CN104470529A

CN104470529A - 利用羊膜来源的贴壁细胞治疗辐射损伤

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Publication number: CN104470529A
Application number: CN201280040374.5A
Authority: CN
Inventors: 亚历山大·弗兰茨基; 阿贾伊·帕尔; 罗伯特·J·哈黎里; 弗拉基米尔·扬科维奇
Original assignee: Anthrogenesis Corp
Current assignee: Clarity Acquisition II LLC
Priority date: 2011-07-15
Filing date: 2012-07-13
Publication date: 2015-03-25
Also published as: WO2013012698A1; JP2014520857A; US20150023926A1; MX2014000567A; EP2731440A1; EP2731440A4; CA2841713A1; TW201311259A

Abstract

本发明提供了通过向个体施用来自羊膜的生血管细胞（称为羊膜来源的贴壁细胞）或这些细胞的群体和包含这些细胞的组合物来治疗已暴露于辐射的个体（例如，患有辐射损伤的个体）的方法。

Description

利用羊膜来源的贴壁细胞治疗辐射损伤

本发明申请主张美国临时专利申请No.61/508,553的优先权，该专利申请的公开内容以其全部内容作为参考并入本文。

1.技术领域

本文提供了治疗患有辐射损伤的个体的方法，包括向所述个体施用治疗有效量的来自羊膜的生血管细胞，在本文中称为“羊膜来源的贴壁细胞”（AMDAC）。羊膜来源的贴壁细胞不同于先前所述的组织培养表面贴壁胎盘干细胞。

2.背景技术

对可以改善或缓和暴露于辐射的生理学影响（包括由于暴露于辐射所引起的身体损伤）的疗法存在需要。本文提供了治疗已暴露于辐射的个体的方法，包括施用治疗有效量（数目）的AMDAC。

3.发明内容

在一个方面，本文提供了治疗已暴露于辐射的个体（例如，患有辐射损伤的个体）的方法，包括向所述个体施用治疗有效量的分离的羊膜来源的贴壁细胞（AMDAC），其中所述细胞贴壁至组织培养表面，并且其中所述细胞是OCT-4^–（八聚物结合蛋白4），如可通过RT-PCR确定的。在某些实施方式中，所述AMDAC是OCT-4^–和CD49f⁺。在某些实施方式中，所述辐射是电离辐射。在一种具体的实施方式中，所述电离辐射是β辐射、γ幅射或X射线。在另一种实施方式中，所述辐射是α-辐射。在另一种实施方式中，所述辐射是中子辐射。

在具体的实施方式中，所述辐射是急性的，例如，0.01毫西弗特（mSv）至0.1mSv（0.001rem至0.01rem之间）的单一剂量；是急性的，例如，1mSv至10mSv（0.1rem至1.0rem之间）（0.001戈瑞（Gy）至0.01Gy之间）的单一剂量；是急性的，例如，10mSv至100mSv（1rem至10rem之间）（0.01Gy至0.1Gy之间）的单一剂量；是急性的，例如，100mSv至1000mSv（10rem至100rem之间）（0.1Gy至1.0Gy之间）的单一剂量；是急性的，例如，1000mSv至2000mSv（100rem至200rem之间）（1Gy至2Gy之间）的单一剂量；是急性的，例如，2000mSv至3000mSv（200rem至300rem之间）（2Gy至3Gy之间）的单一剂量；是急性的，例如，3000mSv至4000mSv（300rem至400rem之间）（3Gy至4Gy之间）的单一剂量；是急性的，例如，4000mSv至5000mSv（400rem至500rem之间）的单一剂量。或者是急性的，例如，5000mSv至10000mSv（500rem至1000rem之间）（5Gy至10Gy之间）的单一剂量。

在其他的具体实施方式中，所述辐射是0.01mSv至0.1mSv（0.001rem至0.01rem）之间的慢性暴露或者基本慢性暴露；1mSv至10mSv（0.1rem至1.0rem之间）（0.001Gy至0.01Gy之间）的慢性暴露；10mSv至100mSv（1rem至10rem之间）（0.01Gy至0.1Gy之间）的慢性暴露；100mSv至1000mSv（10rem至100rem之间）（0.1Gy至1.0Gy之间）的慢性暴露；1000mSv至2000mSv（100rem至200rem之间）（1Gy至2Gy之间）的慢性暴露；2000mSv至3000mSv（200rem至300rem之间）（2Gy至3Gy之间）的慢性暴露；3000mSv至4000mSv（300rem至400rem之间）（3Gy至4Gy之间）的慢性暴露；4000mSv至5000mSv（400rem至500rem之间）（4Gy至5Gy之间）的慢性暴露；5000mSv至10000mSv（500rem至1000rem之间）（5Gy至10Gy之间）的慢性暴露；或者10000mSv至100000mSv（1000rem至10000rem之间）（10Gy至100Gy之间）的慢性暴露。在某些具体的实施方式中，所述慢性暴露为1-6天；7-13天；14-27天；28-56天或者超过56天。“基本慢性暴露”可以包括（例如）在数天、数周或数月的一段持续时间内暴露，在此期间暴露是不连续的但是慢性的，例如，在特定地点随辐射源风向转变暴露。

在具体的实施方式中，个体在医学环境中暴露于所述辐射。在一种更具体的实施方式中，所述个体由于脊髓抑制（myeloablation）的目的暴露于所述辐射。在更具体的实施方式中，所述脊髓抑制是部分的（即，所述个体的至少一些骨髓细胞在辐射处理中存活，或者计算所述剂量以达到该目的）或完全的（即，辐射暴露旨在杀死所述个体的基本所有骨髓细胞；或者辐射暴露是干细胞移植（例如，骨髓移植）必需的，以保持所述个体的生命）。在其他实施方式中，所述个体在非医学环境（例如，工作场所）中暴露。

在某些实施方式中，在所述施用时所述个体尚未发展急性辐射综合征的一种或多种症状。在其他实施方式中，由于所述对辐射的暴露，所述个体已发展或有可能发展急性辐射综合征或急性辐射综合征的症状。在具体的实施方式中，所述一种或多种症状包括恶心、呕吐、腹泻、发烧和/或头痛中的一种或多种。在其他具体的实施方式中，所述一种或多种症状包括紫癜、虚弱、疲劳、感染、脱发、暴露组织的水泡或坏死、和/或出血。在其他的具体实施方式中，所述一种或多种症状包括神经功能缺损、认知损害、共济失调、震颤和/或癫痫。在另一种具体的实施方式中，所述一种或多种症状包括白细胞减少。

在另一种实施方式中，所述个体暴露于来自未接触所述个体身体的源的辐射。在另一种实施方式中，所述个体由于接触所述个体身体的放射源而暴露于辐射。在具体的实施方式中，所述个体由于所述个体吸入或摄入放射源而暴露于辐射。

在某些具体的实施方式中，所述施用在所述暴露96小时内进行；在所述暴露72小时内进行；在所述暴露48小时内进行；或在所述暴露24小时内进行。

在另一个方面，本文提供了在对其有需要的受试者中诱导造血重建（hematopoietic reconsititution）（例如，部分或完全造血重建）的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的分离的AMDAC。因此，AMDAC能够被用于将受益于造血重建的疾病/病症的治疗方法中。

如本文所使用的，造血重建是指其中受试者中造血谱系的一种或多种细胞（例如，一种或多种造血干细胞）的数目和/或类型增加的现象，例如，相对于未用这种治疗中的数目和/或类型，由于使用AMDAC治疗而引起的增加。不希望受到理论束缚，由于使用AMDAC治疗，造血谱系细胞的数目和/或类型的增加可以是由AMDAC对这些细胞的直接或间接作用所导致的。可以使用本领域技术人员已知的方法评价造血重建现象，例如，FACS分析和血液学分析，例如，红细胞计数、血细胞比容和血红蛋白水平（参见，例如，下文实施例4）。

在一种具体的实施方式中，进行造血重建的受试者已暴露于辐射（例如，致死或次致死剂量的辐射）。在另一种具体的实施方式中，受试者未暴露于辐射。在某些实施方式中，受试者经历了脊髓抑制，例如，作为癌症治疗（例如，化疗、免疫疗法）或另一种治疗的一部分的脊髓抑制。

在一种具体的实施方式中，AMDAC能够用于重建骨髓衰竭或一种或多种主要造血谱系的产生遗传性或先天性减少的受试者的造血系统。根据该实施方式能够治疗的与骨髓衰竭有关的病症非限制性地包括再生障碍性贫血，例如，遗传性再生障碍性贫血（如，范科尼贫血（Fanconi‘s anemia）和脊髓发育不良综合征）和获得性再生障碍性贫血，例如由于暴露于辐射、药物和/或化学物质（例如，苯）所造成的贫血。在一种具体的实施方式中，所述获得性贫血不是由于暴露于辐射造成的。

在另一种具体的实施方式中，AMDAC能够用于重建患有贫血的受试者的造血系统，所述贫血包括但不限于慢性疾病（如慢性肾病或肝病）贫血；自身免疫性溶血性贫血；血红蛋白病和地中海贫血，如镰刀形红细胞病，或α-地中海贫血或者β-地中海贫血。

在另一种具体的实施方式中，AMDAC能够用于重建受试者的造血系统，所述受试者患有单纯红细胞再生障碍性贫血，例如，作为原发性病症存在的单纯红细胞再生障碍性贫血，所述原发性病症如自身免疫性红细胞再生障碍性贫血或白血病前期红细胞再生障碍性贫血；或作为与以下疾病有关的继发性病症存在的单纯红细胞再生障碍性贫血，所述疾病如恶性血液病，例如，慢性淋巴细胞性白血病、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、慢性粒细胞性白血病、骨髓纤维化、原发性血小板增多症或急性淋巴母细胞性白血病；实体瘤，例如，胃癌、乳腺癌或胆管腺癌、肺鳞状细胞癌、甲状腺癌、肾细胞癌或卡波西肉瘤；慢性淋巴细胞性贫血；药物和化学物质，例如，别嘌醇、咪唑硫嘌呤、头孢噻吩、雌激素、非诺洛芬、氟烷、异烟肼、苯巴比妥、磺胺噻唑或利福平；或严重肾衰竭。

在某些实施方式中，所述OCT-4^–AMDAC是HLA-G^–，如可通过RT-PCR确定的。在某些其他具体实施方式中，所述AMDAC另外是CD49f⁺，如可通过免疫定位确定的，即，所述AMDAC是OCT-4^–、CD49f⁺。在某些其他具体实施方式中，所述AMDAC是OCT-4^–、HLA-G^–和CD49f⁺。在其他具体的实施方式中，所述AMDAC是CD90⁺、CD105⁺或CD117^–，如可通过免疫定位确定的。在另一种具体的实施方式中，所述AMDAC是CD90⁺、CD105⁺和CD117^–，如可通过流式细胞术确定的。在一种更具体的实施方式中，所述AMDAC是OCT-4^–和HLA-G^–，如通过RT-PCR确定的，和CD49f⁺、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–，如可通过免疫定位确定的。在另一种具体的实施方式中，所述AMDAC是VEGFR1/Flt-1⁺（血管内皮生长因子受体1）和VEGFR2/KDR⁺（血管内皮生长因子受体2），如可通过免疫定位确定的。在另一种具体的实施方式中，所述AMDAC是CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD98⁺、Tie-2⁺（血管生成素受体）、TEM-7⁺（肿瘤血管内皮标志物7）、CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–、CD143^–（血管紧张素I转化酶，ACE）、CD146^–（黑素瘤细胞粘附分子）或CXCR4^–（趋化因子（C-X-C基序）受体4）中的一种或多种，如可通过免疫定位确定的。在另一种具体的实施方式中，所述AMDAC是CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD98⁺、Tie-2⁺（血管生成素受体）、TEM-7⁺（肿瘤血管内皮标志物7）、CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–、CD143^–、CD146^–和CXCR4^–，如可通过免疫定位确定的。在任何上述实施方式的另一种具体实施方式中，AMDAC是“VE-钙粘素”，如可通过免疫定位确定的。在另一种具体的实施方式中，所述AMDAC另外对CD105⁺和CD200⁺是阳性的，如可通过免疫定位确定的。在另一种具体的实施方式中，在暴露于50ng/mL VEGF7天后，所述AMDAC不表达CD34，如可通过免疫定位确定的。

在其他具体的实施方式中，对治疗辐射损伤或者治疗患有辐射损伤的个体有用，和/或在造血重建方法中有用（例如，在治疗将受益于造血重建的疾病中有用）的AMDAC贴壁至组织培养表面；其中所述AMDAC是OCT-4^–，如可通过RT-PCR确定的，和CD49f⁺、HLA-G^–、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–，如可通过免疫定位确定的；并且其中所述AMDAC：（a）表达CD9、CD10、CD44、CD54、CD98、CD200、Tie-2、TEM-7、VEGFR1/Flt-1或VEGFR2/KDR（CD309）中的一种或多种，如可通过免疫定位确定的；（b）缺乏CD31、CD34、CD38、CD45、CD133、CD143、CD144、CD146、CD271、CXCR4、HLA-G或VE-钙粘素的表达，如通过免疫定位可确定的，或缺乏SOX2的表达，如可通过RT-PCR确定的；（c）表达ACTA2、ADAMTS1、AMOT、ANG、ANGPT1、ANGPT2、ANGPTL1、ANGPTL2、ANGPTL4、BAI1、CD44、CD200、CEACAM1、CHGA、COL15A1、COL18A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、CSF3、CTGF、CXCL12、CXCL2、DNMT3B、ECGF1、EDG1、EDIL3、ENPP2、EPHB2、FBLN5、F2、FGF1、FGF2、FIGF、FLT4、FN1、FST、FOXC2、GRN、HGF、HEY1、HSPG2、IFNB1、IL8、IL12A、ITGA4、ITGAV、ITGB3、MDK、MMP2、MYOZ2、NRP1、NRP2、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、PECAM1、PF4、PGK1、PROX1、PTN、SEMA3F、SERPINB5、SERPINC1、SERPINF1、TIMP2、TIMP3、TGFA、TGFB1、THBS1、THBS2、TIE1、TIE2/TEK、TNF、TNNI1、TNFSF15、VASH1、VEGF、VEGFB、VEGFC、VEGFR1/FLT1或VEGFR2/KDR的mRNA；（d）表达蛋白质CD49d、连接蛋白-43、HLA-ABC、β2-微球蛋白、CD349、CD318、PDL1、CD106、半乳凝素-1、ADAM17、血管紧张肽原前体、细丝蛋白A、α-辅肌动蛋白1、巨蛋白、巨噬细胞乙酰化的LDL受体I和II、活化素受体IIB型前体、Wnt-9蛋白、胶质原纤维酸性蛋白、星形细胞、肌球蛋白-结合蛋白C或肌球蛋白重链，非肌A型中的一种或多种；（e）向培养AMDAC的培养基中分泌VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、卵泡抑素、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-I、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR或半乳凝素-1；（f）以高于同等数量的骨髓源间质干细胞的水平表达下述微小RNA：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92或miR-296；（g）以低于同等数量的骨髓源间质干细胞的水平表达下述微小RNA：miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b或miR-16；（h）表达下述miRNA：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b或miR-16；和/或（i）与在21%O₂条件下CD202b、IL-8或VEGF的表达相比，当在低于约5%O₂中培养时，表达较高水平的CD202b、IL-8或VEGF。

本文所提供的治疗暴露于辐射（例如，患有辐射损伤）的个体和/或治疗将受益于造血重建的疾病的方法可以使用包含本文所述的任何AMDAC的细胞群体，其中所述群体中至少50%的细胞，所述群体中至少80%的细胞或所述群体中至少90%的细胞是所述AMDAC。在具体的实施方式中，所述群体还包含分离的第二类型细胞，并且其中所述群体不是羊膜、羊膜的一部分或羊膜匀浆。在具体的实施方式中，所述第二类型细胞是造血干细胞或祖细胞，例如，CD34⁺细胞。在其他更具体的实施方式中，所述第二类型细胞是胚胎干细胞、血细胞、分离自周围血的干细胞、分离自胎盘血的干细胞、分离自胎盘灌流液的干细胞、分离自胎盘组织的干细胞、分离自脐带血的干细胞、脐带干细胞、骨髓源间质干细胞、骨髓源间充质基质细胞、造血干细胞、成体干细胞、软骨细胞、成纤维细胞、肌肉细胞（musclecell）、内皮细胞、成血管细胞、内皮祖细胞、外膜细胞、心肌细胞、肌细胞（myocyte）、心肌成肌细胞、成肌细胞或操纵以类似于胚胎干细胞的细胞。在某些更具体的实施方式中，在所述群体中所述第二类型细胞包含至少10%或至少25%的细胞。

本文所提供的分离的羊膜来源的贴壁细胞和细胞群体不是美国专利No.7,255,879或美国专利申请公开No.2007/0275362中所述的分离的胎盘干细胞或细胞群体。本文所提供的分离的羊膜来源的贴壁细胞也不是内皮祖细胞、羊膜上皮细胞、滋养母细胞、细胞滋养层、胚胎生殖细胞、胚胎干细胞、获自胚胎内细胞团的细胞或获自胚胎生殖嵴（gonadal ridge）的细胞。

如本文所使用的，术语“约”表示（例如）在所说明的数字或数值的10%内。

如本文所使用的，术语“干细胞”定义了在胚胎发育或产后组织置换和修复期间能够广泛但不必需无限制增殖并且促进多种组织形成的任何给定细胞群体的功能性质。

如本文所使用的，术语“祖细胞”定义了在胚胎学发育或产后组织置换和修复期间能够广泛但不必需无限制增殖并且与干细胞相比能够促进有限类型的多种组织形成的任何给定细胞群体的功能性质。

如本文所使用的，术语“来源于”表示分离自或另外表示纯化自。例如，羊膜来源的贴壁细胞分离自羊膜。术语“来源于”涵盖了从直接分离自组织（例如，羊膜）的细胞以及从原代分离细胞培养或扩增的细胞培养的细胞。

如本文所使用的，“免疫定位”表示在（例如）流式细胞术、荧光活化细胞分选术、磁性细胞分选、原位杂交、免疫组织化学等中使用免疫蛋白（例如，抗体或其片段）的化合物（例如，细胞标志物）的检测。

如本文所使用的，术语“分离的细胞”表示与所述分离的细胞来源的组织（例如，羊膜或胎盘）的其他细胞基本分离的细胞。如果在（例如）细胞收集和/或培养期间从所述细胞中除去了至少约20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或至少99%的所述分离的细胞与之天然相联系的细胞，则细胞是“分离的”。如本文所使用的，术语“分离的细胞群体”表示与所述细胞群体来源的组织（例如，羊膜）的其他细胞基本分离的细胞群体。

如本文所使用的，当所述标志物，例如，通过免疫定位，例如，通过流式细胞术；或通过RT-PCR是高于背景可检测的，则细胞对特定标志物是“阳性的”。例如，如果CD105在细胞上是以可检测大于背景的量可检测的（与（例如）同型对照相比），则将细胞描述为对（例如）CD105是阳性的。在（例如）抗体介导的检测的背景中，作为存在特定细胞表面标志物的指征，“阳性”表示使用对该标志物特异的抗体（例如，荧光标记抗体），该标志物是可检测的；“阳性”还表示细胞具有在（例如）流式细胞仪中产生可检测高于背景或高于同型对照的信号的量的标志物。例如，当用对CD105特异的抗体可检测地标记细胞并且来自该抗体的信号可检测地高于对照（例如，背景）时，该细胞是“CD105⁺”。相反，在相同背景中，“阴性”表示使用对该标志物特异的抗体，与背景相比，细胞表面标志物是不可检测的。例如，当细胞未用对CD34特异的抗体可检测地标记时，则细胞是“CD34^–”。除非在本文中另作说明，否则使用抗体检测分化（“CD”）标志物簇。例如，如果使用RT-PCR（例如）30个循环，OCT-4的mRNA是可检测的，则能够确定OCT-4是存在的，并且细胞是OCT-4⁺。

4.附图说明

图1示出了羊膜来源的贴壁细胞和NTERA-2细胞的干细胞相关基因的表达。

图2示出了羊膜来源的贴壁细胞（AMDAC）的细胞表面上的TEM-7的表达。

图3示出了通过羊膜来源的贴壁细胞的所选血管生成蛋白的分泌。图3A：TIMP1、TIMP2、促血小板生成素、VEGF和VEGF-D的分泌。图3B：血管生成素、EGF、ENA-78、bFGF和GRO的分泌。图3C：干扰素γ、IGF-1、IL-6、IL-8和致轻素的分泌。图3D：MCP-1、PDGF-BB、PlGF、RANTES和TGFβ1的分泌。P6：传代6次时的AMDAC。对照：无抗体。多个对照的值基本为0。密度值：Kodak Gel Logic 2200成像系统上的输出值。

图4示出了暴露于辐射并施用载体对照、暴露于辐射并施用AMDAC或Neupogen，或仅施用载体对照的小鼠组的存活曲线。

图5示出了仅施用载体对照（A组）、暴露于辐射并施用载体对照（B组）或暴露于辐射并施用指定剂量的AMDAC（C组和D组）的小鼠组的存活曲线。

图6示出了获自仅施用载体对照、暴露于辐射并施用载体对照或暴露于辐射并施用指定剂量的AMDAC的小鼠的某些血液学分析的比较结果。P值表明暴露于辐射和用载体对照处理（左数第二条棒）的小鼠之间的显著差异。A：血细胞比容（HCT）的比较。B：血红蛋白（HGB）的比较。C：红细胞计数（RBC）的比较。

图7提供了FACS分析的结果。A：仅施用载体对照，暴露于辐射并施用载体对照或暴露于辐射并施用指定剂量的AMDAC的小鼠的骨髓源细胞的c-kit和sca-1表达的图。B：暴露于辐射并施用载体对照或暴露于辐射并施用指定剂量的AMDAC的小鼠中造血干细胞和祖细胞的频率。

5.详细说明

5.1.辐射损伤的治疗

在一个方面，本文提供了治疗已暴露于辐射的个体（例如，患有辐射损伤的个体）的方法，包括向所述个体施用治疗有效量的如在本文其他地方所述的分离的羊膜来源的贴壁细胞（AMDAC），其中所述细胞贴壁至组织培养表面，并且其中所述细胞是OCT-4^–（POU5F1；八聚物结合蛋白4），如可通过RT-PCR确定的。治疗有效量是使得辐射损伤的一种或多种症状的消除、可检测改善、严重程度的减轻、发展的减缓、出现的减少或出现的防止的AMDAC的数目。在具体的实施方式中，所述一种或多种症状包括恶心、呕吐、腹泻、发烧和/或头痛中的一种或多种。在其他具体的实施方式中，所述一种或多种症状包括紫癜、虚弱、疲劳、感染、脱发、暴露组织的水泡或坏死、和/或出血。在其他的具体实施方式中，所述一种或多种症状包括神经功能缺损、认知损害、共济失调、震颤和/或癫痫。在另一种具体的实施方式中，所述一种或多种症状包括白细胞减少。

所述暴露可能是偶然的，例如，在（例如）核机构、研究机构或医院工作期间的暴露，在此期间所述暴露不是故意的或者是由于个体处于已被放射性材料污染的区域（例如，核爆炸或核电站事故周围区域）中所造成的。所述暴露还可能是由军事行动的附属部分（例如，核武器打击）所造成的。所述暴露还可能是故意的，例如，作为与核事故（例如，核反应堆事故）相伴的补救或清理活动的一部分的暴露，或作为医学程序的一部分的暴露。在该实施方式中，医学程序可以是（例如）与头、胸部、胸廓、腹部或其他身体部分有关的一种或多种X射线程序。所述医学程序也可以是头、胸部、胸廓、腹部或其他身体部分的CT扫描。所述医学程序也可以是部分或完全辐射诱导的脊髓抑制。在该实施方式中，“部分”脊髓抑制表示暴露于足够强度和持续时间的辐射以杀死个体中的一些骨髓细胞，但并非全部的骨髓细胞；相反，“完全”脊髓抑制则表示暴露于足够强度和持续时间的辐射以杀死个体中基本全部骨髓细胞以保持个体生命，例如，需要医学看护的暴露，例如，干细胞移植，例如，骨髓移植。

对于开始AMDAC治疗，个体不需要确实诊断为辐射病或放射性暴露的任何症状；个体已暴露于辐射的指示就足够了。

个体中的辐射损伤可以是由任何类型的辐射所引起的。在某些实施方式中，所述辐射是电离辐射。在一种具体的实施方式中，所述电离辐射是β辐射、γ幅射或X射线。在另一种实施方式中，所述辐射是α-辐射。在另一种实施方式中，所述辐射是中子辐射。所述个体可以已经历了全身辐射，例如，其中身体的所有部分接受了相同或基本相同的放射性暴露。所述个体还可以已经历了局部辐射，例如，仅个体身体的一部分的辐射。

在某些实施方式中，所述个体经历的导致辐射损伤的放射性暴露是急性的，即，单次暴露或短时间暴露（例如，小于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12小时）的结果。在某些实施方式中，所述急性暴露是亚致死的。在其他实施方式中，所述急性暴露是致死的，例如，如果未经治疗，则会在暴露后21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1天内导致所述个体死亡。在某些其他实施方式中，所述个体经历的导致辐射损伤的放射性暴露是慢性的，即，在例如1-70天或更长时间的过程中的积累。例如，由于在放射区域中工作延长的时间；在放射区域中生活延长的时间等，所述个体会慢性暴露于辐射。在某些其他实施方式中，所述暴露是基本慢性的。“基本慢性暴露”可以包括（例如）在数天、数周或数月的一段持续时间内暴露，在此期间暴露是不连续的但是慢性的，例如，在特定地点随辐射源风向转变暴露。在某些实施方式中，所述慢性暴露在不进行治疗的情况下不会最终致死。在其他实施方式中，所述慢性暴露在不进行治疗的情况下是最终致死的。

在具体的实施方式中，所述辐射是急性的，例如，0.01mSv（毫西弗）至0.1mSv（0.001rem至0.01rem之间）的单一剂量；是急性的，例如，1mSv至10mSv（0.1rem至1.0rem之间）（0.001Gy（戈瑞）至0.01Gy之间，或者0.1cGy（厘戈瑞）至1.0cGy之间）的单一剂量；是急性的，例如，10mSv至100mSv（1rem至10rem之间）（0.01Gy至0.1Gy之间，或1cGy至10cGy之间）的单一剂量；是急性的，例如，100mSv至1000mSv（10rem至100rem之间）（0.1Gy至1.0Gy之间，或者10cGy至100cGy之间）的单一剂量；1000mSv至2000mSv（100rem至200rem之间）（1Gy至2Gy之间，或者100cGy至200cGy之间）的单一剂量；是急性的，例如，2000mSv至3000mSv（200rem至300rem之间）（2Gy至3Gy之间，或者200cGy至300cGy之间）的单一剂量；是急性的，例如，3000mSv至4000mSv（300rem至400rem之间）（3Gy至4Gy之间，或者300cGy至400cGy之间）的单一剂量；是急性的，例如，4000mSv至5000mSv（400rem至500rem之间）（4Gy至5Gy之间，或者400cGy至500cGy之间）的单一剂量；或者5000mSv至10000mSv（500rem至1000rem之间）（5Gy至10Gy之间，或者500cGy至1000cGy之间）的单一剂量；或者是急性的，例如，10000mSv至100000mSv（1000rem至10000rem之间）（10Gy至100Gy之间，或者1000cGy至10000cGy之间）的单一剂量。

在某些其他实施方式中，所述辐射是0.01mSv至0.1mSv（0.001rem至0.01rem之间）（0.0001Gy至0.001Gy之间，或者0.01cGy至0.1cGy之间）的慢性暴露；1mSv至10mSv（0.1rem至1.0rem之间）（0.001Gy至0.01Gy之间，或者0.1cGy至1.0cGy之间）的慢性暴露；10mSv至100mSv（1rem至10rem之间）（0.01Gy至0.1Gy之间，或者1cGy至10cGy之间）的慢性暴露；100mSv至1000mSv（10rem至100rem之间）（0.1Gy至1.0Gy之间，或者10cGy至100cGy之间）的慢性暴露；1000mSv至2000mSv（100rem至200rem之间）（1Gy至2Gy之间，或者100cGy至200cGy之间）的慢性暴露；2000mSv至3000mSv（200rem至300rem之间）（2Gy至3Gy之间，或者200cGy至300cGy之间）的慢性暴露；3000mSv至4000mSv（300rem至400rem之间）（3Gy至4Gy之间，或者300cGy至400cGy之间）的慢性暴露；4000mSv至5000mSv（400rem至500rem之间）（4Gy至5Gy之间，或者400cGy至500cGy之间）的慢性暴露；5000mSv至10000mSv（500rem至1000rem之间）（5Gy至10Gy之间，或者500cGy至1000cGy之间）的慢性暴露；或者10000mSv至100000mSv（1000rem至10000rem之间）（10Gy至100Gy之间，或者1000cGy至10000cGy之间）的慢性暴露。

在某些具体的实施方式中，所述慢性辐射为1-6天；7-13天；14-27天；28-56天或者超过56天。在某些其他实施方式中，所述暴露为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。

可以预防性施用AMDAC，以改善、降低或预防辐射暴露的一种或多种症状的发展，例如，辐射病的一种或多种症状。因此，在所述方法的某些实施方式中，在所述施用时，所述个体已暴露于辐射，但尚未发展急性放射性综合征的一种或多种症状。或者作为另外一种选择，还可以在已发展或显示出辐射暴露的一种或多种症状后向所述个体施用AMDAC。

在具体的实施方式中，个体在医学环境中暴露于所述辐射。在一种更具体的实施方式中，所述个体由于脊髓抑制（myeloablation）的目的暴露于所述辐射。在更具体的实施方式中，所述脊髓抑制是部分的（即，所述个体的至少一些骨髓细胞在辐射处理中存活，或者计算所述剂量以达到该目的）或完全的（即，辐射暴露旨在杀死所述个体基本所有的骨髓细胞；或者辐射暴露需要干细胞移植，例如，骨髓移植，以保持所述个体的生命）。在其他具体的实施方式中，出于另外的医学目的（例如，身体的一个或多个部位的成像），所述个体已暴露于辐射。

在其他实施方式中，所述个体已在非医学环境（例如，在工作场所，例如，核动力机构、研究机构或核武器机构）中暴露。

在另一种实施方式中，所述个体暴露于来自未接触所述个体身体的源的辐射。在另一种实施方式中，所述个体由于接触所述个体身体的放射源而暴露于辐射。在一种具体的实施方式中，由于所述个体吸入或摄入放射源，例如，摄入（例如）放射性水、食品、灰尘、空气等中的放射性磷、硫、锶、碘、铯、铀、钚等，而使得所述个体暴露于辐射。

在某些具体的实施方式中，所述施用在所述暴露的96小时内；在所述暴露的72小时内；在所述暴露的48小时内；在所述暴露的24小时内；在所述暴露的12小时内；在所述暴露的6小时内；或在所述暴露的3小时内发生。在某些其他具体实施方式中，所述施用在所述暴露检测的96小时内；在所述暴露检测的72小时内；在所述暴露检测的48小时内；在所述暴露检测的24小时内；在所述暴露检测的12小时内；在所述暴露检测的6小时内；或在所述暴露检测的3小时内发生。在某些实施方式中，在暴露的个体中一显示出辐射暴露的一种或多种症状本身，例如，恶心、呕吐、腹泻、头痛、身体的暴露部分中的烧灼感等，就施用AMDAC。

在某些实施方式中，在所述施用时所述个体尚未发展急性辐射综合征的一种或多种症状。在其他实施方式中，由于所述对辐射的暴露，所述个体已发展或有可能发展急性辐射综合征或急性辐射综合征的症状。在某些实施方式中，将AMDAC治疗性施用于所述个体；即，在暴露已经发生后，例如辐射损伤已经发生后。在某些具体的实施方式中，所述施用在所述暴露96小时内进行；在所述暴露72小时内进行；在所述暴露48小时内进行；或在所述暴露24小时内进行。在某些其他实施方式中，例如，在预期暴露于辐射之前约12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1小时内，预防性施用AMDAC。当预期暴露于辐射，例如，所述暴露是医学程序的一部分或者是在污染区域（例如，核反应堆事故）中或周围工作的一部分时，可以在暴露前施用AMDAC一次或多次，例如，所述暴露前1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12小时施用。

在某些实施方式中，暴露于辐射的个体的治疗包括AMDAC的单次施用。在其他实施方式中，暴露于辐射的个体的治疗包括所述AMDAC的多于一次，例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10次施用。

在某些实施方式中，本文所提供的治疗方法包括细胞群体的施用，所述细胞群体包含通过上述标志物组合描述的任何AMDAC，其中所述群体中至少50%的细胞，所述群体中至少80%的细胞，或所述群体中至少90%的细胞是所述AMDAC。然而，所述细胞群体不是分离的羊膜或其部分。

在一种具体的实施方式中，包含AMDAC的细胞群体还包含分离的第二类型细胞，例如，对于辐射损伤可以是治疗性的细胞，例如，以足够的量可以重建所述个体的造血系统的细胞。在某些实施方式中，例如，所述第二类型细胞是造血干细胞，例如，CD34⁺细胞、间质干细胞（例如，骨髓源间质干细胞）、骨髓源基质细胞、粗制骨髓（crude bone marrow）等。在其他具体的实施方式中，所述第二类型细胞是胚胎干细胞、血细胞、分离自周围血的干细胞、分离自胎盘血的干细胞、分离自胎盘灌流液的干细胞、分离自胎盘组织的干细胞、分离自脐带血的干细胞、脐带干细胞、成体干细胞、软骨细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、内皮细胞、成血管细胞、内皮祖细胞、外膜细胞、心肌细胞、肌细胞、心肌成肌细胞、成肌细胞或操纵以类似于胚胎干细胞的细胞，例如，iPS细胞。在某些更具体的实施方式中，在所述群体中所述第二类型细胞包含至少10%或至少25%的细胞。

在某些实施方式中，所述分离的第二类型细胞是干细胞，例如，组织培养表面贴壁多能细胞，其获自胎盘组织，例如，胎盘干细胞，如美国专利No.7,045,148；7,255,879；和7,311,905以及美国专利申请公开No.2007/0275362中所述的，以上每篇专利的公开内容以其全部作为参考并入本文。在具体的实施方式中，所述胎盘干细胞是CD10⁺、CD34^–和CD105⁺；CD10⁺、CD34^–、CD105⁺和CD200⁺；CD10⁺、CD34^–、CD45^–、CD90⁺、CD105⁺和CD200⁺；或者CD10⁺、CD34^–、CD45^–、CD80^–、CD86^–、CD90⁺、CD105⁺和CD200⁺。在其他具体的实施方式中，所述胎盘干细胞是CD200⁺和HLA-G⁺；CD73⁺、CD105⁺和CD200⁺；CD200⁺和OCT-4⁺；CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺；CD73⁺和CD105⁺，并且当所述群体在允许胚状体样体（embryoid-like body）形成的条件下培养时，有利于在包含所述干细胞的胎盘细胞群体中形成一种或多种胚状体样体；或者OCT-4⁺，并且当所述群体在允许胚状体样体形成的条件下培养时，有利于在包含所述干细胞的胎盘细胞群体中形成一种或多种胚状体样体；或它们的任意组合。在一种更具体的实施方式中，所述CD200⁺、HLA-G⁺干细胞是CD34^–、CD38^–、CD45^–、CD73⁺和CD105⁺。在另一种更具体的实施方式中，所述CD73⁺、CD105⁺和CD200⁺干细胞是CD34^–、CD38^–、CD45^–和HLA-G⁺。在另一种更具体的实施方式中，所述CD200⁺、OCT-4⁺干细胞是CD34^–、CD38^–、CD45^–、CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺。在另一种更具体的实施方式中，所述CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺干细胞是CD34^–、CD45^–、OCT-4⁺和CD200⁺。在另一种更具体的实施方式中，所述CD73⁺和CD105⁺干细胞是OCT-4⁺、CD34^–、CD38^–和CD45^–。在另一种更具体的实施方式中，所述OCT-4⁺干细胞是CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD34^–、CD38^–和CD45^–。在另一种更具体的实施方式中，所述胎盘干细胞是母体来源的（即具有母体基因型）。在另一种更具体的实施方式中，所述胎盘干细胞是胎儿来源的（即具有胎儿基因型）。

与每个群体中总有核细胞的数目相比，AMDAC可以以约100,000,000:1、50,000,000:1、20,000,000:1、10,000,000:1、5,000,000:1、2,000,000:1、1,000,000:1、500,000:1、200,000:1、100,000:1、50,000:1、20,000:1、10,000:1、5,000:1、2,000:1、1,000:1、500:1、200:1、100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1；1:2；1:5；1:10；1:100；1:200；1:500；1:1,000；1:2,000；1:5,000；1:10,000；1:20,000；1:50,000；1:100,000；1:500,000；1:1,000,000；1:2,000,000；1:5,000,000；1:10,000,000；1:20,000,000；1:50,000,000或约1:100,000,000的比率与多个另一种类型的细胞组合，例如，与干细胞群体组合。

5.2.造血重建

在另一个方面，本文提供了在对其有需要的受试者中（例如，在已遭受造血干细胞部分或全部丧失的受试者中）诱导造血重建（例如，部分或完全造血重建）的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的分离的AMDAC。因此，AMDAC可以用于治疗将受益于造血重建的疾病/病症的方法中。

如本文所使用的，造血重建是指其中受试者中造血谱系的一种或多种细胞（例如，一种或多种造血干细胞）的数目和/或类型增加的现象，例如，相对于未用这种治疗中的数目和/或类型，由于使用AMDAC治疗而引起的增加。不希望受到理论束缚，由于使用AMDAC治疗，造血谱系细胞的数目和/或类型的增加可以是由AMDAC对这些细胞的直接或间接作用所导致的。可以使用本领域技术人员已知的方法，例如，FACS分析和血液学分析，例如，红细胞计数、血细胞比容和血红蛋白水平（参见，例如，以下实施例4），来评价造血重建现象。

在一种具体的实施方式中，指明进行造血重建的遭受部分或完全造血干细胞损失的受试者已暴露于辐射（例如，致死或次致死剂量的辐射）。在另一种具体的实施方式中，受试者未暴露于辐射。在某些实施方式中，受试者经历了脊髓抑制，例如，作为癌症疗法（例如，化疗、免疫疗法）或其他疗法的一部分的脊髓抑制。

在一种具体的实施方式中，AMDAC可用于重建骨髓衰竭或一种或多种主要造血系的产生遗传性或先天性减少的受试者的造血系统。根据该实施方式可以治疗的与骨髓衰竭有关的病症非限制性地包括再生障碍性贫血，例如，遗传性再生障碍性贫血（如，范科尼贫血和脊髓发育不良综合征）和获得性再生障碍性贫血，如由于暴露于辐射、药物和/或化学物质（例如，苯）所造成的贫血。在一种具体的实施方式中，所述获得性贫血不是由于暴露于辐射所造成的。

在另一种具体的实施方式中，AMDAC可用于重建患有贫血的受试者的造血系统，所述贫血包括但不限于慢性疾病（如慢性肾病或肝病）贫血；自身免疫性溶血性贫血；血红蛋白病和地中海贫血，如镰刀形红细胞病，或α-地中海贫血或者β-地中海贫血。

在另一种具体的实施方式中，AMDAC可用于重建受试者的造血系统，所述受试者患有单纯红细胞再生障碍性贫血，例如，作为原发性病症存在的单纯红细胞再生障碍性贫血，所述原发性病症如自身免疫性红细胞再生障碍性贫血或白血病前期红细胞再生障碍性贫血；或作为与以下疾病有关的继发性病症存在的单纯红细胞再生障碍性贫血，所述疾病如恶性血液病，例如，慢性淋巴细胞性白血病、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、慢性粒细胞性白血病、骨髓纤维化、原发性血小板增多症或急性淋巴母细胞性白血病；实体瘤，例如，胃癌、乳腺癌或胆管腺癌、肺鳞状细胞癌、甲状腺癌、肾细胞癌或卡波西肉瘤；慢性淋巴细胞性贫血；药物和化学物质，例如，别嘌醇、咪唑硫嘌呤、头孢噻吩、雌激素、非诺洛芬、氟烷、异烟肼、苯巴比妥、磺胺噻唑或利福平；或严重肾衰竭。

在某些实施方式中，已暴露于导致受试者中造血系细胞数目和/或类型减少的条件（例如，辐射或脊髓抑制）的受试者中的造血重建是指，相对于用AMDAC治疗前所述受试者中这些细胞的数目和/或类型和/或如果所述受试者不暴露于导致造血谱系细胞数目减少的条件，则将预期在所述受试者中存在的这些细胞的数目和/或类型，所述受试者中的造血系细胞的数目和/或类型增加。在某些实施方式中，遭受将受益于造血重建的疾病或病症的受试者中的造血重建是指相对于用AMDAC治疗前所述受试者中这些细胞的数目和/或类型和/或如果所述受试者未遭受导致造血系细胞数目减少的疾病或病症，则将预期在所述受试者中存在的这些细胞的数目和/或类型，所述受试者中的造血谱系细胞的数目和/或类型增加。

5.3.羊膜来源贴壁细胞的特征

在本文所提供的治疗辐射损伤和造血重建的方法中有用的AMDAC可通过如下所述的两步分离程序获自羊膜，贴壁至细胞培养表面，例如，贴壁至组织培养塑料，其是OCT-4^–（八聚物结合蛋白4），如通过RT-PCR可确定的，并且显示出下列一些或全部特征。

AMDAC显示出将它们与其他羊膜来源或胎盘来源的细胞相区分的细胞标志物。例如，在一种实施方式中，OCT-4^–AMDAC另外还是CD49f⁺，如可通过免疫定位确定的。在另一种具体的实施方式中，所述AMDAC是HLA-G^–，如通过RT-PCR确定的。在另一种具体的实施方式中，所述OCT-4^–AMDAC是VEGFR1/Flt-1⁺（血管内皮生长因子受体1）和/或VEGFR2/KDR⁺（血管内皮生长因子受体2），如可通过免疫定位确定的。在一种具体的实施方式中，所述OCT-4^–AMDAC表达的OCT-4的（例如）20个循环的PCR扩增的mRNA比相同数目的NTERA-2细胞在相同数目的RNA扩增循环时少至少2log。在另一种具体的实施方式中，所述OCT-4^–AMDAC是CD90⁺、CD105⁺或CD117^–。在一种更具体的实施方式中，所述OCT-4^–AMDAC是CD90⁺、CD105⁺和CD117^–，例如，如可通过免疫定位确定的。在一种更具体的实施方式中，所述AMDAC是OCT-4^–和/或HLA-G^–，并且另外还是CD49f⁺、CD90⁺、CD105⁺和/或CD117^–，例如，如可通过免疫定位确定的。在一种更具体的实施方式中，所述AMDAC是OCT-4^–、HLA-G^–、CD49f⁺、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–，例如，如可通过免疫定位确定的。在另一种具体的实施方式中，所述OCT-4^–AMDAC不表达SOX2，例如，如可通过RT-PCR30个循环确定的。因此，在一种具体的实施方式中，所述细胞是OCT-4^–、CD49f⁺、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–，如可通过免疫定位确定的，和SOX2^–，如可通过RT-PCR（例如）30个循环确定的。

在另一种实施方式中，所述OCT-4^–AMDAC是CD29⁺、CD73⁺、ABC-p⁺和CD38^–中的一种或多种，如通过免疫定位所确定的。

在另一种具体的实施方式中，例如，所述OCT-4^–AMDAC另外还是CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD98⁺、TEM-7⁺（肿瘤血管内皮标志物7）、CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–、CD143^–（血管紧张素I转化酶，ACE）、CD146^–（黑素瘤细胞粘附分子）或CXCR4^–（趋化因子（C-X-C基序）受体4）中的一种或多种，如通过免疫定位确定的，或HLA-G^–，如通过RT-PCR确定的。在一种更具体的实施方式中，所述细胞是CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD98⁺、Tie-2⁺、TEM-7⁺、CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–、CD143^–、CD146^–和CXCR4^–，如通过免疫定位确定的，和HLA-G^–，如通过RT-PCR确定的。在一种实施方式中，本文提供的羊膜来源的贴壁细胞是CD31^–、CD34^–、CD45^–和/或CD133^–中的一种或多种。在一种具体的实施方式中，所述羊膜来源的贴壁细胞是OCT-4^–，如通过RT-PCR确定的；VEGFR1/Flt-1⁺和/或VEGFR2/KDR⁺，如通过免疫定位确定的；和CD31^–、CD34^–、CD45^–和/或CD133^–中的一种或多种或全部。

在另一种具体的实施方式中，所述细胞另外还是VE-钙粘素^–，如通过免疫定位确定的。在另一种具体的实施方式中，所述细胞另外还对CD105⁺和CD200⁺呈阳性，如通过免疫定位确定的。在另一种具体的实施方式中，在暴露于1至100ng/mL VEGF4至21天后，所述细胞不表达CD34，如通过免疫定位所检测的。在更具体的实施方式中，在暴露于25至75ng/mLVEGF4至21天后，或暴露于50ng/mL VEGF4至21天后，所述细胞不表达CD34，如通过免疫定位所检测的。在更加具体的实施方式中，在暴露于1、2.5、5、10、25、50、75或100ng/mL VEGF4至21天后，所述细胞不表达CD34，如通过免疫定位所检测的。在更加具体的实施方式中，在暴露于1至100ng/mL VEGF7至14天（例如，7天）后，所述细胞不表达CD34，如通过免疫定位所检测的。

在具体的实施方式中，所述羊膜来源的贴壁细胞是OCT-4^–，如通过RT-PCR确定的，和VE-钙粘素^–、VEGFR2/KDR⁺、CD9⁺、CD54⁺、CD105⁺和/或CD200⁺中的一种或多种，如通过免疫定位确定的。在一种具体的实施方式中，所述羊膜来源的细胞是OCT-4^–，如通过RT-PCR确定的，和VE-钙粘素^–、VEGFR2/KDR⁺、CD9⁺、CD54⁺、CD105⁺和/或CD200⁺，如通过免疫定位确定的。在另一种具体的实施方式中，例如，在暴露于1至100ng/mLVEGF4至21天后，所述细胞不表达CD34，如通过免疫定位所检测的。

在另一种实施方式中，所述羊膜来源的贴壁细胞是OCT-4^–、CD49f⁺、HLA-G^–、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–。在一种更具体的实施方式中，所述细胞是CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD98⁺、Tie-2⁺、TEM-7⁺、CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–、CD143^–、CD146^–或CXCR4^–中的一种或多种，如通过免疫定位确定的。在一种更具体的实施方式中，所述细胞是CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD98⁺、Tie-2⁺、TEM-7⁺、CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–、CD143^–、CD146^–和CXCR4^-，如通过免疫定位确定的。在另一种具体的实施方式中，所述细胞另外还是VEGFR1/Flt-1⁺和/或VEGFR2/KDR⁺，如通过免疫定位确定的；和CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–和/或Tie-2^–中的一种或多种，如通过免疫定位确定的。在另一种具体的实施方式中，所述细胞另外还是VEGFR1/Flt-1⁺、VEGFR2/KDR⁺、CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–和Tie-2^–，如通过免疫定位确定的。

在另一种实施方式中，所述OCT-4^–羊膜来源的贴壁细胞另外是CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD49f⁺、CD54⁺、CD90⁺、CD98⁺、CD105⁺、CD200⁺、Tie-2⁺、TEM-7⁺、VEGFR1/Flt-1⁺和/或VEGFR2/KDR⁺（CD309⁺）中的一种或多种或者全部，如通过免疫定位确定的；或者另外是CD31^–、CD34^–、CD38^–、CD45^–、CD117^–、CD133^–、CD143^–、CD144^–、CD146^–、CD271^–、CXCR4^–、HLA-G^–和/或VE-钙粘素^–中的一种或多种或者全部，如通过免疫定位确定的，或者是SOX2^–，如通过RT-PCR确定的。

在某些实施方式中，所述分离的组织培养塑料贴壁的羊膜来源的贴壁细胞是CD49f⁺。在一种具体的实施方式中，所述CD49f⁺细胞另外还是CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD90⁺、CD98⁺、CD105⁺、CD200⁺、Tie-2⁺、TEM-7⁺、VEGFR1/Flt-1⁺和/或VEGFR2/KDR⁺（CD309⁺）中的一种或多种或者全部，如通过免疫定位确定的；或者另外是CD31^–、CD34^–、CD38^–、CD45^–、CD117^–、CD133^–、CD143^–、CD144^–、CD146^–、CD271^–、CXCR4^–、HLA-G^–、OCT-4^–和/或VE-钙粘素^–中的一种或多种或者全部，如通过免疫定位确定的，或者是SOX2^–，如通过RT-PCR确定的。

在某些其他实施方式中，所述分离的组织培养塑料贴壁的羊膜来源的贴壁细胞是HLA-G^–、CD90⁺和CD117^–。在一种具体的实施方式中，所述HLA-G^–、CD90⁺和CD117^–细胞另外还是CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD49f⁺、CD54⁺、CD98⁺、CD105⁺、CD200⁺、Tie-2⁺、TEM-7⁺、VEGFR1/Flt-1⁺和/或VEGFR2/KDR⁺（CD309⁺）中的一种或多种或者全部，如通过免疫定位确定的；或者另外是CD31^–、CD34^–、CD38^–、CD45^–、CD133^–、CD143^–、CD144^–、CD146^–、CD271^–、CXCR4^–、OCT-4^–和/或VE-钙粘素^–中的一种或多种或者全部，如通过免疫定位确定的，或者是SOX2^–，如通过RT-PCR确定的。

在另一种实施方式中，所述分离的羊膜来源的贴壁细胞或羊膜来源的生血管细胞群体不会组成性地表达成纤维细胞生长因子4（FGF4）、干扰素γ（IFNG）、趋化因子（C-X-C基序）配体10（CXCL10）、血管生成素4（ANGPT4）、血管生成素样蛋白3（ANGPTL3）、纤维蛋白原α链（FGA）、致轻素（LEP）、促乳泌素（PRL）、激动素原蛋白1（PROK1）、腱调蛋白（TNMD）、FMS样酪氨酸激酶3（FLT3）、含胞外连接域蛋白1（XLKD1）、2型钙粘素5（CDH5）、白血球细胞来源的化学吸引素1（LECT1）、纤溶酶原（PLG）、末端酶反转录酶（TERT）、（性别决定区Y）-框蛋白2（SOX2）、NANOG、基质金属蛋白酶13（MMP-13）、远端较小的同源异形盒5（DLX5）和/或骨γ羧基谷氨酸盐（gla）蛋白（BGLAP）的mRNA，如在标准培养条件下通过RT-PCR（例如）30个循环确定的。在其他实施方式中，分离的羊膜来源的贴壁细胞或羊膜来源的生血管细胞群体表达（ARNT2）、神经生长因子（NGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）、胶质源性神经营养因子（GDNF）、神经营养蛋白3（NT-3）、NT-5、缺氧诱导因子1α（HIF1A）、缺氧诱导因子2（HIG2）、血红素加氧酶（解环）1（HMOX1）、胞外超氧化物歧化酶[Cu-Zn]（SOD3）、过氧化氢酶（CAT）、转化生长因子β1（TGFB1）、转化生长因子β1受体（TGFB1R）和肝细胞生长因子受体（HGFR/c-met）的mRNA。

在另一个方面，本文提供了包含本文所述的羊膜来源的贴壁细胞的分离的细胞群体。所述细胞群体可以是同源（homogeneous）群体，例如，至少约90%、95%、98%或99%是羊膜来源的贴壁细胞的细胞群体。所述细胞群体可以是异源（hetergeneous）的，例如，其中所述群体中至多约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%的细胞是羊膜来源的贴壁细胞的细胞群体。然而，所述分离的细胞群体不是组织，即羊膜。

在一种实施方式中，本文提供了包含AMDAC的分离的细胞群体，例如，对于AMDAC基本同源的细胞群体，其中所述AMDAC贴壁至组织培养塑料，并且其中所述AMDAC是OCT-4^–，如通过RT-PCR确定的。在一种具体的实施方式中，所述AMDAC是CD49f⁺或HLA-G⁺，例如，如通过免疫定位或RT-PCR确定的。在另一种具体的实施方式中，所述AMDAC群体是VEGFR1/Flt-1⁺和/或VEGFR2/KDR⁺，如通过免疫定位确定的，其中所述分离的细胞群体不是羊膜（amnion）或羊膜（amniotic membrane）。在一种更具体的实施方式中，所述AMDAC是OCT-4^–和/或HLA-G^–，如通过RT-PCR确定的，和VEGFR1/Flt-1⁺和/或VEGFR2/KDR⁺，如通过免疫定位确定的。在一种具体的实施方式中，所述群体中至少约50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%的细胞是所述羊膜来源的贴壁细胞。在另一种具体的实施方式中，所述AMDAC是CD90⁺、CD105⁺或CD117^–。在一种更具体的实施方式中，所述AMDAC是CD90⁺、CD105⁺和CD117^–。在一种更具体的实施方式中，所述AMDAC是OCT-4^–、CD49f⁺、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–。在另一种具体的实施方式中，所述AMDAC不表达SOX2，例如，如通过RT-PCR30个循环可确定的。在一种更加具体的实施方式中，所述群体包含AMDAC，其中所述AMDAC是OCT-4^–、HLA-G^–、CD49f⁺、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–，如通过免疫定位或流式细胞术确定的，和SOX2^–，例如，如可通过RT-PCR30个循环确定的。

在另一种具体的实施方式中，所述细胞群体中的所述AMDAC是CD90⁺、CD105⁺或CD117^–，如通过免疫定位或流式细胞术确定的。在一种更具体的实施方式中，所述AMDAC是CD90⁺、CD105⁺和CD117^–，如通过免疫定位或流式细胞术确定的。在一种更具体的实施方式中，所述AMDAC是OCT-4^–或HLA-G^–，例如，如通过RT-PCR确定的，并且另外还是CD49f⁺、CD90⁺、CD105⁺或CD117^–，如通过免疫定位或流式细胞术确定的。在一种更具体的实施方式中，所述细胞群体中的AMDAC是OCT-4^–、HLA-G^–、CD49f⁺、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–。在另一种具体的实施方式中，所述AMDAC不表达SOX2，例如，如可通过RT-PCR30个循环确定的。因此，在更具体的实施方式中，所述细胞是OCT-4^–、CD49f⁺、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–，如通过免疫定位或流式细胞术可确定的，和SOX2^–，如通过RT-PCR（例如）30个循环可确定的。在一种更加具体的实施方式中，所述AMDAC是OCT-4^–或HLA-G^–，并且另外还是CD49f⁺、CD90⁺、CD105⁺或CD117^–。在一种更具体的实施方式中，所述AMDAC是OCT-4^–、HLA-G^–、CD49f⁺、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–。

在另一种实施方式中，所述细胞群体中的羊膜来源的贴壁细胞贴壁至组织培养塑料，是OCT-4^–，如通过RT-PCR确定的，并且是VEGFR1/Flt-1⁺和/或VEGFR2/KDR⁺，如通过免疫定位确定的，并且另外还是CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD98⁺、Tie-2⁺、TEM-7⁺、CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–、CD143^–、CD146^–或CXCR4^–中的一种或多种，如通过免疫定位确定的，或者是HLA-G^–，如通过RT-PCR确定的，并且其中所述分离的细胞群体不是羊膜。在另一种实施方式中，本文提供了包含羊膜来源的贴壁细胞的分离的细胞群体，其中所述细胞贴壁至组织培养塑料，其中所述细胞是OCT-4^–，如通过RT-PCR确定的，并且是VEGFR1/Flt-1⁺和/或VEGFR2/KDR⁺，如通过免疫定位确定的，其中所述细胞不表达CD34，如在暴露于1至100ng/mLVEGF4至21天后通过免疫定位检测的，并且其中所述分离的细胞群体不是羊膜。在任何上述实施方式的一种具体实施方式中，所述群体中至少约50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%的细胞是所述羊膜来源的贴壁细胞。

在另一种实施方式中，当在存在胞外基质蛋白（例如，如I型和IV型胶原）或血管生成因子（例如，如血管内皮生长因子（VEGF）、表皮生长因子（EGF）、血小板源性生长因子（PDGF）或碱性成纤维细胞生长因子（bFGF））的情况下（例如）在基质（如胎盘胶原，例如MATRIGEL^TM）中或上培养至少4天并且多至14天时，包含羊膜来源的贴壁细胞的任何上述细胞群体形成芽（sprout）样或管（tube）样结构。

羊膜来源的贴壁细胞和羊膜来源的贴壁细胞群体显示出与血管生成相关或心肌发生相关基因有关的蛋白质的特征表达。在某些实施方式中，本文提供了表达以下蛋白中的一种或多种或者全部的RNA的细胞或者其中所述分离的细胞群体中至少约50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%的细胞是表达所述RNA的羊膜来源的贴壁细胞的细胞群体，所述蛋白如ACTA2（肌动蛋白，α2，平滑肌，主动脉）、ADAMTS1（具有1型血小板反应蛋白基序的ADAM金属肽酶1）、AMOT（血管动蛋白）、ANG（血管生成素）、ANGPT1（血管生成素1）、ANGPT2、ANGPTL1（血管生成素样蛋白1）、ANGPTL2、ANGPTL4、BAI1（脑特异性血管生成抑制剂1）、CD44、CD200、CEACAM1（癌胚抗原相关细胞粘附分子1）、CHGA（嗜铬粒蛋白A）、COL15A1（胶原，XV型，α1）、COL18A1（胶原，XVIII型，α1）、COL4A1（胶原，IV型，α1）、COL4A2（胶原，IV型，α2）、COL4A3（胶原，IV型，α3）、CSF3（集落刺激因子3（粒性白细胞））、CTGF（结缔组织生长因子）、CXCL12（趋化因子（CXC基序）配体12（基质细胞衍生因子1））、CXCL2、DNMT3B（DNA（胞嘧啶-5）-甲基转移酶3β）、ECGF1（胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化酶）、EDG1（内皮细胞分化基因1）、EDIL3（EGF-样重复和盘蛋白I-样结构域3）、ENPP2（核苷酸内焦磷酸酶/磷酸二酯酶2）、EPHB2（EPH受体B2）、FBLN5（腓骨蛋白5）、F2（稳定因子II（凝血酶））、FGF1（酸性成纤维细胞生长因子）、FGF2（碱性成纤维细胞生长因子）、FIGF（c-fos诱导生长因子（血管内皮生长因子D））、FLT4（fms相关酪氨酸激酶4）、FN1（纤连蛋白1）、FST（卵泡抑素）、FOXC2（叉头框蛋白C2（MFH-1，间充质叉头蛋白1））、GRN（颗粒体蛋白）、HGF（肝细胞生长因子）、HEY1（YRPW基序相关多毛或增强子断裂蛋白1）、HSPG2（硫酸乙酰肝素蛋白聚糖2）、IFNB1（干扰素，β1，成纤维细胞）、IL8（白介素8）、IL12A、ITGA4（整合素，α4；CD49d）、ITGAV（整合素，αV）、ITGB3（整合素，β3)、MDK（中期因子）、MMP2（基质金属蛋白酶2）、MYOZ2（肌原调节蛋白2）、NRP1（神经纤毛蛋白1）、NRP2、PDGFB（血小板源性生长因子β）、PDGFRA（血小板源性生长因子受体α）、PDGFRB、PECAM1（血小板/内皮细胞粘附分子）、PF4（血小板因子4）、PGK1（磷酸甘油酸激酶1）、PROX1（Prospero同源框蛋白1）、PTN（多效蛋白）、SEMA3F（臂板蛋白3F）、SERPINB5（丝氨酸蛋白酶抑制蛋白肽酶抑制剂，分支乙（卵清蛋白），成员5）、SERPINC1、SERPINF1、TIMP2（组织金属蛋白酶2组织抑制剂）、TIMP3、TGFA（转化生长因子，α）、TGFBl、THBSl（血小板反应蛋白1）、THBS2、TIE1（免疫球蛋白样酪氨酸激酶和EGF样结构域1）、TIE2/TEK、TNF（肿瘤坏死因子）、TNNI1（肌钙蛋白1，1型）、TNFSF15（肿瘤坏死因子（配体）超家族，成员15）、VASH1（血管抑制蛋白1）、VEGF（血管内皮生长因子）、VEGFB、VEGFC、VEGFR1/FLT1（血管内皮生长因子受体1）和/或VEGFR2/KDR。

当使用人细胞时，全部基因标记是指人序列，并且如本领域技术人员公知的，可以在文献中或在GenBank中查找到代表性序列。可以通过公开可用的序列或通过商业来源确定针对序列的探针，所述商业来源例如特异性TAQMAN探针或TAQMAN血管生成阵列（Applied Biosystems，部件号No.4378710）。

羊膜来源的贴壁细胞和羊膜来源的贴壁细胞群体显示出血管生成相关蛋白的特征表达。在某些实施方式中，本文提供了表达以下蛋白的细胞或者其中所述分离的细胞群体中至少约50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%的细胞是表达所述蛋白的羊膜来源的贴壁细胞的细胞群体，所述蛋白如CD49d、连接蛋白-43、HLA-ABC、β2-微球蛋白、CD349、CD318、PDL1、CD106、半乳凝素-1、ADAM17前体（Α脱整联蛋白及金属蛋白酶结构域17）（TNF-α转化酶）（TNF-α转化酶）、血管紧张肽原前体、细丝蛋白Α（α-细丝蛋白）（细丝蛋白1）（内皮肌动蛋白结合蛋白）（ΑΒΡ-280）（非肌肉细丝蛋白）、α-辅肌动蛋白1（α-辅肌动蛋白细胞骨架同工型）（非肌肉α-辅肌动蛋白1）（F-肌动蛋白交联蛋白）、低密度脂蛋白受体相关蛋白2前体（巨蛋白）（糖蛋白330）（gp330）、I型和II型巨噬细胞清道夫受体（巨噬细胞乙酰化LDL受体I和II）、活化素受体IIB型前体（ACTR-IIB）、Wnt-9蛋白、胶质原纤维酸性蛋白、星形细胞（GFAP）、肌球蛋白-结合蛋白C、心-型（心MyBP-C）（C-蛋白、心肌同工型）和/或肌球蛋白重链、非肌肉A型（细胞肌球蛋白重链，A型）（非肌肉肌球蛋白重链-A）（NMMHC-A）。

本文所提供的羊膜来源的贴壁细胞还分泌促进（例如）内皮细胞、内皮祖细胞等中血管生成的蛋白。在某些实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞、羊膜来源的贴壁细胞群体或者包含羊膜来源的贴壁细胞的细胞群体（例如，其中所述分离的细胞群体中至少约50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%的细胞是羊膜来源的贴壁细胞）向（例如）细胞生长的培养基中分泌VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、卵泡抑素、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR、半乳凝素-1中的一种或多种或者全部。

在另一种实施方式中，包含羊膜来源的贴壁细胞的任何上述细胞群体可以导致在与所述羊膜来源的贴壁细胞接触的内皮细胞群体中形成芽样或管样结构。在一种具体的实施方式中，例如，当在存在胞外基质蛋白（如I型和IV型胶原）和/或血管生成因子（如血管内皮生长因子（VEGF）、表皮生长因子（EGF）、血小板源性生长因子（PDGF）或碱性成纤维细胞生长因子（bFGF））的情况下（例如）在基质（如胎盘胶原或MATRIGEL）中或上培养至少4天和/或多至14天时，所述羊膜来源的生血管细胞与人内皮细胞共培养，从而形成芽样或管样结构或支持内皮细胞出芽。

在另一种实施方式中，当在存在胞外基质蛋白（如I型或IV型胶原）的情况下在（例如）基质（如胎盘胶原或MATRIGEL）中或上培养时，包含羊膜来源的贴壁细胞的任何上述细胞群体分泌血管生成因子，如血管内皮生长因子（VEGF）、表皮生长因子（EGF）、血小板源性生长因子（PDGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）或白介素-8（IL-8）并借此可以诱导人内皮细胞形成芽样或管样结构。

在另一种实施方式中，本文提供了细胞群体，例如，羊膜来源的贴壁细胞群体或者其中所述分离的细胞群体中至少约50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%的细胞是以高于骨髓源间质干细胞的水平表达血管原微小RNA（miRNA）的羊膜来源的贴壁细胞的细胞群体，其中所述miRNA包含miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92和/或miR-296中的一种或多种或者全部。在另一种实施方式中，本文提供了细胞群体，例如，羊膜来源的贴壁细胞群体或者其中所述分离的细胞群体中至少约50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%的细胞是以低于骨髓源间质干细胞的水平表达血管原微小RNA（miRNA）中的一种或多种或者全部的羊膜来源的贴壁细胞的细胞群体，其中所述miRNA包含miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b和/或miR-16中的一种或多种或者全部。在某些实施方式中，AMDAC或AMDAC群体表达血管原miRNA miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b（血管原miRNA簇17-92的成员）、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b和/或miR-16中的一种或多种或者全部。

因此，在一种实施方式中，本文提供了分离的羊膜来源的贴壁细胞，其中所述细胞贴壁至组织培养塑料，并且其中所述细胞是OCT-4^–，如通过RT-PCR确定的，并且是CD49f⁺、HLA-G^–、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–，如通过免疫定位确定的，并且其中所述细胞：（a）表达CD9、CD10、CD44、CD54、CD98、CD200、Tie-2、TEM-7、VEGFR1/Flt-1或VEGFR2/KDR（CD309）中的一种或多种，如通过免疫定位确定的；（b）缺乏CD31、CD34、CD38、CD45、CD133、CD143、CD144、CD146、CD271、CXCR4、HLA-G或VE-钙粘素的表达，如通过免疫定位确定的，或缺乏SOX2的表达，如通过RT-PCR确定的；（c）表达ACTA2、ADAMTS1、AMOT、ANG、ANGPT1、ANGPT2、ANGPTL1、ANGPTL2、ANGPTL4、BAI1、CD44、CD200、CEACAM1、CHGA、COL15A1、COL18A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、CSF3、CTGF、CXCL12、CXCL2、DNMT3B、ECGF1、EDG1、EDIL3、ENPP2、EPHB2、FBLN5、F2、FGF1、FGF2、FIGF、FLT4、FN1、FST、FOXC2、GRN、HGF、HEY1、HSPG2、IFNB1、IL8、IL12A、ITGA4、ITGAV、ITGB3、MDK、MMP2、MYOZ2、NRP1、NRP2、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、PECAM1、PF4、PGK1、PROX1、PTN、SEMA3F、SERPINB5、SERPINC1、SERPINF1、TIMP2、TIMP3、TGFA、TGFB1、THBS1、THBS2、TIE1、TIE2/TEK、TNF、TNNI1、TNFSF15、VASH1、VEGF、VEGFB、VEGFC、VEGFR1/FLT1或VEGFR2/KDR的mRNA；（d）表达蛋白质CD49d、连接蛋白-43、HLA-ABC、β2-微球蛋白、CD349、CD318、PDL1、CD106、半乳凝素-1、ADAM17、血管紧张肽原前体、细丝蛋白A、α-辅肌动蛋白1、巨蛋白、巨噬细胞乙酰化的LDL受体I和II、活化素受体IIB型前体、Wnt-9蛋白、胶质原纤维酸性蛋白、星形细胞、肌球蛋白-结合蛋白C或肌球蛋白重链，非肌A型中的一种或多种；（e）向细胞生长的培养基中分泌VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、卵泡抑素、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-I、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR或半乳凝素-1；（f）以高于同等数量的骨髓源间质干细胞的水平表达下述微小RNA：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92或miR-296；（g）以低于同等数量的骨髓源间质干细胞的水平表达下述微小RNA：miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b或miR-16；（h）表达下述miRNA：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b或miR-16；和/或（i）与在21%O₂条件下CD202b、IL-8或VEGF的表达相比，当在低于约5%O₂中培养时，表达较高水平的CD202b、IL-8或VEGF。在一种具体的实施方式中，所述分离的羊膜来源的贴壁细胞是OCT-4^–，如通过RT-PCR确定的，并且是CD49f⁺、HLA-G^–、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–，如通过免疫定位确定的，并且（a）表达CD9、CD10、CD44、CD54、CD90、CD98、CD200、Tie-2、TEM-7、VEGFR1/Flt-1和/或VEGFR2/KDR（CD309），如通过免疫定位确定的；（b）缺乏CD31、CD34、CD38、CD45、CD133、CD143、CD144、CD146、CD271、CXCR4、HLA-G和/或VE-钙粘素的表达，如通过免疫定位确定的，或缺乏SOX2的表达，如通过RT-PCR确定的；（c）表达ACTA2、ADAMTS1、AMOT、ANG、ANGPT1、ANGPT2、ANGPTL1、ANGPTL2、ANGPTL4、BAI1、CD44、CD200、CEACAM1、CHGA、COL15A1、COL18A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、CSF3、CTGF、CXCL12、CXCL2、DNMT3B、ECGF1、EDG1、EDIL3、ENPP2、EPHB2、FBLN5、F2、FGF1、FGF2、FIGF、FLT4、FN1、FST、FOXC2、GRN、HGF、HEY1、HSPG2、IFNB1、IL8、IL12A、ITGA4、ITGAV、ITGB3、MDK、MMP2、MYOZ2、NRP1、NRP2、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、PECAM1、PF4、PGK1、PROX1、PTN、SEMA3F、SERPINB5、SERPINC1、SERPINF1、TIMP2、TIMP3、TGFA、TGFB1、THBS1、THBS2、TIE1、TIE2/TEK、TNF、TNNI1、TNFSF15、VASH1、VEGF、VEGFB、VEGFC、VEGFR1/FLT1和/或VEGFR2/KDR的mRNA；（d）表达CD49d、连接蛋白-43、HLA-ABC、β2-微球蛋白、CD349、CD318、PDL1、CD106、半乳凝素-1、ADAM17、血管紧张肽原前体、细丝蛋白A、α-辅肌动蛋白1、巨蛋白、巨噬细胞乙酰化的LDL受体I和II、活化素受体IIB型前体、Wnt-9蛋白、胶质原纤维酸性蛋白、星形细胞、肌球蛋白-结合蛋白C或肌球蛋白重链，非肌A型中的一种或多种；（e）向（例如）细胞生长的培养基中分泌VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、卵泡抑素、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-I、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR和/或半乳凝素-1；（f）以高于同等数量的骨髓源间质干细胞的水平表达下述微小RNA：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92和/或miR-296；（g）以低于同等数量的骨髓源间质干细胞的水平表达下述微小RNA：miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b和/或miR-16；（h）表达下述miRNA：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b和/或miR-16；和/或（i）与在21%O₂条件下CD202b、IL-8和/或VEGF的表达相比，当在低于约5%O₂中培养时，表达较高水平的CD202b、IL-8和/或VEGF。本文还提供了包含AMDAC，例如，AMDAC群体的细胞群体，所述AMDAC具有一种或多种上述列举特征。

在另一种实施方式中，包含羊膜来源的贴壁细胞的任何上述细胞群体分泌血管生成因子。在具体的实施方式中，所述细胞群体分泌血管内皮生长因子（VEGF）、表皮生长因子（EGF）、血小板源性生长因子（PDGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和/或白介素-8（IL-8）。在其他具体的实施方式中，包含羊膜来源的生血管细胞的细胞群体分泌一种或多种血管生成因子并借此诱导人内皮细胞在体外伤口愈合测定中迁移。在其他具体的实施方式中，包含羊膜来源的贴壁细胞的细胞群体诱导人内皮细胞、内皮祖细胞、肌细胞或成肌细胞成熟、分化或增殖。

在另一种实施方式中，当在存在胞外基质蛋白（如I型和IV型胶原）和/或一种或多种血管生成因子（例如，VEGF、EGF、PDGF或bFGF）的情况下（例如）在基质（如胎盘胶原或MATRIGEL）上培养时，包含羊膜来源的贴壁细胞的任何上述细胞群体吸收乙酰化的低密度脂蛋白（LDL）。

在另一种实施方式中，本文提供了包含羊膜来源的贴壁细胞的细胞群体，其中所述细胞贴壁至组织培养塑料，并且其中所述细胞是OCT-4^–，如通过RT-PCR确定的，并且是VEGFR2/KDR⁺、CD9⁺、CD54⁺、CD105⁺、CD200⁺或VE-钙粘素^–，如通过免疫定位确定的。在具体的实施方式中，所述细胞群体中至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%的细胞是羊膜来源的细胞，所述羊膜来源的细胞是OCT-4^–，如通过RT-PCR确定的，并且是VEGFR2/KDR⁺、CD9⁺、CD54⁺、CD105⁺、CD200⁺或VE-钙粘素^–，如通过免疫定位确定的。在另一种具体的实施方式中，所述群体中至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%的细胞是羊膜来源的细胞，所述羊膜来源的细胞是OCT-4^–，如通过RT-PCR确定的，并且是VEGFR2/KDR⁺、CD9⁺、CD54⁺、CD105⁺、CD200⁺或VE-钙粘素^–，如通过免疫定位确定的。在另一种具体的实施方式中，在暴露于1至100ng/mL VEGF4至21天后，所述细胞是OCT-4^–，如通过RT-PCR确定的，并且是VEGFR2/KDR⁺、CD9⁺、CD54⁺、CD105⁺、CD200⁺或VE-钙粘素^–，如通过免疫定位确定的，并且不表达CD34，如通过免疫定位检测的。在另一种具体的实施方式中，所述细胞还是VE-钙粘素^–。

本文所提供的包含羊膜来源的贴壁细胞的细胞群体能够形成类似于血管或脉管系统的芽样或管样结构。在一种实施方式中，当在存在血管原部分（例如，VEGF、EGF、PDGF或bFGF）的情况下培养时，包含羊膜来源的贴壁细胞的细胞群体形成芽样或管样结构。在一种更具体的实施方式中，所述羊膜来源的细胞是OCT-4^–，如通过RT-PCR确定的，并且是VEGFR2/KDR⁺、CD9⁺、CD54⁺、CD105⁺、CD200⁺或VE-钙粘素^–，如通过免疫定位确定的，当所述细胞群体在存在血管内皮生长因子（VEGF）的情况下培养时，所述细胞形成芽样或管样结构。

在原代培养中或在适合于干细胞培养的培养基中增殖期间，本文所述的羊膜来源的贴壁细胞显示出上述特征，例如，细胞表面标志物和/或基因表达谱，和/或血管原效力和功能的组合。这些培养基包括（例如）包含1至100%DMEM-LG（Gibco）、1至100%MCDB-201（Sigma）、1至10%胎牛血清（FCS）（Hyclone Laboratories）、0.1至5×胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS,Sigma）、0.1至5×亚油酸-牛血清白蛋白（LA-BSA，Sigma）、10^-5至10^-15M地塞米松（Sigma）、10^-2至10^-10M抗坏血酸2-磷酸酯（Sigma）、1至50ng/mL表皮生长因子（EGF）（R&D Systems）、1至50ng/mL血小板源性生长因子（PDGF-BB）（R&D Systems）和100U青霉素/1000U链霉素的培养基。在一种具体的实施方式中，所述培养基包含60%DMEM-LG（Gibco）、40%MCDB-201（Sigma）、2%胎牛血清（FCS）（HycloneLaboratories）、1×胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）、1×亚麻酸-牛血清白蛋白（LA-BSA）、10^-9M地塞米松（Sigma）、10^-4M抗坏血酸2-磷酸酯（Sigma）、10ng/mL表皮生长因子（EGF）（R&D Systems）、10ng/mL血小板源性生长因子（PDGF-BB）（R&D Systems）和100U青霉素/1000U链霉素。其他适合的培养基如下所述。

例如，在容器中，本文所提供的羊膜来源的贴壁细胞的分离群体可以包含约、至少约或不超过约1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹或更多个羊膜来源的贴壁细胞。在多种实施方式中，在本文所提供的分离的细胞群体中至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%的细胞是羊膜来源的贴壁细胞。也就是说，分离的羊膜来源的贴壁细胞群体可以包含（例如）多至1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的非干细胞。

本文所提供的羊膜来源的贴壁细胞可以在基质上培养。在多种实施方式中，所述基基质可以是在其上可以完成羊膜来源的贴壁细胞的培养和/或选择的任何表面。通常，所述基质是塑料，例如，组织培养盘或塑料多孔板。可以用生物分子或合成模拟剂（例如，CELLSTART^TM、MESENCULT^TMACF-基质、鸟氨酸或聚赖氨酸）或者胞外基质蛋白（例如，胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白等）处理、涂覆或印迹组织培养塑料。

羊膜来源的细胞（例如，本文所提供的羊膜来源的贴壁细胞）和这些细胞的群体可以分离自一种或多种胎盘。例如，本文所提供的分离的羊膜来源的细胞群体可以是包含获自或包含在破裂的羊膜组织（例如，组织消化物（即通过羊膜的酶促消化所获得的细胞收集物））的这些细胞的胎盘细胞群体，其中所述细胞群体对于羊膜来源的细胞是富集的，并且其中所述组织来自于单个胎盘或者两个或更多个胎盘。可以培养并扩增分离的羊膜来源的细胞，以产生这些细胞的群体。还可以培养并扩增包含羊膜来源的贴壁细胞的胎盘细胞群体，以产生羊膜来源的贴壁细胞的群体。

在某些实施方式中，显示出任何上述标志物和/或基因表达特征的AMDAC已传代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次或者更多次。在某些其他实施方式中，显示出任何上述标志物和/或基因表达特征的AMDAC已在培养中倍增了至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或至少50次或者更多次。

5.4.获得羊膜来源的生血管细胞的方法

可以（例如）通过特定的羊膜组织消化方法，并且随后可选地评价所得细胞或细胞群体是否存在标志物或标志物的组合，鉴定羊膜来源的贴壁细胞，或者通过获得羊膜细胞并根据羊膜来源的贴壁细胞的标志物特征选择，来产生（例如，从其他细胞或细胞群体分离）羊膜来源的贴壁细胞和包含羊膜来源的贴壁细胞的细胞群体。

可以通过（例如）羊膜组织的消化并随后选择贴壁细胞来产生本文所提供的羊膜来源的贴壁细胞以及包含羊膜来源的贴壁细胞的分离的细胞群体。在一种实施方式中，例如，能够通过以下步骤产生分离的羊膜来源的贴壁细胞或包含羊膜来源的贴壁细胞的分离的细胞群体：（1）用第一种酶消化羊膜组织从而使来自羊膜上皮层的细胞与来自羊膜间充质层的细胞分离；（2）随后用第二种酶消化羊膜的间充质层以形成单细胞悬液；（3）在组织培养表面（例如，组织培养塑料）上，在所述单细胞悬液中培养细胞；和（4）在改变培养基后，选择贴壁至所述表面的细胞，由此产生了包含羊膜来源的贴壁细胞的分离的细胞群体。在一种具体的实施方式中，所述第一种酶是胰蛋白酶。在一种更具体的实施方式中，在每克待消化的羊膜组织5-20（例如，10）毫升溶液中，以0.25%胰蛋白酶浓度（w/v）使用所述胰蛋白酶。在另一种更具体的实施方式中，允许在37℃进行约15分钟的所述用胰蛋白酶的消化并重复至多三次。在另一种具体的实施方式中，所述第二种酶是胶原酶。在一种更具体的实施方式中，在5mL每克待消化的羊膜组织中，以50至500U/L的浓度使用所述胶原酶。在另一种更具体的实施方式中，允许在37℃进行约45-60分钟的所述用胶原酶的消化。在另一种具体的实施方式中，在步骤（2）至步骤（3）之间通过（例如）75μM-150μM过滤器过滤胶原酶消化后所形成的单细胞悬液。在另一种具体的实施方式中，所述第一种酶是胰蛋白酶，并且所述第二种酶是胶原酶。

在另一种实施方式中，可以通过选择显示出羊膜来源的贴壁细胞的一种或多种特征的来自羊膜的细胞，例如，如在本文其他地方所述的通过消化羊膜组织获得的细胞来获得包含羊膜来源的贴壁细胞的分离的细胞群体。在一种实施方式中，例如，通过以下方法产生细胞群体，所述方法包括选择（a）对OCT-4是阴性的羊膜细胞，如通过RT-PCR确定的，和（b）对VEGFR2/KDR、CD9、CD54、CD105、CD200中的一种或多种是阳性的羊膜细胞，如通过免疫定位确定的；和从其他细胞分离所述细胞，以形成细胞群体。在一种具体的实施方式中，所述羊膜细胞另外还是VE-钙粘素^–。在一种具体的实施方式中，通过选择（a）对OCT-4（如通过RT-PCR确定的）和对VE-钙粘素（如通过免疫定位确定的）是阴性的胎盘细胞，和（b）对VEGFR2/KDR、CD9、CD54、CD105、CD200中的每一个是阳性的胎盘细胞，如通过免疫定位确定的；和从其他细胞分离所述细胞，以形成细胞群体来产生细胞群体。在某些实施方式中，在通过RT-PCR进行选择之前进行通过免疫定位的选择。在另一种具体的实施方式中，所述选择包括在存在1至100ng/mL VEGF的条件下培养4至21天后选择不表达细胞标志物CD34的细胞。

在另一种实施方式中，例如，通过以下方法产生细胞群体，所述方法包括选择贴壁至组织培养塑料并且是OCT-4^–（如通过RT-PCR确定的）和VEGFR1/Flt-1⁺和VEGFR2/KDR⁺（如通过免疫定位确定的）的羊膜细胞，以及从其他细胞分离所述细胞以形成细胞群体。在一种具体的实施方式中，通过以下方法产生细胞群体，所述方法包括选择是OCT-4^–（如通过RT-PCR确定的）和VEGFR1/Flt-1⁺、VEGFR2/KDR⁺和HLA-G^–（如通过免疫定位确定的）的羊膜细胞。在另一种具体的实施方式中，通过选择另外还是CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD98⁺、Tie-2⁺、TEM-7⁺、CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–、CD143^–、CD146^–和/或CXCR4^–（趋化因子（C-X-C基序）受体4）中的一种或多种或者全部的羊膜细胞，和从不显示出这些特征中的一种或多种的细胞分离所述细胞产生了所述细胞群体。在另一种具体的实施方式中，所述细胞群体是通过选择另外是VE-钙粘素^–（如通过免疫定位确定的）的羊膜细胞，和将所述细胞与VE-钙粘素⁺细胞分离产生的。在另一种具体的实施方式中，所述细胞群体是通过选择另外是CD105⁺和CD200⁺（如通过免疫定位确定的）的羊膜细胞，和将所述细胞与CD105^–或CD200^–细胞分离产生的。在另一种具体的实施方式中，在暴露于1至100ng/mL VEGF4至21天后，所述细胞不表达CD34，如通过免疫定位所检测的。

在细胞选择中，不必测试整个细胞群体对羊膜来源的贴壁细胞特异的特征。而是可以测试细胞群体的一个或多个细胞等份（例如，约0.5%-2%）的这些特征，并且结果可以归于所述群体中其余的细胞。

通过在存在VEGF（例如，约50ng/mL）的情况下在基质（例如，MATRIGEL）上将所述细胞的样品（例如，约10⁴至约10⁵个细胞）培养4至14天（例如7天），并目视检查所述细胞的芽和/或细胞网络的出现，可以确认所选细胞是本文所提供的羊膜来源的贴壁细胞。

可以使用细胞选择领域中已知的任何方法通过上述标志物选择羊膜来源的贴壁细胞。例如，可以在（例如）免疫定位，例如，流式细胞术或FACS中，使用抗一种或多种细胞表面标志物的抗体选择所述贴壁细胞。可以使用与磁珠结合的抗体完成选择。对某些标志物特异的抗体在本领域中是已知的，并且是可商购的，例如，抗CD9（Abcam）；CD54（Abcam）；CD105（Abcam；BioDesign International,Saco,ME等）；CD200（Abcam）；细胞角蛋白（SigmaAldrich）的抗体。抗其他标志物的抗体也是可商购的，例如，购自（例如）StemCell Technologies或BioDesign International的CD34、CD38和CD45。适合于RT-PCR的OCT-4序列的引物可以从（例如）Millipore或Invitrogen商购获得，或者可以容易地来源于GenBank登录号No.DQ486513的人序列。

下文提供了获得胎盘和羊膜组织以及处理这些组织以获得羊膜来源的贴壁细胞的详细方法。

5.4.1细胞收集组合物

一般地，可以使用生理学可用的溶液（例如，细胞收集组合物）从来自哺乳动物胎盘（例如，人胎盘）的羊膜获得细胞。优选地，所述细胞收集组合物防止或抑制细胞凋亡，防止或抑制细胞死亡、溶胞、分解等。在标题为“Improved Medium for Collection Placental Stem Cells and PreservingOrgans（用于收集胎盘干细胞和保存器官的改善培养基）”的相关美国专利申请公开No.2007/0190042中详细描述了细胞收集组合物，该专利的公开内容以其全部内容作为参考并入本文。

细胞收集组合物可以包括适合于羊膜来源的贴壁细胞的收集和/或培养的任何生理学可用的溶液，例如，盐水溶液（例如，磷酸盐缓冲盐水、克氏液、改良的克氏液、伊格尔氏溶液、0.9%NaCl等）、培养基（例如，DMEM、HDMEM等）等，其添加或未添加缓冲组份，例如，4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸（HEPES）。

细胞收集组合物可以包含趋于保存细胞（例如，羊膜来源的贴壁细胞）的一种或多种组份，即在从收集到培养期间防止细胞死亡或延缓细胞死亡、减少细胞群体中死亡细胞的数目等。这些组份可以是（例如）细胞凋亡抑制剂（例如，半胱氨酸天冬氨酸酶抑制剂或JNK抑制剂）；血管扩张剂（例如，硫酸镁、抗高血压药、心房钠尿肽（ANP）、促肾上腺皮质激素、促肾上腺皮质激素释放激素、硝普钠、肼屈嗪、三磷腺苷、腺苷、吲哚美辛或硫酸镁、磷酸二酯酶抑制剂等）；坏死抑制剂（例如，2-(1H-吲哚-3-基)-3-戊基氨基-马来酰亚胺、吡咯烷二硫代氨基甲酸盐或氯硝西泮）；TNF-α抑制剂；和/或携氧全氟化碳（例如，全氟辛基溴化物、全氟癸基溴化物等）。

细胞收集组合物可以包含一种或多种组织降解酶，例如，金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、中性蛋白酶、核糖核酸酶或脱氧核糖核酸酶等。这些酶包括但不限于胶原酶（例如，I、II、III或IV型胶原酶、获自溶组织梭状芽孢杆菌（Clostridium histolyticum）的胶原酶等）；分散酶、嗜热菌蛋白酶、弹性酶、胰蛋白酶、LIBERASE^TM、玻璃酸酶等。以下更详细地讨论了包含组织消化酶的细胞收集组合物的使用。

细胞收集组合物可以包含杀菌或细菌抑制有效量的抗生素。在某些非限制性实施方式中，所述抗生素是大环内酯（例如，妥布霉素）、头孢菌素（例如，头孢氨苄、环己烯胺头孢菌素、头孢呋辛、头孢丙烯、头孢克洛、头孢克肟或头孢羟氨苄）、克拉霉素、红霉素、青霉素（例如、青霉素V）或喹诺酮（例如，氧氟沙星、环丙沙星或诺氟沙星）、四环素、链霉素等。在一种特定的实施方式中，所述抗生素对革兰氏（+）和/或革兰氏（-）细菌是有活性的，例如，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等。

细胞收集组合物还可以包含下列化合物中的一种或多种：腺苷（约1mM至约50mM）；D-葡萄糖（约20mM至约100mM）；镁离子（约1mM至约50mM）；分子量大于20,000道尔顿的大分子，在一种实施方式中，其以足以维持内皮完整性和细胞活力的量存在（例如，合成或天然存在的胶体，多糖（如葡聚糖）或聚乙二醇，其以约25g/l至约100g/l或者约40g/l至约60g/l存在）；抗氧化剂（例如，丁基羟基苯甲醚、丁基化羟基甲苯、谷胱甘肽、维生素C或维生素E，其以约25μM至约100μM存在）；还原剂（例如，以约0.1mM至约5mM存在的N-乙酰半胱氨酸）；防止钙进入细胞的试剂（例如，以约2μM至约25μM存在的维拉帕米）；硝酸甘油（例如，约0.05g/L至约0.2g/L）；抗凝血剂，在一种实施方式中，其以足以帮助防止残余血液凝结的量存在（例如，以约1,000单位/升至约100,000单位/升的浓度存在的肝素或水蛭素）；或含有阿米洛利的化合物（例如，阿米洛利、乙基异丙基阿米洛利、六亚甲基阿米洛利、二甲基阿米洛利或异丁基阿米洛利，其以约1.0μM至约5μM存在）。

还可以在（例如）如下所述的消化期间或消化后将本文所述的羊膜来源的贴壁细胞收集到简单的生理学可用的缓冲液中，例如，磷酸盐缓冲盐水、0.9%NaCl溶液、细胞培养基等。

5.4.2胎盘的收集和处理

通常，在分娩后或在（例如）剖腹产后胎盘去除后不久回收人胎盘。在一种优选的实施方式中，在知情同意后并且在获得患者的完整病历并且该病历与胎盘有关后从患者回收胎盘。优选地，在产后继续记录病历。该病历可用于配合胎盘或由此收获的细胞的后续使用。例如，根据病历，人胎盘细胞（例如，羊膜来源的贴壁细胞）可用于与胎盘有关的婴儿或近亲属，或婴儿的父母、兄弟姐妹或其他亲属的个体化医学过程。

在回收羊膜来源的贴壁细胞前，除去脐带血和胎盘血。在某些实施方式中，产后回收胎盘中的脐带血。可以对胎盘进行常规脐带血回收过程。通常，借助于重力使用针或插管对胎盘抽血（参见，例如，Anderson，美国专利No.5,372,581；Hessel等人，美国专利No.5,415,665）。通常将针或插管置于脐静脉中，并且可以轻轻地按摩胎盘以帮助从胎盘中排出脐带血。可以商业化地进行这种脐带血回收，例如，LifeBank USA、Cedar Knolls、N.J.,ViaCord、Cord Blood Registry和CryoCell。优选地，将胎盘重力放血而不进行其他操作，从而使脐带血回收期间的组织破环程度最小。

通常，将胎盘从分娩或产房运送到另一个位置（例如，实验室）以通过（例如）灌注或组织解离用于回收脐带血和收集细胞。优选地，将胎盘在无菌、隔热的输送装置（将胎盘温度维持在20-28℃之间）中运送，例如，通过将近端脐带夹紧的胎盘置于无菌自封塑料袋中，然后置于保温容器中。在另一种实施方式中，胎盘在基本如美国专利No.7,147,626中所述的脐带血收集试剂盒中输送。优选地，在分娩后的4至24小时将胎盘运送到实验室。在某些实施方式中，在脐带血回收之前将近端脐带夹紧，优选地，在胎盘中插入的4-5cm（厘米）内。在其他实施方式中，在脐带血回收后但在胎盘的其他处理前将近端脐带夹紧。

在细胞收集前，可以将胎盘储存在无菌条件下和（例如）4℃至25℃（摄氏度）的温度下（例如，在室温下）。在灌注胎盘以除去任何残余脐带血之前，可以将胎盘保存（例如）0至24小时，多至48小时或长于48小时的一段时间。在一种实施方式中，在娩出后约0小时至约2小时收获胎盘。胎盘可以在4℃至25℃（摄氏度）的温度下保存在抗凝血剂溶液中。适合的抗凝剂溶液在本领域中是熟知的。例如，可以使用柠檬酸钠、肝素或华法令钠溶液。在优选的实施方式中，所述抗凝剂溶液包括肝素溶液（例如，1:1000溶液中的1%（w/w））。优选地，在收集细胞之前将放血的胎盘保存不超过36小时。

5.4.3羊膜组织的物理破环和酶促消化

在一种实施方式中，例如，通过钝器切割（例如使用手指），将羊膜与其余的胎盘分离。在酶促消化和贴壁细胞回收前，可以将羊膜切割成（例如）部分或组织碎片。羊膜来源的贴壁细胞可以获自整个羊膜，或获自羊膜的小碎片，例如，面积为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或约1000平方毫米的羊膜碎片。

一般地，可以在娩出后约前三天内的任何时间从胎盘羊膜或其部分收集羊膜来源的贴壁细胞，但优选地在娩出后约0小时至48小时之间，或者娩出后约8小时至约18小时之间收集。

在一种实施方式中，利用一种或多种组织消化酶通过酶促消化从羊膜组织提取羊膜来源的贴壁细胞。可以（例如）用溶解或混合于如上所述的细胞收集组合物中的一种或多种酶消化羊膜或其部分。

在某些实施方式中，细胞收集组合物包含一种或多种组织破坏酶。酶促消化优选地使用（例如）以顺序次序使用的酶的组合，例如，基质金属蛋白酶和中性蛋白酶的组合，例如，分散酶和胶原酶的组合。当使用不止一种蛋白酶时，可以同时使用该蛋白酶以消化羊膜组织，或者可以顺序使用。在一种实施方式中，例如，用胰蛋白酶消化羊膜组织三次，然后用胶原酶消化一次。

在一种实施方式中，用基质金属蛋白酶、中性蛋白酶和粘多糖酶中的一种或多种酶促消化羊膜组织。在一种具体的实施方式中，用胶原酶、分散酶和玻璃酸酶的组合消化羊膜组织。在另一种具体的实施方式中，用LIBERASE（Boehringer Mannheim Corp.,Indianapolis,Ind.）和玻璃酸酶的组合消化羊膜组织。能够用于破坏羊膜组织的其他酶包括木瓜蛋白酶、脱氧核糖核酸酶、丝氨酸蛋白酶，例如胰蛋白酶、糜蛋白酶或弹性酶。可以通过血清中的α2微球蛋白抑制丝氨酸蛋白酶，并且因此，在某些实施方式中，用于消化的媒介可以是不含血清的。在某些其他实施方式中，在羊膜组织的消化中使用了EDTA和脱氧核糖核酸酶以（例如）提高细胞回收效率。在某些其他实施方式中，稀释消化物以避免将细胞限制（trap）在粘稠的消化液内。

组织消化酶的典型浓度包括，例如，对于胶原酶I和胶原酶IV为50-200U/mL，对于分散酶为1-10U/mL，以及对于弹性酶为10-100U/mL。蛋白酶可以组合使用，即在相同消化反应中使用两种或更多种蛋白酶，或者可以顺序使用以分离羊膜来源的贴壁细胞。例如，在一种实施方式中，首先在37℃，以约0.25%的浓度，用适当量的胰蛋白酶将羊膜组织或其部分消化（例如）15分钟，然后以约1mg/ml至约2mg/ml的胶原酶消化（例如）45分钟。

在一种实施方式中，能够如下所示获得羊膜来源的贴壁细胞。将羊膜切成约0.1”×0.1”至约5”×5”（例如，2”×2”）大小的碎片。如下所示，通过三次胰酶消化从羊膜的胎儿侧除去上皮细胞单层。将羊膜碎片置于具有温热（例如，约20℃至约37℃）胰蛋白酶-EDTA溶液（0.25%）的容器中。胰蛋白酶的体积可以在约5mL每克羊膜至约50mL每克羊膜的范围内。将容器搅拌约5分钟至约30分钟（例如，15分钟），同时保持温度恒定。然后，通过任何适合的方法（如用手除去羊膜碎片或通过过滤）将羊膜部分与胰蛋白酶溶液分离。胰酶消化步骤可以再重复至少一次。

一旦完成了最终的胰酶消化，将羊膜碎片放回到装有温热的胰蛋白酶中和溶液（如磷酸盐缓冲盐水（PBS）/10%FBS、PBS/5%FBS或者PBS/3%FBS）的容器中。将容器搅拌约5秒至约30分钟，例如，5分钟。然后，如上所述将羊膜碎片与胰蛋白酶中和溶液分离，并且将羊膜部分置于装有温热PBS（pH7.2）的容器中。将容器搅拌约5秒至约30分钟，然后将羊膜部分与如上所述的PBS分离。

然后，将羊膜碎片置于装有温热（例如，约20℃至约37℃）消化溶液的容器中。消化溶液的体积可以在约5mL每克羊膜至约50mL每克羊膜的范围内。消化溶液包含处于适合的培养基（如DMEM）中的消化酶。典型的消化溶液包括I型胶原酶（约50U/mL至约500U/mL）；I型胶原酶（约50U/mL至约500U/mL）加分散酶（约5U/mL至约100U/mL）；和I型胶原酶（约50U/mL至约500U/mL）、分散酶（约2U/mL至约50U/mL）和玻璃酸酶（约3U/mL至约10U/mL）。将容器在37℃搅拌直至羊膜消化基本完成（约10分钟至约90分钟）。然后，以约1mL每克羊膜组织至约50mL每克羊膜组织的比值将温热的PBS/5%FBS加入到容器中。将容器搅拌约2分钟至约5分钟。然后，利用40μm至100μm过滤器过滤细胞悬液以除去任何未消化的组织。将细胞悬浮在温热的PBS（约1mL至约500mL）中，然后在20℃以200×g至约400×g离心约5分钟至约30分钟，例如，以300×g离心约15分钟。离心后，除去上清液并将细胞重悬浮于适合的培养基中。可以过滤细胞悬液（40μm至70μm过滤器）以除去任何残余的未消化组织，从而得到单细胞悬液。

在该实施方式中，如在本文其他地方所述的收集并培养悬浮的细胞以产生分离的羊膜来源的贴壁细胞和这些细胞的群体。在该实施方式中，可以弃去剩余的未消化的羊膜。例如，可以通过（例如）离心收集从羊膜组织释放的细胞并在标准细胞培养基中培养。

在本文任何消化规程中，可以通过（例如）包含约50μm至约150μm，例如，约75μm至约125μm的孔的过滤器过滤通过消化获得的细胞悬液。在一种更具体的实施方式中，可以通过两种或更多种过滤器，例如，125μm过滤器和75μm过滤器过滤细胞悬液。

结合本文所述的任何方法，如以上5.3节中所述，通过选择表达一种或多种AMDAC特征的细胞，可以从消化期间释放的细胞中分离AMDAC。

例如，还可以使用包含用胰蛋白酶消化并随后用胶原酶消化的具体的两步分离法分离AMDAC。因此，在另一个方面，本文提供了分离羊膜来源的贴壁细胞的方法，包括用胰蛋白酶消化羊膜或其部分从而使上皮细胞从所述羊膜上释放；从所述上皮细胞上除去羊膜或其部分；用胶原酶进一步水解羊膜或其部分从而使羊膜来源的贴壁细胞从所述羊膜或其部分上释放；以及将所述羊膜来源的贴壁细胞与所述羊膜分离。在一种具体的实施方式中，将羊膜或其部分的消化重复至少一次。在另一种具体的实施方式中，将用胶原酶的羊膜或其部分的消化重复至少一次。在另一种具体的实施方式中，胰蛋白酶为约0.1%-1.0%（最终浓度）。在一种更具体的实施方式中，胰蛋白酶为约0.25%（最终浓度）。在另一种具体的实施方式中，胶原酶为约50U/mL至约1000U/mL（最终浓度）。在一种更具体的实施方式中，胶原酶为约125U/mL（最终浓度）。在另一种具体的实施方式中，分离方法还包括在细胞培养中培养所述羊膜来源的贴壁细胞和在所述培养中将所述羊膜来源的贴壁细胞与非贴壁细胞分离以产生富集的羊膜来源的贴壁细胞群体。在一种更具体的实施方式中，所述富集的羊膜来源的贴壁细胞群体中至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的细胞是所述羊膜来源的贴壁细胞。

在上述方法的一种更具体的实施方式中，所述羊膜来源的贴壁细胞对OCT-4是阴性的，如通过RT-PCR确定的，并且是HLA-G⁺、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–中的一种或多种，如通过流式细胞术确定的。

5.4.4羊膜来源的贴壁细胞的分离、分选和鉴别

如上所述，细胞沉淀物可以重悬浮于新鲜的细胞收集组合物或适合于细胞维持的培养基，例如，达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）；伊思考夫改良达尔伯克培养基（IMDM），例如，含有2U/mL肝素和2mM EDTA的IMDM无血清培养基（GibcoBRL,NY）；缓冲液（例如，PBS、HBSS）与FBS（例如，2%v/v）的混合物；等等。

可以将已在（例如）具有或不具有额外的胞外基质涂层（如纤连蛋白）的组织培养塑料的（例如）表面上培养的羊膜来源的贴壁细胞传代或通过差异贴壁分离。例如，可以在组织培养塑料制品上在培养基中将得自如以上5.4.3节中所述进行的羊膜组织的胶原酶消化的细胞悬液培养（例如）3-7天。在培养期间，悬液中多个细胞贴壁至培养表面，并且在继续培养后，导致产生了羊膜来源的贴壁细胞。在培养基更换期间，除去不会导致产生羊膜来源的贴壁细胞的非贴壁细胞。

可以（例如）通过使用标准细胞检测技术（如免疫定位，例如，流式细胞术、细胞分选、免疫细胞化学（例如，用组织特异或细胞标志物特异的抗体染色）、荧光活化的细胞分选（FACS）、磁性活化的细胞分选（MACS））测量形态和细胞表面标志物的变化，通过使用光学或共聚焦显微镜检查法检查细胞形态和/或通过使用本领域中公知的技术（如PCR和基因表达谱）测量基因表达的变化来监测从羊膜收集的细胞的个数和类型。这些技术也可以用于鉴别对一种或多种特定标志物呈阳性的细胞。例如，使用抗CD34的一种或多种抗体，使用上述技术可以确定细胞是否包含可检测数量的CD34；如果是，则该细胞是CD34⁺。

可以使用荧光活化的细胞分选仪（FACS）来分选羊膜来源的细胞，例如，已通过Ficoll分离、差异贴壁或两者组合分离的细胞。荧光活化的细胞分选（FACS）是根据颗粒的荧光性质分离包括细胞在内的颗粒的公知方法（参见，例如，Kamarch,1987,Methods Enzymol,151:150-165）。各个颗粒中荧光部分的激光激发导致产生少量电荷，其使得正负颗粒与混合物电磁分离。在一种实施方式中，用不同的荧光标记物标记细胞表面标志物特异的抗体或配体。通过细胞分选仪处理细胞，从而允许根据它们与所使用的抗体结合的能力分离细胞。可以将FACS分选的颗粒直接沉积到96孔板或384孔板的各个孔中以有利于分离和克隆。

在一个分选方案中，可以根据标志物CD49f、VEGFR2/KDR和/或Flt-1/VEGFR1的表达分选来自胎盘的细胞（例如，羊膜来源的贴壁细胞）。优选地，通过（例如）在细胞样品中通过RT-PCR确定OCT-4的表达将细胞鉴别为OCT-4^–，其中如果所述样品中的细胞在30次循环后不能显示出mRNA的可检测产生，则所述细胞是OCT-4^–。例如，作为VEGFR2/KDR⁺和VEGFR1/Flt-1⁺的来自羊膜的细胞可以与作为VEGFR2/KDR^–和VEGFR1/Flt-1⁺、CD9⁺、CD54⁺、CD105⁺、CD200⁺和/或VE-钙粘素^–中的一种或多种的细胞分选。在一种具体的实施方式中，将作为CD49f⁺、VEGFR2/KDR⁺、CD9⁺、CD54⁺、CD105⁺、CD200⁺和/或VE-钙粘素^–中的一种或多种的羊膜来源的组织培养塑料贴壁细胞或者作为VEGFR2/KDR⁺、CD9⁺、CD54⁺、CD105⁺、CD200⁺和VE-钙粘素^–的细胞与不表达一种或多种这些标志物的细胞分选开并选择。在另一种具体的实施方式中，将另外是CD31⁺、CD34⁺、CD45⁺、CD133^–和/或Tie-2⁺中的一种或多种或者全部的CD49f⁺、VEGFR2/KDR⁺、VEGFR1/Flt-1⁺细胞与未显示出一种或多种或者任何这些特征的细胞分选。在另一种具体的实施方式中，将另外是CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD98⁺、Tie-2⁺、TEM-7⁺、CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–、CD143^–、CD146^–和/或CXCR4^–中的一种或多种或者全部的VEGFR2/KDR⁺、VEGFR1/Flt-1⁺细胞与未显示出一种或多种或者任何这些特征的细胞分选。

可以对由消化所产生的细胞悬液或对通过（例如）离心或使用流式细胞术的分离从消化物中收集的分离的细胞进行羊膜来源的贴壁细胞的选择。可以单独或者（例如）与根据其在培养中的贴壁特性选择细胞的程序结合来完成通过所表达标志物的选择。例如，可以在根据标志物表达的分选之前或之后完成贴壁选择。

相对于胎盘细胞的抗体介导的检测和分选，可以与适合于细胞检测和分选的任何荧光团或其他标记物结合（例如，荧光激活细胞分选）使用对特定标志物特异的任何抗体。对标志物特异的抗体/荧光团组合包括，但不限于，异硫氰酸荧光素（FITC）结合的抗CD105的单克隆抗体（得自R&D Systems Inc.,Minneapolis,Minnesota）；藻红蛋白（PE）结合的抗CD200单克隆抗体（BD Biosciences Pharmingen）；VEGFR2/KDR-生物素（CD309,Abcam）等。可以用有利于抗体检测的任何标准抗体标记物标记抗本文所公开的任何标志物的抗体，所述标记物包括，例如，辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、乙酰胆碱酯酶抗生蛋白链菌素/生物素、抗生物素蛋白/生物素、伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素（FITC）、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、5-二甲氨基萘磺酰氯或藻红蛋白（PE）、鲁米诺、荧光素酶、萤光素和水母发光蛋白，并且适合的放射性物质的实例包括¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S或³H。

可以用抗单个标志物的抗体标记羊膜来源的贴壁细胞并且基于所述单个标志物检测和分选，或者可以用抗多种不同标志物的多个抗体同时标记并基于所述多种标志物分选。

在另一种实施方式中，可以使用磁珠将细胞（例如，本文所述的羊膜来源的贴壁细胞）与其他羊膜细胞分离。可以使用磁激活细胞分选（MACS）技术分选细胞，该技术是基于其结合磁珠（0.5-100μm直径）的能力分离颗粒的方法。可以在磁性微球上进行多种有用的修饰，其包括共价添加特异性识别特定细胞表面分子或半抗原的抗体。然后，将珠与细胞混合以使其结合。然后，将细胞穿过磁场以分离出具有特异性细胞表面标志物的细胞。在一种实施方式中，然后可以将这些细胞分离并与和抗其他细胞表面标志物的抗体结合的磁珠再次混合。将这些细胞再次通过磁场，从而分离出与两种抗体结合的细胞。然后，可以将这些细胞稀释至单独的盘中，如用于无性系分离的微量滴定盘。

可以使用本领域中已知的标准技术评价羊膜来源的贴壁细胞的存活力、增殖潜能和寿命，所述标准技术如台盼蓝排阻测定、荧光素二乙酸酯吸收测定、碘化丙啶吸收测定（以评价存活力）；和胸苷吸收测定或MTT细胞增殖测定（以评价增殖）。可以通过本领域中熟知的方法确定寿命，如通过确定扩大培养中群体倍增的最大次数。

还可以使用本领域中已知的其他技术将羊膜来源的贴壁细胞与其他胎盘细胞分离，所述技术例如所需细胞的选择性生长（阳性选择）、不希望的细胞的选择性破坏（阴性选择）；基于混合群体中差异细胞可凝集性的分离，如（例如）使用大豆凝集素；冻融程序；过滤；常规和区带离心；离心淘选（逆流离心作用）；单位重力分离；逆流分配；电泳等。

5.5.羊膜来源的贴壁细胞的培养

就任何哺乳动物细胞而言，本文所述的羊膜来源的贴壁细胞的生长部分取决于选择用于生长的特定培养基。在适宜条件下，羊膜来源的贴壁细胞的数目通常在约24小时内加倍。在培养期间，在培养中本文所述的羊膜来源的贴壁细胞贴壁至基质上，例如，组织培养容器（例如，塑料组织培养皿、纤连蛋白涂覆的塑料等）的表面上，并且形成单层。通常，在羊膜消化后的2-7天内构建培养细胞。它们以每天约0.4至1.2次群体倍增增殖并且可以经历至少30至50次群体倍增。细胞在亚汇合和扩增期间显示出间充质细胞/成纤维细胞样表型，在汇合时显示出立方体/卵石样外形，并且在培养时增殖是强烈接触抑制的。在培养中扩增期间，羊膜来源的生血管细胞群体可以形成胚状体样体。

5.5.1培养基

分离的羊膜来源的贴壁细胞或这些细胞的群体可用于起始或接种细胞培养物。一般将细胞转移至未用胞外基质或生物分子涂覆或用其涂覆的无菌组织培养容器中，所述胞外基质或生物分子如层粘连蛋白、胶原（例如，天然或变性的胶原）、明胶、纤连蛋白、鸟氨酸、玻连蛋白和胞外膜蛋白（例如，MATRIGEL^TM（BD Discovery Labware, Bedford, Mass.））。

例如，可以在适合于干细胞培养的培养基中构建AMDAC。构建培养基可以（例如）包括EGM-2培养基（Lonza）、DMEM+10% FBS，或包含60% DMEM-LG（Gibco）、40% MCDB-201（Sigma）、2%胎牛血清（FCS）（Hyclone Laboratories）、1×胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）、1×亚油酸-牛血清白蛋白（LA-BSA）、10^-9M地塞米松（Sigma）、10^-4M抗坏血酸2-磷酸酯（Sigma）、10ng/ml表皮生长因子（EGF）（R&D Systems）、10ng/ml血小板源性生长因子（PDGF-BB）（R&D Systems）和100U青霉素/1000U链霉素的培养基（在本文中称为“标准培养基”）。

可以在本领域中认为是对细胞（例如，贴壁的胎盘干细胞）培养可用的任何培养基中和任何条件下培养羊膜来源的贴壁细胞。优选地，所述培养基包含血清。在多种实施方式中，用于AMDAC的培养或继代培养的培养基包括STEMPRO（Invitrogen）、MSCM-sf（ScienCell,Carlsbad,CA）、MESENCULT-ACF培养基（StemCell Technologies,Vancouver,Canada）、标准培养基、缺少EGF的标准培养基、缺少PDGF的标准培养基、DMEM+10% FBS、EGM-2（Lonza）、EGM-2MV（Lonza）、2%、10%和20% ES培养基、ES-SSR培养基或α-MEM-20% FBS。羊膜来源的贴壁细胞的培养可用的培养基包括，例如，DMEM、IMDM、DMEM（高或低葡萄糖）、伊格尔基础培养基、汉姆氏F10培养基（F10）、汉姆氏F-12培养基（F12）、伊思考夫改良达尔伯克氏培养基、间质干细胞生长培养基（MSCGM Lonza）、ADVANCESTEM^TM培养基（Hyclone）、KNOCKOUT^TMDMEM（Invitrogen）、莱博维茨L-15培养基（Liebovitz′s L-15 medium）、MCDB、DMEM/F12、RPMI 1640、高级DMEM（Gibco）、DMEM/MCDB201（Sigma）和CELL-GRO FREE等。在多种实施方式中，例如，含有ITS（胰岛素-转铁蛋白-硒）、LA+BSA（亚油酸-牛血清白蛋白）、葡萄糖、L-抗坏血酸、PDGF、EGF、IGF-1和青霉素/链霉素的DMEM-LG（达尔伯克氏改良基础培养基，低葡萄糖）/MCDB201（鸡胚成纤维细胞基础培养基）；包含约2%至约20%，例如，约10%胎牛血清（FBS；例如，确定的胎牛血清,Hyclone,Logan Utah）的DMEM-HG（高葡萄糖）；包含约2%至约20%，例如，约15%FBS的DMEM-HG；包含约2%至约20%，例如，约10%FBS、含约2至约20%，例如，约10%马血清和氢化可的松的IMDM（伊思考夫改良达尔伯克氏培养基）；包含约2%至约20%，例如，约10%FBS、EGF和肝素的M199；包含约2%至约20%，例如，约10%FBS、GlutaMAX^TM和庆大霉素的α-MEM（最小必需培养基）；包含10%FBS、GlutaMAX^TM和庆大霉素的DMEM；包括含约2%至约20%，例如，约15%（v/v）胎牛血清（例如，确定的胎牛血清，Hyclone,Logan Utah）、抗生素/抗真菌剂（例如，约100单位/毫升的青霉素、100单位/毫升的链霉素和/或0.25毫克/毫升的两性霉素B（Invitrogen,Carlsbad,Calif.））和0.001%（v/v）β-巯基乙醇（Sigma,St.Louis Mo.）的DMEM-LG；补充有2%至20%FBS、非必需氨基酸（Invitrogen）、β-巯基乙醇的KNOCKOUT^TM-DMEM基础培养基、补充有KNOCKOUT^TM血清置换物的KNOCKOUT^TM基础培养基、包含2%至20%FBS的α-MEM、补充有EGF、VEGF、bFGF、R3-IGF-1、氢化可的松、肝素、抗坏血酸、FBS、庆大霉素的EBM2^TM基础培养基等。

培养基可以单独或组合地补充一种或多种组分，其包括，例如，血清（例如，FCS或FBS，例如，约2-20%（v/v）；马血清（ES）；人血清（HS））；β-巯基乙醇（BME），优选地约0.001%（v/v）；一种或多种生长因子，例如，血小板源性生长因子（PDGF）、表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、白血病抑制因子（LIF）、血管内皮生长因子（VEGF）和促红细胞生成素（EPO）；氨基酸，包括L-缬氨酸；和一种或多种抗生素和/或抗真菌剂以控制微生物污染，如，例如，青霉素、链霉素硫酸盐、两性霉素B、庆大霉素和制霉菌素。

可以在标准的组织培养条件下（例如，在组织培养盘或多孔板中）培养羊膜来源的贴壁细胞（AMDAC）。还可以使用悬滴法培养细胞。在该方法中，细胞以约1×10⁴个细胞/mL悬浮在约5mL培养基中，并且将一滴或多滴培养基置于组织培养容器（例如，100mL培养皿）的盖内。所述滴可以是来自（例如）多孔道移液器的（例如）单滴或多滴。小心地将所述盖翻转并置于培养皿底部的上方，所述培养皿底部含有大量液体（例如，足以维持培养皿气氛中湿度的无菌PBS），并且培养细胞。还可以在标准或大体积或高通量培养系统中培养AMDAC，如T-三角瓶、CorningHYPERFLASK细胞工厂（Nunc）、1-、2-、4-、10或40-层TrayCell堆叠等。还可以在生物反应器，例如，高通量生物反应器、静态生物反应器、推流式生物反应器等中培养AMDAC。生物反应器的实例包括Celligen培养系统（New Brunswick,Edison,NJ）、WAVEBioreactor^TM（General Electric）等。

在一种实施方式中，在存在起维持细胞中未分化表型的作用的化合物的情况下培养羊膜来源的贴壁细胞。在具体的实施方式中，该化合物是取代的3,4-二氢吡啶酚[4,5-d]嘧啶。在更具体的实施方式中，该化合物是具有以下化学结构的化合物：

所述化合物可以（例如）以约1μM至约10μM之间的浓度与羊膜来源的贴壁细胞或这些细胞群体接触。

5.5.2羊膜来源的贴壁细胞的扩增和增殖

一旦分离的羊膜来源的贴壁细胞或这些细胞分离的群体（例如，与至少50%的细胞或细胞群体通常在体内与之相联系的羊膜细胞分离的羊膜来源的贴壁细胞或这些细胞的群体），则所述细胞可以体外增殖和扩增。例如，可以在组织培养容器（例如，盘、烧瓶、多孔板等）中培养贴壁细胞或羊膜来源的贴壁细胞的群体足以使所述细胞增殖至40-70%汇合（即，直至所述细胞以及它们的子代占据组织培养容器的培养表面积的40-70%）的一段时间。

可以将羊膜来源的贴壁细胞以允许细胞生长的密度接种到培养容器中。例如，可以将细胞以低密度（例如，约400至约6000个细胞/cm²）至高密度（例如，约20,000个细胞/cm²或以上）接种。在优选的实施方式中，在空气中在约0体积%至约5体积%的CO₂下培养细胞。在一些优选的实施方式中，将细胞在空气中在约0.1%至约25%的O₂下培养，优选地，在空气中在约5%至约20%O₂下培养。优选地，将细胞在约25℃至约40℃培养，优选地，在约37℃培养。

优选地，将细胞在孵育箱中培养。在培养期间，所述培养基可以是静止的或者可以是搅拌的，例如，在使用生物反应器培养期间。优选地，羊膜来源的贴壁细胞在缺氧胁迫（例如，加入谷胱甘肽、抗坏血酸、过氧化氢酶、维生素E、N-乙酰半胱氨酸等）条件下生长。

尽管羊膜来源的生血管细胞可以生长至汇合，但是细胞优选地不生长至汇合。例如，一旦获得40%-70%的汇合，则可以将细胞传代。例如，可以使用本领域中公知的技术对细胞进行酶促处理（例如，胰蛋白酶化）以将它们从组织培养表面上分离。通过吸取除去细胞并对细胞计数后，可以将约20,000-100,000个细胞，优选地约50,000个细胞，或者约400至约6000个细胞/cm²传代至含有新鲜培养基的新培养容器中。通常，新的培养基与从中除去细胞的培养基类型相同。羊膜来源的贴壁细胞可以传代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次，或更多次。AMDAC可以在培养中倍增至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49次或至少50次，或者更多次。

5.6.包含其他细胞类型的羊膜来源的贴壁细胞群体

包含本文所述的羊膜来源的贴壁细胞的分离的细胞群体可以包含第二种细胞类型，例如，非羊膜来源的贴壁细胞的胎盘细胞，或例如，非胎盘细胞的细胞。例如，分离的羊膜来源的贴壁细胞群体可以包含第二类型的细胞群体（例如，可以与第二类型的细胞群体合并），其中所述第二类型的细胞是（例如）胚胎干细胞、血细胞（例如，胎盘血、胎盘血细胞、脐带血、脐带血细胞、周围血、周围血细胞、来自胎盘血、脐带血或周围血的有核细胞等）、分离自血液的干细胞（例如，分离自胎盘血、脐带血或周围血的干细胞）、胎盘干细胞（例如，美国专利No.7,468,276和美国专利申请公开No.2007/0275362中所述的胎盘干细胞，以上专利的公开内容以它们的全部内容作为参考并入本文）、来自胎盘灌流液的有核细胞，例如，来自胎盘灌流液的总有核细胞；脐带干细胞、血液来源的有核细胞群体、骨髓来源的间充质基质细胞、骨髓源间质干细胞、骨髓源造血干细胞、粗制髓、成人（成体）干细胞、包含在组织中的干细胞群体、培养的细胞（例如，培养的干细胞）、完全分化的细胞群体（例如，软骨细胞、成纤维细胞、羊膜细胞、成骨细胞、肌细胞、心肌细胞等）、外膜细胞等。在一种具体的实施方式中，包含羊膜来源的贴壁细胞的细胞群体包含胎盘干细胞或来自脐带的干细胞。在其中第二种类型细胞是血液或血细胞的某些实施方式中，已从所述细胞群体中除去了红血球。

在一种具体的实施方式中，所述第二种类型细胞是造血干细胞。这些造血干细胞可以（例如）包含在未经处理的胎盘、脐带血或周围血中；来自胎盘血、脐带血或周围血的所有有核细胞中；来自胎盘血、脐带血或周围血的分离的CD34⁺细胞群体中；未处理的骨髓中；来自骨髓的所有有核细胞中；来自骨髓的分离的CD34⁺细胞群体中等。

在另一种实施方式中，分离的羊膜来源的贴壁细胞群体与来自脉管系统的多种成体细胞或祖细胞混合。在多种实施方式中，所述细胞是内皮细胞、内皮祖细胞、肌细胞、心肌细胞、外膜细胞、成血管细胞、成肌细胞或心肌成肌细胞。

在另一种实施方式中，第二种细胞类型是在培养中操纵以表达与胚胎干细胞有关的多能性和功能的标志物的非胚细胞类型。

在上述分离的羊膜来源的贴壁细胞群体的具体实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞和第二类型细胞中的任一种或两者与预定的细胞受体是自体同源的（autologous）或异源的（allogeneic）。

本文还提供了包含羊膜来源的贴壁细胞和除了羊膜来源的贴壁细胞之外的多种干细胞的组合物。在一种具体的实施方式中，所述组合物包含获自胎盘的干细胞，即胎盘干细胞，例如，如美国专利No.7,045,148；7,255,879；和7,311,905以及美国专利申请公开No.2007/0275362中所述的胎盘干细胞，以上每篇专利的公开内容以其全部作为参考并入本文。在具体的实施方式中，所述胎盘干细胞是CD200⁺和HLA-G⁺；CD73⁺、CD105⁺和CD200⁺；CD200⁺和OCT-4⁺；CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺；CD73⁺和CD105⁺，并且当所述群体在允许胚状体样体形成的条件下培养时，有利于在包含所述干细胞的胎盘细胞群体中形成一种或多种胚状体样体；或者OCT-4⁺，并且当所述群体在允许胚状体样体形成的条件下培养时，有利于在包含所述干细胞的胎盘细胞群体中形成一种或多种胚状体样体；或它们的任意组合。在一种更具体的实施方式中，所述CD200⁺、HLA-G⁺干细胞是CD34^–、CD38^–、CD45^–、CD73⁺和CD105⁺。在另一种更具体的实施方式中，所述CD73⁺、CD105⁺和CD200⁺干细胞是CD34^–、CD38^–、CD45^–和HLA-G⁺。在另一种更具体的实施方式中，所述CD200⁺、OCT-4⁺干细胞是CD34^–、CD38^–、CD45^–、CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺。在另一种更具体的实施方式中，所述CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺干细胞是CD34^–、CD45^–、OCT-4⁺和CD200⁺。在另一种更具体的实施方式中，所述CD73⁺和CD105⁺干细胞是OCT-4⁺、CD34^–、CD38^–和CD45^–。在另一种更具体的实施方式中，所述OCT-4⁺干细胞是CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD34^–、CD38^–和CD45^–。在另一种更具体的实施方式中，所述胎盘干细胞是母体来源的（即具有母体基因型）。在另一种更具体的实施方式中，所述胎盘干细胞是胎儿来源的（即具有胎儿基因型）。

在另一种具体的实施方式中，所述组合物包含羊膜来源的贴壁细胞和胚胎干细胞。在另一种具体的实施方式中，所述组合物包含羊膜来源的贴壁细胞和间质基质细胞或干细胞，例如，骨髓源间质基质细胞或干细胞。在另一种具体的实施方式中，所述组合物包含骨髓源造血干细胞。在另一种具体的实施方式中，所述组合物包含羊膜来源的贴壁细胞和造血祖细胞，例如，来自骨髓、胎儿血液、脐带血、胎盘血和/或外周血的造血祖细胞。在另一种具体的实施方式中，所述组合物包含羊膜来源的贴壁细胞和成体干细胞。在一种更具体的实施方式中，所述成体干细胞是神经干细胞、肝脏干细胞、胰腺干细胞、内皮干细胞、心脏干细胞或肌肉干细胞。

在其他的具体实施方式中，第二种类型细胞在所述群体中占约、至少或不超过10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%的细胞。在其他具体的实施方式中，所述组合物中的AMDAC在所述组合物中占至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%的细胞。在其他具体的实施方式中，所述羊膜来源的贴壁细胞在所述群体中占约、至少或不超过10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%或45%的细胞。

与每个群体中总有核细胞的个数相比，可以将分离的羊膜来源的贴壁细胞群体中的细胞以约100,000,000:1、50,000,000:1、20,000,000:1、10,000,000:1、5,000,000:1、2,000,000:1、1,000,000:1、500,000:1、200,000:1、100,000:1、50,000:1、20,000:1、10,000:1、5000:1、2000:1、1000:1、500:1、200:1、100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1；1:2；1:5；1:10；1:100；1:200；1:500；1:1000；1:2000；1:5000；1:10,000；1:20,000；1:50,000；1:100,000；1:500,000；1:1,000,000；1:2,000,000；1:5,000,000；1:10,000,000；1:20,000,000；1:50,000,000或约1:100,000,000的比率与多个另一种类型细胞（例如，与干细胞群体）混合。也可以将分离的羊膜来源的贴壁细胞群体中的细胞与多种细胞类型的多个细胞混合。

5.7.羊膜来源的贴壁细胞的保存

例如，利用本文所述的方法，在（例如）收集期间或者在本文所述的组合物产生之前，可以保存羊膜来源的贴壁细胞，即可以将它们置于使其长期保存的条件或抑制通过（例如）细胞凋亡或坏死的细胞死亡的条件下。

可以使用（例如）包含细胞凋亡抑制剂、坏死抑制剂和/或携氧全氟化碳的组合物来保存羊膜来源的贴壁细胞，如美国专利申请公开No.2007/0190042中所述，该专利的公开内容以其全部内容作为参考并入本文。在一种实施方式中，保存这些细胞或这些细胞群体的方法包括将所述细胞或细胞群体与包含细胞凋亡抑制剂和携氧全氟化碳的细胞收集组合物接触，其中所述细胞凋亡抑制剂以与未接触细胞凋亡抑制剂的细胞群体相比足以降低或防止细胞群体中细胞凋亡的量和时间存在。在一种具体的实施方式中，所述细胞凋亡抑制剂是半胱氨酸天冬氨酸酶抑制剂。在另一种具体的实施方式中，所述细胞凋亡抑制剂是JNK抑制剂。在一种更具体的实施方式中，所述JNK抑制剂不调节羊膜来源的贴壁细胞的分化或增殖。在另一种实施方式中，所述细胞收集组合物包含处于分离的相的所述细胞凋亡抑制剂和所述携氧全氟化碳。在另一种实施方式中，所述细胞收集组合物包含处于乳液中的所述细胞凋亡抑制剂和所述携氧全氟化碳。在另一种实施方式中，所述细胞收集组合物另外还包含乳化剂，例如，卵磷脂。在另一种实施方式中，所述细胞凋亡抑制剂和所述全氟化碳在与细胞接触时处于约0℃至约25℃之间。在另一种更具体的实施方式中，所述细胞凋亡抑制剂和所述全氟化碳在与细胞接触时处于约2℃至10℃之间，或者约2℃至约5℃之间。在另一种更具体的实施方式中，在所述细胞群体的运输期间进行所述接触。在另一种更具体的实施方式中，在所述细胞群体的冻融期间进行所述接触。

可以通过（例如）以下方法保存羊膜来源的贴壁细胞群体，所述方法包括将所述细胞的群体与细胞凋亡抑制剂和器官保存化合物接触，其中所述细胞凋亡抑制剂以与未接触细胞凋亡抑制剂的细胞群体相比足以降低或防止细胞群体中细胞凋亡的量和时间存在。在一种具体的实施方式中，所述器官保存化合物是UW溶液（在美国专利No.4,798,824中描述；也称为ViaSpan；另外参见Southard等人,Transplantation 49(2):251-257(1990)）或者在Stern等人，美国专利No.5,552,267中描述的溶液。在另一种实施方式中，所述器官保存化合物是羟乙基淀粉、乳糖酸、棉子糖或它们的组合。在另一种实施方式中，所述细胞收集组合物另外还包含处于两相或作为乳液的携氧全氟化碳。

在所述方法的另一种实施方式中，在灌流期间将羊膜来源的贴壁细胞与包含细胞凋亡抑制剂和携氧全氟化碳、器官保存化合物或它们的组合的细胞收集组合物接触。在另一种实施方式中，在组织破环（例如，羊膜组织的酶促消化）过程中，将羊膜来源的贴壁细胞与该细胞收集组合物接触。在另一种实施方式中，在通过组织破环（例如，羊膜组织的酶促消化）收集后，将羊膜来源的贴壁细胞与所述细胞收集化合物接触。

通常，在羊膜来源的贴壁细胞的收集、富集和分离期间，优选地最大程度减少或消除由于缺氧和机械应力所造成的细胞胁迫。因此，在所述方法的另一种实施方式中，在收集、富集或分离期间将羊膜来源的贴壁细胞或包含羊膜来源的贴壁细胞的细胞群体在所述保存期间在缺氧条件下暴露小于6小时，其中缺氧条件是（例如）小于正常大气氧浓度；小于正常血氧浓度等的氧浓度。在一种更具体的实施方式中，在所述保存期间将所述细胞或所述细胞的群体在所述缺氧条件下暴露小于两小时。在另一种更具体的实施方式中，在收集、富集或分离期间将所述细胞或所述细胞的群体在所述缺氧条件下暴露小于1小时，或小于30分钟，或不暴露于缺氧条件。在另一种具体的实施方式中，在收集、富集或分离期间未将所述细胞群体暴露于切应力。

可以将羊膜来源的贴壁细胞一般地或通过本文所公开的具体方法（例如，在小容器（例如，安瓿瓶）中的冷冻保存培养基中）冷冻保存。适合的冷冻保存培养基包括，但不限于，包括（例如）生长培养基或细胞冷冻培养基，例如，可商购的细胞冷冻培养基，例如通过SigmaAldrich目录号C2695、C2639（细胞冷冻培养基-无血清1×，不含DMSO）或C6039（细胞冷冻培养基-Glycoerol 1×，含有最小必需培养基、甘油、小牛血清和牛血清）鉴别的细胞冷冻培养基、Lonza PROFREEZE 2×培养基、甲基纤维素、葡聚糖、人血清白蛋白、胎牛血清（fetal bovine serum）、胎牛血清（fetal calfserum）或Plasmalyte在内的培养基。冷冻保存培养基优选地以（例如）约1%至约20%，例如，约5%至10%（v/v）的浓度包含DMSO（二甲亚砜）或甘油，并且可选地包含胎牛血清或者人血清。冷冻保存培养基可以包含其他试剂，例如，甲基纤维素和/或甘油。优选地，在冷冻保存期间将分离的羊膜来源的贴壁细胞以约1℃/min冷却。优选的冷冻保存温度为约-80℃至约-180℃，优选地约-125℃至约-140℃。在融化使用前，可以将冷冻保存的细胞转移到液氮的气相中。在一些实施方式中，例如，一旦安瓿瓶达到约-80℃，则将它们转移到液氮储存区。还可以使用速率控制的冰箱进行冷冻保存。优选地，在约25℃至约40℃的温度下，优选地在约37℃的温度下融化冷冻保存的细胞。

5.8.羊膜来源的贴壁细胞库的产生

可以以多种不同的方式培养羊膜来源的贴壁细胞以产生一组不同批次的这些细胞，例如，一组可单独施用剂量的这些细胞。可以将获自多个胎盘的血管原羊膜细胞批次的组置于细胞库中以用于（例如）长期储存。通常，羊膜来源的贴壁细胞获自细胞的初始培养以形成种子培养，所述种子培养从大约相同倍增次数在控制条件下扩增以形成细胞群体。优选地，批次来源于单个胎盘组织，但是也可以来源于多个胎盘组织。

在一种非限制性实施方式中，如下所示获得了羊膜来源的贴壁细胞的批次或剂量。首先，使羊膜组织破裂，例如，消化，如上文5.4.3节中使用顺序的胰蛋白酶和胶原酶消化中所述。将来自胶原酶-水解液组织的细胞培养（例如）约1-3周，优选地约2周。除去非贴壁细胞后，通过（例如）胰酶消化收集所形成的高密度集落。收集这些细胞并在适量的培养基中重悬浮，并将其定义为0代细胞。

然后，可以将0代细胞用于接种扩增培养。扩增培养可以是单个细胞培养设备的任何排布，例如，NUNCTM的细胞工厂（Cell Factory）。可以将0代培养中的细胞再分至任何程度从而用（例如）1×10³、2×10³、3×10³、4×10³、5×10³、6×10³、7×10³、8×10³、9×10³、1×10⁴、1×10⁴、2×10⁴、3×10⁴、4×10⁴、5×10⁴、6×10⁴、7×10⁴、8×10⁴、9×10⁴或10×10⁴个贴壁细胞接种扩增培养。优选地，将约1×10³至约3×10⁴个0代细胞用于接种每次扩增培养。扩增培养的数目可以取决于0代细胞的数目，并且根据从中获得贴壁细胞的特定胎盘，数目可以更大或更小。

然后，扩增培养可以生长直至培养中的细胞密度达到某一值，例如，约1×10⁵个细胞/cm²。此时可以收集细胞并将其冷冻保存，或者可以传代到如上所述的新的扩增培养中。使用前，可以将细胞传代（例如）2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次。优选地，在扩增培养期间，保持群体倍增累计次数的记录。可以将来自0代培养的细胞扩增2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40次倍增，或多至60次倍增。然而，优选地，在将细胞群体分成单个剂量前，群体倍增次数在约15至约30次倍增之间。可以在整个扩增过程中连续培养细胞，或者可以在扩增期间的一个或多个点冷冻细胞。

可以将用于单个剂量的细胞冷冻，例如，冷冻保存以备随后使用。单个剂量可以包含（例如）约100万至约5000万个细胞/mL，并且总计可以包含约10⁶至约10¹⁰个细胞。

因此，在一种实施方式中，可以通过以下方法制备包含羊膜来源的贴壁细胞的细胞库，所述方法包括：从人分娩后胎盘扩增原代培养羊膜来源的贴壁细胞以用于第一多次群体倍增；冷冻保存所述细胞以形成主细胞库；可选地从主细胞库扩增多个细胞以用于第二多次群体倍增；冷冻保存所述扩增的细胞以形成工作细胞库；可选地从工作细胞库扩增多个扩增的羊膜来源的贴壁细胞以用于第三多次群体倍增；以及在单个剂量中冷冻保存所得的扩增细胞，其中所述单个剂量共同构成了细胞库。所述库可以包含仅羊膜来源的贴壁细胞的剂量或批次，或者可以包含羊膜来源的贴壁细胞的批次与另一种细胞（例如，另一种干细胞或祖细胞）的批次或剂量的组合。优选地，每个单个剂量仅包含羊膜来源的贴壁细胞。在另一种具体的实施方式中，所述原代培养中的所有所述细胞来自相同的胎盘。在另一种具体的实施方式中，所述单个剂量包含约10⁴至约10⁵个细胞。在另一种具体的实施方式中，所述单个剂量包含约10⁵至约10⁶个细胞。在另一种具体的实施方式中，所述单个剂量包含约10⁶至约10⁷个细胞。在另一种具体的实施方式中，所述单个剂量包含约10⁷至约10⁸个细胞。在另一种具体的实施方式中，所述单个剂量包含约10⁸至约10⁹个细胞。在另一种具体的实施方式中，所述单个剂量包含约10⁹至约10¹⁰个细胞。

在某些实施方式中，可以将来自工作细胞库的羊膜来源的贴壁细胞融化并培养以用于多次群体倍增。当产生了所需数目的细胞，或者已发生了所需次数的群体倍增时，可以通过（例如）离心收集贴壁细胞，并且重悬浮在包含（例如）葡聚糖（例如，5%葡聚糖）的溶液中。在某些实施方式中，所述葡聚糖是葡聚糖-40。在某些实施方式中，第二次收集细胞并重悬浮在包含葡聚糖和冷冻保护剂的溶液中，例如，包含10%HSA和2%-20%（例如，5%）DMSO的5%葡聚糖（例如，葡聚糖-40）溶液，并冷冻保存。可以在（例如）使用前立即将冷冻保存的羊膜来源的贴壁细胞融化。

在优选的实施方式中，对从中获得胎盘的供体（例如，母体）检测至少一种病原体。在某些实施方式中，如果所述母体对所测试的病原体测试为阳性，则弃去来自所述胎盘的整个批次。可以在羊膜来源的贴壁细胞批次产生期间的任何时间进行这些测试，包括构建0代细胞之前或之后或者在扩增培养期间。测试其存在性的病原体可以非限制性地包括甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、人类免疫缺陷性病毒（I型和II型）、巨细胞病毒、疱疹病毒等。

5.9.包含羊膜来源的贴壁细胞的组合物

本文所述的治疗已暴露于辐射的个体的方法和/或造血重建的方法涵盖了包含使用AMDAC的组合物（例如，液体、固体（例如，基质）或两者的组合（例如，水凝胶））。在某些实施方式中，AMDAC包含在药物组合物中或者是药物组合物的组分。通常，对于个体全身暴露于辐射的情况，适合于全身施用的组合物是优选的。然而，包含AMDAC的药物组合物适合于局部施用，例如，肌内、腹膜内、皮内、皮下施用等。

可以将所述细胞制备成易于施用至个体的形式，例如，包含在适合于医疗应用的容器内适合于例如静脉内施用的溶液中的AMDAC。这种容器可以是（例如）注射器、无菌塑料袋、烧瓶、罐或从中可以容易地分配AMDAC的其他容器。例如，所述容器可以是输血袋或者是适合于液体静脉内施用至受体的其他医学上可用的塑料袋。在某些实施方式中，所述容器是允许细胞冷冻保存的容器。本文所提供的组合物（例如，药物组合物）中的细胞可以包含来源于单个供体或多个供体的羊膜来源的贴壁细胞。细胞可以是与预定受体完全HLA-匹配的，或者是部分或完全HLA-不匹配的，例如，可以是完全自体同源的，部分异源的或完全异源的。

因此，在一种实施方式中，将本文提供的组合物中的AMDAC以容器中包含AMDAC的组合物的形式施用于对其有需要的个体。在另一种具体的实施方式中，所述容器是袋、烧瓶或罐。在更具体的实施方式中，所述袋是无菌塑料袋。在一种更具体的实施方式中，所述袋适合于，允许或有利于（例如）通过静脉内输注、推注等的所述AMDAC的静脉内施用。所述袋可以包含彼此连接以允许在施用之前或期间细胞和一种或多种其他溶液（例如，药物）混合的多个腔或隔室。在另一种具体的实施方式中，在冷冻保存之前，包含AMDAC的溶液包含有利于细胞冷冻保存的一种或多种化合物。在另一种具体的实施方式中，所述AMDAC包含在生理学可用的水溶液内。在一种更具体的实施方式中，所述生理学可用的水溶液是0.9%NaCl溶液。在另一种具体的实施方式中，所述AMDAC是或者包含与所述细胞的受体HLA-匹配的细胞。在另一种具体的实施方式中，所述AMDAC是或者包含与所述细胞的受体至少部分HLA-不匹配的细胞。在另一种具体的实施方式中，所述AMDAC来源于多个供体。在各种具体的实施方式中，所述容器包含约，至少或至多1×10⁶个所述细胞、5×10⁶个所述细胞、1×10⁷个所述干细胞、5×10⁷个所述细胞、1×10⁸个所述细胞、5×10⁸个所述细胞、1×10⁹个所述细胞、5×10⁹个所述细胞或1×10¹⁰个所述细胞。在任何上述冷冻保存群体的其他具体的实施方式中，所述细胞已传代大约，至少或不超过5次、不超过10次、不超过15次或不超过20次。在任何上述冷冻保存的细胞的另一种具体的实施方式中，已经在所述容器内扩增了所述细胞。在具体的实施方式中，单一单位剂量的AMDAC可以包含，在多种实施方式中，大约，至少或不超过1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹或更多个AMDAC。

在某些实施方式中，本文所提供的药物组合物包含AMDAC群体，所述群体包含50%或以上的活细胞（即所述群体中至少50%的细胞是功能性的或活的）。优选地，在所述群体中至少60%的细胞是有活力的。更优选地，在所述药物组合物中的所述群体中至少70%、80%、90%、95%或99%的细胞是有活力的。

5.9.1包含羊膜来源的贴壁细胞的基质

本文还提供了包含基质、水凝胶、支架等的组合物。可以代替液体悬液中的这些细胞或者除液体悬液中的这些细胞以外使用这些组合物。

所述基质可以是（例如）永久性或可降解的脱细胞组织，例如，脱细胞羊膜或合成基质。所述基质可以是立体支架。在一种更具体的实施方式中，所述基质包含胶原、明胶、层粘连蛋白、纤连蛋白、果胶、鸟氨酸或玻连蛋白。在另一种更具体的实施方式中，所述基质是羊膜或羊膜来源的生物材料。在另一种更具体的实施方式中，所述基质包含胞外膜蛋白。在另一种更具体的实施方式中，所述基质包含合成化合物。在另一种更具体的实施方式中，所述基质包含生物活性化合物。在另一种更具体的实施方式中，所述生物活性化合物是生长因子、细胞因子、抗体或小于5,000道尔顿的有机分子。

可以将本文所述的羊膜来源的贴壁细胞接种到天然基质上，例如，胎盘生物材料，如羊膜材料。这种羊膜材料可以是（例如）直接从哺乳动物胎盘上切下的羊膜；固定或热处理的羊膜、基本干燥（即，<20%的H₂O）的羊膜、绒毛膜、基本干燥的绒毛膜、基本干燥的羊膜和绒毛膜等。在Hariri，美国专利申请公开No.2004/0048796中描述了在其上可以接种本文所提供的羊膜来源的贴壁细胞的优选的胎盘生物材料，该专利的公开内容以其全部内容作为参考并入本文。

在另一种具体的实施方式中，所述基质是包含胞外基质的组合物。在一种更具体的实施方式中，所述组合物是MATRIGEL^TM（BD Biosciences）。

可以将本文所述的分离的羊膜来源的贴壁细胞悬浮在适合于（例如）注射的水凝胶溶液中。水凝胶是（例如）通过共价键、离子键或氢键交联以产生捕获水分子以形成凝胶的立体开放网格结构的（天然或合成）有机聚合物。适合于这些组合物的水凝胶包括自组装肽，如RAD16。在一种实施方式中，可以使包含细胞的水凝胶溶液在（例如）模具中硬化以形成具有分散于其中的细胞的移植用基质。还可以在该基质中培养羊膜来源的贴壁细胞从而使所述细胞在（例如）植入前通过有丝分裂扩增。水凝胶形成材料包括多糖（如海藻酸盐及其盐）、肽、聚膦嗪和聚丙烯酸酯，它们通过阴离子交联或者是嵌段聚合物（如聚环氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物），其分别是通过温度或pH交联的。在一些实施方式中，所述水凝胶或基质是可生物降解的。

在某些实施方式中，本文所提供的包含细胞的组合物包含原位可聚合凝胶（参见，例如，美国专利申请公开2002/0022676；Anseth等人,J.ControlRelease,78(1-3):199-209(2002)；Wang等人,Biomaterials,24(22):3969-80(2003)）。在一些实施方式中，具有带电侧基的聚合物或其一价离子盐在水溶液（如水、缓冲盐溶液或酒精水溶液）中至少是部分可溶的。具有可以与阳离子反应的酸性侧基的聚合物的实例是聚(磷腈)、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、聚(醋酸乙烯酯)和磺化聚合物，如磺化聚苯乙烯。还可以使用具有通过丙烯酸或甲基丙烯酸与乙烯基醚单体或聚合物反应形成的酸性侧基的共聚物。酸性基团的实例是羧基、磺酸基、卤化（优选地，氟化）醇基、酚OH基和酸性OH基。

在一种具体的实施方式中，所述基质是毡制物（felt），其可以由生物可吸收材料（例如，PGA、PLA、PCL共聚物或共混物）或者透明质酸制成的复丝构成。使用由卷曲、切割、梳理和针刺组成的标准纺织加工技术将纱制成毡制物。在另一种优选的实施方式中，将本发明的细胞接种到可以是复合结构的泡沫支架上。另外，可以将立体框架模塑成有用的形状，如体内待修复、替换或扩大的具体结构。可以使用的支架的其他实例包括无纺垫、多孔泡沫或自组装肽。可以使用由乙醇酸和乳酸（例如，PGA/PLA）的合成可吸收共聚物（VICRYL,Ethicon,Inc.,Somerville,N.J.）组成的纤维来形成无纺垫。还可以将通过如冷冻干燥或冻干法（参见，例如，美国专利No.6,355,699）的工艺形成的由（例如）聚(ε-己内酯)/聚(乙醇酸)（PCL/PGA）共聚物组成的泡沫用作支架。

可以将本文所述的羊膜来源的贴壁细胞接种到立体框架或支架上并进行体内移植。该框架可以与任何一种或多种（例如）刺激组织形成（例如，骨形成或者脉管系统形成）生长因子、细胞、药物或其他组分结合移植。

在另一种实施方式中，可以将本文所提供的羊膜来源的贴壁细胞接种到可以是复合结构的泡沫支架上。可以将这些泡沫支架塑模成有用的形状，如在体内待修复、替换或扩大的具体结构的一部分。在一些实施方式中，在细胞接种之前用（例如）0.1M乙酸处理所述框架，然后在聚赖氨酸、PBS和/或胶原中孵育以提高细胞附着。可以（如）通过血浆涂覆基质或一种或多种蛋白（例如，胶原、弹性纤维、网状纤维）、糖蛋白、糖胺聚糖（例如，硫酸肝素、4-硫酸软骨素、6-硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角蛋白等）、细胞基质和/或其他材料（例如，但不限于，明胶、海藻酸盐、琼脂、琼脂糖和植物树胶等）的加入来修饰基质的外表面以改善细胞的附着或生长和组织的分化。

在一些实施方式中，所述基质包含使其为非血栓形成性的材料或用该材料处理。这些处理和材料还可以促进并保持内皮的生长、迁移和胞外基质的沉积。这些材料和处理的实例包括，但不限于，天然材料，如基质膜蛋白（如层粘连蛋白和IV型胶原蛋白）；合成材料，如EPTFE和嵌段聚氨酯脲硅酮（polyurethaneurea silicones），如PURSPAN^TM（The PolymerTechnology Group,Inc.,Berkeley,Calif.）。所述基质还可以包含抗血栓形成试剂，如肝素；还可以在用本文所提供的贴壁细胞接种之前处理所述支架以改变表面电荷（例如，用血浆涂覆）。

可以在本文所提供的羊膜来源的贴壁细胞接种之前处理框架以提高细胞贴壁。例如，在用本发明的细胞接种前，可以用0.1摩尔乙酸处理尼龙基质并将其在聚赖氨酸、PBS和/或胶原中孵育以涂覆尼龙。可以使用硫酸类似地处理聚苯乙烯。

另外，可以修饰立体框架的外表面以改善细胞的贴壁与生长以及组织的分化，如通过血浆涂覆框架或添加一种或多种蛋白（例如，胶原、弹力纤维、网状纤维）、糖蛋白、糖胺聚糖（例如，硫酸肝素、4-硫酸软骨素、6-硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角蛋白等）、细胞基质和/或其他材料（如，但不限于，明胶、海藻酸盐、琼脂、琼脂糖和植物树胶等）。

在一些实施方式中，所述基质包含使基质为非血栓形成性的材料或用该材料处理，例如，天然材料，如基质膜蛋白，如层粘连蛋白和IV型胶原，和合成材料，如ePTFE或片段化的聚氨酯脲硅树脂（segmentedpolyurethaneurea silicones），如PURSPAN（The Polymer Technology Group,Inc.,Berkeley,Calif.）。可以用（例如）肝素和改变材料表面电荷的处理（如血浆涂覆）来进一步处理这些材料以使支架称为非血栓形成性的。

还可以以基质-细胞复合物的形式提供包含羊膜来源的贴壁细胞的治疗性细胞组合物。基质可以包括生物相容性支架、网络、自组装结构等，无论是否是生物可吸收的，无论是液体、凝胶或固体。这些基质在治疗性细胞治疗、手术修复、组织工程和伤口愈合领域中是已知的。在某些实施方式中，所述细胞贴壁至基质。在其他实施方式中，所述细胞被捕获或包含在基质空间中。其中细胞与基质密切结合地生长并且当治疗性使用时，刺激和支持受体细胞向内生长或者刺激或支持血管生成的那些基质-细胞复合体是最优选的。可以通过本领域中公知的任何方式将基质-细胞组合物引入到个体体内，包括但不限于植入、注射、手术附着、与其他组织移植、注射等。在一些实施方式中，体内或原位形成基质。例如，根据本发明可以使用原位可聚合凝胶。这些凝胶的实例是本领域已知的。

在一些实施方式中，将本文所提供的细胞接种到这些立体基质（如支架）上并植入体内，在体内接种的细胞可以在框架上或中增殖或者与或不与其他细胞协同帮助在体内构建置换组织。羊膜来源的贴壁细胞或其共培养物在立体框架上的生长优选地导致形成了立体组织或其基础，所述组织或其基础在体内可以用于（例如）受损或有病组织的修复。例如，所述立体支架可用于形成管状结构，例如，用于在血管的修复中使用；或者用于循环系统或冠状动脉结构方面。根据本发明的一个方面，将羊膜来源的贴壁细胞或其共培养物接种到立体框架或基质上，如支架、泡沫或水凝胶。可以使所述框架形成多种形状，如一般的扁平、一般的圆柱形或管形，或者根据所考虑的矫正结构可能所需或所期望的，可以是完全自由的形式。在一些实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞在所述立体结构中生长，而在其他实施方式中，所述细胞仅存活或甚至死亡，但是刺激或促进受体中新组织的向内生长或血管化。

本发明所述的细胞可以在培养中自由生长，从培养中移除并接种到立体框架上。用（例如）约10⁶至5×10⁷个细胞/毫升的细胞浓度接种所述立体框架优选地导致在相对较短的时间段内构建所述立体支持。此外，在一些应用中，根据所期望的结果，优选地可以使用较多或较少数目的细胞。

在具体的实施方式中，可以将所述基质切成条（例如，形状为长方形），所述条的宽度近似等于最终将其插入到的管状器官的内周长。可以通过在液体培养基中漂浮或悬浮将羊膜来源的贴壁细胞接种到支架上并孵育。在适当的汇合阶段，通过将长边缘连接在一起可以将支架卷起到管中。然后，通过使用具有适合直径的适合材料的纤维将两边缘缝合在一起，可以使接缝闭合。为了防止细胞阻塞腔，可以将管状框架开口端中的一个固定到喷嘴上。可以迫使来自连接至孵育室的来源室的液体培养基通过喷嘴以产生通过管状框架内部的水流。可以将另一个开口端固定至引入到收集室的排出孔，培养基可以从收集室再循环通过来源室。当孵育完成时，可以将管从喷嘴和排出孔处拆下。参见，例如，国际专利申请No.WO94/25584。

一般说来，使用任何以下方法，根据本发明可以将两个立体框架合并至管中。可以将两个或更多个扁平框架放置在另一个上方并缝合在一起。然后，可以将所得的双层片材卷起，并且如上所述将它们连接在一起并固定。在某些实施方式中，可以用羊膜来源的贴壁细胞接种用作内层的一个管状支架并孵育。第二支架可以作为平条带生长，其宽度略大于所述管状框架的外周长。在达到适合的生长后，将扁平框架卷绕在管状支架的外侧，然后将扁平框架两个边缘的接缝闭合并将扁平框架固定至内管。在另一种实施方式中，可以使直径略微不同的两个或更多个管形网状物单独生长。可以将直径较小的框架插入到直径较大的框架内部并固定。对于这些方法中的每一个，通过重复应用所述方法可以将更多层添加到所述双层管上。可以在羊膜来源的贴壁细胞的任何生长阶段合并支架，并且当期望时，可以继续孵育合并的支架。

结合上述内容，可以将本文提供的细胞和治疗性组合物与可植入装置结合使用。例如，羊膜来源的贴壁细胞可以与（例如）支架、人工瓣膜、心室辅助装置、电解可脱性弹簧圈（Guglielmi detachable coil）等共同施用。由于所述装置可以构成提供给需要该疗法的个体的主要疗法，因此所述细胞等可以用作支持性或第二疗法以帮助、刺激或促进植入装置区域中的适当愈合。本发明所述的细胞和治疗性组合物还可以用于预处理某些可植入装置，从而当它们在体内使用时，最大程度减少问题。包括涂覆的装置在内的这些预处理的装置可以更好地被接受它们的患者耐受，同时降低了局部或全身感染的风险，或者例如，减少了血管的再狭窄或进一步堵塞。

5.9.2羊膜来源的贴壁细胞条件培养基

本文还提供了羊膜来源的贴壁细胞调节的培养基，即包含所述贴壁细胞分泌（secrete）或排泄（excrete）的一种或多种生物分子的培养基。在多种实施方式中，所述条件培养基包含其中细胞已生长了至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或更多天，或者至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次群体倍增或者更多次群体倍增的培养基。在其他实施方式中，所述条件培养基包含其中羊膜来源的贴壁细胞已生长至至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%汇合，或多达100%汇合的培养基。这些条件培养基可用于支持细胞（例如，干细胞，例如，胎盘干细胞、胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、成体干细胞等）群体的培养。在另一种实施方式中，所述条件培养基包含其中已共同培养了羊膜来源的贴壁细胞和非羊膜来源的贴壁细胞的细胞的培养基。

所述条件培养基可以包含本文所提供的贴壁细胞。因此，本文提供了包含羊膜来源的贴壁细胞的细胞培养物。在一种具体的实施方式中，所述条件培养基包含多个羊膜来源的贴壁细胞，例如，羊膜来源的贴壁细胞群体。

5.10.修饰的羊膜来源的贴壁细胞

5.10.1基因修饰的羊膜来源的贴壁细胞

在另一个方面，可以基因修饰本文所述的羊膜来源的贴壁细胞，例如，以产生所关心的核酸或多肽，或者以产生能够产生所关心的核酸或多肽的分化细胞，例如，骨原细胞、肌原细胞（myocytic cell）、周细胞（pericyticcell）或生血管细胞。例如，可以修饰羊膜来源的贴壁细胞以产生血管生成因子，如促血管生成分子、可溶性因子和受体或促迁移分子，如趋化因子，例如，基质细胞源因子1（SDF-1）或趋化因子受体。可以（例如）利用病毒基载体完成基因修饰，所述病毒基载体包括（但不限于）非整合型复制载体，例如，乳头状瘤病毒载体、SV40载体、腺病毒载体；整合型病毒载体，例如，逆转录病毒载体或腺相关病毒载体；或者复制缺陷型病毒载体。将DNA引入细胞的其他方法包括脂质体、电穿孔、粒子枪、直接DNA注射等的使用。

例如，可以使用通过一种或多种适当的表达控制元件或与它们操纵性结合控制的DNA来转化或转染本文所提供的贴壁细胞，所述表达控制元件例如启动子或增强子序列、转录终止子、多腺苷酸化位点、内部核糖体进入位点。优选地，这种DNA引入了可选择标志物。引入外源DNA后，基因工程贴壁细胞可以（例如）在富集培养基中生长，然后转移至选择培养基。在一种实施方式中，用于工程设计羊膜来源的贴壁细胞的DNA包含编码所关心的多肽的核苷酸序列，所述多肽例如细胞因子、生长因子、分化剂或治疗性多肽。

用于工程设计贴壁细胞的DNA可以包含本领域中已知的任何启动子以驱使哺乳动物细胞（例如人细胞）中核苷酸序列的表达。例如，启动子包括，但不限于，CMV启动子/增强子、SV40启动子、乳头状瘤病毒启动子、埃-巴二氏病毒启动子、弹性蛋白基因启动子等。在一种具体的实施方式中，所述启动子是可调控的，从而只有当需要时才表达所述核苷酸序列。启动子可以是诱导型的（例如，与金属硫蛋白和热激蛋白有关的那些）或组成型的。

在另一种具体的实施方式中，启动子是组织特异性的或表现出组织特异性。这些启动子的实例包括但不限于肌球蛋白轻链-2基因控制区（Shani,1985,Nature 314:283）（骨骼肌）。

本文所公开的羊膜来源的贴壁细胞可以工程设计，或者否则选择本文所公开的羊膜来源的贴壁细胞以“敲除(knock out)”或“抑制(knock down)”这些细胞中一种或多种基因的表达。可以通过（例如）表达抑制来减弱源自细胞的基因的表达，所述表达抑制是通过（例如）同源重组所导致的基因完全失活所实现的。在一种实施方式中，例如，通过阳性可选择标志物（例如neo）中断了编码蛋白质重要区域的外显子，或5’至该区域的外显子，从而防止从靶标基因产生正常mRNA并因此导致该基因失活。还可以通过产生基因的部分缺失或通过使整个基因缺失来使基因失活。通过使用具有与靶标基因同源并且在基因组中彼此远离的两个区域的构件，可以使插入所述两个区域之间的序列缺失（Mombaerts等人,1991,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.88:3084）。还可以使用抑制靶标基因表达的反义、吗啉（morpholinos)、DNA酶、小干扰RNA、短发夹RNA和核糖酶分子来降低贴壁细胞中靶标基因的活性水平。例如，抑制主要组织适合性基因群（HLA）表达的反义RNA分子已显示是相对于免疫应答最通用的。可以使用三螺旋分子来降低靶标基因活性水平。参见，例如，L.G.Davis等人主编，1994,BASICMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,第二版,Appleton&Lange,Norwalk,Conn.，该文献作为参考并入本文。

在一种具体的实施方式中，可以用包含编码所关心多肽的核苷酸序列的核酸分子来基因修饰本文所公开的羊膜来源的贴壁细胞，其中所关心多肽的表达是通过外源因子可控的，例如多肽、有机小分子等。所述所关心的多肽可以是治疗性多肽。在一种更具体的实施方式中，所述所关心的多肽是IL-12或白介素-1受体拮抗剂（IL-1Ra）。在另一种更具体的实施方式中，所关心的多肽是白介素-1受体拮抗剂和二氢叶酸还原酶（DHFR）的融合体，并且外源因子是抗叶酸物质，例如，甲氨蝶呤。一旦与甲氨蝶呤接触，该构件在表达IL-1Ra或IL-1Ra和DHFR的融合体的羊膜来源的贴壁细胞的工程设计中是有用的。该构件可以在（例如）类风湿性关节炎的治疗中使用。在该实施方式中，一旦暴露于抗叶酸物质（如甲氨蝶呤），则IL-1Ra和DHFR的融合体是翻译上调的。因此，在另一种具体的实施方式中，用于基因工程设计羊膜来源的贴壁细胞的核酸可以包含编码第一多肽和第二多肽的核苷酸序列，其中所述第一和第二多肽在存在外源因子的情况下表达为翻译上调的融合蛋白。所述多肽可以短暂或长期表达（例如，在数周或数月内）。这种核酸分子另外可以包含编码允许对工程设计的细胞进行阳性选择或允许对工程设计的细胞显像的多肽的核苷酸序列。在另一种更具体的实施方式中，所述核苷酸序列编码（例如）在适当显像条件下发荧光的多肽，例如，荧光素酶（Luc）。在一种更具体的实施方式中，该核酸分子可以包含IL-1Ra-DHFR-IRES-Luc，其中IL-1Ra为白介素-1受体拮抗剂，IRES为核糖体内部进入位点，以及DHFR为二氢叶酸还原酶。

5.10.2永生化羊膜来源的贴壁细胞系

可以通过用含有生长促进基因（即编码在适合的条件下促进转染的细胞生长的蛋白的基因）的任何适合的载体转染使哺乳动物羊膜来源的贴壁细胞有条件地永生化，从而生长促进蛋白的产生和/或活性是通过外部因素可调控的。在优选的实施方式中，所述生长促进基因是致癌基因，如（但不限于）V-myc、N-myc、c-myc、p53、SV40大T抗原、多瘤大T抗原、E1a腺病毒或人乳头状瘤病毒的E7蛋白。在另一种实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞可以使用cre-lox重组永生化，如Narushima,M.等人（NatureBiotechnology,2005,23(10:1274-1282)）中对于人胰腺β-细胞系所举例说明的。

可以通过将生长促进基因置于外部可调控启动子（例如，可以通过（例如）改变转染细胞的温度或与所述细胞接触的培养基的组成来控制其活性的启动子）的控制之下来实现生长促进蛋白的外部调控。在一种实施方式中，可以使用四环素（tet）控制的基因表达系统（参见Gossen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:5547-5551,1992；Hoshimaru等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:1518-1523,1996）。在不存在tet的情况下，该载体内的tet控制的反式激活因子（tTA）强烈激活从ph_CMV*-1（融合至tet操纵子序列的来自人巨细胞病毒的最小启动子）的转录。tTA是大肠杆菌（Escherichia coli）的转座子-10源tet耐受操纵子的抑制因子（tetR）和单纯疱疹病毒VP16的酸性域的融合蛋白。低的无毒性的浓度的tet（例如，0.01-1.0μg/mL）通过tTA几乎完全消除了反式激活。

在一种实施方式中，所述载体还含有编码可选择标志物（例如，赋予耐药性的蛋白）的基因。细菌新霉素抗性基因（neo^R）是可以在本发明方法中使用的一种这样的标志物。携带neo^R的细胞可以通过本领域普通技术人员已知的方式进行选择，如将（例如）100-200μg/mL的G418添加至生长培养基。

可以通过本领域技术人员已知的任何多种方式来实现转染，包括但不限于逆转录病毒感染。一般地，可以通过与从载体的生产细胞系所收集的条件培养基和含有N2添加剂的DMEM/F12的混合物孵育来转染细胞培养物。例如，可以在（例如）体外五天后通过在一体积条件培养基和两体积含有N2添加剂的DMEM/F12中孵育约20小时来感染如上所述制备的胎盘细胞培养。然后，可以如上所述选择具有可选择标志物的转染细胞。

转染后，将培养传代至允许增殖（例如，允许至少30%的细胞在24小时的周期内倍增）的表面上。优选的，所述基质为聚鸟氨酸/层粘连蛋白基质，其包括聚鸟氨酸（10μg/mL）和/或层粘连蛋白（10μg/mL）涂覆的组织培养塑料、聚赖氨酸/层粘连蛋白基质或用纤连蛋白处理的表面。然后，每3-4天用可以或可以不补充一种或多种增殖增强因子的生长培养基饲养培养物。当培养小于50%汇合时，可以将增殖增强因子加入至生长培养基。

当80-95%汇合时，可以使用标准技术（如通过胰酶消化）使条件永生化羊膜来源的贴壁细胞系传代。在一些实施方式中，直至约第二十次传代，维持选择（例如，通过对含有新霉素抗性基因的细胞加入G418）是有益的。还可以将细胞在液氮中冷冻以用于长期储存。

可以从如上所述制备的条件永生化贴壁细胞系分离无性细胞系。一般地，可以使用标准技术（如通过限度稀释或使用克隆环）分离这些无性细胞系并扩增。一般地，可以如上所述饲养无性细胞系并使其传代。

一般地，可以通过在有利于分化的培养条件下抑制生长促进蛋白的产生和/或活性来诱导条件永生化人羊膜来源的贴壁细胞系（其可以但不需要是无性系）分化。例如，如果编码生长促进蛋白的基因受外界可调控启动子的控制，则可以改变条件（例如，温度或培养基组成）以抑制所述生长促进基因的转录。对于以上所讨论的四环素控制基因表达系统，可以通过四环素的加入来抑制生长促进基因的转录从而实现分化。一般地，将1μg/mL四环素使用4-5天足以引起分化。为了促进进一步分化，可以在生长培养基中包含其他试剂。

5.11.剂量和施用途径

可以通过相对于待治疗疾病或病况的医学可用的任何途径向对其有需要的个体施用AMDAC。在如上所述的治疗方法的另一种具体实施方式中，通过推注施用所述AMDAC。在另一种具体的实施方式中，通过静脉内输注施用所述分离的AMDAC。在具体的实施方式中，所述静脉内输注是约1至约8小时内的静脉内输注。在另一种具体的实施方式中，颅内施用所述分离的AMDAC。在另一种具体的实施方式中，肌内施用所述分离的AMDAC。在另一种具体的实施方式中，腹膜内施用所述分离的AMDAC。在另一种具体的实施方式中，动脉内施用所述分离的AMDAC。在一种更具体的实施方式中，在缺血区域内施用所述分离的AMDAC。在另一种更具体的实施方式中，向缺血外周区域施用所述分离的AMDAC。在所述治疗方法的另一种具体实施方式中，肌内、皮内或皮下施用所述分离的AMDAC。

在如上所述的治疗方法的另一种具体实施方式中，向所述个体施用一次所述AMDAC。在另一种具体的实施方式中，以两次或更多次单独的施用将所述分离的AMDAC施用至所述个体。在另一种具体的实施方式中，所述施用包括施用约1×10⁴至1×10⁵个分离的AMDAC，例如，AMDAC每千克所述个体。在另一种具体的实施方式中，所述施用包括施用约1×10⁵至1×10⁶个分离的AMDAC每千克所述个体。在另一种具体的实施方式中，所述施用包括施用约1×10⁶至1×10⁷个分离的AMDAC每千克所述个体。在另一种具体的实施方式中，所述施用包括施用约1×10⁷至1×10⁸个分离的胎盘细胞/千克所述个体。在其他具体的实施方式中，所述施用包含施用约1×10⁶至约2×10⁶个分离的胎盘细胞/千克所述个体；约2×10⁶至约3×10⁶个分离的胎盘细胞/千克所述个体；约3×10⁶至约4×10⁶个分离的胎盘细胞/千克所述个体；约4×10⁶至约5×10⁶个分离的胎盘细胞/千克所述个体；约5×10⁶至约6×10⁶个分离的胎盘细胞/千克所述个体；约6×10⁶至约7×10⁶个分离的胎盘细胞/千克所述个体；约7×10⁶至约8×10⁶个分离的胎盘细胞/千克所述个体；约8×10⁶至约9×10⁶个分离的胎盘细胞/千克所述个体；或约9×10⁶至约1×10⁷个分离的胎盘细胞/千克所述个体。在另一种具体的实施方式中，所述施用包括施用约1×10⁷至约2×10⁷个分离的胎盘细胞/千克所述个体至所述个体。在另一种具体的实施方式中，所述施用包括施用约1.3×10⁷至约1.5×10⁷个分离的胎盘细胞/千克所述个体至所述个体。在另一种具体的实施方式中，所述施用包括施用多至约3×10⁷个分离的胎盘细胞/千克所述个体至所述个体。在一种具体的实施方式中，所述施用包括施用约5×10⁶至约2×10⁷个分离的胎盘细胞至所述个体。在另一种具体的实施方式中，所述施用包括以约20毫升溶液将约150×10⁶个分离的胎盘细胞施用至所述个体。

在一种具体的实施方式中，所述施用包括施用约5×10⁶至约2×10⁷个分离的胎盘细胞至所述个体，其中所述细胞包含在含有10%葡聚糖（例如，葡聚糖-40）、5%人血清白蛋白和可选地免疫抑制剂的溶液中。在另一种具体的实施方式中，所述施用包括静脉内施用约5×10⁷至3×10⁹个分离的胎盘细胞。在一种更具体的实施方式中，所述施用包括静脉内施用约9×10⁸个分离的胎盘细胞或约1.8×10⁹个分离的胎盘细胞。在另一种具体的实施方式中，所述施用包括颅内施用约5×10⁷至1×10⁸个分离的胎盘细胞。在一种更具体的实施方式中，所述施用包括颅内施用约9×10⁷个分离的胎盘细胞。

5.12羊膜来源的贴壁细胞的分化

本文所提供的羊膜来源的贴壁细胞可以分化。在一种实施方式中，通过（例如）使细胞与血管内皮生长因子（VEGF）接触，所述细胞已充分分化以表现出内皮细胞、肌性细胞或周细胞的至少一种特征。在一种更具体的实施方式中，内皮细胞、肌性细胞或周细胞的所述特征是CD9、CD31、CD54、CD102、NG2（神经/神经胶质抗原2）或α平滑肌肌动蛋白中的一种或多种的表达，其相对于OCT-4^–、VEGFR2/KDR⁺、CD9⁺、CD54⁺、CD105⁺、CD200⁺和VE-钙粘素^–羊膜细胞而言表达提高。在其他更具体的实施方式中，内皮细胞、肌性细胞或周细胞的所述特性是CD9、CD31、CD54、CD102、NG2（神经/神经胶质抗原2）或α平滑肌肌动蛋白中的一种或多种的表达，其相对于OCT-4^–、VEGFR2/KDR⁺和VEGFR1/Flt-1⁺羊膜细胞而言表达提高。

5.12.1血管生成的诱导

如下所示，可以完成本文所提供的羊膜来源的贴壁细胞所造成的血管生成。例如，在内皮细胞培养基（例如，EGM-2（Lonza））中或下述培养基中培养羊膜来源的贴壁细胞至第3代，所述培养基包含60%DMEM-LG（Gibco）、40%MCDB-201（Sigma）；2%胎牛血清（Hyclone Labs.）；1×胰岛素-转铁因子-硒（ITS）；1×亚油酸-牛血清白蛋白（LA-BSA）；5×10^-9M地塞米松（Sigma）；10^-4M抗坏血酸2-磷酸盐（Sigma）；10ng/mL的表皮生长因子（R&D Systems）；和10ng/mL的血小板源性生长因子（PDGF-BB）（R&D Systems）。然后，例如在96孔板中，以（例如）在相同培养基或者具有包含血管内皮生长因子（VEGF，例如，约10至50ng/mL）的FBS（0-5%v/v）DMEM中约1.5×10⁴个细胞/孔的密度，将细胞铺板至MATRIGEL^TM或包括胶原-1的基质上。可以每周更换约两次培养基。血管生成通过目测检查细胞管样结构的出芽和管腔形成所证实，其在（例如）50×-100×的放大倍数下在显微镜下可见。

5.12.2诱导分化为心肌细胞

本文所提供的羊膜来源的贴壁细胞的肌性（心原性）分化可以通过（例如）将细胞置于诱导分化为心肌细胞的细胞培养条件下来实现。优选的心肌细胞培养基包括补充有1μM视黄酸；10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子；和2ng/mL转化生长因子β-1；和100ng/mL表皮生长因子的DMEM/20%CBS。KnockOut血清替代品（Invitrogen,Carlsbad,California）可用于替代CBS。作为另外一种选择，将羊膜来源的贴壁细胞在补充有1至100（例如，50）ng/mL心肌营养蛋白-1的DMEM/20%CBS中培养24小时。在另一种实施方式中，羊膜来源的贴壁细胞可以培养10-14天，其中在无蛋白培养基中培养5-7天，然后使用（例如）通过在补充有1%脐带血血清的1%HEPES缓冲液中使人心肌匀浆所产生的人心肌提取物进行刺激。

可以通过（例如）RT/PCR显示心脏肌动蛋白的基因表达或者通过可见的细胞博动（beating）来确认分化。当细胞显示出一种或多种这些特征时，可以认为贴壁细胞已分化为心肌细胞。

6.实施例

6.1实施例1：来自羊膜的贴壁细胞的分离和扩增

该实施例示出了羊膜来源的贴壁细胞的分离和扩增。

6.1.1分离

如下所示，从羊膜分离羊膜来源的贴壁细胞。从胎盘切下羊膜/绒毛膜，并用手将羊膜与绒毛膜分离。用无菌PBS清洗羊膜以除去残余的血液、血块和其他物质。使用无菌纱布除去通过清洗未除去的额外的血液、血块或其他物质，并再次用PBS清洗羊膜。从膜上除去过量的PBS，并用手术刀将羊膜切成2”×2”的碎片。为了释放上皮细胞，通过将无菌的带夹套玻璃加工容器与37℃循环水浴利用管路和连接器进行连接，并安装至搅拌板上，来构建加工容器。将胰蛋白酶（0.25%，300mL）在加工容器中加热至37℃；加入羊膜碎片，并且在例如37℃下以100RPM-150RPM搅拌羊膜/胰蛋白酶悬液15分钟。通过将无菌容器置于靠近加工容器的无菌区域内并将无菌的75μm-125μm筛网（screen）插入到容器中（Millipore,Billerica,MA），装配成无菌筛选系统。搅拌羊膜碎片15分钟后，将加工容器的内容物转移至筛网，并使用（例如）无菌镊子将羊膜碎片转移回到加工容器；弃去含有上皮细胞的胰蛋白酶溶液。将羊膜碎片与如上所述的300mL胰蛋白酶溶液（0.25%）再次搅拌。用约100-150mL的PBS清洗筛网，并弃去PBS溶液。搅拌羊膜碎片15分钟后，将加工容器的内容物转移至筛网。然后，将羊膜碎片转移回到加工容器；弃去含有上皮细胞的胰蛋白酶溶液。将羊膜碎片与如上所述的300mL胰蛋白酶溶液（0.25%）再次搅拌。用约100-150mL的PBS清洗筛网，并弃去PBS溶液。搅拌羊膜碎片15分钟后，将加工容器的内容物转移至筛网。然后，将羊膜碎片转移回到加工容器，并弃去含有上皮细胞的胰蛋白酶溶液。在37℃下，将羊膜碎片在PBS/5%FBS（体积比为1:1的羊膜:PBS/5%FBS溶液）中搅拌约2-5分钟以中和胰蛋白酶。装配新的无菌筛选系统。中和胰蛋白酶后，将加工容器的内容物转移至新的筛网，并将羊膜碎片转移回到加工容器。在室温下，将无菌PBS（400mL）加入到加工容器中，并将加工容器的内容物搅拌约2-5分钟。用约100-150mL PBS清洗筛网。搅拌后，将加工容器的内容物转移至筛网；用PBS清洗加工烧瓶，并弃去PBS溶液。用300mL预热的DMEM装满加工容器，并将羊膜碎片转移至DMEM溶液。

为了释放羊膜来源的贴壁细胞，如下所示用胶原酶进一步处理所述处理的羊膜。通过在DMEM中溶解适当量的胶原酶粉末（随着供应商提供的胶原酶批次的活性而变化）制备无菌胶原酶母液（500U/mL）。将溶液通过0.22μm过滤器过滤并分配至单个无菌容器中。将CaCl₂溶液（0.5mL，600mM）加入到每个100mL剂量中，并冷冻所述剂量。在加工容器中将胶原酶（100mL）加入到羊膜碎片中，并将加工容器搅拌30-50分钟，或者直至通过目测检查羊膜消化已完成。羊膜消化完成后，将100mL预热的无菌PBS/5%FBS加入到加工容器中，并将加工容器再搅拌2-3分钟。搅拌后，将烧瓶的内容物转移至无菌60μm筛网中，并通过真空过滤收集液体。用400mL PBS清洗加工容器，并将PBS溶液无菌过滤。然后，将过滤的细胞悬液在20℃下以300×g离心15分钟，并将细胞沉淀物重悬浮于预热的PBS/2%FBS（总计约10mL）中。

6.1.2构建

将新鲜分离的生血管羊膜细胞加入到含有60%DMEM-LG（Gibco）；40%MCDB-201（Sigma）；2%FBS（Hyclone Labs）；1×胰岛素-转铁因子-硒（ITS）；10ng/mL亚油酸-牛血清白蛋白（LA-BSA）；1n-地塞米松（Sigma）；100μM抗坏血酸2-磷酸盐（Sigma）；10ng/mL的表皮生长因子（R&D Systems）；和10ng/mL的血小板源性生长因子（PDGF-BB）（R&D Systems）的培养基中，并以10,000个细胞/cm²的接种密度铺板在T-烧瓶中。然后，在37℃，5%CO₂和>90%的湿度下孵育培养装置。每天监控细胞贴壁、生长和形态。通过更换培养基除去非贴壁细胞和碎片。每周更换两次培养基。具有典型成纤维样/纺锤形态的贴壁细胞在最初铺板后的几天中出现。当汇合度达到40%-70%（最初铺板后的4-11天），通过在室温下（37℃）胰酶消化（0.25%胰蛋白酶-EDTA）5分钟收获细胞。用PBS-5%FBS中和后，在室温下以200-400g将细胞离心5-15分钟，然后重悬浮于生长培养基中。此时，认为AMDAC谱系已成功地构建了初代。在一些情况下，将初代羊膜来源的贴壁细胞冷冻保存或扩增。

6.1.3培养程序

将羊膜来源的贴壁细胞在如上所述的生长培养基中培养，并以2000-4000个/cm²的密度在合适的组织培养处理的培养装置中接种。然后，在37℃，5%CO₂和>90%的湿度下孵育培养装置。在培养期间，AMDAC将贴壁并增殖。每天监控细胞的生长、形态和汇合度。如果培养延长至5天或更多天，则每周更换两次培养基以补充新鲜的营养物。当汇合度达到40%-70%（接种后的3-7天），通过在室温下（37℃）胰酶消化（0.05%-0.25%胰蛋白酶-EDTA）5分钟收获细胞。用PBS-5%FBS中和后，在室温下以200-400g将细胞离心5-15分钟，然后重悬浮于生长培养基中。

以这种方式分离和培养的AMDAC通常会在铺板的1×10⁶个细胞中产生33530+/-15090个集落形成单位（成纤维细胞）（CFU-F)。

6.2实施例2：羊膜来源的贴壁细胞的表型鉴定

6.2.1基因和蛋白表达谱

本实施例描述了羊膜来源的贴壁细胞的表型鉴定，包括特征性细胞表面标志物、mRNA和蛋白质组学表达。

样品制备：如实施例1所述获得了羊膜来源的贴壁细胞。将第6代细胞在如以上实施例1所述的生长培养基中生长至约70%汇合，胰蛋白酶化并在PBS中清洗。NTERA-2细胞（美国典型培养物保藏中心，ATCC编号CRL-1973）在含有4.5g/L葡萄糖、2mM谷氨酰胺和10%FBS的DMEM中生长。对有核细胞计数以获得最少2×10⁶至1×10⁷个细胞。然后，使用QiagenRNeasy试剂盒（Qiagen,Valencia,CA）并使用QIAshredder溶解细胞以获得溶胞产物。然后，使用Qiagen RNeasy试剂盒分离RNA。使用NanodropND1000分光光度计，25ng/μL RNA/反应，确定RNA的数量和质量。使用Applied Biosystems（Foster City,CA）的大容量cDNA库试剂盒（HighCapacity cDNA Archive Kit）准备cDNA反应。使用Applied Biosystems的TAQMAN通用PCR混合母液（TAQMANuniversal PCR master mixes）进行实时PCR反应。在Applied Biosystems 7300实时PCR系统中以标准模式将反应进行40个循环。

样品分析和结果：利用实时PCR方法和特定的TAQMAN基因表达探针和/或TAQMAN人血管生成阵列（Applied Biosystems），鉴定了细胞的干细胞相关的血管生成性和心肌原性标志物的表达。结果表示为与有关细胞对照相比所关心的基因的相对表达，或者与普遍表达的管家基因（例如，GAPDH、18S或GUSB）相比所关心的基因的相对表达（ΔCt）。

羊膜来源的贴壁细胞表达多种干细胞相关的血管生成性和心肌原性基因，并且与NTERA-2细胞相比，显示出相对缺乏OCT-4表达。表1总结了所选的血管生成性、心肌原性和干细胞基因的表达，并且图1示出在AMDAC中缺乏干细胞相关基因POU5F1（OCT-4）、NANOG、SOX2、NES、DNMT3B和TERT的表达。

表1：通过RT-PCR确定的羊膜来源的贴壁细胞的基因表达谱。

“mRNA”列表示在每种情况下确定了特定标志物的mRNA是否存在。

在单独的实验中，还发现AMDAC表达下述基因：芳烃受体核转运蛋白2（ARNT2）、神经生长因子（NGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）、胶质源性神经营养因子（GDNF）、神经营养蛋白3（NT-3）、NT-5、缺氧诱导因子1α（HIF1A）、缺氧诱导蛋白2（HIG2）、血红素加氧酶（脱环）1（HMOX1）、胞外超氧化物歧化酶[Cu-Zn]（S0D3）、过氧化氢酶（CAT）、转化生长因子β1（TGFB1）、转化生长因子β1受体（TGFB1R）和肝细胞生长因子受体（HGFR/c-met）。

6.2.2利用流式细胞术评价羊膜来源的贴壁细胞的血管生成效力

利用流式细胞术作为定量羊膜来源的贴壁细胞表型标志物的方法来限定细胞的同一性。细胞样品获自冷冻储存。融化前和试剂制备期间，将细胞小瓶保持在干冰上。然后，使用37℃水浴快速融化样品。使用冷冻前的细胞计数来计算初始融化后细胞数目依赖性稀释。简言之，将冷冻小瓶在37℃水浴中融化约30秒并轻轻搅拌。融化后马上将约100-200μL冷的（2℃至8℃）融化溶液（具有2.5%白蛋白和5%Gentran40的PBS）加入到冷冻小瓶中并混合。轻轻混合后，将冷冻小瓶中的总体积转移到含有相等体积的冷（2℃至8℃）融化溶液的15mL锥形管中。除去上清液前，在室温下在锥形管中以400g将细胞离心5分钟。用移液管测量（估测）剩余体积；在室温下，将剩余体积和细胞沉淀物重悬浮于含1%FBS的PBS中，从而得到250×10³个细胞/100μL缓冲液的细胞浓度。例如，1×10⁶个细胞将重悬浮于400μL1%的FBS中。将细胞悬液置于预标记的5mL FACS管（BectonDickinson（BD）,Franklin Lakes,NJ）中。对于每种一抗同型，将100μL的细胞悬液等分至一个同型对照管中。表型分析前，优化所有抗体浓度以达到良好的信噪比并在整个可能的4-log动态范围内充分检测CD抗原。确定用于染色每个样品的每个同型和样品抗体的体积。为了使同型和样品管中抗体的量（以μg为单位）标准化，按照下式计算每种抗体的浓度：(1/实际抗体浓度（μg/μL))×(2.5×10⁵个细胞所需的最终抗体量，以μg计)=#μL所添加的抗体。通过向每个管中加入适当量的抗体，制备了同型和样品的抗体混合母液（master mix）。将细胞在黑暗中在室温下染色15-20分钟。染色后，通过离心（400g×5分钟）除去每个样品中未结合的抗体，然后使用2mL1%FBS PBS（室温）清洗，之后重悬浮于150μL室温的1%FBS PBS。然后，在按照生产商的说明书准备待用的Becton Dickinson FACSCalibur、FACSCantoI或BD FACSCantoII流式细胞仪上分析样品。在不设定实时设备补偿参数的情况下获得多参数流式细胞仪数据集（侧散射（SSC）、前散射（FSC）和整合荧光谱（FL））。在数据采集后，根据生产商的说明书使用FACSDiva软件确定补偿参数。将这些设备的设定应用于每个样品。在这些研究中所使用的荧光团结合物为别藻蓝蛋白（APC）、AlexaFluor647（AF647）、异硫氰酸荧光素（FITC）、藻红蛋白（PE）和多甲藻素叶绿素蛋白（PerCP），其全部来自BD Biosciences。表2总结了所选的细胞表面标志物（包括血管生成标志物）的表达。

表2：如通过流式细胞术确定的羊膜来源的贴壁细胞中细胞表面标志物的表达。

“免疫定位流式细胞术”列表示通过免疫定位，尤其是通过流式细胞术确定了特定标志物是否存在。

在另一个实验中，用抗人CD49f（藻红蛋白-结合的克隆GoH3；BDPharmingen商品号No.555736）标记AMDAC细胞，并通过流式细胞术进行分析。约96%的用抗CD49f标记的AMDAC是CD49f⁺。

在其他实验中，通过免疫定位还发现AMDAC表达CD49a、CD106、CD119、CD130、c-met（肝细胞生长因子受体；HGFR）、CXC趋化因子受体1（CXCR1）、PDGFRA和PDGFRB。通过免疫定位还发现AMDAC缺乏CD49e、CD62E、成纤维细胞生长因子受体3（FGFR3）、肿瘤坏死因子受体超家族成员12A（TNFRSF12A）、胰岛素样生长因子1受体（IGF-1R）、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR6、趋化因子受体1（CCR1）、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、表皮生长因子受体（EGF-R）、胰岛素受体（CD220）、白介素受体4（IL4-R；CD124）、IL6-R（CD126）、TNF-R1a和1b（CD120a,b）和erbB2/Her2的表达。

6.2.3使用免疫组织化学（IHC）/免疫荧光化学（IFC）评价羊膜来源的贴壁细胞的血管生成效力

将第6代羊膜来源的贴壁细胞在4孔腔式载玻片上生长至约70%汇合并用4%的福尔马林溶液分别固定30分钟。固定后，用PBS清洗载玻片两次5分钟。然后，将载玻片与来自与二抗相同宿主的10%正常血清、2×酪蛋白和0.3%Triton×100在PBS中的溶液一起在室温下在潮湿的室中孵育20分钟。吸干过量血清并将所述载玻片与一抗（山羊多克隆IgG，Santa Cruz;Santa Cruz,CA）在潮湿的室中一起孵育。通过选择对所使用的抗体最优的条件，确定孵育的时间和温度。一般而言，孵育时间为37℃下1-2小时或4℃过夜。然后，用PBS清洗载玻片三次各5分钟并在室温下在潮湿的室中与针对一抗（兔抗山羊抗体（Santa Cruz））宿主的荧光结合的抗免疫球蛋白二抗一起孵育20-30分钟。随后，用PBS清洗载玻片三次各5分钟，使用DAPI VECTASHIELD（Vector Labs）封固溶液与盖玻片封固以复染核。使用Nikon荧光显微镜使细胞染色显象。所有图像均采用相等的曝光时间，所述曝光时间针对相应同型（山羊IgG（Santa Cruz））背景归一化。表3总结了羊膜来源的贴壁细胞表达血管生成蛋白的结果。

表3：羊膜来源的贴壁细胞上存在或缺少的血管生成标志物。

羊膜来源的贴壁细胞表达的血管生成标志物肿瘤血管内皮标志物7（TEM-7），表3中所示蛋白质中的一种。参见图2。

6.2.4利用膜蛋白质组学评价羊膜来源的贴壁细胞的血管生成效力

膜蛋白纯化：使第6代细胞在生长培养基中生长至约70%汇合，胰蛋白酶化并在PBS中清洗。然后，在细胞溶解前，将细胞与含有蛋白酶抑制剂混合物（P8340,Sigma Aldrich,St.Louis,MO）的溶液孵育15分钟。然后，通过加入10mM HCl溶液（从而避免使用洗涤剂）使细胞溶解，并以400g离心10分钟以成沉淀并除去核。将去核上清液转移至超速离心管并使用具有T-1270转子（Thermo Fisher Scientific,Asheville,NC）的WX80超速离心机以100000g离心150分钟，从而产生膜蛋白沉淀物。

蛋白脂质体的产生、固定化和消化：将膜蛋白沉淀物用Nanoxis缓冲液（10mM Tris,300mM NaCl,pH8）清洗几次。将膜蛋白沉淀物悬浮于1.5mLNanoxis缓冲液中，然后使用VIBRA-CELL VC505超声处理器（Sonics&Materials,Inc.,Newtown,CT）在冰上尖端超声（tip-sonicate）处理20分钟。通过使用FM1-43染料（Invitrogen，Carlsbad,CA）染色确定蛋白脂质体的大小并用荧光显微镜显象。通过BCA测定（Thermo Scientific）确定蛋白脂质体悬液的蛋白浓度。然后，使用标准移液管头将蛋白脂质体注射到LPI流通池（LPI Flow Cell,Nanoxis AB,Gothenburg,Sweden）上并使其固定1小时。固定后，进行一系列清洗步骤，并直接将5μg/mL胰蛋白酶（PrincetonSeparations,Adelphi,NJ）注射到LPI流通池上。在37℃下将芯片孵育过夜，并将胰蛋白酶肽从LPI芯片上洗脱下来，然后使用Sep-Pak柱（WatersCorporation,Milford,MA）脱盐。

LTQ线性离子阱LC/MS/MS分析：使用180分钟梯度（缓冲液A：水，0.1%甲酸；缓冲液B：乙腈，0.1%甲酸），将每个胰蛋白酶消化样品在0.2mm×150mm3μm200MAGIC C18柱（Michrom Bioresources,Inc.,Auburn,CA）上分离，所述C18柱直接连接至沿轴式去溶剂化真空辅助纳米毛细管级电喷雾电离（ADVANCE）源（Michrom Bioresources,Inc.）。ADVANCE源在3μL/min的相当高的流速下操作时达到了与常规nanoESI相当的灵敏度。在LTQ线性离子阱质谱仪（Thermo Fisher Scientific,San Jose,CA）上分析洗脱的肽，所述质谱仪在每次全扫描质谱后采用10次数据依赖性MS/MS扫描。对每个生物样品采集7个分析重复数据集。

生物信息学：利用Sorcerer Solo工作站（Sage-N Research,San Jose,CA）上实施的SEQUEST算法，作为针对IPI人数据库的单一搜索，搜索与每个细胞系所采集的7个分析重复数据集相对应的7个RAW文件。指定肽质量公差为1.2amu，指定甲硫氨酸的氧化为差异修饰，并且指定脲甲基化为静态修饰。将Trans-Proteomic Pipeline（TPP）的支架软件实施用于分类和解析膜蛋白质组学数据。如果蛋白质被鉴别为95%的肽概率、95%的蛋白质概率和1个唯一的肽，则考虑对这些蛋白质进行分析。使用内部开发的自定义Perl脚本，比较膜蛋白质组学数据集。

结果：如表4中所示，羊膜来源的贴壁细胞表达多种血管生成性和心肌原性标志物。

表4：羊膜来源的贴壁细胞表达的心肌原性或血管生成性标志物。

6.2.5利用分泌蛋白质组学谱评价羊膜来源的贴壁细胞的血管生成效力

蛋白质阵列：将第6代羊膜来源的贴壁细胞在生长培养基中以相等的细胞数量铺板，并且在4天后收集条件培养基。使用RayBiotech血管生成蛋白质阵列（Norcross,GA），在细胞条件培养基中对多个血管生成性细胞因子/生长因子进行同时定性分析。简言之，在室温下将蛋白质阵列与2mL1×封闭缓冲液（Ray Biotech）一起孵育30分钟（min）以封闭膜。然后，倒出封闭缓冲液，并在室温下将膜与1mL样品（用各自细胞条件化4天的生长培养基）一起孵育1-2小时。然后，倒出样品，并在室温下用2mL1×清洗缓冲液I（Ray Biotech）将膜振荡清洗3×5分钟。然后，在室温下用2mL1×清洗缓冲液II（Ray Biotech）将膜振荡清洗2×5分钟。此后，将1mL稀释的生物素-结合的抗体（Ray Biotech）加入到每个膜中，并在室温下孵育1-2小时，并用如上所述的清洗缓冲液清洗。然后，将稀释的HRP-结合的抗生蛋白链菌素（2mL）加入到每个膜中，并将膜在室温下孵育2小时。最终，再次清洗膜，用ECL检测试剂盒（Amersham）按照说明书孵育，并使用Kodak Gel Logic2200成像系统对结果进行观察和分析。图3A-图3D中示出了AMDAC分泌的多种血管生成性蛋白。

ELISA：使用可商购的R&D SYSTEMS（Minneapolis,MN）试剂盒对细胞条件培养基中的单一血管生成性细胞因子/生长因子进行定量分析。简言之，根据生产商的说明书进行ELISA测定，并将条件培养基中各个血管生成性生长因子的量归一化至1×10⁶个细胞。羊膜来源的贴壁细胞（n=6）显示出约4500pg VEGF每百万个细胞和约17,200pg IL-8每百万个细胞。

表5：血管生成性标志物的ELISA结果

在单独的实验中，确认AMDAC还分泌血管生成素-1、血管生成素-2、PECAM-1（CD31；血小板内皮细胞粘附分子）、层粘连蛋白和纤连蛋白。

6.2.6AMDAC的微小RNA表达确认了血管生成活性

本实施例显示AMDAC比骨髓源间质干细胞表达更高水平的某些微小RNA（miRNA）和更低水平的某些其他miRNA，这些表达分别与血管生成功能相关。

已知促血管生成miR-296通过调节生长因子受体水平来调节血管生成功能。例如，通过直接靶向肝细胞生长因子调控的酪氨酸激酶底物（HGS）mRNA，从而导致HGS水平降低并借此降低了HGS-介导的生长因子受体VEGFR2和PDGFRb的降解，内皮细胞中的miR-296显著有助于血管生成。参见Würdinger等人,Cancer Cell 14:382-393(2008)。另外，miR-15b和miR-16已显示控制VEGF（参与血管生成的关键促血管生成因子）的表达，并且缺氧诱导的miR-15b和miR-16的减少有助于作为促血管生成性细胞因子的VEGF的增加。参见Kuelbacher等人,Trends in Pharmacological Sciences,29(1):12-15(2007)。

如以上实施例1中所述制备AMDAC。使用MIRVANA miRNA分离试剂盒（Ambion,Cat#1560），对AMDAC和BM-MSC细胞（用作对比）进行微小RNA（miRNA）制备。将0.5×10⁶至1.5×10⁶个细胞在变性溶胞缓冲液中破碎。然后，对样品进行酸-酚+氯仿提取以分离高度富集小RNA分子的RNA。加入100%乙醇，使样品达到25%乙醇。当该溶胞物/乙醇混合物通过玻璃纤维过滤器时，大RNA被固定化，而在滤液中收集小RNA分子。然后，将滤液的乙醇浓度提高至55%，并且将混合物通过第二玻璃纤维过滤器，其中小RNA被固定化。对该RNA进行清洗，并在低离子强度溶液中洗脱。通过测量260nm和280nm下的吸光度，确定回收的小RNA的浓度和纯度。

发现AMDAC表达以下血管生成性miRNA：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b（血管生成性miRNA簇17-92的成员）、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b、miR-16。当与骨髓源间质干细胞（BM-MSC）相比时，还发现AMDAC表达较高水平的以下血管生成性miRNA：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92（血管生成性miRNA簇17-92的成员）、miR-296。这些结果很好地与AMDAC表达较高水平的VEGFR2/KDR的观察结果（参见上文）相关。相反，当与BM-MSC相比时，发现AMDAC表达较低水平的以下血管生成性miRNA：miR-20a、miR-20b（血管生成性miRNA簇17-92的成员）、miR-221、miR-222、miR-15b、miR-16。miR-15b和miR-16表达的降低与在AMDAC中所观察到的较高水平的VEGF表达相关。

6.3实施例3：利用AMDAC治疗辐射损伤

本研究的目标是评价使用铯源（Cs-γ辐射）的单次急性γ辐射全身暴露后，使用或不使用在辐射后24小时施用AMDAC或参考阳性对照（Neupogen）的处理的小鼠中的LD60/60。与未辐射的载体对照组相比，评价了由于AMDAC的存活改善的比较分析。

在该研究中，为4个组中的每一个组分配29只小鼠。将29只小鼠进一步划分，将其中的9只小鼠指定为用于在第4天、第15天和第29天（3只小鼠/天）进行中期尸检的卫星组。构建来自该卫星组的小鼠以用于收集血液进行血液学分析和收集组织用于将来可能的PCR评价。将剩余的20只小鼠指定为主要组，并分配在第60天进行尸检。第1组不用Cs-γ辐射处理，而所有其余的组（即第2组、第3组和第4组）在第0天接受940cGy的单次辐射剂量。如下所示，对在辐射后用载体、细胞或阳性对照处理的组给予单次静脉内、单次皮下或多次静脉内施用：第1组和第2组仅接受载体；对第3组给予多次剂量施用，其在第1-5天接受200μg/kg Neupogen（sc）；和在第1天，第4组以1.0×10⁶个总有核活细胞（TNC）接受AMDAC（iv）。第1天代表辐射处理后的24小时。参见表6。

表6：每组的施用方案

对于分配给第1组的主要或卫星动物，未观察到发病或死亡。第3组中3只小鼠死亡；而第2组和第4组中分别总计有1只和2只提前处死的垂死小鼠。类似地，在卫星小鼠中观察到了死亡，其中第2组、第3组和第4组中分别发现了3只、3只和1只死亡小鼠。归因于剂量处理和/或辐射的临床指征包括在主要组和卫星组中的任一组或两组中观察到的弓背姿势、低体温、衰弱、活动减少、气喘和皮毛竖起等发现。这些发现被认为是毒理学限制并且是由单独的辐射施用或者结合剂量处理产生的。尽管有这些观察结果，但是如以下所讨论的，在所研究的四个组间成功地产生了统计学显著的存活率比较。

在接受辐射处理的所有组中观察到了平均体重的统计学显著降低。辐射后，在主要组和卫星组中观察到了体重降低，并且持续至少到第11天并且长达第60天，其中在一些组中在随后一天观察到了偶发的降低。

以上提及的弓背姿势、低体温、衰弱、活动减少、气喘、皮毛竖起和体重降低等临床指征的增加均归因于被认为是毒理学限制的剂量和/或辐射处理。卫星动物血细胞免疫水平分析确认在暴露于辐射的动物体内中性白细胞减少。

图4中示出了研究过程中每个组内动物的存活曲线。以两种方式评价存活的统计分析：第一种是通过将处理组（第3组和第4组）与未处理（空白）第1组进行比较，而第二种是通过将处理组与第2组进行比较，其中第2组暴露于单独的940cGy Cs-γ辐射并且代表了辐射对照组。

与仅接受辐射的第2组动物相比，载体对照第1组在存活率方面显示出统计学显著差异（p<0.001）。在辐射后30天，单次940cGy的辐射剂量对第2组中50%的动物是致死的（参见图4）。

与辐射后24小时用Neupogen处理的第3组动物相比，载体对照第1组中的动物在存活率方面也显示出统计学显著差异（p<0.001）。Neupogen（非格司亭）是用于刺激粒性白细胞增殖和分化的粒性白细胞集落刺激因子（G-CSF）类似物，并且在中性白细胞减少的治疗中使用（参见，例如，Beveridge等人,1988,Cancer Invest.16(6):366-73）。尽管在辐射后每天用Neupogen处理第3组中受辐射的小鼠，处理5天，但是在辐射后约20天，单次940cGy的辐射剂量对第2组中50%的动物是致死的（参见图4）。相反地，用Neupogen处理的小鼠显示出与受到辐射但未接受后续处理的小鼠（即第2组小鼠；参见图4）相当的存活率。

相反，与载体对照组动物（第1组）相比，暴露于辐射然后在辐射后24小时用AMDAC处理的第4组动物在存活率方面未显示出统计学显著差异。如图4所示，以LD50向暴露于辐射的小鼠施用单次剂量的AMDAC足以提高>80%的动物的存活。此外，暴露于辐射后用AMDAC处理的小鼠（即第4组动物）在存活率方面也显示出与受到辐射但未接受后续处理的第2组动物的统计学显著差异（p=0.003）

总之，暴露于致死剂量的辐射后，向小鼠施用AMDAC将存活率提高至大于80%，而仅暴露于辐射的小鼠或者暴露于辐射并随后用Neupogen处理的小鼠显示出小于50%的存活率。

6.4实施例4：AMDAC诱导造血重建

本研究的目标是对以上实施例3中所述的研究进行确认和展开。在接受单次剂量的γ-辐射后，在小鼠中单次静脉内剂量施用两个浓度的AMDAC后，评价治疗效力。还评价了AMDAC处理对辐射诱导的中性白细胞减少以及几个其他终点（包括免疫反应）的影响。

6.4.1方法

6.4.1.1实验组和施用规程

该研究由4个研究组（1-4）组成，并且将这些研究组进一步分成主要亚组和卫星亚组。第1组动物未暴露于辐射，但是接受了单次剂量的载体缓冲溶液。对于第1组，将4只动物分配到主要亚组，并将8只动物分配到卫星亚组。对于第2-4组，分别将20只动物分配到主要亚组，并且分别将8只动物分配到卫星亚组。第2-4组的动物在第0天接受了单次剂量940cGy的γ-辐射。辐射第2组动物接受了单次剂量的载体缓冲溶液；在辐射处理后约24小时（第1天），分别向第3组和第4组的辐射动物施用一次静脉内（iv）剂量的AMDAC总有核细胞（TNC）。参见表7。在第60天，对主要组的存活动物进行尸检；并且在第14天或第30天，对分别来自第1-4组的卫星组的4只动物进行尸检。

表7：每组的施用方案

组#	辐射	AMDACS(IV)
			1（载体对照）	无	无
2（载体/辐射对照）	第0天，940cGy	无
			3	第0天，940cGy	第1天，1.25×10⁶TNC
4	第0天，940cGy	第1天，2.5×10⁶TNC

6.4.1.2血液采集和分析

在异氟烷麻醉下，从小鼠的眶后窦，或者作为另外一种选择从尾静脉采集血液。使用K3-EDTA作为抗凝血剂采集血液学样品。对于所采集的血清化学样品，不使用抗凝血剂。对于最终采血（terminal bleeds），采集最少500μl全血；在第60天，从（来自第1-4组的）主要动物亚组采血一次，并且在第14和30天，从（来自第1-4组的）卫星动物亚组采血（4只动物/组/天）。所采集的全血用于以下血液学分析：血细胞比容（HCT）、血红蛋白（HGB）、红细胞计数（RBC）、红细胞分布宽度（RDW）、白血球数（WBC）、WBC差别和绝对计数（中性粒细胞绝对计数（ANS）、带状中性粒细胞绝对计数（ANB）、带状中性粒细胞百分比（PNB）、淋巴细胞绝对计数（ALY）、淋巴细胞百分比（PLY）、单核细胞绝对计数（AMO）、单核细胞百分比（PMO）、嗜曙红细胞绝对计数（AEO）、嗜曙红细胞百分比（PEO）、嗜碱细胞绝对计数（ABA）和嗜碱细胞百分比（PBA））、红细胞平均血红蛋白（MCH）、平均红血球容积（MCV）、平均红血球血色素浓度（MCC）、血小板计数（PLC）、血小板平均体积（MPV）和网织红细胞计数（绝对计数，REA，和百分比，RET）。

6.4.1.3FACS

将卫星组的动物用于骨髓收集以用于荧光活化的细胞分选（FACS）。

采集两个股骨以用于FACS分析。采集股骨，并通过使用带有～25G针头的1cc注射器将股骨的内容物冲入至含有约300μl PBS的预标记的冷冻小瓶（或等效物）中来分离骨髓（BM）。将所采集的骨髓样品置于湿润的冰上直至在约1-2小时内转移以建立存活力，用于FACS免疫表型分析。使用针对这些标志物的单克隆抗体，通过流式细胞术分析骨髓细胞的小鼠造血系的小鼠细胞决定簇（CD3、B220、CD11b、Ly-6c、Ter119）、c-kit（CD117）和Sca-1。在研究的第14天和第30天，对来自卫星亚组的动物进行该分析。标记抗体的缩写如下所示：别藻蓝蛋白（APC）、藻红蛋白（PE）和菁（Cy）。通过将牛血清白蛋白（BSA；1%）加入到PBS中制备了染色缓冲液。如下表8中所述，使用荧光标记的单克隆抗体在96孔板中对细胞染色。

表8：

荧色物	标志物
		V450	CD117
PerCP-Cy 5.5	小鼠造血谱系决定簇
		PE	Sca1

对于染色，将细胞在圆底96孔微量滴定板中铺板（1×10⁶个细胞/孔）。通过在4℃以300×g将所述板离心5分钟并倒出上清液，用冷染色缓冲液（100 μl/孔；1% BSA在PBS中的溶液）清洗细胞。将小鼠IgG（5 μg）加入到每个孔中，并且在2-8℃孵育5-7分钟后，将抗体混合物（每孔40 μl抗体混合物）加入到每个孔中。冷冻30至35分钟后，用冷染色缓冲液（150-200 μl/孔）清洗染色细胞两次。染色后，使用LSR-II流式细胞仪（Becton Dickinson）分析样品。

6.4.2结果

6.4.2.1存活研究

图5示出了每个组中的动物在60天研究过程中的存活曲线。如图5所示，对于第1-4组，存活至第60天的小鼠的百分比分别为100%、50%、40%和75%。对于第2组中的动物（940cGy Cs-γ），所观察到的动物死亡率为到第11、15、18、22和29天，分别有1、4、3、1和1只死亡；对于第3组（940cGy Cs-γ和1.25×10⁶TNC AMDAC），到第8、11、15、18、22和25天，分别有1、1、2、3、3和2只死亡；以及对于第4组（940cGy Cs-γ和2.5×10⁶TNC AMDAC），到第15天和第25天，分别有4只和1只死亡。

以两种方式评价存活的统计分析，首先通过将第2-4组与非辐射载体对照组（第1组）进行比较，然后通过将处理第3组和第4组与其中动物暴露于辐射并仅用载体处理的第2组进行比较。还评价了其中的动物接受了不同剂量的AMDAC（分别为1.25×10⁶TNC和2.5×10⁶TNC）的第3组和第4组之间的统计分析。

由于载体对照第1组中动物数目较少，当与组1相比时，未确定来自任何组的存活数据之间的统计学差异。此外，图5表明尽管1.25×10⁶AMDAC处理的小鼠（第3组）的存活与第2组未处理小鼠的存活相当，但是接受更高剂量的AMDAC（即2.5×10⁶）的小鼠显示出比受到辐射但在此后接受治疗的第2组小鼠更好的存活。

6.4.2.2病理学分析

比较了第14天和第30天时卫星动物的血液学参数评价。当与第1组相比时，第2-4组中的每个组在血细胞比容（HCT）、血红蛋白（HGB）、红细胞（RBC）、白血球（WBC）、总中性粒细胞（ANS）、总淋巴细胞（ALY）、血小板计数（PLC）、网织红细胞绝对计数（REA）和网织红细胞百分比（RET）方面显示出统计学显著降低。除ALY和PLC外，所有在第14天降低的参数与到第30天时的载体对照水平相当。

将对第2组所获得的血液学分析结果与对第3组和第4组（辐射暴露后用不同剂量的AMDAC处理的组）所获得的结果进行比较。当比较某些参数时，观察到了显著不同的结果。具体地，与第2组中的水平相比较时，第4组动物在第14天时的HCT、HGB和RBC值中显示出统计学显著提高。参见图6A-图6C。到第30天，数值与第2组相当。

6.4.2.3FACS结果

在第14天和第30天，对第1-4组中的卫星动物进行了鼠骨髓系阴性C-kit⁺/Sca-1⁺细胞群体（LSK细胞）的FACS分析。参见图7A。该群体通常高度富集造血干细胞和原生多系祖细胞。如所期望的，在两个测试时间点，与非辐射对照组（第1组）相比，在辐射对照组（第2组）中造血干细胞和原生祖细胞（HSC和HPPC）的频率显著降低。具体地，如图7A中所示，未暴露于辐射的第1组小鼠中6.38%的测试细胞是C-kit⁺/Sca-1⁺，而第2组（暴露于辐射）小鼠中仅0.0574%的测试细胞是C-kit⁺/Sca-1⁺。还如图7A中所示，与第2组小鼠中这些细胞的水平相比，AMDAC处理小鼠（第3组和第4组）具有非常高水平的C-kit⁺/Sca-1⁺细胞：用1.25×10⁶AMDAC处理的小鼠（第3组）中1.89%的测试细胞是C-kit⁺/Sca-1⁺，和用2.5×10⁶AMDAC处理的小鼠（第4组）中8.33%的测试细胞是C-kit⁺/Sca-1⁺。事实上，辐射暴露后用较高剂量的AMDAC处理的小鼠具有与未暴露于辐射的小鼠（第1组）相当的C-kit⁺/Sca-1⁺细胞数目。图7B证实了该数据，其显示在第一时间点（辐射后14天），与第2组载体处理的辐射动物相比，在第4组（AMDAC处理的小鼠）中检测到了显著更高频率的HSC和HPPC。

6.4.3结论

暴露于辐射后，AMDAC的施用促进了延长存活期。此外，这种施用导致血液学参数显著有益的变化。这些发现表明AMDAC处理能够降低骨髓抑制的严重性，这可以有助于在暴露于致死的辐射后用AMDAC处理的小鼠中所观察到的存活。此外，FACS结果表明内源造血干细胞和祖细胞频率与相比于对照辐射动物使用高剂量AMDAC所观察到的提高的存活率直接相关。所观察到的AMDAC对内源干细胞的影响与内源造血干细胞修复作用的诱导和非抗细胞凋亡作用一致，这是因为所述疗法是在暴露于辐射后24小时施用的，这超出了细胞保护剂的效力窗（window of efficacy）。因此，数据表明AMDAC通过涉及造血重建的机制来治疗辐射损伤。

等同性：

本发明未受限于本文所述的具体实施方式的范围。的确，除所述那些以外，通过上述说明和附图本发明的多种改变将对本领域技术人员是显而易见的。这些改变旨在处于所附权利要求的范围内。

在本文中引用了多个出版物、专利和专利申请，以上出版物、专利和专利申请的公开内容以其全部内容作为参考并入。

Claims

1.一种治疗已暴露于辐射的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的分离的羊膜来源的贴壁细胞（AMDAC），其中所述细胞贴壁至组织培养塑料，并且其中所述细胞是OCT-4^–（八聚物结合蛋白4），可通过RT-PCR确定。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述辐射是电离辐射。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述辐射是β辐射、γ幅射或X射线。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述辐射是α辐射。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述辐射是中子辐射。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述辐射是0.01mSv至0.1mSv（0.001rem至0.01rem）之间的单一剂量。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述辐射是1mSv至10mSv（0.1rem至1.0rem）（001Gy至0.01Gy）之间的单一剂量。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述辐射是10mSv至100mSv（1rem至10rem）（0.01Gy至0.1Gy）之间的单一剂量。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述辐射是100mSv至1000mSv（10rem至100rem）（0.1Gy至1.0Gy）之间的单一剂量。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述辐射是1000mSv至2000mSv（100rem至200rem）（1Gy至2Gy）之间的单一剂量。

11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述辐射是2000mSv至3000mSv（200rem至300rem）（2Gy至3Gy）之间的单一剂量。

12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述辐射是3000mSv至4000mSv（300rem至400rem）（3Gy至4Gy）之间的单一剂量。

13.根据权利要求1所述的方法，其中，所述辐射是5000mSv至10000mSv（500rem至1000rem）（5Gy至10Gy）之间的单一剂量。

14.根据权利要求1所述的方法，其中，所述辐射是10000mSv至100000mSv（1000rem至10000rem）（10Gy至100Gy）之间的慢性暴露。

15.根据权利要求1所述的方法，其中，所述辐射是0.01mSv至0.1mSv（0.001rem至0.01rem）之间的慢性暴露。

16.根据权利要求1所述的方法，其中，所述辐射是1mSv至10mSv（0.1rem至1.0rem）（001Gy至0.01Gy）之间的慢性暴露。

17.根据权利要求1所述的方法，其中，所述辐射是10mSv至100mSv（1rem至10rem）（0.01Gy至0.1Gy）之间的慢性暴露。

18.根据权利要求1所述的方法，其中，所述辐射是100mSv至1000mSv（10rem至100rem）（0.1Gy至1.0Gy）之间的慢性暴露。

19.根据权利要求1所述的方法，其中，所述辐射是1000mSv至2000mSv（100rem至200rem）（1Gy至2Gy）之间的慢性暴露。

20.根据权利要求1所述的方法，其中，所述辐射是2000mSv至3000mSv（200rem至300rem）（2Gy至3Gy）之间的慢性暴露。

21.根据权利要求1所述的方法，其中，所述辐射是3000mSv至4000mSv（300rem至400rem）（3Gy至4Gy）之间的慢性暴露。

22.根据权利要求1所述的方法，其中，所述辐射是5000mSv至10000mSv（500rem至1000rem）（5Gy至10Gy）之间的慢性暴露。

23.根据权利要求1所述的方法，其中，所述辐射是10000mSv至100000mSv（1000rem至10000rem）（10Gy至100Gy）之间的慢性暴露。

24.根据权利要求15-23中任一项所述的方法，其中，所述慢性暴露是在1-6天。

25.根据权利要求15-23中任一项所述的方法，其中，所述慢性暴露是在7-13天。

26.根据权利要求15-23中任一项所述的方法，其中，所述慢性暴露是在14-27天。

27.根据权利要求15-23中任一项所述的方法，其中，所述慢性暴露是在28-56天。

28.根据权利要求1所述的方法，其中，由于所述暴露于辐射，所述个体已发展或有可能发展急性辐射综合征或急性辐射综合征的症状。

29.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述施用时，所述个体尚未发展急性辐射综合征的一种或多种症状。

30.根据权利要求28所述的方法，其中，所述一种或多种症状包括恶心、呕吐、腹泻、发烧和/或头痛中的一种或多种。

31.根据权利要求28所述的方法，其中，所述一种或多种症状包括紫癜、虚弱、疲劳、感染、脱发、暴露组织的水泡或坏死、和/或出血。

32.根据权利要求28所述的方法，其中，所述一种或多种症状包括神经功能缺损、认知损害、共济失调、震颤和/或癫痫。

33.根据权利要求28所述的方法，其中，所述一种或多种症状包括白细胞减少。

34.根据权利要求1所述的方法，其中，所述个体暴露于来自未接触所述个体身体的源的辐射。

35.根据权利要求1所述的方法，其中，所述个体暴露于由于放射源接触所述个体的身体而造成的辐射。

36.根据权利要求1所述的方法，其中，所述个体由于所述个体吸入或摄入放射源而暴露于辐射。

37.根据权利要求1所述的方法，其中，所述施用在所述暴露的96小时内进行。

38.根据权利要求1所述的方法，其中，所述施用在所述暴露的72小时内进行。

39.根据权利要求1所述的方法，其中，所述施用在所述暴露的48小时内进行。

40.根据权利要求1所述的方法，其中，所述施用在所述暴露的24小时内进行。

41.根据权利要求1所述的分离的细胞，其中，所述细胞是HLA-G^–，可通过RT-PCR确定。

42.根据权利要求1所述的分离的细胞，其中，所述细胞另外是CD49f⁺，可通过流式细胞术确定。

43.根据权利要求3所述的分离的细胞，其中，所述AMDAC是OCT-4^–、HLA-G^–和CD49f⁺。

44.根据权利要求1所述的分离的细胞，其中，所述AMDAC是CD90⁺、CD105⁺或CD117^–，可通过流式细胞术确定。

45.根据权利要求44所述的分离的细胞，其中，所述AMDAC是CD90⁺、CD105⁺和CD117^–，可通过流式细胞术可确定。

46.根据权利要求45所述的分离的细胞，其中，所述AMDAC是OCT-4^–和HLA-G^–，通过RT-PCR确定，和CD49f⁺、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–，可通过流式细胞术确定。

47.根据权利要求1所述的分离的细胞，其中，所述AMDAC是VEGFR1/Flt-1⁺（血管内皮生长因子受体1）和VEGFR2/KDR⁺（血管内皮生长因子受体2），可通过免疫定位确定。

48.根据权利要求1所述的分离的细胞，其中，所述AMDAC是CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD98⁺、Tie-2⁺（血管生成素受体）、TEM-7⁺（肿瘤血管内皮标志物7）、CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–、CD143^–（血管紧张素I转化酶，ACE）、CD146^–（黑素瘤细胞粘附分子）或CXCR4^–（趋化因子（C-X-C基序）受体4）中的一种或多种，可通过免疫定位确定。

49.根据权利要求1所述的分离的细胞，其中，所述AMDAC是CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD98⁺、Tie-2⁺（血管生成素受体）、TEM-7⁺（肿瘤血管内皮标志物7）、CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–、CD143^–、CD146^–和CXCR4^–，可通过免疫定位确定。

50.根据权利要求1所述的分离的细胞，其中，所述细胞是VE-钙粘素^–，可通过免疫定位确定。

51.根据权利要求1所述的分离的细胞，其中，所述AMDAC另外对CD105⁺和CD200⁺是阳性的，可通过免疫定位确定。

52.根据权利要求1所述的分离的细胞，其中，在暴露于50ng/mLVEGF7天后，所述AMDAC不表达CD34，可通过免疫定位确定。

53.包含权利要求1所述的AMDAC的分离的细胞群体，其中，所述群体中至少50%的所述细胞是权利要求1所述的细胞。

54.根据权利要求53所述的分离的细胞群体，其中，所述群体中至少80%的所述细胞是权利要求1所述的AMDAC。

55.根据权利要求54所述的分离的细胞群体，其中，所述群体中至少90%的所述细胞是权利要求1所述的AMDAC。

56.包含根据权利要求1或41-52中任一项所述的AMDAC的组合物。

57.包含权利要求53所述的AMDAC的所述分离的细胞群体，其中，所述群体还包含分离的第二类型细胞，并且其中所述群体不是羊膜、羊膜部分或羊膜匀浆。

58.根据权利要求57所述的分离的细胞群体，其中，所述第二类型细胞是胚胎干细胞、血细胞、分离自周围血的干细胞、分离自胎盘血的干细胞、分离自胎盘灌流液的干细胞、分离自胎盘组织的干细胞、分离自脐带血的干细胞、脐带干细胞、骨髓源间质干细胞、骨髓源间充质基质细胞、造血干细胞、成体干细胞、软骨细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、内皮细胞、成血管细胞、内皮祖细胞、外膜细胞、心肌细胞、肌细胞、心肌成肌细胞、成肌细胞、或操纵以类似于胚胎干细胞的细胞。

59.根据权利要求57或58所述的分离的细胞群体，其中，所述第二类型细胞占所述群体中至少10%的细胞。

60.根据权利要求57或58所述的分离的细胞群体，其中，所述第二类型细胞占所述群体中至少25%的细胞。

61.根据权利要求57或58所述的分离的细胞群体，其中，所述第二类型细胞是造血干细胞或祖细胞。

62.根据权利要求61所述的分离的群体，其中，所述造血干细胞或祖细胞是CD34⁺细胞。

63.根据权利要求1所述的方法，其中，所述AMDAC贴壁至组织培养塑料；其中所述细胞是OCT-4^–，通过RT-PCR确定，并且是CD49f⁺、HLA-G^–、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–，通过免疫定位确定；并且其中所述AMDAC：

（a）表达CD9、CD10、CD44、CD54、CD98、CD200、Tie-2、TEM-7、VEGFR1/Flt-1或VEGFR2/KDR（CD309）中的一种或多种，可通过免疫定位确定；

（b）缺乏CD31、CD34、CD38、CD45、CD133、CD143、CD144、CD146、CD271、CXCR4、HLA-G或VE-钙粘素的表达，可通过免疫定位确定，或缺乏SOX2的表达，可通过RT-PCR确定；

（c）表达ACTA2、ADAMTS1、AMOT、ANG、ANGPT1、ANGPT2、ANGPTL1、ANGPTL2、ANGPTL4、BAI1、CD44、CD200、CEACAM1、CHGA、COL15A1、COL18A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、CSF3、CTGF、CXCL12、CXCL2、DNMT3B、ECGF1、EDG1、EDIL3、ENPP2、EPHB2、FBLN5、F2、FGF1、FGF2、FIGF、FLT4、FN1、FST、FOXC2、GRN、HGF、HEY1、HSPG2、IFNB1、IL8、IL12A、ITGA4、ITGAV、ITGB3、MDK、MMP2、MYOZ2、NRP1、NRP2、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、PECAM1、PF4、PGK1、PROX1、PTN、SEMA3F、SERPINB5、SERPINC1、SERPINF1、TIMP2、TIMP3、TGFA、TGFB1、THBS1、THBS2、TIE1、TIE2/TEK、TNF、TNNI1、TNFSF15、VASH1、VEGF、VEGFB、VEGFC、VEGFR1/FLT1或VEGFR2/KDR的mRNA；

（d）表达蛋白质CD49d、连接蛋白-43、HLA-ABC、β2-微球蛋白、CD349、CD318、PDL1、CD106、半乳凝素-1、ADAM17、血管紧张肽原前体、细丝蛋白A、α-辅肌动蛋白1、巨蛋白、巨噬细胞乙酰化的LDL受体I和II、活化素受体IIB型前体、Wnt-9蛋白、胶质原纤维酸性蛋白、星形细胞、肌球蛋白-结合蛋白C或肌球蛋白重链，非肌A型中的一种或多种；

（e）向培养AMDAC的培养基中分泌VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、卵泡抑素、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR或半乳凝素-1；

（f）以高于同等数量的骨髓源间质干细胞的水平表达下述微小RNA：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92或miR-296，；

（g）以低于同等数量的骨髓源间质干细胞的水平表达下述微小RNA：miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b或miR-16，；

（h）表达下述miRNA：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b或miR-16；或

（i）与在21%O₂条件下CD202b、IL-8或VEGF的表达相比，当在低于约5%O₂中培养时，表达较高水平的CD202b、IL-8或VEGF。

64.根据权利要求63所述的方法，其中，所述AMDAC是OCT-4^–，通过RT-PCR确定，并且是CD49f⁺、HLA-G^–、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–，可通过免疫定位确定；并且其中所述AMDAC：

（a）表达CD9、CD10、CD44、CD54、CD98、CD200、Tie-2、TEM-7、VEGFR1/Flt-1和/或VEGFR2/KDR（CD309），可通过免疫定位确定；

（b）缺乏CD31、CD34、CD38、CD45、CD133、CD143、CD144、CD146、CD271、CXCR4、HLA-G和/或VE-钙粘素的表达，可通过免疫定位确定，和/或缺乏SOX2的表达，可通过RT-PCR确定；

（c）表达ACTA2、ADAMTS1、AMOT、ANG、ANGPT1、ANGPT2、ANGPTL1、ANGPTL2、ANGPTL4、BAI1、CD44、CD200、CEACAM1、CHGA、COL15A1、COL18A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、CSF3、CTGF、CXCL12、CXCL2、DNMT3B、ECGF1、EDG1、EDIL3、ENPP2、EPHB2、FBLN5、F2、FGF1、FGF2、FIGF、FLT4、FN1、FST、FOXC2、GRN、HGF、HEY1、HSPG2、IFNB1、IL8、IL12A、ITGA4、ITGAV、ITGB3、MDK、MMP2、MYOZ2、NRP1、NRP2、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、PECAM1、PF4、PGK1、PROX1、PTN、SEMA3F、SERPINB5、SERPINC1、SERPINF1、TIMP2、TIMP3、TGFA、TGFB1、THBS1、THBS2、TIE1、TIE2/TEK、TNF、TNNI1、TNFSF15、VASH1、VEGF、VEGFB、VEGFC、VEGFR1/FLT1和/或VEGFR2/KDR的mRNA；

（d）表达蛋白质CD49d、连接蛋白-43、HLA-ABC、β2-微球蛋白、CD349、CD318、PDL1、CD106、半乳凝素-1、ADAM17、血管紧张肽原前体、细丝蛋白A、α-辅肌动蛋白1、巨蛋白、巨噬细胞乙酰化的LDL受体I和II、活化素受体IIB型前体、Wnt-9蛋白、胶质原纤维酸性蛋白、星形细胞、肌球蛋白-结合蛋白C和/或肌球蛋白重链，非肌A型中的一种或多种；

（e）向培养AMDAC的培养基中分泌VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、卵泡抑素、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR和半乳凝素-1中的一种或多种；

（f）以高于同等数量的骨髓源间质干细胞的水平表达下述微小RNA：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92和/或miR-296，；

（g）以低于同等数量的骨髓源间质干细胞的水平表达下述微小RNA：miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b和/或miR-16，；

（h）表达下述miRNA：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b和/或miR-16；和

（i）与在21%O₂条件下CD202b、IL-8和/或VEGF的表达相比，当在低于约5%O₂中培养时，表达较高水平的CD202b、IL-8和/或VEGF。