CN114288386A - Del-1作为炎症性肠病新的生物标志物及治疗药物应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于发育内皮细胞基因‑1研究技术领域，尤其Del‑1作为炎症性肠病新的生物标志物及治疗药物应用。Del‑1和/或Del‑1‑Fc融合蛋白在制备防治炎症性肠病药物中的应用。Del‑1和/或Del‑1‑Fc融合蛋白在制备抑制结肠炎肠道炎性因子分泌制剂中的应用。肠道炎性因子在制备抑制Del‑1表达或抑制Del‑1‑Fc表达制剂中的应用。Del‑1检测剂在制备炎症性肠病检测制剂中的应用。本发明中Del‑1及其融合蛋白对炎症性肠病具有调节改善作用；同时也针对Del‑1的调节给出调节方案；并且从另一方面针对炎症性肠病检测提供了一种检测方式。
Description
技术领域
本发明属于发育内皮细胞基因-1研究技术领域，尤其涉及Del-1作为炎症性肠病新的生物标志物及治疗药物应用。
背景技术
炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是由免疫介导的慢性炎症疾病，且自身无法修复，若任由不受控制的炎症进展，会引发诸如组织纤维化、器官损伤和衰竭等并发症，严重影响患者的生活质量。近来观点认为IBD治疗不仅要关注于抗炎和抑制异常免疫活动，还应重视促进炎症消退和组织修复的作用，这可能是实现IBD重要治疗目标“完全粘膜愈合”的关键。寻找新的生物标志物和治疗靶点，促进IBD炎症消退和粘膜愈合，可能是突破目前的治疗瓶颈的关键。
发育内皮细胞基因-1(developmentally endothelial locus 1,Del-1)，最初以内皮细胞分泌的一种细胞外基质蛋白而被发现。其蛋白序列编号:NP_005702.3，具体序列为：mkrsvavwll vglslgvpqf gkgdicdpnp cenggiclpg ladgsfscec pdgftdpncssvvevasdee eptsagpctp npchnggtce iseayrgdtf igyvckcprg fngihcqhni necevepcknggictdlvan yscecpgefm grncqykcsg plgieggiis nqqitassth ralfglqkwy pyyarlnkkglinawtaaen drwpwiqinl qrkmrvtgvi tqgakrigsp eyiksykiay sndgktwamy kvkgtnedmvfrgnidnntp yansftppik aqyvrlypqv crrhctlrme llgcelsgcs eplgmksghi qdyqitassifrtlnmdmft weprkarldk qgkvnawtsg hndqsqwlqv dllvptkvtg iitqgakdfg hvqfvgsyklaysndgehwt vyqdekqrkd kvfqgnfdnd thrknvidpp iyarhirilp wswygritlr sellgcteee。
研究显示，Del-1具有多重促进炎症消退的作用，包括调节胞葬作用、抑制白细胞迁移、促进Treg细胞分化以及与特异性促炎症消退介质(specialized pro-resolvingmediators，SPM)相互调节等。
目前尚无Del-1在炎症性肠病表达、治疗药物应用及其自身调节的相关研究。
发明内容
针对上述问题，本发明提供Del-1及其融合蛋白作为炎症性肠病新的生物标志物及治疗药物应用，主要弥补了Del-1及其融合蛋白的一些研究空白，填补了其在炎症性肠病治疗、检测中的应用，同时也针对其调节方式作出了研究。
为了解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
Del-1和/或Del-1-Fc融合蛋白在制备防治炎症性肠病药物中的应用。
在一些方式中，所述的炎症性肠病包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。
在一些方式中，所述炎症性肠病为DSS结肠炎。
Del-1和/或Del-1-Fc融合蛋白在制备抑制结肠炎肠道炎性因子分泌制剂中的应用。
在一些方式中，所述结肠炎肠道炎性因子至少为IL 1β、TNFα、IL-6、IL17中之一。
在一些方式中，所述结肠炎肠道炎性因子分泌为葡聚糖硫酸钠诱导型结肠炎肠道炎性因子分泌。
肠道炎性因子在制备抑制Del-1表达或抑制Del-1-Fc表达制剂中的应用。
在一些方式中，所述结肠炎肠道炎性因子至少为IL 1β、TNFα、IL-6、IL17中之一。
Del-1检测剂在制备炎症性肠病检测制剂中的应用。
本发明的有益效果是：
Del-1及其融合蛋白对炎症性肠病具有调节改善作用。同时也针对Del-1的调节给出调节方案。并且从另一方面针对炎症性肠病检测提供了一种检测方式。
附图说明
图1为Del-1在IBD患者和小鼠表达情况及ROC曲线图；
图2为Del-1改善急性DSS结肠炎小鼠肠道炎症；
图3为Del-1减少急性DSS结肠炎肠道炎性细胞因子分泌。
具体实施方式
本部分第一方面介绍Del-1的用途：
其中之一，Del-1融合蛋白在制备防治炎症性肠病药物中的应用。
在一些方式中，所述的炎症性肠病包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。
在一些方式中，所述炎症性肠病为DSS结肠炎。
其中之二，Del-1和/或Del-1-Fc融合蛋白在制备抑制结肠炎肠道炎性因子分泌制剂中的应用。
在一些方式中，所述结肠炎肠道炎性因子至少为IL 1β、TNFα、IL-6、IL17中之一。
在一些方式中，所述结肠炎肠道炎性因子分泌为葡聚糖硫酸钠诱导型结肠炎肠道炎性因子分泌。
本部分第二方面介绍Del-1-Fc融合蛋白的用途：
其中之一，Del-1-Fc融合蛋白在制备防治炎症性肠病药物中的应用。
在一些方式中，所述的炎症性肠病包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。
在另一些方式中，所述炎症性肠病为DSS结肠炎(葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎)。
其中之二，Del-1-Fc融合蛋白在制备抑制结肠炎肠道炎性因子分泌制剂中的应用。
在一些方式中，所述结肠炎肠道炎性因子至少为IL 1β、TNFα、IL-6、IL17中之一。
在一些方式中，所述结肠炎肠道炎性因子分泌为葡聚糖硫酸钠诱导型结肠炎肠道炎性因子分泌。
Del-1-Fc融合蛋白：将人Del-1与IgG的Fc片段融合构建形成Del-1-Fc融合蛋白；其中，具体的融合方法可参考现有的融合技术。
本部分第三方面介绍肠道炎性因子和Del-1、Del-1-Fc调节应用关系：
肠道炎性因子在制备抑制Del-1表达或抑制Del-1-Fc表达制剂中的应用。
通过肠道炎性细胞因子能够实现降低Del-1或Del-1-Fc表达行为，从而在一些场景中，实现对Del-1或Del-1-Fc的调节作用。比如：在商业性Del-1或Del-1-Fc性质研究实验中，为了研究Del-1或Del-1-Fc表达影响条件，此时利用肠道炎性细胞因子进行调节。
其中，所述结肠炎肠道炎性因子至少为IL 1β、TNFα、IL-6、IL 17中之一。当然，其他能够影响Del-1表达的炎性因子也应当在本发明保护范围内。
本部分第四方面对炎症性肠病检测制剂介绍：
Del-1检测剂在制备炎症性肠病检测制剂中的应用。Del-1为炎症性肠病新的生物标志物。通过检测疑似炎症性肠病待检物中Del-1水平，可以一定程度上对炎症性肠病进行表征。
本部分第五方面结合一具体研究项目介绍：
1.材料
1.1动物:6-8周，雄性C57BL/6J小鼠(购于北京维通利华公司)，于SPF级动物实验中心进行饲养
1.2试剂:构建人Del-1与IgG的Fc片段融合蛋白(Del-1-Fc，构建于南京金斯瑞公司)；人IgG-Fc对照，购买于Sino Biological公司；Human EDIL3(Del-1)ELISAkit，购买于美国R&D公司。
2.方法
分组：雄性C57BL/6J小鼠18只，随机分为对照组、DSS组、DSS+Del-1-Fc组，每组6只，小鼠于SPF级动物实验中心进行适应性喂养和后续实验；
2.1干预
对照组：自由饮用正常水7天，每天腹腔注射200ul/只PBS溶液；
DSS组：小鼠自由饮用3％DSS溶液7天，每天腹腔注射1ug/只IgG-Fc；
DSS+Del-1-Fc组：小鼠自由饮用3％DSS溶液7天，每天腹腔注射1ug/只Del-1-Fc。
一般情况记录：造模开始后，记录每天小鼠体重、大便性状(正常、松散、稀便)及带血情况(无、隐血、肉眼血便)和活动情况(活跃还是倦怠)等。
小鼠处死及标本的收集：造模第7天处死小鼠，首先使用戊巴比妥钠腹腔麻醉小鼠后进行眼球取血，4℃、3500-4500rpm、15min离心，留取血清储存于-80℃冰箱，备用。沿腹中线打开腹腔，测量完整直结肠长度并称取脾脏重量。清洁结肠粪便，留取一段结肠组织于组织固定液中常温固定24h后行石蜡切片及H&E染色，其余组织保存于-80℃冰箱中，用于后续实验。
2.2RT-qPCR
①组织RNA的提取
取经高压灭菌的2ml EP管，编好序号，剪取10mg结肠组织放入相应序号的EP管中，每个EP管加入磁珠2颗和1ml Trizol溶液，置于研磨仪上低温匀浆，65HZ、120s、2次；
向组织匀浆液中加入200ul氯仿(1/5的trizol体积)，按紧管盖，剧烈振荡15s，待溶液呈粉红色后，室温静置5min；
离心：4℃、12000rpm、15min，组织匀浆液分为上层无色RNA相、中间白色蛋白相、下层红色有机相三层；
移液器小心吸取200ul上层无色溶液至新的EP管，注意不要吸到中间的白色相，加入等体积200ul异丙醇，上下颠倒，充分混匀，室温静置5min，4℃、12000rpm、15min离心，EP管底部可见RNA沉淀；
小心弃去上清后，缓慢地沿EP管壁加入预冷的75％乙醇1ml，上下颠倒EP管，4℃、12000rpm、5min离心；
用移液枪小心移除EP管中所有液体，将EP管倒置于滤纸上，干燥5min，使残留乙醇挥发；
根据RNA沉淀量，加入适量的RNase-free水溶解沉淀，用移液枪轻轻吹打沉淀使其充分溶解；
检测RNA浓度：使用分光光度计测定RNA浓度。ddH2O清洗比色杯光滑面内外多次，加入100ul ddH2O调零。向比色杯中加入2ul待测RNA溶液和98ul ddH2O，记录RNA浓度和纯度。
②逆转录
根据扩增反应体系和RNA浓度计算所需的RNA和DEPC水体积；
如10ul体系：RNA-PrimerMix(5X)2ul+RNA待测样品(1/浓度*1000)ul+DEPC水(10-2-VRNA)(ul)；
根据以上体系，计算RNA-PrimerMix、RNA样品、DEPC水体积，分别加入0.5mlEP管，瞬离；
逆转录：在逆转录仪器中进行逆转录，37℃15min，85℃15sec，得到相应cDNA，保存于-20℃冰箱。
③RT-qPCR
配扩增反应体系：引物体系TB Green 5ul+引物1ul，目的基因体系cDNA1ul+ddH2O3ul；
加样：根据实验需求，设计加样的形式，并在96孔板上做相应的记号，分别在每孔侧壁上加入6ul引物体系和4ul目的基因体系，加样完毕后用封板膜封闭96孔板并离心。
扩增：将96孔板放入PCR仪中，设定程序扩增，95℃10min—95℃30s—60℃30s—72℃1min，重复40个循环进行扩增；
结果分析：以β-actin或GAPDH作为内参基因，采用2-△△CT方法，计算分析各组目的基因相较于对照组的表达情况。
引物序列：
2.3酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)
根据试剂盒说明书进行检测，操作步骤简述如下：
1)复温：提前20分钟取出试剂盒于室温中；
2)试剂和样本准备：
①Del-1捕获抗体：向Del-1捕获抗体中加入0.5ml PBS，并用移液枪轻轻吹打混匀，配制存储浓度的Del-1捕获抗体，待用时，Reagent Diluent将其稀释120倍至工作浓度。
②Del-1检测抗体：向Del-1检测抗体中加入1ml Reagent Diluent，并用移液枪轻轻吹打混匀，配制存储浓度的Del-1检测抗体，待用时，Reagent Diluent将其稀释360倍至工作浓度。
③标准品：向标准品中加入0.5ml Reagent Diluent，并用移液枪轻轻吹打混匀，配制存储浓度的标准品，待用时，Reagent Diluent将其稀释80倍至工作浓度，并依次进行倍比稀释1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.3pg/ml、15.6pg/ml。
④Streptavidin-HRP：用Reagent Diluent将其稀释40倍至工作浓度。
3)取出板条，每孔加入100ul Del-1捕获抗体包被，用封板膜封板，室温孵化过夜；
4)洗板：弃掉板条内液体，每孔加入洗板液400ul，静置1min，重复清洗3次后，甩尽剩余液体，在干净滤纸上拍干板条；
5)每孔加入300ul Reagent Diluent，用封板膜封板，室温至少孵1小时；
6)重复步骤4)；
7)每孔加入100ul稀释后的标准品和待测样本，封板膜密封，室温孵育2小时；
8)重复步骤4)；
9)每孔加入100ul Del-1检测抗体，封板膜密封，室温孵育2小时；
10)重复步骤4)；
11)每孔加入100ul Streptavidin-HRP，封板膜密封，室温避光孵育20分钟；
12)重复步骤4)；
13)每孔加入100ul底物溶液，封板膜密封，室温避光孵育20分钟；
14)每孔加入50ul终止液，轻拍板条使液体混匀，避光；
15)立即用酶标仪在450nm和570nm波长处测定OD值，570nm波长的OD值用以矫正；
16)用标准品OD值绘制四参数logistic回归曲线，根据标准曲线计算待测样品浓度，再乘以样品稀释倍数得到最终的样品浓度。
3.统计分析
使用GraphPad Prism 8.0进行实验数据分析，统计结果用均数±标准误表示。两组间差异分析采用t检验，三组间差异分析采用单因素方差分析(One-wayANOVA)。使用SPSS绘制受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC曲线)。P<0.05时认为组间差异具有统计学意义。
4.结果及分析
①Del-1在小鼠和IBD患者中的表达情况及ROC曲线图
选择五只野生型未经过处理的8-10周龄雄性C57BL/6小鼠，用RT-qPCR的方法检测小鼠体内编码Del-1的基因在小鼠肝脏、脾脏、肾脏、肺、胸腺、小肠PP结、空肠、回肠、结肠、阑尾mRNA水平。构建急性DSS结肠炎小鼠模型，具体见方法部分，RT-qPCR检测两组小鼠结肠Del-1mRNA水平。如图1所示，纵轴数值表示该部位内参β-actin与Del-1mRNA的表达量比值，柱越高表示该部Del-1mRNA的相对表达量越大。DSS组小鼠结肠中Del-1水平较对照组显著下降，差异有统计学意义。与健康人相比，UC(溃疡性结肠炎)和CD(克罗恩病)患者肠道组织和血清中Del-1水平显著降低。当截断值取34.16pg/ml时，血清Del-1对从对照组中识别活动性IBD患者的敏感度、特异度和曲线下面积(AUC)分别为92.1％、64.3％和0.817。
总之，Del-1在小鼠肠道组织及免疫相关器官中有表达，在IBD患者和急性DSS结肠炎小鼠中显著下降。Del-1是IBD新的生物标志物，并可能作为IBD治疗的新靶点。
②Del-1改善急性DSS结肠炎小鼠肠道炎症
使用Del-1-Fc干预急性DSS结肠炎小鼠，具体分组及操作见方法部分。测量并计算每只小鼠每日体重与第0天该小鼠体重的比值。
如图2所示，对照组小鼠体重随时间增长，DSS组小鼠体重下降明显，DSS+Del-1-Fc干预组小鼠的平均体重较DSS组重。与DSS组相比，DSS+Del-1-Fc干预组小鼠的平均结肠长度更长，脾脏重量更轻，且均具有统计学意义。说明Del-1减轻急性DSS结肠炎小鼠肠道炎症，具体表现在其可改善急性DSS结肠炎小鼠体重降低、脾脏重量升高以及结肠缩短程度。
③Del-1减少急性DSS结肠炎小鼠肠道炎性细胞因子分泌
使用RT-qPCR检测对照组、DSS组、DSS+Del-1-Fc组小鼠肠道组织炎性细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-17mRNA水平。柱高表示mRNA水平与内参基因β-actin的比值平均值，柱上方的横线与柱的距离表示标准误。
如图3所示，Del-1-Fc干预组小鼠IL 1β、TNFα、IL-6、IL 17mRNA水平较DSS组显著下降，差异有统计学意义，进一步证明了Del-1可减轻急性DSS结肠炎小鼠肠道炎症。
本领域的技术人员可以明确，在不脱离本发明的总体精神以及构思的情形下，可以做出对于以上实施例的各种变型。其均落入本发明的保护范围之内。本发明的保护方案以本发明所附的权利要求书为准。
Claims (9)
1.Del-1和/或Del-1-Fc融合蛋白在制备防治炎症性肠病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述的炎症性肠病包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。
3.根据权利要求1所述的应用，其中，所述炎症性肠病为DSS结肠炎。
4.Del-1和/或Del-1-Fc融合蛋白在制备抑制结肠炎肠道炎性因子分泌制剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其中，所述结肠炎肠道炎性因子至少为IL1β、TNFα、IL-6、IL 17中之一。
6.根据权利要求4所述的应用，其中，所述结肠炎肠道炎性因子分泌为葡聚糖硫酸钠诱导型结肠炎肠道炎性因子分泌。
7.肠道炎性因子在制备抑制Del-1表达或抑制Del-1-Fc表达制剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其中，所述结肠炎肠道炎性因子至少为IL1β、TNFα、IL-6、IL 17中之一。
9.Del-1检测剂在制备炎症性肠病检测制剂中的应用。
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