CN103403150A

CN103403150A - 利用羊膜来源贴壁细胞治疗与免疫相关的疾病和紊乱

Info

Publication number: CN103403150A
Application number: CN2011800679163A
Authority: CN
Inventors: 斯图尔特·阿博特; 詹姆士·W·爱丁格; 亚历山大·弗兰茨基; 弗拉基米尔·扬科维奇; 毕涛·梁
Original assignee: Anthrogenesis Corp
Current assignee: Clarity Acquisition II LLC
Priority date: 2010-12-17
Filing date: 2011-12-15
Publication date: 2013-11-20
Also published as: US20120164114A1; CA2821809C; JP2014501249A; KR20230005417A; KR20200133393A; KR20190114045A; ES2599331T3; MX2013006791A; EP2652126A1; KR20210144909A; NZ611981A; AU2011343736A1; MX345730B; KR20180100250A; KR20130128438A; CA2821809A1; KR20240019854A; EP2652126A4; EP2652126B1; WO2012083021A1

Abstract

本文提供利用羊膜来源贴壁细胞和这类细胞的群以及包含这类细胞的组合物来调节免疫应答的方法。在各种实施方式中，该免疫应答是移植物抗宿主病、过敏症、哮喘或与免疫相关的疾病或紊乱，例如自身免疫性疾病。

Description

利用羊膜来源贴壁细胞治疗与免疫相关的疾病和紊乱

本申请要求2010年12月17日提交的申请号为61/424,593的美国临时申请的优先权，所述美国临时申请以引用方式全部并入本文。

1.技术领域

本文提供体内或体外调节，例如降低，免疫应答的方法，包括使一种或多种类型的免疫细胞与有效量的羊膜来源贴壁细胞（称为AMDAC）接触。本文还提供对患有不需要或不适当的免疫应答（例如自身免疫性疾病、移植物抗宿主病、过敏症或哮喘）的个体进行治疗的方法，包括向这类个体施用AMDAC。

2.发明背景

炎症性以及与免疫相关的疾病以及病症，例如自身免疫性疾病、移植物抗宿主病、过敏症和哮喘，继续是重要的医疗问题。需要改进这类病症的疗法。

3.发明概述

一方面，本文提供对患有与不适当或不需要的免疫应答有关或由所述免疫应答所引起的疾病或紊乱或有罹患所述疾病或紊乱的风险的个体进行治疗的方法，包括向所述个体施用治疗有效量的羊膜来源贴壁细胞（AMDAC）或AMDAC条件培养基，其中所述治疗有效量是足以对所述疾病、紊乱或病症的一种或多种症状产生可检测到的改善效果的量，以及其中所述AMDAC通过逆转录酶聚合酶链式反应（RT-PCR）可测定为OCT-4^–（对OCT-4是阴性的；OCT-4还被称为POU5F1或八聚体结合蛋白4），以及贴附于组织培养塑料。

在具体的实施方式中，所述疾病或紊乱是由促炎症应答（例如Th1应答或Th17应答）所引起的或与其有关，以及施用所述AMDAC则抑制所述促炎症应答，例如所述Th1应答或Th17应答。在具体的实施方式中，该方法包括使介导所述Th1或Th17应答的T细胞（例如CD4⁺T淋巴细胞或白细胞）接触AMDAC。在具体的实施方式中，可检测到，所述接触降低了Th1细胞的成熟。在该方法的具体实施方式中，可检测到，所述接触减少了所述T细胞（例如所述个体体内）或抗原生成细胞对如下一种或多种的生产：淋巴毒素-1α（LT-1α）、白介素-1β（IL-1β）、IL-12、IL-17、IL-21、IL-23、肿瘤坏死因子α（TNFα）和/或干扰素γ（IFNγ）。在该方法的另一具体实施方式中，所述接触加强或上调调节性T细胞（Treg）表型，和/或降低促进Th1和/或Th17应答（例如CD80、CD83、CD86、ICAM-1、HLA-II）的生物分子在树突细胞（DC）和/或巨噬细胞中的表达。在具体的实施方式中，还使所述T细胞接触IL-10，例如并非由所述T细胞产生的外源性IL-10或IL-10，例如重组IL-10。

在上述任意治疗方法的具体实施方式中，所述疾病或紊乱是过敏症、哮喘、或对对所述个体来说是外源性的抗原产生的反应。在上述任意治疗方法的另一具体实施方式中，所述疾病或紊乱是移植物抗宿主病。

在上述任意治疗方法的另一具体实施方式中，所述疾病或紊乱是自身免疫性疾病。在某些具体的实施方式中，所述自身免疫性疾病是炎症性肠病（例如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎）、多发性硬化症、风湿性关节炎、牛皮癣、红斑狼疮、糖尿病、蕈样霉菌病或硬皮症。在某些其他具体的实施方式中，所述自身免疫性疾病如下一种或多种：阿狄森氏病、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂抗体综合症、抗磷脂综合症（原发性或继发性）、哮喘、自身免疫性胃炎、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病、自身免疫性淋巴组织增生病、自身免疫性血小板减少性紫癜、巴洛病、贝切特氏病、大疱性类天疱疮、心肌症、乳糜泻、查加斯病、慢性炎症性脱髓鞘性多神经病、疤痕性类天疱疮（例如粘膜类天疱疮）、冷凝集素病、德戈斯病、疱疹样皮炎（hepatiformis）、皮肌炎（幼年型）、特发性混合型冷沉淀球蛋白血症、古德帕斯彻氏综合症、格雷夫斯氏病、格-巴二氏综合症、桥本氏甲状腺炎（桥本氏病；自身免疫性甲状腺炎）、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜、IgA肾病、幼年型关节炎、扁平苔癣、梅尼埃病、混合型结缔组织病、硬斑病、假麻痹性重症肌无力、发作性睡病、神经性肌强直、儿童自身免疫性神经精神障碍（PANDA）、慢性天疱疮、恶性贫血、结节性动脉周围炎、多软骨炎、风湿性多肌痛、多肌炎（例如皮肌炎）、原发性丙种球蛋白缺乏症、原发性胆汁性肝硬变、雷诺病（雷诺现象）、莱特尔氏病、复发性多软骨炎、风湿热、斯耶格伦氏综合症、僵人综合症（Moersch-Woltmann综合症）、高安氏动脉炎、颞动脉炎（巨细胞性动脉炎）、葡萄膜炎、血管炎（例如与红斑狼疮无关的血管炎）、白癫风和/或韦格内氏肉芽肿症。

在具体的实施方式中，其中所述自身免疫性疾病是炎症性肠病，所述炎症性肠病是克罗恩氏病。在更具体的实施方式中，所述克罗恩氏病是胃十二指肠克罗恩氏病、空肠回肠炎、回肠结肠炎或克罗恩氏结肠炎。在另一具体的实施方式中，所述炎症性肠病是溃疡性结肠炎。在某些具体的实施方式中，所述溃疡性结肠炎是全结肠炎、限性结肠炎、远端结肠炎或直肠炎。在某些具体的实施方式中，炎症性肠病（例如克罗恩氏病）的所述症状是如下的一种或多种：部分胃肠（GI）道发炎和肿胀、腹痛、频繁的肠道排空、腹泻、直肠出血、贫血、减重、关节炎、皮肤问题、发烧、肠壁增厚、个体肠内疤痕组织的形成、个体肠内疮口或溃疡的形成、个体肠内壁一处或多处瘘管的形成、个体肛门内一处或多处裂缝的形成、患营养缺乏（例如蛋白、热量、维生素的一种或多种的缺乏）、患肾结石或患胆结石。在某些其他具体的实施方式中，炎症性肠病（例如溃疡性结肠炎）的所述症状是如下一种或多种：腹痛、血性腹泻、发烧、恶心、腹部痛性痉挛、贫血、疲劳、减重、食欲不振、直肠出血、体液和营养流失、皮肤病损、关节痛和发育不足。在另一更具体的实施方式中，所述症状是骨质疏松症，眼炎或肝病。

在本文披露的所述治疗方法的另一实施方式中，所述疾病或紊乱是硬皮症。在具体的实施方式中，该硬皮症是弥漫性硬皮症、限性硬皮症（CREST综合症）、硬斑病或线形硬皮症。在某些具体的实施方式中，硬皮症的所述症状包括如下的一种或多种：面部皮肤硬化、手指皮肤硬化、雷诺氏综合症、肢体中不适当的血管收缩、钙质沉着、毛细管扩张或食道运动功能障碍。

在本文披露的所述治疗方法的另一实施方式中，所述疾病或紊乱是牛皮癣。在某些具体的实施方式中，牛皮癣的所述症状是如下一种或多种：牛皮癣关节炎、皮肤鳞屑、皮肤发红、皮肤增厚、斑块的形成、指甲板下变色、指甲凹陷、指甲横纹、指甲下皮肤增厚、甲松离、脓泡的形成、关节或结缔组织发炎、皮肤发炎或皮肤剥落。

在本文披露的所述治疗方法的另一实施方式中，所述疾病或紊乱是多发性硬化症。在某些具体的实施方式中，多发性硬化症的所述症状是如下一种或多种：个体的肢体感觉障碍、视神经功能障碍、锥体束功能障碍、膀胱功能障碍、肠功能障碍、性功能障碍、运动失调或复视。

在本文披露的所述治疗方法的另一实施方式中，所述疾病或紊乱是类风湿性关节炎。在某些具体的实施方式中，所述类风湿性关节炎涉及如下一种或多种：坏疽性脓皮病、嗜中性皮肤病、斯威特氏综合症、病毒性感染、结节性红斑、小叶性脂膜炎、趾皮肤萎缩、掌红斑、弥漫性稀疏（宣纸皮肤）、皮肤脆性、外表面上（例如手肘上）皮下结节、肺部纤维化（例如氨甲蝶呤疗法所导致的肺部纤维化）、卡普兰氏结节、血管炎性紊乱、甲皱梗塞、神经病变、肾病、淀粉样变性病、假性肌肥大、心内膜炎、左心衰竭、心瓣炎、巩膜软化症、多发性神经炎或寰枢椎不全脱位。

在本文披露的所述治疗方法的另一实施方式中，所述疾病或紊乱是红斑狼疮。在某些具体的实施方式中，红斑狼疮的所述症状是如下一种或多种：面颊疹、皮肤上形成厚的鳞屑红斑、秃头症、口腔溃疡、鼻腔溃疡、阴道溃疡、皮肤病损、关节痛、营养性贫血、铁缺乏症、低于正常的血小板和白细胞数、抗磷脂抗体综合症、血液中存在抗心磷脂抗体、心包炎、心肌炎、心内膜炎、肺炎、胸膜炎、肋膜炎、胸膜腔积液、狼疮性肺炎、肺动脉高血压、肺栓子、肺出血、自身免疫性肝炎、黄疸、血液中存在抗核抗体（ANA）、血液中存在平滑肌抗体（SMA）、血液中存在肝/肾微粒体抗体（LKM-1）、血液中存在抗线粒体抗体（AMA）、血尿症、蛋白尿、狼疮性肾炎、肾衰竭、患上具有“线圈”异常的膜性肾小球肾炎、发作、精神病、脑脊髓液异常、个体的T细胞中缺乏CD45磷酸酶和/或CD40配体的表达上升、狼疮性肠胃炎、狼疮性胰腺炎、狼疮性膀胱炎、自身免疫性内耳病、副交感神经功能障碍、视网膜血管炎、系统性血管炎、FcεRIγ的表达上升、T细胞中钙水平上升并持续、血液中肌醇三磷酸增加、蛋白激酶C磷酸化作用减弱、Ras-MAP激酶信号减弱或蛋白激酶AI活性缺乏。

在本文披露的所述治疗方法的另一实施方式中，所述疾病或紊乱是糖尿病。在某些具体的实施方式中，所述症状是如下一种或多种：血糖异常高、通过葡萄糖耐量试验测定缺乏抗胰岛素性、疲劳或意识丧失。

在本文披露的所述治疗方法的另一实施方式中，所述疾病、紊乱或病症是蕈样霉菌病（Alibert-Bazin综合症）。在某些具体的实施方式中，所述蕈样霉菌病处于红斑阶段、皮肤肿瘤阶段、皮肤发红（红皮病）阶段或淋巴结阶段。在某些其他具体的实施方式中，蕈样霉菌病的所述症状是如下一种或多种：形成发痒的扁平红斑、形成鼓起的扁平硬红斑（斑块）、形成鼓起的肿块（结节）、身体上形成发痒的大块红鳞屑区、手掌和脚底的皮肤开裂、手掌和脚底的皮肤增厚或淋巴结发炎。

可用于本文披露的所述治疗方法的AMDAC可以通过细胞和遗传标记的不同组合来确认。在具体的实施方式中，例如，所述AMDAC通过RT-PCR测定为OCT-4^–。在另一实施方式中，该AMDAC通过流式细胞术测定是CD49f⁺。在仍然另一实施方式中，该AMDAC通过RT-PCR以及流式细胞术测定分别是OCT-4^–以及CD49f⁺。在仍然另一实施方式中，该AMDAC通过免疫定位（例如流式细胞术）测定是CD49f⁺、CD105⁺和CD200⁺。在另一实施方式中，该AMDAC通过RT-PCR测定是OCT-4^–以及通过免疫定位（例如流式细胞术）测定是CD49f⁺、CD105⁺和CD200⁺。在另一具体的实施方式中，所述AMDAC通过免疫定位（例如流式细胞术）测定对VEGFR1/Flt-1（血管内皮生长因子受体1）或CD309（还被称为VEGFR2/KDR（血管内皮生长因子受体2））是阳性的。在另一具体的实施方式中，所述AMDAC通过流式细胞术测定是CD90⁺和CD117^–以及通过RT-PCR测定是HLA-G–。在另一具体的实施方式中，所述AMDAC通过RT-PCR测定是OCT-4^–和HLA-G^–以及通过免疫定位（例如流式细胞术）测定是CD49f⁺、CD90⁺、CD105⁺和/或CD117^–。在另一具体的实施方式中，任何上述AMDAC通过免疫定位（例如流式细胞术）测定附加地为如下一种或多种：CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD98⁺、Tie-2⁺（血管生成素受体）、TEM-7⁺（肿瘤内皮标记7）、CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–、CD143^–、CD146^–或CXCR4^–（趋化因子（C-X-C基序）受体4）。在另一具体的实施方式中，任何上述AMDAC通过免疫定位（例如流式细胞术）测定附加地为CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD98⁺、Tie-2⁺、TEM-7⁺、CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–、CD143^–、CD146^–和CXCR4^–。

在另一具体的实施方式中，该AMDAC通过例如短期神经分化分析（见，例如下文6.3.3部分）测定是GFAP⁺。在另一具体的实施方式中，该AMDAC通过例如短期神经分化分析（见，例如下文6.3.3部分）测定是β-微管蛋白III（Tuj1）⁺。在另一具体的实施方式中，该AMDAC是OCT-4^–、GFAP⁺和β-微管蛋白III（Tuj1）⁺。在另一具体的实施方式中，本文所述的AMDAC是OCT-4^–、CD200⁺、CD105⁺和CD49f⁺。在另一具体的实施方式中，该AMDAC是CD200⁺、CD105⁺、CD90⁺和CD73⁺。在另一具体的实施方式中，本文所述的AMDAC是CD117^–以及并非利用CD117的抗体选定。在另一具体的实施方式中，该AMDAC是CD146^–以及并非利用CD146的抗体选定。在另一具体的实施方式中，该AMDAC通过RT-PCR和/或免疫定位（例如流式细胞术）测定是OCT-4^–以及用VEGF诱导后并不表达CD34。在另一具体的实施方式中，所述AMDAC通过RT-PCR测定是OCT-4^–以及通过免疫定位（例如流式细胞术）测定是CD49f⁺、HLA-G^–、CD90⁺、CD105⁺、CD117^–和CD200⁺。

在另一具体的实施方式中，可用于本文所述的方法的AMDAC通过短期神经分化分析（见，例如下文6.3.3部分）测定是神经原性的。在另一具体的实施方式中，可用于本文所述的方法的AMDAC通过体外软骨形成潜能分析（见，例如下文6.3.2部分）测定是没有软骨形成的。在另一具体的实施方式中，可用于本文所述的方法的AMDAC通过成骨表型分析（见，例如下文6.3.1部分）测定是非成骨性的。在另一具体的实施方式中，本文所述的AMDAC在补充有100nM地塞米松、10mMβ-磷酸甘油、50μML-抗坏血酸-2-磷酸盐，pH7.4的DMEM（高糖）中培养长达6周（例如达2周、4周或6周）之后是非成骨性的，其中成骨作用利用冯库萨染色法；茜素红染色法；或通过利用，例如RT-PCR检测骨桥蛋白、骨钙蛋白、骨粘连蛋白和/或骨唾液蛋白的存在来评估。

在更具体的实施方式中，任何上述AMDAC附加地：（a）通过免疫定位（例如流式细胞术）测定表达如下一种或多种：CD9、CD10、CD44、CD54、CD98、CD200、Tie-2、TEM-7、VEGFR1/Flt-1或VEGFR2/KDR（CD309）；（b）通过免疫定位（例如流式细胞术）测定缺乏如下一种或多种的表达：CD31、CD34、CD38、CD45、CD133、CD143、CD144、CD146、CD271、CXCR4、HLA-G或VE-钙粘着蛋白；（c）通过RT-PCR测定缺乏SOX2的表达；（d）表达如下一种或多种mRNA：ACTA2、ADAMTS1、AMOT、ANG、ANGPT1、ANGPT2、ANGPTL1、ANGPTL2、ANGPTL4、BAI1、c-myc、CD44、CD140a、CD140b、CD200、CD202b、CD304、CD309、CEACAM1、CHGA、COL15A1、COL18A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、连接蛋白-3、CSF3、CTGF、CXCL12、CXCL2、DNMT3B、ECGF1、EDG1、EDIL3、ENPP2、EPHB2、FBLN5、F2、FGF1、FGF2、FIGF、FLT4、FN1、FST、FOXC2、半乳凝素-1、GRN、HGF、HEY1、HSPG2、IFNB1、IL8、IL12A、ITGA4、ITGAV、ITGB3、KLF-4、MDK、MMP2、MYOZ2、NRP2、PDGFB、PF4、PGK1、PROX1、PTN、SEMA3F、SERPINB5、SERPINC1、SERPINF1、TGFA、TGFB1、THBS1、THBS2、TIE1、TIMP2、TIMP3、TNF、TNNC1、TNNT2、TNFSF15、VASH1、VEGF、VEGFB、VEGFC或VEGFR1/FLT1；（e）产生如下一种或多种：蛋白CD49d、连接蛋白-43、HLA-ABC、Β 2-微球蛋白、CD349、CD318、PDL1、CD106、半乳凝素-1、ADAM 17、血管紧张肽原前体、细丝蛋白A、α-辅肌动蛋白1、巨蛋白、巨噬细胞乙酰化的LDL受体I和II、活化素受体IIB型前体、Wnt-9蛋白、胶质细胞原纤维酸性蛋白、星形细胞、肌球蛋白-结合蛋白C或肌球蛋白重链、非肌型A；（f）向所述AMDAC生长的培养基中分泌如下一种或多种：血管内皮生长因子（VEGF）、肝细胞生长因子（HGF）、白介素-8（IL-8）、单核细胞趋化蛋白-3（MCP-3）、FGF2、卵泡抑素、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR或半乳凝素-1；（g）以高于相同数量骨髓来源间质干细胞的水平表达如下一种或多种：微RNA miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92或miR-296；（h）以低于相同数量骨髓来源间质干细胞的水平表达如下一种或多种：微RNA miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b或miR-16；（i）表达如下一种或多种：微RNA miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b和/或miR-16；或（j）与在21% O₂中培养时CD202b、IL-8或VEGF的表达相比，在少于约5% O₂中培养时以更高的水平表达：CD202b、IL-8或VEGF。在更具体的实施方式中，所述AMDAC通过RT-PCR测定是OCT-4^–以及通过免疫定位（例如流式细胞术）测定是CD49f⁺、HLA-G^–、CD90⁺、CD105⁺、CD117^–和CD200⁺。在另一具体的实施方式中，所述AMDAC通过RT-PCR测定是OCT-4^–以及通过免疫定位（例如流式细胞术）测定是CD49f⁺、HLA-G^–、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–以及其中所述AMDAC附加地：（a）通过免疫定位（例如流式细胞术）测定表达CD9、CD10、CD44、CD54、CD98、CD200、Tie-2、TEM-7、VEGFR1/Flt-1和VEGFR2/KDR（CD309）；（b）通过免疫定位（例如流式细胞术）测定缺乏CD31、CD34、CD38、CD45、CD133、CD143、CD144、CD146、CD271、CXCR4、HLA-G和VE-钙粘着蛋白的表达；（c）通过RT-PCR测定缺乏SOX2的表达；（d）通过RT-PCR测定表达如下mRNA：ACTA2、ADAMTS1、AMOT、ANG、ANGPT1、ANGPT2、ANGPTL1、ANGPTL2、ANGPTL4、BAI1、c-myc、CD44、CD140a、CD140b、CD200、CD202b、CD304、CD309、CEACAM1、CHGA、COL15A1、COL18A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、连接蛋白-3、CSF3、CTGF、CXCL12、CXCL2、DNMT3B、ECGF1、EDG1、EDIL3、ENPP2、EPHB2、FBLN5、F2、FGF1、FGF2、FIGF、FLT4、FN1、FST、FOXC2、半乳凝素-1、GRN、HGF、HEY1、HSPG2、IFNB1、IL8、IL12A、ITGA4、ITGAV、ITGB3、KLF-4、MDK、MMP2、MYOZ2、NRP2、PDGFB、PF4、PGK1、PROX1、PTN、SEMA3F、SERPINB5、SERPINC1、SERPINF1、TGFA、TGFB1、THBS1、THBS2、TIE1、TIMP2、TIMP3、TNF、TNNC1、TNNT2、TNFSF15、VASH1、VEGF、VEGFB、VEGFC和VEGFR1/FLT1；（e）产生蛋白CD49d、连接蛋白-43、HLA-ABC、Β 2-微球蛋白、CD349、CD318、PDL1、CD106、半乳凝素-1、ADAM 17、血管紧张肽原前体、细丝蛋白A、α-辅肌动蛋白1、巨蛋白、巨噬细胞乙酰化的LDL受体I和II、活化素受体IIB型前体、Wnt-9蛋白、胶质细胞原纤维酸性蛋白、星形细胞、肌球蛋白-结合蛋白C和/或肌球蛋白重链、非肌型A；（f）向细胞生长的培养基中分泌VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、卵泡抑素、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR和半乳凝素-1；（g）以高于相同数量骨髓来源间质干细胞的水平表达微RNA miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92和miR-296；（h）以低于相同数量骨髓来源间质干细胞的水平表达微RNA miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b和miR-16；（i）表达miRNA miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b和miR-16；或（j）与在21% O₂条件下的CD202b、IL-8和/或VEGF的表达相比，在少于约5% O₂中培养时以更高的水平表达CD202b、IL-8和/或VEGF。

在其他的实施方式中，例如，该羊膜来源贴壁细胞贴附于组织培养塑料以及例如与合适的对照细胞系，例如胚胎性癌源性干细胞系（例如NTERA-2，例如可购自美国模式培养物保藏所，ATCC号CRL-1973）相比，通过30轮RT-PCR测定是OCT-4^–。在具体的实施方式中，该细胞通过RT-PCR测定是 OCT-4^–以及通过免疫定位（例如流式细胞术）测定是VEGFR1/Flt-1⁺（血管内皮生长因子受体1）和/或VEGFR2/KDR⁺（血管内皮生长因子受体2，还被称为激酶插入域受体）。在另一具体的实施方式中，该细胞通过RT-PCR测定是OCT-4^–以及通过免疫定位（例如流式细胞术）测定是CD49f⁺（整联蛋白-α6⁺）。在具体的实施方式中，所述细胞通过RT-PCR测定是OCT-4^–以及通过RT-PCR测定是HLA-G^–。在另一具体的实施方式中，所述细胞通过RT-PCR测定是OCT-4^–以及通过免疫定位（例如流式细胞术）测定是CD90⁺、CD105⁺或CD117^–。在更具体的实施方式中，所述OCT-4^–细胞是CD90⁺、CD105⁺和CD117^–。在另一具体的实施方式中，该细胞通过例如30轮的RT-PCR测定是OCT-4^–以及并不表达SOX2。

在另一实施方式中，所述OCT-4^–细胞通过免疫定位（例如流式细胞术）测定是如下一种或多种：CD29⁺、CD73⁺、ABC-p⁺和CD38^–。

在另一具体的实施方式中，所述OCT-4^–羊膜来源贴壁细胞通过免疫定位（例如流式细胞术）测定附加地为如下一种或多种：CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD98⁺、Tie-2⁺（血管生成素受体）、TEM-7⁺（肿瘤内皮标记7）、CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–、CD143^–（血管紧张肽-I-转化酶，ACE）、CD146^–（黑素瘤细胞粘附分子）、CXCR4^–（趋化因子（C-X-C基序）受体4）。在更具体的实施方式中，所述羊膜来源贴壁细胞通过免疫定位（例如流式细胞术）测定是CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD98⁺、Tie-2⁺、TEM-7⁺、CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–、CD143^–、CD146^–和CXCR4^–。在另一更具体的实施方式中，本文提供的羊膜来源贴壁细胞通过RT-PCR测定是OCT-4^–；通过免疫定位（例如流式细胞术）测定是VEGFR1/Flt-1⁺和/或VEGFR2/KDR⁺；以及通过免疫定位（例如流式细胞术）测定是如下一种或多种或全部：CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–和/或Tie-2^–。在具体的实施方式中，对于OCT-4，例如>20轮（例如20-30轮）时，该羊膜来源贴壁细胞表达的PCR-扩增的mRNA与相同数量NTERA-2细胞相比少至少2 log。在另一具体的实施方式中，所述OCT-4^–细胞通过免疫定位（例如流式细胞术）测定附加地为VE-钙粘着蛋白^–（CD144^–）。在另一具体的实施方式中，所述OCT-4^–细胞通过免疫定位（例如流式细胞术）测定附加地为CD105⁺和CD200⁺阳性。在另一具体的实施方式中，所述OCT-4^–细胞暴露于1至100 ng/mL VEGF（血管内皮生长因子）4至21天之后，通过例如免疫定位（例如流式细胞术）检测，并不表达CD34。

在另一实施方式中，该羊膜来源贴壁细胞贴附于组织培养塑料以及通过RT-PCR测定是OCT-4^–以及SOX-2^–。在仍然另一实施方式中，所述细胞通过免疫定位（例如流式细胞术）测定是CD90⁺、CD105⁺和CD117^–。在具体的实施方式中，该OCT-4^–、SOX-2^–羊膜来源贴壁细胞通过免疫定位（例如流式细胞术）测定附加地为HLA-G^–或CD271^–。在更具体的实施方式中，所述细胞通过RT-PCR测定是OCT-4^–和SOX-2^–；以及通过免疫定位（例如流式细胞术）测定是CD90⁺、CD105⁺、CD117^–、CD271^–以及HLA-G^–。

在任何上述AMDAC的另一实施方式中以及除了任何上述AMDAC之外，所述细胞贴附于组织培养塑料以及是CD309阳性的（还被称为VEGFR2/KDR⁺）。

在另一实施方式中，可用于本文披露的所述治疗方法的羊膜来源贴壁细胞贴附于组织培养塑料，在例如>20轮（例如20-30轮）时通过RT-PCR测定是OCT-4^–以及通过免疫定位（例如流式细胞术）测定是如下一种或多种：VEGFR2/KDR⁺、CD9⁺、CD54⁺、CD105⁺、CD200⁺或VE-钙粘着蛋白^–。在具体的实施方式中，在例如>20轮（例如20-30轮）时，所述细胞通过RT-PCR测定是OCT-4^-以及通过免疫定位（例如流式细胞术）测定是VEGFR2/KDR⁺、CD9⁺、CD54⁺、CD105⁺、CD200⁺和VE-钙粘着蛋白^–。在另一具体的实施方式中，该细胞暴露于1至100 ng/mL VEGF 4至21天之后，通过例如免疫定位（例如流式细胞术）检测，并不表达CD34。

在另一实施方式中，该羊膜来源贴壁细胞是OCT-4^–、CD49f⁺、HLA-G^–、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–。在更具体的实施方式中，所述细胞通过免疫定位（例如流式细胞术）测定是如下一种或多种：CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD98⁺、Tie-2⁺、TEM-7⁺、CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–、CD143^–、CD146^–（黑素瘤细胞粘附分子）或CXCR4^–。在更具体的实施方式中，所述细胞通过免疫定位（例如流式细胞术）测定是CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD98⁺、Tie-2⁺、TEM-7⁺、CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–、CD143^–、CD146^–和CXCR4^–。在另一具体的实施方式中，所述细胞通过免疫定位（例如流式细胞术）测定是VEGFR1/Flt-1⁺和/或VEGFR2/KDR⁺；以及通过免疫定位（例如流式细胞术）测定是如下一种或多种：CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–和/或Tie-2⁺。在另一具体的实施方式中，所述细胞通过免疫定位（例如流式细胞术）测定附加地为 VEGFR1/Flt-1⁺、VEGFR2/KDR⁺、CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–和Tie-2⁺。

在另一实施方式中，本文披露的羊膜来源贴壁细胞通过例如30轮的RT-PCR测定，并不表达如下一种或多种mRNA：ANGPT4、ANGPTL3、BGLAP、CD31、CD34、CDH5、CXCL10、DLX5、FGA、FGF4、FLT3、HLA-G、IFNG、LECT1、LEP、MMP-13、NANOG、巢蛋白、PLG、POU5F1、PRL、PROK1、SOX2、TERT、TNMD和/或XLKD1。在另一实施方式中，本文提供的羊膜来源贴壁细胞通过流式细胞术测定基本上不表达如下一种或多种：不变链、HLA-DR-DP-DQ、CD6或CD271，也就是，该羊膜来源贴壁细胞在正常无刺激的条件下并不表达这些标记。

在具体的实施方式中，本文所述的AMDAC通过，例如RT-PCR和/或端粒扩增（TRAP）分析法测得是端粒酶^–。在另一具体的实施方式中，本文所述的AMDAC通过例如30轮的RT-PCR测定并不表达端粒酶逆转录酶（TERT）mRNA。在另一具体的实施方式中，本文所述的AMDAC通过RT-PCR测得是NANOG-。在另一具体的实施方式中，本文所述的AMDAC通过例如30轮的RT-PCR测定并不表达NANOG mRNA。在具体的实施方式中，本文所述的AMDAC是（性别决定区Y）-框2（SOX2）^–。在另一具体的实施方式中，本文所述的AMDAC通过例如30轮的RT-PCR测定并不表达SOX2mRNA。

本文进一步提供的是包括羊膜来源贴壁细胞的分离的细胞群，其中该细胞群在本文披露的所述治疗方法中在治疗上是有效的。这类细胞群可以包括本文披露的，通过任何标记组合所描述的任何所述的羊膜来源贴壁细胞。在具体的实施方式中，所述群中至少约50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%的细胞是这类羊膜来源贴壁细胞。在其他具体的实施方式中，所述包括羊膜来源贴壁细胞的分离的细胞群中至少25%、35%、45%、50%、60%、75%、85%或更多的细胞不是OCT-4⁺。

在某些实施方式中，本文提供的所述治疗方法包括向所述个体附加地施用第二类型的干细胞。在具体的实施方式中，羊膜来源贴壁细胞的分离的群附加地包括第二类型的细胞，例如干细胞或祖细胞。在具体的实施方式中，本文披露的AMDAC包括所述群中至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、80%、85%、90%、95%或至少98%的细胞。在其他具体的实施方式中，包括羊膜来源贴壁细胞和第二类型的细胞的细胞群中至少25%、35%、45%、50%、60%、75%、85%或更多的细胞不是OCT-4⁺。在具体的实施方式中，该第二类型的细胞包含在胎盘血、脐血、天然骨髓或其他组织中或从中分离得到。在更具体的实施方式中，所述第二类型的细胞是胚胎干细胞、从外周血液中分离的干细胞、从胎盘血中分离的干细胞、从胎盘灌洗液中分离的干细胞、从胎盘组织中分离的干细胞、从脐血中分离的干细胞、脐带干细胞（例如来自脐带基质或华顿氏胶质的干细胞）、骨髓来源间质干细胞、间充质基质细胞、造血干细胞或祖细胞（例如CD34⁺细胞）、成体干细胞、脂肪干细胞、诱导性多潜能干细胞或诸如此类。在另一更具体的实施方式中，所述第二类型的细胞包括所述群中至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%的细胞。

在另一具体的实施方式中，任何上述AMDAC或第二类型的细胞在或已经在培养物中得以增殖。在另一具体的实施方式中，任何上述细胞来自已经经过至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次或更多次传代的这类细胞的培养物。在另一具体的实施方式中，任何上述细胞来自经过至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或至少50次或更多次倍增的这类细胞的培养物。

在其他的实施方式中，本文披露的所述治疗方法包括以组合物（例如药物组合物）的形式向受感染的个体施用该AMDAC。在具体的实施方式中，该组合物是基质或支架，例如天然组织基质或支架，例如，永久性或可降解的脱细胞的组织基质或支架；或合成的基质或支架。在更具体的实施方式中，所述基质或支架以微球、管状的形式或其他三维形式成型。在另一更具体的实施方式中，所述基质是脱细胞的组织基质。在另一具体的实施方式中，该组合物包括如下一种或多种：含于生理学上可接受的溶液（例如盐水溶液、培养基或诸如此类）的本文提供的分离的羊膜来源贴壁细胞或包括该羊膜来源贴壁细胞的细胞群。

在本文提供的治疗方法的另一具体实施方式中，所述细胞通过注射施用至所述个体。在另一具体的实施方式中，所述细胞通过静脉输注施用至所述个体。在所述治疗方法的另一具体实施方式中，所述细胞通过将如上所述的包括羊膜来源贴壁细胞的基质或支架植入所述个体的方式施用至所述个体。

本文提供的所述分离的羊膜来源贴壁细胞和细胞群不是，例如美国专利号7,255,879或美国专利申请公开号2007/0275362（其披露内容特此以引用方式全部并入本文）中所述的分离的胎盘干细胞或细胞群。本文提供的所述分离的羊膜来源贴壁细胞也不是内皮祖细胞、羊膜上皮细胞、滋养层、细胞滋养层、胚胎生殖细胞、胚胎干细胞、从胚胎的内细胞团块中获得的细胞该或从胚胎的性腺嵴中获得的细胞。

本文所用的术语“约”指，例如指定数字或数值的10%以内。

本文所用的术语“干细胞”限定任何给定细胞群的功能属性：可以广泛地（例如高达约40个群体倍增数），但不一定无限地增殖，以及可以分化，例如可以在体外分化，为多种细胞类型。

本文所用的术语“祖细胞”限定任何给定细胞群的功能属性：可以广泛地（例如高达约40个群体倍增数），但不一定无限地增殖以及可以分化，例如可以在体外分化为受限组的细胞类型，一般地，其与干细胞的类型相比更加地受限。

本文所用的术语“来源”指从中分离或以其他方式提纯。例如，羊膜来源贴壁细胞是从羊膜中分离得到的。术语“来源”包含直接从组织（例如羊膜）分离的细胞经培养得到的细胞和原代分离物经培养或扩增得到的细胞。

本文所用的“免疫定位”指利用免疫蛋白，例如抗体或其片段；例如，流式细胞术、荧光活化的细胞分拣法、磁珠细胞分拣法、原位杂交、免疫组织化学或诸如此类来检测化合物（例如细胞标记）。

本文所用的术语“分离的细胞”指与其所来源的组织（例如羊膜）的其他细胞大体上分离的细胞（例如AMDAC）。如果，例如在细胞的收集和/或培养过程中，与该细胞天然连接的至少约20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或至少约99%的其他细胞与该细胞分离开来，则说该细胞是“分离的”。

本文所用的术语“分离的细胞群”指与其所来源的组织（例如羊膜或胎盘）的其他细胞大体上分离的细胞群。如果，例如在羊膜来源贴壁细胞的收集和/或培养过程中，与细胞群或该细胞群所来源的细胞天然连接的至少约20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或至少99%的细胞与该细胞分离开来，则说该细胞群是“分离的”。

如本文所用，当特定标记例如通过免疫定位；例如通过流式细胞术；或通过RT-PCR等等可在背景上检测到时，细胞或细胞群对于该标记则是“阳性的”。例如，如果细胞上或细胞群中的，例如CD105可检测到且可检测到的量大于背景（与例如，同型对照相比），该细胞或该细胞群对于CD105则是阳性的。在例如，抗体介导的检测的情况下，“阳性的”（表明存在特定的细胞表面标记）指利用对标记具有特异性的抗体（例如荧光标记的抗体）可以检测到该标记；“阳性的”还指细胞或细胞群按一定的量显示该标记，所述量，例如在细胞计、ELISA或诸如此类中产生信号，在背景上是可检测到。例如，细胞是“CD105⁺”，其中该细胞可检测到地标记有对CD105具有特异性的抗体，以及来自该抗体的信号可检测到高于对照（例如背景）。相反地，在相同情况下，“阴性的”指与背景相比，利用对细胞表面标记具有特异性的抗体不能检测到该标记。例如，细胞或细胞群是“CD34^–”，其中该细胞或细胞群不可检测地标记有对CD34具有特异性的抗体。除非本文中另有说明，否则，利用抗体便可检测分化（“CD”）标记簇。例如，可以测定OCT-4的存在，以及如果利用，例如30轮的RT-PCR可检测到针对OCT-4的mRNA，则细胞是OCT-4⁺。

附图说明

图1示出通过羊膜来源贴壁细胞以及NTERA-2细胞对与干细胞相关的基因的表达。

图2示出羊膜来源贴壁细胞（AMDAC）的细胞表面上TEM-7的表达。

图3A-3D示出通过羊膜来源贴壁细胞分泌选定的血管原性蛋白。图3A：通过金属蛋白酶-1（TIMP-1）、TIMP-2、血小板生成素、血管内皮生长因子（VEGF）和VEGF-D的组织抑制剂的第六代AMDAC（n=3）进行的分泌。图3B：通过血管生成素、表皮生长因子（EGF）、上皮来源的中性粒细胞活化肽78（ENA-78）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和生长调节致癌基因α（GRO）的第六代AMDAC（n=3）进行的分泌。图3C：通过干扰素γ（IFN-γ）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、白介素-6（IL-6）、IL-8和来普汀的第六代AMDAC（n=3）进行的分泌。图3D：通过单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、血小板源性生长因子（PDGF）-BB、胎盘生长因子（PlGF）、T细胞激活分泌调节因子和转化生长因子-β（TGF-β）的第六代AMDAC（n=3）进行的分泌。

图4证实了AMDAC抑制体外T细胞增殖的能力。NHDF：新生儿真皮成纤维细胞。AMDAC、NHDF的左边条形图：与不存在AMDAC或NHDF时相比，CD4+T细胞抑制。AMDAC、NHDF的右边条形图：与不存在AMDAC或NHDF时相比，CD8+T细胞抑制。Y轴：与不存在AMDAC或NHDF时的T细胞增殖相比，AMDAC或NHDF引起的抑制百分比。

图5证实了AMDAC条件培养基导致T细胞生产TNF-α的抑制。Y轴：与不存在AMDAC或NHDF时TNF-α的生产相比，存在AMDAC或NHDF时大量T细胞生产TNF-α的抑制百分比。

图6示出AMDAC对Th1 T细胞的抑制。PanTbase：不存在AMDAC时Th1 T细胞的百分比。100K、75K、50K、25K：分别存在100,000、75,000、50,000和25,000个AMDAC时Th1T细胞的百分比。

图7示出AMDAC以剂量依赖性方式抑制Th17 T细胞。100K、80K、60K、40K：分别与100,000、80,000、60,000和40,000个AMDAC共培养之后留下的Th17 T细胞的百分比（不存在AMDAC时）。

图8示出AMDAC增加了FoxP3 Treg细胞。基线：不存在AMDAC时FoxP3 Treg细胞占全部T细胞的百分比。100K、75K、50K、25K：分别存在100,000、75,000、50,000和25,000个AMDAC时FoxP3 Treg细胞的百分比。

图9A-9C描述了通过CD86和HLA-DR表达评估的DC群的流式细胞术结果。All: SSC:侧向角散射门。细胞类型：仅树突细胞（DC）或DC+AMDAC。LPS+IFN-γ：用（+）或不用（–）细菌脂多糖以及干扰素γ刺激的细胞。图9A：用抗CD86-藻红蛋白（PE）标记的DC。图9B：用抗HLA-DR-PerCP Cy5.5标记的DC。图9C：用抗IL-12-PE（Y-轴）和抗CD11c-FITC标记的DC。

图10描述了通过细菌脂多糖（LPS）刺激的树突细胞（DC）抑制肿瘤坏死因子-α（TNF-α）以及白介素-12（IL-12）的产生。对每种情况（IL-12或TNF-α的产生），左侧柱状图是存在LPS以及干扰素-γ（IFN-γ）时DC生产细胞因子的情况以及右侧柱状图是存在LPS、IFN-γ和AMDAC时DC生产细胞因子的情况。“-”表示DC没有用LPS或IFN-γ刺激的情况。每种情况右侧的数字表示每种情况下DC产生的IL-12或TNF-α的皮克数。

图11描述了自然杀伤（NK）细胞增殖受AMDAC介导的抑制情况。X轴：存在（左边条形图）或不存在（右边条形图）AMDAC时NK细胞前体的培养天数。Y轴：每个指定培养日NK细胞的数量。

图12描述了NK细胞细胞毒性的AMDAC抑制情况。X轴：在以NK细胞和K562细胞（人永生化的骨髓性白血病细胞系）为靶的共培养物中每个孔的AMDAC数量。Y轴：根据（1–样本中K562细胞的总数÷不含NK细胞的对照中K562细胞总数）X 100算得的NK细胞毒性百分比。

图13示出，在大鼠多发性硬化症模型中，经过12-24天的治疗，接受AMDAC的大鼠（G9）与接受对照溶媒的大鼠（G1）相比，显示出了明显的改善（13A）以及经过12-28天的治疗，用AMDAC治疗的大鼠中，大鼠体重较高（13B）。

图14示出，在大鼠多发性硬化症模型中，接受AMDAC的大鼠（G9）比仅仅接受对照溶媒的大鼠（G1）出现症状要晚。

5.发明详述

5.1利用羊膜来源贴壁细胞的免疫调节

一方面，本文提供通过使一个或多个免疫细胞接触本文所述的多个羊膜来源贴壁细胞（AMDAC），调节（例如抑制）该免疫细胞的活性（例如增殖）的方法。该免疫细胞可以是体外细胞或可以是体内免疫应答的一部分。在某些实施方式中，本文提供一种抑制个体内免疫应答的方法，其中该免疫应答是，例如自身免疫性疾病、移植物抗宿主病、哮喘或过敏症，该方法包括使作为免疫应答的一部分的多个个体免疫细胞接触多个羊膜来源贴壁细胞达一定时间，所述时间对所述羊膜来源贴壁细胞来说，足以可检测到地抑制该免疫应答，例如其中，例如，在混合淋巴细胞反应（MLR）分析或回归分析中，所述羊膜来源贴壁细胞可检测到地抑制T细胞增殖。

可用于调节免疫应答或免疫细胞活性的羊膜来源贴壁细胞是本文其他部分所述的羊膜来源贴壁细胞（见5.4部分）。用于免疫抑制的羊膜来源贴壁细胞可以来源于单个胎盘的羊膜或多个胎盘的羊膜或从中获得。用于免疫抑制的羊膜来源贴壁细胞还可以来源于单个物种（例如预定接收者物种或免疫细胞物种），所述物种的功能将被降低或抑制；或可以来源于多个物种。

本文披露的所述方法的情况下，“免疫细胞”指免疫系统的任何细胞，尤其是T细胞和自然杀伤（NK）细胞。因此，在该方法的各种实施方式中，羊膜来源贴壁细胞与多个免疫细胞接触，其中该多个免疫细胞是或包括，多个T细胞（例如多个CD3⁺T细胞、CD4⁺T细胞和/或CD8⁺T细胞）和/或自然杀伤细胞。在该方法的情况下，“免疫应答”可以是免疫细胞对免疫细胞通常认为的刺激物做出的任何应答，例如对抗原存在的应答。在各种实施方式中，免疫应答可以是作为自身免疫性疾病、移植物抗宿主病、过敏症或哮喘的一部分的T细胞（例如CD3⁺T细胞、CD4⁺T细胞和/或CD8⁺T细胞）增殖。该免疫应答还可以是自然杀伤（NK）细胞的任何活性、树突细胞的成熟或诸如此类。该免疫应答还可以是一种或多种类别的免疫细胞的活性的局部、组织特异性或器官特异性或全身效应，例如，该免疫应答可以是发炎、与发炎相关的疤痕组织的形成以及诸如此类。

在本文提供的所述方法的情况下，“接触”包含使羊膜来源贴壁细胞和免疫细胞集合在单个容器（例如培养皿、细颈瓶、小瓶等等）内或体内，例如，在同一个体（例如哺乳动物，如人）中。在优选的实施方式中，该接触持续足够长的时间，并具有数量足够的羊膜来源贴壁细胞和免疫细胞，以便可检测到该免疫细胞的免疫功能的改变。更优选地，在各种实施方式中，所述接触足以使免疫功能（例如针对抗原的T细胞增殖应答）与不存在该羊膜来源贴壁细胞时的免疫功能相比抑制至少50%、60%、70%、80%、90%或95%。体内的情况下，这类抑制可以通过体外分析测定（见下文）；也就是，对于接受个体内特定数量的羊膜来源贴壁细胞和一定数量的免疫细胞，体外分析中的抑制程度可以预测为该个体内的抑制程度。

在某些实施方式中，本文提供利用羊膜来源贴壁细胞调节免疫应答或在体外调节一种或多种类型的免疫细胞的多个的活性的方法。使该羊膜来源贴壁细胞和多个免疫细胞接触可以包括将该羊膜来源贴壁细胞和免疫细胞结合于相同的物理空间内，以便多个羊膜来源贴壁细胞的至少一部分与多个免疫细胞的至少一部分相互作用；将该羊膜来源贴壁细胞和免疫细胞保持在具有共同培养基的独立的物理空间内；或可以包括使来自羊膜来源贴壁细胞或免疫细胞的一份或一种培养物的培养基接触其他类型的细胞（例如，从羊膜来源贴壁细胞的培养物中获得培养基以及将分离的免疫细胞再悬浮于该培养基中）。在具体的实施例中，该接触在混合淋巴细胞反应（MLR）中进行。在另一具体的实施例中，该接触在回归分析或磁珠T细胞反应（BTR）分析中进行。

这类接触可以，例如，参与实验设定，所述实验设定设计以测定特定的多个羊膜来源贴壁细胞免疫调节（例如免疫抑制）的程度。这类实验设定可以是，例如混合淋巴细胞反应（MLR）或回归分析。用于执行该MLR以及回归分析的程序在本领域中是熟知的。见，例如，Schwarz,“The Mixed Lymphocyte Reaction: An In Vitro Test for Tolerance,”J.Exp.Med.127(5):879-890(1968);Lacerda等人,“Human Epstein-Barr Virus (EBV)-Specific Cytotoxic T Lymphocytes Home Preferentially to and Induce Selective Regressions of Autologous EBV-Induced B Lymphoproliferations in Xenografted C.B-17 Scid/Scid Mice,”J. Exp.Med.183:1215-1228(1996)。在优选的实施方式中，进行MLR，其中使多个羊膜来源贴壁细胞与多个免疫细胞（例如淋巴细胞，例如CD3⁺、CD4⁺和/或CD8⁺T淋巴细胞）接触。

该MLR可用来测定多个羊膜来源贴壁细胞的免疫抑制能力。例如，可以在MLR中检测多个羊膜来源贴壁细胞，该MLR包括按，例如约10:1:2的比率结合CD4⁺或CD8⁺T细胞、树突细胞（DC）以及羊膜来源贴壁细胞，其中利用染料，例如分配进入子细胞的CFSE（作为举例），对该T细胞染色，以及其中允许该T细胞增殖约6天。如果存在羊膜来源贴壁细胞时6天的T细胞增殖，与存在DC以及不存在羊膜来源贴壁细胞时的T细胞增殖相比，可检测到是降低的，则该多个羊膜来源贴壁细胞受到免疫抑制。在这类MLR中，羊膜来源贴壁细胞从培养物中融解得到或收获。将约20,000个羊膜来源贴壁细胞再悬浮于100μl的培养基（RPMI 1640、1 mMHEPES缓冲液、抗生素和5%混合人血清）中并允许其贴附于孔底2h。利用Miltenyi磁珠从整个外周血液单核细胞中分离得到CD4⁺和/或CD8⁺T细胞。该细胞是CFSE染色的以及每个孔添加总共100,000个T细胞（仅添加CD4⁺T细胞、仅添加CD8⁺T细胞或等量添加CD4⁺和CD8⁺T细胞）。使孔中的体积变为200μl并允许该MLR进行下去。

因此，在一个实施方式中，本文提供一种抑制免疫应答的方法，该方法包括使多个免疫细胞接触多个羊膜来源贴壁细胞达一定时间，所述时间对所述羊膜来源贴壁细胞来说，在混合淋巴细胞反应（MLR）分析、磁珠T细胞反应（BTR）分析或回归分析中足以可检测到地抑制T细胞增殖。在一个实施方式中，该MLR、BTR或回归分析中所用的所述羊膜来源贴壁细胞表示来自更大的羊膜来源贴壁细胞群的羊膜来源贴壁细胞样本或等分。

从不同的胎盘或相同胎盘的不同组织中获得的羊膜来源贴壁细胞群可以在调节免疫细胞活性的能力方面不同，例如可以在抑制T细胞活性或增殖或NK细胞活性的能力方面不同。因此，需要在使用前测定特定的羊膜来源贴壁细胞群的免疫抑制能力。这类能力可以，例如在MLR或回归分析中通过检测该羊膜来源贴壁细胞群的样本来测定。在一个实施方式中，用所述样本执行MLR以及在所述分析中测定该羊膜来源贴壁细胞引起的免疫抑制程度。然后，可以将该免疫抑制程度归因于所取样的羊膜来源贴壁细胞群。因此，该MLR可以用作一种测定特定的羊膜来源贴壁细胞群抑制免疫功能的绝对和相对能力的方法。MLR参数可以是多样化，以提供更多数据或更好地测定羊膜来源贴壁细胞样本的免疫抑制能力。例如，因为羊膜来源贴壁细胞产生的免疫抑制看起来以与该分析中存在的羊膜来源贴壁细胞的数量成比例的方式粗略增长，因此，在一个实施方式中，可以用两种或更多数量的羊膜来源贴壁细胞（例如每个反应1x10³，3x10³，1x10⁴和/或3x10⁴个羊膜来源贴壁细胞）执行该MLR。该分析中，羊膜来源贴壁细胞与T细胞的相对数量还可以是多变的。例如，虽然可以使用相对大量的羊膜来源贴壁细胞或T细胞，但是，该分析中，羊膜来源贴壁细胞和T细胞可以按任何比率（例如约100:1至约1:100，优选地约1:5）存在。

可以以类似的方式采用所述回归分析或BTR分析。

因此，本文提供利用羊膜来源贴壁细胞调节免疫应答或在体外调节一种或多种类型的免疫细胞的多个的活性的方法。羊膜来源贴壁细胞和免疫细胞可以，例如在作为多个羊膜来源贴壁细胞的接受者的个体中接触。当该接触在个体中进行时，在一个实施方式中，该接触发生在外源性羊膜来源贴壁细胞（也就是，并非来源于该个体或来源于与该个体有关的羊膜的羊膜来源贴壁细胞；同种异体细胞）和对该个体来说是内源性的多个免疫细胞之间。在其他的实施方式中，该羊膜来源贴壁细胞对该个体来说是内源性的，例如与该个体共有遗传同一性，例如对该个体来说是自体的。在具体的实施方式中，该个体内的免疫细胞是CD3⁺T细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞和/或NK细胞。

该羊膜来源贴壁细胞可以施用至个体，其中该羊膜来源贴壁细胞与该个体中已知或期望的免疫细胞（例如T细胞）数量的比率从约10:1至约1:10，优选地约1:5。然而，在非限制性实施例中，多个羊膜来源贴壁细胞可以按，约10,000:1、约1,000:1、约100:1、约10:1、约1:1、约1:10、约1:100、约1:1,000或约1:10,000的比率施用至个体。一般地，可以施用约1x10⁵至约1x10⁸个羊膜来源贴壁细胞/kg（接受者体重），优选地约1x10⁶至约1x10⁷个羊膜来源贴壁细胞/kg（接受者体重），以产生免疫抑制。在各种实施方式中，施用至个体或对象的多个羊膜来源贴壁细胞包括至少、约或不多于，1x10⁵、3x10⁵、1x10⁶、3x10⁶、1x10⁷、3x10⁷、1x10⁸、3x10⁸、1x10⁹、3X10⁹个羊膜来源贴壁细胞或更多。

该羊膜来源贴壁细胞还可以与一种或多种第二类型的干细胞一起施用，例如来自骨髓的间质干细胞或美国专利号7,468,276或美国专利申请公开号2007/0275362（其披露内容特此以引用方式全部并入本文）中所述的胎盘干细胞。这类第二干细胞可以按相对于羊膜来源贴壁细胞，例如约1:10至约10:1的比率施用至个体。

为了便于体内该羊膜来源贴壁细胞和免疫细胞的接触或接近，该羊膜来源贴壁细胞可以按任何足以使该羊膜来源贴壁细胞和免疫细胞彼此接触的途径施用至个体。例如，该羊膜来源贴壁细胞可以通过，例如静脉内，肌内，腹膜内，眼内，肠胃外，鞘内或直接进入器官（例如胰脏）的途径施用至个体。对于体内给药，该羊膜来源贴壁细胞可以配制为药物组合物，如下文5.8.1部分所述。

免疫抑制方法可以附加地包括添加一种或多种免疫抑制剂，尤指体内的情况下。在一个实施方式中，在个体内，该多个羊膜来源贴壁细胞与该多个免疫细胞体内接触以及包括免疫抑制剂的组合物被施用至该个体。免疫抑制剂为本领域所熟知以及包括，例如抗T细胞受体抗体（单克隆或多克隆或抗体片段或其衍生物）、抗IL-2受体抗体（例如巴利昔单抗（SIMULEC

）或达克珠单抗（ZENAPAX）、抗T细胞受体抗体（例如莫罗单抗-CD3）、硫唑嘌呤、皮质甾类、环孢素、他克莫司、麦考酚酸莫酯、西罗莫司、钙调磷酸酶抑制剂等等。在具体的实施方式中，该免疫抑制剂是巨噬细胞炎症性蛋白（MIP）-1α或MIP-1β的中和抗体。优选地，抗MIP-1α或MIP-1β抗体按一定量施用，所述量足以在所述个体内导致MIP-1α和/或MIP-1β的量可检测到地下降。

除了抑制T细胞增殖之外，羊膜来源贴壁细胞还对免疫系统的细胞具有其他抗炎症效果，该效果可能有益于，例如自身免疫性疾病、移植物抗宿主病、哮喘或过敏症的治疗。例如，当羊膜来源贴壁细胞（例如体外或体内）被施用至个体时，降低了由Th1和/或Th17T细胞亚群介导的免疫应答。在另一方面，本文提供一种在体内或体外抑制促炎症应答（例如Th1应答或Th17应答）的方法，该方法包括使T细胞（例如CD4⁺T淋巴细胞或白细胞）接触羊膜来源贴壁细胞，即本文所述的羊膜来源贴壁细胞。在具体的实施方式中，所述接触可检测到地降低Th1细胞成熟。在该方法的具体实施方式中，所述接触可检测到地降低所述T细胞或抗原生成细胞对如下一种或多种的生产：淋巴毒素-1α（LT-1α）、白介素-1β（IL-1β）、IL-12、IL-17、IL-21、IL-23、肿瘤坏死因子α（TNFα）和/或干扰素γ（IFNγ）。在该方法的另一具体实施方式中，所述接触加强或上调调节性T细胞（Treg）表型；和/或降低促进Th1和/或Th17应答（例如CD80、CD83、CD86、ICAM-1、HLA-II）的生物分子在树突细胞（DC）和/或巨噬细胞中的表达。在具体的实施方式中，还使所述T细胞接触IL-10，例如并非由所述T细胞产生的外源性IL-10或IL-10，例如重组IL-10。

在另一实施方式中，本文提供一种减少巨噬细胞中促炎症性细胞因子的产生的方法，该方法包括使该巨噬细胞接触有效量的羊膜来源贴壁细胞。在另一实施方式中，本文提供一种增加致耐受性细胞的数量、促进免疫细胞的致耐受性功能和/或上调致耐受性细胞因子（例如来自巨噬细胞）的方法，该方法包括使免疫系统细胞接触有效量的羊膜来源贴壁细胞。在具体的实施方式中，所述接触使活化的巨噬细胞，比没有接触所述羊膜来源贴壁细胞的活化的巨噬细胞产生可检测到地更多的IL-10。在另一实施方式中，本文提供一种上调或增加抗炎症性T细胞的数量的方法，该方法包括使免疫系统细胞接触有效量的羊膜来源贴壁细胞。

在一个实施方式中，本文提供一种抑制患有或经历与免疫相关的疾病或病症（例如自身免疫性疾病、移植物抗宿主病、哮喘或过敏症）的症状个体内Th1应答的方法，该方法包括向该个体施用有效量的羊膜来源贴壁细胞，其中所述有效量是导致该个体内Th1应答可检测到地降低的量。在另一实施方式中，本文提供一种抑制患有或经历与免疫相关的疾病或病症的症状的个体内Th17应答的方法，该方法包括向该个体施用有效量的羊膜来源贴壁细胞，其中所述有效量是导致该个体内Th17应答可检测到地降低的量。在这些方法的具体实施方式中，所述施用可检测到地降低所述个体内由T细胞或抗原提呈细胞产生的IL-1β、IL-12、IL-17、IL-21、IL-23、TNFα和/或IFNγ的一种或多种。在该方法的另一具体实施方式中，所述接触加强或上调调节性T细胞（Treg）表型；或调节促进Th1或Th17应答的标记的所述个体内树突细胞（DC）和/或巨噬细胞的产生。在另一具体的实施方式中，该方法包括向所述个体附加地施用IL-10。

在另一方面，本文提供如本文所述的羊膜来源贴壁细胞，其已经过遗传设计，来表达一种或多种抗炎症性细胞因子。在具体的实施方式中，所述抗炎症性细胞因子包括IL-10。

5.2利用羊膜来源贴壁细胞的治疗方法

本文提供治疗患有疾病或紊乱的个体的方法，其中该疾病或紊乱由不适当或不需要的免疫应答（例如可以通过免疫抑制治疗的疾病、紊乱或病症）导致的或与该不适当或不需要的免疫应答有关，该方法包括向该个体施用治疗有效量的（也就是，数量的）本文所述的羊膜来源贴壁细胞。在具体的实施方式中，该治疗有效量是足以在该个体内可检测到地抑制免疫应答的量。这类免疫应答可以是，例如利用来自该个体的T细胞执行的MLR或回归分析中的T细胞增殖。在另一具体的实施方式中，治疗有效量是羊膜来源贴壁细胞的量，该量的施用导致该疾病或紊乱的一种或多种症状得到可检测到的改善或使所述症状进展减慢。

患有与不适当或不需要的免疫应答有关或由该免疫应答所引起的疾病或紊乱的个体可以用多个羊膜来源贴壁细胞以及可选地，用一种或多种治疗剂在该疾病进展过程中的任何时间进行治疗。在某些实施方式中，该个体患有如下疾病或有罹患如下疾病的风险：多发性硬化症；炎症性肠病，例如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎；移植物抗宿主病；风湿性关节炎；糖尿病；牛皮癣；蕈样霉菌病；或本文所列的其他与免疫相关的疾病或紊乱的一种。例如，该个体可以在诊断之后即刻；或在诊断后1，2、3、4、5、6天内；或在诊断后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多周或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多年之内进行治疗。在该疾病的临床过程中可以对该个体进行一次或多次治疗。在急性发作期间、缓和期间或慢性衰退期期间可以对该个体进行合适的治疗。

可用于治疗这类疾病、紊乱或病症的羊膜来源贴壁细胞可以是本文披露的任何AMDAC。在具体的非限制性实施方式中，该羊膜来源贴壁细胞表达CD49f、CD105和CD200以及不表达OCT-4。在各种实施方式中，施用至该个体的AMDAC可以包括由本文所述的蛋白或遗传标记的任何组合定义或可由其表征的AMDAC。

在一个实施方式中，该方法包括向该个体施用至少一个剂量的约3亿个羊膜来源贴壁细胞。然而，具体的剂量可以根据个体的物理特性（例如体重）而变化，以及其范围可以是从1百万至100亿个AMDAC/剂量，优选地1千万到10亿个AMDAC/剂量之间或1亿到5亿个AMDAC/剂量之间。该施用优选地通过静脉内，但是对于活细胞的施用可以通过任何医学上可接受的途径，例如肠胃外、皮下、肌内、腹膜内、眼内、通过腰椎穿刺等等。在一个实施方式中，该羊膜来源贴壁细胞来自细胞库。在另一实施方式中，羊膜来源贴壁细胞的剂量被包含在适于弹丸注射或通过导管给药的血袋或类似袋中。

在另一实施方式中，本文提供一种治疗患有疾病或紊乱的个体的方法，其中该疾病或紊乱由不适当或不需要的免疫应答（例如，可以通过免疫抑制有效治疗的疾病或紊乱）导致或与该免疫应答有关，该方法包括按足以在该个体内可检测到地抑制免疫应答的量，向该个体施用已经通过羊膜来源贴壁细胞处理的培养基。这类免疫应答可以是，例如利用来自该个体的T细胞执行的MLR、BTR或回归分析中的的T细胞增殖。

羊膜来源贴壁细胞或该羊膜来源贴壁细胞条件培养基可以按单剂量或按多剂量施用。在某些实施方式中，例如在按多剂量施用所述AMDAC的实施方式中，该剂量可以是设计以缓解，例如疾病或紊乱的一种或多种急性症状的治疗方案的一部分，其中该疾病或紊乱由不适当或不需要的免疫应答导致或与其有关。在某些其他的实施方式中，例如在按多剂量施用所述AMDAC的实施方式中，该剂量可以是设计以预防或减轻这类疾病或紊乱慢性过程的严重程度的长期治疗方案的一部分。

5.2.1多发性硬化症的治疗

在另一方面，本文提供一种治疗患有多发性硬化症或与多发性硬化症有关的症状的个体的方法，该方法包括按足以在该个体内可检测到地调节（例如抑制）免疫应答的量和时间，向该个体施用多个羊膜来源贴壁细胞或羊膜来源贴壁细胞条件培养基。

多发性硬化症（MS）是中枢神经系统的一种慢性、复发性炎症性疾病。该疾病对CNS和PNS轴突、少突神经胶质细胞和神经细胞本身周围的髓鞘造成损伤。该疾病通过自身反应性T细胞（尤其是CD4⁺T细胞）进行介导，所述细胞增殖，穿过血脑屏障并在细胞粘附分子和促炎症性细胞因子的影响下进入该CNS。MS的症状包括四肢感觉障碍、视神经功能障碍、锥体束功能障碍、膀胱功能障碍、肠功能障碍、性功能障碍、运动失调和复视。

已经确认四种不同类型或临床过程的MS。第一种，复发/缓解型MS（RRMS），其特点是在数天至数周期间，表现为急性的神经功能障碍的自限性发作，接着是长达数月的恢复期（有时候是不完全的恢复期）。第二种，继发性进展型MS（SPMS），其开始是RRMS，但是发生了变化，使得临床过程逐渐以与急性发作无关的稳定的功能恶化为特点。第三种，原发性进展型MS（PPMS），其特点是发作后，功能稳定衰退，没有急性发作。第四种，进展/复发型MS（PRMS），其也始于进展型过程，并有间歇性发作，加上进展型功能衰退。

一般地，利用运动技能评估，可选地用MRI对MS患者进行评估。例如，在一项运动技能评估中，关于受感染个体能力的扩展的能力丧失状况等级（EDSS）、评分分级如下：

0.0 神经检查正常

1.0 一个FS中无能力丧失、最小迹象

1.5 一个以上FS无能力丧失、最小迹象

2.0 一个FS中有最低能力丧失

2.5 一个FS有轻度能力丧失或两个FS中有最低能力丧失

3.0 一个FS中有中度能力丧失或三个或四个FS中有轻度能力丧失.完全能走动.

3.5 完全能走动，但是一个FS中有中度能力丧失而几个其他FS中高于最低能力丧失

4.0 尽管有相对重度的能力丧失，在没有帮助的情况下，完全能走动、自立，长达约12h/天；没有帮助或不休息的情况下，能够行走约500m

4.5 在没有帮助的情况下，一天中约大部分的时间完全能走动，能工作一整天，另外可能在充分活动方面受一些限制或需要基本的帮助；以相对重度的能力丧失为特点；没有帮助或不休息的情况下，能行走约300m。

5.0 没有帮助或不休息的情况下，能走动约200m；能力丧失重度，足以妨碍完整的日常活动（没有特殊规定的情况下工作一整天）

5.5 没有帮助或不休息的情况下，能走动约100m；能力丧失重度，足以妨碍完整的日常活动

6.0 不管休不休息，行走约100m需要断断续续的或单方面持续的帮助（手杖、拐杖、支架）

6.5 不休息的情况下，行走约20m需要单方面持续的帮助（手杖、拐杖、支架）

7.0 即使有帮助（基本上限于轮椅）也不能行走超出约5m；自己操作标准轮椅走动；一天在轮椅中待的时间长达约12h

7.5 不能迈上几步；待在轮椅中；走动可能需要帮助；一整天靠标准轮椅走动，但是不能自己不能上轮椅；可能需要电动轮椅

8.0 基本上待在床上或椅子上或靠轮椅散步，但是可能一天中大部分时间不卧床；保留许多自理能力；一般地能有效地用臂

8.5 一天中大部分时间基本上待在床上；能有效地用臂；保留一些自理能力

9.0 离不开床；仍然可以交流和饮食。

9.5 完全是不能自理的卧床病人；不能有效地交流或饮食/吞咽

10.0 MS导致死亡

在上述评分系统中，“FS”指检测的八个功能系统，包括锥体、小脑、脑干、感觉、肠和膀胱、视觉、脑血管系统和其他系统。

已知的其他类似的评分系统包括临时神经症状评分量表（Scripps neurological rating scale）、能走动指数和多发性硬化症功能综合评分法（MSFC）。MS的进展也已经通过测定发作率得以评估。MS的进展还已经通过磁共振成像得以评估，该磁共振成像可以检测与MS有关的神经病变（例如新病变、增强的病变或独特的联合性活跃病变）。

因此，在一个实施方式中，本文提供一种治疗患有MS的个体（例如已诊断患有MS的个体）的方法，该方法包括向该个体施用足以在该个体内可检测到地抑制免疫应答的多个羊膜来源贴壁细胞。在具体的实施方式中，该 MS是复发/缓解型MS。在另一具体的实施方式中，该MS是继发性进展型MS。在另一具体的实施方式中，该MS是原发性进展型MS。在另一具体的实施方式中，该MS是进展/复发型MS。在另一具体的实施方式中，该施用在该个体内可检测到地改善MS的一种或多种症状。在更具体的实施方式中，该症状是，例如如下一种或多种：四肢感觉障碍、视神经功能障碍、锥体束功能障碍、膀胱功能障碍、肠功能障碍、性功能障碍、运动失调或复视。在另一具体的实施方式中，所述施用在EDSS等级方面产生至少0.5个点的改善。在另一具体的实施方式中，所述施用，根据至少一个MS评分系统，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个月期间使功能得到保持。在另一具体的实施方式中，所述施用产生至少1个点的EDSS等级方面的改善。在另一具体的实施方式中，所述施用产生至少2个点的EDSS等级方面的改善。在其他具体的实施方式中，所述施用产生多发性硬化症评估等级或MRI方面可检测到地的改善。在急性发作期间、缓和期间或慢性衰退期期间可以对该个体进行合适的治疗。在另一实施方式中，将该AMDAC施用至患有产后MS的女性，以保持缓和状态或降低孕期经受的复发发生率。

本文还提供用于治疗患有MS的个体（例如已诊断患有MS的个体）的方法，该方法包括向该个体施用足以在该个体内可检测到地抑制免疫应答的多个羊膜来源贴壁细胞（其中该施用可检测到地改善该个体内MS的一种或多种症状）；以及附加地一种或多种第二治疗剂。在一个实施方式中，该第二治疗剂是如下一种或多种：利妥昔单抗、阿来组单抗、克拉屈滨、达克珠单抗、那他珠单抗、Tysabri或米诺环素（米诺环素）。在其他的实施方式中，该第二治疗剂是糖皮质类固醇。在具体的实施方式中，该糖皮质类固醇是促肾上腺皮质激素（ACTH）、甲基强的松龙或地塞米松。在另一实施方式中，该第二治疗剂是免疫调节剂或免疫抑制剂。在各种特异性实施方式中，该免疫调节剂或免疫抑制剂是IFNβ-1a、IFN-1b、醋酸格拉替雷（glatriamer acetate）、环磷酰胺、氨甲蝶呤、硫唑嘌呤、克拉屈滨、环孢素或米托蒽醌。在其他的实施方式中，该治疗剂是静脉内免疫球蛋白、血浆置换或柳氮磺胺吡啶。在另一实施方式中，该个体除了施用该AMDAC之外，还施用上述第二治疗剂的任何组合。

5.2.2炎症性肠病的治疗

在另一方面，羊膜来源贴壁细胞用来治疗患有炎症性肠病（IBD）（例如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎）或有罹患所述IBD的风险的个体。因此，本文提供一种治疗患有炎症性肠病或与有炎症性肠病关的症状的个体的方法，该方法包括按足以可检测到地调节（例如抑制）该个体内免疫应答的量和时间，向该个体施用多个羊膜来源贴壁细胞或羊膜来源贴壁细胞条件培养基。

克罗恩氏病.在一个实施方式中，该IBD是克罗恩氏病，有时称为回肠炎或小肠炎。克罗恩氏病是导致消化道（还称为胃肠或GI道）发炎的慢性紊乱。克罗恩氏病可以累及该GI道从口到肛门的任何一部分，但是最常累及的是小肠的下段部分，称为回肠。已知有五种类型的克罗恩氏病。胃十二指肠克罗恩氏病累及胃和十二指肠（小肠的最上部）。空肠回肠炎是空肠（小肠最长部分）的克罗恩氏病。回肠炎是回肠（小肠的下部）的克罗恩氏病。回肠结肠炎（最常见形式的克罗恩氏病）累及回肠和结肠。最后，克罗恩氏结肠炎（肉芽肿性结肠炎）累及结肠，以及与溃疡性结肠炎是有区别的，这是因为对于克罗恩氏结肠炎，发病组织区域之间常常是健康组织区域，以及克罗恩氏结肠炎可以仅涉及结肠，而不涉及直肠。认为，克罗恩氏病是身体的免疫系统对该GI道中的抗原（包括，例如食物、有益菌等等）做出不适当反应，导致肠膜内白细胞聚集而引起的。与克罗恩氏病有关的发炎还归因于细胞因子肿瘤坏死因子（TNF-α）的作用。

溃疡性结肠炎.在另一实施方式中，该IBD是溃疡性结肠炎。溃疡性结肠炎是导致直肠和/或结肠的膜发炎和产生疮口（溃疡）的疾病。在通常形成结肠膜的细胞已被炎症杀死的地方，形成溃疡；随后，该溃疡通常流血并生脓。当结肠的下段部分和直肠中发炎时，疾病称为溃疡性直肠炎。如果整个结肠受累，则疾病称为全结肠炎。如果仅仅结肠的左侧受累，则疾病称为限性或远端结肠炎。溃疡性结肠炎的症状包括，但不限于，腹痛、血性腹泻、发烧、恶心、腹部痛性痉挛、贫血、疲劳、减重、食欲不振、直肠出血、体液和营养流失、皮肤病损、关节痛和成长不足（儿童）。溃疡性结肠炎还可以导致并发症，例如眼炎、肝病和骨质疏松症。

因此，在一个实施方式中，本文提供一种治疗患有炎症性肠病的个体的方法，该方法包括向所述个体施用治疗有效量的羊膜来源贴壁细胞，其中所述治疗有效量是在所述炎症性肠病（IBD）的至少一个症状中产生可检测到地的改善的量。在具体的实施方式中，该IBD是克罗恩氏病。在更具体的实施方式中，所述克罗恩氏病是胃十二指肠克罗恩氏病、空肠回肠炎、回肠炎、回肠结肠炎或克罗恩氏结肠炎。在另一具体的实施方式中，该克罗恩氏病是瘘管型克罗恩氏病。在另一更具体的实施方式中，所述症状是克罗恩氏病的症状。在更具体的实施方式中，所述克罗恩氏病的症状是GI道一部分的发炎和肿胀、腹痛、频繁的肠道排空和/或腹泻。在另一更具体的实施方式中，所述克罗恩氏病的症状是直肠出血、贫血、减重、关节炎、皮肤问题、发烧、肠壁增厚、肠内疤痕组织的形成、肠内疮口或溃疡的形成、肠内壁一处或多处瘘管的形成、肛门内一处或多处裂缝的形成、患营养缺乏（例如蛋白、热量、维生素的一种或多种的缺乏）、患肾结石、患胆结石或肝或胆管系统疾病。

在另一更具体的实施方式中，该IBD是溃疡性结肠炎。在更具体的实施方式中，所述溃疡性结肠炎是溃疡性直肠炎、全结肠炎、限性结肠炎或远端结肠炎。在另一更具体的实施方式中，所述症状是溃疡性结肠炎的症状。在更具体的实施方式中，所述症状是腹痛、血性腹泻、发烧、恶心、腹部痛性痉挛、贫血、疲劳、减重、食欲不振、直肠出血、体液和营养流失、皮肤病损、关节痛和成长不足。在另一更具体的实施方式中，该症状是骨质疏松症、眼炎或肝病。

在某些实施方式中，该羊膜来源贴壁细胞经遗传设计，以表达一种或多种治疗蛋白。在具体的实施方式中，所述一种或多种治疗蛋白是IL-10、肝细胞生长因子（HGF）、血管内皮生长因子（VEGF）和/或成纤维细胞生长因子（FGF）。

在另一具体的实施方式中，施用该羊膜来源贴壁细胞的所述个体附加地施用一种或多种第二治疗剂，其中所述第二治疗剂包括，例如抗炎剂、类固醇、免疫抑制剂和/或抗生素。可用来治疗例如，克罗恩氏病或溃疡性结肠炎的抗炎药物的实施例包括，但不限于，美沙拉嗪、5-ASA（5-氨基水杨酸）药剂（例如ASACOL（美沙拉嗪，缓释）、DIPENTUM（奥沙拉嗪）、PENTASA

（美沙拉嗪，控释））、柳氮磺胺吡啶（5-ASA和磺胺吡啶的组合）、抗炎症性抗体（例如英夫利昔单抗（REMICADE

））等等。可用来治疗克罗恩氏病或溃疡性结肠炎的类固醇的实施例包括，但不限于，可的松、氢化可的松、强的松（prednisone）、甲基强的松等等。通常，如本领域惯例，类固醇的剂量是先按相对大的剂量给药，然后，随着炎症消退改用较小的剂量。可用来治疗克罗恩氏病的免疫抑制剂的实施例包括，但不限于，环孢素A、6-巯基嘌呤或硫唑嘌呤。任何抗生素可用来治疗克罗恩氏病，包括，例如氨苄西林、磺酰胺、头孢菌素、四环素和/或甲硝唑。在另一具体的实施方式中，第二疗法是施用猪鞭虫，例如猪鞭虫虫卵。在其他具体的实施方式中，第二疗法是如下一种或多种：TNFα的抑制剂（例如英夫利昔单抗、阿达木单抗、赛妥珠单抗）、IL-6的抑制剂（例如Atilizumab）、结合至整联蛋白α4的抗体（例如那他珠单抗）、干扰素γ抑制剂（例如芳妥珠单抗Fontolizumab）、结合至CD4+ T细胞和Th2辅助性T细胞亚群的抗体（例如维西珠单抗）、Alicaforsen（ICAM-1反义抑制剂）、抗IL-12Ab抗体、结合至整联蛋白α4β7的抗体（例如MLN02，一种实验室产生的抗体）和/或重组GM-CSF（例如沙莫司亭，

在某些实施方式中，对于用于IBD治疗的任何其他疗法来说，患有炎症性肠病（例如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎）的个体不是难治愈的。在另一实施方式中，对于用于IBD治疗的至少一种其他疗法来说，患有炎症性肠病（例如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎）的个体是难治愈的。在具体的实施方式中，对于用于IBD（例如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎）治疗的至少一种其他疗法来说难治愈的个体，对于类固醇疗法（例如皮质类固醇疗法）来说是难治愈的。

在某些实施方式中，该炎症性肠病（例如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎）与免疫细胞（例如激活的T细胞、淋巴细胞和/或巨噬细胞）数量的可检测到的增加有关或在某种程度上由其导致。在具体的实施方式中，活化的淋巴细胞是Th17和/或Th1 T细胞。在某些其他的实施方式中，该炎症性肠病（例如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎）与IL-2、IL-12、IL-23、TNFα和/或IFNγ的血液血清浓度的可检测到的增加有关或在某种程度上由其导致。就此而言，本文提供一种治疗患有炎症性肠病（例如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎）的个体的方法，该方法包括（1）测定所述个体内激活的T细胞、淋巴细胞和/或巨噬细胞的数量；以及（2）如本文所述，向该个体施用治疗有效量的羊膜来源贴壁细胞（即一定量的细胞），其中所述治疗有效量是使所述个体内激活的T细胞、淋巴细胞和/或巨噬细胞的数量与所述施用之前相比可检测到地降低的量。在另一实施方式中，本文提供一种治疗患有炎症性肠病（例如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎）的个体的方法，该方法包括（1）测定来自所述个体的组织（例如血液或血清）中IL-2、IL-12、IL-23、TNFα和/或IFNγ的浓度；以及（2）如本文所述，向该个体施用治疗有效量的羊膜来源贴壁细胞（即一定量的细胞），其中所述治疗有效量是使来自所述个体的所述组织中IL-2、IL-12、IL-23、TNFα和/或IFNγ的浓度与所述施用之前相比可检测到地降低的量。在另一实施方式中，本文提供一种治疗患有炎症性肠病（例如克罗恩氏病）的个体的方法，该方法包括（1）测定T细胞、淋巴细胞、抗原生成细胞和/或巨噬细胞产生的IL-2、IL-12、IL-23、TNFα和/或IFNγ的量；以及（2）如本文所述，向该个体施用有效量的羊膜来源贴壁细胞，其中所述有效量是使所述个体内T细胞、淋巴细胞、抗原生成细胞和/或巨噬细胞产生的IL-2、IL-12、IL-23、TNFα和/或IFNγ的量与所述施用之前相比可检测到地降低的量。在另一实施方式中，本文提供一种治疗患有炎症性肠病（例如克罗恩氏病）的个体的方法，该方法包括（1）测定来自所述个体的样本中Th1和/或Th17 T细胞的数量；以及（2）如本文所述，向该个体施用有效量的羊膜来源贴壁细胞，其中所述有效量是使Th1和/或Th17细胞的数量与所述施用之前的数量相比可检测到地降低的量。

在其中所述炎症性肠病是溃疡性结肠炎的某些其他的实施方式中，疾病主要的特征是活化的淋巴细胞和中性粒细胞，以及激活的T细胞亚群是Th17（Il-23）以及Th2（IL-4、IL-5和IL-13）。因此，本文提供一种治疗患有溃疡性结肠炎的个体的方法，该方法包括（1）测定来自所述个体的组织（例如血清）中IL-4、IL-5、IL-13和/或IL-23的浓度；以及（2）如本文所述，向该个体施用治疗有效量的羊膜来源贴壁细胞，其中所述治疗有效量是使来自所述个体的所述组织中IL-23的浓度与所述施用之前相比可检测到地降低的量。

用于治疗IBD（例如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎）的AMDAC可以通过本文所述的任何医学上可接受的途径施用。在其中所述IBD是瘘管型克罗恩氏病的某些实施方式中，该AMDAC可以局部施用，例如直接施用在一种或多种瘘管中或靠近一种或多种瘘管施用。

5.2.3移植物抗宿主疾病的治疗

在另一实施方式中，本文提供一种治疗患有或正经受移植物抗宿主病（GVHD）的症状或有罹患该GVHD的风险的个体（例如移植物接受者或将接受移植物的个体）的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的羊膜来源贴壁细胞（即一定量的细胞）或羊膜来源贴壁细胞条件培养基，其中该治疗有效量是足以可检测到地改善GVHD的一种或多种症状或足以可检测到地降低GVHD的一种或多种症状的发作的量。

GVHD通常在完全或部分地同种异体组织移植（特别是同种异体造血干细胞移植）之后或因其而患得，以及GVHD可以包括皮炎、小肠炎和肝炎的一种或多种，其通常在移植的5-100天内患得。GVHD可以是急性或慢性的。急性GVHD可能以通常移植之后5至47天起出现瘙痒或疼痛的疹子为特点。超急性GVHD还可以伴有发烧、全身性红皮病和脱皮。肝也可能受累，这通过升高（例如高于正常）水平的胆红素、丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）和碱性磷酸酶（AP）得以证明。急性GVHD还可能累及结肠，导致腹泻、内出血、痉挛、腹痛和肠梗阻。慢性GVHD可发生在已经经受急性GVHD或以前无症状的移植患者体内。慢性GVHD的症状包括眼睛有灼热感、眼睛刺痛、畏光和泪液分泌减少导致的眼痛；口干、对辛辣或酸性食物敏感、腹痛、吞咽不利（吞咽困难）、吞咽痛（吞咽疼痛）、减重、阻塞性肺疾病、肌肉无力、神经性疼痛和/或肌肉痉挛。

因此，在该方法的具体实施方式中，羊膜来源贴壁细胞的治疗有效量是足以可检测到地改善急性GVHD的一种或多种症状或足以可检测到地降低急性GVHD的一种或多种症状的发作的量。在更具体的实施方式中，所述一种或多种症状包括皮炎、皮肤瘙痒、疹子、小肠炎、肝炎、发烧、红皮病、脱皮、ALT水平升高、AST水平升高、AP水平升高；胆红素水平升高；腹痛、痉挛、内出血或肠梗阻。在该方法的另一具体的实施方式中，羊膜来源贴壁细胞的治疗有效量是足以可检测到地改善慢性GVHD的一种或多种症状或足以可检测到地降低慢性GVHD的一种或多种症状的发作的量，其中所述一种或多种症状包括眼睛有灼热感、眼睛刺痛、泪液产生减少、畏光、泪液分泌减少导致的眼痛、口干、对辛辣或酸性食物敏感、腹痛、吞咽不利（吞咽困难）、吞咽痛（吞咽疼痛）、减重、阻塞性肺疾病（包括任何喘息性呼吸困难和/或慢性咳嗽）、肌肉无力、神经性疼痛和/或肌肉痉挛。在该方法的其他具体的实施方式中，急性GVHD和/或慢性GVHD的症状包括高胆红素血症、黄疸、门静脉高血压、肝硬化、出血性结膜炎、假膜的形成、兔眼、慢性角膜结膜炎、干燥症（sicca）、点状角膜病变、口腔黏膜萎缩、红斑、颊或唇黏膜产生苔藓样病变、闭塞性细支气管炎、阴道炎、阴道狭窄、自身免疫性血小板减少症和/或贫血。

该方法不受供体或接受者属性的限制。移植可以跨种界。在优选的实施方式中，供体和接受者是相同的物种，例如都是人类。移植物接受者与供体可以是完全或部分地同种异体的。移植可以是自体的。移植物接受者或供体可以小于5岁、从1至10岁、从5至15岁、从10至20岁、从15至25岁、从20至30岁、从25至35岁、从30至40岁、从35至45岁、从40至50岁、从45至55岁、从50至60岁、从55至65岁、从60至70岁或70岁或更老。

GVHD一般地通过症状的严重程度分级。例如，在一个实施方式中，对GVHD的症状进行分期，以及根据皮肤、肝和/或肠内症状，按照从0（无GVHD）到IV（威胁生命的GVHD）的标准，对GVHD分级，如表1和表2中所示：

表1.急性移植物抗宿主病的分期

表2.急性GVHD的分级

因此，在该方法的另一实施方式中，羊膜来源贴壁细胞的治疗有效量是足以改善，例如个体（例如已经接受移植物的个体（移植物接受者））内移植物抗宿主病的一种或多种症状的量，以便通过至少一个步骤降低所述移植物抗宿主病的级别。在具体的实施方式中，所述移植物抗宿主病从级别IV降至级别III；从级别IV降至级别II；从级别IV降至级别I；从级别IV降至级别0；从级别III降至级别II；从级别III降至级别I；从级别III降至级别0；从级别II降至级别I；从级别II降至级别0；或从级别I降至级别0。在该方法的另一实施方式中，羊膜来源贴壁细胞的治疗有效量是使移植后10、20、30、40、50、60、70、80、90或100天之内，所述个体内移植物抗宿主病的发展不超过级别0、级别I、级别II或级别II的量。

在各种具体的实施方式中，患有GVHD或有罹患GVHD的风险的个体是接受同种异体造血细胞移植物的个体（例如没有接受GVHD预防的个体；较老的个体；HLA不相同的造血干细胞的接受者；来自同种异体致敏的（allosensitized）供体的移植物的接受者；来自不相关的供体的移植物的接受者）；接受实质器官移植物，尤其是包括淋巴组织的器官移植物（例如小的肠移植物）的个体；以及接受未经照射的血液制品的个体（例如新生儿和胎儿，患有先天性免疫缺陷综合症的个体，接受免疫抑制化学疗法的个体，接受来自部分地HLA相同的、HLA同源的供体的定向捐献血液的个体）；接受复合组织同种异体移植物（即具有一种以上组织类型的同种异体移植物）的个体；等等。GVHD还可发生在自体或同系造血细胞移植之后。在另一具体的实施方式中，该个体已经接受致命性或致命性以下剂量的辐射（例如已经接受照射），作为移植的辅助手段。

在具体的实施方式中，该羊膜来源贴壁细胞于导致或引发移植物抗宿主病的，例如组织移植之前的14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1天之内施用至该个体。在另一具体的实施方式中，该羊膜来源贴壁细胞的施用与移植同时进行。在另一具体的实施方式中，该羊膜来源贴壁细胞在移植的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天之内施用。可以多次，例如在移植之前、移植过程中或移植之后或其任何组合期间多次，执行该羊膜来源贴壁细胞的施用。在另一实施方式中，当该个体（移植物接受者）内体现级别II或更严重级别的移植物抗宿主病时，在移植之后任何时间施用羊膜来源贴壁细胞。

在该方法的另一实施方式中，该个体（例如移植物接受者或将移植物的个体）施用羊膜来源贴壁细胞以及附加地一种或多种第二治疗剂。在具体的实施方式中，该治疗剂是胸腺细胞球蛋白、麦考酚酸莫酯、西罗莫司、坎帕斯-1H、角质化细胞生长因子（KGF）、辛二酰苯胺异羟肟酸（SAHA）、可的松、氢化可的松、强的松或甲基强的松。在另一具体的实施方式中，该治疗剂是免疫抑制剂或免疫调节剂。适用于GVHD的免疫抑制剂和免疫调节剂已为本领域所知，以及包括，但不限于，氨甲蝶呤（methotrexate）、来氟米特、环磷酰胺、环孢素A、大环内酯类抗生素（例如FK506（他克莫司））、甲基强的松龙（MP）、皮质甾类、类固醇、麦考酚酸莫酯、雷帕霉素（西罗莫司）、咪唑立宾、脱氧精胍菌素、布喹那、malononitriloaminde（例如来氟米特）、T细胞受体调节剂和细胞因子受体调节剂。肽模拟物；以及抗体（例如人、人源化的、嵌合的、单克隆、多克隆、Fvs、ScFvs、Fab或F(ab)₂片段或表位结合片段）；核酸分子（例如反义核酸分子和三股螺旋）；小分子；有机化合物和无机化合物。具体地，免疫调节剂包括，但不限于，氨甲蝶呤、来氟米特、环磷酰胺、环磷酰胺、依木兰、环孢素A、米诺环素、硫唑嘌呤、抗生素（例如FK506（他克莫司））、甲基强的松龙（MP）、皮质甾类、类固醇、麦考酚酸莫酯、雷帕霉素（西罗莫司）、咪唑立宾、脱氧精胍菌素、布喹那、malononitriloaminde（例如来氟米特）、T细胞受体调节剂和细胞因子受体调节剂。T细胞受体调节剂的实施例包括，但不限于，抗T细胞受体抗体（例如抗CD4抗体（例如cM-T412（勃林格）、IDEC-CE9.Is（IDEC和SKB）、mAB4162W94、ORTHOCLONE

以及OKTcdr4a（Janssen-Cilag））、抗CD3抗体（例如NUVION

（Product Design Labs）、OKT3（Johnson&Johnson）或Rituxan（IDEC））、抗CD5抗体（例如抗CD5蓖麻毒相关的免疫共轭物）、抗CD7抗体（例如CHH-380（Nvartis））、抗CD8抗体、抗CD40配体单克隆抗体（例如IDEC-131（IDEC））、抗CD52抗体（例如坎帕斯

1H（Ilex））、抗CD2抗体、抗CD1a抗体（例如Xanelim（Genentech））和抗B7抗体（例如IDEC-114）（IDEC）））、CTLA4-免疫球蛋白、反应停或上文5.6.6部分中化合物的一种。在具体的实施方式中，T细胞受体调节剂是CD2拮抗剂。在其他的实施方式中，T细胞受体调节剂不是CD2拮抗剂。在另一具体的实施方式中，该药剂是抗体MEDI-501（T10B9）。在另一具体的实施方式中，T细胞受体调节剂是CD2结合分子，优选地MEDI-507。在其他的实施方式中，T细胞受体调节剂不是CD2结合分子。可以施用适用于治疗GVHD或GVHD的症状的上述治疗剂的任何组合。这类治疗剂可以以任何组合的形式结合该羊膜来源贴壁细胞，同时或作为独立的治疗过程施用。

5.2.4风湿性关节炎的治疗

在另一实施方式中，本文提供一种治疗患有或正经受风湿性关节炎（RA）的症状或有罹患该RA的风险的个体的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的羊膜来源贴壁细胞（即一定量的细胞）或羊膜来源贴壁细胞条件培养基，其中该治疗有效量是足以可检测到地改善RA的一种或多种症状或足以可检测到地降低RA的一种或多种症状的发作的量。类风湿性关节炎是一种慢性、炎症性自身免疫性病症，其中身体免疫系统攻击关节，以及，通常地，攻击身体其他组织。

在具体的实施方式中，该施用足以在患有RA的个体的至少一个关节内，可检测到地改善RA的一种或多种症状或足以可检测到地降低RA的一种或多种症状的发作。在另一具体的实施方式中，该施用足以在患有RA的个体的至少一个非关节组织内，可检测到地改善RA的一种或多种症状或足以可检测到地降低RA的一种或多种症状的发作。可以受RA感染的非关节组织的实施例包括，但不限于，皮肤（真皮）、肺、自身免疫系统或血液、肾组织、心血管组织、眼组织或神经组织。

在具体的实施方式中，RA的症状是（不限于）早晨僵直（例如持续时间超过1h）、一个或多个关节或关节群的软组织肿胀、关节痛、皮下结节、第95个百分位数以上存在的类风湿因子或暗示关节腐蚀的辐照学变化。

在具体的实施方式中，该施用足以可检测到地改善附属RA的一种或多种病症或足以可检测到地降低附属RA的一种或多种病症的发作。这类病症的实施例包括，但不限于，坏疽性脓皮病、嗜中性皮肤病、斯威特氏综合症、病毒性感染、结节性红斑、小叶性脂膜炎、趾皮肤萎缩、掌红斑、弥漫性稀疏（宣纸皮肤）、皮肤脆性、外表面上（例如手肘上）皮下结节、肺部纤维化（例如氨甲蝶呤疗法所导致的肺部纤维化）、卡普兰氏结节、血管炎性紊乱、甲皱梗塞、神经病变、肾病、淀粉样变性病、假性肌肥大、心内膜炎、左心衰竭、心瓣炎、巩膜软化症、多发性神经炎或寰枢椎不全脱位等等。

在该方法的另一实施方式中，患有RA的个体施用羊膜来源贴壁细胞以及附加地至少一种其他治疗剂。在具体的实施方式中，该治疗剂是，例如镇痛剂或抗炎剂。在另一具体的实施方式中，该治疗剂是疾病修饰抗风湿类药物（DMARD）。在更具体的实施方式中，该DMARD是如下一种或多种：异生素（例如硫唑嘌呤、环孢素A、D-青霉胺、氯化钠金、羟氯喹、来氟米特、氨甲蝶呤、米诺环素或柳氮磺胺吡啶）或生物制剂（例如肿瘤坏死因子α（TNF-α）阻断剂，如依那西普（ENBREL）、英夫利昔单抗（REMICADE

）、阿达木单抗（HUMIRA

）或上文5.6.8部分中披露的化合物的一种；白介素-1阻断剂；抗B细胞（CD20）抗体（例如利妥昔单抗或RITUXAN

）；或T细胞活化的阻断剂（例如阿巴西普或ORENCIA

）。在另一更具体的实施方式中，该镇痛剂或抗炎剂是糖皮质类固醇、非类固醇抗炎药物、醋氨酚、布洛芬、阿司匹林、鸦片制剂或利多卡因（局部）。可以施用适用于治疗GVHD或GVHD的症状的上述治疗剂的任何组合。这类治疗剂可以以任何组合的形式结合该羊膜来源贴壁细胞，同时或作为独立的治疗过程施用。

在具体的实施方式中，施用患有RA的个体的多个羊膜来源贴壁细胞已经经过遗传设计，以表达治疗RA的多肽。在更具体的实施方式中，该治疗RA的多肽是IL-1Ra（白介素-1受体拮抗剂）。在另一更具体的实施方式中，该治疗RA的多肽是包括IL-1Ra和DHFR（二氢叶酸还原酶）的融合蛋白。在更具体的实施方式中，该羊膜来源贴壁细胞用编码IL-1Ra-DHFR融合蛋白的核酸转化，其中通过抗叶酸素（例如氨甲蝶呤）提高融合蛋白的表达。在另一具体的实施方式中，向患有RA的个体附加地施用多个第二类型的干细胞，其中该第二类型的干细胞或至少多个该第二类型的干细胞已经经过遗传设计，以表达治疗RA的多肽，例如上文披露的任何多肽。在一个更具体的实施方式中，核酸编码IL-1Ra-DHFR-IRES-Luc，其中IRES是内部核糖体进入位点，以及Luc是荧光素酶。在另一具体的实施方式中，所述核酸包括实现对IL-1Ra或IL-1Ra-DHFR融合多肽表达的控制的核苷酸序列。

用来治疗RA的经遗传设计的羊膜来源贴壁细胞或另一类干细胞，可以以任何组合的形式结合还未经遗传改性的这类干细胞施用至患有RA的个体。

5.2.5硬皮症的治疗

在另一实施方式中，本文提供一种治疗患有或正经受硬皮症的症状或有罹患硬皮症的风险的个体的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的羊膜来源贴壁细胞（即一定量的细胞）或羊膜来源贴壁细胞条件培养基，其中该治疗有效量是足以可检测到地改善硬皮症的一种或多种症状或足以可检测到地降低硬皮症的一种或多种症状的发作的量。

硬皮症是一种慢性疾病，其特点是皮肤或其他器官中胶原蛋白过度沉积。硬皮症可以是局部或全身性的。局部形式的所述疾病虽可致残，但往往不是致命的。全身形式的所述疾病，表现为弥漫性硬皮症或全身性硬化症，可因心脏、肾、肺或肠损伤而致命。三种类型的硬皮症是弥漫性硬皮症和限性（CREST综合症）硬皮症，它们是全身性的；以及硬斑病/线形硬皮症，其局限于皮肤。弥漫性硬皮症是最严重的形式，受害者起病急骤、经受广布的皮肤硬化以及严重的内部器官损害（尤其是对肺部和胃肠道的损害）。

限性形式的硬皮症温和得多，表现出较慢的发病和进展。皮肤硬化通常局限于手和脸，内脏器官受累情况不如弥漫形式严峻。通常情况下，雷诺氏现象可能比硬皮症早几年。雷诺氏现象是由寒冷之中暴露的周围部分——特别是手和脚——的小动脉血管收缩造成的，以及通常的特点是三相颜色变化——先是白色，然后是蓝色，最终回温变红。限性形式经常被称为CREST综合症，其中“CREST”是5个主要功能的首字母缩写：钙质沉着（软组织，例如皮肤中，钙沉积）、雷诺氏综合症、食管运动功能障碍、指硬皮病（手指的硬皮症）和毛细血管扩张（蜘蛛网状静脉）。

硬皮症的患病与自身抗体（特别是抗着丝点和抗scl70/抗拓扑异构酶抗体）的存在相关。高达90%的受感染的个体具有可检测到的抗核抗体。抗着丝点抗体在限性形式（80-90%）中比在全身性形式（10%）中更常见，以及抗scl70在弥漫性形式（30-40%）中比在非洲裔美国人患者中更常见。

因此，在本文提供的治疗方法中，羊膜来源贴壁细胞的施用抑制硬皮症的一种或多种症状的患得，降低其严重程度或减缓其进展。在一个实施方式中，该硬皮症是限性硬皮症。在另一实施方式中，该硬皮症是弥漫性硬皮症。在另一实施方式中，该硬皮症是硬斑病。在另一具体的实施方式中，该症状是如下一种或多种：面部皮肤硬化、手指皮肤硬化、雷诺氏综合症、肢体中不适当的血管收缩、钙质沉着、毛细管扩张或食道运动功能障碍。在另一具体的实施方式中，羊膜来源贴壁细胞的施用可检测到地降低来自个体的毫升血液中一种或多种抗核抗体（例如抗着丝点抗体或抗拓扑异构酶抗体）的量或浓度。

在另一实施方式中，本文提供的治疗方法包括施用第二治疗剂，其中该第二治疗剂是抗炎药物，例如类固醇抗炎药物或非类固醇抗炎药物（NSAID）、醋氨酚、甲氧萘丙酸、布洛芬、乙酰水杨酸等等。在施用NSAID的更具体的实施方式中，还可以施用质子泵抑制剂（PPI）（例如奥美拉唑）。在另一实施方式中，该第二治疗剂是免疫抑制性化合物，例如麦考酚酸莫酯、环磷酰胺或氨甲蝶呤。在另一实施方式中，当受感染的个体患有指溃疡和肺动脉高血压时，可以施用血管扩张剂，例如前列环素（伊洛前列素）。

在另一实施方式中，该第二治疗剂是第二类型的细胞。在某些实施方式中，该第二类型的细胞是，例如从约10⁵个细胞/kg至约10⁹个细胞/kg的一种或多种剂量的造血干细胞，例如CD34⁺造血干细胞。在另一具体的实施方式中，所述第二类型的干细胞是间质干细胞，例如骨髓来源间质干细胞。在另一具体的实施方式中，该第二类型的干细胞是脂肪来源干细胞。该第二类型的干细胞（例如造血干细胞、间质干细胞、脂肪干细胞或诸如此类）可以与该羊膜来源贴壁细胞按任何比率（例如约100:1、75:1、50:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:50、1:75或1:100）一起施用。干细胞（例如骨髓来源间质干细胞或脂肪来源干细胞）可以购得或从原始母体（例如骨髓、骨髓抽吸物、脂肪组织等等）中获得。

可以施用适于治疗硬皮症或硬皮症的症状的上述治疗剂的任何组合。这类治疗剂可以以任何组合的形式结合该羊膜来源贴壁细胞，同时或作为独立的治疗过程施用。

本文所述的羊膜来源贴壁细胞可以以药物组合物的形式（例如，适于，例如静脉内、肌内或腹膜内注射的药物组合物）施用至罹患硬皮症的个体。

5.2.6牛皮癣的治疗

在另一实施方式中，本文提供一种治疗患有或正经受牛皮癣的症状或有罹患牛皮癣的风险的个体的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的羊膜来源贴壁细胞（即一定量的细胞）或羊膜来源贴壁细胞条件培养基，其中该治疗有效量是足以可检测到地改善牛皮癣的一种或多种症状、足以可检测到地降低牛皮癣的一种或多种症状的发作或足以减缓牛皮癣的进展的量。

牛皮癣是一种累及皮肤和关节的疾病，其通常导致皮肤上出现鳞屑红斑（称为牛皮癣斑块）。牛皮癣斑是发炎并产生多余皮肤的区域。皮肤在这些部位快速积聚并呈现银白色外观。手肘和膝盖的皮肤上频繁出现斑块，但是可受累的是包括头皮和生殖器的任何区域。假定牛皮癣是免疫介导的。

已经确认了几种不同类型的牛皮癣。斑块状牛皮癣（寻常性牛皮癣），其是最常见形式的牛皮癣，通常呈现覆盖有银白色鳞屑状皮肤（称为斑块）的鼓起的发炎皮肤区域。曲侧牛皮癣（皮褶牛皮癣）表现为皮肤褶襞中，例如生殖器（大腿和腹股沟之间）周围、腋窝、超重的胃部下方以及乳房下方，出现平滑的发炎皮肤斑块。滴状牛皮癣表现为身体的大部分区域，例如躯干、四肢和头皮上出现许多椭圆形（泪珠状）小点。滴状牛皮癣与链球菌性喉部感染有关。脓包性牛皮癣表现为填满非感染性脓（脓泡）的鼓起的凸块。脓包性牛皮癣可以是局部性的，通常针对手和脚（掌跖脓疱病）；或全身性的，身体任何部分上随机出现广布的斑。指甲牛皮癣导致手指和脚趾指甲外观上发生许多变化，包括指甲板下变色、指甲凹陷、指甲横纹、指甲下皮肤增厚、松离（甲松离）以及指甲剥落。牛皮癣关节炎涉及例如手指和脚趾的关节中，关节和结缔组织发炎，其可以使手指和脚趾呈腊肠形肿胀（称为指趾炎）。牛皮癣关节炎还可以累及臀部、膝盖和脊椎（脊椎炎）。红皮性牛皮癣表现为体表绝大部分区域上出现广布的皮肤炎症和剥落。其可伴有严重的瘙痒、肿胀和疼痛。其是，尤其是全身性治疗突然停药之后，不稳定的斑块状牛皮癣恶化导致的。这种形式的牛皮癣可以是致命的，因为极度的发炎和剥落扰乱了身体的体温调节能力和皮肤执行屏障功能的能力。

因此，在一个实施方式中，本发明提供一种治疗患有牛皮癣的个体的方法，其中该牛皮癣是上文所列的牛皮癣类型的一种，该方法包括向该个体施用治疗有效剂量的羊膜来源贴壁细胞，其中所述有效剂量是足以，例如可检测到地改善上文所列的牛皮癣症状的一种或多种、降低其严重程度或减缓其进展的羊膜来源贴壁细胞的量（即一定量的细胞）。

牛皮癣的严重程度可以通过，例如牛皮癣面积严重性指数（PASI）评估。PASI将对病变严重程度和受累面积的评估整合为范围从0（没有疾病）到72（最严重疾病）的单个分数。

要计算该PASI，将身体分为四部分：腿部；躯体（躯干区域（胃、胸、背等等）；臂部；以及头部。对这些区域的每个单独评分，然后将四个分数整合为最终的PASI。针对每个部分，计算牛皮癣累及的皮肤面积百分比，然后将其转化为从0至6的级别，如下：

涉及的面积百分比级别

通过级别从0至4的四个不同参数对严重程度进行评估：瘙痒、红斑（发红）、鳞屑以及增厚。然后，针对皮肤的每个部分，对所有的四个严重性参数求和，乘以该区域的面积分数并乘以各个部分的权重（头部是0.1，臂部是0.2，躯体是0.3以及腿部是0.4）。实例：（I_躯体+E_躯体+S_躯体+T_躯体）xA_躯体x0.3=总分_躯体。最后，将所有的四个皮肤部分的PASI总和评定为总体的PASI。

还可以通过为罹患牛皮癣的个体拍片，以及通过计算机计算牛皮癣病变所覆盖的体面积的百分比来评估严重程度。

因此，在本文提供的治疗方法的具体实施方式中，该牛皮癣是斑块状牛皮癣（寻常性牛皮癣）、曲侧牛皮癣（皮褶牛皮癣）、滴状牛皮癣、脓包性牛皮癣、指甲牛皮癣、牛皮癣关节炎或红皮性牛皮癣。在该方法的具体实施方式中，羊膜来源贴壁细胞或羊膜来源贴壁细胞条件培养基的治疗有效量是足以改善牛皮癣的一种或多种症状、延缓其发作或减缓其进展的量，其中所述一种或多种症状是皮肤鳞屑、皮肤发红、皮肤增厚、斑块的形成、指甲板下变色、指甲凹陷、指甲横纹、指甲下皮肤增厚、甲松离、脓泡的形成、关节或结缔组织发炎、皮肤发炎或皮肤剥落。在另一实施方式中，羊膜来源贴壁细胞或羊膜来源贴壁细胞条件培养基的治疗有效量是足以导致该牛皮癣面积严重性指数降低5、10、15、20、25、30、35、40个或更多个点的量。

在另一实施方式中，该治疗有效量的羊膜来源贴壁细胞或羊膜来源贴壁细胞条件培养基结合第二疗法施用。该第二疗法可以是局部的，例如乳膏或软膏，包括如下一种或多种：皮质类固醇（例如去羟米松（desoximetasone）、维生素D3类似物（例如钙泊三醇）、蒽林、阿甘油（argan oil）、类维生素A或煤焦油。在另一具体的实施方式中，该第二疗法包括如下暴露方式的一种或多种：例如长约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18或20min，暴露于紫外线，例如波长在约280nm至约315nm之间，特别是约311nm至约312nm之间的UVB。在另一具体的实施方式中，该第二疗法包括局部施用补骨脂素，并结合以暴露于UVA光。在另一具体的实施方式中，该第二疗法包括，例如氨甲蝶呤、环孢素、类维生素A、硫鸟嘌呤（thioguanine）、羟基脲、柳氮磺胺吡啶、麦考酚酸莫酯、硫唑嘌呤、口服他克莫司和/或富马酸酯的一种或多种的一种或多种全身性施用。

5.2.7红斑狼疮的治疗

在另一实施方式中，本文提供一种治疗患有或正经受红斑狼疮（LE）的症状或有罹患该LE的风险的个体的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的羊膜来源贴壁细胞或羊膜来源贴壁细胞条件培养基，其中该治疗有效量是足以可检测到地改善LE的一种或多种症状、足以可检测到地降低LE的一种或多种症状的发作或足以减缓LE的进展的量。

LE有许多症状，以及该疾病在不同的个体中可以进展不同。症状可以包括皮肤病学表现（例如面颊疹（还称为蝴蝶疹）；盘状狼疮（皮肤上厚的鳞屑红斑）；秃头症；口腔、鼻腔和阴道溃疡；和/或皮肤上病变）；肌骨表现（例如关节痛）；血液学表现（例如贫血和铁缺乏症、低于正常的血小板和白细胞数、抗磷脂抗体综合症（血栓性紊乱，其中患者的血清中存在针对磷脂的自身抗体）和/或血液中存在抗心磷脂抗体）；心脏表现（例如心包炎、心肌炎和/或心内膜炎）；肺表现（例如肺和/或胸膜发炎、肋膜炎、胸膜腔积液、狼疮性肺炎、慢性弥漫性间质肺病、肺动脉高血压、肺栓子和/或肺出血）；肝表现（例如自身免疫性肝炎；黄疸；血液流中存在抗核抗体（ANA）、平滑肌抗体（SMA）、肝/肾微粒体抗体（LKM-1）和/或抗线粒体抗体（AMA））；肾表现（例如无痛性血尿症或蛋白尿、狼疮性肾炎、肾衰竭和/或患上具有“线圈”异常的膜性肾小球肾炎）；神经病学表现（例如发作、精神病、脑脊髓液异常）；T-细胞异常（例如缺乏CD45磷酸酶和/或CD40配体的表达上升）；和/或非特异性表现（例如狼疮性肠胃炎、狼疮性胰腺炎、狼疮性膀胱炎、自身免疫性内耳病、副交感神经功能障碍、视网膜血管炎、系统性血管炎、FcεRIγ的表达上升、T细胞中钙水平上升并持续、血液中肌醇三磷酸增加、蛋白激酶C磷酸化作用减弱、Ras-MAP激酶信号减弱或蛋白激酶A I活性缺乏）。

因此，在具体的实施方式中，羊膜来源贴壁细胞或羊膜来源贴壁细胞条件培养基的所述治疗有效量是有效地可检测到地改善LE的一种或多种症状、足以可检测到地降低LE的一种或多种症状的发作或足以减少LE的一种或多种症状恶化的量，其中所述一种或多种症状包括LE的皮肤病学表现、血液学表现、肌骨表现、神经病学表现、肾表现、肝表现或T-细胞表现的一种或多种。在另一具体的实施方式中，所述治疗有效量是足以可检测到地改善LE的一种或多种症状、足以可检测到地降低LE的一种或多种症状的发作或足以减少LE的一种或多种症状恶化的量，其中所述一种或多种症状包括面颊疹；蝴蝶疹；盘状狼疮；秃头症；口腔、鼻腔和阴道溃疡；皮肤上病变；关节痛；贫血和/或铁缺乏症；低于正常的血小板和白细胞数；抗磷脂抗体综合症；液中存在抗心磷脂抗体；心包炎；心肌炎；心内膜炎；肺和/或胸膜炎；肋膜炎；胸膜腔积液；狼疮性肺炎；慢性弥漫性间质肺病；肺动脉高血压；肺栓子；肺出血；自身免疫性肝炎；黄疸；血液流中存在抗核抗体（ANA）、平滑肌抗体（SMA）、肝/肾微粒体抗体（LKM-1）和/或抗线粒体抗体（AMA）；无痛性血尿症或蛋白尿、狼疮性肾炎、肾衰竭和/或患上具有“线圈”异常的膜性肾小球肾炎）；神经病学表现（例如发作、精神病、脑脊髓液异常）；T-细胞异常（例如缺乏CD45磷酸酶和/或CD40配体的表达上升）；和/或非特异性表现（例如狼疮性肠胃炎、狼疮性胰腺炎、狼疮性膀胱炎、自身免疫性内耳病、副交感神经功能障碍、视网膜血管炎、系统性血管炎、FcεRIγ的表达上升、T细胞中钙水平上升并持续、血液中肌醇三磷酸增加、蛋白激酶C磷酸化作用减弱、Ras-MAP激酶信号减弱或蛋白激酶AI活性缺乏）。

羊膜来源贴壁细胞可以以药物组合物的形式（例如，适于，例如静脉内、肌内或腹膜内注射的药物组合物）施用至罹患红斑狼疮的个体。

5.2.8蕈样霉菌病的治疗

在另一实施方式中，本文提供一种治疗患有或正经受蕈样霉菌病的症状或有罹患该蕈样霉菌病的风险的个体的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的羊膜来源贴壁细胞（即一定量的细胞）或羊膜来源贴壁细胞条件培养基，其中该治疗有效量是足以可检测到地改善蕈样霉菌病的一种或多种症状、足以可检测到地降低蕈样霉菌病的一种或多种症状的发作或足以减缓蕈样霉菌病的进展的量。

蕈样霉菌病是最常见的皮肤T细胞淋巴瘤，是生长在皮肤中的一组罕见的癌症。塞扎莱综合症是一种较为少见的形式，其中T细胞累及外周血以及皮肤，其发生率占所有蕈样霉菌病病例的约5％。蕈样霉菌病由皮肤症状定义的一般的发展阶段是：（1）红斑阶段，期间，皮肤具有平坦的红斑；或对于深色皮肤的人，皮肤具有极亮或极暗的红斑，这些红斑非常痒，并可能是凸起的且是硬的（斑块）；（2）皮肤肿瘤阶段，期间，出现凸起的红紫色肿块（结节），该肿块可能是圆顶形（像蘑菇）或溃烂的；（3）皮肤发红（红皮病）阶段，期间，个体的皮肤出现极痒的大块红色鳞屑区域，以及期间，手掌和脚底的皮肤可能变厚并开裂；以及（4）淋巴结阶段，期间，蕈样霉菌病通过逐渐发炎，以及通常发生癌变的淋巴结，开始移动到身体的其他部位，并可能扩散到肝脏、肺或骨髓。

因此，在具体的实施方式中，羊膜来源贴壁细胞或羊膜来源贴壁细胞条件培养基的治疗有效量是有效地可检测到地改善蕈样霉菌病的一种或多种症状、足以可检测到地降低蕈样霉菌病的一种或多种症状的发作或足以减少蕈样霉菌病的一种或多种症状恶化的量，其中所述一种或多种症状包括蕈样霉菌病的皮肤病学表现、血液学表现、肌骨表现、神经病学表现、肾表现、肝表现或T-细胞表现的一种或多种。在另一具体的实施方式中，所述治疗有效量是足以可检测到地改善蕈样霉菌病的一种或多种症状、足以可检测到地降低蕈样霉菌病的一种或多种症状的发作或足以减少蕈样霉菌病的一种或多种症状恶化的量，其中所述一种或多种症状包括皮肤上发痒的亮或暗的红斑、皮肤斑块、患上皮肤瘤、皮肤上鼓起的凸块、出现发痒的红色鳞屑状皮肤区域、脚底或手掌的皮肤增厚、手掌或脚底的皮肤开裂或淋巴结发炎。

在另一实施方式中，该治疗有效量的羊膜来源贴壁细胞或羊膜来源贴壁细胞条件培养基结合第二疗法或第二治疗剂施用。在更具体的实施方式中，该第二疗法或治疗剂是如下一种或多种：所述个体的受累区域暴露于日光或紫外线、局部类固醇、局部表层辐射疗法、全身皮肤电子束辐照、向感染红皮病（erythroderma）的皮肤涂抹有机（麦卢卡）蜂蜜或生物疗法。在更具体的实施方式中，所述生物疗法包括向个体施用如下一种或多种：干扰素、类维生素A、rexinoid、伏立诺他（例如ZOLINZA

）。

5.2.9糖尿病的治疗

在另一实施方式中，本文提供一种治疗患有或正经受糖尿病的症状或有罹患该糖尿病的风险的个体的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的羊膜来源贴壁细胞（即一定量的细胞）或羊膜来源贴壁细胞条件培养基，其中该治疗有效量是足以可检测到地改善糖尿病的一种或多种症状、足以可检测到地降低糖尿病的一种或多种症状的发作或足以减缓糖尿病的进展的量。在具体的实施方式中，该糖尿病是第1型糖尿病，也称为1型糖尿病、I型糖尿病、T1D或胰岛素依赖型糖尿病（IDDM）。

在该疾病的过程期间可以一次或多次施用该羊膜来源贴壁细胞。优选地，在第一次诊断后的1、2、3、4、5或6天或1周之内施用干细胞。在一个实施方式中，该羊膜来源贴壁细胞的所述治疗有效量是足以逆转第1型糖尿病的症状、降低其严重程度或以其他方式改善所述症状的量，所述症状包括血糖异常高、通过葡萄糖耐量试验测定缺乏抗胰岛素性、疲劳或意识丧失。

该羊膜来源贴壁细胞可以结合第二疗法，例如移植的胰腺组织和/或胰岛细胞；自体或同种异体干细胞疗法或诸如此类施用。

5.2.10其他与免疫相关的疾病或紊乱的治疗

本文进一步提供利用AMDAC治疗其他与免疫相关的疾病或病症的方法。在其他的实施方式中，例如，本文提供一种治疗患有疾病或紊乱的个体的方法，其中该疾病或紊乱由不适当或不需要的免疫应答导致或与其有关，例如可以通过免疫抑制有益地治疗的疾病、紊乱或病症，该方法包括向该个体施用本文所述的羊膜来源贴壁细胞。在各种具体的实施方式中，所述与免疫相关的疾病是如下一种或多种：阿狄森氏病、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂抗体综合症、抗磷脂综合症（原发性或继发性）、哮喘、自身免疫性胃炎、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病、自身免疫性淋巴组织增生病、自身免疫性血小板减少性紫癜、巴洛病、贝切特氏病、大疱性类天疱疮、心肌症、乳糜泻、查加斯病、慢性炎症性脱髓鞘性多神经病、疤痕性类天疱疮（例如粘膜类天疱疮）、冷凝集素病、德戈斯病、疱疹样皮炎（hepatiformis）、特发性混合型冷沉淀球蛋白血症、古德帕斯彻氏综合症、格雷夫斯氏病、格-巴二氏综合症、桥本氏甲状腺炎（桥本氏病；自身免疫性甲状腺炎）、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜、IgA肾病、幼年型关节炎、扁平苔癣、梅尼埃病、混合型结缔组织病、硬斑病、假麻痹性重症肌无力、发作性睡病、神经性肌强直、儿童自身免疫性神经精神障碍（PANDA）、慢性天疱疮、恶性贫血、结节性动脉周围炎、多软骨炎、风湿性多肌痛、原发性丙种球蛋白缺乏症、原发性胆汁性肝硬变、雷诺病（雷诺现象）、莱特尔氏病、复发性多软骨炎、风湿热、斯耶格伦氏综合症、僵人综合症（Moersch-Woltmann综合症）、高安氏动脉炎、颞动脉炎（巨细胞性动脉炎）、葡萄膜炎、血管炎（例如与红斑狼疮无关的血管炎）、白癫风和/或韦格内氏肉芽肿症。

在各种其他具体的实施方式中，所述自身免疫性疾病是如下一种或多种：炎症性肌炎、皮肌炎、皮肌炎（幼年型）、幼年型肌炎、涵体肌炎和/或多肌炎（例如伴有皮肌炎）。

5.2.11第二治疗组合物和第二疗法

在任何上述治疗方法中，所述方法可以包括施用第二治疗组合物或第二疗法。上文治疗具体疾病的方法中对具体的第二治疗化合物或第二疗法的叙述不具有排他性。例如，本文所讨论的任何疾病、紊乱或病症可以用本文所述的任何抗炎性化合物或免疫抑制性化合物治疗。在结合第二治疗剂或结合第二类型的干细胞施用羊膜来源贴壁细胞的实施方式中，该羊膜来源贴壁细胞和第二治疗剂和/或第二类型的干细胞可以同时或不同时施用，例如该施用可以彼此间隔1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50min；或彼此间隔1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20或22h；或彼此间隔1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天或更多天。

在具体的实施方式中，对与不适当的、有毒的或有害的免疫应答相关或由其引起的疾病、紊乱或病症的治疗包括除了该羊膜来源贴壁细胞之外，还施用第二类型的干细胞或第二类型的干细胞群。在具体的实施方式中，所述第二类型的干细胞是间质干细胞，例如骨髓来源间质干细胞。在另一实施方式中，该第二类型的干细胞是脂肪来源干细胞。在其他的实施方式中，该第二类型的干细胞是多能（multipotent）干细胞；复效（pluripotent）干细胞；祖细胞；造血干细胞，例如CD34⁺造血干细胞；成体干细胞；胚胎干细胞或胚胎生殖细胞。该第二类型的干细胞（例如间质干细胞或脂肪来源干细胞）可以与该羊膜来源贴壁细胞按任何比率（例如约100:1、75:1、50:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:50、1:75或1:100的比率）一起施用。间质干细胞可以购得或从原始母体（例如骨髓、骨髓抽吸物、脂肪组织等等）中获得。

在另一具体的实施方式中，所述第二疗法包括免疫调节性化合物，其中该免疫调节性化合物是3-(4-氨基-1-氧代-1,3-二氢异氮杂茚-2-基)-哌啶-2,6-二酮；3-(4'氨基异吲哚啉-1'-酮)-1-哌啶-2,6-二酮；4-(氨基)-2-(2,6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1,3-二酮；或α-(3-氨基苯二甲酰亚氨基)戊二酰亚胺。在更具体的实施方式中，所述免疫调节性化合物是具有如下结构的化合物：

其中X和Y中一个是C=O，X和Y中另一个是C=O或CH₂，以及R²是氢或低级烷基；或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、对映体、非对映体、外消旋体或立体异构体混合物。在另一更具体的实施方式中，所述免疫调节性化合物是具有如下结构的化合物：

其中X和Y中一个是C=O以及另一个是CH₂或C=O；

R¹是H、(C₁–C₈)烷基、(C₃–C₇)环烷基、(C₂–C₈)链烯基、(C₂-C₈)炔基、苯甲基、芳基、(C₀-C₄)烷基–(C₁-C₆)杂环烷基、(C₀-C₄)烷基–(C₂-C₅)杂芳基、C(O)R³、C(S)R³、C(O)OR⁴、(C₁-C₈)烷基–N(R⁶)₂、(C₁-C₈)烷基–OR⁵、(C₁-C₈)烷基–C(O)OR⁵、C(O)NHR³、C(S)NHR³、C(O)NR³R^3’、C(S)NR³R^3’或(C₁-C₈)烷基–O(CO)R⁵；

R²是H、F、苯甲基、(C₁-C₈)烷基、(C₂-C₈)链烯基或(C₂-C₈)炔基；

R³和R^3’独立地是(C₁-C₈)烷基、(C₃-C₇)环烷基、(C₂-C₈)链烯基、(C₂-C₈)炔基、苯甲基、芳基、(C₀-C₄)烷基–(C₁-C₆)杂环烷基、(C₀-C₄)烷基–(C₂-C₅)杂芳基、(C₀-C₈)烷基–N(R⁶)₂、(C₁-C₈)烷基–OR⁵、(C₁-C₈)烷基–C(O)OR⁵、(C₁-C₈)烷基–O(CO)R⁵或C(O)OR⁵；

R⁴是(C₁-C₈)烷基、(C₂-C₈)链烯基、(C₂-C₈)炔基、(C₁-C₄)烷基–OR⁵、苯甲基、芳基、(C₀-C₄)烷基–(C₁-C₆)杂环烷基或(C₀-C₄)烷基–(C₂-C₅)杂芳基；

R⁵是(C₁-C₈)烷基、(C₂-C₈)链烯基、(C₂-C₈)炔基、苯甲基、芳基或(C₂-C₅)杂芳基；

每次出现的R⁶独立地是H、(C₁-C₈)烷基、(C₂-C₈)链烯基、(C₂-C₈)炔基、苯甲基、芳基、(C₂-C₅)杂芳基或(C₀-C₈)烷基–C(O)O–R⁵；或R⁶基团可以参与形成杂环烷基基团；

n是0或1；以及

*表示手性碳中心；

或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、对映体、非对映体、外消旋体或立体异构体混合物。在另一更具体的实施方式中，所述免疫调节性化合物是具有如下结构的化合物：

其中：

X和Y中一个是C=O以及另一个是CH₂或C=O；

R是H或CH₂OCOR’；

(i)R¹、R²、R³或R⁴中每个（独立于其他）是卤素、含1至4个碳原子的烷基或含1至4个碳原子的烷氧基；或(ii)R¹、R²、R³或R⁴中一个是硝基或-NHR⁵以及R¹、R²、R³或R⁴中其余的是氢；

R⁵是氢或含1至8个碳的烷基；

R⁶是氢、含1至8个碳原子的烷基、苯并、氯或氟；

R’是R⁷-CHR¹⁰-N(R⁸R⁹)；

R⁷是间苯撑或对苯撑或-(C_nH_2n)-，其中n的值从0至4；

R⁸和R⁹中每个（看做是彼此独立地）是氢或含1至8个碳原子的烷基；或R⁸以及R⁹一起为四亚甲基、五亚甲基、六亚甲基或-CH₂CH₂X₁CH₂CH₂–，其中X₁是-O-、-S-或-NH-；

R¹⁰是氢、含1至8个碳原子的烷基或苯基；以及

*表示手性碳中心；或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、对映体、非对映体、外消旋体或立体异构体混合物。

可以施用上述治疗剂的任何组合。这类治疗剂可以以任何组合的形式结合该羊膜来源贴壁细胞，同时或作为独立的治疗过程施用。

羊膜来源贴壁细胞可以以药物组合物的形式（例如，适于静脉内、肌内或腹膜内注射的药物组合物）施用至罹患与免疫相关的疾病的个体。羊膜来源贴壁细胞可以按单剂量或按多剂量施用。当按多剂量施用羊膜来源贴壁细胞时，该剂量可以是设计以缓解与免疫相关的疾病或紊乱（例如IBD，如克罗恩氏病）的一种或多种急性症状的治疗方案的一部分；或者可以是设计以预防或减轻该疾病慢性过程的严重程度的长期治疗方案的一部分。在结合第二治疗剂或结合第二类型的干细胞施用羊膜来源贴壁细胞的实施方式中，该羊膜来源贴壁细胞和第二治疗剂和/或第二类型的干细胞可以同时或不同时施用，例如该施用可以彼此间隔1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50min；或彼此间隔1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20或22h；或彼此间隔1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天或更多天。

5.3羊膜来源贴壁细胞

本文提供的方法使用贴附于组织培养塑料的羊膜来源细胞以及这类细胞的群，在本文中称为“羊膜来源贴壁细胞”或AMDAC。一般地，羊膜来源贴壁细胞一般地具有成纤维样形状，在外观上与成纤维细胞或间充质细胞相似。这类细胞贴附于细胞培养表面，例如贴附于组织培养塑料上。在本文披露的任何AMDAC的某些实施方式中，该细胞是人细胞。

本文提供的AMDAC显示将其与其他羊膜来源或胎盘源性细胞区分开来的细胞标记。对于本文所述的AMDAC的每个实施方式，在其某些实施方式中，该AMDAC是分离的。

在一个实施方式中，羊膜来源贴壁细胞通过RT-PCR测定是OCT-4^–（八聚体结合蛋白4）。在另一具体的实施方式中，OCT-4^–羊膜来源贴壁细胞通过，例如免疫定位（例如流式细胞术）测定是CD49f⁺。在另一具体的实施方式中，所述OCT-4^–细胞通过RT-PCR测定是HLA-G^–。在另一具体的实施方式中，该OCT-4^–细胞通过免疫定位（例如流式细胞术）测定是VEGFR1/Flt-1⁺（血管内皮生长因子受体1）和/或VEGFR2/KDR⁺（血管内皮生长因子受体2）。在具体的实施方式中，对于OCT-4，例如20轮时，OCT-4^–羊膜来源贴壁细胞表达的PCR-扩增的mRNA与相同数量NTERA-2细胞以及RNA扩增轮次相比少至少2log。在另一具体的实施方式中，所述OCT-4^–细胞通过，例如免疫定位（例如流式细胞术）测定是CD90⁺、CD105⁺或CD117^–。在更具体的实施方式中，所述OCT-4^–细胞通过，例如免疫定位（例如流式细胞术）测定是CD90⁺、CD105⁺和CD117^–。在更具体的实施方式中，该细胞通过，例如免疫定位（例如流式细胞术）测定是OCT-4^–或HLA-G^–以及附加地是CD49f⁺、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–。在更具体的实施方式中，该细胞通过，例如免疫定位（例如流式细胞术）测定是OCT-4^–、HLA-G^–、CD49f⁺、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–。在另一具体的实施方式中，该OCT-4^–细胞通过，例如30轮的RT-PCR测定，并不表达SOX2。因此，在具体的实施方式中，该羊膜来源贴壁细胞通过免疫定位（例如流式细胞术）测定是OCT-4^–、CD49f⁺、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–，以及通过，例如30轮的RT-PCR测定，是SOX2^–。

在具体的实施方式中，本文所述的AMDAC通过例如短期神经分化分析（见，例如下文6.3.3部分）测定是GFAP⁺。在另一具体的实施方式中，本文所述的AMDAC通过例如短期神经分化分析测定是β-微管蛋白III（Tuj1）⁺。在另一具体的实施方式中，该AMDAC是OCT-4^–、GFAP⁺和β-微管蛋白III（Tuj1）⁺。在另一具体的实施方式中，该AMDAC是OCT-4^–、CD200⁺、CD105⁺和CD49f⁺。在另一具体的实施方式中，该AMDAC是CD200⁺、CD105⁺、CD90⁺和CD73⁺。在另一具体的实施方式中，本文所述的AMDAC是CD117^–以及并非利用CD117的抗体选定。在另一具体的实施方式中，本文所述的AMDAC是CD146^–以及并非利用CD146的抗体选定。在另一具体的实施方式中，本文所述的AMDAC通过RT-PCR和/或免疫定位（例如流式细胞术）测定是OCT-4^–，以及通过，例如RT-PCR和/或免疫定位（例如流式细胞术）测定，用VEGF诱导后并不表达CD34。在另一具体的实施方式中，本文所述的方法中所用的AMDAC通过短期神经分化分析（见，例如下文6.3.3部分）测定是神经原性的。在另一具体的实施方式中，本文所述的方法中所用的AMDAC通过体外软骨形成潜能分析（见，例如下文6.3.2部分）测定是没有软骨形成的。在另一具体的实施方式中，本文所述的方法中所用的AMDAC通过成骨表型分析（见，例如下文6.3.1部分）测定是非成骨性的。在另一具体的实施方式中，本文所述的AMDAC在补充有100nM地塞米松、10mMβ-磷酸甘油、50μM L-抗坏血酸-2-磷酸盐，pH7.4的DMEM（高糖）中培养长达6周（例如达2周、4周或6周）之后是非成骨性的，其中成骨作用利用冯库萨染色法；茜素红染色法；或通过利用，例如RT-PCR检测骨桥蛋白、骨钙蛋白、骨粘连蛋白和/或骨唾液蛋白的存在来评估。

在另一具体的实施方式中，例如，OCT-4^–AMDAC可以通过，例如免疫定位（例如流式细胞术）测定，附加地为如下一种或多种：CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD98⁺、TEM-7⁺（肿瘤内皮标记7）、CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–、CD143^–（血管紧张肽-I-转化酶，ACE）、CD146^–（黑素瘤细胞粘附分子）或CXCR4^–（趋化因子（C-X-C基序）受体4）；或通过RT-PCR测定是HLA-G^–。在更具体的实施方式中，所述细胞通过，例如免疫定位（例如流式细胞术）测定是CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD98⁺、Tie-2⁺、TEM-7⁺、CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–、CD143^–、CD146^–和CXCR4^–，以及通过RT-PCR测定是HLA-G^–。在另一实施方式中，该羊膜来源贴壁细胞通过，例如免疫定位（例如流式细胞术）测定是如下一种或多种：CD31^–、CD34^–、CD45^–和/或CD133^–。在具体的实施方式中，该羊膜来源贴壁细胞通过RT-PCR测定是OCT-4^–；通过免疫定位（例如流式细胞术）测定是VEGFR1/Flt-1⁺和/或VEGFR2/KDR⁺；以及通过，例如免疫定位（例如流式细胞术）测定是如下一种或多种或全部：CD31^–、CD34^–、CD45^–和/或CD133^–。

在另一具体的实施方式中，所述AMDAC通过免疫定位（例如流式细胞术）测定附加地为VE-钙粘着蛋白^–。在另一具体的实施方式中，所述OCT-4^–细胞，单独地或结合其他标记，通过免疫定位（例如流式细胞术）测定附加地为阳性的：CD105⁺以及CD200⁺。在另一具体的实施方式中，所述细胞暴露于1至100ng/mL VEGF4至21天之后，通过例如免疫定位（例如流式细胞术）检测，并不表达CD34。在更具体的实施方式中，所述细胞暴露于25至75ng/mL VEGF4至21天或暴露于50ng/mL VEGF4至21天之后，通过免疫定位（例如流式细胞术）检测，并不表达CD34。在更多的具体实施方式中，所述细胞暴露于1、2.5、5、10、25、50、75或100ng/mL VEGF4至21天之后，通过免疫定位（例如流式细胞术）检测并不表达CD34。在仍然更多的具体实施方式中，所述细胞暴露于1至100ng/mL VEGF7至14天（例如7天）之后，通过免疫定位（例如流式细胞术）检测并不表达CD34。

在具体的实施方式中，该羊膜来源贴壁细胞通过RT-PCR测定是OCT-4^–，以及通过免疫定位（例如流式细胞术）测定是如下一种或多种：VE-钙粘着蛋白^–、VEGFR2/KDR⁺、CD9⁺、CD54⁺、CD105⁺和/或CD200⁺。在具体的实施方式中，该羊膜来源贴壁细胞通过RT-PCR测定是OCT-4^–以及通过免疫定位（例如流式细胞术）测定是VE-钙粘着蛋白^–、VEGFR2/KDR⁺、CD9⁺、CD54⁺、CD105⁺和CD200⁺。在另一具体的实施方式中，所述细胞，例如暴露于1至100ng/mL VEGF4至21天之后，通过免疫定位（例如流式细胞术）检测并不表达CD34。

在另一实施方式中，该羊膜来源贴壁细胞是OCT-4^–、CD49f⁺、HLA-G^–、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–。在更具体的实施方式中，所述细胞通过免疫定位（例如流式细胞术）测定是如下一种或多种：CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD98⁺、Tie-2⁺、TEM-7⁺、CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–、CD143^–、CD146^–或CXCR4^–。在更具体的实施方式中，所述细胞通过免疫定位（例如流式细胞术）测定是CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD98⁺、Tie-2⁺、TEM-7⁺、CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–、CD143^–、CD146^–和CXCR4^–。在另一具体的实施方式中，所述细胞通过免疫定位（例如流式细胞术）测定，附加地为VEGFR1/Flt-1⁺和/或VEGFR2/KDR⁺；以及通过免疫定位（例如流式细胞术）测定，是如下一种或多种：CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–和/或Tie-2^–。在另一具体的实施方式中，所述细胞通过免疫定位（例如流式细胞术）测定，附加地为VEGFR1/Flt-1⁺、VEGFR2/KDR⁺、CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–和Tie-2^–。

在另一实施方式中，该OCT-4–羊膜来源贴壁细胞通过免疫定位（例如流式细胞术）测定，附加地为如下一种或多种或全部：CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD49f⁺、CD54⁺、CD90⁺、CD98⁺、CD105⁺、CD200⁺、Tie-2⁺、TEM-7⁺、VEGFR1/Flt-1⁺和/或VEGFR2/KDR⁺（CD309⁺）；或通过免疫定位（例如流式细胞术）测定，附加地如下一种或多种或全部：CD31^–、CD34^–、CD38^–、CD45^–、CD117^–、CD133^-、CD143^–、CD144^–、CD146^–、CD271^–、CXCR4^–、HLA-G^–和/或VE-钙粘着蛋白^–；或通过RT-PCR测定是SOX2^–。

在某些实施方式中，分离的贴附于组织培养塑料的羊膜来源贴壁细胞是CD49f⁺。在具体的实施方式中，所述CD49f⁺细胞通过免疫定位（例如流式细胞术）测定，附加地为如下一种或多种或全部：CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD54⁺、 CD90⁺、CD98⁺、CD105⁺、CD200⁺、Tie-2⁺、TEM-7⁺、VEGFR1/Flt-1⁺和/或VEGFR2/KDR⁺（CD309⁺）；或通过免疫定位（例如流式细胞术）测定，附加地如下一种或多种或全部：CD31^–、CD34^–、CD38^–、CD45^–、CD117^–、CD133^–、CD143^–、CD144^–、CD146^–、CD271^–、CXCR4^–、HLA-G^–、OCT-4^–和/或VE-钙粘着蛋白^–；或通过RT-PCR测定是SOX2^–。

在某些其他的实施方式中，分离的贴附于组织培养塑料的羊膜来源贴壁细胞是HLA-G^–、CD90⁺和CD117^–。在具体的实施方式中，所述HLA-G^–、CD90⁺和CD117^–细胞通过免疫定位（例如流式细胞术）测定，附加地为如下一种或多种或全部：CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD49f⁺、CD54⁺、CD98⁺、CD105⁺、CD200⁺、Tie-2⁺、TEM-7⁺、VEGFR1/Flt-1⁺和/或VEGFR2/KDR⁺（CD309⁺）；或通过免疫定位（例如流式细胞术）测定，附加地如下一种或多种或全部：CD31^–、CD34^–、CD38^–、CD45^–、CD133^–、CD143^–、CD144^–、CD146^–、CD271^–、CXCR4^–、OCT-4^–和/或VE-钙粘着蛋白^–；或通过RT-PCR测定是SOX2^–。

在另一实施方式中，分离的羊膜来源贴壁细胞，在标准的培养条件下，通过，例如30轮的RT-PCR测定，基本上不表达如下的mRNA：血管生成素4（ANGPT4）、类血管生成素3（ANGPTL3）、钙粘着蛋白5、类型2（CDH5）、骨γ-羧基谷氨酸（gla）蛋白（BGLAP）、CD31、CD34、趋化因子（C-X-C基序）配体10（CXCL10）、远端缺失同源异型框（DLX5）、血纤蛋白原α链（FGA）、成纤维细胞生长因子4（FGF4）、FMS样酪氨酸激酶3（FLT3）、HLA-G、干扰素γ（IFNG）、白细胞细胞源性化学吸引素1（LECT1）、来普汀（LEP）、基质金属蛋白酶13（MMP-13）、NANOG、巢蛋白、血纤维蛋白溶酶原（PLG）、POU5F1（OCT-4）、促乳素（PRL）、促动力素1（PROK1）、（性别决定区Y）-框2（SOX2）、端粒酶逆转录酶（TERT）、腱调蛋白（TNMD）和/或含胞外连接域1（XLKD1）。

在其他的实施方式中，分离的羊膜来源贴壁细胞或羊膜来源贴壁细胞群表达（ARNT2）、神经生长因子（NGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）、神经胶质源性神经营养因子（GDNF）、神经营养因子-3（NT-3）、NT-5、缺氧诱导因子1α（HIF1A）、缺氧诱导蛋白2（HIG2）、血红素加氧酶1（解环）（HMOX1）、胞外超氧物歧化酶[Cu-Zn]（SOD3）、过氧化氢酶（CAT）、转化生长因子β1（TGFB1）、转化生长因子β1受体（TGFB1R）和肝细胞生长因子受体（HGFR/c-met）的mRNA。

在另一方面，本文提供分离的细胞群，例如分离的羊膜细胞或胎盘细胞的群；或包括本文所述的羊膜来源贴壁细胞的大体上分离的AMDAC群。细胞群可以是同源群，例如其中至少约90%、95%、98%或99%是羊膜来源贴壁细胞的细胞群。细胞群可以是异源的细胞群，例如，该群中至多约10%、20%、 30%、40%、50%、60%、70%或80%是羊膜来源贴壁细胞。然而，分离的细胞群不是组织，即羊膜。

在一个实施方式中，本文提供包括AMDAC的分离的细胞群，例如对于AMDAC大体上同源的细胞群或对于该AMDAC异源的细胞群，其中所述AMDAC贴附于组织培养塑料，以及其中所述AMDAC通过RT-PCR测定是OCT-4^–。在具体的实施方式中，该AMDAC通过，例如免疫定位（例如流式细胞术）或RT-PCR测定，是CD49f⁺或HLA-G⁺。在另一具体的实施方式中，所述细胞群中的所述AMDAC通过免疫定位（例如流式细胞术）测定是VEGFR1/Flt-1⁺和/或VEGFR2/KDR⁺，其中所述分离的细胞群不是羊膜或其他组织。在更具体的实施方式中，所述细胞群中的该AMDAC通过RT-PCR测定，是OCT-4^–和/或HLA-G^–；以及通过免疫定位（例如流式细胞术）测定，是VEGFR1/Flt-1⁺和/或VEGFR2/KDR⁺。在另一具体的实施方式中，所述AMDAC是CD90⁺、CD105⁺或CD117^–。在更具体的实施方式中，所述AMDAC是CD90⁺、CD105⁺和CD117^–。在更具体的实施方式中，该AMDAC是OCT-4^–、CD49f⁺、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–。在另一具体的实施方式中，该AMDAC通过，例如30轮的RT-PCR测定并不表达SOX2。在更具体的实施方式中，该群包括AMDAC，其中所述AMDAC通过免疫定位（例如流式细胞术）测定，是OCT-4^–、HLA-G^–、CD49f⁺、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–，以及通过，例如30轮的RT-PCR测定是SOX2^–。

在另一具体的实施方式中，所述细胞群中的所述AMDAC通过免疫定位（例如流式细胞术）测定是CD90⁺、CD105⁺或CD117^–。在更具体的实施方式中，该AMDAC通过免疫定位（例如流式细胞术）测定是CD90⁺、CD105⁺和CD117^–。在更具体的实施方式中，该AMDAC通过，例如RT-PCR测定，是OCT-4^–或HLA-G^–，以及通过免疫定位（例如流式细胞术）测定附加地是CD49f⁺、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–。在更具体的实施方式中，所述细胞群中的该AMDAC是OCT-4^–、HLA-G^–、CD49f⁺、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–。在另一具体的实施方式中，该AMDAC通过，例如30轮的RT-PCR测定并不表达SOX2。因此，在更具体的实施方式中，该AMDAC通过免疫定位（例如流式细胞术）测定，是OCT-4^–、CD49f⁺、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–，以及通过，例如30轮的RT-PCR测定，是SOX2^–。在更具体的实施方式中，该AMDAC是OCT-4^–或HLA-G^–以及附加地是CD49f⁺、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–。在更具体的实施方式中，该AMDAC是OCT-4^–、HLA-G^–、CD49f⁺、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–。

在另一实施方式中，所述细胞群中的羊膜来源贴壁细胞贴附于组织培养塑料；通过RT-PCR测定是OCT-4^–；以及通过免疫定位（例如流式细胞术）测定是VEGFR1/Flt-1⁺和/或VEGFR2/KDR⁺；以及通过免疫定位（例如流式细胞术）测定附加地为CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD98⁺、Tie-2⁺、TEM-7⁺、CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–、CD143^–、CD146^–或CXCR4^–的一种或多种；或通过RT-PCR测定是HLA-G^–；以及其中所述分离的细胞群不是羊膜。在另一实施方式中，本文提供包括羊膜来源贴壁细胞的分离的细胞群，其中所述细胞贴附于组织培养塑料，其中所述细胞通过RT-PCR测定是OCT-4^–以及通过免疫定位（例如流式细胞术）测定是VEGFR1/Flt-1⁺和/或VEGFR2/KDR⁺，其中所述细胞暴露于1至100ng/mL VEGF4至21天之后，通过免疫定位（例如流式细胞术）检测并不表达CD34，以及其中所述分离的细胞群不是羊膜。

在任何上述实施方式的具体实施方式中，所述群中至少约50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%的细胞是通过上文所述的任何细胞标记组合描述或以其为特点的所述羊膜来源贴壁细胞。

在另一实施方式中，当，例如在基质（例如胎盘胶原或MATRIGEL^TM；仅作为举例）中或在其上，并在如下胞外基质蛋白存在下培养至少4天，乃至14天时，任何上述包括羊膜来源贴壁细胞的细胞群形成籽芽或管状样结构：存在细胞外基质蛋白，像I型和IV型胶原蛋白（仅作为举例）；或存在血管原性因子，像血管内皮生长因子（VEGF）、上皮生长因子（EGF）、血小板源性生长因子（PDGF）或碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）（仅作为举例）。

在某些实施方式中，本文提供为表达如下一种或多种或全部RNA的细胞，或细胞群，其中在所述分离的细胞群中至少约50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%的细胞是表达如下一种或多种或全部RNA羊膜来源贴壁细胞：ACTA2（肌动蛋白，α2，平滑肌，主动脉）、ACTC1（肌动蛋白，α心肌1）、ADAMTS1（具有1型血小板反应蛋白基序的ADAM金属肽酶，1）、AMOT（血管动蛋白）、ANG（血管生成素）、ANGPT1（血管生成素1）、ANGPT2、ANGPTL1（类血管生成素1）、ANGPTL2、ANGPTL4、BAI1（脑特异性血管生成抑制剂1）、c-myc、CD44、CD140a、CD140b、CD200、CD202b、CD304、CD309、CEACAM1（癌胚抗原相关的细胞粘附分子1）、CHGA（嗜铬粒蛋白A）、COL15A1（胶原蛋白，类型XV，α1）、COL18A1（胶原蛋白，类型XVIII，α1）、COL4A1（胶原蛋白，类型IV，α1）、COL4A2（胶原蛋白，类型IV，α2）、COL4A3（胶原蛋白，类型IV，α3）、连接蛋白-43、CSF3（集落刺激因子3（粒细胞）、CTGF（结缔组织生长因子）、CXCL12（趋化因子（CXC基序）配体12（基质细胞源性因子1））、CXCL2、DNMT3B（DNA（胞嘧啶-5-）-甲基转移酶3β）、ECGF1（胸苷磷酸化酶）、EDG1（内皮细胞分化基因1）、EDIL3（EGF样重复和盘状I样域3）、ENPP2（抗核苷酸内焦磷酸酶/磷酸二酯酶2）、EPHB2（EPH 受体B2）、FBLN5（FIBULIN5）、F2（凝结因子II（凝血酶））、FGF1（酸性成纤维细胞生长因子）、FGF2（碱性成纤维细胞生长因子）、FIGF（c-fos诱导的生长因子（血管内皮生长因子D））、FLT4（fms相关的酪氨酸激酶4）、FN1（纤连蛋白1）、FST（卵泡抑素）、FOXC2（叉头框C2（MFH-1，间充质叉头1））、卵泡抑素、半乳凝素-1、GRN（颗粒体蛋白）、HGF（肝细胞生长因子）、HEY1（与YRPW基序1相关的发状/裂增强剂）、HSPG2（硫酸乙酰肝素蛋白聚糖2）、IFNB1（干扰素，β1，成纤维细胞）、IL8（白介素8）、IL12A、ITGA4（整联蛋白，α4；CD49d）、ITGAV（整联蛋白，αV）、ITGB3（整联蛋白，β3）、KLF4（Kruppel样因子4）、MDK（肝素结合细胞因子）、MMP2（基质金属蛋白酶2）、MYOZ2（肌原调节蛋白2）、NRP2（神经菌毛素2）、PDGFB（血小板源性生长因子β）、PF4（血小板因子4）、PGK1（磷酸甘油酸激酶1）、PROX1（普洛斯彼同源异型框1）、PTN（多功能生长因子）、SEMA3F（semophorin3F）、SERPINB5（丝氨酸蛋白酶抑制剂肽酶抑制因子，进化枝B（卵白蛋白），成员5）、SERPINC1、SERPINF1、TIMP2（金属蛋白酶的组织抑制剂2）、TIMP3、TGFA（转化生长因子α）、TGFB1、THBS1（血小板反应蛋白1）、THBS2、TIE1（具有免疫球蛋白样和EGF样域的酪氨酸激酶1）、TNF（肿瘤坏死因子）、TNNC1（1型肌钙蛋白C）、TNNT2、TNFSF15（肿瘤坏死因子（配体）超家族，成员15）、VASH1（vasohibin1）、VEGF（血管内皮生长因子）、VEGFB、VEGFC和/或VEGFR1/FLT1（血管内皮生长因子受体1）。

当使用人细胞时，所有的基因符号指人序列，以及，本领域的技术人员已知，代表性序列可以在文献或在GenBank中发现。序列探针可以通过向公众公开的序列，或通过商业渠道，例如特异性TAQMAN

探针或TAQMANAngiogenesis Array（Applied Biosystems，料号4378710）确定。

在某些实施方式中，本文提供通过免疫定位检测，表达如下的细胞或细胞群，其中在所述分离的细胞群中至少约50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%的细胞是羊膜来源贴壁细胞：CD49d、连接蛋白-43、HLA-ABC、Β2-微球蛋白、CD349、CD318、PDL1、CD106、半乳凝素-1、ADAM17前体（A解聚素以及金属蛋白酶域17）（TNF-α转化酶）（TNF-α转换酶）、血管紧张肽原前体、细丝蛋白A（α-细丝蛋白）（细丝蛋白1）（内皮肌动蛋白-结合蛋白）（ABP-280）（非肌细丝蛋白）、Α-辅肌动蛋白1（α-辅肌动蛋白细胞骨架异形体）（非肌α-辅肌动蛋白1）（F-肌动蛋白交联蛋白）、低密度脂蛋白受体相关的蛋白2前体（巨蛋白）（糖蛋白330）（gp330）、型I和II巨噬细胞清道夫受体（巨噬细胞乙酰化的LDL受体I和II）、活化素受体IIB型前体（ACTR-IIB）、Wnt-9蛋白、胶质细胞原纤维酸性蛋白、星形细胞（GFAP）、肌球蛋白-结合蛋白C、心脏型（心脏MyBP-C）（C-蛋白，心肌异形体）和/或肌球蛋白重链、非肌型A（细胞肌球蛋白重链，类型A）（非肌肌球蛋白重链-A）（NMMHC-A）。

在某些实施方式中，该羊膜来源贴壁细胞或包括羊膜来源贴壁细胞的细胞群（例如，其中在所述分离的细胞群中至少约50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%的细胞是羊膜来源贴壁细胞），例如向所述细胞生长的培养基中分泌如下一种或多种或全部：VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、卵泡抑素、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR、半乳凝素-1。

在另一实施方式中，本文提供细胞群，例如羊膜来源贴壁细胞群或这样的细胞群：其中所述分离的细胞群中至少约50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%的细胞是以高于骨髓来源间质干细胞的水平表达微RNA（miRNA）的羊膜来源贴壁细胞，其中所述miRNA包括如下一种或多种或全部：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92和/或miR-296。在另一实施方式中，本文提供细胞群，例如羊膜来源贴壁细胞群或这样的细胞群：其中所述分离的细胞群中至少约50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%的细胞是以低于骨髓来源间质干细胞的水平表达微RNA（miRNA）的一种或多种或全部的羊膜来源贴壁细胞，其中所述miRNA包括一种或多种或全部：miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b和/或miR-16。在某些实施方式中，AMDAC或AMDAC群表达如下血管原性miRNA的一种或多种或全部：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b（血管原性miRNA簇17-92的成员）、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b和/或miR-16。

在一个实施方式中，本文提供分离的羊膜来源贴壁细胞，其中所述细胞贴附于组织培养塑料，其中所述细胞通过RT-PCR测定是OCT-4^–，以及通过免疫定位（例如流式细胞术）测定是CD49f⁺、HLA-G^–、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–，以及其中所述细胞：（a）通过免疫定位（例如流式细胞术）测定表达如下一种或多种：CD9、CD10、CD44、CD54、CD98、CD200、Tie-2、TEM-7、VEGFR1/Flt-1或VEGFR2/KDR（CD309）；（b）通过免疫定位（例如流式细胞术）测定缺乏如下的表达：CD31、CD34、CD38、CD45、CD133、CD143、CD144、CD146、CD271、CXCR4、HLA-G或VE-钙粘着蛋白；（c）通过RT-PCR测定缺乏SOX2的表达；（d）表达如下mRNA：ACTA2、ADAMTS1、AMOT、ANG、ANGPT1、ANGPT2、ANGPTL1、ANGPTL2、ANGPTL4、BAI1、c-myc、CD44、CD140a、CD140b、CD200、CD202b、CD304、CD309、CEACAM1、CHGA、COL15A1、COL18A1、 COL4A1、COL4A2、COL4A3、连接蛋白-3、CSF3、CTGF、CXCL12、CXCL2、DNMT3B、ECGF1、EDG1、EDIL3、ENPP2、EPHB2、FBLN5、F2、FGF1、FGF2、FIGF、FLT4、FN1、FST、FOXC2、半乳凝素-1、GRN、HGF、HEY1、HSPG2、IFNB1、IL8、IL12A、ITGA4、ITGAV、ITGB3、KLF-4、MDK、MMP2、MYOZ2、NRP2、PDGFB、PF4、PGK1、PROX1、PTN、SEMA3F、SERPINB5、SERPINC1、SERPINF1、TGFA、TGFB1、THBS1、THBS2、TIE1、TIMP2、TIMP3、TNF、TNNC1、TNNT2、TNFSF15、VASH1、VEGF、VEGFB、VEGFC或VEGFR1/FLT1；（e）表达如下一种或多种：蛋白CD49d、连接蛋白-43、HLA-ABC、Β2-微球蛋白、CD349、CD318、PDL1、CD106、半乳凝素-1、ADAM17、血管紧张肽原前体、细丝蛋白A、α-辅肌动蛋白1、巨蛋白、巨噬细胞乙酰化的LDL受体I和II、活化素受体IIB型前体、Wnt-9蛋白、胶质细胞原纤维酸性蛋白、星形细胞、肌球蛋白-结合蛋白C或肌球蛋白重链、非肌型A；（f）向所述细胞生长的培养基中分泌VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、卵泡抑素、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR或半乳凝素-1；（g）以高于相同数量骨髓来源间质干细胞的水平表达微RNA miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92或miR-296；（h）以低于相同数量骨髓来源间质干细胞的水平表达微RNA miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b或miR-16；（i）表达miRNA miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b或miR-16；和/或（j）与21%O₂条件下的CD202b、IL-8或VEGF的表达相比，在少于约5%O₂中培养时以更高水平表达CD202b、IL-8或VEGF。在具体的实施方式中，该分离的羊膜来源贴壁细胞通过RT-PCR测定是OCT-4^–以及通过免疫定位（例如流式细胞术）测定是CD49f⁺、HLA-G^–、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–，以及（a）通过免疫定位（例如流式细胞术）测定表达CD9、CD10、CD44、CD54、CD90、CD98、CD200、Tie-2、TEM-7、VEGFR1/Flt-1和VEGFR2/KDR（CD309）；（b）通过免疫定位（例如流式细胞术）测定缺乏CD31、CD34、CD38、CD45、CD133、CD143、CD144、CD146、CD271、CXCR4、HLA-G和VE-钙粘着蛋白的表达；（c）通过RT-PCR测定缺乏SOX2的表达；（d）表达如下mRNA：ACTA2、ADAMTS1、AMOT、ANG、ANGPT1、ANGPT2、ANGPTL1、ANGPTL2、ANGPTL4、BAI1、c-myc、CD44、CD140a、CD140b、CD200、CD202b、CD304、CD309、CEACAM1、CHGA、COL15A1、COL18A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、连接蛋白-3、CSF3、CTGF、CXCL12、CXCL2、DNMT3B、ECGF1、EDG1、EDIL3、ENPP2、EPHB2、FBLN5、F2、FGF1、FGF2、FIGF、FLT4、 FN1、FST、FOXC2、半乳凝素-1、GRN、HGF、HEY1、HSPG2、IFNB1、IL8、IL12A、ITGA4、ITGAV、ITGB3、KLF-4、MDK、MMP2、MYOZ2、NRP2、PDGFB、PF4、PGK1、PROX1、PTN、SEMA3F、SERPINB5、SERPINC1、SERPINF1、TGFA、TGFB1、THBS1、THBS2、TIE1、TIMP2、TIMP3、TNF、TNNC1、TNNT2、TNFSF15、VASH1、VEGF、VEGFB、VEGFC和VEGFR1/FLT1；（e）表达如下一种或多种：CD49d、连接蛋白-43、HLA-ABC、Β2-微球蛋白、CD349、CD318、PDL1、CD106、半乳凝素-1、ADAM17、血管紧张肽原前体、细丝蛋白A、α-辅肌动蛋白1、巨蛋白、巨噬细胞乙酰化的LDL受体I和II、活化素受体IIB型前体、Wnt-9蛋白、胶质细胞原纤维酸性蛋白、星形细胞、肌球蛋白-结合蛋白C和/或肌球蛋白重链、非肌型A；（f）向，例如所述细胞生长的培养基中分泌VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、卵泡抑素、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR和/或半乳凝素-1；（g）以高于相同数量骨髓来源间质干细胞的水平表达微RNA miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92和miR-296；（h）以低于相同数量骨髓来源间质干细胞的水平表达微RNA miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b和miR-16；（i）表达miRNA miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b和miR-16；和/或（j）与在21%O₂条件下培养的CD202b、IL-8和/或VEGF的表达相比，在少于约5%O₂中培养时以更高水平表达CD202b、IL-8和VEGF。本文进一步提供包括AMDAC的细胞群，例如，具有上述一种或多种特点的AMDAC群。

在其他具体的实施方式中，包括羊膜来源血管原性细胞的细胞群在体外伤愈检测中，分泌一种或多种血管原性因子，从而诱导人内皮细胞迁移。在其他具体的实施方式中，包括羊膜来源贴壁细胞的细胞群诱导人内皮细胞、内皮祖细胞、肌细胞或成肌细胞成熟、分化或增殖。

在另一实施方式中，当，例如在基质（例如胎盘胶原或MATRIGEL^TM；仅作为举例）上，并在如下胞外基质蛋白存在下培养时，任何上述羊膜来源贴壁细胞或包括羊膜来源贴壁细胞的细胞群吸收乙酰化的低密度脂蛋白（LDL）：存在细胞外基质蛋白，如I型或IV型胶原蛋白；和/或存在血管原性因子，如VEGF、EGF、PDGF或bFGF。

在另一实施方式中，该AMDAC包含在细胞群中。在这类实施方式中的具体实施方式中，该羊膜来源贴壁细胞贴附于组织培养塑料，通过RT-PCR测定是OCT-4^–，以及通过免疫定位（例如流式细胞术）测定，是VEGFR2/KDR⁺、CD9⁺、CD54⁺、CD105⁺、CD200⁺或VE-钙粘着蛋白^–。在具体的实施方式中，所述细胞群中至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、 70%、80%、90%、95%、98%或99%的细胞是羊膜来源细胞，所述羊膜来源细胞通过RT-PCR测定，是OCT-4^–，以及通过免疫定位（例如流式细胞术）测定，是VEGFR2/KDR⁺、CD9⁺、CD54⁺、CD105⁺、CD200⁺或VE-钙粘着蛋白^–。在另一具体的实施方式中，所述群中至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%的细胞是羊膜来源细胞，所述羊膜来源细胞通过RT-PCR测定，是OCT-4^–，以及通过免疫定位（例如流式细胞术）测定，是VEGFR2/KDR⁺、CD9⁺、CD54⁺、CD105⁺、CD200⁺和VE-钙粘着蛋白^–。在另一具体的实施方式中，所述细胞通过RT-PCR测定，是OCT-4^–，以及通过免疫定位（例如流式细胞术）测定，是VEGFR2/KDR⁺、CD9⁺、CD54⁺、CD105⁺、CD200⁺或VE-钙粘着蛋白^–，以及暴露于1至100ng/mL VEGF4至21天之后，通过免疫定位（例如流式细胞术）测定并不表达CD34。在另一具体的实施方式中，所述细胞还是VE-钙粘着蛋白^–。

在具体的实施方式中，所述羊膜来源细胞通过RT-PCR测定，是OCT-4^–，以及通过免疫定位（例如流式细胞术）测定，是VEGFR2/KDR⁺、CD9⁺、CD54⁺、CD105⁺、CD200⁺或VE-钙粘着蛋白^–，当所述细胞群在存在血管内皮生长因子（VEGF）的条件下培养时，所述羊膜来源细胞形成籽芽或管状样结构。

本文所述的羊膜来源贴壁细胞在原代培养物或在适于培养干细胞的培养基中增殖的过程中，显示上述特点，例如细胞表面标记和/或基因表达谱的组合。这类培养基包括，例如，包括1至100%DMEM-LG（Gibco）、1至100%MCDB-201（Sigma）、1至10%胎牛血清（FCS）（Hyclone Laboratories）、0.1至5x胰岛素-铁传递蛋白-硒（ITS，Sigma）、0.1至5x亚麻酸牛血清白蛋白（LA-BSA，Sigma）、10^-5至10^-15M地塞米松（Sigma）、10^-2至10^-10M抗坏血酸2-磷酸盐（Sigma）、1至50ng/mL表皮生长因子（EGF），（R&DSystems）、1至50ng/mL血小板源性-生长因子（PDGF-BB）（R&D Systems）和100U青霉素/1000U链霉素的培养基。在具体的实施方式中，该培养基包括60%DMEM-LG（Gibco）、40%MCDB-201（Sigma）、2%胎牛血清（FCS）（Hyclone Laboratories）、1x胰岛素-铁传递蛋白-硒（ITS）、1x亚麻酸牛血清白蛋白（LA-BSA）、10^-9M地塞米松（Sigma）、10^-4M抗坏血酸2-磷酸盐（Sigma）、表皮生长因子（EGF）10ng/ml（R&D Systems）、血小板源性-生长因子（PDGF-BB）10ng/ml（R&D Systems）和100U青霉素/1000U链霉素。其他合适的培养基如下文所述。

本文提供的分离的羊膜来源贴壁细胞群在，例如容器中，可以包括约、至少约或不多于约1x10⁵、5x10⁵、1x10⁶、5x10⁶、1x10⁷、5x10⁷、1x10⁸、5x10⁸、1x10⁹、5x10⁹、1x10¹⁰、5x10¹⁰、1x10¹¹或更多个羊膜来源贴壁细胞。在各种实施方式中，本文提供的分离的细胞群中，至少10%、20%、 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%的细胞是该羊膜来源贴壁细胞。也就是，分离的羊膜来源贴壁细胞群可以包括，例如多达1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的非AMDAC细胞。在其他具体的实施方式中，在该包括羊膜来源贴壁细胞的分离的细胞群中，至少25%、35%、45%、50%、60%、75%、85%或更多的细胞不是OCT-4⁺。

本文提供的羊膜来源贴壁细胞可以在基质上培养。在各种实施方式中，该基质可以是任何表面，在其上可以完成对羊膜来源贴壁细胞的培养和/或选择。通常，该基质是塑料，例如组织培养皿或多孔板塑料。组织培养塑料可以用生物分子或合成的模拟药剂（例如CELLTART^TM、MESENCULT^TMACF-基质、鸟氨酸或聚赖氨酸）或胞外基质蛋白（例如胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白或诸如此类）处理、涂覆或印记。

本文提供的羊膜来源贴壁细胞和这类细胞的群可以从一种或多种胎盘中分离。分离的羊膜来源细胞可以经培养和扩增，以产生这类细胞的群。包括羊膜来源贴壁细胞的细胞群还可以经培养和扩增，以产生羊膜来源贴壁细胞群。

在某些实施方式中，显示任何上述标记和/或基因表达特点的AMDAC已经传代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次或更多次。在某些其他的实施方式中，显示任何上述标记和/或基因表达特点的AMDAC经培养，已经过至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或至少50次或更多次倍增。

在具体的实施方式中，本文所述的AMDAC通过RT-PCR和/或TRAP分析测得，对于端粒酶是阴性的。在另一具体的实施方式中，本文所述的AMDAC通过例如30轮的RT-PCR测定，并不表达端粒酶逆转录酶（TERT）mRNA。在另一具体的实施方式中，本文所述的AMDAC通过RT-PCR测得是NANOG^–。在另一具体的实施方式中，本文所述的AMDAC通过例如30轮的RT-PCR测定，并不表达NANOG mRNA。在具体的实施方式中，本文所述的AMDAC对于（性别决定区Y）-框2（SOX2）是阴性的。在另一具体的实施方式中，本文所述的AMDAC通过例如30轮的RT-PCR测定，并不表达SOX2mRNA。在另一具体的实施方式中，本文所述的AMDAC通过成骨表型分析（见，例如下文6.3.1部分）测定是非成骨性的。在另一具体的实施方式中，本文所述的AMDAC通过软骨形成潜能分析（见，例如下文6.3.2部分）测定是没有软骨形成的。在另一具体的实施方式中，本文所述的AMDAC通过成骨表型分析（见，例如下文6.3.1部分）测定是非成骨性的以及通过软骨形成潜能分析（见，例如下文6.3.1部分）测定是没有软骨形成的。

AMDAC通过RT-PCR测定，可以显示本文所述的一种或多种特点，如表3中所示。例如，当经过如下文5.6部分所述的分离和培养时，AMDAC可以显示一种或多种这类特点。

表3

AMDAC通过免疫定位（例如流式细胞术）测定，可以显示本文所述的一种或多种特点，如表4中所示。例如，当经过如下文5.6部分所述的分离和培养时，AMDAC可以显示一种或多种这类特点。

表4

AMDAC通过免疫定位（例如免疫荧光和/或免疫组织化学）测定，可以显示本文所述的一种或多种特点，如表5中所示。例如，当经过如下文5.6部分所述的分离和培养时，AMDAC可以显示一种或多种这类特点。

表5

AMDAC标记	阳性	阴性
			CD31		X
CD34		X
			VEGFR2/KDR	X
连接蛋白-43	X
			半乳凝素-1	X
TEM-7	X

AMDAC通过免疫定位（例如膜蛋白质组学）测定，可以显示本文所述的一种或多种特点，如表6中所示。例如，当经过如下文5.6部分所述的分离和培养时，AMDAC可以显示一种或多种这类特点。

表6

AMDAC通过分泌组分析（例如ELISA）测定，可以显示本文所述的一种或多种特点，如表7中所示。例如，当经过如下文5.6部分所述的分离和培养时，AMDAC可以显示一种或多种这类特点。

表7

AMDAC标记	阳性	阴性
			ANG	X
EGF	X
			ENA-78	X

[0274]

FGF2	X
		卵泡抑素	X
G-CSF	X
		GRO	X
HGF	X
		IL-6	X
IL-8	X
		来普汀	X
MCP-1	X
		MCP-3	X
PDGFB	X
		PLGF	X
T细胞激活分泌调节因子	X
		TGFB1	X
血小板生成素	X
		TIMP1	X
TIMP2	X
		uPAR	X
VEGF	X
		VEGFD	X

5.4包括其他细胞类型的羊膜来源贴壁细胞群

本文所述的包括羊膜来源贴壁细胞的分离的细胞群可以包括第二类型的细胞，例如不是羊膜来源贴壁细胞的胎盘细胞；或者，例如不是胎盘细胞的细胞。例如，羊膜来源贴壁细胞的分离群可以包括，例如可以结合，第二类型的细胞群，其中所述第二类型的细胞是，例如胚胎干细胞；血液细胞（例如胎盘血；胎盘血细胞；脐血；脐血细胞；外周血液；外周血液细胞；来自胎盘血、脐血或外周血液的有核细胞；等等）；从血液中分离的干细胞（例如从胎盘血、脐血或外周血液中分离的干细胞）；胎盘干细胞（例如美国专利号7,468,276和美国专利申请公开号2007/0275362（其披露内容以引用方式全部并入本文）中所述的胎盘干细胞）；来自胎盘灌洗液的有核细胞（例如来自胎盘灌洗液的全部有核细胞）；美国专利号7,638,141（其披露内容特此以引用方式全部并入本文）中所述并请求保护的细胞；脐带干细胞；血液来源有核细胞群；骨髓来源间充质基质细胞；骨髓来源间质干细胞；骨髓来源造血干细胞；天然骨髓；成体干细胞；包含在组织中的干细胞群；培养的细胞（例如培养的干细胞）；完全分化的细胞（例如软骨细胞、成纤维细胞、羊膜细胞、成骨细胞、肌细胞、心肌细胞等等）的群；周皮细胞等等。在具体的实施方式中，包括羊膜来源贴壁细胞的分离的细胞群包括胎盘干细胞或来自脐带的干细胞。在所述第二类型的细胞是血液或血液细胞的某些实施方式，红细胞已经从所述示细胞群中移除。

在具体的实施方式中，该第二类型的细胞是造血干细胞。这类造血干细胞可以是，例如，包含在未处理的胎盘血、脐血或外周血液中；在来自胎盘血、脐血或外周血液的全部有核细胞中；在来自胎盘血、脐血或外周血液的CD34⁺细胞的分离群中；在未处理的骨髓中；在来自骨髓的全部有核细胞中；在来自骨髓的CD34⁺细胞的分离群中；或诸如此类。

在另一实施方式中，该第二细胞类型是非胚胎细胞类型，该类型在培养物中经过操作，以表达与胚胎干细胞有关的复效以及多种功能的标记。

在上述羊膜来源贴壁细胞的分离群的具体实施方式中，该羊膜来源贴壁细胞和/或第二类型的细胞对该细胞的预定接收者来说，是自体的或是同种异体的。

本文进一步提供一种组合物，该组合物包括羊膜来源贴壁细胞，以及非所述羊膜来源贴壁细胞的多个干细胞。在具体的实施方式中，该组合物包括从胎盘中获得的干细胞，即胎盘干细胞，例如美国专利号7,045,148；7,255,879和7,311,905以及美国专利申请公开号2007/0275362（每个专利的披露内容以引用方式全部并入本文）中所述的胎盘干细胞。在具体的实施方式中，该胎盘干细胞是CD34^–、CD10⁺以及CD105⁺。在更具体的实施方式中，该胎盘干细胞是CD34^–、CD10⁺、CD105⁺以及CD200⁺。在更具体的实施方式中，该胎盘干细胞是CD34^–、CD45^–、CD10⁺、CD90⁺、CD105⁺以及CD200⁺。在更具体的实施方式中，该胎盘干细胞是CD34^–、CD45^–、CD80^–、CD86^–、CD10⁺、CD90⁺、CD105⁺以及CD200⁺。在其他具体的实施方式中，所述胎盘干细胞是CD200⁺和HLA-G⁺；CD73⁺、CD105⁺和CD200⁺；CD200⁺和OCT-4⁺；CD73⁺、CD105⁺和HLA-G⁺；是CD73⁺和CD105⁺，以及当所述群在允许胚胎体样小体形成的条件下培养时，所述胎盘干细胞便于包括所述干细胞的胎盘细胞群中形成一种或多种胚胎体样小体；或是OCT-4⁺以及当所述群在允许胚胎体样小体形成的条件下培养时，所述胎盘干细胞便于包括该干细胞的胎盘细胞群中形成一种或多种胚胎体样小体；或是其任何组合。在更具体的实施方式中，所述CD200⁺、HLA-G⁺干细胞是CD34^–、CD38^–、CD45^–、CD73⁺以及CD105⁺。在另一更具体的实施方式中，所述CD73⁺、CD105⁺和CD200⁺干细胞是CD34^–、CD38^–、CD45^–和HLA-G⁺。在另一更具体的实施方式中，所述CD200⁺、OCT-4⁺干细胞是CD34^–、CD38^–、CD45^–、CD73⁺、CD105⁺以及HLA-G⁺。在另一更具体的实施方式中，所述CD73⁺、CD105⁺以及HLA-G⁺干细胞是CD34^–、CD45^–、OCT-4⁺以及CD200⁺。在另一更具体的实施方式中，所述CD73⁺和CD105⁺干细胞是OCT-4⁺、CD34^–、CD38^–以及CD45^–。在另一更具体的实施方式中，所述OCT-4⁺干细胞是CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD34^–、CD38^–和CD45^–。在另一更具体的实施方式中，该胎盘干细胞在来源上是母体的（也就是，有母体基因型）。在另一更具体的实施方式中，该胎盘干细胞在来源上是胎儿的（也就是，有胎儿基因型）。

在另一具体的实施方式中，该组合物包括羊膜来源贴壁细胞和胚胎干细胞。在另一具体的实施方式中，该组合物包括羊膜来源贴壁细胞以及间充质基质或干细胞，例如骨髓来源间充质基质或干细胞。在另一具体的实施方式中，该组合物包括骨髓来源造血干细胞。在另一具体的实施方式中，该组合物包括羊膜来源贴壁细胞以及造血祖细胞，例如来自骨髓、胎儿血液、脐血、胎盘血和/或外周血液的造血祖细胞。在另一具体的实施方式中，该组合物包括羊膜来源贴壁细胞和成体干细胞。在更具体的实施方式中，所述成体干细胞是神经干细胞、肝干细胞、胰腺干细胞、内皮干细胞、心肌干细胞或肌干细胞。

在其他具体的实施方式中，该第二类型的细胞包括所述群中约、至少或不多于10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%的细胞。在其他具体的实施方式中，所述组合物中的AMDAC包括所述组合物中至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%的细胞。在其他具体的实施方式中，该羊膜来源贴壁细胞包括所述群中约、至少或不多于10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%或45%的细胞。在其他具体的实施方式中，所述群中至少25%、35%、45%、50%、60%、75%、85%或更多的细胞不是OCT-4⁺。

羊膜来源贴壁细胞的分离群中的细胞可以按如下的比率结合另一类型的多个细胞，例如结合干细胞群：约100,000,000:1；50,000,000:1；20,000,000:1；10,000,000:1；5,000,000:1；2,000,000:1；1,000,000:1；500,000:1；200,000:1；100,000:1；50,000:1；20,000:1；10,000:1；5,000:1；2,000:1；1,000:1；500:1；200:1；100:1；50:1；20:1；10:1；5:1；2:1；1:1；1:2；1:5；1:10；1:100；1:200；1:500；1:1,000；1:2,000；1:5,000；1:10,000；1:20,000；1:50,000；1:100,000；1:500,000；1:1,000,000；1:2,000,000；1:5,000,000；1:10,000,000；1:20,000,000；1:50,000,000；或约1:100,000,000（与每个群中全部有核细胞的数目相比）。羊膜来源贴壁细胞的分离群中的细胞还可以结合多个细胞类型的多个细胞。

5.5培养物中的培育

对于任何哺乳动物细胞，本文所述的羊膜来源贴壁细胞的培育在某种程度上取决于选定用于培育的特定培养基。在最佳条件下，羊膜来源贴壁细胞在大约24h内通常会数量倍增。培养的过程中，本文所述的羊膜来源贴壁细胞贴附于培养物中的基质，例如，组织培养容器的表面（如组织培养皿塑料、涂覆有纤连蛋白的塑料等等）并形成单层。通常，所述细胞在消化羊膜之后的2-7天之内在培养物中培植。它们每天以大约0.4至1.2个群体倍增数增殖以及可以经历至少30至50个群体倍增数。所述细胞在亚汇合（subconfluence）和扩增的过程中显示间充质/成纤维细胞样表型，以及培养物中汇合（confluence）和增殖时的立方体/鹅卵石样外观受到强烈的接触抑制。羊膜来源贴壁细胞群可以在培养物中扩增的过程中，形成胚胎体样小体。羊膜来源贴壁细胞可以在含氧量正常或含氧量低的条件（例如从约0.1%O₂至约21%O₂，如约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%或21%O₂）下培育。

5.6获得羊膜来源贴壁细胞的方法

该羊膜来源贴壁细胞和包括该羊膜来源贴壁细胞的细胞群可以例如，通过如下特定方法，从其他细胞或细胞群中产生（例如分离）：消化羊膜组织，接着可选地对所得的细胞或细胞群进行存在或不存在标记或标记组合的评估，或者接着获得羊膜细胞并基于羊膜来源贴壁细胞特有的标记进行选择。

本文提供的羊膜来源贴壁细胞和包括该羊膜来源贴壁细胞的分离细胞群可以通过，例如消化羊膜组织，接着进行贴壁细胞选择而产生。在一个实施方式中，例如，分离的羊膜来源贴壁细胞或包括羊膜来源贴壁细胞的分离细胞群可以通过如下步骤产生：（1）用第一酶消化羊膜组织，以将细胞从来自羊膜的间充质层的羊膜的上皮层中分离出来；（2）接着用第二酶消化该羊膜的间充质层，以形成单细胞悬液；（3）在组织培养表面（例如组织培养塑料）上培养所述单细胞悬液中的细胞；以及（4）更换培养基之后，选择贴附于所述表面的细胞，从而产生包括羊膜来源贴壁细胞的分离细胞群。在具体的实施方式中，所述第一酶是胰蛋白酶。在更具体的实施方式中，所述胰蛋白酶按每克待消化的羊膜组织，含于5-20，例如10mL溶液的0.25%胰蛋白酶（w/v）的浓度使用。在另一更具体的实施方式中，允许利用胰蛋白酶的所述消化于37℃条件下进行约15min并重复多达三次。在另一具体的实施方式中，所述第二酶是胶原蛋白酶。在更具体的实施方式中，所述胶原蛋白酶按每克待消化的羊膜组织，含于5mL溶液的50到500U/L之间的浓度使用。在另一更具体的实施方式中，允许利用胶原蛋白酶的所述消化于37℃条件下进行约45-60min。在另一具体的实施方式中，用胶原蛋白酶消化之后形成的单细胞悬液在步骤（2）和步骤（3）之间通过，例如75μm–150μM的滤器过滤。在另一具体的实施方式中，所述第一酶是胰蛋白酶以及所述第二酶是胶原蛋白酶。

在另一实施方式中，包括羊膜来源贴壁细胞的分离细胞群可以通过从羊膜（例如，如本文他处所述，通过消化羊膜组织获得的细胞）中选择显示羊膜来源贴壁细胞一种或多种特点的细胞而获得。在一个实施方式中，例如，细胞群通过一种方法产生，该方法包括：选择确认（a）通过RT-PCR测定对于OCT-4是阴性的细胞，以及（b）通过免疫定位（例如流式细胞术）测定或选择，对VEGFR2/KDR、CD9、CD54、CD105、CD200的一种或多种是阳性的细胞；以及将所述细胞与其他细胞分离开来，以形成细胞群。在具体的实施方式中，所述羊膜细胞附加地为VE-钙粘着蛋白^–。在具体的实施方式中，细胞群通过如下手段产生：选择（a）通过RT-PCR测定对于OCT-4以及通过免疫定位（例如流式细胞术）测定对于VE-钙粘着蛋白是阴性的羊膜细胞，以及（b）通过免疫定位（例如流式细胞术）测定对VEGFR2/KDR、CD9、CD54、CD105、CD200的每个是阳性的羊膜细胞；以及将所述细胞与其他细胞分离开来，以形成细胞群。在某些实施方式中，通过免疫定位（例如流式细胞术）的选择执行之后是通过RT-PCR进行的选择。在另一具体的实施方式中，所述选择包括选择在1至100ng/mL VEGF的存在下培养4至21天之后并不表达细胞标记CD34D的细胞。

例如，在另一实施方式中，细胞群通过一种方法产生，该方法包括：选择羊膜细胞，该羊膜细胞贴附于组织培养塑料以及通过RT-PCR测定是OCT-4^–以及通过免疫定位（例如流式细胞术）测定是VEGFR1/Flt-1⁺和VEGFR2/KDR⁺；以及将所述细胞与其他细胞分离开来，以形成细胞群。在具体的实施方式中，细胞群通过一种方法产生，该方法包括：选择通过RT-PCR测定是OCT-4^–，以及通过免疫定位（例如流式细胞术）测定是VEGFR1/Flt-1⁺、VEGFR2/KDR⁺和HLA-G^–的羊膜细胞。在另一具体的实施方式中，所述细胞群通过如下手段产生：选择通过免疫定位（例如流式细胞术）测定附加地为如下一种或多种或全部的羊膜细胞：CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD98⁺、Tie-2⁺、TEM-7⁺、CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–、CD143^–、CD146^–和/或CXCR4^–（趋化因子（C-X-C基序）受体4）；以及将该细胞与并不显示一种或多种这些特点的细胞分离开来。在另一具体的实施方式中，所述细胞群通过如下手段产生：选择通过免疫定位（例如流式细胞术）测定附加地为VE-钙粘着蛋白–的羊膜细胞；以及将该细胞与VE-钙粘着蛋白⁺的细胞分离开来。在另一具体的实施方式中，所述细胞群通过如下手段产生：选择通过免疫定位（例如流式细胞术）测定附加地为CD105⁺和CD200⁺的羊膜细胞；以及将该细胞与CD105^–或CD200^–细胞分离开来。在另一具体的实施方式中，所述细胞在暴露于1至100ng/mL VEGF4至21天之后，通过免疫定位（例如流式细胞术）检测不表达CD34。

在细胞的选择中，无需对整个细胞群进行针对羊膜来源贴壁细胞的特异性特点检测。然而，可以对细胞群的一种或多种等分的细胞（例如约0.5%-2%）进行这类特点的检测以及可以将结果归于该群中其余的细胞。

选定的细胞可以通过如下方式便确认是本文提供的羊膜来源贴壁细胞：在基质（例如MATRIGEL^TM）上，在VEGF（例如约50ng/mL）的存在下，将该细胞的样本（例如约10⁴至约10⁵个细胞）培养4至14（例如7）天；以及目测该细胞，存在籽芽和/或细胞网络。

羊膜来源贴壁细胞可以利用本领域已知的任何细胞选择方法通过上述标记选定。例如，该贴壁细胞可以在，例如免疫定位（例如流式细胞术或FACS）中，利用一种或多种细胞表面标记的一种或多种抗体选定。利用抗体并结合磁珠可以完成选择。对某些标记具有特异性的抗体为本领域已知且可购得，例如CD9（Abcam）；CD54（Abcam）；CD105（Abcam；BioDesign International，Saco，ME等等）；CD200（Abcam）细胞角蛋白（SigmaAldrich）的抗体。其他标记的抗体也是可购得的，例如CD34、CD38和CD45可购自StemCell Technologies或BioDesign International。适于RT-PCR的OCT-4序列的引物可以购自，例如Millipore或Invitrogen；或可以轻易地从GenBank登录号为DQ486513的人序列中得到。

下文提供了获得胎盘以及从胎盘中获得羊膜组织，以及对这类组织进行处理以获得羊膜来源贴壁细胞的详细方法。

5.6.1细胞收集组合物

一般地，细胞可以利用生理学上可接受的溶液（例如细胞收集组合物），从哺乳动物胎盘（例如人胎盘）的羊膜中获得。在某些实施方式中，该细胞收集组合物阻止或抑制细胞凋亡，阻止或抑制细胞死亡、裂解、分解以及诸如此类。细胞收集组合物在相关的美国专利申请公开号2007/0190042（标题为“Improved Medium for Collecting Placental Stem Cells and Preserving Organs”；其披露内容以引用方式全部并入本文）中有详细地描述。

该细胞收集组合物可以包括适于收集和/或培养羊膜来源贴壁细胞的任何生理学上可接受的溶液，例如，盐水溶液（如磷酸盐缓冲盐水、克雷伯氏溶液、改良的克雷伯氏溶液、伊格尔氏溶液、0.9%NaCl等等）；培养基（例如DMEM、H.DMEM等等）以及诸如此类，添加有或不添加缓冲组分，例如4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）。

该细胞收集组合物可以包括一种或多种组分，所述组分往往在收集时到培养时的期间，保护细胞（例如羊膜来源的贴壁细胞），也就是，防止细胞死亡；或延缓细胞死亡；减少细胞群中死亡细胞的数量；或诸如此类。这类组分可以是，例如，细胞凋亡抑制剂（例如半胱天冬酶抑制剂或JNK抑制剂）；血管扩张剂（例如硫酸镁、抗高血压药、心房利钠肽（ANP）、促肾上腺皮质激素、促肾上腺皮质激素释放激素、硝普钠、肼苯哒嗪、三磷酸腺苷、腺苷、吲哚美辛或硫酸镁、磷酸二酯酶抑制剂等）；坏死抑制剂（例如2-(1H-吲哚-3-基)-3-戊基氨基-马来酰亚胺、吡咯烷二硫代氨基甲酸盐或氯硝西泮）；TNF-α抑制剂；和/或携氧全氟化碳（例如全氟辛基溴、全氟癸基溴等）。

该细胞收集组合物可以包括一种或多种组织降解酶，例如金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、中性蛋白酶、核糖核酸酶或脱氧核糖核酸酶或诸如此类。这类酶包括，但不限于，胶原蛋白酶（例如胶原蛋白酶I、II、III或IV；来自溶组织梭菌的胶原蛋白酶；等等）；分散酶；嗜热菌蛋白酶；弹性蛋白酶；胰蛋白酶；LIBERASE^TM；透明质酸酶等等。包括组织降解酶的细胞收集组合物其用途在下文中进行更详细地讨论。

该细胞收集组合物可以包括杀菌或抑菌有效量的抗生素。在某些非限制性实施方式中，该抗生素是大环内酯（例如托普霉素）、头孢菌素（如头孢氨苄、头孢拉定、头孢氨呋肟、头孢丙烯、头孢克洛、头孢克肟或头孢羟氨苄）、克拉霉素、红霉素、青霉素（例如青霉素V）或喹诺酮（例如氧氟沙星、环丙沙星或诺氟沙星）、四环素、链霉素等。在特定的实施方式中，该抗生素对革兰氏（+）和/或革兰氏（-）细菌（例如铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌等）有活性。

该细胞收集组合物还可以包括如下化合物的一种或多种：腺苷（约1mM至约50mM）；D-葡萄糖（约20mM至约100mM）；镁离子（约1mM至约50mM）；分子量高于20,000道尔顿的大分子，在一个实施方式中，其按足以保持内皮完整性和细胞活性的量存在（例如，按约25g/l至约100g/l或约40g/l至约60g/l的量存在的合成或天然存在的胶体；多糖，如葡聚糖；或聚乙二醇）；抗氧化剂（例如，按约25μM至约100μM的量存在的叔丁对甲氧酚、丁基化羟基甲苯、谷胱甘肽、维生素C或维生素E）；还原剂（例如，按约0.1mM至约5mM的量存在的N-乙酰半胱氨酸）；阻止钙进入细胞的药剂（例如，按约2μM至约25μM的量存在的异搏定）；硝化甘油（例如约0.05g/L至约0.2g/L）；抗凝血剂，在一个实施方式中，其按足以帮助残余血液凝结的量存在（例如，以约1000单位/l至约100,000单位/l的浓度存在的肝素或水蛭素）；或含阿米洛利的化合物（例如，按约1.0μM至约5μM的量存在的阿米洛利、乙基异丙基阿米洛利、六亚甲基阿米洛利、二甲基阿米洛利或异丁基阿米洛利）。

本文所述的羊膜来源贴壁细胞还可以，例如如下文所述，在消化过程中以及消化之后，收集进入简单的生理学上可接受的缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水、0.9%NaCl溶液、细胞培养基或诸如此类。

5.6.2胎盘的收集和处理

人胎盘一般地在分娩或在，例如剖腹产手术之后，其排出后不久回收。在优选的实施方式中，该胎盘在得到患者的知情同意书以及在获得该患者的完整病历并将胎盘情况与之关联之后，从该患者处回收得到。优选地，该病历在分娩后继续。这类病历可用来调整该胎盘或从该胎盘中收获的细胞的后续用途。例如，人羊膜来源贴壁细胞可以在考虑到该病历的情况下，用来个性化治疗婴儿；或与该胎盘有关的近亲；或该婴儿的父母、同胞或其他亲属。

在回收羊膜来源贴壁细胞之前，去除脐血和胎盘血。在某些实施方式中，分娩之后，回收胎盘内的脐血。可以对胎盘进行传统的脐血回收处理。通常使用针或插管，在重力的帮助下给胎盘放血（见，例如Anderson，美国专利号5,372,581；Hessel等人，美国专利号5,415,665）。通常将所述针或插管放于脐静脉内，以及可以轻柔地按摩胎盘，以帮助脐血从胎盘中排出。这类脐血回收可以通过商业手段执行，例如LifeBank USA、Cedar Knolls、N.J.、ViaCord、Cord Blood Registry以及Cryocell。优选地，胎盘借助重力排出，而不进行进一步操作，以使脐血回收过程中的组织破坏最小化。

通常，胎盘从产房运送至另一区域（例如实验室），以通过，例如组织解离进行脐血回收和细胞收集。胎盘优选地在无菌、绝热的运送设备（保持胎盘的温度在20-28℃之间）中（例如，通过将夹持有近侧脐带的胎盘放于无菌自封塑料袋中，然后将该塑料袋置于绝缘容器中）运送。在另一实施方式中，胎盘大体上如美国专利号7,147,626中所述，在脐血收集试剂盒中运送。优选地，胎盘在分娩后4至24h内送至实验室。在某些实施方式中，在脐血回收之前，该近侧脐带被夹持在胎盘盘内，插入深度优选地在4-5cm（厘米）之内。在其他的实施方式中，在脐血回收之后，但是在对胎盘做进一步处理之前，夹持该近侧脐带。

细胞收集之前，胎盘可以在无菌条件下以及在，例如4至25℃（摄氏度），例如在室温下储存。在灌注胎盘以去除任何残余脐血之前，可以将胎盘储存一段时间，例如0至24h、高达48h或长于48h。在一个实施方式中，胎盘在排出后约0h至约2h之间获取。胎盘可以于，例如4至25℃（摄氏度）的温度下，储存在抗凝溶液中。合适的抗凝溶液为本领域所熟知。例如，可以使用柠檬酸钠、肝素或华法林钠溶液。在优选的实施方式中，该抗凝溶液包括肝素溶液（例如，含于1:1000溶液的1%w/w）。在细胞收集之前，排出的胎盘优选地储存不多于36h。

关于胎盘收集和处理的其他信息，见，例如美国专利号7,638,141（其披露内容特此以引用方式全部并入本文）。

5.6.3羊膜组织的物理破坏和酶消化

在一个实施方式中，通过，例如钝性分离（例如利用手指）将羊膜与胎盘的其余部分分离。在酶消化和贴壁细胞回收之前，可以将羊膜分为，例如几个部分或组织片段。可以从整个羊膜或从羊膜的小片段（例如面积约为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或约1000平方毫米的羊膜片段）中获得羊膜来源贴壁细胞。

羊膜来源贴壁细胞一般地可以在排出后约前三天之内的任何时间，但是优选地在排出之后约0h到48h之间；或排出后约8h到约18h之间从胎盘羊膜或其部分中收集。

AMDAC可以，例如，利用特定的两步分离法（其包括用胰蛋白酶消化，继之以用胶原蛋白酶消化）分离。例如，本文提供一种分离羊膜来源贴壁细胞的方法，该方法包括用胰蛋白酶消化羊膜或其部分，使得上皮细胞从所述羊膜中释放；从所述上皮细胞中去除该羊膜或其部分；进一步用胶原蛋白酶消化该羊膜或其部分。在具体的实施方式中，用胰蛋白酶对该羊膜或其部分的消化重复至少一次。在另一具体的实施方式中，用胶原蛋白酶对该羊膜或其部分的消化重复至少一次。在另一具体的实施方式中，该胰蛋白酶为约0.1%-1.0%（最终浓度）。在更具体的实施方式中，该胰蛋白酶为约0.25%（最终浓度）。在另一具体的实施方式中，该胶原蛋白酶为约50U/mL至约1000U/mL（最终浓度）。在更具体的实施方式中，该胶原蛋白酶为约125U/mL（最终浓度）。

在一个实施方式中，例如，羊膜来源贴壁细胞可以通过如下方式获得。羊膜通过，例如分离法从胎盘中分离得到，然后切割为大小为约0.1”x0.1”至约5”x5”，例如2”x2”的片段。如下通过胰蛋白酶消化（例如三重胰蛋白酶消化）从羊膜的胎儿侧去除上皮单层。将羊膜片段置入装有温的（例如约20℃至约37℃）胰蛋白酶-EDTA溶液（0.25%）的容器中。胰蛋白酶溶液的体积范围可以从每克羊膜约5mL至每克羊膜约50mL。将该容器搅动约5min至约30min（例如15min），同时保持恒温。然后，通过任何合适的方法（例如手动去除羊膜片段或通过过滤）将羊膜片段从胰蛋白酶溶液中分离出来。该胰蛋白酶消化步骤可以至少再重复一次。在一个实施方式中，该胰蛋白酶消化步骤重复两次（对于三重胰蛋白酶消化）或三次（对于四重胰蛋白酶消化）。

在一个实施方式中，完成最终的胰蛋白酶消化之后，将羊膜片段放回温的（例如约20℃至约37℃）胰蛋白酶中和溶液（例如体积为每克羊膜约5mL至每克羊膜约50mL）中，例如磷酸盐-缓冲盐水（PBS）/10%胎牛血清（FBS）、PBS/5%FBS或PBS/3%FBS。搅动该容器约5sec至约30min（例如5、10 或15min）。然后，通过任何合适的方法（例如手动去除羊膜片段或通过过滤）将羊膜片段从胰蛋白酶溶液中分离出来。将羊膜片段置入填充有温的（例如约20℃至约37℃）PBS，pH7.2溶液（例如体积为每克羊膜约5mL至每克羊膜约50mL）的容器。搅动该容器约5sec至约30min（例如5、10或15min）。然后如上所述从该PBS中分离羊膜片段。

然后将羊膜片段置入温的（例如约20℃至约37℃)消化溶液中。消化溶液的体积范围可以从每克羊膜约5mL至每克羊膜约50mL。消化溶液包括含于合适培养基（例如DMEM）的消化酶。典型的消化溶液包括I型胶原蛋白酶（约50U/mL至约500U/mL）。用于该阶段过程的消化溶液一般地不包括胰蛋白酶。一般地在37℃搅动，直到有证据表明，羊膜消化，通过，例如羊膜的完全溶解，大体上完成，获得均质的悬浮液（大约10min至约90min）。然后，按每克羊膜组织约1mL到每克羊膜组织约50mL的比率添加温的PBS/5%FBS并搅动约2min至约5min。然后利用，例如40μm至100μm滤器过滤细胞悬浮液，以去除任何未消化的组织。将细胞悬浮在温的PBS（约1mL至约500mL）中，然后于20℃以200x g至约400x g离心约5min至约30min（例如，以300x g离心约15min）。离心之后，去除上清液并将细胞再悬浮于合适的培养基中。可以过滤（40μm至70μm滤器）细胞悬浮液，以去除任何残留的未消化的组织，获得单细胞悬浮液。在该实施方式中，残留的未消化的羊膜可以丢弃。

在该实施方式中，如本文其他部分所述，收集和培养悬浮液中的细胞，以产生分离的羊膜来源贴壁细胞和这类细胞的群。例如，在一个实施方式中，可以培养悬浮液中的细胞以及可以将羊膜来源贴壁细胞与所述培养物中的非贴壁细胞分离，以产生富集的羊膜来源贴壁细胞群。在更具体的实施方式中，所述富集的羊膜来源贴壁细胞群中至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的细胞是所述羊膜来源贴壁细胞。

在本文的任何消化方案中，通过消化获得的细胞悬浮液可以通过，例如包括从约50μm至约150μm（例如从约75μm至约125μm）的孔的滤器过滤。在更具体的实施方式中，该细胞悬浮液可以通过两种或更多种滤器（例如125μm滤器和75μm滤器）过滤。

结合本文所述的任何方法，可以如上文5.3部分所述，通过选择表达AMDAC的一种或多种特点的细胞，将AMDAC与消化过程中释放的细胞相分离。

在一个实施方式中，AMDAC可以依次利用第一酶和第二酶进行分离，其中该方法中所用的第一酶不是胶原蛋白酶，以及其中该方法中所用的第二酶不是胰蛋白酶。在另一实施方式中，用来分离AMDAC的消化步骤不使用胶原蛋白酶、分散酶或透明质酸酶的任何两种或更多种的组合。在另一实施方式中，该AMDAC不是通过外植体培养分离的，以允许细胞通过培育、复制或迁移出外植体被检测到。

在另一实施方式中，在AMDAC的分离期间不使用脱氧核糖核酸酶（DNase）。例如，在某些实施方式中，分离的胶原蛋白酶消化步骤之后不使用DNase。

5.6.4羊膜来源贴壁细胞的分离、分拣和表征

细胞团可以再悬浮于新鲜的细胞收集组合物（如上所述）或适于细胞保持的培养基，例如达尔伯克氏改良的伊格尔氏培养基（DMEM）；Iscove氏改良的达尔伯克氏培养基（IMDM），例如，含有2U/mL肝素和2mM EDTA而不含IMDM血清的培养基（GibcoBRL，NY）；缓冲液（例如PBS、HBSS）和FBS（例如2%v/v）的混合物；或诸如此类。

已经在有或没有附加的细胞外基质涂层（例如纤连蛋白）条件下，于，例如表面上（例如组织培养塑料上）培养的羊膜来源贴壁细胞可以通过差速贴壁法传代或分离。例如，如上文5.6.3部分所述获得的细胞悬浮液可以在组织培养塑料上，于培养基中培养，例如3-7天。期间培养，悬浮液中的多个细胞贴附于培养表面，以及非贴壁细胞在培养基更换期间被去除。

从羊膜中收集的细胞其数量和类型的监测可以例如，通过利用标准的细胞检测技术，例如免疫定位，如流式细胞术、细胞分拣法、免疫细胞化学（例如用组织特异性或细胞标记特异性抗体染色）、荧光活化的细胞分拣法（FACS）、磁性活化的细胞分拣法（MACS）来测量形态学变化和细胞表面标记；通过利用光学或共聚焦显微镜检查细胞形态；和/或通过利用本领域已知的技术（例如PCR和基因表达谱）测量基因表达的变化。这些技术也可以用来确认对一种或多种特定的标记具有阳性的细胞。例如，利用CD34的一种或多种抗体，我们可以利用上述技术测定一种细胞是否包括可检测到的量的CD34；如果是，则该细胞是CD34⁺。

羊膜来源贴壁细胞可以通过Ficoll分离法（例如Ficoll梯度离心法）分离。这类离心可以遵循任何标准的离心速度等方案。在一个实施方式中，例如，羊膜消化之后回收的细胞通过在室温下5000x g离心15min，利用Ficoll梯度进行分离，以及对有关的细胞层进行收集，用于进一步的处理。

羊膜来源细胞（例如，已经通过Ficoll分离、差速贴壁法或这两者的组合分离的细胞）可以利用荧光活化的细胞分拣器（FACS）分拣。荧光活化的细胞分拣法（FACS）是熟知的用于基于颗粒的荧光特性，分离颗粒（包括细胞）的方法（见，例如Kamarch,1987,Methods Enzymol,151:150-165）。个体颗粒中荧光部分的激光激发产生小的电荷，该电荷允许阳性和阴性颗粒从混合物中电磁分离出来。在一个实施方式中，细胞表面标记特异性抗体或配体标有独特的荧光标记。通过细胞分捡器处理细胞，允许细胞基于其结合所用抗体的能力进行分离。可以将经FACS分拣的颗粒直接沉积入96孔板或384孔板的个孔中，以便于分离和克隆。

在一个分拣方案中，来自胎盘的细胞（例如羊膜来源贴壁细胞）可以基于标记CD49f、VEGFR2/KDR和/或Flt-1/VEGFR1的表达进行分拣。优选地，该细胞通过，例如通过RT-PCR测定该细胞的样本中OCT-4的表达，被确认为OCT-4^–，其中30轮之后，如果该样本中该细胞不能示出可检测到地生产针对OCT-4的mRNA，则该细胞是OCT-4^–。例如，可以从是VEGFR2/KDR^–和VEGFR1/Flt-1⁺、CD9⁺、CD54⁺、CD105⁺、CD200⁺和/或VE-钙粘着蛋白^–的一种或多种的细胞中分拣是VEGFR2/KDR⁺和VEGFR1/Flt-1⁺的来自羊膜的细胞。在具体的实施方式中，是CD49f⁺、VEGFR2/KDR⁺、CD9⁺、CD54⁺、CD105⁺、CD200⁺和/或VE-钙粘着蛋白^–的一种或多种的贴于组织培养塑料的羊膜来源贴壁细胞或是VEGFR2/KDR⁺、CD9⁺、CD54⁺、CD105⁺、CD200⁺和VE-钙粘着蛋白^–的细胞与不表达这类标记的一种或多种的细胞分拣开并选定。在另一具体的实施方式中，附加地为CD31⁺、CD34⁺、CD45⁺、CD133^–和/或Tie-2⁺的一种或多种或全部的CD49f⁺、VEGFR2/KDR⁺、VEGFR1/Flt-1⁺细胞与不显示这类特点的一种或更多种或任何种类的细胞分拣开。在另一具体的实施方式中，附加地为CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD98⁺、Tie-2⁺、TEM-7⁺、CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–、CD143^–、CD146^–和/或CXCR4^–的一种或多种或全部的VEGFR2/KDR⁺、VEGFR1/Flt-1⁺细胞与不显示这类特点的一种或更多种或任何种类的细胞分拣开。

可以对由消化产生的细胞悬浮液或对通过，例如离心或利用流式细胞术进行的分离而从消化浆（digestate）中收集的分离的细胞，执行羊膜来源贴壁细胞的选择。通过表达的标记进行的选择可以单独地，或者，例如结合基于培养物中细胞的贴壁特性进行细胞选择的程序，来完成。例如，贴壁选择可以在基于标记表达的分拣之前或之后完成。

关于羊膜细胞的抗体介导的检测以及分拣，可以结合任何荧光团或适于细胞检测和分拣（例如荧光活化的细胞分拣法）的其他标记，使用对特定的标记具有特异性的任何抗体。特异性标记的抗体/荧光团组合包括，但不限于，针对CD105的异硫氰酸荧光素（FITC）共轭的单克隆抗体（可购自明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D Systems Inc.）；针对CD200的藻红蛋白（PE）共轭的单克隆抗体（BD Biosciences Pharmingen）；VEGFR2/KDR-生物素（CD309，Abcam）等等。本文披露的任何标记的抗体可以用任何便于抗体检测的标准抗体标记来标记，包括，例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、乙酰胆碱酯酶抗生蛋白链菌素/生物素、亲和素/生物素、伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素（FITC）、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白（PE）、鲁米诺、荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白，以及合适的放射性物质的例子包括¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S或³H。

羊膜来源贴壁细胞可以用单一标记的抗体标记并基于该单一标记进行检测和/分拣；或可以同时用多个不同标记的多个抗体标记以及基于该多个标记进行分拣。

在另一实施方式中，磁珠可用来分离细胞，例如用来将本文所述的羊膜来源贴壁细胞与其他羊膜细胞分离开来。该细胞可以利用磁性活化的细胞分拣法（MACS）技术进行分拣，该分拣法是一种基于颗粒结合磁珠（0.5-100μm直径）的能力分离颗粒的方法。可以对磁性微球体执行各种有用的改良，包括共价添加特异性识别特定的细胞表面分子或半抗原的抗体。然后将微球混合该细胞，以允许结合。然后通过磁场传递细胞，以分离出具有特异性细胞表面标记的细胞。在一个实施方式中，这些细胞然后可以分离，并与耦合至针对附加的细胞表面标记的抗体的磁珠再混合。该细胞再次通过磁场传递，分离结合这两种抗体的细胞。这类细胞然后可以稀释进入单独的器皿（例如微量滴定器皿），进行克隆分离。

羊膜来源贴壁细胞可以利用本领域已知的标准技术，例如台盼蓝排除分析、荧光素二乙酸酯摄取分析、碘化丙啶摄取分析（评估活性）；以及胸苷摄取分析或MTT细胞增殖分析（评估增殖）进行活性、增殖潜力和寿命评估。寿命可以通过本领域熟知的方法（例如通过测定长期培养物中群倍增的最大数量）测定。

羊膜来源贴壁细胞与其他胎盘或羊膜细胞的分离还可以利用本领域已知的其他技术，例如所需细胞的选择性培育（阳性选择）、不需要的细胞的选择性破坏（阴性选择）；基于混合群中（例如，用大豆凝集素进行的）差示细胞凝集能力的分离；冻融程序；过滤；传统以及区带离心；淘析离心（逆流离心）；单位重力分离；逆流分配；电泳；以及诸如此类。

5.7羊膜来源贴壁细胞的培养

5.7.1培养基

分离的羊膜来源贴壁细胞或这类细胞的群可用来引发或接种细胞培养物。一般地将细胞移至未涂覆或涂覆有细胞外基质或生物分子，例如层粘连蛋白、胶原蛋白（例如原生或变性的）、明胶、纤连蛋白、鸟氨酸、玻连蛋白和细胞外膜蛋白（例如MATRIGEL^TM（马萨诸塞州贝德福德的BD Discovery Labware））的无菌组织培养瓶。

AMDAC可以，例如，在适于干细胞培养的培养基中培植。培植培养基（establishment media）可以，例如，包括EGM-2培养基（Lonza）；DMEM+10%FBS；或包括如下的培养基（在本文称为“标准培养基”）：60%DMEM-LG（Gibco）、40%MCDB-201（Sigma）、2%胎牛血清（FCS）（Hyclone Laboratories）、1X胰岛素-铁传递蛋白-硒（ITS）、1X亚麻酸牛血清白蛋白（LA-BSA）、10^-9M地塞米松（Sigma）、10^-4M抗坏血酸2-磷酸盐（Sigma）、表皮生长因子（EGF）10ng/ml（R&D Systems）、血小板源性-生长因子（PDGF-BB）10ng/ml（R&D Systems）和100U青霉素/1000U链霉素。

羊膜来源贴壁细胞可以在本领域公认为可接受地用于培养细胞（例如贴壁胎盘干细胞）的任何培养基和任何条件下培养。优选地，该培养基包括血清。在各种实施方式中，用于AMDAC的培养或继代培养的培养基包括STEMPRO

（Invitrogen）；MSCM-sf（加利福尼亚州卡尔斯巴德的ScienCell）；MESENCULT

-ACF培养基（加拿大温哥华StemCell Technologies）；标准培养基；缺少EGF的标准培养基；缺少PDGF的标准培养基；DMEM+10%FBS；EGM-2（Lonza）；EGM-2MV（Lonza）；2%、10%和20%ES培养基；ES-SSR培养基或α-MEM-20%FBS。可接受地用于培养羊膜来源贴壁细胞的培养基包括，例如DMEM、IMDM、DMEM（高或低葡萄糖）、伊格尔氏基础培养基、Ham氏F10培养基（F10）、Ham氏F-12培养基（F12）、Iscove氏改良的达尔伯克氏培养基、间质干细胞生长培养基（MSCGM Lonza）、ADVANCESTEM^TM培养基（Hyclone）、KNOCKOUT^TMDMEM（Invitrogen）、Leibovitz氏L-15培养基、MCDB、DMEM/F12、RPMI1640、改进的DMEM（Gibco）、DMEM/MCDB201（Sigma）和CELL-GRO FREE或诸如此类。在各种实施方式中，例如，包含ITS（胰岛素-铁传递蛋白-硒）、LA+BSA（亚油酸牛血清白蛋白）、右旋糖、L-抗坏血酸、PDGF、EGF、IGF-1和青霉素/链霉素的DMEM-LG（达尔伯克氏改良的必需培养基，低葡萄糖）/MCDB201（小鸡成纤维细胞基础培养基）；包括约2至约20%（例如约10%）胎牛血清（FBS；例如，定义的胎牛血清，犹他州洛根的Hyclone）的DMEM-HG（高糖）；包括约2至约20%（例如约15%）FBS的DMEM-HG；包括约2至约20%（例如约10%）FBS、约2至约20%（例如约10%）马血清和氢化可的松的IMDM（Iscove氏改良的达尔伯克氏培养基）；包括约2至约20%（例如约10%）FBS、EGF和肝素的M199；包括约2至约20%（例如约10%）FBS、GLUTAMAX^TM和艮他霉素的α-MEM（最低必需培养基）；包括10%FBS、GLUTAMAX^TM和艮他霉素的DMEM；包括约2至约20%（例如约15%）（v/v）胎牛血清（例如，定义的胎牛血清，犹他州洛根的Hyclone）、抗生素/抗真菌药（例如约100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和/或0.25μg/mL两性霉素 B（加利福尼亚州卡尔斯巴德的Invitrogen））和0.001%（v/v）β-巯基乙醇（密苏里州圣路易斯的Sigma）的DMEM-LG；补充有2至20%FBS、非必需的氨基酸（Invitrogen）、β-巯基乙醇的KNOCKOUT^TM-DMEM基础培养基；补充有KNOCKOUT^TM血清替代物的KNOCKOUT^TM基础培养基；包括2至20%FBS的α-MEM；补充有EGF、VEGF、bFGF、R3-IGF-1、氢化可的松、肝素、抗坏血酸、FBS、艮他霉素）的EBM2^TM基础培养基；或诸如此类。

该培养基可以补充包括，例如如下的一种或多种组分：血清（例如FCS或FBS，例如约2-20%（v/v）；马血清（ES）；人血清（HS））；β-巯基乙醇（BME），优选地约0.001%（v/v）；一种或多种生长因子，例如，血小板源性生长因子（PDGF）、表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、白血病抑制因子（LIF）、血管内皮生长因子（VEGF）和促红细胞生成素（EPO）；氨基酸，包括缬氨酸；以及控制微生物污染的一种或多种抗生素和/或抗霉菌剂，例如单独的青霉素G、硫酸链霉素、两性霉素B、艮他霉素和制霉菌素或其组合（仅用于举例）。

羊膜来源贴壁细胞（AMDAC）可以在标准的组织培养条件下（例如在组织培养皿或多孔板中）培养。该细胞还可以利用悬滴法培养。在该方法中，按约1x10⁴细胞/mL将该细胞悬浮于约5mL的培养基中，以及在组织培养容器（例如100mL培特利式培养皿）的盖子内侧上放置该培养基的一滴或多滴。该滴可以是，来自，例如多道移液器的例如单滴或多滴。将该盖子小心地翻转并置于该培养皿的底部上方，该培养皿包含足以保持该培养皿气氛中水分含量的一定体积的液体（例如无菌PBS），以及培养该细胞。AMDAC还可以在标准的或高体积或高吞吐量的培养系统（例如T-细颈瓶；Corning HYPERFLASK

；Cell Factories（Nunc）；1个、2个、4个、10个或40个托盘型多层细胞培养器等）中培养。

在一个实施方式中，羊膜来源贴壁细胞在一种化合物的存在下培养，该化合物的作用是保持该细胞中未分化的表型。在具体的实施方式中，该化合物是取代的3,4-二氢吡啶醇[4,5-d]嘧啶。在更具体的实施方式中，该化合物是具有以下化学结构的化合物：

该化合物可以例如约1μM至约10μM之间的浓度接触浓度羊膜来源贴壁细胞或这类细胞的群。

5.7.2羊膜来源贴壁细胞的扩增和增殖

一旦羊膜来源贴壁细胞分离或这类细胞的群分离（例如羊膜来源贴壁细胞或这类细胞的群与该细胞或细胞群在体内通常关联的至少50%的羊膜细胞分离），该细胞便可以在体外增殖以及扩增。例如，贴壁细胞或羊膜来源贴壁细胞的群可以在组织培养容器（例如培养皿、细颈瓶、多孔板或诸如此类）中培养一段时间，所述时间对于该细胞来说，足以增殖至40-70%汇合率，也就是，直到该细胞及其后代占据了该组织培养容器的40-70%的培养表面。

羊膜来源贴壁细胞可以以允许细胞生长的密度接种于培养瓶中。例如，该细胞可以以从低密度（例如约400至约6,000个细胞/cm²）至高密度（例如约20,000个或更多个细胞/cm²）不等的密度接种。在优选的实施方式中，该细胞在空气中CO₂体积为从约0%至约5%的条件下培养。在某些优选的实施方式中，该细胞在空气中CO₂体积为从约0.1%至约25%，优选地空气中CO₂为从约5%至约20%的条件下培养。该细胞优选地在约25℃至约40℃，优选地在约37℃的条件下培养。

该细胞优选地在孵育箱中培养。培养期间，培养基可以是静态的或可以例如，在利用生物反应器培养的期间，搅动。羊膜来源贴壁细胞优选地在低氧化应激下（例如添加谷胱甘肽、抗坏血酸、过氧化氢酶、生育酚、N-乙酰半胱氨酸或诸如此类）培育。

虽然该羊膜来源贴壁细胞可以培育至汇合，该细胞优选地不培育至汇合。例如，一旦获得40%-70%的汇合率，该细胞便可以传代。例如，该细胞可以利用本领域熟知的技术，进行酶催处理（例如胰蛋白酶化），以将它们从组织培养表面分离出来。通过移液去除该细胞并对该细胞计数之后，约20,000-100,000个细胞，优选地约50,000个细胞或约400个至约6,000个细胞/cm2可以传代至包含新鲜培养基的新培养容器中。通常，新的培养基与去除细胞的培养基是相同的类型。该羊膜来源贴壁细胞可以传代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次或更多次。培养物中AMDAC可以倍增至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49次或至少50次或更多次。

5.8包括该羊膜来源贴壁细胞的组合物

5.8.1包括该羊膜来源贴壁细胞的药物组合物

在某些实施方式中，羊膜来源贴壁细胞包含在药物组合物内；或是药物组合物的组分。该细胞可以以容易施用至个体的形式制备，例如，包含在适于医药用途的容器内的羊膜来源贴壁细胞。这类容器可以是，例如注射器、无菌塑料袋、细颈瓶、小瓶、罐或该羊膜来源贴壁细胞群可以容易地从中取出的其他容器。例如，该容器可以是血袋或适于向接受者静脉内施用液体的其他塑料制成的、医学上可接受的袋子。在某些实施方式中，该容器是允许对该细胞进行深低温保藏的容器。本文提供的组合物（例如药物组合物）中的细胞可以包括来源于单个供体或来源于多个供体的羊膜来源贴壁细胞。该细胞可以对预定接收者来说是完全地HLA匹配的；或者是部分或完全地HLA不匹配的。

因此，在一个实施方式中，本文提供的组合物中的羊膜来源贴壁细胞以含于容器的包括羊膜来源贴壁细胞的组合物的形式施用至有这种需要的个体。在另一具体的实施方式中，该容器是袋子、细颈瓶、小瓶或罐。在更具体的实施方式中，所述袋子是无菌塑料袋。在更具体的实施方式中，所述袋子适于、允许或便于通过，例如静脉输注、弹丸注射或诸如此类进行所述贴壁细胞的静脉内给药。给药之前或期间，该袋子可以包括多个腔或室，所述腔或室相互连接，以允许该细胞以及一种或多种其他溶液（例如药物）相混合。在另一具体的实施方式中，深低温保藏之前，该溶液包括羊膜来源贴壁细胞，该羊膜来源贴壁细胞包括便于该细胞深低温保藏的一种或多种化合物。在另一具体的实施方式中，所述羊膜来源贴壁细胞包含在生理学上可接受的水性溶液中。在更具体的实施方式中，所述生理学上可接受的水性溶液是0.9%NaCl溶液。在另一具体的实施方式中，所述羊膜来源贴壁细胞包括与所述细胞的接受者HLA匹配的细胞。在另一具体的实施方式中，所述羊膜来源贴壁细胞包括与所述细胞的接受者至少部分地HLA不匹配的细胞。在另一具体的实施方式中，所述羊膜来源贴壁细胞来源于多个供体。在各种具体的实施方式中，所述容器包括约、至少或至多1x10⁶所述细胞、5x10⁶所述细胞、1x10⁷所述干细胞、5x10⁷所述细胞、1x10⁸所述细胞、5x10⁸所述细胞、1x10⁹所述细胞、5x10⁹所述细胞、1x10¹⁰或1x10¹¹所述细胞。在上述任何深低温保藏的群的其他具体的实施方式中，所述细胞已经传代约、至少或不多于5次、不多于10次、不多于15次或不多于20次。在上述任何深低温保藏的细胞的另一具体的实施方式中，所述细胞已经在所述容器中扩增。在具体的实施方式中，单个单位剂量的羊膜来源贴壁细胞可以包括，在各种实施方式中，约、至少或不多于1x10⁵、5x10⁵、1x10⁶、5x10⁶、1x10⁷、5x10⁷、1x10⁸、5x10⁸、1x10⁹、5x10⁹、1x10¹⁰、5x10¹⁰、1x10¹¹个或更多个羊膜来源贴壁细胞。

在某些实施方式中，本文提供的药物组合物包括羊膜来源贴壁细胞群，该群包括50%活性细胞或更多（也就是，在该群中至少50%的细胞是有功能的或是活的）。优选地，在该群中至少60%的细胞是有活性的。更优选地，在该药物组合物的该群中，至少70%、80%、90%、95%或99%的细胞是有活性的。

5.8.2包括羊膜来源贴壁细胞的基质

本文进一步提供包括基质、水凝胶、支架等的组合物。这类组合物可以替代液体悬浮液中的这类细胞或作为其补充使用。

该基质可以是，例如永久性或可降解的脱细胞的组织，例如脱细胞的羊膜；或合成的基质。该基质可以是三维支架。在更具体的实施方式中，所述基质包括胶原蛋白、明胶、层粘连蛋白、纤连蛋白、果胶、鸟氨酸或玻连蛋白。在另一更具体的实施方式中，该基质是羊膜或羊膜来源生物材料。在另一更具体的实施方式中，所述基质包括细胞外膜蛋白。在另一更具体的实施方式中，所述基质包括合成的化合物。在另一更具体的实施方式中，所述基质包括生物活性化合物。在另一更具体的实施方式中，所述生物活性化合物是生长因子、细胞因子、抗体或少于5,000道尔顿的有机分子。

本文所述的羊膜来源贴壁细胞可以接种在天然基质（例如胎盘生物材料，如羊膜材料）上。这类羊膜材料可以是，例如直接从哺乳动物胎盘中分离的羊膜；固定的或热处理的羊膜、大体上干燥的（即H₂O<20%）羊膜、绒毛膜、大体上干燥的绒毛膜、大体上干燥的羊膜和绒毛膜以及诸如此来。本文提供的羊膜来源贴壁细胞可以接种其上的优选的胎盘生物材料在Hariri的美国申请公开号2004/0048796（其披露内容以引用方式全部并入本文）中有描述。

在另一具体的实施方式中，该基质是包括细胞外基质的组合物。在更具体的实施方式中，所述组合物是MATRIGEL^TM（BD Biosciences）。

本文所述的分离的羊膜来源贴壁细胞可以悬浮在适于，例如注射的水凝胶溶液中。该水凝胶是，例如有机聚合物（天然或合成的），该有机聚合物通过共价键、离子键或氢键交联，以创建诱捕水分子以形成凝胶的三维开式栅格结构。适于这类组合物的水凝胶包括自组装肽，例如RAD16。在一个实施方式中，包括该细胞的水凝胶溶液可以被允许，例如在模子中，硬化以形成在其中分散有用于植入的细胞的基质。这类基质中该羊膜来源贴壁细胞还可以培养，以便该细胞，例如在植入之前通过有丝分裂扩增。形成水凝胶的材料包括多糖，例如海藻酸及其盐、肽、聚磷腈和聚丙烯酸盐，其通过离子交联；或嵌段聚合物，例如聚环氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物，其分别通过温度或pH交联。在某些实施方式中，该水凝胶或基质是可生物降解的。

在某些实施方式中，本文提供的包括细胞的组合物包括原位可聚合凝胶(见，例如，美国专利申请公开2002/0022676；Anseth等人,J.Control Release,78(1-3):199-209(2002);Wang等人,Biomaterials,24(22):3969-80(2003))。在某些实施方式中，具有带电侧基或其单价离子盐的聚合物至少部分地可溶于水性溶液，例如水、缓冲盐溶液或水性醇溶液。可以与阳离子反应的、具有酸性侧基的聚合物的例子是聚(膦腈)、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、聚(乙酸乙烯酯)和磺化聚合物（例如磺化聚苯乙烯）。还可以使用具有酸性侧基的共聚物，其通过丙烯酸或甲基丙烯酸以及乙烯醚单体或聚合物的反应形成。酸性基团的例子是羧酸基团、磺酸基团、卤化的（优选地氟化的）醇基团、酚OH基团和酸性OH基团。

在具体的实施方式中，该基质是由复丝纱组成的毛毡，该复丝纱由可生物吸收的材料（例如，PGA、PLA、PCL共聚物或共混物；或透明质酸）制成。使用标准的纺织加工技术（由压接、切断、梳理和针刺组成）将该纱制成毛毡。在另一优选的实施方式中，本发明的细胞接种到可以是复合材料结构的泡沫支架上。此外，三维框架可以模制成有用的形状，例如置于体内待维修、更换或增强的具体结构。可以使用的支架的其他例子包括非织造垫、多孔泡沫或自组装肽。非织造垫可以利用包括乙醇酸和乳酸（例如PGA/PLA）（VICRYL，来自新泽西州萨默维尔的Ethicon,Inc.）的合成可吸收共聚物的纤维形成。还可以将通过例如冷冻干燥或冻干的工艺形成的（见，例如美国专利号6,355,699）包括，例如聚（ε-己内酯）/聚（乙醇酸）（PCL/PGA）共聚物的泡沫用作支架。

本文所述的羊膜来源贴壁细胞可以接种到三维框架或支架上并进行体内植入。这类框架可以结合任何一种或多种生长因子、细胞、药物或，例如刺激组织形成（例如骨形成或脉管系统的形成）的其他组分植入。

在另一实施方式中，本文提供的该羊膜来源贴壁细胞可以接种到泡沫支架上，该支架可以是复合材料结构。这类泡沫支架可以模制成有用的形状，例如置于体内待维修、更换或增强的具体结构的一部分。在某些实施方式中，在该细胞接种之前，该框架用，例如0.1M乙酸处理，接着在聚赖氨酸、PBS和/或胶原蛋白中进行孵育，以提高细胞附着性。基质的外表面可以，例如通过用血浆涂覆该基质或添加如下一种或多种进行改性：蛋白（例如胶原蛋白、弹性纤维、网状纤维）、糖蛋白、糖胺聚糖（例如硫酸肝素、软骨素-4-硫酸、软骨素-6-硫酸、硫酸皮肤素、硫酸角蛋白等）；细胞基质；和/或其他材料，例如，但不限于，明胶、海藻酸盐、琼脂、琼脂糖和植物胶以及诸如此类，以改善细胞的附着性或生长情况以及组织的分化情况。

在某些实施方式中，该基质包括使其具有非血栓形成性的材料或用该材料进行处理。这些处理和材料还可以促进和维持内皮生长、迁移和细胞外基质沉积。这些材料和处理的例子包括但不限于天然材料，例如基底膜蛋白（例如层粘连蛋白和IV型胶原蛋白）；合成材料，例如EPTFE；以及片段化的聚氨酯脲硅酮，例如PURSPAN^TM（加利福尼亚州伯克利的The Polymer Technology Group,Inc.）。该基质还可以包括抗血栓形成的药剂，例如肝素；该支架还可以在接种本文提供的贴壁细胞之前，进行处理，以改变表面电荷（例如用血浆涂覆）。

该框架可以在本文提供的羊膜来源贴壁细胞接种之前，进行处理以提高细胞附着性。例如，在用本发明的细胞接种之前，尼龙基质可以用0.1mol乙酸处理并在聚赖氨酸、PBS和/或胶原蛋白中孵育，以涂覆尼龙。聚苯乙烯可以利用硫酸进行类似的处理。

此外，该三维框架的外表面可以，例如通过用血浆涂覆该框架或添加如下一种或多种进行改性：蛋白（例如胶原蛋白、弹性纤维、网状纤维）、糖蛋白、糖胺聚糖（例如硫酸肝素、软骨素-4-硫酸、软骨素-6-硫酸、硫酸皮肤素、硫酸角蛋白）；细胞基质；和/或其他材料，例如，但不限于，明胶、海藻酸盐、琼脂、琼脂糖和植物胶，以改善细胞的附着性或生长情况以及组织的分化情况。

在某些实施方式中，该基质包括使其具有非血栓形成性的材料，例如天然材料，例如基底膜蛋白（例如层粘连蛋白和IV型胶原蛋白）；以及合成材料，例如ePTFE；或者片段化的聚氨酯脲硅酮，例如PURSPAN（加利福尼亚州伯克利的The Polymer Technology Group,Inc.）；或用该材料进行处理。这类材料可以，例如用肝素以及改变该材料的表面电荷的处理（例如血浆涂覆）进一步进行处理，以使该支架具有非血栓形成性。

包括羊膜来源贴壁细胞的治疗细胞组合物还可以以基质-细胞配合物的形式提供。基质可以包括生物相容的支架、栅格、自组装结构以及诸如此类，无论是否是可生物吸收的、液体、凝胶或固体。这类基质在治疗细胞处理、手术修补、组织工程和伤口愈合的领域是已知的。在某些实施方式中，该细胞贴附于该基质。在其他的实施方式中，该细胞被诱捕或包含在基质空间中。最优选的是那些基质-细胞配合物，其中该细胞的生长与该基质密切相关以及当用于治疗时，刺激并支持接受者的细胞向内生长。基质-细胞组合物可以通过本领域已知的任何方式（包括但不限于植入、注射、手术连接、用其他组织移植、注射等）引入个体体内。在某些实施方式中，该基质在体内或原位形成。例如，根据本发明可以使用原位可聚合的凝胶。这类凝胶的例子为本领域所知。

在某些实施方式中，本文提供的细胞接种到这类三维基质（例如支架）之上，并进行体内植入，其中该接种的细胞可以在该框架上或在其中增殖或者有助于在有或没有其他细胞配合的情况下，在体内培植替代组织。该三维框架上该羊膜来源贴壁细胞或其共培养物的生长优选地导致形成三维组织或其基础物，其可以在体内用于，例如修复受损或得病的组织。例如，该三维支架可用来形成管状结构，例如用于修复血管；或循环系统或冠状结构的外观。根据本发明的一个方面，羊膜来源贴壁细胞或其共培养物，被接种或接种到三维框架或基质（例如支架、泡沫或水凝胶）上。该框架可以配置为各种形状，例如一般的扁平状，一般的圆筒状或管状；或可以完全是不定形状的，可以经考虑，根据矫正结构的要求或需求而定。在某些实施方式中，该羊膜来源贴壁细胞在该三维结构上生长，而在其他的实施方式中，该细胞仅仅是幸存状态，甚或死亡，但仍刺激或促进接受者内新组织向内生长或血管形成。

本发明的细胞可以在培养物中自由培育，从该培养物中去除以及接种到三维框架上。用一定浓度的细胞（例如大约10⁶至5x10⁷个细胞/mL）接种该三维框架优选地导致三维支柱在相对较短的时间段内培植。而且，在某些应用中，可能根据所需的结果优选地使用更多或更少的细胞。

在具体的实施方式中，该基质可以切成条（例如矩形形状），该条的宽度约等于该条最终将插入的管状器官的内周长。该羊膜来源贴壁细胞可以接种到该支架上以及通过漂浮或悬浮在液体培养基中进行孵育。在合适的汇合阶段，可以通过将长边连接起来而将该支架卷起，形成管状。然后，可以通过利用直径合适、材料合适的纤维将两边缝合起来而闭合接缝处。为了防止细胞阻塞管腔，可以把该管状框架开口端之一固定于喷嘴。可以迫使液体培养基从与孵育室连接的源室，通过该喷嘴，以产生通过该管状框架内部的一股流。另一开口端可以固定于通向收集室的流出孔，该培养基可以从该收集室再循环出来，通过该源室。当孵育完成时，可以将管从该喷嘴和流出孔上拆卸。见，例如国际申请号WO94/25584。

一般而言，根据本发明，利用下文任何方法可以将两个三维框架结合形成管。两个或更多扁平框架可以摞起并缝合起来。所得的两层板然后可以卷起，以及，如上所述的，连接起来并缝合。在某些实施方式中，用作内层的一个管状支架可以用羊膜来源贴壁细胞接种并孵育。第二支架可以培育成扁平条，该条的宽度稍大于该管状框架的外周长。实现合适的生长之后，将该扁平框架围绕该管状支架的外部包裹起来，接着将该扁平框架的两边的接缝处闭合并将该扁平框架固定于内管。在另一实施方式中，直径略有不同的两个或更多管可以单独培育。直径较小的框架可以插入直径较大的框架内并固定好。对于这些方法中的每个，可以通过将该方法再次应用于双层管来添加更多层。可以在培育该羊膜来源贴壁细胞的任何阶段，进行支架结合，以及需要时，可以继续孵育所结合的支架。

结合上文，本文提供的细胞以及治疗组合物可以结合可植入式装置使用。例如，该羊膜来源贴壁细胞可以与例如，支架、人造瓣膜、心室辅助装置、 Guglielmi可拆卸式线圈等共同施用。由于该装置可以构成提供给需要这类疗法的个体的主要疗法，所述细胞等可以用作辅助性或次要疗法，以有助于、刺激或促进植入装置的区域的合适愈合。本发明的细胞以及治疗组合物还可以用来对某些可植入式装置进行预处理，以使在体内使用这些装置时，发生的问题最小化。这类预处理的装置（包括涂覆的装置）可以被接受它们的患者更好地忍受，其中局部或全身感染或者，例如，血管再狭窄或进一步阻塞的风险降低。

5.8.3羊膜来源贴壁细胞条件培养基

本文进一步提供已经经过羊膜来源贴壁细胞处理的培养基，也就是，包括由该贴壁细胞分泌或排出的一种或多种生物分子的培养基。在各种实施方式中，该处理的培养基包括这样的培养基：其中所述细胞已经生长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或更多天；或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个群体倍增数或更多。在其他的实施方式中，该处理的培养基包括这样的培养基：其中羊膜来源贴壁细胞已经生长至至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的汇合率或高达100%汇合率。这类处理的培养基可用来支持细胞（例如干细胞，如胎盘干细胞、胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、成体干细胞或诸如此类）的群的培养物。在另一实施方式中，该处理的培养基包括这样的培养基：其中羊膜来源贴壁细胞以及不是羊膜来源贴壁细胞的细胞已经在一起培养。

该处理的培养基可以包括本文提供的贴壁细胞。因此，本文提供包括羊膜来源贴壁细胞的细胞培养物。在具体的实施方式中，该处理的培养基包括多个羊膜来源贴壁细胞，例如羊膜来源贴壁细胞群。

该处理的培养基可以从该细胞培养物中收集以及利用本领域已知的方法过滤和/或灭菌，例如该处理的培养基可以经灭菌，以中和任何潜在污染物的活性或者通过小孔滤器（例如0.22μM滤器）过滤以去除污染物。在某些实施方式中，该处理的培养基可以在收集以及灭菌/过滤之后立即用于本文提供的治疗方法中。在其他的实施方式中，该处理的培养基可以冷冻以及储存，后续用于本文提供的治疗方法中。

5.9羊膜来源贴壁细胞的保藏

羊膜来源贴壁细胞可以，例如利用本文所述的方法，例如在收集或生产本文所述的组合物之前，保藏，也就是，置于允许长期储存的条件下；或抑制细胞死亡（例如凋亡或坏死）的条件下。

羊膜来源贴壁细胞可以利用，例如包括凋亡抑制剂、坏死抑制剂和/或携氧全氟化碳的组合物保藏，如美国申请公开号2007/0190042（其披露内容特此以引用方式全部并入本文）中所述。在一个实施方式中，一种保藏这类细胞或这类细胞群的方法包括使所述细胞或细胞群接触包括凋亡抑制剂和携氧全氟化碳的细胞收集组合物，其中所述凋亡抑制剂存在的量和时间足以降低或防止该细胞群中的凋亡（与没有接触该凋亡抑制剂的细胞群相比）。在具体的实施方式中，所述凋亡抑制剂是半胱天冬酶抑制剂。在另一具体的实施方式中，所述凋亡抑制剂是JNK抑制剂。在更具体的实施方式中，所述JNK抑制剂不调节羊膜来源贴壁细胞的分化或增殖。在另一实施方式中，所述细胞收集组合物包括所述凋亡抑制剂以及分离相的所述携氧全氟化碳。在另一实施方式中，所述细胞收集组合物包括所述凋亡抑制剂以及含于乳剂的所述携氧全氟化碳。在另一实施方式中，该细胞收集组合物附加地包括乳化剂，例如卵磷脂。在另一实施方式中，所述凋亡抑制剂和所述全氟化碳在接触该细胞时，处于约0℃到约25℃之间。在另一更具体的实施方式中，所述凋亡抑制剂和所述全氟化碳在接触该细胞时，处于约2℃到10℃之间或约2℃到约5℃之间。在另一更具体的实施方式中，所述接触在移送所述细胞群期间执行。在另一更具体的实施方式中，所述接触在冷冻和融解所述细胞群期间执行。

羊膜来源贴壁细胞群可以通过，例如一种包括使所述细胞群接触凋亡抑制剂和器官保藏化合物的方法保藏，其中所述凋亡抑制剂存在的量和时间足以降低或防止该细胞群中的凋亡（与没有接触该凋亡抑制剂的细胞群相比）。在具体的实施方式中，该器官保藏化合物是UW溶液(如美国专利号4,798,824中所述；还被称为ViaSpan；还参见Southard等人,Transplantation49(2):251-257(1990))或如Stern等人的美国专利号5,552,267中所述的溶液。在另一实施方式中，所述器官保藏化合物是羟乙基淀粉、乳糖酸、棉子糖或其组合。在另一实施方式中，该细胞收集组合物附加地包括两相或作为乳剂的携氧全氟化碳。

在该方法的另一实施方式中，羊膜来源贴壁细胞，例如在组织破坏工艺（例如羊膜组织的酶消化）期间，接触包括凋亡抑制剂以及携氧全氟化碳、器官保藏化合物或其组合的细胞收集组合物。在另一实施方式中，羊膜来源贴壁细胞在通过组织破坏（例如羊膜组织的酶消化）进行的收集之后，接触所述细胞收集化合物。

通常，在羊膜来源贴壁细胞的收集、富集以及分离期间，优选地最小化或消除低氧导致的细胞应激和机械应激。因此，在该方法的另一实施方式中，在所述保藏期间，羊膜来源贴壁细胞或包括该羊膜来源贴壁细胞的细胞群在收集、富集或分离过程中，暴露于含氧量低的条件少于6h，其中含氧量低的条件是，例如少于正常大气氧浓度；少于正常血液氧浓度；或诸如此类的氧浓度。在更具体的实施方式中，在所述保藏期间，所述细胞或所述细胞群暴露于所述含氧量低的条件少于2h。在另一更具体的实施方式中，所述细胞或所述细胞群在收集、富集或分离期间，暴露于所述含氧量低的条件少于1h或少于30min；或不暴露于含氧量低的条件。在另一具体的实施方式中，所述细胞群在收集、富集或分离期间不暴露于剪切应激。

羊膜来源贴壁细胞可以通过一般方法或通过本文披露的具体方法，例如在含于小容器（例如安瓿）的深低温保藏培养基中深低温保藏。合适的深低温保藏培养基包括，但不限于，包括如下的培养基：例如，生长培养基；或细胞冷冻培养基，例如可购得的细胞冷冻培养基，例如通过SigmaAldrich目录号C2695、C2639（不包含DMSO的无血清细胞冷冻培养基1X）或C6039（包含最小必需培养基、甘油、小牛血清和牛血清的细胞冷冻培养基-Glycoerol1X）确认的细胞冷冻培养基，Lonza ProFreeze^TM2x培养基，甲基纤维素，葡聚糖，人血清白蛋白，胎牛血清，胎小牛血清或Plasmalyte。深低温保藏培养基优选地包括浓度为例如约1%至约20%、例如约5%至10%（v/v）的DMSO（二甲基亚砜）或甘油，可选地包括胎牛血清或人血清。深低温保藏培养基可以包括附加药剂，例如，含或不含甘油的甲基纤维素。分离的羊膜来源贴壁细胞在深低温保藏期间优选地按约1℃/min冷却。优选的深低温保藏温度为约-80℃至约-180℃，优选地约-125℃至约-140℃。深低温保藏的细胞可以在融化使用之前转移至液态氮的汽相中。在某些实施方式中，例如，一旦安瓿已达到约-80℃，便将其转移至液态氮储存区域。还可以利用程控冷冻器进行深低温保藏。深低温保藏的细胞优选地在约25℃至约40℃的温度（优选地约37℃的温度）下融化。

5.10改性的羊膜来源贴壁细胞

5.10.1遗传改性的羊膜来源贴壁细胞

在另一方面，本文所述的羊膜来源贴壁细胞可以经遗传改性，例如以产生相关的核酸或多肽；或产生分化的细胞（例如成骨细胞、心肌细胞、周围细胞或血管原性细胞），所述细胞产生相关的核酸或多肽。遗传改性可以例如利用基于病毒的载体（其包括，但不限于，非整合复制型载体，例如乳头状瘤病毒载体、SV40载体、腺病毒载体；整合型病毒载体，例如逆转录病毒载体或与腺相关的病毒载体；或复制缺陷型病毒载体）完成。将DNA引入细胞的其他方法包括使用脂质体、电穿孔法、粒子枪、直接的DNA注射或诸如此类。

本文提供的贴壁细胞可以例如，通过一种或多种合适的表达控制元件（例如，启动子或增强子序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点、内部核糖体进入位点）控制或与其在操作上相关地，用DNA进行转化或转染。优选地，这类DNA掺入了可选的标记。引入外来DNA之后，可以，例如在富集的培养基中培育经设计的贴壁细胞，然后将其移入选择性培养基中。在一个实施方式中，用来设计羊膜来源贴壁细胞的DNA包括编码相关多肽（例如细胞因子、生长因子、分化药剂或治疗性多肽）的核苷酸序列。

用来设计该贴壁细胞的DNA可以包括本领域已知的驱动哺乳动物细胞（例如人细胞）中苷酸序列的表达的任何启动子。例如，启动子包括，但不限于，CMV启动子/增强子、SV40启动子、乳头瘤病毒启动子、Epstein-Barr病毒启动子、弹性蛋白基因启动子等等。在具体的实施方式中，该启动子是可调节的，以便仅在需要时表达核苷酸序列。启动子可以是诱导型（例如那些与金属硫蛋白和热休克蛋白有关的启动子）或组成型的。

在另一具体的实施方式中，该启动子是组织特异性的或显示出组织特异性。这类启动子的例子包括但不限于肌球蛋白轻链-2基因控制区(Shani,1985,Nature314:283)(骨骼肌)。

本文披露的羊膜来源贴壁细胞可以经设计或以其他方式选定来“敲除(knock out)”或“敲减(knock down)”这类细胞中一种或多种基因的表达。细胞天然的基因表达可以通过，例如使该基因完全失活（通过例如同源重组）而抑制表达来减小。在一个实施方式中，例如，编码蛋白重要区域的外显子或该区域的外显子5’通过阳性的可选标记（例如neo）中断，防止靶基因生产的正常的mRNA以及导致基因失活。基因还可以通过删除基因的一部分或通过删除整个基因而失活。通过利用具有与靶基因同源，在基因组方面相距很远的两个区域的构建体，可以删除介入该两个区域的序列（Mombaerts等人,1991,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.88:3084）。抑制靶基因表达的反义、吗啉代、脱氧核酶、小干扰RNA、短发夹RNA和核酶分子还可用来降低该贴壁细胞中靶基因活性的水平。例如，抑制主要组织相容性基因复合体（HLA）的表达的反义RNA分子已经显示出，在免疫应答方面，是最万能的。三螺旋分子可以用来降低靶基因活性的水平。见，例如L.G.Davis等人(编辑),1994,BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,第二版,Appleton&Lange,Norwalk,Conn.（其以引用方式并入本文）。

在具体的实施方式中，本文披露的羊膜来源贴壁细胞可以用包括编码相关多肽的核苷酸序列的核酸分子进行遗传改性，其中该相关多肽的表达是可以通过外源性因子（例如多肽）、小的有机分子或诸如此类控制的。该相关多肽可以是治疗性多肽。在更具体的实施方式中，该相关多肽是IL-12或白介素-1受体拮抗剂（IL-1Ra）。在另一更具体的实施方式中，该相关多肽是白介素-1受体拮抗剂和二氢叶酸还原酶（DHFR）的融合体，以及该外源性因子是抗叶酸素，例如氨甲蝶呤。这类构建体可用于设计羊膜来源贴壁细胞，该细胞一旦接触氨甲蝶呤便表达IL-1Ra或IL-1Ra和DHFR的融合体。这类构建体可以用来，例如治疗风湿性关节炎。在该实施方式中，该IL-1Ra和DHFR的融合体一旦暴露于抗叶酸素（例如氨甲蝶呤）便会发生翻译上调。因此，在另一具体的实施方式中，用于羊膜来源贴壁细胞的遗传设计的核酸可以包括编码第一多肽和第二多肽的核苷酸序列，其中所述第一多肽和第二多肽表达为融合蛋白，该融合蛋白在外源性因子存在时发生翻译上调。该多肽可以瞬时或长期（例如长达数周或数月）表达。这类核酸分子可以附加地包括编码多肽的核苷酸序列，该多肽允许对设计的细胞进行阳性选择或允许对该设计的细胞进行目测。在另一更具体的实施方式中，核苷酸序列编码多肽，该多肽在合适的目测条件，例如荧光素酶（Luc）下是，例如荧光。在更具体的实施方式中，这类核酸分子可以包括IL-1Ra-DHFR-IRES-Luc，其中IL-1Ra是白介素-1受体拮抗剂，IRES是内部核糖体进入位点，以及DHFR是二氢叶酸还原酶。

5.10.2永生化的羊膜来源贴壁细胞系

哺乳动物羊膜来源贴壁细胞可以通过用包含生长促进基因（即在合适的条件下，促进经转染的细胞的生长、编码蛋白的基因）的任何合适的载体转染而有条件地永生化，以便生长促进蛋白的生产和/或活性可通过外因子调节。在优选的实施方式中，生长促进基因是致癌基因，例如，但不限于，v-myc、N-myc、c-myc、p53、SV40大T抗原、多瘤大T抗原、E1a腺病毒或人乳头瘤病毒E7蛋白。在另一实施方式中，羊膜来源贴壁细胞可以利用cre-lox重组永生化，见Narushima,M.,等人(Nature Biotechnology,2005,23(10:1274-1282)，针对人胰岛β-细胞系的实施例。

该生长促进蛋白的外部调节可以通过将该生长促进基因置于可外部调节的启动子（例如其活性可以通过，例如调整经转染的细胞或接触该细胞的培养基的组合物的温度得到控制的启动子）的控制下实现。在一个实施方式中，可以采用四环素（tet）-控制的基因表达系统(见Gossen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:5547-5551,1992;Hoshimaru等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:1518-1523,1996)。在tet不存在时，该载体内的tet-控制的反式作用子（tTA）强烈地活化始自ph_CMV*-1（来自人巨细胞病毒、融合到tet操纵基因序列的一种最小启动子）的转录。tTA是大肠埃希氏杆菌的转座子-10源性tet抗性操纵子的阻遏物（tetR）和单纯疱疹病毒的VP16的酸性域的融合蛋白。非毒性低浓度的tet（例如0.01-1.0μg/mL）几乎完全根除了tTA的反式作用。

在一个实施方式中，该载体进一步包含编码可选标记（例如赋予抗药性的蛋白）的基因。细菌新霉素抗性基因（neo^R）是本申请的方法中可以采用的一种这类标记。携带neo^R的细胞可以通过本领域的普通技术人员已知的手段（例如向生长培养基中添加，例如100-200μg/mL G418）选定。

转染可以通过本领域的普通技术人员已知的各种手段（包括，但不限于，逆转录病毒感染）的任何一种实现。一般而言，细胞培养物可以通过利用从载体的生产者细胞系中收集的经处理的培养基和包含N2补充物的DMEM/F12的混合物孵育来转染。例如，如上所述制备的胎盘细胞培养物可以在体外，例如5天之后，通过在一份体积的经处理的培养基和两份体积的包含N2补充物的DMEM/F12中孵育约20h而感染。然后，可以如上所述，选定携带可选标记的经转染的细胞。

转染之后，在允许增殖（例如允许至少30%的细胞24h的时间段内倍增）的表面上进行培养物传代。优选地，该基质是由涂覆有聚鸟氨酸（10μg/mL）和/或层粘连蛋白（10μg/mL）的组织培养塑料组成的聚鸟氨酸/层粘连蛋白基质、聚赖氨酸/层粘连蛋白基质或用纤连蛋白处理的表面。然后，每3-4天用可以补充或不补充有一种或多种增殖促进因子的生长培养基喂养培养物。当培养物少于50%汇合率时，可以向该生长培养基中添加增殖促进因子。

当汇合率为80-95%时，经处理的永生化的羊膜来源贴壁细胞系可以利用标准的技术（例如通过胰蛋白酶消化）传代。在某些实施方式中，多达大约二十代时，保持选择性（通过，例如，为包含新霉素抗性基因的细胞添加G418）是有益的。细胞还可以在液态氮中冷冻，长期储存。

克隆细胞系可以从如上所述制备的经处理的永生化的贴壁细胞系中分离得到。一般而言，这类克隆细胞系可以利用标准技术（例如通过限度稀释或利用克隆环）分离，以及扩增。一般地，克隆细胞系可以如上所述喂食以及传代。

经处理的永生化的人羊膜来源贴壁细胞系可以但不必是克隆的，一般地，可以在便于分化的培养条件下，通过抑制生长促进蛋白的生产和/或活性诱导所述细胞系分化。例如，如果编码该生长促进蛋白的基因在可外部调节的启动子的控制下，那么可以改变培养基的条件（例如温度）或组合物，以抑制生长促进基因的转录。对于上文所讨论的四环素控制的基因表达系统，可以通过添加四环素以抑制生长促进基因的转录而实现分化。一般而言，4-5天1μg/mL四环素足以引起分化。要促进进一步分化，可以使该生长培养基包括附加药剂。

5.11给药剂量和途径

向有这种需要的个体施用羊膜来源贴壁细胞（AMDAC）可以通过与待治疗的与免疫相关的疾病或病症有关的任何医学上可接受的途径。在上文所述的治疗方法的另一具体的实施方式中，所述AMDAC通过弹丸注射给药。在另一具体的实施方式中，所述分离的AMDAC通过静脉内（例如通过静脉输注）给药。在具体的实施方式中，所述静脉输注是长达约1至约8h的静脉输注。在另一具体的实施方式中，所述分离的AMDAC通过局部（例如，个体体内与免疫相关的疾病或病症累及的特定位点）给药。在另一具体的实施方式中，所述分离的AMDAC通过颅内给药。在另一具体的实施方式中，所述分离的AMDAC通过肌内给药。在另一具体的实施方式中，所述分离的AMDAC通过腹膜内给药。在另一具体的实施方式中，所述分离的AMDAC通过动脉内给药。在所述治疗方法的另一具体的实施方式中，所述分离的AMDAC通过肌内、真皮内或皮下给药。在另一具体的实施方式中，所述分离的AMDAC通过静脉内给药。在另一具体的实施方式中，所述分离的AMDAC通过心室内给药。在另一具体的实施方式中，所述分离的AMDAC通过胸骨内给药。在另一具体的实施方式中，所述分离的AMDAC通过滑膜内给药。在另一具体的实施方式中，所述分离的AMDAC通过眼内给药。在另一具体的实施方式中，所述分离的AMDAC通过玻璃体内给药。在另一具体的实施方式中，所述分离的AMDAC通过脑内给药。在另一具体的实施方式中，所述分离的AMDAC通过脑室内给药。在另一具体的实施方式中，所述分离的AMDAC通过鞘内给药。在另一具体的实施方式中，所述分离的AMDAC通过骨内输注给药。在另一具体的实施方式中，所述分离的AMDAC通过膀胱内给药。在另一具体的实施方式中，所述分离的AMDAC通过经皮给药。在另一具体的实施方式中，所述分离的AMDAC通过脑池内给药。在另一具体的实施方式中，所述分离的AMDAC通过硬膜外给药。

在上文所述的治疗方法的另一具体的实施方式中，所述AMDAC向所述个体施用一次。在另一具体的实施方式中，所述分离的AMDAC通过两次或更多次的单独给药施用至所述个体。在另一具体的实施方式中，所述施用包括施用约1x10⁴到1x10⁵个之间分离的AMDAC（例如AMDAC）/kg所述个体。在另一具体的实施方式中，所述施用包括施用约1x10⁵到1x10⁶个之间分离的AMDAC/kg所述个体。在另一具体的实施方式中，所述施用包括施用约1x10⁶到1x10⁷个之间分离的AMDAC/kg所述个体。在另一具体的实施方式中，所述施用包括施用约1x10⁷到1x10⁸个之间分离的AMDAC/kg所述个体。在另一具体的实施方式中，所述施用包括施用约1x10⁸到1x10⁹个之间分离的AMDAC/kg所述个体。在另一具体的实施方式中，所述施用包括施用约1x10⁹到1x10¹⁰个之间分离的AMDAC/kg所述个体。在另一具体的实施方式中，所述施用包括施用约1x10¹⁰到1x10¹¹个之间分离的AMDAC/kg所述个体。

在其他具体的实施方式中，所述施用包括施用约1x10⁶到约2x10⁶个之间分离的AMDAC/kg所述个体；约2x10⁶到约3x10⁶个之间分离的AMDAC/kg所述个体；约3x10⁶到约4x10⁶个之间分离的AMDAC/kg所述个体；约4x10⁶到约5x10⁶个之间分离的AMDAC/kg所述个体；约5x10⁶到约6x10⁶个之间分离的AMDAC/kg所述个体；约6x10⁶到约7x10⁶个之间分离的AMDAC/kg所述个体；约7x10⁶到约8x10⁶个之间分离的AMDAC/kg所述个体；约8x10⁶到约9x10⁶个之间分离的AMDAC/kg所述个体；或约9x10⁶到约1x10⁷个之间分离的AMDAC/kg所述个体。在另一具体的实施方式中，所述施用包括向所述个体施用约1x10⁷到约2x10⁷个之间分离的AMDAC/kg所述个体。在另一具体的实施方式中，所述施用包括向所述个体施用约1.3x10⁷到约1.5x10⁷个之间分离的AMDAC/kg所述个体。在另一具体的实施方式中，所述施用包括向所述个体施用高达约3x10⁷个分离的AMDAC/kg所述个体。在具体的实施方式中，所述施用包括向所述个体施用约5x10⁶到约2x10⁷个之间分离的AMDAC。在另一具体的实施方式中，所述施用包括向所述个体施用含于约20mL溶液的约150x10⁶个分离的AMDAC。

在上文所述的治疗方法的另一具体的实施方式中，分离的AMDAC作为单个单位剂量施用至个体。在具体的实施方式中，单个单位剂量的AMDAC可以包括，在各种实施方式中，约、至少或不多于1x10⁵、5x10⁵、1x10⁶、5x10⁶、1x10⁷、5x10⁷、1x10⁸、5x10⁸、1x10⁹、5x10⁹、1x10¹⁰、5x10¹⁰、1x10¹¹个或更多AMDAC。

在具体的实施方式中，所述施用包括向所述个体施用约5x10⁶到约2x10⁷个之间分离的AMDAC，其中所述细胞含于包括10%葡聚糖（例如葡聚糖-40）、5%人血清白蛋白以及可选地免疫抑制剂的溶液中。在另一具体的实施方式中，所述施用包括静脉内施用约5x10⁷到3x10⁹个之间分离的AMDAC。在更具体的实施方式中，所述施用包括静脉内施用约9x10⁸个分离的AMDAC或约1.8x10⁹个分离的AMDAC。在另一具体的实施方式中，所述施用包括颅内施用约5x10⁷到1x10⁸个之间分离的AMDAC。在更具体的实施方式中，所述施用包括颅内施用约9x10⁷个分离的AMDAC。

向有这种需要的个体施用AMDAC条件培养基可以通过与待治疗的与CNS损伤相关的疾病、紊乱或病症有关的任何医学上可接受的途径，包括，但不限于，弹丸注射、静脉内（例如通过静脉输注）、局部（例如，个体体内与CNS损伤相关的疾病、紊乱或病症累及的特定位点）、颅内、肌内、腹膜内、动脉内、肌内、真皮内、皮下、心室内、滑膜内、眼内、玻璃体内、脑内、脑室内、鞘内、通过骨内输注、膀胱内、经皮、脑池内或硬膜外。在具体的实施方式中，该AMDAC条件培养基通过持续输注给药。在另一具体的实施方式中，该AMDAC条件培养基作为单个剂量给药。

在某些实施方式中，向有这种需要的个体施用AMDAC条件培养基包括施用约0.01至约0.02ml AMDAC条件培养基/100g体重；约0.01至约0.05mlAMDAC条件培养基/100g体重；约0.01至约0.1ml AMDAC条件培养基/100g体重；约0.01至约0.15ml AMDAC条件培养基/100g体重；约0.01至约0.2ml AMDAC条件培养基/100g体重；约0.01至约0.25ml AMDAC条件培养基/100g体重；约0.01至约0.3ml AMDAC条件培养基/100g体重；约0.01至约0.35ml AMDAC条件培养基/100g体重；约0.01至约0.4ml AMDAC条件培养基/100g体重；约0.01至约0.45ml AMDAC条件培养基/100g体重；或约0.01至约0.5ml AMDAC条件培养基/100g体重。

5.12羊膜来源贴壁细胞的分化

本文提供的羊膜来源贴壁细胞可以分化。在一个实施方式中，该细胞已经，例如通过使该细胞接触血管内皮生长因子（VEGF）；或者如5.11.2部分、下文6.3.3或6.3.4部分所述，进行分化，分化的程度足以使所述细胞显示内皮细胞、肌原性细胞或周围细胞的至少一个特点。在更具体的实施方式中，内皮细胞、肌原性细胞或周围细胞的所述特点是如下一种或多种的表达：CD9、CD31、CD54、CD102、NG2（神经/神经胶质抗原2）或α平滑肌肌动蛋白，该表达与OCT-4^–、VEGFR2/KDR⁺、CD9⁺、CD54⁺、CD105⁺、CD200⁺和VE-钙粘着蛋白^–羊膜细胞相比增加。在其他的更具体的实施方式中，内皮细胞、肌原性细胞或周围细胞的所述特点是表达如下一种或多种：CD9、CD31、CD54、CD102、NG2（神经/神经胶质抗原2）或α平滑肌肌动蛋白，该表达与OCT-4^–、VEGFR2/KDR⁺和VEGFR1/Flt-1⁺羊膜细胞相比增加。

本文提供的该羊膜来源贴壁细胞的肌原性（心原性）分化可以例如，通过将该细胞置于诱导分化为心肌细胞的细胞培养条件下完成优选的心肌细胞培养基包括补充有视黄酸的DMEM/20%CBS，1μM；碱性成纤维细胞生长因子，10ng/mL；以及转化生长因子β-1，2ng/mL；以及表皮生长因子，100ng/mL。可以用KnockOut Serum Replacement（加利福尼亚州卡尔斯巴德的Invitrogen）替代CBS。替代性地，在补充有1至100（例如50）ng/mL嗜心素-1的DMEM/20%CBS中培养该羊膜来源贴壁细胞24h。在另一实施方式中，可以在5-7天不含蛋白的培养基中培养羊膜来源贴壁细胞10-14天，然后用人心肌提取物（例如，通过在补充有1%脐血血清的1%HEPES缓冲液中使人心肌均质化产生的人心肌提取物）刺激。

可以通过心脏肌动蛋白基因表达的论证（例如通过RT/PCR）或通过细胞的可视搏动确认分化情况。当贴壁细胞显示一种或多种这些特点时，则认为该细胞已经分化为心脏细胞。

5.12.1分化为神经原性细胞

当羊膜来源血管原性细胞在神经原性条件下培养时，其分化为显示神经形态和神经标记的细胞。举例来说，AMDAC，例如，AMDAC在具有用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）（例如约20ng/ml）、表皮生长因子（EGF）（例如约20ng/ml）、包含15%v/v FBS的DMEM/F12培养基中扩增，例如4天，然后在包括DMEM/F12，不含血清，包含200mM叔丁对甲氧酚、10nM氯化钾、5mgs/mL胰岛素、10nM毛喉素、4nM丙戊酸和2nM氢化可的松的诱导型培养基中培养4天。在这些条件下，AMDAC通过抗体染色评估，显示表达人巢蛋白、Tuj1和GFAP。

5.12.2不分化为成骨细胞

羊膜来源贴壁细胞在标准的成骨作用分析中没有显示成骨分化。例如，在一个实施方式中，AMDAC缺乏成骨分化可以例如，通过沉积钙的缺乏（如成骨条件下针对AMDAC的冯库萨染色法所示）显示出来。例如，AMDAC（例如新鲜制备的或深低温保藏的AMDAC）可以悬浮在生长培养基中，例如在含于生长培养基的24孔板和6孔板中按约5000个细胞/cm²悬浮，以及孵育过夜，然后在成骨培养基中培养14-35天（例如28天）。在某些实施方式中，成骨培养基包括DMEM-低葡萄糖、10%v/v胎牛血清（FBS）、10mMβ磷酸甘油、100nM地塞米松和100μm抗坏血酸磷酸盐，补充有转化生长因子-β1（TGF-β1），例如1-100ng/mL、例如20ng/mL；以及人重组骨形成蛋白-2（BMP-2），例如1-100ng/mL、例如40ng/mL。然后利用标准的方案，通过冯库萨染色给细胞染色；脆银矿沉积物的形成表示存在矿化作用。在AMDAC的情况下，例如与骨髓-间质干细胞相比，培养物应该大体上，例如完全地，不含沉积物，这表明该AMDAC并不产生钙沉积，因此并不沿着成骨路径分化。

5.12.3不分化为成软骨细胞

类似地，羊膜来源贴壁细胞在标准的成软骨作用分析中没有显示成软骨分化。例如，在一个实施方式中，AMDAC缺乏成软骨分化可以例如，通过成软骨作用分析中AMDAC缺乏细胞团的形成显示出来，其中细胞团的成软骨细胞。例如，AMDAC（例如新鲜制备的或深低温保藏的，如2.5×10⁵个细胞）可以置于15mL锥形管中以及室温下，按200×g离心5min，以形成球状细胞团。然后将收集的细胞在包含TGFβ-3（例如约10ng/mL）、重组人生长/分化因子-5（rhGDF-5）（例如约500ng/mL）或TGFβ-3（10ng/mL）和rhGDF-5（例如约500ng/mL）的组合的成软骨诱导型培养基（例如Lonza ChondrocyteMedium）中培养3周。3周末，用阿尔新蓝对该细胞染色，该阿尔新蓝针对成软骨细胞产生的粘多糖和糖胺聚糖染色。通常，当BM-MSC或软骨细胞在这些条件下培养时，不会形成对于阿尔新蓝染色呈阳性的细胞团，则AMDAC既不形成沉淀物，也不会被阿尔新蓝染色。

6.实施例

6.1实施例1：来自羊膜的贴壁细胞的分离和扩增

该实施例证实了羊膜来源贴壁细胞的分离和扩增。

6.1.1分离

羊膜来源贴壁细胞从羊膜中分离如下。将羊膜/绒毛膜从胎盘中切下，以及将羊膜从该绒毛膜中手动分离。用无菌PBS冲洗该羊膜以去除残余的血液、血块及其他材料。使用无菌纱布去除通过冲洗未除去的额外的血液、血块或其他材料并再次用PBS冲洗该羊膜。将多余的PBS从该膜中去除，以及用手术刀将该羊膜切成2”X2”的片段。为了释放上皮细胞，通过利用管材和连接器将无菌夹套式玻璃处理器皿连接至37℃循环水浴安设处理器皿并将该处理器皿设于搅拌板上。在该处理器皿中将胰蛋白酶（0.25%，300mL）加温至37℃；添加羊膜片段并于37℃按，例如100RPM-150RPM搅动羊膜/胰蛋白酶悬浮液15min。通过在靠近该处理器皿的无菌区上放置无菌容器并将75μm至125μm无菌筛网插入该容器来组装无菌筛选系统（马萨诸塞州比尔里卡Millipore）。搅动该羊膜片段15min之后，将处理器皿的内容物转移至该筛网，以及利用，例如无菌镊子将该羊膜片段转移回该处理器皿内；将包含上皮细胞的胰蛋白酶溶液丢弃。再次用如上所述的300mL胰蛋白酶溶液（0.25%）搅动该羊膜片段。用大约100-150mL的PBS冲洗该筛网并丢弃PBS溶液。搅动该羊膜片段15min之后，将处理器皿的内容物转移至该筛网。然后将该羊膜片段转移回该处理器皿内；丢弃包含上皮细胞的胰蛋白酶溶液。再次用如上所述的300mL胰蛋白酶溶液（0.25%）搅动该羊膜片段。用大约100-150mL的PBS冲洗该筛网并丢弃PBS溶液。搅动该羊膜片段15min之后，将该处理器皿的内容物转移至该筛网。然后将该羊膜片段转移回该处理器皿内并丢弃包含上皮细胞的胰蛋白酶溶液。于37℃在PBS/5%FBS中搅动该羊膜片段（羊膜与PBS/5%FBS溶液的体积比率为1:1）大约2-5min以中和该胰蛋白酶。组装新鲜无菌的筛网系统。中和该胰蛋白酶之后，将该处理器皿的内容物转移至新的筛网，以及将该羊膜片段转移回该处理器皿内。室温下，将无菌PBS（400mL）添加至该处理器皿，以及搅动该处理器皿的内容物大约2-5min。用大约100-150mL的PBS冲洗该筛网。搅动之后，将该处理器皿的内容物转移至该筛网；用PBS冲洗处理细颈瓶并丢弃PBS溶液。然后用300mL预温的DMEM填充该处理器皿并将该羊膜片段转移至DMEM溶液内。

为了释放该羊膜来源贴壁细胞，将处理的羊膜进一步用胶原蛋白酶处理如下。通过将合适量的胶原蛋白酶粉（从供应商处收到的胶原蛋白酶批次在活性方面不同）溶于DMEM中制备无菌胶原蛋白酶原液（500U/mL）。通过0.22μm滤器过滤该溶液并分配到单独的无菌容器内。向每100mL剂量添加CaCl₂溶液（0.5mL，600mM）并将该剂量冷冻。将胶原蛋白酶（100mL）添加至该处理器皿中的该羊膜片段，以及搅动该处理器皿30-50min或直到通过目测羊膜消化完成。羊膜消化完成之后，将100mL预温无菌PBS/5%FBS添加至该处理器皿，以及将该处理器皿搅动另外2-3min。搅动之后，将细颈瓶的内容物转移至无菌60μm筛网，以及通过真空过滤收集液体。用400mL的PBS冲洗该处理器皿并对PBS溶液进行无菌过滤。然后，于20℃按300xg将过滤的细胞悬浮液离心15min，以及在预温的PBS/2%FBS（总共大约10mL）中再悬浮细胞团。

6.1.2培植

将新鲜分离的血管原性羊膜细胞加入生长培养基中，该生长培养基包含60%DMEM-LG（Gibco）；40%MCBD-201（Sigma）；2%FBS（Hyclone Labs），1×胰岛素-铁传递蛋白-硒（ITS）；10ng/mL亚油酸牛血清白蛋白（LA-BSA）；1n-地塞米松（Sigma）；100μm抗坏血酸2-磷酸盐（Sigma）；10ng/mL表皮生长因子（R&D Systems）；以及10ng/mL血小板源性生长因子（PDGF-BB）（R&D Systems）以及以10,000个细胞/cm²的接种密度在T-细颈瓶中被制成板。然后，在37℃、5%CO₂、湿度>90%的条件下孵育培养装置。每天监测细胞附着性、生长情况和形态。通过更换培养基去除非贴壁细胞和碎片。培养基每周更换两次。在最初涂板后几天，出现具有典型成纤维细胞样/纺锤体状形态的贴壁细胞。当汇合率达到40%-70%时（最初涂板后4–11天），通过室温（37℃）下5min胰蛋白酶消化（0.25%胰蛋白酶–EDTA）收获细胞。用PBS-5%FBS中和之后，室温下按200–400g离心细胞5-15min，然后再悬浮于生长培养基中。这时，认为在最初传代阶段成功地培植了AMDAC系。在某些情况下，最初传代的羊膜来源贴壁细胞被深低温保藏或扩增（例如在培养物中培育以增加细胞数量）。

6.1.3培养程序

羊膜来源贴壁细胞如上文所述在生长培养基中培养以及按2000–4000个/cm²的密度接种在合适的组织培养物–处理的培养装置中。然后，在37℃、5%CO₂、湿度>90%的条件下孵育该培养装置。培养期间，AMDAC会贴壁并增殖。每天监测细胞生长、形态和汇合情况。如果培养延长到5天或更长时间，一周更换培养基两次，以补充新鲜营养物。当汇合率达到40%-70%时（接种后3–7天），通过室温（37℃）下5min胰蛋白酶消化（0.05%-0.25%胰蛋白酶–EDTA）收获细胞。用PBS-5%FBS中和之后，室温下按200–400g离心细胞5-15min，然后再悬浮于生长培养基中。

以这种方式分离和培养的AMDAC通常从1x10⁶个涂板的细胞中产生33530+/–15090菌落形成单元（成纤维细胞）（CFU-F）。

6.2实施例2：羊膜来源贴壁细胞的表型表征

6.2.1基因和蛋白表达谱

该实施例描述了羊膜来源贴壁细胞的表型表征，包括特性细胞表面标记、mRNA和蛋白组表达。

样本制备：如实施例1所述获得羊膜来源贴壁细胞。传代6时，该细胞在生长培养基中被培育为汇合率大约70%（如上文实施例1中所述）、胰蛋白酶化以及在PBS中清洗。在包含4.5g/L葡萄糖、2mM谷氨酰胺和10%FBS的DMEM中培育NTERA-2细胞（美国模式培养物保藏所，ATCC号CRL-1973）。执行有核细胞计数以获得最少的2x10⁶至1x10⁷个细胞。然后，利用Qiagen RNeasy试剂盒（加利福尼亚州瓦伦西亚的Qiagen），利用QIAshredder裂解该细胞，以获得裂解物。然后，利用Qiagen RNeasy试剂盒执行RNA分离。利用Nanodrop ND1000分光光度计、25ng/μL的RNA/反应测定RNA数量和质量。利用Applied Biosystems（加利福尼亚州福斯特城）的High Capacity cDNA Archive Kit准备cDNA反应。利用来自Applied Biosystems的TAQMA

Universal PCR Master Mix执行实时的PCR反应。在Applied Biosystems7300实时PCR系统上以标准模式进行40轮反应。

样本分析和结果：利用实时PCR方法论以及特异性TAQMA

基因表达探针和/或TAQMA

人血管生成阵列（Applied Biosystems），表征细胞以表达干细胞相关性、血管原性以及心肌原性标记。结果表示为与相关细胞对照相比的有关基因的相对表达或与普遍表达的持家基因（例如GAPDH、18S或GUSB）相比有关基因的相对表达（delta Ct）。

羊膜来源贴壁细胞表达各种干细胞相关性、血管原性和心肌原性基因以及显示与NTERA-2细胞相比相对不存在OCT-4表达。表8总结了选定的血管原性、心肌原性和干细胞基因的表达，以及图1证实了在AMDAC中缺乏干细胞相关性基因POU5F1（OCT-4）、NANOG、SOX2、NES、DNMT3B和TERT的表达。

表8：通过RT-PCR测定的羊膜来源贴壁细胞的基因表达谱。

在单独的实验中，附加地发现AMDAC表达如下的基因：芳烃受体核转运蛋白2（ARNT2）、神经生长因子（NGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）、神经胶质源性神经营养因子（GDNF）、神经营养因子-3（NT-3）、NT-5、缺氧诱导因子1α（HIF1A）、缺氧诱导蛋白2（HIG2）、血红素加氧酶1（解环）（HMOX1）、胞外超氧物歧化酶[Cu-Zn]（SOD3）、过氧化氢酶（CAT）、转化生长因子β1（TGFB1）、转化生长因子β1受体（TGFB1R）和肝细胞生长因子受体（HGFR/c-met）。

6.2.2用于评估羊膜来源贴壁细胞的流式细胞术

将流式细胞术作为一种方法来量化羊膜来源贴壁细胞的表型标记，以定义该细胞的同一性。从冷冻的原料中获得细胞样本。融化之前以及试剂制备期间，将细胞瓶保持在干冰上。接着，利用37℃水浴快速融化样本。预冷冻细胞计数被用来计算最初融化后细胞数量依赖性稀释。简言之，在37℃水浴中通过轻轻搅动融化冷冻小瓶大约30sec。融化之后紧接着，向该冷冻小瓶添加大约100-200μL冷的（2至8℃）融化溶液（具有2.5%白蛋白和5%Gentran40的PBS）并混合。轻轻混合之后，将该冷冻小瓶中的全部体积转移到包含等体积的冷的（2至8℃）融化溶液的15mL锥形管中。于室温下，在锥形管中按400g离心细胞5min，然后去除上清液。用移液管测量残余的体积（估算）；室温下，将残余的体积和细胞团再悬浮于含于PBS的1%FBS中，以实现细胞浓度为250x10³个细胞/100μL的缓冲液。例如，可能将1x10⁶个细胞再悬浮于400μL1%FBS中。将细胞悬浮液置入预标记的5mL FACS管（新泽西州富兰克林湖的Becton Dickinson（BD））中。对于每种原发性抗体同型，取100μL细胞悬浮液的等分试样，放入同型对照管。表型分析之前，将所有抗体的浓度优化，以实现良好的信噪比以及对潜在4log动态范围内的CD抗原进行充足的检测。测定每种同型和用于每种样本染色的每种样本抗体的体积。为了使同型和样本管中的抗体的量（μg）标准化，将每种抗体的浓度计算为（1/实际抗体浓度（μg/μL））x（2.5x10⁵个细胞所需的抗体最终量（μg））=#添加的抗体（μL）。通过向每个管中添加合适量的抗体，为该同型和该样本均制成了抗体的Master Mix。在黑暗中室温下对细胞染色15-20min。染色之后，通过离心（400g x5min）将每个样本中未结合的抗体除去，接着利用2mL1%FBS PBS（室温）进行清洗，然后再悬浮于150μL室温1%FBS PBS。然后，根据厂商说明，在Becton Dickinson FACSCalibur、FACSCantoI或BD FACSCantoII流式细胞计上分析样本并制备备用。采集多参数流式细胞术数据集（侧向角散射（SSC）、前向角散射（FSC）和积分荧光谱（FL））而不设定动态仪器补偿参数。根据厂商说明，利用FACSDiva软件采集之后，测定补偿参数。这些仪器设定应用于每个样本。在这些研究中所用的荧光团共轭物是别藻蓝蛋白（APC）、AlexaFluor647（AF647）、异硫氰酸荧光素（FITC）、藻红蛋白（PE）以及多甲藻黄素叶绿素蛋白（PerCP），其均来自BD Biosciences。

表9总结了选定的细胞表面标记（包括血管原性标记）的表达。

表9：通过流式细胞术测定的羊膜来源贴壁细胞中的细胞表面标记表达。

在另一实验中，AMDAC细胞标记有抗人CD49f（Clone GoH3，藻红蛋白-共轭的；BD Pharmingen料号555736），以及通过流式细胞术分析。大约96%的AMDAC标记有抗CD49f（也就是，为CD49f⁺）。

在其他的实验中，通过免疫定位，附加地发现AMDAC表达CD49a，CD106，CD119，CD130，c-met（肝细胞生长因子受体；HGFR），CXC趋化因子受体1（CXCR1），PDGFRA和PDGFRB。通过免疫定位，还发现AMDAC缺乏如下的表达：CD49e、CD62E、成纤维细胞生长因子受体3（FGFR3）、肿瘤坏死因子受体超家族成员12A（TNFRSF12A）、胰岛素样生长因子1受体（IGF-1R）、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR6、趋化因子受体1（CCR1）、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、表皮生长因子受体（EGF-R）、胰岛素受体（CD220）、白介素受体4（IL4-R；CD124）、IL6-R（CD126）、TNF-R1a和1b（CD120a，b）以及erbB2/Her2。

6.2.3用于评估羊膜来源贴壁细胞的血管生成能力的免疫组织化学（IHC）/免疫荧光化学（IFC）

将来自传代6的羊膜来源贴壁细胞在4-孔室载玻片上培育至大约70%汇合率以及用4%福尔马林溶液固定，每次30min。固定之后，用PBS冲洗该载玻片两次达5min。然后，在湿室中，于室温下，用来自相同宿主作为二级抗体的10%正常血清、2x酪蛋白和含于PBS的0.3% Triton X100孵育该载玻片20min。吸去多余的血清以及在加湿室中用一级抗体（山羊多克隆IgG（加利福尼亚州圣克鲁斯的Santa Cruz公司）孵育该载玻片。通过为使用中的抗体选择最佳条件来测定孵育时间和温度。一般而言，孵育时间为37℃条件下1至2h或4℃条件下过夜。然后，用PBS冲洗该载玻片三次，每次5min以及在湿室中室温下用针对一级抗体（兔子抗山羊抗体（Santa Cruz））宿主的荧光共轭的抗免疫球蛋白二级抗体孵育20-30 min。之后，用PBS冲洗该载玻片三次，每次5min，利用DAPI VECTASHIEL

（Vector Labs）封固溶液复染细胞核，并用用盖玻片封固。利用Nikon荧光显微镜目测细胞染色。以针对相应同型（山羊IgG（Santa Cruz））的背景进行归一化的相同暴露时间拍摄所有照片。表10总结了羊膜来源贴壁细胞表达血管原性蛋白的结果。

表10：羊膜来源贴壁细胞上存在或不存在血管原性标记。

AMDAC标记	阳性	阴性

CD31		X
			CD34		X
（VEGFR2/KDR）	X
			连接蛋白-43	X

[0455]

半乳凝素-1	X
			TEM-7	X

羊膜来源贴壁细胞表达了标记肿瘤内皮标记7（TEM-7），该蛋白中的一种示于表10。见图2。

6.2.4用于评估羊膜来源贴壁细胞的血管生成能力的膜蛋白组学

膜蛋白提纯：将传代6的细胞在生长培养基中培育至大约70%汇合率，进行胰蛋白酶化并在PBS中清洗。然后，在细胞裂解前，用包含蛋白酶抑制剂鸡尾酒（密苏里州圣路易斯Sigma Aldrich的P8340）的溶液孵育该细胞15min。然后，通过添加10mM HCl溶液（从而避免使用去污剂）将该细胞裂解以及按400g离心10min，以沉淀并去除细胞核。将去除细胞核之后的上清液转移至超速离心管以及利用具有T-1270转子的WX80超速离心机（北卡罗来纳州阿什维尔Thermo Fisher Scientific）按100,00g离心150min，生成蛋白沉淀物。

蛋白脂质体的生成、固定化以及消化：利用Nanoxis缓冲液（10 mM Tris，300 mM NaCl，pH8）清洗该膜蛋白沉淀物数次。将该膜蛋白沉淀物悬浮于1.5mL的Nanoxis缓冲液中，然后在冰上，利用VIBRA-CELL^TMVC505超声波处理器（康涅狄格州纽镇Sonics & Materials,Inc.）进行顶端超声处理（tip-sonicated）。该蛋白脂质体的尺寸通过用FM1-43染料（加利福尼亚州卡尔斯巴德的Invitrogen）染色来测定以及用荧光显微术目测。通过BCA分析（Thermo Scientific）测定蛋白脂质体悬浮液的蛋白浓度。然后，利用标准微量移液管将该蛋白脂质体注入到LPI^TMFlow CELL（瑞士哥德堡Nanoxis AB）之上并允许固定化1h。固定化之后，执行一系列的清洗步骤以及将5μg/mL胰蛋白酶（新泽西州阿德菲Princeton Separations）直接注入到LPI^TMFlow CELL之上。将芯片37℃孵育过夜以及将胰蛋白酶肽从LPI^TM芯片中洗脱，然后利用Sep-Pak cartridge（马萨诸塞州米尔福德Waters Corporation）脱盐。

LTQ线性离子阱LC/MS/MS分析：在直接接口至轴向去溶剂化真空辅助的纳升毛细管电喷雾离子化（ADVANCE）源（(Michrom Biore源s,Inc.）的0.2mmx150mm 3μmMAGIC C18柱（加利福尼亚州奥本Michrom Bioresources, Inc.）上利用180分钟梯度（缓冲液A：水，0.1%甲酸；缓冲液B：乙腈，0.1%甲酸）分离每种胰蛋白酶消化样本。当按相当高的流速3μL/min运行时，ADVANCE源实现了能与传统的纳升毛细管电喷雾离子化（nanoESI）相媲美的灵敏度。在LTQ线性离子阱质谱仪（加利福尼亚州圣何塞Thermo Fisher Scientific）上分析洗脱的肽，该LTQ线性离子阱质谱仪在每次全扫描质谱之后采用十次数据依赖性MS/MS扫描。为每种生物样本收集7个分析复制数据集。

生物信息学：利用Sorcerer Solo^TM工作站（加利福尼亚州圣何塞Sage-N Research）上SEQUEST算法的执行，检索对应于为每种细胞系收集的7个分析复制数据集的7个RAW文档，作为针对IPI人数据库的单个检索。指定1.2amu的肽质量公差，将蛋氨酸的氧化指定为差分修正，以及将脲基甲基化指定为静态修正。Trans-Proteomic Pipeline（TPP）的支架软件实施被用来对膜蛋白组学数据进行分类和分析。如果蛋白被确认为具有95%肽概率、95%蛋白概率以及1个独特的肽，则考虑对其进行分析。利用内部开发的自定义Perl脚本进行膜蛋白组学数据集之间的比较。

结果：如表11所示，羊膜来源贴壁细胞表达了各种血管原性以及心肌原性标记。

表11：羊膜来源贴壁细胞表达的心肌原性或血管原性标记。

AMDAC标记	阳性	阴性

活化素受体IIB型	X
			ADAM17	X
A-辅肌动蛋白1	X
			血管紧张肽原	X
细丝蛋白A	X
			巨噬细胞乙酰化的LDL受体I和II	X
巨蛋白	X
			肌球蛋白重链非肌型A	X
肌球蛋白-结合蛋白C心脏型	X
			Wnt-9	X

6.2.5用于评估羊膜来源贴壁细胞的血管生成能力的分泌蛋白组(Secretome)谱

蛋白阵列：在生长培养基中按相等的细胞数量将传代6的羊膜来源贴壁细胞制成板以及在4天之后收集经处理的培养基。利用RayBiotech Angiogenesis Protein Arrays（乔治亚州诺克罗斯）在细胞条件培养基中同时执行多个血管原性细胞因子/生长因子的定性分析。简言之，室温下用2mL1X封闭缓冲液（Ray Biotech）孵育蛋白阵列30分钟（min）以封闭膜。接着，将该封闭缓冲液轻轻倾倒以及室温下用1mL的样本（经细胞各自处理4天的生长培养基）孵育该膜1至2h。然后，将该样本轻轻倾倒以及在室温下用2mL的1X清洗缓冲液I（Ray Biotech）摇晃清洗该膜3x5min。然后，在室温下用2mL的1X清洗缓冲液II（Ray Biotech）摇晃清洗该膜2x5min。之后，向每个膜添加1mL稀释的生物素-共轭的抗体（Ray Biotech）以及在室温下孵育1-2h并用如上所述的清洗缓冲液清洗。然后，向每个膜添加稀释的HRP-共轭的抗生蛋白链菌素（2mL）以及在室温下孵育该膜2h。最后，再次清洗该膜，根据说明用ECL^TM检测试剂盒（Amersham）孵育以及目测结果并利用Kodak Gel Logic2200Imaging System分析。AMDAC对各种血管原性蛋白的分泌如图3所示。

ELISA：利用可购自R&D Systems（明尼苏达州明尼阿波利斯）的试剂盒在细胞条件培养基中执行单个血管原性细胞因子/生长因子的定量分析。简言之，根据厂商说明执行ELISA分析以及将经处理的培养基中各个血管原性生长因子的量归一化为1x10⁶个细胞。羊膜来源贴壁细胞（n=6）显示每百万个细胞大约4500pg VEGF以及每百万个细胞大约17,200pg IL-8。

表12：血管原性标记的ELISA结果

AMDAC标记	阳性	阴性

ANG	X
			EGF	X
ENA-78	X
			FGF2	X
卵泡抑素	X
			G-CSF	X
GRO	X
			HGF	X
IL-6	X
			IL-8	X
来普汀	X
			MCP-1	X
MCP-3	X
			PDGFB	X
PLGF	X
			T细胞激活分泌调节因子	X
TGFB1	X
			血小板生成素	X
TIMP1	X
			TIMP2	X
uPAR	X
			VEGF	X
VEGFD	X

[0470] 在单独的实验中，确认AMDAC还分泌血管生成素-1、血管生成素-2、PECAM-1（CD31；血小板内皮细胞粘附分子）、层粘连蛋白以及纤连蛋白。其他实验确认，该AMDAC附加地分泌基质金属蛋白（MMP）1、MMP7、MMP9以及MMP10。

6.2.6AMDAC微RNA表达

该实施例证实了，AMDAC比骨髓来源间质干细胞表达较高水平的某些微RNA（miRNA）和较低水平的某些其他的miRNA，其中每个与血管原性功能相关。

已知促血管原性miR-296通过调节生长因子受体的水平调节血管原性功能。例如，内皮细胞中的miR-296通过直接靶向肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶基质（HGS）mRNA，导致HGS水平降低，从而降低生长因子受体VEGFR2和PDGFRb的HGS介导的降解，显著有助于血管生成。见Würdinger等人，Cancer Cell14:382-393(2008)。此外，miR-15b和miR-16已经显示，控制VEGF（血管生成中涉及的一种关键的促血管原性因子）的表达，以及miR-15b和miR-16的低氧导致的还原有助于增加VEGF（一种促血管原性细胞因子）。见Kuelbacher等人，Trends in Pharmacological Sciences,29(1):12-15(2007)。

如上文实施例1所述制备AMDAC。利用MIRVANA^TMmiRNA Isolation Kit（Ambion，目录号1560）使AMDAC和BM-MSC细胞（作为比较器）经受microRNA（miRNA）制备过程。在变性的裂解缓冲液中破坏0.5x10⁶至1.5x10⁶个细胞。接下来，使样本经受酸-苯酚+氯仿提取过程，以分离小RNA物种极度富集的RNA。添加100%乙醇，以使样本具有25%乙醇。当裂解物/乙醇混合物通过玻璃纤维滤器时，大RNA被固定化以及小RNA物种被收集在滤出液中。然后，该滤出液的乙醇浓度增加至55%，以及该混合物通过第二玻璃纤维滤器，其中小RNA逐渐被固定化。将该RNA清洗并在低离子强度溶液中洗脱。回收的小RNA通过测量其260和280nm处的吸光度测定其浓度和纯度。

发现AMDAC表达如下血管原性miRNA：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b（血管原性miRNA簇17-92的成员）、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b、miR-16。还发现，当与骨髓来源间质干细胞（BM-MSC）相比时，AMDAC表达较高水平的如下血管原性miRNA：miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92（血管原性miRNA簇17-92的成员）、miR-296。这些结果与AMDAC表达高水平的VEGFR2/KDR（见上文）的观察情况很好地关联起来。相反地，发现，当与BM-MSC相比时，AMDAC表达较低水平的如下血管原性miRNA：miR-20a 、miR-20b（血管原性miRNA簇17-92的成员）、miR-221、miR-222、miR-15b、miR-16。miR-15b和miR-16的降低表达与AMDAC中所见的VEGF的较高水平的表达相关。

6.3实施例3：羊膜来源贴壁细胞的分化

6.3.1实施例3.1：羊膜来源贴壁细胞的非成骨性分化

该实施例证实了，如通过，例如冯库萨染色法（其针对矿化，如细胞沉积的钙染色）所确定的，羊膜来源贴壁细胞（AMDAC）并不分化为成骨细胞。

将如上文实施例1所述获得的深低温保藏的OCT-4–AMDAC融化、清洗以去除二甲基亚砜（DMSO）以及再悬浮于生长培养基中。于生长培养基中在24孔板和6孔板内按5000个细胞/cm²接种该细胞以及孵育过夜。接着，去除该培养基并替换为包括DMEM-低葡萄糖、10%v/v胎牛血清（FBS）、10mMβ磷酸甘油（Sigma）、100nM地塞米松（Sigma）、100μm抗坏血酸磷酸盐（Sigma）、两性霉素B（Gibco）、50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素（Gibco）的成骨培养基。该成骨培养基补充有20ng/ml转化生长因子-β1（TGF-β1）（Sigma）和40ng/ml人重组骨形成蛋白-2（BMP-2）（Sigma）。在成骨培养基中继续培养该AMDAC一共28天，每3-4天更换培养基。在培养期的末了，对该细胞进行收集、清洗和染色（如下文详述）以评估矿化、指示物或成骨分化情况。当在显微镜下观察时，具有成纤维细胞样形态的（例如外观上是非立方形的）细胞层完全汇合，没有观察到结节。

作为对照，真皮成纤维细胞和骨髓来源间质干细胞（BM-MSC）也在该成骨培养基中进行培养。成人正常人真皮成纤维细胞（NHDF）从Lonza（美国马里兰州沃克斯维尔）处获得以及新生儿NHDF从ATCC（美国弗吉尼亚州马纳萨斯）处获得。对来源不同的三种BM-MSC系进行评估：一种来自ScienCell Laboratories（加利福尼亚州卡尔斯巴德），第二种来自Lonza（美国马里兰州沃克斯维尔），以及第三种从新鲜完整正常的骨髓抽吸物中分离得到，该骨髓抽吸物从AllCells（美国加利福尼亚州爱莫利维尔）处获得。

用10%（v/v）中性甲醇缓冲液固定细胞。固定之后，在去离子水中清洗该细胞以及在直接的UV光下，在5%硝酸银（Aldrich）中孵育1h。然后，在去离子水中清洗该细胞以及在5%（w/v）硫代硫酸钠中孵育5min。然后，在蒸馏水中再次清洗该细胞以及通过光学显微术检查。

在诱导前后，通过RT-PCR评估不同表达水平的成骨分化相关的基因骨唾液蛋白（IBSP）以及骨钙蛋白（BGLAP）。具体地，在成骨分化分析的末了接受该AMDAC，然后利用RLT裂解缓冲液（Qiagen）裂解。将细胞裂解物储存于-80℃条件下。融化AMDAC细胞裂解物，以及利用RNEasy试剂盒（Qiagen），根据厂商说明，通过DNAse处理分离RNA。然后，用DEPC处理的水洗脱RNA，以及利用Nanodrop ND1000分光光度计测定RNA的量。利用Applied Biosystems逆转录试剂将该RNA制成cDNA。利用来自Applied Biosystems的Taqman Universal PCR Master Mix执行实时PCR反应。所用的Taqman基因表达分析是Hs00173720骨唾液蛋白、Hs00609452骨钙蛋白和GAPDH。在ABI7300系统中运行实时PCR反应，如下文所示：

阈值循环（Ct）值说明：

平均Ct1-10非常高的表达

平均Ct10-20高表达

平均Ct20-30培养基水平表达

平均Ct30-35低表达

平均Ct35-40非常低的表达。

将每种基因的表达值（Ct）归一化为持家基因GAPDH的表达值。然后，在诱导前后，比较每种样本的归一化表达值（dCt）。在改变成倍的情况下，将相对差值报告为“RQ”。由于持家基因的dCt常有变化，少于3的任何诱导成倍差值不认为是显著的。

结果：冯库萨染色法结果证实了，AMDAC显然是非成骨性的，因为没有检测到冯库萨染色。对照成纤维细胞显示了最低的矿化，而BM-MSC显示了各种程度的矿化。

表13：冯库萨染色法结果

关于基因表达，所有受测细胞均显示骨钙蛋白的中度基态表达（Ct27.5–30.9）。AMDAC证实了骨钙蛋白表达的微小（<2倍）诱导作用，这与观察到的成纤维细胞或BM-MSC的骨钙蛋白表达的诱导作用相比，不被认为是显著的。就此而言，AMDAC的骨钙蛋白表达的诱导作用并不表明成骨潜能。相反，2/3BM-MSC系显示了诱导之后可观的上调。BM-MSC中骨唾液蛋白诱导的变化可能是由于供体的变化。

表14：基因表达结果

ND–未检测到

NA–因为没有检测到未诱导的条件（也就是，无Ct值可测定）而不能计算

因为用作比较对象(comparator)的持家基因其表达多变，表14中出现的3或更小的成倍诱导值不被认为是显著的。因此，基于上述结果，得出的结论是，AMDAC并不显示成骨潜能。

6.3.2实施例3.2：羊膜来源贴壁细胞非成软骨分化

该实施例证实了，如本文所述，羊膜来源贴壁细胞并不沿着成软骨路径分化。

将本文他处所述的OCT-4^–AMDAC用于成软骨分析中，而将真皮成纤维细胞和BM-MSC作为对照。对于每种检测样本，将0.25×10⁶个细胞置于15mL的锥形管中并于室温下按200×g离心5min，以形成球状沉淀物。在包含TGFβ-3（10ng/mL）、重组人生长/分化因子-5（rhGDF-5）（500ng/mL）或TGFβ-3（10ng/mL）和rhGDF-5（500ng/mL））的组合的成软骨诱导型培养基(Lonza Chondrocyte Medium(Lonza PT-3003))中或在生长培养（DMEM-低葡萄糖（Gibco）+FBS（2%v/v）（Hyclone）+青霉素以及链霉素）中培养沉淀物3周。培养期间，每周两次完全更换培养基。

在培养期的末了，将细胞团固定在10%福尔马林中24h。然后，通过梯度酒精将所有样本脱水并包埋在石蜡中。切出厚度为5μm的切片，然后根据下文所述的方案染色。利用光学显微术检查组织切片。

阿尔新蓝染色：当用于3%乙酸溶液（pH2.5）时，阿尔新蓝对硫酸化和羧基化的酸性粘多糖以及硫酸化和/或羧基化的唾液酸粘蛋白均染色。使用含于3%乙酸的1%阿尔新蓝（Sigma-Aldrich#23655-1），接着是0.1%核固红（Sigma-Aldrich#22911-3）复染。简言之，将该切片脱蜡并通过梯度酒精水化为蒸馏水，在阿尔新蓝中染色30min，在流动的自来水中清洗2min，在蒸馏水中冲洗，然后在核固红溶液中复染5min，在流动的自来水中清洗1min，通过梯度酒精脱水，在二甲苯中变清澈，最后用树脂封固培养基封固。

II型胶原蛋白染色：通过免疫组织化学对成软骨分化条件前后细胞培养物样本中II型胶原蛋白的存在情况进行评估，概述如下。利用抗体5B2.5（Abcam目录号ab3092）评估该细胞的II型胶原蛋白的生产情况，该抗体5B2.5是大鼠单克隆抗体，对II型胶原蛋白具有高度特异性，而显示对I、III、IV、V、VI、IX、X或XI型胶原蛋白无交叉反应以及对胃蛋白酶消化的II型胶原蛋白无交叉反应。该分析将山羊抗大鼠AF594（Invitrogen IgG2a，目录号A21135）作为二级抗体。在10%福尔马林中固定细胞团最少4h至过夜并在石蜡中浸润。

在PBS中清洗所有的细胞样本以及在室温下暴露于包含PBS、4%山羊血清以及0.3%Triton-100X的蛋白封闭溶液30min。然后，于4℃涂抹在封闭溶液中稀释的一级抗体（1:50以及1:100）过夜。第二天早上，在PBS中清洗样本，以及在室温下涂抹在封闭溶液中稀释的二级抗体（山羊-抗大鼠AF594）（1:500）1h。然后，在PBS中清洗该细胞以及在室温下涂抹600nMDAPI溶液10min以目测细胞核。

BM-MSC和成纤维细胞在成软骨诱导型培养基中形成细胞团。软骨细胞形成大的细胞团，顶端或中心无显著的细胞群。相反，培养期间，AMDAC没有形成细胞团。对于II型胶原蛋白或阿尔新蓝，均没有获得关于AMDAC的染色结果，这是因为AMDAC没有形成细胞团。因此，得出的结论是，AMDAC不会形成软骨。

6.3.3实施例3.3：羊膜来源贴壁细胞的神经分化

该实施例证实了，羊膜来源贴壁细胞可以分化为具有神经细胞特点的细胞。将AMDAC的神经分化与正常人神经前细胞（Lonza）、真皮成纤维细胞、新生儿正常细胞（供体3）、骨髓MSC（供体5和6）的神经分化作比较。

在第一短期神经分化程序中，将AMDAC及其他细胞融化以及，按约5000/cm²接种之后在其各自的生长培养基中扩增，直到它们达到亚汇合。将细胞胰蛋白酶化以及按每个孔6000个细胞接种在涂覆有组织培养物的板中。最初在包含15%v/v FBS（Hyclone）、20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、20ng/ml表皮生长因子（EGF）（Peprotech）以及青霉素/链霉素（PenStrep，Invitrogen）的DMEM/F12培养基（Invitrogen）中对所有细胞扩增4天。4天之后，在PBS（Invitrogen）中冲洗该细胞。然后，在具有20%v/vFBS、PenStrep的DMEM/F12中培养该细胞约24h。24h之后，用PBS（Invitrogen）冲洗该细胞以及在包含DMEM/F12、不含血清、包含200mM叔丁对甲氧酚、10nM氯化钾、5mgs/mL胰岛素、10nM毛喉素、4nM丙戊酸和2nM氢化可的松（Sigma）的诱导型培养基中培养。接着，于–20℃用100%甲醇固定该细胞。然后，通过免疫组织化学（IHC），用DAPI复染细胞核，利用抗巢蛋白抗体（Alexa-Fluor594（Red）共轭的）对固定的样本进行人巢蛋白表达评估。

在第二短期神经分化方案中，最初在包含15%FBS（Hyclone）、20ng/ml碱性FGF、20ng/ml EGF以及PenStrep（Invitrogen）的DMEM/F12培养基（Invitrogen）中对所有细胞扩增4天。4天之后，在PBS（Invitrogen）中冲洗该细胞以及在具有20%v/v FBS、PenStrep的DMEM/F12中培养。24h之后，用PBS冲洗细胞。然后，将培养基更换为神经前细胞扩增培养基（NPE），其包NEUROBASAL^TM-A基础培养基（Gibco）、B27（Gibco）、4mM L-谷氨酰胺、1μm视黄酸（Sigma）和PenStrep。4天之后，将该培养基从每个孔中去除以及室温下用冰冷的4%w/v多聚甲醛固定细胞10min。然后，通过IHC对固定的样本进行评估，分别对星形细胞表型进行GFAP（胶质细胞原纤维酸性蛋白）表达评估以及对神经元表型进行TuJ1（神经元特异性III类微管蛋白）表达评估。

在第一分化方案中，所有细胞类型转化为具有双极形态的细胞类型以及巢蛋白染色呈阳性。神经前细胞如预期基本上表达巢蛋白。在第二分化方案中，对神经元相关的（Tuj1）和星形细胞相关的（GFAP）标记的表达进行了评估。诱导后，AMDAC和BM-MSC表达低水平的Tuj1。发现，成纤维细胞上的表达呈临界值阳性，这可能是由于背景的缘故。AMDAC和一种BM-MSC细胞系显示低水平的GFAP表达。阳性对照细胞系（神经前细胞）如预期基本上既表达Tuj1又表达GFAP。

因此，在神经诱导条件下，AMDAC能够显示与神经分化一致的形态以及生物化学变化。

6.4实施例4：利用羊膜来源血管原性细胞的免疫调节

该实施例证实了，在利用微球刺激的T细胞的分析中，AMDAC显示体外免疫抑制功能。

6.4.1T细胞增殖的AMDAC-介导的抑制

如上文实施例1所述获得AMDAC。从人外周血液中获得CD4⁺以及CD8⁺T细胞。

该T细胞标记有羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）并混合以抗CD3抗CD28-涂覆的Dynabeads，接着以允许细胞与细胞接触的方式，在不存在AMDAC时培养或与AMDAC共培养，还被称为磁珠T-淋巴细胞反应（BTR）。在存在或不存在20,000个AMDAC细胞时，通过按1:3的磁珠:T-淋巴细胞比率将100,000个T-淋巴细胞和抗CD3和抗CD28涂覆的Dynabeads（Invitrogen）混合在96孔板的孔中执行与AMDAC的共培养。在37℃、5%CO₂和90%相对湿度下孵育混合的（共培养）以及未混合的细胞培养物5天。将大体上不具有T细胞抑制活性的正常人真皮成纤维细胞（NHDF）用作阴性对照并使其经受如AMDAC的相同条件。

5天以后，利用流式细胞术检测CD4⁺和CD8⁺T细胞上的CFSE荧光，以及基于未增殖（CFSE高）T细胞与没有与AMDAC或NHDF共培养的CFSE-标记的T细胞的培养物相比所增加的分数来计算T细胞生长抑制的百分比。如图4中证实，AMDAC抑制体外CD4⁺和CD8⁺T细胞的增殖，这表明AMDAC具有免疫调节性。

6.4.2AMDAC条件培养基抑制T细胞对TNF-α的分泌

如上文实施例1所述获得AMDAC。从人外周血液中获得T细胞。

将该AMDAC接种在组织培养板上以及孵育过夜以形成贴壁单层。第二天，用IL-1β刺激AMDAC培养物，该IL-1β先前已经显示是AMDAC源性抗炎性因子的有效诱导物。IL-1β刺激16h之后，收集该AMDAC条件培养基并按9:1的体积比与涂覆有抗CD3抗CD28-涂覆的Dynabeads的人外周血液T细胞混合。将单独的覆有抗CD3抗CD28-涂覆的Dynabeads的人外周血液T细胞群保持为对照。将该T细胞与AMDAC条件培养基混合以及在37℃、5%CO₂和90%相对湿度下孵育未混合的T细胞群72h。将大体上不具有TNF-α抑制活性的正常人真皮成纤维细胞（NHDF）用作阴性对照并使其经受如AMDAC的相同条件。

72h培养之后，利用基于细胞计数微球的ELISA方法测量T-细胞源性TNF-α在T细胞培养物上清液中的浓度。基于存在AMDAC条件培养基时TNF-α与没有混合AMDAC条件培养基的T细胞对照培养物相比的浓度减少情况，计算TNF-α分泌的抑制百分比。如图5中证实，存在AMDAC条件培养基时该T细胞的培养物诱导了对T细胞源性TNF-α的生产的抑制。

6.5实施例5：AMDAC调节T细胞隔室

该实施例证实了，如实施例1所述获得的羊膜来源贴壁细胞（AMDAC）能影响Th1、Th17和FoxP3Treg亚群中的偏移。

6.5.1方法

T-淋巴细胞增殖分析

存在或不存在如上文实施例1所述分离的20,000个AMDAC细胞时，将100,000个由HLA不匹配的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记的T-淋巴细胞与10,000个成熟树突细胞（mDC）混合在FALCON平底96孔组织培养板（宾夕法尼亚州匹兹堡的Fisher Scientific）的每个孔中来执行混合淋巴细胞反应（MLR）。在37℃、5%CO₂和90%相对湿度下孵育混合细胞培养物6天。在第6天，回收所有细胞并用抗CD4-PE和抗CD8-APC（明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D Systems）染色。

通过按1:3的磁珠:T-淋巴细胞比率将100,000个T-淋巴细胞与抗CD3和抗CD28涂覆的Dynabeads（Invitrogen）混合在96孔板的孔中执行磁珠T-淋巴细胞反应（BTR）。在存在或不存在20,000个AMDAC细胞时进行该BTR反应。在37℃、5%CO₂和90%相对湿度下孵育混合细胞培养物6天。在第6天，回收所有细胞并用抗CD4-PE和抗CD8-APC（明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D Systems）染色。

通过用FACS Canto II机器（新泽西州富兰克林湖的BD）对CD4和CD8单个阳性细胞上的CFSE荧光强度进行分析来测量T-淋巴细胞增殖。通过利用flowjo8.7.1软件（俄勒冈州阿什兰的Tree Star,InC.）分析本研究中的所有FACS数据。

T细胞偏移（极化）

利用包含IL-2（200IU/ml）、IL-12（2ng/ml）和抗IL-4（0.4μg/ml）的附加Th1偏移细胞因子鸡尾酒的BTR反应执行Th1偏移。

对于Th17偏移，在存在或不存在50,000个AMDAC时用5x10⁵个分拣的CD14⁺单核细胞、50ng/mL抗CD3抗体（BD BioScienences）以及100ng/mLLPS（Sigma Aldrich）刺激总共5x10⁵个T-淋巴细胞6天。通过胞内细胞因子染色法（ICCS）对CD4阳性的群上的IL-17进行染色来分析Th17细胞群。

胞内细胞因子以及Foxp3染色

Th1细胞亚群列举如下。用50ng/mL卟啉醇肉豆蔻酸乙酸酯（PMA）和750ng/mL离子霉素（PI）（Sigma Aldrich）再活化来自BTR反应的T细胞5h。在最后的3h期间添加GOLGISTOP^TM（Becton Dickinson；蛋白转运抑制剂）。然后，根据厂商说明，用Cytofix/Cytoperm试剂盒（Becton Dickinson），通过PE标记的抗CD4抗体以及接着通过APC共轭的抗IFN-γ抗体对细胞进行表面染色。

为了列举Th17细胞亚群，用50ng/mL PMA和750ng/mL离子霉素（Sigma Aldrich）再活化来自Th17偏移活化反应的T细胞5h，其中最后3h期间存在GOLGISTOP^TM（Becton Dickinson）。然后，根据厂商说明，用Cytofix/Cytoperm试剂盒（Becton Dickinson），通过PE标记的抗CD4抗体以及接着通过APC共轭的抗IL-17抗体对细胞进行染色。

为了列举Treg细胞亚群，根据厂商说明，利用Foxp3染色试剂盒（加利福尼亚州圣迭戈的eBioscience），通过PE标记的抗CD4抗体以及接着通过APC共轭的抗Foxp3抗体对来自BTR反应的T细胞进行表面染色。

树突细胞分化和刺激

不成熟的DC（iDC）通过促细胞分裂剂导向的分化产自磁性分拣的CD14⁺单核细胞群。简言之，iDC从以1x10⁶/ml与GM-CSF（20ng/ml）和IL-4（40ng/ml）一起培养4天的单核细胞中获得。然后，在FALCON24孔组织培养板（宾夕法尼亚州匹兹堡的Fisher Scientific）的每个孔中，在不存在或存在1x10⁵个AMDAC时，用1μg/ml LPS刺激iDC（1x10⁵个细胞）24h。收集培养物上清液以及通过流式微球阵列法（Cytometric Bead Array；CBA）分析细胞因子谱。

流式微球阵列法（CBA）分析

根据厂商说明，利用流式微球阵列法系统（CBA；Becton Dickinson）对多个可溶分析物进行同时定量检测来测量培养物上清液中的细胞因子浓度。简言之，用捕获微球的混合物孵育BTR培养物上清液的样本，以具体检测激活的T细胞产生的如下细胞因子：IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、TNF、淋巴毒素-α（LT-α）以及IFN-γ。接着，将结合微球的细胞因子与荧光标记的检测试剂耦合以及遵照厂商的方案，利用FACSCanto II流式细胞计检测。获得数据并利用FACS-DIVA6.0软件（Becton Dickinson）分析，接着利用FCAP Array1.0程序（Becton Dickinson）计算细胞因子浓度。

IL-21ELISA

根据厂商方案，用来自eBioscience（88-7216）的IL-21ELSAI试剂盒测量从Th17偏移培养物中获得的上清液中的可溶IL-21。

NK增殖分析和NK细胞毒性分析

根据厂商说明，利用NK细胞分离试剂盒（加利福尼亚州奥本的Miltenyi Biotech）从PBMC中分离得到人NK细胞。通过在包含10%胎牛血清（FBS）（Hyclone）并补充有35μg/ml铁传递蛋白、5μg/ml胰岛素、20μM乙醇胺、1μg/ml油酸、1μg/ml亚油酸、0.2μg/ml棕榈酸、2.5μg/ml BSA、0.1μg/mlPHA（Sigma-Aldrich）以及200IU/ml人IL-2（R&D）的1ml IMDM中培养2.5X10⁵个NK细胞，连同丝裂霉素处理的（16g/ml）喂养细胞（1x10⁶个人同种异体PBMC或1x10⁵个K562细胞）来测定NK细胞增殖。于37℃，在5%CO₂中通过每3天添加等体积的IMDM（10%FBS、2%人血清和400IU/ml IL-2）孵育细胞。每7天通过FACS测定NK细胞数量如下。简言之，从组织培养孔中收集全部NK细胞。用PBS清洗之后，则用2uM TO-PRO3对细胞染色。最后，将10μl计数的微球（Spherotech，目录号ACBP-50-10）添加至每种样本，作为校准细胞总数的内部标准。基于收集的每1000个计数微球的活NK细胞总数计算相对的NK数量。

通过按不同的效应子/靶（E/T）比率混合NK细胞和靶细胞来执行NK细胞毒性分析。培养过夜之后，利用上文所述的计数微球方法加上细胞表面标记以从靶细胞中分化NK细胞来测定靶细胞数量。对于K562细胞的NK细胞毒性，将FITC共轭的抗HLA-ABC抗体用作NK细胞标记，因为K562细胞是HLA-ABC阴性的。对于AMDAC细胞，用CD90-PE来区分AMDAC以及NK和K562细胞。通过（1–样本中的全部靶数量÷不含NK细胞的对照中的全部靶细胞）X100算得细胞毒性百分比。

6.5.2T细胞隔室的AMDAC偏移

通过在利用T细胞和AMDAC共培养物的Th1和Th17偏移分析中，测量产生细胞因子的T细胞来检测T细胞隔室中AMDAC影响偏移的能力。简言之，在Th1偏移分析中，预先将AMDAC制成板。接下来的一天，添加1x10⁶/ml T细胞、6x10⁵/ml的Dynabeads、IL-2（200IU/ml）、IL-12（2ng/ml）和抗IL-4（0.4μg/ml）并与该AMDAC混合。4天之后，通过干扰素-γ（IFN-γ）胞内染色法分析Th1细胞的百分比。如图6所示，AMDAC以剂量依赖的方式大大降低了Th1的百分比。类似地，在Th17偏移分析中，预先将AMDAC制成板过夜。然后，向包含AMDAC的板中添加T细胞（1x10⁶/ml）、CD14⁺细胞（1x10⁶/ml）、抗CD3（50ng/ml）和细菌脂多糖（LPS）（100ng/ml）的混合物。培养6天之后，通过IL-17胞内染色法检测Th17的百分比。如图7所示，AMDAC以剂量依赖的方式抑制了Th17的百分比。将1X10⁶个PBMC与AMDAC共培养6天，以研究AMDAC对FoxP3阳性T细胞群的作用。通过FoxP3胞内染色法分析FoxP3阳性群。如图8所示，AMDAC使该FoxP3阳性T细胞群稍有增加。

6.5.3由AMDAC介导的对DC成熟和功能的调节

该实验证实了，AMDAC调节不成熟的树突细胞（DC）的成熟以及分化。

为了探究由AMDAC介导的对DC成熟和功能的调节，在不存在或存在AMDAC时，单独用LPS或用LPS加IFN-γ的组合处理单核细胞源性不成熟的DC，以进一步促进DC成熟过程。通过DC成熟标记CD86和HLA-DR的FACS染色分析DC成熟情况。通过对IL-12的胞内染色以及对CBA的可溶细胞因子生产的测量来评估DC功能。如图9A和9B所示，AMDAC通过调低DC上CD86（图9A）和HLA-DR表达（图9B）强有力地抑制了LPS以及LPS加IFN-γ-诱导的DC成熟。进一步，如图9C所示，AMDAC对LPS加IFN-γ刺激的生产IL-12的DC群有显著的抑制作用，达～70%。进一步，AMDAC能抑制LPS刺激的DC对TNF-α和IL-12的生产。见图10。

6.5.4AMDAC抑制Th17偏移培养物中IL-21的生产

IL-21是维持Th17群所需的重要的细胞因子。如方法部分所述，将AMDAC引入Th17偏移培养物，以研究AMDAC是否能调节IL-21的生产。与没有AMDAC细胞的Th17偏移培养物相比，在AMDAC-Th17共培养物中，AMDAC对IL-21生产的抑制达72.35%。附加地，与不存在AMDAC时的培养物相比，AMDAC使Th17T细胞群减少了72.65%。

6.5.5AMDAC对NK细胞细胞毒性和增殖的调节

NK细胞是一种细胞毒性淋巴细胞，其构成了先天免疫系统的主要部分。NK细胞在排斥肿瘤和受病毒感染的细胞以及同种异体细胞和组织方面发挥了重要作用。构建NK细胞增殖和细胞毒性分析，以研究AMDAC对NK 细胞的免疫调节作用。如图11所示，与没有AMDAC细胞的对照相比，AMDAC抑制了人NK细胞增殖。

此外，研究了AMDAC对NK细胞细胞毒性的作用。在本分析中，如上文方法部分所述，将AMDAC引入NK细胞毒性分析。简言之，将1x10⁶个NK细胞与1x10⁵个K562细胞（E/T比为10:1）混合，2倍滴定预接种的AMDAC（1x10⁵个细胞）。将NK细胞和K562细胞共培养过夜，以及根据上文方法部分所述的方案测定NK细胞细胞毒性。如图12所示，AMDAC细胞以剂量依赖方式抑制人NK细胞的细胞毒性。

6.6实施例6：利用羊膜来源贴壁细胞的治疗方法

6.6.1利用AMDAC治疗炎症性肠病

个体存在腹部痛性痉挛和血性腹泻。该症状在过去的一年断断续续、逐渐地恶化。排除结肠癌之后，进行溃疡性结肠炎的诊断。向该个体静脉内施用含于0.9%NaCl溶液的1-5x10⁸个OCT-4^–羊膜来源贴壁细胞（AMDAC）。在接下来的2周监测该个体以评估一种或多种症状的减少，例如大便中血量的减少。附加地，在接下来的一年期内监测该个体，以及需要时，例如症状重现时，施用相同剂量的AMDAC。

6.6.2利用AMDAC治疗克罗恩氏病

个体存在回肠结肠炎，克罗恩氏病的一种形式以及正经受腹痛、血性腹泻和发烧。向该个体静脉内施用含于0.9%NaCl溶液的1-5x10⁸个OCT-4^–羊膜来源贴壁细胞（AMDAC）。在接下来的2周监测该个体以评估一种或多种症状的减少。附加地，在接下来的一年期内监测该个体，以及需要时，例如症状重现时，施用相同剂量的AMDAC。

6.6.3利用AMDAC治疗风湿性关节炎

个体的三处或更多处关节中存在风湿性关节炎。向该个体施用OCT-4^–AMDAC和已经改性以产生包括IL-1Ra和DHFR的融合多肽的OCT-4^–AMDAC的组合，其中这两种类型的干细胞按1:1的比率施用。经设计的以及未经设计的细胞是含于0.9%NaCl溶液的1-5x10⁸个OCT-4^–AMDAC。向该个体提供标准剂量的氨甲蝶呤以及监测关节发炎的减轻。附加地，在接下来的一年期内监测该个体，以及需要时，例如症状重现时，施用相同剂量的AMDAC。

6.6.4利用AMDAC治疗糖尿病

个体在过去的2个月内患得，存在视力模糊、尿频、多饮以及多食。血液检测确认血液葡萄糖水平升高（大于7.0mmol/L葡萄糖或大于126mg/dL葡萄糖）。得出1型糖尿病的诊断。向该个体静脉内施用含于0.9%NaCl溶液的OCT-4^–羊膜来源贴壁细胞（AMDAC），以及在接下来的6个月内监测该个体的血液葡萄糖。如果该个体的血液葡萄糖水平降至少于7.0mmol/L葡萄糖或少于126mg/dL葡萄糖，则认为该施用是成功的。如果，进一步追踪观察之后，发现该个体的血液葡萄糖水平再次超过7.0mmol/L葡萄糖或126mg/dL葡萄糖，则重复施用。

6.6.5利用AMDAC对移植物抗宿主病的组合治疗

在骨髓移植之前24h内向等待同种异体骨髓移植物的个体静脉内施用含于0.9%NaCl溶液的OCT-4^–羊膜来源贴壁细胞（AMDAC）。在骨髓移植之后的24h内重复施用干细胞。在接下来的100天内监测该个体，以及如果GVHD发展并越过级别I，则后续向其施用5-10x10⁸个剂量的OCT-4^–AMDAC。

6.7实施例7：AMDAC治疗患有中度到重度克罗恩氏病的成人的用途.

患有活性中度到重度克罗恩氏病且对至少1种在先疗法无反应的12名患者分别接受1周2次的OCT4-AMDAC输注。然后，另外4周，每周对患者进行监测，在输注后的6个月对其进行再次评估。前6名患者接受2次2x10⁸个细胞（低剂量）的输注而后6名患者接受2次8x10⁸个细胞（高剂量）的输注。在本研究的整个过程中保持合并用药。利用克罗恩氏病活性指数（CDAI）测量疾病活性。对象还完成炎症性肠病问卷（IBDQ）。患者的平均年龄是35-40岁。通过CDAI监测所有患者的克罗恩氏病的改善以及缓和（CDAI<150），其中该改善至少在2次连续就诊期存在，例如4周以及6个月；而该缓和至少在2次连续就诊期保持。

6.8实施例8：多发性硬化症模型中AMDAC的功效

该实施例证实了，在慢性多发性硬化症的大鼠实验性自身免疫性脑炎（EAE）模型中，OCT-4–、CD49f+AMDAC能改善存活时间并减少症状。EAE症状通过含于弗氏完全佐剂（CFA）乳剂的髓鞘少突神经胶质细胞糖蛋白（MOG33-55）和百日咳毒素（PTx）的组合诱导。

将30天龄的实验性雌性C57BL/6大鼠（Taconic）分成四组：（1）OCT4-、CD49f+AMDAC群的1.5x10⁶个细胞；（2）溶媒对照；（3）疾病对照组（CFA/PTx，无MOG35-55治疗）；以及（4）接受MOG35-55/CFA/PTx，但没接受AMDAC的未经治疗的大鼠。1-3组以及5组分别由10只大鼠组成以及4组由5只大鼠组成。1-4组中每只大鼠分别施用了400μl的MOG35-55/CFA/PTx以及AMDAC、溶媒、CFA/PTx或MOG35-55/CFA/PTx。通过结合PTx施用MOG35-55/CFA，诱导1、2和4组中大鼠的多发性硬化症症状。在第0天施用MOG35-55，以及在第1天在有或没有AMDAC的情况下施用PTx。第4组接受了CFA和PTX，但是没有接受MOG35-55。施用后每2-3天对动物称重，以及施用后每天，利用如下等级对施用后32天症状的发展评估情况打分：

打分时根据实验者的自由裁量权给予半值。症状发作通常发生在第10天左右。

在第12-24天，接受AMDAC的大鼠（G9）的临床得分显示其比接受溶媒的大鼠（G1）有显著的改善（图13A），以及在第12-28天接受AMDAC的大鼠的大鼠体重明显高于接受溶媒的大鼠（图13B）。而且，施用后，接受AMDAC的大鼠其症状发展的中值日（median day）比仅仅接受溶媒的大鼠明显要晚（p=0.0275；图14）。没有接受治疗的大鼠其症状发展如预期，而没有接受MOG33-55的大鼠在整个实验过程中没有显著的症状表现。

因此，AMDAC的施用不仅改善了症状的程度，改善了有症状的大鼠体内所见的减重，而且延迟了症状的发作，这表明AMDAC在多发性硬化症的治疗中具有疗效。

等同性：

本文所述的具体实施方式不是对本发明范围的限制。事实上，对本领域技术人员而言，基于前文的说明和附图，除了所述的那些以外，本发明的各种其他修改也将是显而易见的。这样的修改都将落入所附权利要求书的范围内。

本文引用各种出版物、专利和专利申请并以引用的方式将其所披露的全部内容并入。

Claims

1.一种治疗患有与不适当或不必要的免疫应答有关或由其所引起的疾病或紊乱或有患该疾病或紊乱的风险的个体的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的羊膜来源贴壁细胞（AMDAC）或AMDAC条件培养基，其中所述治疗有效量是足以可检测到地改善所述疾病、紊乱或病症的一种或多种症状的量，以及其中所述AMDAC通过RT-PCR测定是OCT-4^–，以及贴附于组织培养塑料上。

2.权利要求1所述的方法，其中所述疾病或紊乱由Th1或Th17促炎症应答导致或介导。

3.权利要求2所述的方法，其中所述施用包括使介导所述Th1或Th17应答的T细胞接触所述AMDAC。

4.权利要求1-3任意一项所述的方法，其中所述AMDAC降低所述个体内Th1细胞的成熟。

5.权利要求1-3任意一项所述的方法，其中所述AMDAC上调所述个体内调节性T细胞表型。

6.权利要求1-3任意一项所述的方法，其中所述AMDAC降低树突细胞（DC）和/或巨噬细胞中促进所述个体内Th1和/或Th17应答的生物分子的表达。

7.权利要求1-3任意一项所述的方法，其中所述AMDAC可检测到地降低所述T细胞对如下一种或多种的生产：淋巴毒素-1α（LT-1α）、白介素-1β（IL-1β）、IL-12、IL-17、IL-21、IL-23、肿瘤坏死因子α（TNFα）和/或干扰素γ（IFNγ）。

8.权利要求1所述的方法，其中所述AMDAC通过RT-PCR测定是OCT-4^–，以及通过流式细胞术测定是CD49f⁺、CD105⁺和CD200⁺。

9.权利要求1所述的方法，其中所述AMDAC通过免疫定位测定对VEGFR1/Flt-1（血管内皮生长因子受体1）和VEGFR2/KDR（血管内皮生长因子受体2）是阳性的。

10.权利要求1所述的方法，其中所述AMDAC通过流式细胞术测定是CD90⁺和CD117^–，以及通过RT-PCR测定是HLA-G–。

11.权利要求10所述的方法，其中所述AMDAC通过RT-PCR测定是OCT-4^–和HLA-G^–，以及通过流式细胞术测定是CD49f⁺、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–。

12.权利要求1所述的方法，其中所述AMDAC通过免疫定位测定附加地为如下一种或多种：CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD98⁺、Tie-2⁺（血管生成素受体）、TEM-7⁺（肿瘤内皮标记7）、CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–、CD143^–、CD146^–或CXCR4^–（趋化因子（C-X-C基序）受体4）。

13.权利要求1所述的方法，其中所述AMDAC通过免疫定位测定附加地为CD9⁺、CD10⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD98⁺、Tie-2⁺、TEM-7⁺、CD31^–、CD34^–、CD45^–、CD133^–、CD143^–、CD146^–和CXCR4^–。

14.权利要求1所述的方法，其中所述AMDAC通过RT-PCR测定是OCT-4^–，以及通过免疫定位测定是CD49f⁺、HLA-G^–、CD90⁺、CD105⁺、CD117^–和CD200⁺，以及其中所述AMDAC：

（a）通过免疫定位测定表达如下一种或多种：CD9、CD10、CD44、CD54、CD98、CD200、Tie-2、TEM-7、VEGFR1/Flt-1或VEGFR2/KDR（CD309）；

（b）通过免疫定位测定缺乏CD31、CD34、CD38、CD45、CD133、CD143、CD144、CD146、CD271、CXCR4、HLA-G或VE-钙粘着蛋白的表达；

（c）通过RT-PCR测定缺乏SOX2的表达；

（d）表达以下mRNA:ACTA2、ADAMTS1、AMOT、ANG、ANGPT1、ANGPT2、ANGPTL1、ANGPTL2、ANGPTL4、BAI1、c-myc、CD44、CD140a、CD140b、CD200、CD202b、CD304、CD309、CEACAM1、CHGA、COL15A1、COL18A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、连接蛋白-3、CSF3、CTGF、CXCL12、CXCL2、DNMT3B、ECGF1、EDG1、EDIL3、ENPP2、EPHB2、FBLN5、F2、FGF1、FGF2、FIGF、FLT4、FN1、FST、FOXC2、半乳凝素-1、GRN、HGF、HEY1、HSPG2、IFNB1、IL8、IL12A、ITGA4、ITGAV、ITGB3、KLF-4、MDK、MMP2、MYOZ2、NRP2、PDGFB、PF4、PGK1、PROX1、PTN、SEMA3F、SERPINB5、SERPINC1、SERPINF1、TGFA、TGFB1、THBS1、THBS2、TIE1、TIMP2、TIMP3、TNF、TNNC1、TNNT2、TNFSF15、VASH1、VEGF、VEGFB、VEGFC和VEGFR1/FLT1；

（e）产生如下一种或多种：蛋白CD49d、连接蛋白-43、HLA-ABC、Β2-微球蛋白、CD349、CD318、PDL1、CD106、半乳凝素-1、ADAM17、血管紧张肽原前体、细丝蛋白A、α-辅肌动蛋白1、巨蛋白、巨噬细胞乙酰化的LDL受体I和II、活化素受体IIB型前体、Wnt-9蛋白、胶质细胞原纤维酸性蛋白、星形细胞、肌球蛋白-结合蛋白C或肌球蛋白重链、非肌型A；

（f）向该AMDAC生长的培养基中分泌血管内皮生长因子（VEGF）、肝细胞生长因子（HGF）、白介素-8（IL-8）、单核细胞趋化蛋白-3（MCP-3）、FGF2、卵泡抑素、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR或半乳凝素-1；

（g）以高于骨髓来源间质干细胞当量数的水平表达微RNAmiR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92或miR-296；

（h）以低于骨髓来源间质干细胞当量数的水平表达微RNAmiR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b或miR-16；

（i）表达miRNA miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b或miR-16；或

（j）与在21%O₂中培养时CD202b、IL-8或VEGF的表达相比，在少于约5%O₂中培养时以更高的水平表达CD202b、IL-8或VEGF。

15.权利要求14所述的方法，其中所述AMDAC通过RT-PCR测定是OCT-4^–，以及通过免疫定位测定是CD49f⁺、HLA-G^–、CD90⁺、CD105⁺和CD117^–，以及其中所述AMDAC：

（a）通过免疫定位测定表达CD9、CD10、CD44、CD54、CD98、CD200、Tie-2、TEM-7、VEGFR1/Flt-1和VEGFR2/KDR（CD309）；

（b）通过免疫定位测定缺乏CD31、CD34、CD38、CD45、CD133、CD143、CD144、CD146、CD271、CXCR4、HLA-G和VE-钙粘着蛋白的表达；

（c）通过RT-PCR测定缺乏SOX2的表达；

（d）通过RT-PCR测定表达以下mRNA：ACTA2、ADAMTS1、AMOT、ANG、ANGPT1、ANGPT2、ANGPTL1、ANGPTL2、ANGPTL4、BAI1、c-myc、CD44、CD140a、CD140b、CD200、CD202b、CD304、CD309、CEACAM1、CHGA、COL15A1、COL18A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、连接蛋白-3、CSF3、CTGF、CXCL12、CXCL2、DNMT3B、ECGF1、EDG1、EDIL3、ENPP2、EPHB2、FBLN5、F2、FGF1、FGF2、FIGF、FLT4、FN1、FST、FOXC2、半乳凝素-1、GRN、HGF、HEY1、HSPG2、IFNB1、IL8、IL12A、ITGA4、ITGAV、ITGB3、KLF-4、MDK、MMP2、MYOZ2、NRP2、PDGFB、PF4、PGK1、PROX1、PTN、SEMA3F、SERPINB5、SERPINC1、SERPINF1、TGFA、TGFB1、THBS1、THBS2、TIE1、TIMP2、TIMP3、TNF、TNNC1、TNNT2、TNFSF15、VASH1、VEGF、VEGFB、VEGFC和VEGFR1/FLT1；

（e）产生蛋白CD49d、连接蛋白-43、HLA-ABC、Β2-微球蛋白、CD349、CD318、PDL1、CD106、半乳凝素-1、ADAM17、血管紧张肽原前体、细丝蛋白A、α-辅肌动蛋白1、巨蛋白、巨噬细胞乙酰化的LDL受体I和II、活化素受体IIB型前体、Wnt-9蛋白、胶质细胞原纤维酸性蛋白、星形细胞、肌球蛋白-结合蛋白C和/或肌球蛋白重链、非肌型A；

（f）向细胞生长的培养基中分泌VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、卵泡抑素、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR和半乳凝素-1；

（g）以高于相同数量骨髓来源间质干细胞的水平表达微RNAmiR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92和miR-296；

（h）以低于相同数量骨髓来源间质干细胞的水平表达微RNAmiR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b和miR-16；

（i）表达miRNA miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b和miR-16；或

（j）与在21%O₂条件下的CD202b、IL-8和/或VEGF的表达相比，在少于约5%O₂中培养时以更高的水平表达CD202b、IL-8和/或VEGF。

16.权利要求1-15任意一项所述的方法，包括向所述个体附加地施用第二类型的干细胞。

17.权利要求16所述的方法，其中所述第二类型的干细胞是胚胎干细胞、从外周血液中分离的干细胞、从胎盘血中分离的干细胞、从胎盘灌洗液中分离的干细胞、从胎盘组织中分离的非AMDAC干细胞、从脐血中分离的干细胞、脐带干细胞、骨髓来源间质干细胞、脂肪来源干细胞、造血干细胞或成体干细胞。

18.权利要求1-15任意一项所述的方法。其中所述疾病或紊乱是过敏症、哮喘、或对对所述个体来说是外源性的抗原产生的反应。

19.权利要求18所述的方法，其中所述疾病或紊乱是移植物抗宿主病。

20.权利要求1-15任意一项所述的方法，其中所述疾病或紊乱是自身免疫性疾病。

21.权利要求20所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是炎症性肠病、多发性硬化症、风湿性关节炎、牛皮癣、红斑狼疮、糖尿病、蕈样霉菌病或硬皮症。

22.权利要求20所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是如下一种或多种：阿狄森氏病、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂抗体综合症、抗磷脂综合症（原发性或继发性）、哮喘、自身免疫性胃炎、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病、自身免疫性淋巴组织增生病、自身免疫性血小板减少性紫癜、巴洛病、贝切特氏病、大疱性类天疱疮、心肌症、乳糜泻、查加斯病、慢性炎症性脱髓鞘性多神经病、疤痕性类天疱疮（例如粘膜类天疱疮）、冷凝集素病、德戈斯病、疱疹样皮炎、皮肌炎（幼年型）、特发性混合型冷沉淀球蛋白血症、古德帕斯彻氏综合症、格雷夫斯氏病、格-巴二氏综合症、桥本氏甲状腺炎（桥本氏病；自身免疫性甲状腺炎）、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜、IgA肾病、幼年型关节炎、扁平苔癣、梅尼埃病、混合型结缔组织病、硬斑病、假麻痹性重症肌无力、发作性睡病、神经性肌强直、儿童自身免疫性神经精神障碍（PANDA）、慢性天疱疮、恶性贫血、结节性动脉周围炎、多软骨炎、风湿性多肌痛、多肌炎（例如用皮肌炎）、原发性丙种球蛋白缺乏症、原发性胆汁性肝硬变、雷诺病（雷诺现象）、莱特尔氏病、复发性多软骨炎、风湿热、斯耶格伦氏综合症、僵人综合症（Moersch-Woltmann综合症）、高安氏动脉炎、颞动脉炎（巨细胞性动脉炎）、葡萄膜炎、血管炎（例如与红斑狼疮无关的血管炎）、白癫风和/或韦格内氏肉芽肿症。

23.权利要求22所述的方法，其中所述炎症性肠病是克罗恩氏病。

24.权利要求23所述的方法，其中所述克罗恩氏病是胃十二指肠克罗恩氏病、空肠回肠炎、回肠结肠炎或克罗恩氏结肠炎。

25.权利要求23所述的方法，其中所述炎症性肠病是溃疡性结肠炎。

26.权利要求25所述的方法，其中所述溃疡性结肠炎是全结肠炎、限性结肠炎、远端结肠炎或直肠炎。

27.权利要求25所述的方法，其中所述症状是如下一种或多种：GI道一部分的发炎和肿胀、腹痛、频繁的肠道排空、腹泻、直肠出血、贫血、减重、关节炎、皮肤问题、发烧、肠壁增厚、个体肠内疤痕组织的形成、个体肠内疮口或溃疡的形成、个体肠内壁一处或多处瘘管的形成、个体肛门内一处或多处裂缝的形成、患营养缺乏（例如蛋白、热量、维生素的一种或多种的缺乏）、患肾结石或患胆结石。

28.权利要求27所述的方法，其中所述症状是如下一种或多种：腹痛、血性腹泻、发烧、恶心、腹部痛性痉挛、贫血、疲劳、减重、食欲不振、直肠出血、体液和营养流失、皮肤病损、关节痛、成长不足、骨质疏松症、眼炎或肝病。

29.权利要求20所述的方法，其中所述疾病或紊乱是硬皮症。

30.权利要求29所述的方法，其中该硬皮症是弥漫性硬皮症、限性硬皮症（CREST综合症）、硬斑病或线形硬皮症。

31.权利要求29所述的方法，其中所述症状包括如下一种或多种：面部皮肤硬化、手指皮肤硬化、雷诺氏综合症、肢体中不适当的血管收缩、钙质沉着、毛细管扩张或食道运动功能障碍。

32.权利要求20所述的方法，其中所述疾病或紊乱是牛皮癣。

33.权利要求32所述的方法，其中所述牛皮癣的症状是牛皮癣关节炎。

34.权利要求32所述的方法，其中所述牛皮癣的症状是如下一种或多种：皮肤鳞屑、皮肤发红、皮肤增厚、斑块的形成、指甲板下变色、指甲凹陷、指甲横纹、指甲下皮肤增厚、甲松离、脓泡的形成、关节或结缔组织发炎、皮肤发炎或皮肤剥落。

35.权利要求20所述的方法，其中所述疾病或紊乱是多发性硬化症。

36.权利要求35所述的方法，其中所述症状是如下一种或多种：个体的肢体感觉障碍、视神经功能障碍、锥体束功能障碍、膀胱功能障碍、肠功能障碍、性功能障碍、运动失调或复视。

37.权利要求20所述的方法，其中所述疾病或紊乱是类风湿性关节炎。

38.权利要求37所述的方法，其中所述类风湿性关节炎涉及如下一种或多种：坏疽性脓皮病、嗜中性皮肤病、斯威特氏综合症、病毒性感染、结节性红斑、小叶性脂膜炎、趾皮肤萎缩、掌红斑、弥漫性稀疏（宣纸皮肤）、皮肤脆性、外表面上（例如手肘上）皮下结节、肺部纤维化（例如氨甲蝶呤疗法所导致的肺部纤维化）、卡普兰氏结节、血管炎性紊乱、甲皱梗塞、神经病变、肾病、淀粉样变性病、假性肌肥大、心内膜炎、左心衰竭、心瓣炎、巩膜软化症、多发性神经炎或寰枢椎不全脱位。

39.权利要求20所述的方法，其中所述疾病或紊乱是红斑狼疮。

40.权利要求39所述的方法，其中的所述症状红斑狼疮是如下一种或多种：面颊疹、皮肤上形成厚的鳞屑红斑、秃头症、口腔溃疡、鼻腔溃疡、阴道溃疡、皮肤病损、关节痛、营养性贫血、铁缺乏症、低于正常的血小板和白细胞数、抗磷脂抗体综合症、血液中存在抗心磷脂抗体、心包炎、心肌炎、心内膜炎、肺炎、胸膜炎、肋膜炎、胸膜腔积液、狼疮性肺炎、肺动脉高血压、肺栓子、肺出血、自身免疫性肝炎、黄疸、血液中存在抗核抗体（ANA）、血液中存在平滑肌抗体（SMA）、血液中存在肝/肾微粒体抗体（LKM-1）、血液中存在抗线粒体抗体（AMA）、血尿症、蛋白尿、狼疮性肾炎、肾衰竭、患上具有“线圈”异常的膜性肾小球肾炎、发作、精神病、脑脊髓液异常、个体的T细胞中缺乏CD45磷酸酶和/或CD40配体的表达上升、狼疮性肠胃炎、狼疮性胰腺炎、狼疮性膀胱炎、自身免疫性内耳病、副交感神经功能障碍、视网膜血管炎、系统性血管炎、FcεRIγ的表达上升、T细胞中钙水平上升并持续、血液中肌醇三磷酸增加、蛋白激酶C磷酸化作用减弱、Ras-MAP激酶信号减弱或蛋白激酶A I活性缺乏。

41.权利要求20所述的方法，其中所述疾病或紊乱是糖尿病。

42.权利要求41所述的方法其中所述症状是如下一种或多种：血糖异常高、通过葡萄糖耐量试验测定缺乏抗胰岛素性、疲劳或意识丧失。

43.权利要求20所述的方法，其中所述疾病、紊乱或病症是蕈样霉菌病（Alibert-Bazin综合症）。

44.权利要求43所述的方法，其中所述蕈样霉菌病处于红斑阶段。

45.权利要求43所述的方法，其中所述蕈样霉菌病处于皮肤肿瘤阶段。

46.权利要求43所述的方法，其中所述蕈样霉菌病处于皮肤发红（红皮病）阶段。

47.权利要求43所述的方法，其中所述蕈样霉菌病处于淋巴结阶段。

48.权利要求43所述的方法，其中所述症状是如下一种或多种：形成发痒的扁平红斑、形成鼓起的扁平硬红斑（斑块）、形成鼓起的肿块（结节）、身体上形成发痒的大块红鳞屑区、手掌和脚底的皮肤开裂、手掌和脚底的皮肤增厚或淋巴结发炎。