白多糖2）、IFNB1（干扰素，β1，成纤维细胞）、IL8（白介素8）、IL12A、ITGA4（整合素，α4；CD49d）、ITGAV（整合素，αV）、ITGB3（整合素，β3）、KLF4（Kruppel样因子4）、MDK（中期因子）、MMP2（基质金属蛋白酶2）、MYOZ2（myozenin2）、NRP2（神经毡蛋白2）、PDGFB（血小板源性生长因子β）、PF4（血小板因子4）、PGK1（磷酸甘油酸激酶1）、PROX1（prospero同源框1）、PTN（多效因子）、SEMA3F（semophorin3F）、SERPINB5（丝氨酸蛋白酶抑制蛋白肽酶抑制剂，分支乙（卵清蛋白），成员5）、SERPINC1、SERPINF1、TIMP2（金属蛋白酶2组织抑制剂）、TIMP3、TGFA（转化生长因子，α）、TGFB1、THBS1（血小板反应蛋白1）、THBS2、TIE1（具有免疫球蛋白样和EGF样模序1的酪氨酸激酶）、TNF（肿瘤坏死因子）、TNNC1（肌钙蛋白C，类型1）、TNNT2，TNFSF15（肿瘤坏死因子（配体）超家族，成员15）、VASH1（血管抑制蛋白1）、VEGF（血管内皮生长因子）、VEGFB、VEGFC和/或VEGFR1/FLT1（血管内皮生长因子受体1）。

当使用人类细胞时，基因名称全部指人类序列，并且，如本领域技术人员众所周知，代表性序列可在文献例如GenBank中找到。序列的探针可以通过序列确定，所述序列是公开可获得的序列或者通过商业资源，例如，具体的

探针或者

血管生成阵列（应用生物系统，NO.4378710部分）。

在某些实施方式中，本发明提供一种表达下列的细胞或者细胞群，其中所述分离的细胞群中至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或者98%的细胞是羊膜来源的贴壁细胞：CD49d、连接蛋白-43、HLA-ABC、β2-小球蛋白、CD349、CD318、PDL1、CD106、半乳糖凝集素-1、ADAM17前体（去整合素和金属蛋白酶结构域17）（TNF-α转化酶）（TNF-α转化酶）、血管紧张素原前体、细丝蛋白（α细丝蛋白）（细丝蛋白1）（内皮细胞肌动蛋白结合蛋白）（ABP-280）（非肌肉细丝蛋白）、α-辅肌动蛋白1（α-辅肌动蛋白细胞骨架亚型）（非肌肉α-辅肌动蛋白1）（F-肌动蛋白交联蛋白）、低密度脂蛋白受体相关蛋白2前体（巨蛋白）（糖蛋330）（gp330）、巨噬细胞清除受体I和II型（巨噬细胞乙酰化LDL受体I和II）、辅肌动蛋白受体IIB型前体（ACTRIIB）、Wnt-9蛋白、胶质原纤维酸性蛋白、星形细胞（GFAP）、肌球蛋白结合蛋白C、心肌类型（心肌MyBP－C）（C－蛋白，心肌亚型）、肌球蛋白重链、非肌肉型A（细胞肌球蛋白重链，A型）（非肌肉肌球蛋白重链A）（NMMHCA）、VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、卵泡抑素、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR、miR-173p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、miRNA簇17-92的成员、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b，和/或miR-16。

在一个实施方式中，本发明提供分离的羊膜来源的贴壁细胞，其中所述细胞附着于组织培养塑料，其中所述细胞经RT-PCR测定是OCT-4^–，并且经免疫定位（例如，流式细胞术）测定是CD49f⁺，HLA-GCD90⁺、CD105⁺和CD117^–，并且其中所述细胞：（a）经免疫定位（例如，流式细胞术）测定表达CD9、CD10、CD44、CD54、CD98、CD200、Tie-2、TEM-7、VEGFR1/Flt-1或者VEGFR2/KDR（CD309）的一种或多种；（b）经免疫定位（例如，流式细胞术）测定不表达CD31、CD34、CD38、CD45、CD133、CD143、CD144、CD146、CD271、CXCR4、HLA-G或VE-钙粘蛋白；（c）经RT-PCR测定不表达SOX2；（d）表达ACTA2、ADAMTS1、AMOT、ANG、ANGPT1、ANGPT2、ANGPTL1、ANGPTL2、ANGPTL4、BAI1、c-myc、CD44、CD140a、CD140b、CD200、CD202b、CD304、CD309、CEACAM1、CHGA、COL15A1、COL18A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、连接蛋白-3、CSF3、CTGF、CXCL12、CXCL2、DNMT3B、ECGF1、EDG1、EDIL3、ENPP2、EPHB2、FBLN5、F2、FGF1、FGF2、FIGF、FLT4、FN1、FST、FOXC2、半乳糖凝集素-1、GRN、HGF、HEY1、HSPG2、IFNB1、IL8、IL12A、ITGA4、ITGAV、ITGB3、KLF-4、MDK、MMP2、MYOZ2、NRP2、PDGFB、PF4、PGK1、PROX1、PTN、SEMA3F、SERPINB5、SERPINC1、SERPINF1、TGFA、TGFB1、THBS1、THBS2、TIE1、TIMP2、TIMP3、TNF、TNNC1、TNNT2、TNFSF15、VASH1、VEGF、VEGFB、VEGFC或者VEGFR1/FLT1的mRNA；（e）表达CD49d、连接蛋白-43、HLA-ABC、β2-小球蛋白、CD349、CD318、PDL1、CD106、半乳糖凝集素-1、ADAM17、血管紧张素原前体、细丝蛋白A、α-辅肌动蛋白1、巨蛋白、巨噬细胞乙酰化LDL受体I和II、辅肌动蛋白受体IIB型前体、Wnt-9蛋白质、胶质细胞原纤维酸性蛋白、星形细胞、肌球蛋白结合蛋白C，或者肌球蛋白重链、非肌肉A型中的一种或多种蛋白质；（f）分泌VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、卵泡抑素、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR或者半乳糖凝集素-1进入细胞生长的培养基；（g）与相同数量的骨髓来源的间质干细胞相比以更高的水平表达微RNAs：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92或miR-296；（h）与相同数量的骨髓来源的间质干细胞相比以更低水平表达微RNAs miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b或者miR-16；（i）表达miRNAs miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b，或者miR-16；和/或（j）与在21%O₂下表达CD202b、IL-8或者VEGF相比，当在低于大约5%O₂中培养时表达增加水平的CD202b、IL-8或者VEGF。在一个具体实施方式中，所述分离的羊膜来源的贴壁细胞经RT-PCR测定是OCT-4^–，并且经免疫定位（例如，流式细胞术）测定是CD49f⁺、HLA-G^–、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–，并且：（a）经免疫定位（例如，流式细胞术）测定表达CD9、CD10、CD44、CD54、CD90、CD98、CD200、Tie-2、TEM-7、VEGFR1/Flt-1或者VEGFR2/KDR（CD309）；（b）经免疫定位（例如，流式细胞术）测定不表达CD31、CD34、CD38、CD45、CD133、CD143、CD144、CD146、CD271、CXCR4、HLA-G和VE-钙粘蛋白；（c）经RT-PCR测定不表达SOX2；（d）经RT-PCR测定表达以下mRNA：ACTA2、ADAMTS1、AMOT、ANG、ANGPT1、ANGPT2、ANGPTL1、ANGPTL2、ANGPTL4、BAI1、c-myc、CD44、CD140a、CD140b、CD200、CD202b、CD304、CD309、CEACAM1、CHGA、COL15A1、COL18A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、连接蛋白-3、CSF3、CTGF、CXCL12、CXCL2、DNMT3B、ECGF1、EDG1、EDIL3、ENPP2、EPHB2、FBLN5、F2、FGF1、FGF2、FIGF、FLT4、FN1、FST、FOXC2、半乳糖凝集素-1、GRN、HGF、HEY1、HSPG2、IFNB1、IL8、IL12A、ITGA4、ITGAV、ITGB3、KLF-4、MDK、MMP2、MYOZ2、NRP2、PDGFB、PF4、PGK1、PROX1、PTN、SEMA3F、SERPINB5、SERPINC1、SERPINF1、TGFA、TGFB1、THBS1、THBS2、TIE1、TIMP2、TIMP3、TNF、TNNC1、TNNT2、TNFSF15、VASH1、VEGF、VEGFB、VEGFC和/或VEGFR1/FLT1；（e）表达CD49d、连接蛋白-43、HLA-ABC、β2-小球蛋白、CD349、CD318、PDL1、CD106、半乳糖凝集素-1、ADAM17、血管紧张素原前体、细丝蛋白A、α-辅肌动蛋白1、巨蛋白、巨噬细胞乙酰化LDL受体I和II、辅肌动蛋白受体IIB型前体、Wnt-9蛋白质、胶质细胞原纤维酸性蛋白、星形细胞、肌球蛋白结合蛋白C，和/或肌球蛋白重链、非肌肉A型中的一种或多种；（f）分泌VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、卵泡抑素、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR，和/或半乳糖凝集素-1例如进入细胞生长的培养基；（g）与相同数量的骨髓来源的间质干细胞相比以更高的水平表达下列微RNAs：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92和miR-296；（h）与相同数量的骨髓来源的间质干细胞相比以更低水平表达下列微RNAs：miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b，和miR-16；（i）表达下列miRNAs：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b，和miR-16；和/或（i）与当所述细胞在21%O₂下培养时表达CD202b、IL-8和/或VEGF相比，当在低于大约5%O₂中培养时表达增加水平的CD202b、IL-8和VEGF。本发明更进一步地提供包括具有一种或多种上述特征的AMDAC的细胞群，例如AMDAC群。

在另一个实施方式中，任何上述的羊膜来源的贴壁细胞，或者包括羊膜来源的贴壁细胞的细胞群，当在细胞外基质蛋白（例如胶原蛋白I或IV型）和/或一种或多种血管生成因子（例如VEGF、EGF、PDGF或者bFGF）存在下在例如胎盘胶原蛋白或者MATRIGEL^TM的基质上培养时，摄取乙酰化低密度脂蛋白（LDL）。

在另一个实施方式中，所述的AMDAC包括于细胞群中。在这种实施方式的具体实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞附着于组织培养塑料，经RT-PCR测定是OCT-4^–，并且经免疫定位（例如，流式细胞术）测定是VEGFR2/KDR⁺、CD9⁺、CD54⁺、CD105⁺、CD200⁺或者VE-钙粘蛋白^–。在具体的实施方式中，在所述群细胞中至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或者99%的细胞是羊膜来源的贴壁细胞，所述羊膜来源的贴壁细胞经RT-PCR测定是OCT-4^–，并且经免疫定位（例如，流式细胞术）测定是VEGFR2/KDR⁺、CD9⁺、CD54⁺、CD105⁺、CD200⁺或者VE-钙粘蛋白^–。在另一个具体实施方式中，在所述群细胞中至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或者99%的细胞是羊膜来源的贴壁细胞，所述羊膜来源的贴壁细胞经RT-PCR测定是OCT-4^–，并且经免疫定位（例如，流式细胞术）测定是VEGFR2/KDR⁺、CD9⁺、CD54⁺、CD105⁺、CD200⁺和VE-钙粘蛋白^–。在另一个具体实施方式中，所述细胞经RT-PCR测定是OCT-4^–，并且经免疫定位（例如，流式细胞术）测定是VEGFR2/KDR⁺、CD9⁺、CD54⁺、CD105⁺、CD200⁺或者VE-钙粘蛋白^–，在暴露于1到100ng/mL VEGF4到21天之后经免疫定位（例如，流式细胞术）测定不表达CD34。在另一个具体实施方式中，所述的细胞也是VE-钙粘蛋白^–。

在一个具体实施方式中，所述的羊膜来源的贴壁细胞经RT-PCR测定是OCT-4^–，并且经免疫定位（例如，流式细胞术）测定是CD9⁺，VEGFR2/KDR⁺、CD54⁺、CD105⁺、CD200⁺或者VE-钙粘蛋白^–，当所述的细胞群在血管内皮生长因子（VEGF）存在下培养时形成芽或者管状结构。

在适于培养干细胞的培养基中进行原始培养或者在增殖期间，本发明所述的羊膜来源的贴壁细胞显示上述的特征，例如细胞表面标记物和/或基因表达谱的组合。这种培养基包括，例如，包含1至100%DMEM-LG（Gibco）、1至100%MCDB-201（Sigma）、1至10%胎牛血清（FCS）（Hyclone实验室）、0.1至5x胰岛素铁硒传递蛋白（ITS，Sigma）、0.1至5x亚麻酸牛血清白蛋白（LA-BSA，Sigma）、10-5到10^-15M地塞米松（Sigma）、10^-2到10^-10M抗坏血酸-2-磷酸酯（Sigma）、1至50ng/mL表皮生长因子（EGF）（R&D系统）、1至50ng/mL血小板源性生长因子（PDGF-BB）（R&D系统）、以及100U青霉素/1000U链霉素的培养基。在一个具体实施方式中，所述培养基包含60%DMEM-LG（Gibco）、40%MCDB-201（Sigma）、2%胎牛血清（FCS）（Hyclone实验室）、1x胰岛素铁硒传递蛋白（ITS）、1x亚麻酸牛血清白蛋白（LA-BSA）、10^-9M地塞米松（Sigma）、10^-4M抗坏血酸-2-磷酸酯（Sigma）、表皮生长因子（EGF）10ng/毫升（R&D系统）、血小板源性生长因子（PDGF-BB）10ng/毫升（R&D系统）、以及100U青霉素/1000U链霉素。其它合适的培养基如下所述。

本发明提供的分离的羊膜来源的贴壁细胞群例如在一个容器中可包括大约，至少大约，或者最多大约，1x10⁵、5x10⁵、1x10⁶、5x10⁶、1x10⁷、5x10⁷、1x10⁸、5x10⁸、1x10⁹、5x10⁹、1x10¹⁰、5x10¹⁰、1x10¹¹或更多羊膜来源的贴壁细胞。在各实施方式中，在本发明提供的分离的细胞群中至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、或者99%的细胞是羊膜来源的贴壁细胞。即，分离的羊膜来源的贴壁细胞群可包括，例如，多达1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的非AMDAC细胞。在其它具体实施方式中，在包括羊膜来源的贴壁细胞的所述细胞群中至少25%、35%、45%、50%、60%、75%、85%或更多的细胞不是OCT-4^–。

本发明提供的羊膜来源的贴壁细胞可在基质上培养。在各实施方式中，所述基质可以是任何表面，在其上可以完成羊膜来源的贴壁细胞的培养和/或筛选。通常，所述基质是塑料，例如，组织培养皿或者多孔板塑料。组织培养塑料可用生物分子或者合成模拟剂例如CELLSTART^TM、MESENCULT^TMACF－基质，鸟氨酸，或者聚赖氨酸，或者细胞外基质蛋白例如胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维连接蛋白、玻连蛋白等等进行处理，包被或者压印。

本发明提供的羊膜来源的贴壁细胞和这种细胞的群可以从一个或多个胎盘分离。分离的羊膜来源的细胞可以被培养和扩增以产生这种细胞的群。包括羊膜来源的贴壁细胞的细胞群也可被培养和扩增以产生羊膜来源的贴壁细胞群。

在某些实施方式中，显示任何上述标记物和/或基因表达特征的AMDAC已经传代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次，或者更多。在某些其它实施方式中，显示任何上述标记物和/或基因表达特征的AMDAC被倍增培养至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或至少50次，或者更多。

在一个具体实施方式中，本发明所述的AMDAC经RT-PCR和/或TRAP分析法测定是端粒酶^－。在另一个具体实施方式中，本发明所述的AMDAC经RT-PCR例如30个循环测定不表达端粒酶逆转录酶（TERT）的mRNA。在另一个具体实施方式中，本发明所述的AMDAC经RT-PCR测定是NANOG^－。在另一个具体实施方式中，本发明所述的AMDAC经RT-PCR例如30个循环测定不表达NANOG的mRNA。在一个具体实施方式中，本发明所述的AMDAC是（性别决定区Y）-逻辑框2（SOX2）^－。在另一个具体实施方式中，本发明所述的AMDAC经RT-PCR例如30个循环测定不表达SOX2的mRNA。在另一个具体实施方式中，通过成骨表型分析法测定本发明所述的AMDAC不是成骨性的（参见，例如下文第5.12.2节）。在另一个具体实施方式中，通过软骨形成潜能分析测定本发明所述的AMDAC不是软骨形成的（参见，例如下文第5.12.3节）。在另一个具体实施方式中，通过成骨表型分析测定本发明所述的AMDAC不是成骨性的（参见，例如下文第5.12.2节），并且通过软骨形成潜能分析测定不是软骨形成的（参见，例如下文第5.12.3节）。

经RT-PCR测定AMDAC可显示一种或多种本发明所述的特征，如表1中所示。例如，AMDAC当按下文第5.6节中所述进行分离和培养时可显示一种或多种这种特征。

表1

经免疫定位例如流式细胞术测定AMDAC可显示一种或多种本发明所述的特征，如表2中所示。例如，AMDAC当按下文第5.6节中所述进行分离和培养时可显示一种或多种这种特征。

表2

经免疫定位例如免疫荧光法和/或免疫组织化学法测定，AMDAC可显示一种或多种本发明所述的特征，如表3中所示。例如，AMDAC当按下文第5.6节中所述进行分离和培养时可显示一种或多种这种特征。

表3

AMDAC标记物	阳性	阴性

CD31		X
			CD34		X
（VEGFR2/KDR）	X
			联接蛋白-43	X
半乳糖凝集素-1	X
			TEM-7	X

经免疫定位例如膜蛋白质组学测定，AMDAC可显示一种或多种本发明所述的特征，如表4中所示。例如，AMDAC当按下文第5.6节中所述进行分离和培养时可显示一种或多种这种特征。

表4

经分泌蛋白质组分析例如ELISA测定，AMDAC可显示一种或多种本发明所述的特征，如表5中所示。例如，AMDAC当按下文第5.6节中所述进行分离和培养时可显示一种或多种这种特征。

表5

5.4包括其它细胞类型的羊膜来源的贴壁细胞群

包括本发明所述的羊膜来源的贴壁细胞的分离的细胞群可包括第二类细胞，例如，不是羊膜来源的贴壁细胞的胎盘细胞，或者例如不是胎盘细胞的细胞。例如，分离的羊膜来源的贴壁细胞群可包括第二类细胞的群，例如，可与之组合，其中所述的第二类细胞是例如胚胎干细胞，血细胞（例如胎盘血，胎盘血细胞，脐血，脐带血细胞，外周血，外周血细胞，来自胎盘血、脐血或者外周血的有核细胞，等等），自血中分离的干细胞（例如自胎盘血、脐血或者外周血分离的干细胞），胎盘干细胞（例如描述于美国专利7,468,276和美国专利申请公开2007/0275362中的胎盘干细胞，其公开内容全文引入本发明作为参考），来自胎盘灌注液的有核细胞，例如来自胎盘灌注液的总有核细胞，所述细胞描述于美国专利7,638,141中并要求保护，其公开内容全文引入本发明作为参考，脐带血干细胞，血液来源的有核细胞群，骨髓来源的间充质干细胞，骨髓来源的间质干细胞，骨髓来源的造血干细胞，天然骨髓，成体干细胞，包含在组织中的干细胞群，培养的细胞（例如培养的干细胞），完全分化的细胞群（例如软骨细胞，成纤维细胞，羊膜细胞，成骨细胞，肌肉细胞，心肌细胞等），周皮细胞，等等。在一个具体实施方式中，分离的包括羊膜来源的贴壁细胞的细胞群包括胎盘干细胞或者来自脐带的干细胞。在某些实施方式中，其中第二类细胞是血或者血细胞，红细胞已经被从细胞群清除。

在一个具体实施方式中，所述的第二类细胞是造血干细胞。这种造血干细胞可以例如被包含在未处理的胎盘血，脐血或者外周血中；来自胎盘血、脐血或者外周血的总有核细胞中；分离的来自胎盘血、脐血或者外周血的CD34⁺细胞群中；未处理的骨髓中；来自骨髓的总有核细胞中；分离的来自骨髓等的CD34⁺细胞群中。

在另一个实施方式中，所述的第二类细胞是在培养中操控以表达多潜能性标记物以及与胚胎干细胞相关的功能的胚胎细胞类型。

在上述分离的羊膜来源的贴壁细胞群的具体实施方式中，对于希望的细胞接受者来说，羊膜来源的贴壁细胞和第二类细胞之一或两者是自体的或者同种异体的。

本发明更进一步提供包括羊膜来源的贴壁细胞和除了羊膜来源的贴壁细胞以外的其它多个干细胞的组合物。在一个具体实施方式中，所述组合物包括一种来自胎盘的干细胞，即胎盘干细胞，例如，描述于美国专利第7,045,148；7,255,879；和7,311,905号，以及美国专利申请公开第2007/0275362号中的胎盘干细胞，每篇公开的内容全文引入本发明作为参考。在一个具体实施方式中，所述胎盘干细胞是CD34^–、CD10⁺和CD105⁺。在一个更具体的实施方式中，所述胎盘干细胞是CD34^–、CD10⁺、CD105⁺和CD200⁺。在一个更具体的实施方式中，所述胎盘干细胞是CD34^–、CD45^–、CD10⁺、CD90⁺、CD105⁺和CD200⁺。在一个更具体的实施方式中，所述胎盘干细胞是CD34^–、CD45^–、CD80^–、CD86^–、CD10⁺、CD90⁺、CD105⁺和CD200⁺。在其它具体实施方式中，所述的胎盘干细胞是CD200⁺和HLA-G⁺；CD73⁺、CD105⁺和CD200⁺；CD200⁺和OCT-4⁺；CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺；CD73⁺和CD105⁺，并且当所述群在允许形成胚状体的条件下培养时，有利于在包括所述干细胞的胎盘细胞群中形成一种或多种胚状体；或者是OCT-4⁺并且当所述群在允许形成胚状体的条件下培养时，有利于在包括所述干细胞的胎盘细胞群中形成一种或多种胚状体；或者其任意组合。在一个更具体的实施方式中，所述的CD200⁺，HLA-G⁺干细胞是CD34^–、CD38^–、CD45^–、CD73⁺和CD105⁺。在另一个更具体的实施方式中，所述的CD73⁺、CD105⁺和CD200⁺干细胞是CD34^–、CD38^–、CD45^–、和HLA-G⁺。在另一个更具体的实施方式中，所述的CD200⁺，OCT-4⁺干细胞是CD34^–、CD38^–、CD45^–、CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺。在另一个更具体的实施方式中，所述的CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺干细胞是CD34^–、CD45^–、OCT-4⁺和CD200⁺。在另一个更具体的实施方式中，所述的CD73⁺和CD105⁺干细胞是OCT-4⁺、CD34^–、CD38^–以及CD45^–。在另一个更具体的实施方式中，所述的OCT-4⁺干细胞是CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD34^–、CD38^–、以及CD45^–。在另一个更具体的实施方式中，所述胎盘干细胞是母系来源的（即，具有母亲基因型）。在另一个更具体的实施方式中，所述胎盘干细胞是胎儿来源的（即，有胎儿的基因型）。

在另一个具体实施方式中，所述组合物包括羊膜来源的贴壁细胞和胚胎干细胞。在另一个具体实施方式中，所述组合物包括羊膜来源的贴壁细胞和间叶基质或者干细胞，例如，骨髓来源的间叶基质或者干细胞。在另一个具体实施方式中，所述组合物包括骨髓来源的造血干细胞。在另一个具体实施方式中，所述组合物包括羊膜来源的贴壁细胞和造血祖细胞，例如来自骨髓、胎儿血、脐血、胎盘血和/或外周血的造血祖细胞。在另一个具体实施方式中，所述组合物包括羊膜来源的贴壁细胞和成体干细胞。在一个更具体的实施方式中，所述的成体干细胞是神经干细胞，肝脏干细胞，胰腺干细胞，内皮干细胞，心肌干细胞或者肌肉干细胞。

在其它具体实施方式中，第二类细胞包括所述群中大约，至少，或者至多10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、或者50%的细胞。在其它具体实施方式中，所述组合物中的AMDAC包括所述组合物中至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或者90%的细胞。在其它具体实施方式中，所述羊膜来源的贴壁细胞包括所述群中大约，至少，或者至多10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、或者45%的细胞。在其它具体实施方式中，在所述群中至少25%、35%、45%、50%、60%、75%、85%或更多的细胞不是OCT-4⁺。

分离的羊膜来源的贴壁细胞群中的细胞可以与多种其它类型的细胞组合，例如，与干细胞群组合，其与每个群中的总有核细胞数量的比例为大约100,000,000:1，50,000,000:1，20,000,000:1，10,000,000:1，5,000,000:1，2,000,000:1，1,000,000:1，500,000:1，200,000:1，100,000:1，50,000:1，20,000:1，10,000:1，5,000:1，2,000:1，1,000:1，500:1，200:1，100:1，50:1，20:1，10:1，5:1，2:1，1:1；1:2；1:5；1:10；1:100；1:200；1:500；1:1,000；1:2,000；1:5,000；1:10,000；1:20,000；1:50,000；1:100,000；1:500,000；1:1,000,000；1:2,000,000；1:5,000,000；1:10,000,000；1:20,000,000；1:50,000,000；或者大约1:100,000,000。分离的羊膜来源的贴壁细胞群中的细胞也可以与多种类型的多个细胞进行组合。

5.5生长培养

对于任何哺乳动物细胞而言，本发明描述的羊膜来源的贴壁细胞的生长部分取决于选定用于生长的特殊培养基。在最优选条件下，羊膜来源的贴壁细胞一般在大约24小时内数量倍增。在培养过程中，本发明描述的的羊膜来源的贴壁细胞附着于培养基质，例如组织培养容器的表面（例如，组织培养皿塑料，纤维粘连蛋白包被的塑料，等等）并形成单层。通常，细胞在羊膜消化后2-7天内在培养中建立。其以每天大约0.4-1.2个群倍增的速度增殖，并可以经历至少30-50次群倍增。细胞在近汇合和扩增期间显示出间质/成纤维细胞样表型，并且在汇合状态显示为立方形/鹅卵石样外观，并且培养增殖是强接触抑制的。在培养扩增期间羊膜来源的贴壁细胞可以形成胚状体。

5.6获得羊膜来源的贴壁细胞的方法

羊膜来源的贴壁细胞和包括羊膜来源的贴壁细胞的细胞群可通过以下方法产生，例如，分离自其它细胞或细胞群，例如，通过特殊方法消化羊膜组织，随后可选地评价所得到的细胞或细胞群存在或者不存在标记物，或者标记物组合，羊膜来源的贴壁细胞的特征，或者通过获得羊膜细胞并基于羊膜来源的贴壁细胞的标记物特征进行筛选。

本发明提供的羊膜来源的贴壁细胞和分离的包括羊膜来源的贴壁细胞的细胞群，可以通过例如消化羊膜组织并进而筛选贴壁细胞来制备。在一个实施方式中，例如，分离的羊膜来源的贴壁细胞或分离的包括羊膜来源的贴壁细胞的细胞群，可通过以下步骤制备：（1）用第一种酶消化羊膜组织，从羊膜间质层细胞上的羊膜表皮层解离细胞；（2）然后用第二种酶消化羊膜间质层形成单细胞悬液；（3）在例如组织培养塑料的组织培养表面上的所述单细胞悬液中培养细胞；以及（4）筛选在更换培养基后附着于所述表面的细胞，从而制备分离的包括羊膜来源的贴壁细胞的细胞群。在一个具体的实施方式中，所述第一种酶是胰蛋白酶。在一个更具体的实施方式中，所述胰蛋白酶以0.25％胰蛋白酶（w/v）的浓度使用于5-20毫升（例如10毫升）每克要消化的羊膜组织的溶液中。在另一个更具体的实施方式中，所述的胰蛋白酶消化在37℃下进行大约15分钟并重复多达3次。在另一个具体的实施方式中，所述第二种酶为胶原蛋白酶。在一个更具体的实施方式中，所述胶原蛋白酶以50-500U/L的浓度使用于5mL每克要消化的羊膜组织中。在另一个更具体的实施方式中，所述的用胶原蛋白酶消化在37℃下进行大约45-60分钟。在另一个具体的实施方式中，用胶原蛋白酶消化后形成的单细胞悬液在步骤（2）和步骤（3）之间使用例如75μM-150μM过滤器过滤。在另一个具体的实施方式中，所述第一种酶是胰蛋白酶，并且所述第二种酶是胶原蛋白酶。

在另一个实施方式中，分离的包括羊膜来源的贴壁细胞的细胞群能够通过从羊膜选择细胞获得，例如，通过本发明其它部分描述的消化羊膜组织获得细胞，其表现出一种或多种羊膜来源的贴壁细胞特征。在一个实施方式中，例如，细胞群通过以下方法制备，包括鉴定下述羊膜细胞：（a）经RT-PCR测定OCT-4呈阴性，和（b）经免疫定位（例如流式细胞术）测定为VEGFR2/KDR、CD9、CD54、CD105、CD200中的一种或多种呈阳性；以及从其它细胞中分离所述细胞形成细胞群。在一个具体的实施方式中，所述羊膜细胞还是VE-钙粘蛋白^－。在一个具体的实施方式中，细胞群通过选择以下胎盘细胞制备：（a）经RT-PCR测定OCT-4呈阴性和经免疫定位（例如流式细胞术）测定VE-钙粘蛋白呈阴性，和（b）经免疫定位（例如流式细胞术）测定VEGFR2/KDR、CD9、CD54、CD105、CD200中的每一种呈阳性；以及从其它细胞中分离所述细胞以形成细胞群。在某些实施方式中，在通过RT-PCR进行筛选之前通过免疫定位进行筛选。在另一个具体的实施方式中，所述筛选包括筛选在1-100ng/mL VEGF存在下培养4-21天后不表达细胞标记物CD34的细胞。

在另一个实施方式中，例如，细胞群通过以下方法制备，包括筛选附着于组织培养塑料并经RT-PCR测定为OCT-4^－，和经免疫定位（例如流式细胞术）测定为VEGFR1/Flt-1⁺和VEGFR2/KDR⁺的羊膜细胞，以及从其它细胞中分离所述细胞以形成细胞群。在一个具体的实施方式中，细胞群通过以下方法制备，其包括筛选经RT-PCR测定为OCT-4^－，和经免疫定位（例如流式细胞术）测定为VEGFR1/Flt-1⁺、VEGFR2/KDR⁺和HLA-G^－的羊膜细胞。在另一个具体的实施方式中，所述细胞群通过以下方法产生，筛选其中经免疫定位（例如流式细胞术）测定还是CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD98⁺、Tie-2⁺、TEM-7⁺、CD31^－、CD34^－、CD45^－、CD133^－、CD143^－、CD146^－、和/或CXCR4^－（趋化因子（C-X-C模序）受体4）中的一种或多种或全部的羊膜细胞，并且从未表现出一种或多种这些特征的细胞中分离所述细胞。在另一个具体的实施方式中，所述细胞群通过筛选经免疫定位（例如流式细胞术）测定还是VE-钙粘蛋白^－的羊膜细胞，并从VE-钙粘蛋白⁺的细胞中分离所述细胞进行制备。在另一个具体的实施方式中，所述细胞群通过筛选经免疫定位（例如流式细胞术）测定还是CD105⁺和CD200⁺的羊膜细胞，并从CD105^－或CD200^－的细胞中分离所述细胞。在另一个具体的实施方式中，所述细胞暴露于1-100ng/mL VEGF下4-21天后经免疫定位（例如流式细胞术）测定不表达CD34。

在细胞筛选中，没有必要检测整个细胞群的羊膜来源的贴壁细胞的特异性特征。相反，可以检测细胞群的一种或多种的部分细胞（例如，大约0.5％-2％）的这些特征，并将结果用于计算所述群中剩下的细胞。

筛选的细胞可以通过下述方式被确认为本发明提供的羊膜来源的贴壁细胞：在VEGF（例如，大约50ng/mL）存在下，在基质例如MATRIGEL^TM上将细胞样品（例如，大约10⁴至大约10⁵细胞）培养4-14天，例如，7天，并肉眼观察细胞出芽和/或细胞网络的出现。

羊膜来源的贴壁细胞可使用细胞筛选领域已知的任何方法通过上述标记物进行筛选。例如，贴壁细胞可以在例如流式细胞术或FACS免疫定位中使用针对一种或多种细胞表面标记物的抗体或多种抗体进行筛选。可以通过使用结合磁珠的抗体来进行筛选。特异性针对某种标记物的抗体是本领域已知的并可通过商购获得，例如，抗CD9（Abcam）、CD54（Abcam）、CD105（Abcam；BioDesign International，Saco，ME，等）、CD200（Abcam）细胞角蛋白（SigmaAldrich）抗体。抗其它标记物的抗体也是可通过商购获得的，例如，CD34、CD38和CD45可购自，例如，StemCell Technologies或BioDesign International。适于RT-PCR的OCT-4序列的引物可购自，例如，Millipore或Invitrogen，或可以容易地衍生自GenBank登录号DQ486513的人序列。

从胎盘获得胎盘和羊膜组织的方法以及为获得羊膜来源的贴壁细胞而处理该组织的详细方法提供如下。

5.6.1细胞收集组合物

一般地，可以从哺乳动物胎盘的羊膜中获得细胞，例如，人胎盘，其中使用生理可接受的溶液，例如，细胞收集组合物。在一些实施方式中，细胞收集组合物预防或抑制凋亡，预防或抑制细胞死亡、裂解、分解等等。细胞收集组合物详细描述于相关的美国专利申请公开号2007/0190042，标题为“Improved Medium for Collecting Placental Stem Cells and Preserving Organs”，其公开内容本发明全文引入作为参考。

细胞收集组合物可以包括任何适于收集和/或培养羊膜来源的贴壁细胞的生理可接受的溶液，例如，盐溶液（例如，磷酸盐缓冲盐水、Kreb溶液、修饰的Kreb溶液、Eagle溶液、0.9％NaCl等）、培养基（例如，DMEM、H.DMEM等），等等，其中添加或不添加缓冲成分，例如，4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）。

细胞收集组合物可以包含一种或多种保护细胞（例如，羊膜来源的贴壁细胞）的组分，即，从收集开始到培养的时间内防止细胞死亡，或延迟细胞死亡，减少死亡的细胞群中的细胞数量，等。该组分可以是，例如，凋亡抑制剂（例如，半胱天冬酶抑制剂或JNK抑制剂）；血管扩张剂（例如，硫酸镁、抗高血压药、心房利钠肽（ANP）、促肾上腺皮质激素、促肾上腺皮质激素释放激素、硝普钠、肼苯哒嗪、三磷酸腺苷、腺苷、吲哚美辛或硫酸镁、磷酸二酯酶抑制剂等）；坏死抑制剂（例如，2-(1H-吲哚-3-基)-3-戊胺-马来酰亚胺、二硫代氨基甲酸吡咯烷或氯硝西泮）；TNF-α抑制剂；和/或携氧全氟化碳（例如，全氟溴辛烷、全氟溴癸烷等）。

细胞收集组合物可以包含一种或多种组织降解酶，例如，金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、中性蛋白酶、RNA酶、或DNA酶等。这些酶包括但不限于胶原蛋白酶（例如，胶原蛋白酶I、II、III或IV，来自溶组织梭菌的胶原蛋白酶等）；分散酶，嗜热菌蛋白酶，弹性蛋白酶，胰蛋白酶，LIBERASE^TM，透明质酸酶，等等。含有组织消化酶的细胞收集组合物的用途如下详述。

细胞收集组合物可以包含杀菌或抑菌有效量的抗生素。在一些非限制性的实施方式中，抗生素为大环内酯类（例如，妥布霉素）、头孢菌素（例如，头孢氨苄、头孢拉定、头孢呋辛、头孢丙烯、头孢克洛、头孢克肟或头孢羟氨苄）、克拉霉素、红霉素、青霉素（例如，青霉素V）或喹诺酮（例如，氧氟沙星、环丙沙星或诺氟沙星）、四环素、链霉素等。在一个特殊的实施方式中，抗生素活性针对Gram(+)和/或Gram(-)细菌，例如，铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌等等。

细胞收集组合物还可以包含一种或多种的下述化合物：腺苷（大约1mM至大约50mM）；D-葡萄糖（大约20mM至大约100mM）；镁离子（大约1mM至大约50mM）；分子量大于20,000道尔顿的大分子，在一个实施方式中，其含量足以维持内皮完整性和细胞生存（例如，合成的或天然产生的胶体、多糖例如葡聚糖或聚乙二醇，含量大约25g/l至大约100g/l，或大约40g/l至大约60g/l）；抗氧化剂（例如，丁基羟基苯甲醚、丁基羟基甲苯、谷胱甘肽、维生素C或维生素E，含量为大约25μM至大约100μM）；还原剂（例如，N－乙酰半胱氨酸，含量为大约0.1mM至大约5mM）；防止钙进入细胞的试剂（例如，维拉帕米，含量为大约2μM至大约25μM）；硝化甘油（例如，大约0.05g/L至大约0.2g/L）；抗凝血剂，在一个实施方式中，其含量足以帮助防止残血凝块（例如，肝素或水蛭素，含量为浓度大约1000单位/l至大约100,000单位/l）；或含氨氯吡脒化合物（例如，氨氯吡脒、乙基异丙基氨氯吡脒、六甲撑氨氯吡脒、二甲基氨氯吡脒或异丁基氨氯吡脒，含量为大约1.0μM至大约5μM）。

本发明描述的羊膜来源的贴壁细胞也可以在例如下述消化过程中以及消化后被收集到简单的生理可接受缓冲液中，例如，磷酸盐缓冲盐水、0.9％NaCl溶液、细胞培养基，等。

5.6.2胎盘的收集和处理

一般地，人胎盘在其出生后排出体内的短时间内或在例如剖腹产之后进行收集。在优选的实施方式中，在对患者进行知会同意并获得该患者的完整病历且与胎盘关联后回收胎盘。优选的，在分娩后继续跟踪病历。该病历可用于调整从中获得的胎盘或细胞的后续应用。例如，人胎盘细胞，例如，羊膜来源的贴壁细胞，可以按照病历被用于婴儿、或与胎盘有关的近亲属、或父母、兄弟姐妹或婴儿的其它亲属的个体化用药。

在回收羊膜来源的贴壁细胞前移除脐带血和胎盘血。在某些实施方式中，分娩后回收胎盘中的脐带血。胎盘可被用于脐带血常规回收过程。一般使用针或套管，在重力作用下给胎盘抽血。针或套管通常置于脐带静脉，胎盘可以被轻柔的挤压以帮助排空胎盘中的脐带血。该脐带血回收可以商业化地进行，例如，Life Bank USA，Cedar Knolls，N.J.，ViaCord，Cord Blood Registry and Cryocell。优选的，用重力排空胎盘而不进行进一步操作，从而使得脐带血回收中的组织破坏得以最小化。

一般地，将胎盘从分娩室或产房转移到另一位置，例如，实验室中，用于通过例如组织解离来回收脐带血并收集细胞。优选的将胎盘转移到无菌的、隔热的转移设备（保持胎盘温度20-28℃）中，例如，将胎盘与近端夹紧的脐带血置于无菌拉链塑料袋中，后者接着被置于隔热容器中。在另一个实施方式中，胎盘使用基本上按照描述于美国专利号7,147,626的脐带血收集试剂盒进行转移。优选的，胎盘在分娩后4-24小时转移到实验室。在某些实施方式中，优选的在脐带血回收前，在）脐带插入胎盘的4-5㎝厘米处夹紧近端脐带。在其它实施方式中，在脐带血回收后和进一步处理胎盘之前，夹紧近端脐带。

在细胞收集之前可以将胎盘储藏在无菌条件以及例如4-25℃（摄氏度）的温度下，例如，室温下。在灌注胎盘除去任何残留的脐带血之前，可以储藏胎盘例如0-24小时、高达48小时、或多于48小时。在一个实施方式中，在排出后大约0小时至大约2小时收获胎盘。胎盘可以在例如4-25℃（摄氏度）的温度下储藏于抗凝血剂溶液中。合适的抗凝血剂溶液是本领域熟知的。例如，可以使用柠檬酸钠、肝素或华法令钠溶液。在优选的实施方式中，抗凝血剂溶液包括肝素溶液（例如，在1∶1000溶液中1％w/w）。优选的抽血胎盘在收集细胞前储藏不多于36小时。

参见（例如）美国专利号7,638,141，其公开内容全文引入本发明作为参考，作为关于收集和处理胎盘的附加信息。

5.6.3羊膜组织的物理破碎和酶促消化

在一个实施方式中，羊膜分离自剩余的胎盘，例如，通过钝器解剖，例如，使用手指。在酶促消化和贴壁细胞回收之前可以将羊膜切成例如小块或组织片段。羊膜来源的贴壁细胞可以获得自完整羊膜，或来自羊膜的小块部分，例如，面积为大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或大约1000平方毫米的羊膜的部分。

羊膜来源的贴壁细胞一般可以收集自胎盘羊膜或其部分，其可以在排出后大约前3天内的任何时间进行，但优选排出后大约0小时至48小时，或排出后大约8小时至大约18小时进行。

AMDAC可以（例如）使用特异的两步分离法进行分离，其包括用胰蛋白酶消化之后用胶原蛋白酶消化。例如，本发明提供一种分离羊膜来源的贴壁细胞的方法，包括胰蛋白酶消化羊膜或其部分，从而从所述羊膜中释放上皮细胞；从所述上皮细胞去除羊膜或其部分；进一步用胶原蛋白酶消化羊膜或其部分。在一个具体的实施方式中，用胰蛋白酶消化羊膜或其部分重复至少一次。在另一个具体的实施方式中，羊膜或其部分的胶原蛋白酶消化重复至少一次。在另一个具体的实施方式中，胰蛋白酶为大约0.1％-1.0％（终浓度）。在一个更具体的实施方式中，胰蛋白酶为大约0.25％（终浓度）。在另一个具体的实施方式中，胶原蛋白酶为大约50U/mL至大约1000U/mL（终浓度）。在一个更具体的实施方式中，胶原蛋白酶为大约125U/mL（终浓度）。

在一个实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞可以按照如下方式获得。将羊膜通过（例如）钝性剥离与胎盘分离，然后切成0.1”×0.1”至大约5”×5”，例如2”×2”大小的碎片。通过胰蛋白酶消化（例如如下的三重胰蛋白酶消化）将上皮单层从羊膜的胚胎侧去除。将羊膜碎片置于装有温热的（例如大约20℃至大约37℃）胰蛋白酶-EDTA溶液（0.25％）的容器中。羊膜碎片被激烈（例如，大约20C到大约37C）胰蛋白EDTA溶液（0.25%）投入一个容器。胰蛋白酶溶液的体积可以是从大约5mL每克羊膜至大约50mL每克羊膜。将容器振荡大约5分钟至大约30分钟，例如15分钟，同时保持温度恒定。然后通过任何合适的方法将羊膜碎片从胰蛋白酶溶液中分离，所述方法为例如手工去除羊膜碎片或者通过过滤。胰蛋白酶消化步骤可以重复至少一次以上。在一个实施方式中，胰蛋白酶消化步骤重复两次（三重胰蛋白酶消化）或者三次（四重胰蛋白酶消化）。

在一个实施方式中，当最后的胰蛋白酶消化完成时，将羊膜碎片置于装有温热的（例如大约20℃至大约37℃）胰蛋白酶中和溶液中（例如，以每克羊膜大约5mL到每克羊膜大约50mL的体积），例如磷酸盐缓冲液（PBS）/10%胎牛血清（FBS），PBS/5%FBS或者PBS/3%FBS，并且搅拌大约5秒钟到大约30分钟，例如5、10或者15分钟。所述羊膜碎片然后通过任何适当的方法与胰蛋白酶中和溶液分离，所述方法为例如手工清除羊膜碎片，或者通过过滤。所述羊膜碎片然后置于装有温热的（例如，大约20℃到大约37℃）pH7.2的PBS溶液中（例如，以每克羊膜大约5mL到每克羊膜大约50mL的体积），搅拌大约5秒钟到大约30分钟，例如5、10或者15分钟。所述羊膜碎片然后按如上所述的方法与PBS分离。

所述羊膜碎片然后置于装有温热的（例如，大约20℃到大约37℃）消化液中。消化液的体积可在大约每克羊膜5mL到大约每克羊膜50mL的范围内。消化液包括合适的培养基中的消化酶，例如DMEM。典型的消化液包括胶原酶I型（大约50U/ml到大约500U/ml）。该方法此阶段的消化液一般不包括胰蛋白酶。通常在37℃搅拌直到羊膜消化基本上完成，以例如完全溶解产生均一的悬浮液（大约10分钟到大约90分钟）为证。然后以每克羊膜组织大约1mL到每克羊膜组织大约50mL的比例加入温热的PBS/5%FBS并且搅拌大约2分钟到大约5分钟。然后用例如40μm到100μm过滤器过滤所述细胞悬液以除去任何未消化的组织。将所述细胞悬浮于温热的PBS中（大约1mL到大约500mL），然后以200×克到大约400×克离心大约5分钟到大约30分钟，例如在20℃以300×克离心大约15分钟。离心后，移除上清液，所述细胞悬浮于合适的培养基中。所述细胞悬液可以过滤（40μm到70μm过滤器）以清除任何残留的未消化组织，产生单一细胞悬浮液。在本实施方式中，残留的未消化羊膜可以弃去。

在本实施方式中，悬浮液中的细胞按本发明其它地方所述的方法收集和培养，以产生分离的羊膜来源的贴壁细胞及其细胞群。例如，在一个实施方式中，可以培养悬浮液中的所述细胞，并且可以将羊膜来源的贴壁细胞与所述培养物中的非贴壁细胞分离，以产生富集的羊膜来源的贴壁细胞群。在更具体的实施方式中，在富集的羊膜来源的贴壁细胞群中至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或者99%的细胞是所述的羊膜来源的贴壁细胞。

在本发明任一消化流程中，可以将消化获得的细胞悬液进行过滤，例如，通过包括大约50μm至大约150μm，例如大约75μm至大约125μm的孔的过滤器进行过滤。在一个更具体的实施方式中，所述细胞悬液可以通过两个或多个过滤器进行过滤，例如，一个125μm过滤器和一个75μm过滤器。

与本发明描述的任何方法一起，AMDAC可以通过选择表达如上述第5.1节所述的一种或多种AMDAC特征的细胞与消化过程中释放的细胞分离。

在一个实施方式中，AMDAC可以依次使用第一种酶和第二种酶分离，其中用于该方法的第一种酶不是胶原酶，并且其中用于该方法的第二种酶不是胰蛋白酶。

在另一个实施方式中，用于分离AMDAC的消化步骤不使用胶原酶、分散酶或者透明质酸酶的任何两种或多种组合。

在另一个实施方式中，AMDAC不通过外植体培养分离，以使所述细胞通过在外植体之外生长、复制或者迁移来检测。

在另一个实施方式中，在AMDAC分离期间不使用脱氧核糖核酸酶（DNA酶）。例如，在分离的胶原酶消化步骤之后不使用脱氧核糖核酸酶。

5.6.4羊膜来源的贴壁细胞的分离、分选和鉴定

可以将细胞沉淀重悬于如上所述的新鲜细胞收集组合物中，或适于维持细胞的培养基中，例如，达尔伯克氏改良的伊格尔氏培养基（DMEM）；Iscove改良的达尔伯克氏培养基（IMDM），例如含有2U/mL肝素和2mM EDTA（GibcoBRL，NY）的IMDM无血清培养基；缓冲液（例如PBS，HBSS）与FBS（例如2％v/v）混合物；等。

在例如组织培养塑料表面培养的羊膜来源的贴壁细胞，无论其是否有额外的胞外基质包被，例如纤维粘连蛋白，都可以通过差速贴壁法传代或分离。例如，按照上述第5.6.3节的描述获得的细胞悬液可以在组织培养塑料上的培养基中培养例如3-7天。培养过程中，悬液中的多个细胞附着于培养表面，并且非贴壁细胞在更换培养基时被去除。

可以进行监控从羊膜中收集的细胞数量和类型，例如，通过使用诸如免疫定位的标准细胞检测技术检测细胞形态和表面标记物的变化来进行监控，其中检测技术例如流式细胞术、细胞分选、免疫细胞化学（例如、组织特异性或细胞标记物特异性抗体染色）荧光激活细胞分选（FACS）、磁性激活细胞分选（MACS）、通过使用光学或共聚焦显微镜检查细胞形态、和/或通过使用诸如PCR和基因表达谱等本领域熟知的技术检测基因表达变化。这些技术也可以用于鉴定对于一种或多种特殊标记物呈阳性的细胞。例如，使用一种或多种CD34抗体，人们可以使用上述技术以确定一种细胞是否包含可检测量的CD34；如果是这样的话，那么细胞是CD34⁺。

羊膜来源的贴壁细胞可以通过菲科尔分离法进行分离，例如菲科尔梯度离心。这种离心的离心速度等可以遵循任何标准方案。在一个实施方式中，例如，羊膜消化后回收的细胞在室温下通过使用菲科尔梯度离心以5000×g离心15分钟，收集目标细胞层作进一步处理。

羊膜来源的细胞，例如，通过菲科尔分离、差速贴壁法或二者的组合分离的细胞可以使用荧光激活细胞分选仪（FACS）进行分选。荧光激活细胞分选（FACS）是一种公知的分离颗粒的方法，包括分离细胞，其基于颗粒的荧光特征（参见，例如，Kamarch，1987，Methods Enzymol，151：150-165）。每个颗粒荧光部分的激光激发会导致微小的电荷，使得可以从混合物中进行电磁分离阳性和阴性的颗粒。在一个实施方式中，细胞表面标记物特异性抗体或配体被标记物了不同的荧光标签。通过细胞分选仪处理细胞，从而允许基于细胞结合所用抗体的能力对细胞进行分离。FACS分选的颗粒可以直接储存至96-孔或384-孔板的各个孔内，方便分离和克隆。

在一个分选方案中，来自胎盘的细胞，例如，羊膜来源的贴壁细胞，可以基于标记物CD49f、VEGFR2/KDR和/或Flt-1/VEGFR1的表达进行分选。优选的细胞鉴定为OCT-4^－，例如，通过RT-PCR检测OCT-4在细胞样品中的表达进行鉴定，其中如果样品中的细胞在30个循环后不能表现出可检测的OCT-4mRNA合成，则该细胞是OCT-4^－。例如，来自羊膜的VEGFR2/KDR⁺和VEGFR1/Flt-1⁺细胞可以从具有VEGFR2/KDR^－和VEGFR1/Flt-1⁺、CD9⁺、CD54⁺、CD105⁺、CD200⁺和/或VE-钙粘蛋白^－中的一种或多种的细胞中进行分选。在一个具体的实施方式中，将羊膜来源的具有CD49f⁺、VEGFR2/KDR⁺、CD9⁺、CD54⁺、CD105⁺、CD200⁺和/或VE-钙粘蛋白^－中的一种或多种的组织培养塑料贴壁细胞，或将VEGFR2/KDR⁺、CD9⁺、CD54⁺、CD105⁺、CD200⁺和VE-钙粘蛋白^－细胞，从不表达一种或多种这些标记物的细胞中进行分选并筛选。在另一个具体的实施方式中，将另外为CD31⁺、CD34⁺、CD45⁺、CD133^－和/或Tie-2⁺的CD49f⁺、VEGFR2/KDR⁺、VEGFR1/Flt-1⁺中的一种或多种或全部的细胞，从未表现出一种或多种或任何这些性质的细胞中进行分选。在另一个具体的实施方式中，将另外为CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD98⁺、Tie-2⁺、TEM-7⁺、CD31^－、CD34^－、CD45^－、CD133^－、CD143^－、CD146^－和/或CXCR4^－的一种或多种或全部的VEGFR2/KDR⁺、VEGFR1/Flt-1⁺细胞，从未表现出一种或多种或任何这些性质的细胞中进行分选。

羊膜来源的贴壁细胞的筛选可以针对消化产生的细胞悬液或从消化物收集的分离细胞来进行，例如，通过离心或使用流式细胞仪分离。通过表达标记物的筛选可以单独完成，或者，例如，与基于细胞培养中的贴壁性质的细胞筛选流程联用。例如，可以在基于标记物表达的分选之前或之后进行贴壁筛选。

对于抗体-介导的胎盘细胞检测和分选，可以使用任何特殊标记物特异性的抗体，其结合任何荧光基团或适于细胞检测和分选（例如，荧光激活细胞分选）的其它标签。结合特异性标记物的抗体/荧光基团包括但不限于，异硫氰酸荧光素（FITC）偶联的抗CD105单克隆抗体（可购自R&D系统公司，明尼阿波里斯，明尼苏达州）；藻红蛋白（PE）偶联的抗CD200单克隆抗体（BD Biosciences Pharmingen）；VEGFR2/KDR-生物素（CD309，Abcam），等等。针对本发明公开的任何标记物的抗体都可以使用任何用于抗体的标准标签进行标记物，后者有利于检测抗体，包括，例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、乙酰胆碱酯酶链霉亲和素/生物素、抗生物素蛋白/生物素、伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素（FITC）、罗丹明、二氯三吖胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白（PE）、鲁米诺、荧光素酶、荧光素和水母蛋白，和合适的放射性材料的例子，包括¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S或³H。

羊膜来源的贴壁细胞可以标记物有单一标记物的抗体，并基于该单一标记物进行检测和分选；或者可以同时标记物有多个不同标记物的多个抗体，并基于多种标记物进行分选。

在另一个实施方式中，可以使用磁珠分离细胞，例如，从其它羊膜细胞中分离本发明描述的羊膜来源的贴壁细胞。细胞可以使用磁性激活细胞分选（MACS）技术进行分选，其为一种基于颗粒结合磁珠（0.5-100μm直径）的能力来分离颗粒的方法。可以对磁性微球进行多种有用的修饰，包括共价添加特异性识别特殊细胞表面分子或半抗原的抗体。然后将磁珠与细胞混合进行结合。然后将细胞通过磁场，分离具有特异性细胞表面标记物的细胞。在一个实施方式中，随后可以将这些细胞进行分离并重新混合偶联有抗其它细胞表面标记物的抗体的磁珠。再次将细胞通过磁场，分离结合有该两种抗体的细胞。然后可以将该细胞在诸如微滴盘的不同盘内进行稀释，用于克隆分离。

可以使用本领域已知的标准技术评价羊膜来源的贴壁细胞的活力、增殖潜力和寿命，例如台盼蓝拒染实验、荧光素二乙酸酯吸收分析、碘化丙锭吸收分析（评价活力）；以及胸腺嘧啶吸收分析或MTT细胞增殖分析（评价增殖）。细胞寿命可以通过本领域熟知的方法进行测定，例如通过检测延伸培养中的最大群倍增数测定。

5.7羊膜来源的贴壁细胞的培养

5.7.1培养基

[0241]分离的羊膜来源的贴壁细胞或该细胞的群，可用于启动细胞培养或接种细胞培养物。一般将细胞转移到无菌组织培养容器中，后者或者不包被、或者包被胞外基质或生物分子，例如层粘连蛋白、胶原蛋白（例如，天然或变性的）、明胶、纤维粘连蛋白、鸟氨酸、玻璃体粘连蛋白、和胞外膜蛋白（例如，MATRIGEL^TM（BD Discovery Labware，贝德福德，马萨诸塞））。

AMDAC可以，例如，在适合干细胞培养的培养基中进行培植。培植培养基可以，例如，含有EGM-2培养基（龙沙）、DMEM+10％FBS，或含有60％DMEM-LG（Gibco）、40％MCDB-201（Sigma）、2％胎牛血清（FCS）（Hyclone Laboratories）、1×胰岛素-转铁因子-硒补充剂（ITS）、1×亚油酸-牛血清白蛋白（LA-BSA）、10^-9M地塞米松（Sigma）、10^-4M抗坏血酸-2-磷酸酯（Sigma）、表皮生长因子（EGF）10ng/ml（R&D系统公司）、血小板衍生的生长因子（PDGF-BB）10ng/ml（R&D系统公司）、和100U青霉素/1000U链霉素的培养基（本发明称为“标准培养基”）。

羊膜来源的贴壁细胞可被培养于本领域认可的可用于例如贴壁胎盘干细胞的细胞培养的任何培养基，以及任何条件下。优选的，培养基含有血清。在不同的实施方式中，AMDAC的培养或传代培养的培养基包括

（Invitrogen）、MS㎝-sf（ScienCell，卡尔斯巴德，CA）、

-ACF培养基（干细胞技术公司，温哥华，加拿大）、标准培养基、缺少EGF的标准培养基、缺少PDGF的标准培养基、DMEM+10％FBS、EGM-2（龙沙）、EGM-2MV（龙沙）、2％、10％和20％的ES培养基、ES－SSR培养基或α-MEM-20％FBS。可用于培养羊膜来源的贴壁细胞的培养基包括，例如，DMEM、IMDM、DMEM（高或低葡萄糖）、伊格尔氏基本培养基、Ham的F10培养基（F10）、Ham的F-12培养基（F12）、Iscove的改良达尔伯克氏培养基、间质干细胞生长的培养基（MSCGM Lonza）、ADVANCESTEM^TM培养基（Hyclone）、KNOCKOUT^TMDMEM（Invitrogen）、Leibovitz的L-15培养基、MCDB、DMEM/F12、RPMI1640、改良DMEM（Gibco）、DMEM/MCDB201（Sigma）和CELL-GRO FREE等等。在不同的实施方式中，例如，DMEM-LG（达尔伯克氏的改良必需培养基，低葡萄糖）/MCDB201（鸡成纤维细胞基本培养基）含有ITS（胰岛素-转铁因子-硒补充剂）、LA+BSA（亚油酸-牛血清白蛋白）、葡萄糖、L-抗坏血酸、PDGF、EGF、IGF-1、和青霉素/链霉素；DMEM-HG（高葡萄糖）包含大约2至大约20％胎牛血清，例如，大约10％的胎牛血清（FBS；例如确定的胎牛血清，Hyclone，Logan Utah）；DMEM-HG包含大约2至大约20％FBS，例如，大约15％的FBS；IMDM（Iscove的改良达尔伯克氏培养基）包含大约2至大约20％FBS，例如，大约10％的FBS，大约2至大约20％马血清，例如，大约10％的马血清，和氢化可的松；M199包含大约2至大约20％，例如，大约10％的FBS、EGF和肝素；α-MEM（最小必需培养基）包含大约2至大约20％，例如，大约10％的FBS、GLUTAMAX^TM和庆大霉素；DMEM包含10％FBS、GLUTAMAX^TM和庆大霉素；DMEM-LG包含大约2至大约20％，例如，大约15％（v/v）的胎牛血清（例如，确定的胎牛血清，Hyclone，LoganUtah）、抗生素/抗真菌药（例如，青霉素大约100单位/微升、链霉素100微克/微升、和/或两性霉素B0.25微克/微升（Invitrogen，卡尔斯巴德，Calif）），和0.001％（v/v）β-巯基乙醇（Sigma，St.Louis Mo.）；补充2-20％FBS、非必需氨基酸（Invitrogen）、β-巯基乙醇的KNOCKOUT^TMDMEM基本培养基，补充KNOCKOUT^TM的血清替代品、含有2-20％FBS的α-MEM的KNOCKOUT^TM基本培养基，补充EGF、VEGF、bFGF、R3－IGF-1、氢化可的松、肝素、抗坏血酸、FBS、庆大霉素的EBM2^TM基本培养基，等等。

培养基可以补充一种或多种组分，包括，例如，血清（例如，FCS或FBS，例如，大约2-20％（v/v）；马血清（ES）；人血清（HS））；β-巯基乙醇（BME），优选的大约0.001％（v/v）；一种或多种生长因子，例如，血小板衍生的生长因子（PDGF）、表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、白血病抑制因子（LIF）、血管内皮生长因子（VEGF）和促红细胞生成素（EPO）；氨基酸，包括L-缬氨酸；以及一种或多种抗生素和/或抗真菌剂以控制微生物污染，例如，青霉素G、硫酸链霉素、两性霉素B、庆大霉素和制霉菌素，其可单独或组合使用。

羊膜来源的贴壁细胞（AMDAC）可被培养于标准组织培养条件，例如，培养于组织培养皿或多孔板。细胞还可以使用悬滴方法进行培养。在该方法中，细胞在大约5mL的培养基中悬浮于大约1×10⁴细胞每mL，且一滴或更多培养基置于组织培养容器的盖内，例如，在100mL Petri培养皿中。这些液滴可以是，例如，单一液滴，或来自例如多通道移液管的多个液滴。小心地将盖翻转并置于培养皿底部的顶上，其中含有一定体积的液体，例如，足够维持培养皿中潮湿环境的无菌PBS，并进而培养细胞。AMDAC也可以在标准或大体积或高产量培养系统中进行培养，例如T-摇瓶、Corning

，Cell Factories（Nunc），1-、2-、4-、10或40-Tray Cell stack，等等。

在一个实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞在能够维持细胞未分化表型的化合物的存在下进行培养。在一个具体的实施方式中，该化合物是取代的3,4-二氢嘧啶酮[4,5-d]嘧啶。在一个更具体的实施方式中，该化合物是具有下述化学结构的化合物：

该化合物可以与一种羊膜来源的贴壁细胞或该细胞群进行接触，其浓度为，例如，大约1μM至大约10μM。

5.7.2羊膜来源的贴壁细胞的扩增和增殖

一旦分离了羊膜来源的贴壁细胞或分离了该细胞群（例如，分离自至少50％的羊膜细胞的羊膜来源的贴壁细胞或该细胞群，该细胞或细胞群通常与其在体内相关联），即可以在体外增殖和扩增细胞。例如，贴壁细胞或羊膜来源的贴壁细胞群可以在组织培养容器中进行培养，例如，培养皿、摇瓶、多孔板等，培养持续足够时间使得细胞增殖至40-70％汇合度（confluence），即，直到细胞及其后代占据40-70％的组织培养容器的培养表面积。

可以在培养容器中接种羊膜来源的贴壁细胞，接种密度允许细胞生长。例如，可以在低密度（例如，大约400至大约6,000细胞/㎝²）至高密度（例如，大约20,000或更多细胞/㎝²）下接种细胞。在优选的实施方式中，细胞培养于CO₂为大约0％至大约5％的空气中。在一些优选的实施方式中，细胞培养于大约0.1％至大约25％O₂的空气中，优选的大约5％至大约20％O₂的空气中。细胞优选的培养于大约25℃至大约40℃，优选的大约37℃。

细胞优选的培养于保温箱中。培养过程中，培养基可以是静止或进行搅拌的，例如，培养过程中使用生物反应器。羊膜来源的贴壁细胞优选的生长于低氧化压力下（例如，添加谷胱甘肽、抗坏血酸、过氧化氢酶、生育酚、N－乙酰半胱氨酸等）。

虽然所述细胞可以生长至汇合，但是细胞优选的不生长至汇合。例如，一旦达到40％-70％的汇合度，即可以传代细胞。例如，细胞可以使用本领域熟知的技术进行酶处理，例如，胰蛋白酶化，将其从组织培养表面进行分离。吸走细胞并对其进行计数后，可以将大约20,000-100,000细胞、优选的大约50,000细胞、或大约400至大约6,000细胞/㎝²传代至含有新鲜培养基的新培养容器。一般地，新培养基与去除细胞的培养基为相同类型。羊膜来源的贴壁细胞可以传代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次，或更多。AMDAC可以在培养物中翻倍至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或至少50倍或更多。

5.8包括羊膜来源的贴壁细胞的组合物

5.8.1包括羊膜来源的贴壁细胞的药物组合物

在某些实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞包含于药物组合物或为其中的组分。可以按照利于对个体进行施用的方式制备细胞，例如，羊膜来源的贴壁细胞，其被置于一个适于进行医药用途的容器内。该容器可以是，例如，注射器、无菌塑料袋、小瓶、烧瓶、罐、或其它容器，其中羊膜来源的贴壁细胞群可以很容易地进行分配。例如，容器可以是血袋或其它塑料的、适于液体静脉施用至受体的医学上可接受的袋子。在某些实施方式中，容器允许低温贮藏细胞。本发明提供的组合物例如药物组合物中的细胞可以包括羊膜来源的贴壁细胞，后者衍生于单一供体或多个供体。细胞对于目标受体而言可以是完全的HLA-匹配，或部分或完全的HLA-不匹配。

从而，在一个实施方式中，本发明提供的组合物中的羊膜来源的贴壁细胞以在容器中含有羊膜来源的贴壁细胞的组合物的形式施用至有需求的个体。在另一个具体的实施方式中，容器为袋子、小瓶、烧瓶或罐。在更具体的实施方式中，所述袋子是无菌塑料袋。在一个更具体的实施方式中，所述袋子适于，允许或有利于所述贴壁细胞的静脉施用，例如，通过静脉输液，弹丸注射等。袋子可以包括多个腔或隔间，其相互连通以允许在施用前或施用中混合细胞和一种或多种其它溶液，例如，一种药物。在另一个具体的实施方式中，低温贮藏前，含有羊膜来源的贴壁细胞的溶液包含一种或多种有利于低温贮藏细胞的化合物。在另一个具体的实施方式中，所述羊膜来源的贴壁细胞存在于生理可接受的水溶液中。在一个更具体的实施方式中，所述生理可接受的水溶液为0.9％NaCl溶液。在另一个具体的实施方式中，所述羊膜来源的贴壁细胞包括对所述细胞的受体HLA-匹配的细胞。在另一个具体的实施方式中，所述羊膜来源的贴壁细胞包括对所述细胞的受体至少部分HLA-不匹配的细胞。在另一个具体的实施方式中，所述羊膜来源的贴壁细胞衍生于多个供体。在各个具体的实施方式中，所述容器包括大约、至少、或最多1×10⁶所述细胞、5×10⁶所述细胞、1×10⁷所述干细胞、5×10⁷所述细胞、1×10⁸所述细胞、5×10⁸所述细胞、1×10⁹所述细胞、5×10⁹所述细胞、1×10¹⁰或1×10¹¹所述细胞。在关于任何前述低温贮藏群的其它具体的实施方式中，所述细胞已经传代大约，至少，或不多于5次，不多于10次，不多于15次，或不多于20次。在关于任何前述低温贮藏细胞的另一个具体的实施方式中，所述细胞已经在所述容器中进行了扩增。在具体的实施方式中，单一单位剂量的羊膜来源的贴壁细胞可以包括，在不同的实施方式中，大约，至少，或不多于1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹或更多的羊膜来源的贴壁细胞。

在某些实施方式中，本发明提供的药物组合物包含羊膜来源的贴壁细胞群，其包括50％活细胞或更多（即，在群中至少50％的细胞为有功能的或存活的）。优选的，在群中至少60％的细胞是活细胞。更加优选的，在药物组合物的群中至少70％、80％、90％、95％、或99％的细胞是活细胞。

5.8.2包含羊膜来源的贴壁细胞的基质

进一步本发明提供的是组合物，其包含基质、水凝胶、支架，等等。该组合物可用于代替或辅助液体悬液中的该细胞。

基质可以是，例如，永久的或可降解的去细胞化的组织，例如，去细胞化的羊膜，或合成的基质。基质可以是三维支架。在一个更具体的实施方式中，所述基质包含胶原蛋白、明胶、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白、果胶、鸟氨酸、或玻璃体粘连蛋白。在另一个更具体的实施方式中，基质为羊膜或羊膜来源的生物材料。在另一个更具体的实施方式中，所述基质包含胞外膜蛋白。在另一个更具体的实施方式中，所述基质包含合成的化合物。在另一个更具体的实施方式中，所述基质包含生物活性化合物。在另一个更具体的实施方式中，所述生物活性化合物为生长因子、细胞因子、抗体、或低于5,000道尔顿的有机分子。

本发明描述的羊膜来源的贴壁细胞可被接种至天然基质上，例如，胎盘生物材料例如羊膜材料。该羊膜材料可以是，例如，直接切开哺乳动物胎盘得到的羊膜；固定的或热处理的羊膜、基本上干燥的（即，＜20％H₂O）羊膜，绒膜、基本上干燥的绒膜、基本上干燥的羊膜和绒膜，等等。可以接种本发明提供的羊膜来源的贴壁细胞的优选的胎盘生物材料描述于Hariri，美国申请公开号2004/0048796，其公开内容本发明全文引入作为参考。

在另一个具体的实施方式中，基质为包含胞外基质的组合物。在一个更具体的实施方式中，所述组合物为MATRIGEL^TM（BD Bioscience）。

本发明描述的分离的羊膜来源的贴壁细胞可悬浮于例如适合注射的水凝胶溶液。水凝胶为例如有机聚合物（天然或合成的），其通过共价键、离子键或氢键交联形成三维开放式晶格结构，包围水分子形成凝胶。适合该组合物的水凝胶包括自组装肽，例如RAD16。在一个实施方式中，含有细胞的水凝胶溶液可以允许例如在模子中硬化形成具有用于移植的分散细胞的基质。该基质中的羊膜来源的贴壁细胞在例如移植前也可以进行培养，从而细胞进行有丝分裂扩增。水凝胶形成材料包括例如海藻酸及其盐的多糖、多肽、含磷氮链聚合物和聚丙烯酸酯，其离子化交联；或嵌段共聚物，例如聚氧化乙烯－聚丙烯醇嵌段共聚物，其分别通过温度或pH进行交联。在一些实施方式中，水凝胶或基质是生物可降解的。

在某些实施方式中，本发明提供的含有细胞的组合物，包含原位可聚合的凝胶（参见，例如，美国专利申请公开2002/0022676；Anseth等人，J.Control Release，78（1-3）：199-209（2002）；Wang等人，Biomaterials，24（22）：3969-80（2003）。在一些实施方式中，聚合物在诸如水、缓冲盐溶液、或具有荷电侧链基团的水性醇溶液、或其单价离子盐等的水性溶液中至少部分溶解。能与阳离子反应、具有酸性侧链基团的聚合物的例子有聚（磷氮基）、聚（丙烯酸）、聚（甲基丙烯酸）、丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物、聚（醋酸乙烯酯）、以及例如磺化聚苯乙烯的磺化聚合物。也可以使用具有酸性侧链基团的共聚物，其通过丙烯酸或甲基丙烯酸与乙烯醚单体或聚合物反应形成。酸性基团的例子有羧酸基团、磺酸基团、卤化（优选的氟化）醇基团、酚OH基团，和酸性OH基团。

在一个具体的实施方式中，基质为毡，其可以由诸如PGA、PLA、PCL共聚物或混纺或透明质酸等生物吸收材料制成的复丝纱线制成。纱线使用标准纺织工艺技术制成毡，包括卷边、剪裁、梳理和针织。在另一个优选的实施方式中，本发明的细胞接种到可以是复合结构的泡沫支架上。另外，三维框架可以模塑为可用的形状，例如需要修复、替换或扩张的特定身体结构。其它可用的支架例子包括非织毡、多孔泡沫或自组装多肽。可以使用含有合成的乙醇酸和乳酸共聚物（例如，PGA/PLA）（VICRYL，Ethicon，Inc.，Somerville，N.J.）的可吸收共聚物的纤维制成非织毡。通过诸如冷冻干燥或冻干的过程进行制备（参见，例如，美国专利号6,355,699）的聚（ε-己内酯）/聚（乙醇酸）（PCL/PGA）共聚物组成的泡沫也可以用作支架。

本发明描述的羊膜来源的贴壁细胞可接种于三维框架或支架上，并植入体内。该框架可以与任何一种或多种的例如刺激组织形成的，例如骨骼形成或脉管形成的生长因子、细胞、药物或其它组分一起移植。

在另一个实施方式中，本发明提供的羊膜来源的贴壁细胞可以接种于泡沫支架上，其可以是复合结构。该泡沫支架可以模塑为可用的形状，例如需要修复、替换或扩张的特定身体结构的部分。在一些实施方式中，框架使用例如0.1M乙酸进行处理，然后在细胞接种前在聚赖氨酸、PBS和/或胶原蛋白中孵育，以增强细胞吸附。基质外表面可以进行修饰以增强细胞吸附或生长以及组织分化，例如采用血浆包被基质，或添加一种或多种蛋白（例如，胶原蛋白，弹性纤维，网状纤维）、糖蛋白、粘多糖（例如，硫酸肝素、软骨素-4－硫酸盐、软骨素-6－硫酸盐、皮肤素硫酸盐、角质素硫酸盐，等）、细胞基质和/或其它材料，例如但不限于明胶、海藻酸、琼脂、琼脂糖、和植物胶，等等。

在一些实施方式中，基质包括使其不致栓塞的材料，或经其处理。这些处理和材料也可以促进和维持内皮生长、迁移和胞外基质储存。这些材料和处理的例子包括但不限于天然材料，例如基膜蛋白，例如层粘连蛋白和IV型胶原蛋白；合成材料例如EPTFE；和切开的聚氨酯脲硅酮，例如PURSPAN^TM（The Polymer Technology Group，Inc.，Berkeley，Calif.）。基质也可以包括抗血栓剂例如肝素；支架也可以在接种本发明提供的贴壁细胞前进行处理改变表面电荷（例如，血浆包被）。

框架可以在接种本发明提供的羊膜来源的贴壁细胞前进行处理以增强细胞吸附。例如，在接种本发明的细胞前，可以使用0.1摩尔乙酸处理尼龙基质并在聚赖氨酸、PBS和/或胶原蛋白中孵育以包被尼龙。可以使用硫酸对聚苯乙烯进行类似处理。

另外，三维框架外表面可以进行修饰以增强细胞吸附或生长以及组织分化，例如采用血浆包被框架，或添加一种或多种蛋白（例如，胶原蛋白、弹性纤维、网状纤维）、糖蛋白、粘多糖（例如，硫酸肝素、软骨素-4－硫酸盐、软骨素-6－硫酸盐、皮肤素硫酸盐、角质素硫酸盐）、细胞基质和/或其它材料，例如但不限于明胶、海藻酸、琼脂、琼脂糖、或植物胶。

在一些实施方式中，基质包括使其不致栓塞的材料，或经其处理，例如天然材料，例如基膜蛋白，例如层粘连蛋白和IV型胶原蛋白；和合成材料例如EPTFE或切开的聚氨酯脲硅酮，例如PURSPAN（The PolymerTechnology Group，Inc.，Berkeley，Calif）。该材料可以进一步处理使得支架不致栓塞，例如，使用肝素处理，以及改变材料表面电荷的处理，例如血浆包被。

包括羊膜来源的贴壁细胞的治疗的细胞组合物还可以以基质－细胞复合物的形式提供。基质可以包括生物可相容的支架、点阵、自组装结构等等，不论其可生物吸收与否或是液体、凝胶或固体。本领域已知该基质可用于治疗细胞处理、手术恢复、组织工程和创伤愈合。在某些实施方式中，细胞附着于基质。在其它实施方式中，细胞包埋或包含在基质空间内。最优选的是那些细胞与基质紧密相连生长的基质－细胞复合物，且当医疗上使用时，其刺激并支撑受体细胞的向内生长。基质-细胞组合物可用本领域已知的任何方法导入个体体内，包括但不限于植入、注射、手术附着、移植其它组织、注射等等。在一些实施方式中，基质形成于体内或原位。例如，可以使用原位可聚合凝胶配合本发明。该凝胶的例子是本领域已知的。

在一些实施方式中，本发明提供的细胞接种至该三维基质上，例如支架，并植入体内，其中接种的细胞在框架上或框架内进行增殖或在体内帮助培植替换组织，其中可以有其它细胞的协同作用，也可以没有。羊膜来源的贴壁细胞或其共培养物在三维框架的生长优选的导致形成三维组织或其基础，其可以在体内进行利用，例如用于修复损坏的或患病的组织。例如，三维支架可用于形成管状结构，例如用于修复血管；或循环系统或冠状结构的方面。按照本发明的一个方面，羊膜来源的贴壁细胞或其共培养物被接种于三维框架或基质，例如支架、泡沫或水凝胶。框架可以设置为不同形状，例如基本为平的、基本为圆柱的或管状的，或可以完全是自由形态的，因为可能需要或要求其在考虑之中为可修正的结构。在一些实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞生长于三维结构，而在其它实施方式中，细胞只是勉强存活或甚至死亡，但刺激或促进了受体内的新组织向内生长或血管形成。

本发明的细胞可以在培养物中自由生长，从培养物中移出并接种至三维框架。用一定浓度细胞接种三维框架，例如，大约10⁶至5×10⁷细胞每微升，优选的导致三维支撑的培植以相对较短的时间进行。另外，在一些应用中可以优选的使用更多或更少的细胞数量，其取决于期望的效果。

在一个具体的实施方式中，可以将基质切成条状（例如，形状为矩形），其宽度大约等于其最终将要插入的管状器官的内径。羊膜来源的贴壁细胞可以接种至支架并通过流动或悬浮于液体培养基中进行培养。当达到合适的汇合度阶段，可以通过将长边接在一起将支架卷入管中。然后可以使用合适材料、合适直径的纤维缝合两个边缘将缝隙封闭。为了防止细胞堵塞内腔，可以将管状框架的一个开口端固定在喷嘴上。可以将液体培养基从连接培养室的来源室进行挤压通过喷嘴，在管状框架内部形成流体。可以将另一个开口端固定于出液孔，其连接受集室，其中培养基可以通过来源室进行再循环。当培养完成后可以使管子脱离喷嘴和出液孔。参见，例如，国际申请号WO94/25584。

一般而言，可以按照本发明使用任何下述方法将两个三维框架组合成一个管子。可以将两个或更多平面框架置于另一个顶部并进行缝合。然后可以将得到的双层片进行翻卷，并按照上述方法进行连接和密封。在某些实施方式中，可以用羊膜来源的贴壁细胞接种一个作为内层的管状支架并进行培养。可以将第二支架生长为扁平条带，其宽度略大于管状框架的外径。在获得合适的生长后，将扁平框架包在管状支架的外部，然后封闭扁平框架两端的缝隙并将扁平框架密封至内管。在另一个实施方式中，可以将两种或更多直径稍有不同的管状网络进行分别生长。可以将具有较小直径的框架插入较大的内部并进行密封。对于每种这样的方法，可以通过对双层管重复使用该方法在其中添加更多的层。可以在羊膜来源的贴壁细胞生长的任何阶段组合支架，且组合支架的培养可以在需要时继续进行。

与上述操作一起，本发明提供的细胞和治疗组合物可与能够移植的设备一起使用。例如，羊膜来源的贴壁细胞可以与例如支架、人工瓣膜、心室辅助设备、电解可脱性弹簧圈等等一同施用。由于所述设备可能构成针对需要该治疗的个体的主要治疗手段，细胞等可以用作辅助性治疗剂或第二治疗剂使用，以辅助、刺激或促进植入设备区域的适当愈合。本发明的细胞和治疗组合物还可以用于预处理某些可移植设备，以最小化其在体内使用时的问题。该预处理的设备，包括包被的设备，可以更好地被移植它们的患者所接纳，降低了局部或系统性感染的风险，或例如血管重狭窄或进一步闭塞的风险。

5.8.3羊膜来源的贴壁细胞条件培养基

本发明进一步提供羊膜来源的贴壁细胞条件培养基，即，包含贴壁细胞分泌或排出的一种或多种生物分子的培养基。在不同的实施方式中，条件培养基包括培养基中细胞生长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次群倍增，或更多。在其它实施方式中，条件培养基包括培养基中羊膜来源的贴壁细胞已经生长到至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％汇合度，或直至100％汇合度。该条件培养基可用于支撑细胞群的培养，例如，干细胞，例如，胎盘干细胞、胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、成体干细胞等。在另一个实施方式中，条件培养基包括培养基中羊膜来源的贴壁细胞和非羊膜来源的贴壁细胞被共同培养。

条件培养基可以包括本发明提供的贴壁细胞。从而，本发明提供包括羊膜来源的贴壁细胞的细胞培养物。在一个具体的实施方式中，条件培养基包括多个，例如，羊膜来源的贴壁细胞群。

所述条件培养基可以使用本领域公知的方法从所述细胞培养物收集以及过滤和/或灭菌，例如，可以将所述条件培养基灭菌以中和为清除污染物而过滤通过过滤器小孔（例如，0.22μM过滤器）的任何潜在污染物的活性。在一些实施方式中，所述条件培养基在收集和灭菌/过滤之后可以立即用于本发明提供的治疗方法中。在其它实施方式中，所述条件培养基可以冷冻储存以备随后用于本发明提供的治疗方法中。

5.9羊膜来源的贴壁细胞的保存

在例如收集过程或使用诸如本发明描述的方法来生产本发明描述的组合物之前，可以将羊膜来源的贴壁细胞保存于，即，置于允许长期存储的条件下，或抑制诸如凋亡或坏死的细胞死亡的条件下。

羊膜来源的贴壁细胞可以使用例如包含凋亡抑制剂、坏死抑制剂和/或携氧全氟化碳的组合物进行保存，如描述于美国申请公开号2007/0190042，其公开内容本发明全文引入作为参考。在一个实施方式中，保存该细胞或该细胞群的方法包括将所述细胞或细胞群与细胞收集组合物接触，包括凋亡抑制剂和携氧全氟化碳，其中与不接触凋亡抑制剂的细胞群相比，所述凋亡抑制剂的用量和使用时间足以减少或防止细胞群中的凋亡。在一个具体的实施方式中，所述凋亡抑制剂为半胱天冬酶抑制剂。在另一个具体的实施方式中，所述凋亡抑制剂为JNK抑制剂。在一个更加具体的实施方式中，所述JNK抑制剂不调节羊膜来源的贴壁细胞的分化或增殖。在另一个实施方式中，所述细胞收集组合物包含所述凋亡抑制剂且所述携氧全氟化碳在不同的相中。在另一个实施方式中，所述细胞收集组合物在乳液中含有所述凋亡抑制剂和所述携氧全氟化碳。在另一个实施方式中，细胞收集组合物还包含乳化剂，例如，卵磷脂。在另一个实施方式中，在接触细胞时所述凋亡抑制剂和所述全氟化碳为大约0℃至大约25℃。在另一个更具体的实施方式中，在接触细胞的时候所述凋亡抑制剂和所述全氟化碳为大约2℃至10℃、或大约2℃至大约5℃。在另一个更具体的实施方式中，所述接触在所述细胞群传递过程中进行。在另一个更具体的实施方式中，所述接触在所述细胞群冻融过程中进行。

羊膜来源的贴壁细胞群可以通过例如包括将所述细胞群与凋亡抑制剂和器官保存化合物进行接触的方法进行保存，其中与不接触凋亡抑制剂的细胞群相比，所述凋亡抑制剂的用量和使用时间足以减少或防止细胞群中的凋亡。在一个具体的实施方式中，器官保存化合物为UW溶液（描述于美国专利号4,798,824；也称为ViaSpan；还参见Southard等人，Transplantation49（2）：251-257（1990））或描述于Stern等人，美国专利号5,552,267的溶液。在另一个实施方式中，所述器官保存化合物为羟乙基淀粉、乳糖酸、棉子糖、或其组合。在另一个实施方式中，细胞收集组合物还包含携氧全氟化碳，其存在于两相中或以乳液形式存在。

在所述方法的另一个实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞在组织破碎（例如羊膜组织的酶促消化）过程中与包含凋亡抑制剂和携氧全氟化碳的细胞收集组合物、器官保存化合物或其组合进行接触。在另一个实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞在通过例如酶促消化羊膜组织的组织破碎进行收集后与细胞收集组合物接触。

一般地，在收集、富集和分离羊膜来源的贴壁细胞过程中，优选最小化或消除由于低氧和机械压力造成的细胞压力。从而，在本方法的另一个实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞或含有羊膜来源的贴壁细胞的细胞群在收集、富集和分离时在所述保存过程中被暴露于低氧条件下少于6小时，其中低氧条件为氧浓度例如低于正常的大气氧浓度；低于正常血氧浓度等。在一个更加具体的实施方式中，所述细胞或所述细胞群在所述保存过程中暴露于所述低氧条件下少于2小时。在另一个更具体的实施方式中，所述细胞或所述细胞群在收集、富集或分离过程中暴露于所述低氧条件下少于1小时，或低于30分钟，或不暴露于低氧条件。在另一个具体的实施方式中，所述细胞群在收集、富集或分离过程中不暴露于剪切力。

羊膜来源的贴壁细胞可以通过一般方法或本发明公开的特殊方法进行低温贮藏，例如，在诸如安瓶的小容器中的低温贮藏培养基内保存。合适的低温贮藏培养基包括但不限于以下培养基，包括，例如，生长培养基，或细胞冷冻培养基，例如商业可获得的细胞冷冻培养基，例如，根据SigmaAldrich产品目录号C2695、C2639（1×细胞冷冻无血清培养基，不含DMSO）或C6039（1×细胞冷冻甘油培养基，含有最小必需培养基、甘油、小牛血清和牛血清）的细胞冷冻培养基、Lonza PROFREEZE^TM2×培养基、甲基纤维素、葡聚糖、人血清白蛋白、胎牛血清、胎牛血清、或勃脉力。低温贮藏培养基优选的包括DMSO（二甲亚砜）或甘油，其浓度为，例如，大约1％至大约20％，例如，大约5％-10％（v/v），可选的包含胎牛血清或人血清。低温贮藏培养基可以包含其它试剂，例如，含或不含甘油的甲基纤维素。分离的羊膜来源的贴壁细胞在低温贮藏中优选的以大约1℃/min的速度冷冻。优选的低温贮藏温度为大约-80℃至大约-180℃，优选的大约-125℃至大约-140℃。低温贮藏细胞可以在解冻使用之前被转移至液氮的气相中。在一些实施方式中，例如，一旦安瓶达到大约-80℃，其即被转移至液氮储存区内。低温贮藏也可以使用可控速率的冰箱。低温贮藏细胞优选的大约25℃至大约40℃的温度下解冻，优选大约37℃的温度。

5.10修饰的羊膜来源的贴壁细胞

5.10.1遗传修饰的羊膜来源的贴壁细胞

在另一个方面，本发明描述的羊膜来源的贴壁细胞可以是遗传修饰的，例如，以制备目标核酸或多肽，或制备分化型细胞，例如成骨细胞、成心肌细胞、周细胞或贴壁细胞，其制备目标核酸或多肽。可以使用例如基于病毒的载体进行遗传修饰，包括但不限于，非整合型复制载体，例如，乳突瘤病毒载体，SV40载体、腺病毒载体；整合型病毒载体，例如，逆转录病毒载体或腺体相关的病毒载体；或复制－缺陷型病毒载体。将DNA导入细胞的其它方法包括使用脂质体、电穿孔、基因枪、直接DNA注射等。

本发明提供的贴壁细胞可以，例如，转化或转染DNA，其被控制或可操作地连接一种或多种合适的表达调控元件，例如，启动子或增强子序列、转录终止子、多腺苷酸化位点、内部核酸进入位点。优选的，该DNA包括可选标记物。在外源DNA导入后，工程化的贴壁细胞可以例如在富集培养基中生长并随后转移至筛选培养基。在一个实施方式中，用于工程化羊膜来源的贴壁细胞的DNA包括编码目标多肽的核酸序列，例如，细胞因子、生长因子、分化剂或治疗多肽。

用于工程化贴壁细胞的DNA可以包括任何本领域已知的启动子以在哺乳动物细胞，例如，人细胞中驱动表达核苷酸序列。例如，启动子包括但不限于㎝V启动子/增强子、SV40启动子、乳突瘤病毒启动子、EB病毒启动子、弹性蛋白基因启动子等等。在一个具体的实施方式中，启动子是可调节的，从而核苷酸序列只有在需要时才进行表达。启动子可以是诱导型（例如，与金属硫蛋白和热休克蛋白相关的）或组成型的。

在另一个具体的实施方式中，启动子为组织特异性或表现出组织特异性。该启动子的例子包括但不限于肌凝蛋白轻链-2基因控制区（Shani，1985，Nature314：283）（骨骼肌）。

本发明公开的羊膜来源的贴壁细胞可以进行工程化或用其他方式筛选“敲除（knock out）”或“敲低（knock down）”一种或多种基因在该细胞中的表达。细胞自身基因的表达可以通过例如同源重组的方式使基因完全失活来进行抑制。在一个实施方式中，例如，通过诸如neo的阳性筛选标记物打断编码蛋白重要区域的外显子或5’至该区域的外显子，防止从目标基因产生常规mRNA并导致该基因失活。还可以通过在基因的一部分创造缺口或缺失整个基因来使基因失活。通过使用具有在基因组上彼此远离的两个目标基因的同源区域的构建子，可以缺失介于该两个区域之间的序列（Mombaerts等人，1991，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.88：3084）。抑制目标基因表达的反义、吗啉代（morpholinos）、DNA酶、干扰小RNA、短发卡样RNA和核酶分子也可以用于降低贴壁细胞中的目标基因活性。例如，已发现抑制主要的组织相容性基因复合物（HLA）表达的反义RNA分子对于免疫响应而言是最通用的。可以使用三螺旋分子降低目标基因活性水平。参见，例如，L.G.Davis等（编辑），1994，BASIC METHODS INMOLECULAR BIOLOGY，第2版，Appleton & Lange，Norwalk，Conn.，其引入本发明作为参考。

在一个具体的实施方式中，本发明公开的羊膜来源的贴壁细胞可以使用包括编码目标多肽的核苷酸序列的核酸分子进行遗传修饰，其中目标多肽的表达是可通过外源因子控制的，例如，多肽、有机小分子，等。目标多肽可以是治疗多肽。在一个更具体的实施方式中，目标多肽是IL-12或白细胞介素-1受体拮抗剂（IL-1Ra）。在另一个更具体的实施方式中，目标多肽为白细胞介素-1受体拮抗剂与二氢叶酸还原酶（DHFR）汇合物，且外源因子为抗叶酸素，例如，氨甲喋呤。该构建子通过接触氨甲喋呤可用于工程化羊膜来源的贴壁细胞，其表达IL-1Ra、或IL-1Ra和DHFR汇合物。该构建子可用于，例如，治疗风湿性关节炎。在本实施方式中，在暴露于诸如氨甲喋呤的抗叶酸素时IL-1Ra和DHFR汇合物转译上调。从而，在另一个具体的实施方式中，用于遗传工程化羊膜来源的贴壁细胞的核酸可以包括核苷酸序列，其编码第一多肽和第二多肽，其中所述第一和第二多肽作为汇合蛋白进行表达，其在外源因子存在下转译上调。多肽可以短暂或长期（例如，经过数周或数月的时间）表达。该核酸分子可以另外包括编码多肽的核苷酸序列，其允许对工程化的细胞进行阳性筛选，或允许工程化细胞可视化。在另一个更具体的实施方式中，核苷酸序列编码多肽，其在例如荧光素酶（Luc）的适当可视化条件下发生荧光。在一个更具体的实施方式中，该核酸分子可以包括IL-1Ra－DHFR－IRES－Luc，其中IL-1Ra为白细胞介素-1受体拮抗剂，IRES为核糖体内部进入位点，以及DHFR为二氢叶酸还原酶。

5.10.2永生化的羊膜来源的贴壁细胞系

哺乳动物羊膜来源的贴壁细胞可以通过转染任何含有促生长基因的合适载体进行有条件的永生化，即，编码在适当条件下促进转染细胞生长的蛋白的基因，从而促生长蛋白的制备和/或活性可以由外部因子调节。在优选的实施方式中促生长基因为癌基因，例如但不限于，v－myc、N－myc、c-myc、p53、SV40大T抗原、多瘤病毒大T抗原、E1a腺病毒或人乳突瘤病毒E7蛋白。在另一个实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞可以使用cre－lox重组永生化，如Narushima，M.等人，（Nature Biotechnology，2005，23（10：1274-1282）中的针对人胰腺β-细胞系的例子所示。

促生长蛋白的外部调控可以通过将促生长基因置于外部可调节的启动子的控制下进行，例如，一种活性可以通过例如改变转染细胞或与细胞接触的培养基组合物的温度进行控制的启动子。在一个实施方式中，可以采用四环素（tet）控制的基因表达系统（参见Gossen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：5547-5551，1992；Hoshimaru等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：1518-1523，1996）。在tet不存在的情况下，在该载体中的tet－控制的反式激活子（tTA）强烈激活来自ph_㎝V*-1的转录，后者是来自人巨细胞病毒的最小启动子，其与tet操纵子序列汇合。tTA为转座子-10衍生的大肠杆菌（Escherichia coli）tet抗性操纵子抑制剂（tetR）与单纯疱疹病毒VP16的酸性区域的汇合蛋白。低的、无毒性的tet浓度（例如，0.01-1.0μg/mL）被tTA几乎完全取消了反式激活。

在一个实施方式中，载体进一步包含编码可选标记物的基因，例如，产生抗药性的蛋白。细菌新霉素抗性基因（neo^R）是一种可用于本方法的标记物。携带neo^R的细胞可以通过本领域一般技术人员知晓的方法进行筛选，例如将100-200μg/mL G418添加至生长培养基中。

转染可以通过本领域一般技术人员知晓的方法进行，包括但不限于，逆转录病毒感染。一般而言，细胞培养物可以通过与收集自载体的生产细胞系的条件培养基混合物和含有N2补充物的DMEM/F12一起孵育进行转染。例如，按照上述制备的胎盘细胞培养物可以在体外例如5天后通过与一体积的条件培养基和两体积的含有N2补充物的DMEM/F12孵育大约20小时进行转染。然后可以按照上述筛选携带可选标记物的转染的细胞。

转染后，将培养物传代到允许增殖的表面，例如，允许至少30％的细胞在24小时的时间内倍增。优选的，基质为聚鸟氨酸/层粘连蛋白基质，包括包被有聚鸟氨酸（10μg/mL）和/或层粘连蛋白（10μg/mL）的组织培养塑料、聚赖氨酸/层粘连蛋白基质或用纤维粘连蛋白处理的表面。然后每3-4天给培养物补充生长培养基，其中可以或可以不补充一种或多种增殖－增强因子。增殖－增强因子可以在培养物低于50％汇合度状态下添加至生长培养基。

条件永生化的羊膜来源的贴壁细胞系可以使用标准技术传代，例如当80-95％汇合度时通过胰蛋白酶消化。在一些实施方式中，直至大约第20代才有利于维持筛选（例如通过在含有新霉素抗性基因的细胞中添加G418）。也可以将细胞冷冻在液氮中长时间保存。

可以从根据上述制备的条件永生化的贴壁细胞系中分离无性细胞系。一般而言，该无性细胞系可以使用标准技术进行分离，例如通过有限稀释或使用克隆环，并进行扩增。无性细胞系一般可以按照上述进行培养和传代。

条件永生化的人羊膜来源的贴壁细胞系，其可以是克隆的，但不是必需，一般可以通过在利于分化的培养条件下抑制促生长蛋白的制备和/或活性进行诱导分化。例如，如果编码促生长蛋白的基因在外部可调节的启动子的控制下，诸如温度或培养基组合物的条件可以进行改变以抑制促生长基因的转录。对于上述四环素控制的基因表达系统，可以通过添加四环素抑制促生长基因的转录进行分化。一般而言，4-5天的1μg/mL四环素足以启动分化。为了促进进一步分化，在生长培养基中可以还包含其它试剂。

5.11剂量和给药途径

可以通过任何医学上可接受的与待治疗的CNS损伤相关性疾病、障碍或病况有关的途径，将羊膜来源的贴壁细胞（AMDAC）施用给需要它的个体。在如上所述的治疗方法的一个具体实施方式中，所述的AMDAC经团注射给药。在另一个具体实施方式中，所述的分离的AMDAC经静脉内给药，例如，通过静脉内输注。在一个具体实施方式中，所述的静脉内输注是静脉内输注超过大约1到大约8小时。在另一个具体实施方式中，所述的分离的AMDAC经局部给药，例如，在受与CNS损伤相关的疾病、障碍或者病况影响的个体的特定身体部位。在另一个具体实施方式中，所述的分离的AMDAC经颅内给药。在另一个具体实施方式中，所述的分离的AMDAC经肌内注射给药。在另一个具体实施方式中，所述的分离的AMDAC经腹腔内给药。在另一个具体实施方式中，所述的分离的AMDAC经动脉内给药。在所述治疗方法的另一个具体实施方式中，所述的分离的AMDAC经肌内、皮内或者皮下给药。在另一个具体实施方式中，所述的分离的AMDAC经静脉内给药。在另一个具体实施方式中，所述的分离的AMDAC经脑室内给药。在另一个具体实施方式中，所述的分离的AMDAC经胸骨内给药。在另一个具体实施方式中，所述的分离的AMDAC经滑液给药。在另一个具体实施方式中，所述的分离的AMDAC经眼内给药。在另一个具体实施方式中，所述的分离的AMDAC经玻璃体内给药。在另一个具体实施方式中，所述的分离的AMDAC经脑内给药。在另一个具体实施方式中，所述的分离的AMDAC给药经侧脑室内。在另一个具体实施方式中，所述的分离的AMDAC经鞘内给药。在另一个具体实施方式中，所述的分离的AMDAC经骨髓输液给药。在另一个具体实施方式中，所述的分离的AMDAC经膀胱内给药。在另一个具体实施方式中，所述的分离的AMDAC经透皮给药。在另一个具体实施方式中，所述的分离的AMDAC经脑池内给药。在另一个具体实施方式中，所述的分离的AMDAC经硬膜内给药。

在如上所述的治疗方法的另一个具体实施方式中，所述AMDAC向所述个体施用一次。在另一个具体实施方式中，所述分离的AMDAC按两次或多次单独给药方式施用到所述个体。在另一个具体实施方式中，所述给药包括施用大约1×10⁴和1×10⁵之间的分离的AMDAC，例如，AMDAC每千克所述个体。在另一个具体实施方式中，所述给药包括每千克所述个体施用大约1×10⁵和1×10⁶之间的分离的AMDAC。在另一个具体实施方式中，所述给药包括每千克所述个体施用大约1×10⁶和1×10⁷之间的分离的AMDAC。在另一个具体实施方式中，所述给药包括每千克所述个体施用大约1×10⁷和1×10⁸之间的分离的AMDAC。在另一个具体实施方式中，所述给药包括每千克所述个体施用大约1×10⁸和1×10⁹之间的分离的AMDAC。在另一个具体实施方式中，所述给药包括每千克所述个体施用大约1×10⁹和1×10¹⁰之间的分离的AMDAC。在另一个具体实施方式中，所述给药包括每千克所述个体施用大约1×10¹⁰和1×10¹¹之间的分离的AMDAC。在其它具体实施方式中，所述给药包括每千克所述个体施用大约1×10⁶和大约2×10⁶之间的分离的AMDAC；每千克所述个体大约2×10⁶和大约3×10⁶之间的分离的AMDAC；每千克所述个体大约3×10⁶和大约4×10⁶之间的分离的AMDAC；每千克所述个体大约4×10⁶和大约5×10⁶之间的分离的AMDAC；每千克所述个体大约5×10⁶和大约6×10⁶之间的分离的AMDAC；每千克所述个体大约6×10⁶和大约7×10⁶之间的分离的AMDAC；每千克所述个体大约7×10⁶和大约8×10⁶之间的分离的AMDAC；每千克所述个体大约8×10⁶和大约9×10⁶之间的分离的AMDAC；或者每千克所述个体大约之间9×10⁶和大约1×10⁷分离的AMDAC。在另一个具体实施方式中，所述给药包括每千克所述个体施用1×10⁷和大约2×10⁷之间的分离的AMDAC。在另一个具体实施方式中，所述给药包括每千克所述个体施用大约1.3×10⁷和大约1.5×10⁷之间的分离的AMDAC。在另一个具体实施方式中，所述给药包括每千克所述个体施用多达大约3×10⁷的分离的AMDAC。在一个具体实施方式中，所述给药包括对所述个体施用大约5×10⁶和大约2×10⁷之间的分离的AMDAC。在另一个具体实施方式中，所述给药包括对所述个体施用大约20毫升溶液中的大约150×10⁶分离的AMDAC。

在如上所述的治疗方法的另一个具体实施方式中，分离的AMDAC以单一的单位剂量对所述个体施用。在具体的实施方式中，单一的单位剂量的AMDAC在各实施方式中可包括大约、至少或者最多1×10⁵，5×10⁵，1×10⁶，5×10⁶，1×10⁷，5×10⁷，1×10⁸，5×10⁸，1×10⁹，5×10⁹，1×10¹⁰，5×10¹⁰，1×10¹¹或更多的AMDAC。

在一个具体实施方式中，所述给药包括对所述个体施用大约5×10⁶和大约2×10⁷之间的分离的AMDAC，其中所述细胞包含在包括10%葡聚糖，例如葡聚糖-40，5%人血清白蛋白和可选地一种免疫抑制剂的溶液中。在另一个具体实施方式中，所述给药包括静脉内施用大约5×10⁷和3×10⁹之间的分离的AMDAC。在更具体的实施方式中，所述给药包括静脉内施用大约9×10⁸分离的AMDAC或者大约1.8×10⁹分离的AMDAC。在另一个具体实施方式中，所述给药包括颅内施用大约5×10⁷和1×10⁸之间的分离的AMDAC。在一个更具体的实施方式中，所述给药包括颅内施用给药大约9×10⁷分离的AMDAC。

对需要的个体施用AMDAC条件培养基可以通过与待治疗的CNS损伤相关性疾病、障碍或者病况有关的任何医学可接受的途径，包括但不限于，团注射，静脉内（例如静脉内输注）、局部（例如，遭受与CNS损伤相关的疾病、障碍或者病况的个体的特定身体部位）、颅内、肌内、腹腔内、动脉内、肌内、皮内、皮下、脑室内、滑膜内、眼内、玻璃体内、脑内、侧脑室内、鞘内、骨髓输液、膀胱内、透皮、脑池内或者硬膜内。在一个具体实施方式中，AMDAC条件培养基被连续输注给药。在另一个具体实施方式中，AMDAC条件培养基以单一剂量给药。

在一些实施方式中，对其中需要的个体施用AMDAC条件培养基包括每100克体重施用大约0.01至大约0.02毫升AMDAC条件培养基，每100克体重大约0.01到大约0.05毫升AMDAC条件培养基，每100克体重大约0.01到大约0.1毫升AMDAC条件培养基，每100克体重施用大约0.01到大约0.15毫升AMDAC条件培养基，每100克体重大约0.01到大约0.2毫升AMDAC条件培养基，每100克体重大约0.01到大约0.25毫升AMDAC条件培养基，每100克体重大约0.01到大约0.3毫升AMDAC条件培养基，每100克体重大约0.01到大约0.35毫升AMDAC条件培养基，每100克体重大约0.01到大约0.4毫升AMDAC条件培养基，每100克体重大约0.01到大约0.45毫升AMDAC条件培养基，或者每100克体重大约0.01到大约0.5毫升AMDAC条件培养基。

5.12羊膜来源的贴壁细胞的分化

本发明提供的羊膜来源的贴壁细胞可以是分化的。在一个实施方式中，通过例如使细胞接触血管内皮生长因子（VEGF），或按照描述于下述5.11.2、6.3.3或6.3.4节的方法，细胞已经充分分化至能够表现出至少一种的内皮细胞、肌性细胞或周细胞的特征。在更具体的实施方式中，所述内皮细胞、肌性细胞或周细胞的特征是表达CD9、CD31、CD54、CD102、NG2（神经/神经胶质抗原2）或α平滑肌肌动蛋白中的一种或多种，其相对于OCT-4^－、VEGFR2/KDR⁺、CD9⁺、CD54⁺、CD105⁺、CD200⁺，和VE-钙粘蛋白^－羊膜细胞而言表达增强。在其它更加特殊的实施方式中，所述内皮细胞、肌性细胞或周细胞的特征是表达CD9、CD31、CD54、CD102、NG2（神经/神经胶质抗原2）或α平滑肌肌动蛋白中的一种或多种，其相对于OCT-4^－、VEGFR2/KDR⁺，和VEGFR1/Flt-1⁺羊膜细胞而言表达增强。

本发明提供的羊膜来源的贴壁细胞的肌源性（心源性）分化可以通过例如将细胞置于诱导分化为成心肌细胞的培养条件下来实现。优选的成心肌细胞培养基包括补充1μM类维生素A的DMEM/20％CBS；碱性成纤维细胞生长因子，10ng/mL；以及转化生长因子β-1，2ng/mL；以及表皮生长因子，100ng/mL。KnockOut血清替代品（Invitrogen，卡尔斯巴德，California）可用于替代CBS。可选的，羊膜来源的贴壁细胞培养于补充1-100的DMEM/20％CBS中24小时，例如，50ng/mL的心肌营养蛋白-1。在另一个实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞可以培养10-14天，其中在无蛋白培养基中培养5-7天，然后使用例如在补充1％脐带血血清的1％HEPES缓冲液中匀浆人心肌得到的人心肌提取物进行刺激。

可以通过例如RT/PCR显示基因表达或通过可观察的细胞博动（beating）来确认分化。当细胞表现出一种或多种的这些特征时可以认为贴壁细胞已经分化为心肌细胞。

5.12.1分化成神经源性的细胞

羊膜来源的血管源性细胞当在神经源性条件下培养时，分化成显示出神经形态学和神经标记物的细胞。例如，AMDAC，例如在包含15%v/v FBS的DMEM/F12培养基中扩增4天的AMDAC，与碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）（例如以大约20ng/毫升）、表皮生长因子（EGF）（例如以大约20ng/毫升）一起培养例如4天，接着在包括DMEM/F12的无血清诱导培养基中培养4天，其中含有200mM丁基羟基茴香醚、10nM氯化钾、5毫克/ml胰岛素、10nM毛喉素、4nM丙戊酸和2nM氢化可的松。在这些条件下，通过抗体染色法评价，AMDAC显示出表达人巢蛋白、Tuj1和GFAP。

5.12.2不分化成成骨细胞

羊膜来源的贴壁细胞在成骨标准分析法中不显示成骨性分化。例如，在一个实施方式中，如在成骨条件下显示出AMDAC缺乏冯库萨染色那样，例如由缺乏钙储存可显示出AMDAC缺乏成骨分化。例如，AMDAC（例如新制备或者冷冻保存的AMDAC）可以悬浮于生长培养基中，例如，以大约5000细胞/㎝²悬浮于24孔平板和6孔平板中的生长培养基中，并且孵育过夜，然后在成骨培养基中培养14-35天（例如28天）。在某些实施方式中，成骨培养基包括低糖DMEM、10%v/v胎牛血清（FBS）、10mMβ-磷酸甘油、100nM地塞米松和100nM抗坏血酸磷酸盐，补充转化生长因子-β（TGF-β1），例如以1-100ng/mL，例如20ng/mL，和人重组骨形态发生蛋白-2（BMP-2），例如1-100ng/mL，例如，40ng/mL。然后使用冯库萨染色法按标准实验方案将细胞染色；黑银沉淀物的发展表明骨盐沉积作用的存在。就AMDAC而言，例如与骨髓间质干细胞相比，培养应该基本上（例如完全）无储存(deposit)，表明AMDAC不产生钙储存，因此不分化成成骨性途径。

5.12.3不分化成软骨形成细胞

类似地羊膜来源的贴壁细胞在软骨形成标准分析中不显示软骨形成分化。例如，在一个实施方式中，由在细胞颗粒可发展成软骨形成细胞的软骨形成分析中细胞颗粒的AMDAC缺乏发展可显示出AMDAC缺乏软骨形成分化。例如，AMDAC，例如新制备的或者冷冻保存的，例如2.5×10⁵个细胞，可置于15mL锥形管中并在室温下以200×g离心5分钟，以形成球形细胞颗粒。收集的细胞然后在软骨形成诱导培养基中培养3周，所述培养基例如龙沙软骨细胞培养基包含TGFβ-3（例如大约10ng/mL）、重组人生长/分化因子-5（rhGDF-5）（例如大约500ng/mL）、或者TGFβ-3（10毫微克/毫升）和rhGDF-5（例如大约500ng/mL）的组合。在3周结束时，所述细胞用阿尔新蓝染色，其粘对软骨形成细胞产生的多糖和氨基多糖染色。通常，当BM-MSCs或者软骨细胞在这些条件下培养时，将发展对阿尔新蓝染色阳性的细胞颗粒，AMDAC既不形成颗粒也不被阿尔新蓝染色。

6.实施例

6.1实施例1：来自羊膜的贴壁细胞的分离和扩增

本实施例显示羊膜来源的贴壁细胞的分离和扩增。

6.1.1分离

羊膜来源的贴壁细胞按照下述方法从羊膜中分离。从胎盘切下羊膜/绒毛膜，并将羊膜从绒毛膜中进行手工分离。用无菌PBS洗涤羊膜去除剩余的血液、血块和其它物质。使用无菌纱布去除洗涤未曾除去的血液、血块或其它物质，并用PBS再次洗涤羊膜。从膜上去除多余的PBS，并用手术刀将羊膜切成2”乘2”的碎片。为了释放上皮细胞，通过将无菌加套的玻璃加工容器与37℃循环水浴使用管路和连接器进行连接，并安装至搅拌盘上，来构建加工容器。将胰蛋白酶（0.25％，300mL）在加工容器中加热至37℃；加入羊膜碎片，搅拌羊膜/胰蛋白酶悬液，例如，在37℃下100RPM-150RPM搅拌15分钟。将无菌容器置于靠近加工容器的无菌区域内并在其中插入无菌的75μm-125μm筛选器（Millipore，Billerica，MA），装配无菌筛选系统。搅拌羊膜碎片15分钟后，将加工容器的内容物转移至筛选器，并使用例如无菌镊子将羊膜碎片转移回加工容器；丢弃含有上皮细胞的胰蛋白酶溶液。将羊膜碎片与如上所述的300mL胰蛋白酶溶液（0.25％）进行再次搅拌。用大约100-150mL的PBS洗涤筛选器，并丢弃PBS溶液。搅拌羊膜碎片15分钟后，将加工容器的内容物转移至筛选器。然后将羊膜碎片转移回加工容器；丢弃含有上皮细胞的胰蛋白酶溶液。将羊膜碎片与如上所述的300mL胰蛋白酶溶液（0.25％）进行再次搅拌。用洗涤筛选器大约100-150mL的PBS，并丢弃PBS溶液。搅拌羊膜碎片15分钟后，将加工容器的内容物转移至筛选器。然后将羊膜碎片转移回加工容器，并丢弃含有上皮细胞的胰蛋白酶溶液。在37℃下将羊膜碎片在PBS/5％FBS（体积比1∶1比例的羊膜∶PBS/5％FBS溶液）中搅拌大约2-5分钟中和胰蛋白酶。装配新鲜的无菌筛选系统。中和胰蛋白酶后，将加工容器的内容物转移至新筛选器，并将羊膜碎片转移回加工容器。室温下，将无菌PBS（400mL）加至加工容器，并将加工容器内容物搅拌大约2-5分钟。用大约100-150mL的PBS洗涤筛选器。搅拌后，将加工容器的内容物转移至筛选器；用PBS洗涤加工的烧瓶，并丢弃PBS溶液。用300mL预热的DMEM填充加工容器，并将羊膜碎片转移至DMEM溶液。

为了释放羊膜来源的贴壁细胞，将上述处理的羊膜进一步用胶原蛋白酶进行如下处理。通过在DMEM中溶解适当数量的胶原蛋白酶粉末（随着供应商提供的胶原蛋白酶批次的活性而变化）制备无菌胶原蛋白酶储存液（500U/mL）。将溶液经0.22μm过滤器过滤并分装至单独的无菌容器中。将CaCl₂溶液（0.5mL，600mM）加至各100mL剂量，并冷冻各剂量。在加工容器中将胶原蛋白酶（100mL）加至羊膜碎片，并对加工容器进行搅拌30-50分钟，或直至通过视觉观察羊膜已经消化完成。羊膜消化完成后，将100mL的预热的无菌PBS/5％FBS加至加工容器，并另外搅拌加工容器2-3分钟。搅拌后，烧瓶的内容物被转移至一个无菌60μm筛选器中，并通过真空过滤收集液体。加工容器用400mL的PBS洗涤，并无菌过滤该PBS溶液。然后将过滤的细胞悬液在20℃下离心300xg15分钟，并将细胞沉淀重悬于预热的PBS/2％FBS（共大约10mL）。

6.1.2培植

新鲜分离的血管生成羊膜细胞被加至含有60％DMEM-LG（Gibco）；40％MCBD-201（Sigma）；2％FBS（Hyclone Labs），1×胰岛素-转铁因子-硒补充剂（ITS）；10ng/mL亚油酸-牛血清白蛋白（LA-BSA）；1n－地塞米松（Sigma）；100μM抗坏血酸-2-磷酸酯（Sigma）；10ng/mL表皮生长因子（R&D系统）；以及10ng/mL血小板衍生的生长因子（PDGF-BB）（R&D系统）的生长培养基中，并以10,000细胞每㎝²的接种密度接种于T－Flask中。然后在37℃，5％CO₂和＞90％湿度下孵育培养设备。每天监控细胞的附着、生长和形态。及时去除非贴壁细胞和碎片在更换培养。培养基每周更换两次。具有典型的成纤维样/纺锤形态的贴壁细胞在最初接种的几天后出现。当汇合度达到40％-70％（最初接种后4-11天），通过胰蛋白酶消化（0.25％胰蛋白酶-EDTA）5分钟在室温下（37℃）收获细胞。用PBS-5％FBS中和后，细胞在室温下200-400g离心5-15分钟，然后重悬于生长培养基。这时，可以认为AMDAC系已经成功地在初代进行了培植。在一些情况下，将初代羊膜来源的贴壁细胞进行低温贮藏或扩增（例如在培养基中生长）。

6.1.3培养方法

羊膜来源的贴壁细胞培养于上述生长培养基中并在密度为2000-4000每㎝²下接种于合适的组织培养处理的培养设备。然后在37℃，5％CO₂和＞90％湿度下孵育培养设备。培养过程中，AMDAC将会贴壁并增殖。每天监控细胞的生长、形态和汇合度。如果培养延续至5天或更多则每周更换两次培养基补充新鲜营养物。当汇合度达到40％-70％（接种后3-7天）时，通过胰蛋白酶消化（0.05％-0.25％胰蛋白酶-EDTA）5分钟在室温下（37℃）收获细胞。用PBS-5％FBS中和后，细胞在室温下200-400g离心5-15分钟，然后重悬于生长培养基。

按照本方法分离并培养的AMDAC一般在接种的1×10⁶细胞中产生33530+/－15090集落形成单位（成纤维细胞）（CFU-F）。

6.2实施例2：羊膜来源的贴壁细胞的表型特征

6.2.1基因和蛋白表达谱

本实施例描述了羊膜来源的贴壁细胞的表型特征，包括细胞表面标记物、mRNA和蛋白质表达等特征。

样品制备：羊膜来源的贴壁细胞按照描述于实施例1的方法获得。第6代的细胞在描述于上述实施例1的生长培养基中生长至大约70％汇合度，进行胰蛋白酶化和PBS洗涤。将NTERA-2细胞（美国模式培养物保藏所，ATCC编号CRL-1973）生长于含有4.5g/L葡萄糖、2mM谷氨酰胺和10％FBS的DMEM。进行有核细胞计数以获得最少2×10⁶-1x10⁷细胞。然后使用Qiagen RNeasy试剂盒（Qiagen，瓦伦西亚，CA）裂解细胞，使用QIAshredder得到裂解物。然后使用Qiagen RNeasy试剂盒分离RNA。使用Nanodrop ND1000分光光度计检测RNA的数量和质量，25ng/μL RNA/反应。使用Applied Biosystems（Foster City，CA）的High Capacity cDNAArchive试剂盒进行cDNA反应。使用Applied Biosystems的

Universal PCR主要混合物进行实时PCR反应。在Applied Biosystems7300实时PCR系统中以标准模式进行40个循环的反应。

样品分析和结果：使用实时PCR方法和特定的

基因表达探针和/或

人血管生成阵列（Applied Biosystems），表征了细胞的干细胞相关的血管生成性和心原性标记物的表达。结果或者显示为与有关细胞对照相比目标基因的相对表达，或者与普遍存在的看家基因（例如，GAPDH、18S或GUSB）相比目标基因的相对表达（δCt）。

羊膜来源的贴壁细胞表达不同的干细胞相关性血管生成性和心原性基因，并且，与NTERA-2细胞相比，表现出相对缺失的OCT-4表达。表6总结了选定的血管生成、心原性和干细胞基因的表达。

表6：经RT-PCR测定羊膜来源的贴壁细胞的基因表达谱。

在一个单独的实验中，还发现AMDAC表达下述基因：芳基碳氢化合物受体核转运蛋白2（ARNT2）、神经生长因子（NGF）、脑衍生的神经营养因子（BDNF）、神经胶质衍生的神经营养因子（GDNF）、神经营养蛋白3（NT-3）、NT-5、低氧诱导的因子1α（HIF1A）、低氧诱导的蛋白2（HIG2）、血红素加氧酶（脱环）1（HMOX1）、胞外超氧化物歧化酶[Cu－Zn]（SOD3）、过氧化氢酶（CAT）、转化生长因子β1（TGFB1）、转化生长因子β1受体（TGFB1R）和肝细胞生长因子受体（HGFR/c-met）。

使用流式细胞术作为定量羊膜来源的贴壁细胞表型标记物的方法来定义细胞同一性。细胞样品来自冷冻储存。解冻前和试剂制备过程中，将细胞瓶维持在干冰上。然后，使用37℃水浴快速解冻样品。使用预冰冻的细胞计数（count）来计算初始解冻后基于数量的细胞稀释液。将冷冻管在37℃水浴中短暂解冻大约30秒并轻轻搅拌。解冻后马上将大约100-200μL冷的（2-8℃）解冻溶液（添加2.5％白蛋白和5％Gentran40的PBS）加至冷冻管并混合。轻柔混合后，将冷冻管的内容物全部转移到含有相等体积的冷的（2-8℃）解冻溶液的15mL圆锥管中。去除上清液之前，在室温下圆锥管中400g离心肌细胞5分钟。剩余体积用移液管测量（估测）；在室温下剩余体积和细胞沉淀重悬于含1％FBS的PBS中，得到细胞浓度250×x10³细胞/100μL缓冲液。例如，将1×10⁶细胞重悬于400μL1％FBS。将细胞悬液置于预标记物的5mL FACS管（Becton Dickinson（BD），FranklinLakes，NJ）。对于每种第一抗体类别，将100μL的细胞悬液分装至一个同型对照管。表型分析前，将全部抗体的浓度最优化以达到好的信号/噪声比以及CD抗原跨4-log动态范围的充分检测。对于用来染色各样品的各同型和样品抗体的体积进行了测定。为了标准化同型和样品管中抗体的量（以μg计），各抗体的浓度按照下式计算：（1/实际抗体浓度（μg/μL））×（对于2.5×10⁵细胞的目标最终抗体μg数）＝添加的抗体#μL。通过添加适当数量的抗体至各管中制备同型和样品的抗体主要混合物。将细胞在暗处室温下染色15-20分钟。染色后，通过离心（400g×5分钟）去除各样品中未结合的抗体，然后在重悬于150μL的室温1％FBS PBS之前使用2mL1％FBSPBS（室温）洗涤。然后在Becton Dickinson FACSCalibur、FACSCantoI或BD FACSCantoII流式细胞仪中按照生产商的使用说明进行样品分析。在不设定实时设备补偿参数的情况下得到多参数流式细胞仪数据集（侧散射（SSC）、前散射（FSC）和整合荧光谱（FL））。在得到（数据）后使用FACSDiva软件根据生产商的使用说明测定补偿参数。这些设备的设定被应用至各个样品。在这些研究中所使用的荧光基团偶联物为别藻蓝蛋白（APC）、荧光剂647（AF647）、异硫氰酸荧光素（FITC）、藻红蛋白（PE）和多甲藻素叶绿素蛋白（PerCP），其全部来自BD Biosciences。表7总结了选定的细胞表面标记物，包括血管生成标记物的表达。

表7：按照流式细胞术测定的羊膜来源的贴壁细胞中细胞表面标记物的表达。

在另一个实验中，AMDAC细胞被标记物了抗人CD49f（藻红蛋白－偶联的克隆GoH3；BD Pharmingen商品号555736），并通过流式细胞术进行分析。大约96％的AMDAC标记了抗CD49f（即，为CD49f⁺）。

在另外的实验中，通过免疫定位还发现AMDAC表达CD49a、CD106、CD119、CD130、c-met（肝细胞生长因子受体；HGFR）、CXC趋化因子受体1（CXCR1）、PDGFRA、和PDGFRB。通过免疫定位还发现AMDAC缺乏CD49E、CD62E、成纤维细胞生长因子受体3（FGFR3）、肿瘤坏死因子受体超家族成员12A（TNFRSF12A）、胰岛素样生长因子1受体（IGF-1R）、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR6、趋化因子受体1（CCR1）、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、表皮生长因子受体（EGF-R）、胰岛素受体（CD220）、白细胞介素受体4（IL4-R；CD124）、IL6-R（CD126）、TNF-R1a和1b（CD120a、b）以及erbB2/Her2的表达。

6.2.2使用免疫组织化学（IHC）/免疫荧光化学（IFC）评价羊膜来源的贴壁细胞的血管生成能力

将第6代羊膜来源的贴壁细胞在4孔腔式载玻片上生长至大约70％汇合度并用4％福尔马林溶液各固定30分钟。固定后，用PBS洗涤载玻片两次5分钟。将载玻片与来自第二抗体相同宿主的10％常规血清、2×酪蛋白和PBS中0.3％的Triton X100一起在室温下的湿度箱中孵育20分钟。吸干过量血清并用第一抗体（山羊多克隆IgG（Santa Cruz；Santa Cruz，CA））在湿度箱中孵育载玻片。孵育温度和时间取决于针对所用抗体筛选的最优条件。一般而言，孵育时间为37℃下1-2小时或4℃下过夜。然后用PBS洗涤载玻片三次各5分钟并在室温下湿度箱中与针对第一抗体（兔抗山羊抗体（Santa Cruz））宿主的荧光－偶联的抗免疫球蛋白第二抗体一起孵育20-30分钟。随后用PBS洗涤载玻片三次各5分钟，使用DAPI

（Vector Labs）装好盖玻片，加入溶液以复染胞核。细胞染色可以使用Nikon荧光显微镜进行观测。所有图像均采用相等的曝光时间，其针对对应类别（山羊IgG（Santa Cruz））的背景进行标准化。表8总结了羊膜来源的贴壁细胞表达血管生成蛋白的结果。

表8：羊膜来源的贴壁细胞存在或者缺失的血管生成标记物。

羊膜来源的贴壁细胞表达血管生成标记物肿瘤内皮细胞标记物7（TEM-7），表8所示蛋白质中的一种。参见图2。

6.2.3使用膜蛋白质组学评价羊膜来源的贴壁细胞的血管生成能力

膜蛋白纯化：将第6代羊膜来源的贴壁细胞在生长培养基中生长至大约70％汇合度，胰蛋白酶消化，并用PBS洗涤。在细胞裂解前，将细胞用含有蛋白酶抑制剂混合物（P8340，Sigma Aldrich，St.Louis，MO）的溶液孵育15分钟。然后通过添加10mM HCl溶液（从而避免使用洗涤剂）裂解细胞并在400g下离心10分钟以沉淀和去除胞核。将去核上清液转移至超离心管并使用具有T-1270转子（Thermo Fisher Scientific，Asheville，NC）的WX80超速离心机在100,000g下离心150分钟，产生膜蛋白沉淀。

蛋白脂质体的生成、固定化和消化：将膜蛋白沉淀用Nanoxis缓冲液（10mM Tris，300mM NaCl，pH8）洗涤几次。将膜蛋白沉淀重悬于1.5mL的Nanoxis缓冲液中，然后使用VIBRA-CELL^TMVC505超声处理器（Sonics&Materials，Inc.，Newtown，CT）在冰上尖端超声20分钟。通过使用FM1-43染料（Invitrogen，卡尔斯巴德，CA）染色测定蛋白脂质体大小并用荧光显微镜观察。蛋白脂质体悬液的蛋白浓度通过BCA分析（ThermoScientific）测定。然后使用标准移液管头将蛋白脂质体注射至LPI^TMFlowCell（Nanoxis AB，Gothenburg，Sweden）并使之固定化1小时。固定化以后，进行一系列洗涤步骤，并直接向LPI^TMFlow Cell注射胰蛋白酶5μg/mL（Princeton Separations，Adelphi，NJ）。37℃下将芯片孵育过夜，并将胰蛋白酶多肽从LPI^TM芯片上洗脱，然后使用Sep-Pak盒（WatersCorporation，Milford，MA）脱盐。

LTQ线性离子阱LC/MS/MS分析：将各胰蛋白酶消化样品在0.2mm×150mm3μm

MAGIC C18柱（Michrom Bioresources，Inc.，Auburn，CA）上分离，其直接连接于沿轴式去溶剂化真空辅助纳米毛细管级电喷雾电离（ADVANCE）源（Michrom Bioresources，Inc.）。使用180分钟梯度（缓冲液A：水，0.1％甲酸；缓冲液B：乙腈，0.1％甲酸）。ADVANCE源在非常高的流速3μL/min下操作是可以达到相当于传统的纳米ESI的灵敏度。在LTQ线性离子阱质谱仪（Thermo Fisher Scientific，SanJose，CA）上对洗脱的多肽进行分析，其在各全扫描质谱后采用10数据依赖的MS/MS扫描。对各生物样品收集7个分析重复数据集。

生物信息学：对各细胞系收集的7个分析重复数据集对应的7个RAW文件进行搜索作为针对IPI人数据库的单独搜索，其中使用SorcererSolo^TM工作站（Sage－N Research，San Jose，CA）实施的SEQUEST算法。指定1.2amu的肽质量允差、甲硫氨酸氧化作为差分修正、以及脲甲基化作为静态修正。使用Trans－Proteomic Pipeline（TPP）实施的支架软件来分类和解析膜蛋白质组学数据。对于那些鉴定为肽概率95％、蛋白概率95％且为唯一肽的蛋白考虑进行分析。使用自身发展的自定义Perl脚本对于膜蛋白质组学数据集进行比较。

结果：如表9所示羊膜来源的贴壁细胞表达不同的血管生成和心原性标记物。

表9：羊膜来源的贴壁细胞表达的心原性或者血管生成标记物。

6.2.4使用分泌蛋白质组谱评价羊膜来源的贴壁细胞的血管生成能力

蛋白质阵列：将第6代的羊膜来源的贴壁细胞按照与生长培养基中相等的数量接种，4天后收集条件培养基。使用RayBiotech血管生成蛋白阵列（Norcross，GA）对于细胞条件培养基中的多个贴壁细胞因子/生长因子进行同步定性分析。简要地，将蛋白阵列与2mL1×封闭缓冲液（Ray Biotech）一起在室温下孵育30分钟（min）以封闭膜。然后，倾倒出封闭缓冲液并将膜与1mL的样品（用各自的细胞条件化生长培养基4天）在室温下一起孵育1-2小时。然后，倾出样品并将膜用2mL1×洗涤缓冲液I（Ray Biotech）在室温下振荡洗涤3×5min。然后，将膜用2mL1×洗涤缓冲液II（Ray Biotech）在室温下振荡洗涤2×5min。其后，将1mL稀释的生物素－偶联抗体（Ray Biotech）加至各膜，在室温下孵育1-2小时，并用如上所述的洗涤缓冲液进行洗涤。然后将稀释的HRP－偶联的链霉亲和素（2mL）加至各膜，并将膜在室温下孵育2小时。最终，再次洗涤膜，按照说明书用ECL^TM检测试剂盒（Amersham）进行孵育，对结果用Kodak Gel Logic2200成像系统进行观察和分析。AMDAC分泌的各种血管生成蛋白显示于图3。

ELISA：使用商业可获得的R&D系统公司（明尼阿波里斯，MN）试剂盒对细胞条件培养基中的单一贴壁细胞因子/生长因子进行了定量分析。简要地，根据生产商的使用说明进行ELISA分析，条件培养基中的每种血管生成生长因子的数量被归一化为1×10⁶细胞。羊膜来源的贴壁细胞（n＝6）表现出大约4500pg VEGF每百万细胞和大约17,200pg IL-8每百万细胞。

表10：血管生成标记物的ELISA结果

在另一个实验中，经确认AMDAC还分泌血管生成素-1、血管生成素-2、PECAM-1（CD31；血小板内皮细胞粘附分子）、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白、MMP1、MMP7、MMP9和MMP10。

6.3实施例3：羊膜来源的贴壁细胞的分化

6.3.1实施例3.1：羊膜来源的贴壁细胞的成骨性不分化

本实施例说明通过例如冯库萨染色法培植，其对骨盐沉积作用（例如细胞储存的钙）染色，羊膜来源的贴壁细胞（AMDAC）不分化成成骨细胞。

按上述实施例1的描述获得的冷冻保存的OCT-4^–AMDAC被解冻，洗去二甲基亚砜（DMSO）并重新悬浮于生长培养基中。所述细胞以5000个细胞/㎝²接种于24孔平板和6孔平板的生长培养基中并且孵育过夜。随后，去除培养基并替换成成骨培养基，其包括低糖DMEM、10%v/v胎牛血清（FBS）、10mMβ磷酸甘油（Sigma）、100nM地塞米松（Sigma）、100μM抗坏血酸磷酸酯（Sigma）、两性霉素B（Gibco）、50单位/ml青霉素和50μg/ml链霉素（Gibco）。所述成骨培养基用20ng/ml转化生长因子β（TGF-β1）（Sigma）和40ng/ml人重组骨形态发生蛋白-2（BMP-2）（Sigma）补充。AMDAC的培养在成骨培养基中连续进行共28天，每3-4天改变培养基。在培养期结束时，收集细胞，洗涤并按下文详述的方法染色，以评价骨盐沉积作用、指示剂或成骨性分化。当在显微镜下观察时，所述细胞层与成纤维细胞形态学（例如外观非长方体）完全汇合，没有观察到结节。

作为对照，真皮成纤维细胞和骨髓来源的间质干细胞（BM-MSCs）也在成骨培养基中培养。成年正常人真皮成纤维细胞（NHDF）从龙沙（Walkersville，MD，美国）获得，和新生NHDF从ATCC（Manassas，VA，USA）获得。评价来自不同起源的3种BM-MSCs细胞系：一种来自ScienCell实验室（卡尔斯巴德，CA，美国），第二种来自龙沙（Walkersville，MD，USA），以及第三种从新鲜的整个正常骨髓分离出，从AllCells（Emeryville，CA，USA）获得。

所述细胞用10%v/v中性缓冲甲醇固定。固定后，所述细胞用去离子水洗涤并且在间接紫外线下在5%硝酸银（Aldrich）中孵育1小时。然后用去离子水洗所述细胞并且在5%w/v硫代硫酸钠中孵育5分钟。所述细胞然后再次用蒸馏水洗涤并且用光学显微术检查。

在诱导前后成骨性分化相关基因骨唾液蛋白（IBSP）和骨钙蛋白（BGLAP）的差异表达水平通过RT-PCR评价。具体地，在成骨分化试验终点接受AMDAC，然后用RLT裂解缓冲液（Qiagen）裂解。细胞裂解物在-80℃储存。将AMDAC细胞裂解物解冻，并且用RNA提取试剂盒（Qiagen）按制造商的说明书用DNA酶处理分离RNA。然后将RNA用DEPC处理的水洗脱，并且RNA的量使用NanodropND1000分光光度计测定。用应用生物系统逆转录试剂由RNA制备cDNA。使用由应用生物系统提供的Taqman通用PCR主要混合物进行实时PCR反应。所使用的Taqman基因表达分析法是Hs00173720骨唾液蛋白，Hs00609452骨钙蛋白和GAPDH。实时PCR反应在如下所示的ABI7300系统中运行：

临界循环（Ct）值的解释：

平均Ct1-10为高表达

平均Ct10-20为高表达

平均Ct20-30为中等水平表达

平均Ct30-35为低表达

平均Ct35-40非常低表达

每种基因的表达值（Ct）规格化到管家基因GAPDH的表达值。然后比较诱导前后每种样品的规格化表达值（dCt）。就倍数变化而言，相应的差值记为“RQ”。由于管家基因dCt的通常可变性，任何诱导倍数差小于3被认为不是显著的。

结果：冯库萨染色法结果证明AMDAC明显是非成骨性，因为没有检测到冯库萨染色。对照成纤维细胞显示最小的骨盐沉积作用，而BM-MSCs显各种程度的骨盐沉积。

表11：冯库萨染色结果

关于基因表达，所有测试的细胞显示骨钙蛋白的中度基础表达（Ct27.5-30.9）。表明AMDAC边界（<2折叠）诱导骨钙蛋白表达，当与为成纤维细胞或者BM-MSCs观察到的骨钙蛋白表达诱导相比时，其不被认为是显著的。因此，AMDAC诱导的骨钙蛋白表达不表现出成骨性潜能。对骨唾液蛋白基因来说，诱导之前在AMDAC上没有发现表达，并且在诱导后观察到极低的表达。相反，3个BM-MSCs细胞系中的2个显示出对诱导基本上正调节。在BM-MSCs中骨唾液蛋白诱导的变化可能是由于供体变化。

表12：基因表达结果

ND–未检测

NA–不能计算，因为未诱导条件没有检测到（即，未测量Ct值）

因此，基于以上所述结果，得出AMDAC不显示成骨性潜能的结论。

6.3.2实施例3.2：羊膜来源的贴壁细胞的成软骨性不分化

如本发明所述的那样，本实施例证明羊膜来源的贴壁细胞不沿着软骨形成途径分化。

本发明别处描述的OCT-4^–AMDAC与作为对照的真皮成纤维细胞和BM-MSCs一起用于软骨形成试验。对每个试验样品来说，将0.25×10⁶个细胞置于15mL锥形管中，并且在室温下在200×g离心5分钟形成球形颗粒。球形颗粒在包含TGFβ-3（10ng/mL），重组人生长/分化因子-5（rhGDF-5）（500ng/mL）、或者重组TGFβ-3（10纳克/毫升），并且rhGDF5（500ng/mL））的软骨形成诱导培养基（龙沙软骨细胞培养基（龙沙PT-3003））或者生长培养基（低糖DMEM（Gibco）+FBS（2%v/v）（Hyclone）+青霉素＋链霉素）中持续3周。在培养期间，每周两次完全交换培养基。

在培养期末，细胞颗粒在10%福尔马林中固定24小时。然后所有样品用乙醇分级脱水，并且埋入到石蜡中。切成5μm厚的片，然后根据如下所述的试验方案染色。所述组织切片使用光学显微术检测。

阿尔新蓝染色法：当用于3%醋酸溶液（pH2.5）中时，阿尔新蓝使粘多糖的硫酸盐和羰酸盐以及唾液黏蛋白的硫酸盐和/或羰酸盐都染色。使用3%乙酸中的1%阿尔新蓝（SigmaAldrich#23655-1），随后用0.1%的核固红（Sigma-Aldrich#22911-3）复染色。总之，切片通过不同浓度乙醇到蒸馏水进行脱蜡和水合，在阿尔新蓝中染色30分钟，用自来水洗涤两分钟，用蒸馏水冲洗，然后在核固红溶液中复染分钟，用自来水洗1分钟，通过不同浓度乙醇脱水，在二甲苯中清理，并且最后用树脂封固剂固定。

II型胶原蛋白染色法：在软骨形成分化条件前后细胞培养基样品中II型胶原蛋白的存在通过以下列举的免疫组织化学评价。细胞II型胶原蛋白的产生使用抗体5B2.5（Abcam Cat.#ab3092）筛选，鼠单克隆对于II型胶原蛋白是高度特异性的，并且与I、III、IV、V、VI、IX、X或者X I型胶原蛋白没有交叉反应，并且与胃蛋白酶消化的II型胶原蛋白没有交叉反应。所述测定使用山羊抗鼠AF594（InvitrogenIgG2a，Cat.#A21135）作为第二抗体。细胞颗粒在10%福尔马林中固定至少4小时过夜，并且渗入石蜡中。

所有细胞样品在PBS中洗涤并且在室温暴露于包含PBS、4%山羊血清和0.3%氚-100X的蛋白质阻断溶液中30分钟。阻断溶液（1:50和1:100）中稀释的初级抗体然后被用于在4℃过夜。第二天早晨，样品用PBS洗涤，并且在阻断溶液（1:500）中稀释的第二抗体（山羊抗鼠AF594）在室温下应用1小时。所述细胞然后在PBS中洗涤并且在600nM DAPI溶液在室温下应用10分钟以观察细胞核。

BM-MSCs和成纤维细胞在软骨形成诱导培养基中形成细胞颗粒。软骨细胞形成大细胞颗粒与顶端或者沿中心细胞群没有区别。相反，AMDAC不能在培养期间形成细胞颗粒。对于AMDAC胶原蛋白II或者阿尔新蓝均没有获得染色结果，因为AMDAC不能形成细胞颗粒。因此，得出AMDAC是非软骨形成性的结论。

6.3.3实施例3.3：羊膜来源的贴壁细胞的神经分化

本实施例证明羊膜来源的贴壁细胞可以分化成具有神经特征的细胞。将AMDAC的神经分化与正常人神经前体细胞（龙沙）、真皮成纤维细胞，新生儿正常（供体3）、骨髓MSC（供体5和6）进行比较。

在第一个短期神经分化过程中，AMDAC和其它细胞被解冻并在以大约5000/㎝²接种之后在其各自的生长培养基中扩增，直到它们近汇合。将细胞胰酶化并以6000细胞每孔接种于组织培养涂覆的平板上。所有细胞最初在包含15%v/v FBS（Hyclone）以及20ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、20ng/ml的表皮生长因子（EGF）（Peprotech）和青霉素/链霉素（PenStrep，Invitrogen）的DMEM/F12培养基（Invitrogen）中扩增4天。4天后，所述细胞在PBS（Invitrogen）中冲洗。所述细胞然后在含有20%v/v FBS，PenStrep的DMEM/F12中培养大约24小时。24小时后，所述细胞用PBS（Invitrogen）冲洗并在由DMEM/F12组成的无血清诱导培养基中培养，其中包含200mM丁基羟基茴香醚，10nM氯化钾，5mg/ml胰岛素，10nM毛喉素，4nM丙戊酸和2nM氢化可的松（Sigma）。所述细胞随后在-20℃用100%甲醇固定。固定的样品然后通过免疫组织化学（IHC）评价人巢蛋白的表达，其中使用抗-巢蛋白抗体（Alexa-Fluor594（红）共轭），用DAPI复染细胞核。

在第二个短期神经分化试验方案中，所有细胞最初在包含15%的FBS（Hyclone）、以及20ng/ml的碱性FGF，20ng/ml的EGF和PenStrep（Invitrogen）的DMEM/F12培养基（Invitrogen）中扩增4天。4天后，所述细胞在PBS（Invitrogen）中冲洗，并且在含有20%v/v FBS，PenStrep的DMEM/F12中培养。24小时后，用PBS冲洗细胞。然后将培养基切换成神经祖细胞扩展培养基（NPE），其中包括NEUROBASAL^TM基础培养基（Gibco），以及B27（Gibco）、4mM L-谷氨酸，1μM视黄酸（Sigma）和PenStrep。4天后，从每个孔清除培养基并用冰冷却的4%w/v多聚甲醛在室温下固定10分钟。固定的样品然后通过IHC分别评价星形细胞表现型GFAP（胶原纤维酸性蛋白）的表达，以及神经元表现型的Tuj1（神经元特异性III类微管蛋白）。

在第一个分化试验方案中，所有细胞类型转化成具有两极形态的细胞类型并且用巢蛋白染色呈阳性。神经前体细胞如预期地组成性表达巢蛋白。在第二个分化试验方案中，评价神经元相关的（Tuj1）和星形细胞相关的（GFAP）标记物的表达。通过诱导，AMDAC和BM-MSCs表达低水平的Tuj1。发现成纤维细胞的表达为边界线阳性，其可能是由背景引起。AMDAC和一个BM-MSCs细胞系显示低水平表达GFAP。阳性对照细胞系（神经前体细胞）如预期地组成性表达Tuj1和GFAP。

因此，在神经诱导条件下，AMDAC能显示与神经分化一致的形态学和生化的改变。

6.4实施例4：使用羊膜来源的血管源性细胞的免疫调节作用

本实施例证明AMDAC在应用小珠刺激的T细胞分析法中显示体外免疫抑制功能。

6.4.1AMDAC介导的T细胞增殖抑制作用

AMDAC按上文实施例1所述获得。CD4⁺和CD8⁺T细胞从人外周血获得。

所述T细胞用羧基荧光素琥珀酰胺酯（CFSE）标记并与抗-CD3抗-CD28涂覆的磁珠混合，随后在缺乏AMDAC的培养基中培养或者以允许细胞与细胞间接触的方式与AMDAC共培养，也称为磁珠T淋巴细胞反应（BTR）。与AMDAC的共培养通过在96孔平板上使100,000个T-淋巴细胞与抗-CD3和抗-CD28涂覆的磁珠（Invitrogen）以磁珠：T淋巴细胞比1:3混合来进行，存在或者不存在20,000个AMDAC细胞。混合的（共培养物）或者未混合的细胞培养物在37℃，5%CO₂和90%相对湿度孵育5天。正常人真皮成纤维细胞（NHDF）基本上不拥有T细胞抑制活性用作阴性对照，并且经过与AMDAC相同条件。

5天后，CD4⁺和CD8⁺T细胞上的CFSE荧光使用流式细胞术检测，与不用AMDAC或者NHDF共同培养的CFSE标记的T细胞相比，基于非增殖（高CFSE）T细胞增加的部分计算T细胞生长的抑制百分比。如图4所示，AMDAC在体外抑制CD4⁺和CD8⁺T细胞的增殖，表明AMDAC是免疫调节剂。

6.4.2AMDAC条件培养基抑制T细胞对TNF-α的分泌

AMDAC按上文的实施例1所述获得。T细胞从人外周血获得。

AMDAC接种于组织培养板上并且孵育过夜以形成贴壁单层。第二天，所述AMDAC培养物用IL-1β刺激，其在前面已经显示是AMDAC源的抗炎症因子的一种强诱导剂。IL-1β剌激16h后，收集AMDAC条件培养基，并以9:1的体积比与用抗-CD3抗-CD28涂覆的磁珠包裹的人外周血T细胞混合。用抗-CD3抗-CD28涂覆的磁珠包裹的分离的人外周血T细胞群作为对照保持。与AMDAC条件培养基混合的所述T细胞和不混合的T细胞群在37℃，5%CO₂和90%相对湿度孵育72h。正常人真皮成纤维细胞（NHDF）条件培养基基本上不拥有TNFα抑制活性用作阴性对照，和经过与AMDAC相同的条件。

培养72h后，使用基于细胞计数磁珠的ALISA方法测定T细胞培养物上清液中TNFα得到的T细胞浓度。与不与AMDAC条件培养基混合的对照T细胞培养物相比，在AMDAC条件培养基存在下TNFα分泌的抑制百分比基于TNF-α浓度的减小来计算。如图5所示，在AMDAC条件培养基存在下，T细胞的培养物诱导T细胞来源的TNF-α的产生的抑制作用。

6.5实施例5：AMDAC调节T细胞池(T CELL COMPARTMENT)

本实施例证明羊膜来源的贴壁细胞（AMDAC）按上文实施例1所述的方法获得，能影响在Th1，Th17和FoxP3Treg子集中的偏移。

6.5.1方法

T-淋巴细胞增殖测定

[0361]混合淋巴细胞反应（MLR）通过在FALCON平底96孔组织培养板（FisherScientific，匹兹堡，PA）的每一孔中混合100,000HLA-错配的羧基荧光素琥珀酰胺酯（CFSE）标记的T-淋巴细胞与10,000成熟树突细胞（mDC）执行，其中存在或者不存在20,000个按上文实施例1所述分离的AMDAC细胞。混合的细胞培养物在37℃，5%CO₂，和90%相对湿度下孵育6天。第6天时，回收所有细胞并用抗-CD4-PE和抗-CD8-APC（R&D系统，明尼阿波利斯，MN）染色。

磁珠T淋巴细胞反应（BTR）通过在96孔平板的孔中混合将100,000T-淋巴细胞和抗-CD3和抗-CD28涂覆的磁珠（Invitrogen）按磁珠：T-淋巴细胞为1:3的比率混合执行。所述BTR反应在存在或者不存在20,000个AMDAC的情况下执行。所述混合细胞培养物在37℃，5%CO₂，和90%相对湿度孵育6天。第6天，回收所有细胞并且用抗-CD4PE和抗-CD8的APC（R&D系统，明尼阿波利斯，MN）染色。

T淋巴细胞的增殖通过用FACS Canto II机器（BD，富兰克林湖，NJ）分析CD4和CD8单一阳性细胞上的CFSE荧光强度来测定。在次此研究中的所有FACS数据通过使用flowjo8.7.1软件（Tree Star,InC.Ashland OR）分析。

T细胞偏移（极化）

Th1偏移使用BTR反应用包含IL-2（200IU/ml）、IL-12（2ng/ml）和抗-IL-4（0.4μg/ml）的其它Th1偏移细胞因子混合物执行。

对于Th17偏移，5×10⁵总T-淋巴细胞用5×10⁵分选的CD14⁺单核细胞，50ng/mL抗-CD3抗体（BD BioScienences）和100ng/mL LPS（SigmaAldrich）刺激6天，其中存在或者不存在50,000AMDAC。通过细胞内细胞因子染色法（ICCS）分析Th17细胞群在CD4阳性群上IL-17的染色。

胞内细胞因子和Foxp3染色法

Th1细胞亚群列举如下。来自BTR反应的T细胞用50ng/mL豆蔻酰佛波醇乙酯（PMA）和750ng/mL离子霉素（PI）（SigmaAldrich）重新激活5小时。在最后3小时期间加入GOLGISTOP^TM（Becton Dickinson；蛋白质转运抑制剂）。然后使用Cytofix/Cytoperm试剂盒根据制造商的说明，用PE标记的抗-CD4抗体和随后用APC共轭的抗-IFN-γ抗体对细胞表面染色。

为了列举Th17细胞亚群，在最后3小时期间，在GOLGISTOP^TM（BectonDickinson）存在下，来自Th17偏移活化反应的T细胞用50ng/mL PMA和750ng/mL离子霉素（SigmaAldrich）重新激活5小时。然后使用Cytofix/Cytoperm试剂盒根据制造商的说明，用PE标记的抗-CD4抗体和随后用APC共轭的抗-IL-17抗体对细胞表面染色。

为了列举Treg细胞亚群，使用Foxp3染色试剂盒（eBioscience，San Diego，CA）根据制造商的说明，用PE标记的抗-CD4抗体和随后用APC共轭的抗-Foxp3抗体对BTR反应的T细胞进行表面染色。

树突细胞分化和剌激作用

未成熟的DC（iDC）通过有丝分裂原定向分化从磁性分选的CD14⁺单核细胞群产生。简单地，iDCs从单核细胞获得，所述单核细胞用GM-CSFB（20ng/ml）和IL-4（40ng/ml）以1×10⁶/ml培养4天。iDCs（1×10⁵细胞）然后用1μg/ml的LPS刺激24小时，其中在FALCON24孔组织培养板（Fisher Scientific，Pittsburgh,PA）的每孔中存在或者不存在1×10⁵AMDAC。收集培养物上清液，细胞因子概况通过细胞计数珠阵列（CBA）分析。

细胞珠阵列（CBA）分析

培养上清液中细胞因子的浓度使用细胞计数珠阵列系统（CBA；BectonDickinson）测定，根据制造商的说明同时定量检测多种可溶的分析物。简单地，BTR培养上清液的样品与捕获磁珠一起孵育，特异性检测活化T细胞产生的下列细胞因子：IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、TNF、淋巴毒素α（LTα）和IFN-γ。随后，结合于细胞因子的磁珠与荧光标记检测试剂耦合，使用FACSC anto II流式细胞仪按照制造商的试验方案检测。使用FACS-DIVA6.0软件（Becton Dickinson）获得并分析数据，随后使用FCAP阵列1.0程序（（Becton Dickinson）计算细胞因子浓度。

IL-21ALISA

可溶性IL-21用来自eBioscience（88-7216）的IL-21ELSAI试剂盒根据制造商的试验方案在从Th17偏移培养物获得的上清液中测定。

NK增殖测定和NK细胞毒性测定

用NK细胞分离试剂盒（Miltenyi Biotech，Aubum，CA）根据制造商的使用说明将人NK细胞从PBMC分离。NK细胞增殖通过在1ml IMDM中培养2.5×10⁵NK细胞测定，其中所述的IMDM包含10%胎牛血清（FBS）（Hyclone），用35μg/ml转铁蛋白，5μg/ml胰岛素，20M乙醇胺，1μg/ml油酸，1μg/ml亚油酸，0.2μg/ml软脂酸，2.5μg/ml BSA，0.1μg/ml PHA（SigmaAldrich）和200IU/ml人IL-2（R&D），以及丝裂霉素C处理的（16g/ml）喂养细胞（1×10⁶人同种PBMC或者1×10⁵K562细胞）补充。细胞在37℃在5%CO₂中孵育，每3天加入等量体积的IMDM（10%FBS，2%人血清和400IU/ml IL-2）。每7天通过如下的FACS测定NK细胞数。简单地，总NK细胞从组织培养孔收集。在PBS洗涤后，然后用2μM TO-PRO3将细胞染色。最后，向每个样品中加入10μL计数小珠（Spherotech，Cat#ACBP-50-10），其作为内标校准总细胞数。有关的NK数根据每1000个收集的计数珠活NK细胞总数计算。

NK细胞毒性试验通过以不同的效应物/目标（E/T）比例混合NK细胞与靶细胞进行。培养过夜后，使用如上所述的计数珠法加上将NK细胞与靶细胞区别开的细胞表面标记物确定靶细胞数。对于K562细胞的NK细胞毒性，FITC配对的抗-HLA-ABC抗体被用作NK细胞标记物，因为K562细胞是HLA-ABC阴性的。对于AMDAC细胞来说，CD90-PE用来将AMDAC与NK和K562细胞区分开。细胞毒性百分比计算为（1–样品中的总靶数÷不含NK细胞的对照中的靶细胞）×100。

6.5.2T细胞池的AMDAC偏移

AMDAC影响T细胞池中偏移的能力通过在Th1和Th17偏移试验中使用T细胞和AMDAC共培养物测量细胞因子产生T细胞而检测。简单地，在Th1偏移试验中，AMDAC预固定。第二天，加入1×10⁶/ml T细胞，6×10⁵/ml磁珠，IL-2（200IU/ml）、IL-12（2ng/ml）、以及抗-IL-4（0.4μg/ml），并且与AMDAC混合。4天后，Th1细胞的百分比通过γ干扰素（IFN-γ）细胞内染色分析。如图6中所示，AMDAC以剂量依赖方式极大地降低Th1百分比。类似地，在Th17偏移试验中，AMDAC预固定过夜。T细胞（1×10⁶/ml）、CD14⁺细胞（1×10⁶/ml）、抗-CD3（50ng/ml）和细菌脂多糖（LPS）（100ng/ml）的混合物然后加入到包含AMDAC的平板上。培养6天后，通过IL-17细胞内染色检测Th17百分比。如图7中所示，AMDAC以剂量依赖方式抑制Th17百分比。为了考察AMDAC对FoxP3阳性T细胞群的影响，1×10⁶PBMC与AMDAC共同培养6天。FoxP3阳性细胞群通过FoxP3细胞内染色分析。如图8中所示，AMDAC轻微增加FoxP3阳性T细胞群。

6.5.3AMDAC介导的DC成熟和功能的调节作用

本实验证明AMDAC调节未成熟树突状细胞（DC）的成熟和分化。

为了探讨AMDAC介导的DC成熟和功能的调节作用，单核细胞来源的未成熟DC在存在或者不存在AMDAC的情况下单独用LPS或者LPS加IFN的组合进行处理，以进一步促进DC成熟过程。DC成熟通过DC成熟标记物CD86和HLA-DR的FACS染色进行分析。DC功能通过IL-12的细胞内染色和CBA产生可溶性细胞因子的测量进行评价。如图9A和9B中所示，通过下调DC上CD86（图9A）和HLA-DR-表达（图9B），AMDAC强烈抑制LPS和LPS加IFN-γ诱导的DC成熟。此外，如图9C中所示，AMDAC显著抑制LPS加IFN-γ刺激的产生IL-12的DC细胞群70%。进一步发现AMDAC能够抑制LPS刺激的DC产生TNF-α以及IL-12。参见图10。

6.5.4AMDAC在Th17偏移培养物中抑制IL-21的产生

IL-21是一种保持Th17细胞群所需要的重要的细胞因子。为了调查AMDAC能否调节IL21的产生，按方法部分所述将AMDAC引入Th17偏移培养物中。与没有AMDAC的Th17偏移培养物相比，在AMDAC-Th17共培养中AMDAC抑制IL-21的产生72.35%。与缺乏AMDAC的情况下培养相比AMDAC也抑制Th17T细胞数72.65%。

6.5.5AMDAC对NK细胞的细胞毒性和增殖的调节

NK细胞是一种细胞毒性淋巴细胞，其构成固有免疫系统的主要成分。NK细胞在排斥肿瘤和病毒感染细胞以及异种细胞和组织中起主要作用。为了调查AMDAC对NK细胞的免疫调节作用，建立了NK细胞增殖和细胞毒性试验。如图11中所示，与没有AMDAC细胞的对照相比，AMDAC抑制人NK细胞增殖。

另外，调查了AMDAC对NK细胞的细胞毒性的作用。在此试验中，将AMDAC引入到如上所述的方法部分描述的NK细胞毒性试验中。简单地，1×10⁶个NK细胞与1×10⁵个K562细胞（E/T比为10:1）和2倍滴度的预接种AMDAC（1×10⁵所述细胞）混合。NK细胞和K562细胞共培养过夜，并且NK细胞的细胞毒性根据上述方法部分描述的试验方案确定。如图12中所示，AMDAC细胞以剂量依赖方式抑制人NK细胞的细胞毒性。

6.6实施例6：在大鼠SCI模型中使用AMDAC对SCI的治疗

本实施例提供一种评价AMDAC对脊髓损伤的影响的示例性模型和方法，以及尤其是评价AMDAC对移植到未损伤或者损伤的大鼠脊髓的免疫排斥反应、迁移、和分化的分化。所述模型提供评价AMDAC单独给药或者与第二治疗剂例如甲基去氢氢化可的松，锂盐和/或环孢菌素A组合共给药的作用。与对照大鼠没有细胞移植相比，在有和没有环孢菌素存在下，AMDAC对功能的影响在损伤后12周时进行评价，包括步行的恢复（BBB得分），皮层脊髓束、血清素轴突和脊髓白质区的再生。所述细胞不久（损伤后2周和6周）被移植到脊髓，以刺激移植细胞进入脊髓损伤的急性、亚急性和慢性阶段。评价了在损伤后0、1、2、3、4和6周施用AMDAC的生存，迁移和分化。另外，在施用AMDAC后神经源性生长因子（例如神经营养因子）的表达可以利用基因芯片，RT-PCR和ALISA方法评价。

试验设计

体内AMDAC的持续性。在第0、1、2、3、4和6周时将AMDAC注射到有或没有遭受25mm落重（n=4/组）脊髓损伤的大鼠脊髓T9上缘和T10下缘的脊椎部分的中枢灰质区。6周后，大鼠用60ml/kg戊巴比妥麻醉，用甲醛灌注，和将脊髓水平切片并用落射荧光解剖显微镜检查。通过荧光测量AMDAC从注射位置到各距离的分布，并且对截面的β3-微管蛋白（神经元）、GFAP（星形细胞）、巢蛋白（祖先）标记物进行免疫组织学染色。

治疗方法。施用AMDAC的大鼠用甲基强的松龙（MP，移植时30mg/kg团注射）、锂盐（Li，100ml/kg/天治疗6周）和环孢菌素（CsA，10ml/kg/天）治疗，并且评价在损伤和移植后6周移植的AMDAC的数量、分布和特征。评价单独的AMDAC、单独的MP、单独的Li，单独的CsA，或者MP⁺Li的作用。为了定量细胞，测量脊髓中人DNA和绿色荧光蛋白（GFP）的数量。在AMDAC中短中期GFP表达通过基于Amaxa的编码组成性GFP表达的质粒载体的电脉冲获得。长期表达通过使用编码组成性GFP表达的慢病毒载体而实现。

基因/蛋白表达。用RT/PCR和ALISA测量经或者不经AMDAC单独，AMDAC加MP，AMDAC加MP和Li，以及AMDAC加MP、Li和CsA治疗的动物中LIF、BDNF、GDNF、NT3、NGFA和GFP的mRNA和蛋白质水平。

回收/再生。在损伤后2周和6周移植AMDAC，用或不用CsA治疗，并且所述动物保持12周。评价运动恢复（BBB）并进行组织学研究。

试验方案

麻醉。77±1天龄的斯普拉格-道利鼠经椎板切除术。所述大鼠用腹腔注射戊巴比妥（雌性45ml/kg，雄性65ml/kg）麻醉。将5分钟内不变成深度麻醉的大鼠从实验排除。为了在损伤后1周和4周延迟将细胞移植到脊髓，大鼠经椎头通过自发吸入异氟烷而被麻醉（5%诱导5分钟然后用1%保持）。

脊髓损伤。给大鼠剃毛并用必妥碘准备手术位置后，做背部中线切口以暴露T8-11脊柱并进行T9-10椎板切除术以暴露下面的T13脊髓。所述大鼠用置于TS和T11背突上的手术钳悬挂。在诱导麻醉1小时后，使一根10克的杆从25mm落到脊髓T13上。将一层聚乳酸和聚癸内酯（polycaprilactone）的薄膜（100μ）覆盖在硬脑膜外防止粘附，并且将一张自体皮下脂肪放于椎板切除术部位以阻止结痂形成。在椎板切除术的上方和下方将肌肉用丝线在中线缝合。皮肤用不锈钢夹子封闭。一周后去除夹子。

细胞移植。硬脑膜用一个26-量规的结核菌素注射器切开，并且将200,000个细胞的1微升悬浮液注入到脊髓。为了延迟移植，椎板切除术部位用异氟烷麻醉后重新打开，制作一个小的硬脑膜切口，并且用一个微量移液管将两份200,000个细胞的1微升悬浮液注入到受影响部位脊髓的前部嘴和尾部。

术后护理。将大鼠保持在加热板上直到它们苏醒。显示发绀（从他们脚的颜色）的大鼠接受经口气管吸出物以清理分泌物并刺激呼吸。如果有妨碍呼吸的多种事件，阿托品以0.04ml/kg IM或者甘罗溴铵（glycopyrolate）以0.5ml/kg IM可选择地给药以降低手术发生的分泌积累。有脱水迹象（例如，捏起背部皮肤不立即安定下来）的大鼠接受5-10ml皮下生理盐水注射（雌性5ml，雄性10ml）。所有大鼠每天经皮下接受50ml/kg头孢唑林7天，以降低泌尿道和伤口感染。

术后镇痛。脊髓损伤大鼠一般没有疼痛的证据，因为损伤在损伤部位及以下引起麻醉。然而，对于仅经受椎板切除术的动物来说，即没有脊髓损伤，并且显示术后痛，局部麻醉，布比卡因（麻卡因）以2ml/kg体重的最大剂量施用于手术部位。监测每只动物疼痛的证据，并且根据需要提供另外的疼痛减轻的证据。

长期护理。大鼠每天检查并且每周评价运动得分（BBB）。首先，所述动物每天检查两次，并且如果在他们的膀胱中触诊指数＞1ml尿液手动挤出。大鼠有浑浊和血尿，表明膀胱感染，在初始7天时间之后接受2.5ml/kg/天的拜有利（氟喹诺酮抗菌素）7-10天。如果不使感染好转，则使所述大鼠安乐死。其次，所述大鼠被保持在无菌的白纸褥草（基本干燥）上，其保持大鼠干燥并且显示出血尿的存在。挑出有血尿的大鼠并且与其它大鼠分离护理，以避免转移感染。第三，如果大鼠显示疼痛（发声，对接触敏感）或自食己肉（通过掉毛或者皮肤穿透证明撕咬损伤部位以下的皮肤），给所述大鼠每日口服醋氨酚（64ml/kg/天口服婴儿泰诺）直到它们的皮肤损害被完全治愈。如果没有发现疼痛的确切原因，使大鼠安乐死。所述动物第一周每日称重和此后每周称重。

安乐死。所有动物用戊巴比妥（100ml/kg雌性-雄性剂量）深度麻醉并且断头用于分子研究或者用4%多聚甲醛溶液灌注固定和组织学研究。

6.7实施例7：在大鼠TBI模型中使用AMDAC对TBI的治疗

本实施例提供一个示例性的用于评价AMDAC对外伤性脑损伤的作用的模型和方法。不打算受任何特别的理论或者作用机制限制，据说外伤性脑损伤导致脾脏质量减少，脾脏质量与循环免疫细胞（其导致增加的血脑屏障渗透性）的增加有关。因此，该方法提供评价AMDAC调节免疫应答的能力；协同定位脾细胞以促进脾细胞增殖和抗炎症细胞因子例如IL-4和IL-10的分泌；保护脾脏的质量；以及在引起外伤性脑损伤后保持血脑屏障的完整性。

体内方法

对照的皮层撞击伤。对照的皮层撞击（CCI）设备，例如，eCCI模型6.3；VCU，Richmond，VA被用来如Lighthall J.，Neurotrauma5,1–15(1988))描述的给单边脑损伤给药，其公开内容全文引入本发明作为参考。称重为225-250g的雄性大鼠用4%异氟烷和O₂麻醉，每只大鼠的头固定在立体框架上。保持头在水平面上。用中线切口暴露和在右侧颅骨上进行7-8mm颅骨切除术。颅骨切除术的中心在前囟点和人字点的中点，中线后侧～3mm处，覆盖颞顶皮层。动物受到3.1mm深变形的单一撞击，其具有5.8m/s的冲击速度，并且以与垂直面成10°的角度停留150ms（中度-重度损伤），使用直径6mm的撞击尖，使撞击面与皮层表面垂直。所述撞击用于顶叶联合皮层。假的损伤通过使动物麻醉进行，做中线切口，和分离皮肤，来自颅骨的结缔组织和腱膜。缺口然后被封闭。

AMDAC的制备和静脉注射。注射前，将AMDAC解冻，洗涤并以2×10⁶个细胞/ml的浓度悬浮于磷酸盐缓冲液（PBS）载体中。所述细胞通过台盼蓝排除法计数和检查生存能力。在即将静脉注射前，AMDAC缓慢滴定8-10次以保证所述细胞的均匀混合物。AMDAC以2种不同剂量（CCI+2×10⁶AMDAC/kg和CCI+10×10⁶AMDAC/kg）在CCI损伤后的2和24h注射。因此，每只治疗动物接受2个独立的他们所分配的AMDAC浓度的剂量。CCI损伤对照动物以与所述细胞治疗的动物相同的指定时间点单独接受PBS载体注射。

大鼠脾脏切除。对于在脾脏切除后用大鼠完成的所有实验来说，雄性斯普拉格道利大鼠按如上所述麻醉并且以仰卧姿势放置。在腹部的左上象限作一个小的3㎝切口，随后回缩脾脏并结扎脾门。去除脾脏后将切口连续缝合封闭。使所述动物在脾脏切除术后恢复和适应72h。然后所有实验在最早的脾脏切除术后72h完成。

伊文思蓝血脑屏障（BBB）渗透性分析。在CCI损伤后72小时，所述大鼠按如上所述麻醉，并且通过右侧颈内静脉直接穿刺法注射1mL（4㎝³/kg）3%伊文思蓝染料的PBS溶液。使所述动物恢复60分钟以允许灌注染料。此后，所述动物通过右心房穿刺处死并用4%多聚甲醛灌注。接着，所述动物斩首后提取大脑。将小脑从其余的皮层组织切除。大脑通过中线分开，并且测量每个半球（损伤的同侧和损伤的对侧）的质量用于标准化。随后，使每个半球在5mL甲酰胺中在50℃孵育过夜并以提取染料。离心后，将每个样品的100μL上清液转移到96孔板（一式三份），并且在620nm测量吸光度。所有值对半球重量作标准化。

皮层的免疫组织化学。通过紧密连接蛋白封闭的免疫染色法进一步检查BBB的完整性，并且用荧光显微术可视化（DAPI染蓝的细胞核和FITC染绿的闭合蛋白）。在CCI损伤后72小时，具有完整脾的大鼠和脾脏切除大鼠两种的4组（未损伤，单独CCI损伤，CCI损伤+2×10⁶AMDAC/kg，和CCI损伤+10×10⁶AMDAC/kg）处死后迅速断头。提取大脑并分离两个半球（损伤的同侧和对侧）。然后将组织样品迅速放于预冷却的2-甲基丁烷中速冻。将所述样品转移到干冰中并在-80℃储存直到组织切片。然后将所述组织放于最佳切割温度复合物中，例如Sakura Finetek、Torrance、CA，和通过直接损伤区制作20μm冷冻切片。对血管结构的直接损伤通过紧密连接蛋白闭合蛋白抗体（例如，1:150稀释，Invitrogen，卡尔斯巴德，CA）和适当的异硫氰酸荧光素（FITC）缀合二级抗体（例如，1:200稀释，Invitrogen，卡尔斯巴德，CA）染色进行评价。在所有抗体染色后，所述组织切片用4',6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）（例如，Invitrogen，卡尔斯巴德，CA）复染和用荧光显微术可视化。

脾脏的免疫组织化学。为了在体内跟踪AMDAC，例如确定施用的AMDAC是否绕开肺微脉管系统并达到脾脏，4组大鼠（未损伤，单独CCI损伤，CCI损伤+2×10⁶AMDAC/kg以及CCI损伤+10×10⁶AMDAC/kg）遭受假损伤或者CCI损伤。接着，在CCI损伤后2和24h，两个治疗组接受注射量子点（例如，QDOT，Qtracker细胞标记试剂盒525和800，英杰股份有限公司，卡尔斯巴德，CA）标记（按制造商建议的实验方案）的AMDAC。在第二次QDOT标记的AMDAC输注后6小时，处死所述动物并取出脾脏。然后将所述脾脏放于荧光扫描器上（例如，奥德赛成像系统，Licor Inc.,Lincoln,NE）以定位QDOT标记的AMDAC。在扫描完成后，然后将所述组织样品迅速投入预先冷却的2-甲基丁烷中速冻。将所述样品转移到干冰中并且在-80℃储存直到使用。接着，所述组织样品然后放于最佳切割温度复合物中（例如，Sakura Finetek，Torrance，CA）和通过脾脏制作10μm冷冻切片。所述组织切片用4',6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）（Invitrogen，卡尔斯巴德，CA）对细胞核染色，QDOT标记的AMDAC和脾脏细胞都用荧光显微术可视化。而且，按照制造商建议的实验方案进行苏木素和曙红染色以评价脾脏的结构。

脾脏细胞的分离/脾脏质量的测量。损伤后72小时，所述动物遭受脾脏脏切除术测量脾脏的质量。此时所述动物安乐死。接着，脾脏使用刀片微粒化，用基本培养基（10%FBS和1%青霉素/链霉素的RPMI溶液）冲洗，捣碎，并用100μm过滤器过滤。将过滤器流出物样品缓慢滴定8-10次并随后通过40μm过滤器过滤以清除任何残留的结缔组织。所述样品以1000克离心3分钟。接着移出上清溶液，并且将所述样品悬浮于3mL血红细胞裂解缓冲液中（Qiagen Sciences,瓦伦西亚,CA），并且允许在冰浴上孵育5分钟，随后，用基本培养基洗涤所述样品两次并使用前述设置离心。所述脾脏细胞通过台盼蓝排除法计数并且检查生存能力。

体内脾脏细胞增殖分析。使用例如Click-iT^TMEdU流式细胞试验试剂盒（Invitrogen，卡尔斯巴德，CA）根据制造商建议的试验方案测量在处死时活性增殖脾脏细胞（S期）的百分比。简单地，在72h收获脾脏细胞，并且将20mM的EdU加入到细胞中并允许孵育2h。接着，用4%多聚甲醛洗涤并固定所述细胞。用Triton-X100使细胞具有渗透性，然后加入由制造商提供的抗-EdU抗体“鸡尾酒”。最后，洗涤细胞，然后添加核糖核酸酶和CellCycle488-Red染色以分析DNA含量。

体内脾脏细胞凋亡分析。使用例如膜联蛋白V染色（BD Biosciences，圣何塞，CA）根据制造商建议的试验方案测量在处死时脾脏细胞凋亡的百分比。简单地，在分离后，用冷PBS冲洗脾脏细胞两次。接着，1×10⁶细胞用5μL膜联蛋白V和7-氨基-放线菌素（7-AAD）孵育15分钟。然后用流式细胞术测量凋亡细胞的百分比。根据制造商的说明使用例如RNEasy柱（Qiagen，瓦伦西亚，CA）将定量的PCRRNA与脾脏细胞分离。大鼠参照RNA（Stratagene，La Jolla，CA）用作阳性对照。cDNA的合成用M-MLV逆转录酶和随机六聚体（Promega，Madison，WI）进行。不用逆转录酶进行对照反应与基因组DNA污染对照。qPCR使用例如具有9600仿真度的ABI7500进行。

体外方法

脾脏细胞培养。以7.5×10⁵细胞/ml的密度培养脾脏细胞，允许在生长培养基（10%FBS，含维生素的1％RPMI，1%丙酮酸钠，0.09%2-巯基乙醇和1%青霉素/链霉素的RPMI溶液）中用2μg伴刀豆球蛋白A刺激扩增72h。

脾脏细胞鉴别。分离的脾脏细胞用流式细胞术分析以确定单核细胞、嗜中性粒细胞、和T细胞群。单核细胞和嗜中性粒细胞分别使用对DC200和DC11b/DC18的抗体测定。脾脏细胞T细胞群使用DC3、DC4和DC8抗体标记。所有染色法根据制造商建议的试验方案完成。

体外增殖分析。在刺激的生长培养基中培养后DC4⁺脾脏细胞活性增殖（S期）的百分比用例如Click-iT^TMEdU流式细胞分析试剂盒（Invitrogen，卡尔斯巴德，CA）按照制造商建议的试验方案测量。简单地，脾脏细胞按如前所述在用2μg伴刀豆球蛋白A刺激的生长培养基中以7.5×10⁵细胞/ml的密度培养72h。加入20mM的EdU并且允许孵育1h。接着，所述细胞用4%牛血清的DMEM溶液（4%FBS）洗涤，加入DC4-PE以控制感兴趣的T细胞群。孵育30分钟后，用4%多聚甲醛洗涤并固定所述细胞。用Triton-X100使细胞具有渗透性，然后加入由制造商提供的抗-EdU抗体“鸡尾酒”。最后，洗涤细胞，然后添加核糖核酸酶和CellCycle488-Red染色以分析DNA含量。

在体外脾细胞细胞因子的产生。在刺激生长培养基中培养后，抗炎细胞因子IL4和IL10的产生通过流式细胞术使用例如BD细胞计数微球阵列弯曲套（BDBiosciences，圣何塞，CA）按照制造商建议的试验方案定量。

6.8实施例8：AMDAC用于组织重建

本实施例示例AMDAC如何用于调节纤维变性和重建组织。

使用ALISA和多重分析，将AMDAC条件培养基与正常人真皮成纤维细胞（NHDF）条件培养基相比较来评价两种细胞类型的分泌曲线。与NHDF分泌卵泡抑素的量相比，确定了AMDAC分泌更多的卵泡抑素。与NHDF分泌HGF的量相比，也确定了AMDAC分泌更多的肝细胞生长因子（HGF）。另外，确定了AMDAC分泌基质金属蛋白酶（MMP）1、MMP2、MMP7和MMP10。

确定了相对于NHDF而言AMDAC分泌高水平的卵泡抑素和HGF，并且AMDAC也分泌MMP1、MMP2、MMP7和MMP10，其表明AMDAC在体内可调节纤维变性，并且因此可用于涉及组织重建的方法中，例如本发明所述的方法。

6.9实施例9：使用羊膜来源的贴壁细胞的治疗方法

6.9.1用AMDAC治疗SCI

个体存在脊髓损伤（SCI），并且正遭受感觉和/或运动功能的丧失。向所述个体静脉内施用2.5×10⁸到1×10¹⁰个细胞的OCT-4^–、CD49f⁺羊膜来源的贴壁细胞群（AMDAC）的0.9%NaCl溶液。在随后的一个月期间监测个体以评价一种或多种症状的减少。在随后的一年期间还要监测个体，并且按需要施用相同剂量的AMDAC，例如如果症状重新出现或者严重程度增加。

6.9.2用AMDAC治疗SCI

个体存在脊髓损伤（SCI），并且正遭受感觉和/或运动功能的丧失。在脊髓损伤部位向所述个体施用1×10⁶到1×10⁷个细胞的OCT-4^–、CD49f⁺羊膜来源的贴壁细胞群（AMDAC）的0.9%NaCl溶液。在随后的一个月期间监测个体以评价一种或多种症状的减少。在随后的一年期间还要监测个体，并且按需要施用相同剂量的AMDAC，例如如果症状重新出现或者严重程度增加。

6.9.3用AMDAC治疗TBI

个体存在外伤性脑损伤（TBI），并且正遭受失忆，注意力/精力不良，和/或头晕/失去平衡。向所述个体静脉内施用2.5×10⁸到1×10¹⁰个细胞的OCT-4^–、CD49f⁺羊膜来源的贴壁细胞群（AMDAC）的0.9%NaCl溶液。在随后的一个月期间监测个体以评价一种或多种症状的减少。在随后的一年期间还要监测个体，并且按需要施用相同剂量的AMDAC，例如如果症状重新出现或者严重程度增加。

6.9.4用AMDAC治疗TBI

个体存在外伤性脑损伤（TBI），并且正遭受失忆，注意力/精力不良，和/或头晕/失去平衡。向所述个体颅腔内施用1×10⁶到1×10⁷个细胞的OCT-4^–、CD49f⁺羊膜来源的贴壁细胞群（AMDAC）的0.9%NaCl溶液。在随后的一个月期间监测个体以评价一种或多种症状的减少。在随后的一年期间还要监测个体，并且按需要施用相同剂量的AMDAC，例如如果症状重新出现或者严重程度增加。

等同性：

本发明并不限于本发明描述的具体实施方式的范围。事实上，除了这些描述之外，根据之前的描述和随后的附图而对本发明进行的各种改变对于本领域技术人员而言是显而易见的。这些改变同样落入附加的权利要求的范围之内。

本发明引用了各种出版物、专利和专利申请，其公开内容全文引入作为参考。

Claims

1.一种治疗患有中枢神经系统疾病、障碍或病况或者存在发病风险的个体的方法，包括向所述的个体施用治疗有效量的羊膜来源的贴壁细胞或者羊膜来源的贴壁细胞的条件培养基，其中治疗有效量是足以引起所述的疾病、障碍或者病况的一种或多种症状可检测的改善的数量，其中所述的AMDAC经RT-PCR测定是OCT-4^–，并且附着于组织培养塑料。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述的AMDAC经RT-PCR测定是OCT-4^－，经流式细胞术测定是CD49f⁺、CD105⁺和CD200⁺。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述的AMDAC经免疫定位测定是VEGFR1/Flt-1（血管内皮生长因子受体1）和VEGFR2/KDR（血管内皮生长因子受体2）阳性。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述的AMDAC经流式细胞术测定是CD90⁺和CD117^–，经RT-PCR测定是HLA-G^–。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述的AMDAC经RT-PCR测定是OCT-4^－以及HLA-G－，和经流式细胞术测定是CD49f⁺、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述的AMDAC经免疫定位测定还是CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD98⁺、Tie-2⁺（促血管生成素受体）、TEM-7⁺（肿瘤内皮标记物7）、CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–、CD143^–、CD146^–或CXCR4^–（趋化因子（C-X-C模序）受体4）的一种或多种。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述的AMDAC经免疫定位测定还是CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD98⁺、Tie-2⁺、TEM-7⁺、CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–、CD143^–、CD146^–和CXCR4^–。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述的AMDAC经RT-PCR测定是OCT-4^–，和经免疫定位测定是CD49f⁺、HLA-G^–、CD90⁺、CD105⁺、CD117^–和CD200⁺，并且其中所述的AMDAC：

（a）经免疫定位测定表达CD9、CD10、CD44、CD54、CD98、CD200、Tie-2、TEM-7、VEGFR1/Flt-1或者VEGFR2/KDR（CD309）的一种或多种；

（b）经免疫定位测定不表达CD31、CD34、CD38、CD45、CD133、CD143、CD144、CD146、CD271、CXCR4、HLA-G或VE-钙粘蛋白；

（c）经RT-PCR测定不表达SOX2；

（d）表达以下mRNA：ACTA2、ADAMTS1、AMOT、ANG、ANGPT1、ANGPT2、ANGPTL1、ANGPTL2、ANGPTL4、BAI1、c-myc、CD44、CD140a、CD140b、CD200、CD202b、CD304、CD309、CEACAM1、CHGA、COL15A1、COL18A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、连接蛋白-3、CSF3、CTGF、CXCL12、CXCL2、DNMT3B、ECGF1、EDG1、EDIL3、ENPP2、EPHB2、FBLN5、F2、FGF1、FGF2、FIGF、FLT4、FN1、FST、FOXC2、半乳糖凝集素-1、GRN、HGF、HEY1、HSPG2、IFNB1、IL8、IL12A、ITGA4、ITGAV、ITGB3、KLF-4、MDK、MMP2、MYOZ2、NRP2、PDGFB、PF4、PGK1、PROX1、PTN、SEMA3F、SERPINB5、SERPINC1、SERPINF1、TGFA、TGFB1、THBS1、THBS2、TIE1、TIMP2、TIMP3、TNF、TNNC1、TNNT2、TNFSF15、VASH1、VEGF、VEGFB、VEGFC或者VEGFR1/FLT1；

（e）产生一种或多种蛋白质CD49d、连接蛋白-43、HLA-ABC、β2-小球蛋白、CD349、CD318、PDL1、CD106、半乳糖凝集素-1、ADAM17、血管紧张素原前体、细丝蛋白A、α-辅肌动蛋白1、巨蛋白、巨噬细胞乙酰化LDL受体I和II、辅肌动蛋白受体IIB型前体、Wnt-9蛋白质、胶质细胞原纤维酸性蛋白、星形细胞、肌球蛋白结合蛋白C，或者肌球蛋白重链、非肌肉A型；

（f）分泌血管内皮细胞生长因子（VEGF）、肝细胞生长因子（HGF）、白介素-8（IL-8）、单核细胞趋化蛋白-3（MCP-3）、FGF2、卵泡抑素、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR或者半乳糖凝集素-1进入AMDAC生长的培养基；

（g）与相同数量的骨髓来源的间质干细胞相比以更高的水平表达以下微RNAs：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92或miR-296；

（h）与相同数量的骨髓来源的间质干细胞相比以更低水平表达以下微RNAs：miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b或者miR-16；

（i）表达以下miRNAs：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b或者miR-16；或者

（j）与在21%O₂条件下培养时表达CD202b、IL-8或者VEGF相比，当在低于大约5%O₂中培养时表达增加水平的CD202b、IL-8或者VEGF。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述的AMDAC经RT-PCR测定是OCT-4^–，并且经免疫定位测定是CD49f⁺、HLA-GCD90⁺、CD105⁺和CD117^–，并且其中所述的AMDAC：

（a）经免疫定位测定表达CD9、CD10、CD44、CD54、CD98、CD200、Tie-2、TEM-7、VEGFR1/Flt-1或者VEGFR2/KDR（CD309）；

（b）经免疫定位测定不表达CD31、CD34、CD38、CD45、CD133、CD143、CD144、CD146、CD271、CXCR4、HLA-G和VE-钙粘蛋白；

（c）经RT-PCR测定不表达SOX2；

（d）经RT-PCR测定表达以下mRNA：ACTA2、ADAMTS1、AMOT、ANG、ANGPT1、ANGPT2、ANGPTL1、ANGPTL2、ANGPTL4、BAI1、c-myc、CD44、CD140a、CD140b、CD200、CD202b、CD304、CD309、CEACAM1、CHGA、COL15A1、COL18A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、连接蛋白-3、CSF3、CTGF、CXCL12、CXCL2、DNMT3B、ECGF1、EDG1、EDIL3、ENPP2、EPHB2、FBLN5、F2、FGF1、FGF2、FIGF、FLT4、FN1、FST、FOXC2、半乳糖凝集素-1、GRN、HGF、HEY1、HSPG2、IFNB1、IL8、IL12A、ITGA4、ITGAV、ITGB3、KLF-4、MDK、MMP2、MYOZ2、NRP2、PDGFB、PF4、PGK1、PROX1、PTN、SEMA3F、SERPINB5、SERPINC1、SERPINF1、TGFA、TGFB1、THBS1、THBS2、TIE1、TIMP2、TIMP3、TNF、TNNC1、TNNT2、TNFSF15、VASH1、VEGF、VEGFB、VEGFC或者VEGFR1/FLT1；

（e）产生蛋白质CD49d、连接蛋白-43、HLA-ABC、β2-小球蛋白、CD349、CD318、PDL1、CD106、半乳糖凝集素-1、ADAM17、血管紧张素原前体、细丝蛋白A、α-辅肌动蛋白1、巨蛋白、巨噬细胞乙酰化LDL受体I和II、辅肌动蛋白受体IIB型前体、Wnt-9蛋白质、胶质细胞原纤维酸性蛋白、星形细胞、肌球蛋白结合蛋白C，和/或肌球蛋白重链、非肌肉A型；

（f）分泌VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、卵泡抑素、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR和半乳糖凝集素-1进入AMDAC生长的培养基；

（g）与相同数量的骨髓来源的间质干细胞相比以更高的水平表达下列微RNAs：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92和miR-296；

（h）与相同数量的骨髓来源的间质干细胞相比以更低水平表达下列微RNAs：miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b和miR-16；

（i）表达下列miRNAs：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b和miR-16；或者

10.如权利要求1–9任一项的方法，包括对所述的个体另外施用第二类干细胞。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述的第二类干细胞是胚胎干细胞、从外围血分离的干细胞、从胎盘血分离的干细胞、从胎盘灌注液分离的干细胞、从胎盘组织分离的非AMDAC干细胞、从脐血分离的干细胞、脐带血干细胞、骨髓来源的间质干细胞、脂肪源性干细胞、造血干细胞或者成体干细胞。

12.如权利要求1–9任一项的方法，其中所述的疾病、障碍或者病况是脊髓损伤。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述的脊髓损伤由直接创伤的破坏引起。

14.如权利要求12所述的方法，其中所述的脊髓损伤由骨碎片或者盘材料压迫引起。

15.如权利要求1–9任一项的方法，其中所述的疾病、障碍或者病况是由脊髓损伤导致的脊髓休克。

16.如权利要求1–9任一项的方法，其中所述的疾病、障碍或者病况是由脊髓损伤导致的神经性休克。

17.如权利要求1–9任一项的方法，其中所述的疾病、障碍或者病况是由脊髓损伤导致的自主神经反射异常。

18.如权利要求1–9任一项的方法，其中所述的疾病、障碍或者病况是由脊髓损伤导致的水肿。

19.如权利要求1–9任一项的方法，其中所述的疾病、障碍或者病况选自由中央脊髓综合征、布朗-塞卡尔综合征、前脊髓综合征、脊髓圆锥综合症和马尾综合症。

20.如权利要求12所述的方法，其中所述的脊髓损伤是在颈椎、胸椎、腰椎或者骶椎中一处或多处。

21.如权利要求12所述的方法，其中所述的脊髓损伤是对颈髓、胸髓、腰髓、脊髓圆锥、枕骨部的一种或多种，或者马尾的一束或多束神经的损伤。

22.如权利要求12所述的方法，其中所述的一种或多种症状包括在脊髓的颈、胸、腰或者骶骨部位的运动功能、感觉功能或者运动和感觉功能的丧失或者损伤。

23.如权利要求12所述的方法，其中所述的一种或多种症状包括在臂、躯干、腿或者盆腔内器官中的运动功能、感觉功能或者运动和感觉功能的丧失或损失。

24.如权利要求12所述的方法，其中所述的一种或多种症状包括在皮区C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8、T9、T10、T11、T12、L1、L2、L3、L4或L5中的一处或多处麻木。

25.如权利要求12所述的方法，其中在脊髓损伤的14天以内向所述的个体施用治疗有效量的羊膜来源的贴壁细胞，或者羊膜来源的贴壁细胞的条件培养基。

26.如权利要求12所述的方法，包括向所述的个体施用第二治疗剂。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述的第二治疗剂是类固醇、神经保护剂、免疫调节剂或者免疫抑制剂剂或者抗凝血剂。

28.如权利要求1–9任一项的方法，其中所述的疾病、障碍或者病况是外伤性脑损伤。

29.如权利要求28所述的方法，其中外伤性脑损伤是对额叶、顶叶、枕叶、颞叶、脑干或者小脑的损伤。

30.如权利要求28所述的方法，其中外伤性脑损伤是轻度外伤性脑损伤。

31.如权利要求28所述的方法，其中外伤性脑损伤是中度到重度的外伤性脑损伤。

32.如权利要求28所述的方法，其中所述的症状是以下症状的一种或多种的：头痛、思考困难、记忆问题、注意力障碍、情绪波动和挫折、疲劳、视力障碍、失忆、注意力分散、睡眠障碍、头晕/失去平衡、易怒、情绪困扰、感情抑郁、癫痫、恶心、嗅觉丧失、光和声音敏感、情绪易变、迷失或者混乱以及思维缓慢。

33.如权利要求28所述的方法，其中所述的症状是以下的一种或多种：注意力困难、注意力集中困难、注意力分散、记忆困难、行动迟缓、意识模糊、持续言语、冲动、语言处理障碍、言语和语言障碍、不理解所讲的话（感觉性失语症）、讲话困难和理解困难（表达性失语症）、言语不清、说话非常快或非常缓慢、阅读障碍、和书写障碍、对触觉、温度、运动、肢体位置和细微区别的解释困难、难于将感官印象整合或者模拟成心理意义的数据、部分或者完全丧失视力、眼部肌无力和重影（复视）、视觉模糊、判断距离障碍、无意识眼球运动（眼球振颤）、畏光（恐光症）、听力减弱或丧失、耳鸣（耳鸣）、声音敏感性增加、嗅觉丧失或减弱（嗅觉缺失）、味觉丧失或减弱、癫痫、与癫痫相关的惊厥、身体麻痹/痉挛、慢性疼痛、大小便失禁、睡眠障碍、失去耐力、胃口变化、体温调节异常、月经障碍、社会情感障碍、依赖行为、缺乏感情能力、缺乏动力、易怒、攻击性、抑郁、去抑制以及缺乏意识。

34.如权利要求28所述的方法，包括向所述的个体施用第二治疗剂。

35.如权利要求34所述的方法，其中所述的第二治疗剂是抗癫痫药、抗抑郁剂、金刚烷胺、哌醋甲酯、溴隐亭、卡马西平或者阿米替林。

36.如权利要求1所述的方法，其中通过选自由以下的途径给个体施用治疗有效量的羊膜来源的贴壁细胞，或者羊膜来源的贴壁细胞的条件培养基：静脉内、动脉内、腹腔内、脑室内、胸骨内、颅内、肌肉内、滑膜内、眼内、玻璃体内、脑内、侧脑室内、鞘内、骨髓输液、膀胱内、透皮、脑池内、硬膜外、皮下给药。

37.如权利要求1所述的方法，将治疗有效量的羊膜来源的贴壁细胞，或者羊膜来源的贴壁细胞的条件培养基直接施用到个体的损伤部位。