KR100953821B1 - 비타민 ｄ 결합 단백질을 이용한 천식 진단 마커 및 천식치료제 - Google Patents

Abstract

본 발명자들은 2-D 전기영동을 이용하여 기관지 천식 환자와 건강한 정상인의 기관지폐포세척액(Bronchoalveolar lavage fluid, BALF) 단백질 프로파일을 비교하였고, 천식 환자의 BALF 에서 발현 증가된 단백질 스폿 중 비타민 D 결합 단백질(DBP)을 선택하였다. 상기 발현 증가를 난백알부민으로 민감화된 쥐 모델에서 검증하고, 또한 난백알부민으로 민감화된 쥐 모델을 항-DBP 항체로 치료한 결과, 기도 과민반응성, 염증성 세포의 수 및 사이토카인 생산이 현저하게 감소한다는 것을 밝혀내어 천식과 DBP의 상관관계를 다시 검증하였으며, DBP로 직접 쥐를 공격하여 알레르기성 천식의 전형적인 병리학적 증상이 나타나는 것을 확인하였다. 본 발명은 DBP 단백질의 발현량과 천식의 상관관계를 밝혀, 이를 이용한 천식에 대한 진단 마커, DBP 항체 또는 안티센스를 이용한 천식 치료제를 개시한다.

2-D 전기영동, 천식, 기관지폐포세척액(BALF), 비타민 D 결합 단백질(DBP)

Description

비타민 Ｄ 결합 단백질을 이용한 천식 진단 마커 및 천식 치료제{Biomarker for diagnosing asthma and therapeutic agent of asthma controlling expression of vitamin D binding protein}

본 발명은 DBP 단백질의 발현량과 천식의 상관관계를 이용한, 천식에 대한 진단 마커 및 DBP 항체 또는 안티센스를 이용한 천식 치료제에 관한 것이다.

천식은 간헐적 기도 폐색 및 만성적인 기도 염증 및 리모델링과 연관된 호흡기 증상을 보이는 흔한 혼성 호흡기 질환이다. 기도 리모델링의 병리학적 특징은 잔모양 세포 과생성 (goblet cell hyperplasia), 상피세포하 섬유증 (subepithelial fibrosis), 콜라겐 퇴적, 점막샘 과생성, 불수의근 이상발달 및 세포외매트릭스에서의 변화를 포함한다. 염증 및 리모델링은 기도 과민반응성(AHR) 및 만성적 기도 폐색의 주 원인이다. 천식에서의 병리생리학적 변화는 전사 경로, 염증성 매개물질, 케모카인, 사이토카인, 아폽토시스 및 세포증식과 같은 것과 연관된 단백질들의 이상 발현에 의한다. 그러나, 천식 표현형의 복합적인 특성(유전적으로 혼성인 것 및 환경적인 영향) 때문에 천식의 기본적 특성을 밝히는 것이 어렵다.

기관지폐포세척(Bronchoalveolar lavage, BAL)은 기관지 내시경과 함께 수행되는 것으로서 기도 및 폐포를 덮고 있는 상피 점액층으로부터 세포 및 다른 수용성 성분을 수집하기 위하여 널리 사용되어 왔다. BAL액은 혈류 내의 다양한 단백질뿐만 아니라 상피세포 및 염증성 세포를 포함하는 다양한 세포 종류로부터 분비된 단백질들을 포함한다.

그러나 천식환자의 BAL액에 대한 단백질체 분석은 제한적이고, 천식환자에 대한 신규한 바이오마커 및 병원성 분자는 아직 밝혀진 바가 없다.

본 발명자들은 BALF 단백질의 다양한 기원에 착안하여, BALF 의 분석이 중요한 병리학적 매개물질을 밝힐 수 있고 만성적 기도 질환의 특성을 분자 수준에서 좀더 정확하게 밝힐 수 있을 것이라고 생각하고서, 정상인 대조군과 천식환자간의 비교를 위한 차별적 표시 프로테오믹스(differential-display proteomics)를 도입하여 천식환자의 BALF 에서 차별적으로 발현되는 단백질을 동정하였다. 특히 비타민 D 결합 단백질(DBP)이 천식환자에서 현저하게 증가하는 것으로 밝혔다. 따라서 본 발명은 천식에서의 DBP의 역할을 밝히고, DBP를 이용하여 천식의 새로운 치료제 및 진단 마커를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 가지는 단백질로 구성된 천식 진단 마커를 제공한다.

본 발명은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 가지는 단백질에 대한 항체를 유효성분으로 하는 천식 치료제를 제공한다.

본 발명은 서열번호 1에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가지고, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 가지는 단백질의 생산을 저해하는 안티센스 뉴클레오티드를 유효성분으로 하는 천식 치료제를 제공한다.

본 발명은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 가지는 단백질에 시험 물질을 결합시키는 단계; 및 상기 시험 물질이 상기 단백질의 작용을 억제하는지를 확 인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 천식 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명은 시험 물질에 대하여 천식 억제 여부를 스크리닝하는 방법으로서, 상기 시험 물질이 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 가지는 단백질의 발현을 촉진하는지를 ELISA 또는 웨스턴블럿(immuno blot) 방법으로 확인하는 단계를 포함하는 천식 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에서 밝혀진 천식에서의 DBP의 역할을 기초로 하여, DBP 의 전사체 및 단백질 발현량을 천식 진단을 위하여 이용할 수 있고, 천식의 치료를 위한 새로운 치료방법 설계에 유용할 것이다.

기관지 천식은 광범위의 분석이 필요하여 개개 또는 소수의 유전자의 분석을 통해서는 이해할 수 없는 다중요인 질병이므로 본 발명자들은 천식에 연관된 단백질을 다중적으로 분석하기 위하여, 단백질체에 대한 큰 규모의 연구를 수행하였고, 천식 특이적인 단백질을 찾아내어 이를 천식의 조기 발견, 예측 및 치료에 이용하려고 한다.

본 발명의 일실시예에서 본 발명자들은 2차원 전기영동을 이용하여 단백질체적 접근을 채택하였다. 실험적 변동을 최소화하기 위하여, 정상인 대조군(8명) 또는 천식환자(8명)로부터의 복제 젤을 제조하여 통계처리 하였고, 그 결과 두 그룹간 단백질 농도에 있어서 현저한 차이가 있음을 밝혔다. 천식환자에서는 정상인 대 조군에 비하여 10개의 단백질 스폿이 발현감소하고 10개의 단백질 스폿이 발현증가하였다. 이 스폿들은 젤 내 분해 (in-gel digestion) 및 LC-MS/MS를 통하여 동정되었다.

BALF는 공기-혈액 장벽을 통하여 투과하는 혈청단백질을 풍부하게 포함한다. 따라서, BALF 내 어떤 단백질 증가되었다면, 이는 상기 단백질이 혈장 수준에서 증가되어 더 많은 양이 폐포의 상피 장벽을 통과한 것으로 설명될 수도 있다. 그러나 개개 단백질의 알부민에 상대적인 삼출(exudation) 특성을 상대 배출 계수(RCE = Q_{individual protein}/Q_ALB)개념을 사용하여 계산한 결과, BALF 내 증가된 단백질은 혈장 수준에서 증가된 것이 아니고, 국부적 생산 또는 폐순환으로부터 선택적으로 삼출된 것에 의한 것이라는 것을 밝혀내었다.

본 발명의 일실시예에서는 동정된 20개의 단백질 중 DBP가 선택되었다. 상기 단백질은 대사 및 염증에 관련되어 있으며 2-DE에서 정상인 대조군에 비하여 천식환자의 BALF에서 5배나 증가된 향 염증성 매개자이기 때문이다.

DBP는 운반자 기능, 염증 및 면역 메커니즘의 조절과 같은 많은 중요한 기능을 가지는 다기능 혈장 단백질로서 혈장 내에서 비타민 D 스테롤을 운반하고, 간 유세포에 의해 우세하게 생산되는 것으로 알려져 있으나, 다양한 다른 조직들도 DBP를 생산하며 상기 단백질은 혈장이 아닌 다른 액체, 예를 들어 뇌척수액, 정액, 침, 모유, 및 기관지 상피 점액에서도 검출된다. DBP단백질을 코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1과 같고, DBP단백질의 아미노산 서열은 서열번호 2 와 같다.

본 발명의 일실시예에서, 정상인 대조군(27명)에 비하여 천식환자의(69명) BAL액에서 DBP농도가 현저하게 상승한다는 것은 ELISA를 이용하여 설명되었다(도 2b). 천식환자의 BALF 내 단백질 1ug에 대한 DBP의 양은 2.5ng이었다. 즉, 총 단백질 내 DBP 비율은 대략 0.25%이었다. 한편, 혈청 내 DBP농도는 대략 70-300mg/L이고, 혈장 단백질은 70mg/mL이다. 즉, DBP/단백질의 비는 대략 0.1%이다. 천식환자에 있어서 DBP/단백질의 비는 혈청에서보다 BALF에서 2.5배 높았다. 따라서 상기 데이터는 특정량의 DBP가 천식환자의 폐에서 생산되고 분비될 수 있다는 것을 가리킨다. 또한 BAL 세포의 면역조직화학염색에서 천식환자의 마크로파지는 다른 세포에 비하여 강하게 염색되었다(도 2c). 이것은 폐 마크로파지가 천식환자의 DBP 원천이 될 가능성을 나타낸다. DBP mRNA의 양은 대조군에 비하여 OVA 천식 모델의 BAL세포에서 증가하였으나 간조직에서는 증가하지 않았고(도 3a), BALF의 웨스턴 블럿상에서 DBP의 농도는 대조군에 비하여 OVA 천식 모델의 BALF에서 현저하게 상승하였다(도 3b). OVA 공격된 쥐의 마크로파지 및 기관지 상피세포에 대한 면역조직화학염색 결과에서도 DBP가 대조군에 비하여 OVA 공격된 쥐의 마크로파지 및 기관지 상피세포에서 강하게 발현된다는 것을 알 수 있었다. 따라서, DBP가 폐 내에서 마크로파지 및 상피세포에 의하여 국부적으로 생산된다는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명의 일실시예에서는, DBP가 기도 알레르기성 염증에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 다양한 양(40- 200fmol)의 항-DBP 항체를 비강 경로를 통하여 처리 하였다. 이러한 처리는 실질적으로 OVA 유도된 과민반응성을 감소시켰다(도 4a). 상기 처리는 투여량에 의존적으로 염증성 세포의 BALF 내로의 침투를 억제하였다(도 4b,c). H&E-염색된 이미지로부터의 염증 지표의 반 정량적(semiquantitative)인 수치(도 4d) 및 PAS 양성 잔모양 세포의 백분율(도 4e)도 항-DBP 항체로 처리된 OVA 공격된 쥐에서 현저하게 감소되었다.

OVA 공격된 쥐 모델은 인간의 알레르기성 기도 질환에 대한 모델로 널리 사용된다. 상기 모델에서 관찰되는 병리적 특성이, 예를 들면 T-헬퍼 2 세포의 활성화로 인한 IL-4, IL-5, IL-13의 발현, 및 IgE 전신적 반응, 이로 인한 에오시노필성 기도 염증 및 기도 과민반응 야기 등이 인간 질환과 유사하기 때문이다. 본 발명의 일실시예에서는, OVA 유도 염증성 사이토카인 분비에 대한 항-DBP항체의 억제효과를 평가하기 위하여 OVA 공격된 쥐의 BALF 내 에오택신(eotaxin), IL-4, IL-5, IL-13와 같은 Th2 사이토카인 및 Th1 사이토카인(IFN-γ, TGF-β)을 측정하였다.(도 4f) 상기 OVA 공격은 모든 사이토카인 분비의 유효한 증가를 야기하였으나, OVA 공격된 쥐를 200 fmol의 항-DBP 항체로 처리하면 Th2타입 사이토카인, 에오택신, 및 IFN-γ 의 생산이 현저하게 억제되었다. 그러나 TGF-β는 억제되지 않았다. 또한, 항-DBP항체는 혈청 내 IgE의 농도를 현저하게 감소시켰다(도 4f). 이러한 데이터는 DBP가 염증 사이토카인을 더욱 상승시키면서 천식의 기도 염증 및 상피세포 변화를 유도한다는 것을 의미한다.

또한 본 발명의 일실시예에서는, 분리된 DBP를 쥐에 직접 주입함으로써 DBP의 효과도 밝혀내었다. DBP 공격된 쥐는 OVA 쥐 모델에서 관찰되는 병리적 특성과 유사한 특성을 보였다. 예를 들면 T-헬퍼 2 세포의 활성화로 인한 IL-4, IL-13, 에오택신, IFN-γ의 발현 및 IgE 전신적 반응, 이로 인한 기도 과민반응이 인간의 질환 특성과도 유사하다. 그러나 DBP 공격은 IL-5의 농도 및 침투한 에오시노필 개수에는 유효한 변화를 유발하지는 않았다.

본 발명이 일실시예에서는, SPSS 10.0을 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. 두 그룹(기관지 천식 및 정상인 대조군)의 밀도 차이를 비교하기 위하여 Kruskal-Wallis 테스트를 사용하였다. 차이가 현저하다면 두 그룹간의 차이를 분석하기 위하여 Mann-Whitney 테스트를 사용하였다. 변수들간의 상관관계를 분석하기 위하여 단순 선형회귀 분석이 수행되었으며, Pearson's 상관계수(R)가 결정되었다. 모든 데이터는 중앙값으로 표현되었고 유효성은 p < 0.05로 정의되었다.

본 발명의 일실시예에 따른 진단 키트에 포함된 DBP 단백질(서열번호 2)에 대한 항체는 일반적인 항체 제조방법으로 제조된다.

본 발명의 일실시예에 따른 천식 치료제에 포함된 DBP 유전자에 대한 안티센스 뉴클레오티드는 일반적인 안티센스 제조방법으로 제조된다.

본 발명의 일실시예에 따른 천식 치료제는 본 발명에 따른 항체 또는 안티센스뉴클레오티드를 유효성분으로 하여 상용되는 무기 또는 유기의 담체를 가하여 고체, 반고체 또는 액상의 형태로 경구투여제 혹은 비경구 투여제로 제제화할 수 있다.

경구투여을 위한 제재로서는 정제 (錠劑), 환제 (丸劑), 과립제 (顆粒劑), 연·경 캡슐제, 산제, 세립제, 분제, 유탁제 (乳濁濟), 시럽제, 펠렛제 등을 들 수 있다. 비경구 투여를 위한 제재로는 주사제, 점적제, 연고, 로션, 스프레이, 현탁제, 유제, 좌제 (坐劑) 등을 들 수가 있다. 본 발명의 유효성분을 제제화하기 위해서는 상법에 따라서 실시하면 용이하게 제제화할 수 있으며 계면활성제, 부형제, 착색료, 향신료, 보존료, 안정제, 완충제, 현탁제, 기타 상용하는 보조제를 적당히 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 약학 조성물은 경구, 비경구, 직장, 국소, 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 피하 등으로 투여될 수 있다.

또한, 상기 활성성분의 투여량은 치료 받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.001mg/kg/일 내지 대략 2000mg/kg/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 0.5mg/kg/일 내지 2.5mg/kg/일이다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예에 관하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나 후술하는 실시예는 본 발명의 바람직한 일실시예일 뿐, 본 발명이 그러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

1. 실험 대상

실험 대상은 경미하거나 중간정도의 천식으로 안정적인 상태에서 순천향 대학 부천 병원에서 정기적으로 체크되는 천식환자들로부터 수집되었다. 각각의 환자는 FEV1 및/또는 10 mg/ml 미만의 메타콜린에 대한 기도 과민반응이 15% 이상 증가한 양성 기관지 확장 반응에 의하여 알 수 있듯이, 기도가역을 나타내었다. 정상인 대상은 호흡기 증상에 대한 문진에 부정적 대답을 하였으며 FEV₁ 가 예상수치의 75% 이상이며, PC₂₀ 가 10 mg/ml이상의 메타콜린이며, 정상적인 가슴 x-레이를 나타낸다. 상기 실험대상들은 24가지(집먼지진드기, 알터내리아(Alternaria ),, 아스퍼질러스(Aspergillus ), 꽃가루, 개털, 고양이털, 바퀴벌레 등)의 보편적인 흡입알레르겐에 대한 피부 테스트(skin-prick test)를 받았다. 아토피는 히스타민(1mg/ml)에 의한 발진반응 또는 직경 3mm 보다 크거나 유사한 발진반응이 알레르겐 추출물에 의하여 나타나는 것으로 정의되었다. 총 IgE 는 UniCAP 시스템(Pharmacia Diagnostics, Uppsala, Sweden)을 사용하여 측정되었다. 현 흡연자 및 전 흡연자는 실험에서 제외되었다.

2. 기관지 폐포 세척(Bronchoalveolar lavage) 및 BAL 액 준비

천식 증상을 나타내는 환자들에서 코르티코스테로이드 및 베타 아고니스트 흡입 처리를 이용하여 BAL이 수행되었다. 아트로핀(atropine) 및 디아제팜(diazepam)으로 예비마취한 후 광섬유 기관지경(Olympus B2-10)을 수행하였다. 그리고 2% 리도카인 20ml로 국부마취하였다. 각 실험대상은 기관지경 전에 200 μg 의 살부타몰(salbutamol)을 흡입하였다. 멸균되고 따뜻한 생리식염수 4 알리콧(각 50ml) 을 오른쪽 중앙 엽에 주입함으로써 세척이 수행되었다. 세척액은 50mmHg 미만의 음압을 이용한 부드러운 석션으로 즉시 채취되어 얼음 위 폴리에틸렌 튜브 내에 수집되었다. 4장의 거즈를 통하여 여과된 후 세포 개수가 헤모사이토미터로 계수되었다. BAL 액은 4℃에서 500 x g 으로 5분동안 원심분리됨으로써 세포펠렛으로부터 분리되었다. 분리된 세포(2 x 10⁶ 개)들은 세포원심분리(Cytofuge; StatSpin, Norwood, MA)를 이용하여 현미경의 유리슬라이드에 부착되었고 메탄올로 고정되었으며 염색(Diff-Quik; American Scientific Products. Chicago, IL)되었다. 500여개의 백혈구가 관찰되었고, 상기 BAL 액은 -80℃에서 보관되었다.

3. 샘플 준비 및 2-DE

세척액은 오버나이트 투석(Mr cut-off 3500)에 의하여 600볼륨의 10mM Tris-HCl (pH7.4)버퍼를 세 번 교환함으로써 탈염되었다. 단백질 농도는 소혈청알부민을 기준으로 하여 분석키트(Pierce, Rockford, IL, USA)를 사용하여 결정되었다. 투석된 BALF 내의 단백질들은 밤새도록 -70℃의 냉동고에서 10% TCA 함유 아세톤에 의하여 침전되었다. 그리고 4℃에서 14000 rpm으로 20분동안 원심분리되었다. 단백질 펠렛은 냉각된 아세톤으로 3회 세척되어 오염물이 제거되었고, 상기 펠렛은 수분간 건조되어 샘플 용액(7 M 우레아, 2M 티오우레아, 4% CHAPS, 0.3% IPG 버퍼, 100mM DTT) 내에 다시 현탁되었다.

1차 분리에서 등전점 전기영동(IEF)을 위하여 건조된 단백질 샘플들(약 1mg)이 재수화된 버퍼(7M 우레아, 2M 티오우레아, 4% CHAPS, 0.3% IPG 버퍼, 100mM DTT, 트레이스 BPB) 500μl 에 용해되었다.

등전점 전기영동을 위하여 Immobiline DryStrips (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) 을 사용하였고, 이것은 IPGphore 시스템 (Amersham Biosciences) 상에서 추출된 단백질 1mg으로 수행되었다. 등전점 전기영동 분리 후에 상기 단백질은 7.5-20% SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동(PAGE)에 의하여 2차 분리되었다. 이미지 분석을 위하여 상기 젤들은 Coomassie brilliant blue G-250로 시각화되었고 상기 2-D 젤들은 전송모드에서 이미지스캐너(Amersham Biosciences)로 스캔되었다. 스폿 탐지 및 매칭은 ImageMaster 2D ver. 5.0 (Amersham Biosciences)를 이용하여 수행되었다. 디질털화된 이미지는 분석되어 2-D 스폿 강도(intensity)가 계산되었고, 표준화되었다. 상기 수치는 통계적 분석을 위하여 SPSS 10.0 로 전송되었다.

4. 단백질 동정; 나노 LC-MS/MS 및 데이터베이스 탐색

모든 LC-MS/MS 실험은 Agilent Nanoflow Proteomics Solution을 사용하여 수행되었는데, 그것은 MS/MS 를 위한 Agilent 1100 시리즈 nano-LC가 Agilent 1100 시리즈 LC/MSC Trap XCT 이온 트랩 질량 스펙트로미터에 직각으로 나노스프레이 이온 소스를 통하여 연결되었다. 상기 nano-LC 시스템은 ZORBAX 300SB-C18 농축화 칼럼(0.3 x 50mm, 5um)을 이용하여 샘플 농축화/탈염 모드에서 구동되었다. 크로마토 그래피는 ZORBAX 300 SB-C18 (75 um x 150 mm)나노칼럼을 이용하여 수행되었다. 용매 구배는 3% 용매 B (0.1 % 포름산 함유 아세토니트릴) 및 97% 용매 A(0.1 % 포름산 함유 물)에서 시작되었다. 용매구배는 다음과 같이 진행되었다. 0-5분동안은 3%의 B를 조성변화없이, 5-10분동안에는 B를 3%에서 10%로, 10-50분에는 B를 10% 에서 45%로, 50-55분동안에는 B를 45%에서 90%로, 55-60분동안에는 90%의 B를 조성변화없이, 60-61분동안에는 B를 90%에서 3%로, 그리고, 10분동안 3%의 B로 세척하였다.

LC/MSD Trap XCT 는 독특한 펩티드 스캔 자동-MS/MS 모드에서 구동되었다. 이온화모드는 Agilent의 직각 양성 나노전자스프레이 소스를 이용하였다. 건조 기체는 5 L/분으로 흐르고 건조 기체 온도는 300℃였다. V 캡은 일반적으로 1800-1900 V로서, 통과는 30V에서, 모세관 탈출 오프셋은 75V에서 수행되었다. 트랩 드라이브는 평균 1 또는 2개로 85V에 설정되었다. 최대 축적 시간은 150ms이고, 스마트 표적은 125,000, MS 스캔 범위는 300-2200이었다. 자동화된 MS/MS는 모 개수 2, 단편화 진폭 1.15V, SmartFrag 작동(30-200%), 능동제외 작동(1분동안 2 스펙트럼 이후), prefer+2 작동, MS/MS 스캔 범위는 100-1800, 및 울트라 스캔 작동되는 채로, 울트라 스캔 모드에 있었다. 획득한 각각의 MS/MS 스펙트럼은 Spectrum Mill 소프트웨어 도구를 이용하여 비중복 단백질 서열 데이터베이스에서 탐색되었다.

5. 결과

BAL 액의 2-DE 분석결과 각 그룹간 스폿의 평균 개수에서는 현저한 차이가 관찰되지 않았다. (정상인 대조군, 중앙값 565, 범위 542 ~ 596; 기관지 천식환자, 중앙값 571, 범위 547 ~ 586).

MALDI-TOF MS 분석에 의하여 동정된 모든 스폿들은 분자량 10-200kDa 범위에서 pI 3-10 범위에 있었다. 상기 단백질 스폿들의 상대적 강도를 Mann-Whitney U-test를 이용하여 비교한 결과, 천식환자들(8명)과 정상인 대조군(8명) 사이에 상대적 강도에 있어서 2배 이상의 현저한 차이를 나타내는 20개의 단백질 스폿을 발견하였다. (p<0.05). 상기 차등 발현된 단백질은 도 1에 나타난다. 스폿들의 상대적 강도는 평균 ± 표준오차(Standard error of the mean, SEM) 로 표현되고, 동정된 단백질 스폿의 위치는 마스터 이미지로 나타난다.

스폿 1-10의 상대적 강도는 대조군 그룹에서보다 천식환자 그룹에서 현저하게 더욱 높다. 대조적으로 11-20 스폿의 상대적 강도는 대조군 그룹에서보다 천식환자그룹에서 현저하게 낮다. 이러한 스폿들은 젤로부터 분리되어 단백질을 분해하기 위하여 트립신과 함께 배양되고 LC-MS/MS 및 MALDI-TOF/TOF로 동정되었다.

[실시예 2]

1. 천식환자의 BAL액 내 비타민 D 결합단백질(DBP)의 ELISA

상기 단백질 중 DBP를 선택하여 27명의 정상인 대조군 및 69명의 기관지 천식환자에 대하여 BAL 액 내의 비타민 D결합 단백질(DBP)의 총량을 측정하기 위하여 샌드위치 ELISA 키트(Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany) 를 이용하였다. 검출 한계는 2.2-60 ng/ml였다. 상기 검출한계 미만의 수치는 통계 분석에서는 0 ug/ml으로 간주되었다.

2. 결과

상기 결과는 도 2에 나타나 있다. 우선 BAL액(각 래인마다 20μg 이 단백질)의 웨스턴 블럿 분석으로 정상인 대조군과 비교하여 천식환자에서 DBP를 나타내는 58kDa 의 단백질 밴드가 현저하게 증가하였다는 것을 확인하였다(도 2a). ELISA를 이용하여 측정된 비타민 D 결합단백질의 양은 도 2b에 나타난 바와 같이, 정상인 대조군과 비교하여 천식환자에서 2.8배 높게 나타났다.(p=0.018). 또한 인간 BAL세포 내에서의 DBP 발현을 알아보기 위하여 DBP에 대한 항체를 이용하여 3명의 기관지 천식환자로부터의 BAL 내 림프구를 염색하는 면역세포화학(immunocytochemistry, ICC)실험을 하였다. 그 결과 도 2c에 나타난 바와 같이, DBP를 발현하는 BAL 내 림프구(cytospins, 화살표 부분)의 비율은 대부분 단핵구 및 마크로파지였다.

[실시예 3]

1. OVA-유도된 알레르기성 천식 모델

생후 6주된 수컷 BALB/c (Charles River Technology) 쥐를 무균상태로 보관하였다. 그들은 12시간 빛을 쬐면서 20-50% 습도, 22℃에서 보관되었다. 음식 및 물은 임의로 주었다. OVA 공격된 쥐들은 1일째 및 14일째에 20mg의 알루미늄 하이드록사이드(Sigma)에 유화된 100μg의 OVA(Sigma) (총 부피 200μl)가 복강 내 주 사됨으로써 민감화되었다. 최초 민감화 이후 15, 16 및 17일째 상기 쥐들은 엔도톡신이 없는 10% 글리세롤 PBS 0.1ml 내에 용해된 1.5mg OVA가 비강내 흡입됨으로써 공격받았다. 항-DBP 처리의 경우에는, 쥐들은 비강 경로를 통한 OVA 공격 전에 15분동안 엔도톡신이 없는 10% 글리세롤 PBS 0.1ml 내에 있는 다양한 양의 항-DBP(Santacruz, CA, USA)를 투여받았다. 마지막 공격 이후 1일째, 기도 저항성이 원챔버 혈량 측정기(plethysmography) (ALL Medicus, Korea) 에 의하여 측정되었고, PBS 공격 이후의 Penh 수치와 비교하여 메타콜린의 각 농도에 대한 증가 정도로 표현되었다. Penh 수치는 분당 호흡빈도로 표시되는 호흡계저항(Rrs) 수치이다. 상기 마지막 공격 이후 2일째, 쥐들은 펜토바르비탈 소디움(100 mg/kg)이 복강내 주사됨으로써 희생되었고, 기관지폐포 세척이 1ml의 인산 완충 생리식염수의 4회 주입으로 수행되었다. 헤모사이토미터를 이용하여 세포 개수가 측정되었고 세포-원심분리 및 Diff-Quick 염색(Scientific Products)에 의하여 준비된 슬라이드 상에서 차등 세포 계수가 수행되었다. BAL 바로 직후, 기관 및 오른쪽 상부폐는 4% 파라포름알데하이드 함유 PBS로 고정되고 형태연구를 위하여 파라핀에 묻었다. 왼쪽 폐는 RNA 추출을 위하여 사용되었고 오른쪽 하부폐는 웨스턴 블럿을 위하여 처리되었다. BAL 액 내 에오택신(eotaxin), IL-4, IL-5, IL-6, IL-10(BD Biosciences), IL-13 및 TGF-β (R&D System)는 정량 샌드위치 효소-결합 면역분석법으로 측정되었다. 검출의 하한은 대략 15.6 pg/ml이었다. 이 한계 미만의 수치는 통계분석에 대하여 0으로 간주되었다.

2. 반정량 RT-PCR

총 RNA를 OVA 공격/민감화된 폐로부터 Trizol 반응제(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 분리하였다. 샘플로부터 게놈 DNA를 제거하기 위하여 DNase I (Qiagen) 처리를 포함시켰다. cDNA 는 Superscript II 키트 (Invitrogen)를 사용하여 준비하였고, PCR에 의하여 유전자발현 분석을 위한 주형(template)으로 사용되었다. 상기 RNA는 50분동안 42℃에서 10mMdNTP, 0.1MDTT, 1 ul 올리고(dT) (500 ug/ml) 및 1 ul SuperScript II (200 U/ul; Life Technologies, Grand Island, NY) 와 함께 배양됨으로써 역전사되었다. 그리고 15분동안 70℃에서 열로 불활성화되었다. 역전사 후 상기 cDNA 는 쥐의 DBP 및 GAPDH 유전자에 대한 프라이머 쌍을 포함하는 튜브에 옮겨졌다. 하우스키핑 유전자인 GAPDH 유전자는 RNA 변동을 조절하기 위하여 사용되었다. 프라이머 및 프로브는 상기 DBP 및 GAPDH 유전자에 대하여 GeneFisher프로그램을 이용하여 디자인되었다. 하기 프라이머 서열(5'→3')이 사용되었다: 글리세랄데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나제(GAPDH): CGTCT TCACC ACCAT GGAGA (정방향, 서열번호 3), CGGCC ATCAC GCCAC AGTTT (역방향, 서열번호 4); 비타민 D 결합 단백질(DBP) : ACCTGCTACGACACCAGGA (정방향, 서열번호 5), TGGAGAACGTTCTGCCACTA (역방향, 서열번호 6). PCR은 GeneAmp PCR 시스템 9600 (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA) 에서 수행되었는데, 초기 변성단계는 94℃에서 5분, 그 후 94℃에서 1분, 53℃에서 1분, 72℃에서 1분을 35 사이클 수행하고, 72℃에서 10분동안 최종 신장을 수행하였다. 유전자 발현은 대조군 및 OVA 민감화/공격된 쥐의 6개의 독립적인 페 조직에서 측정되었다. 상기 증폭된 PCR 결과물은 100bp DNA마커(Bioneer Co., Daejon, Korea)와 함께 1% 아가로오스 젤에서 전기영동되었고 에티디움 브로마이드 염색으로 시각화되었다. PCR 결과물의 서열분석은 PCR Amplicon 시퀀싱을 이용하여 수행되었다. 상기 DBP유전자의 PCR 결과물은 PCR 프라이머와 혼합되어 ABI BigDye 터미네이터 사이클 시퀀싱 키트(Applied Biosystems, Foster City, CA) 및 ABI PRISM 3700 DNA 분석기(Applied Biosystems)를 이용하여 서열분석되었다. 밝혀진 서열을 NIH의 BLAST 탐색프로그램을 이용하여 다른 유전자의 서열과 비교하였다.

3. DBP 발현의 웨스턴-블럿 분석

OVA 및 항-DBP로 처리된 천식 쥐와 대조군 쥐의 기관지 폐포 세척 액을 획득한 후 웨스턴 블럿 분석이 수행되었다. 단백질은 15% SDS-PAGE에 의하여 단편화되었고, 니트로셀룰로오스 막(Amersham Pharmacia Biotech, Inc.)으로 전달되었다. 상기 막은 5% 탈지 우유 함유 트리스 완충 식염수(TBS)로 오버나이트 블로킹되었고, 상온에서 2시간동안 폴리클로날 염소 항-DBP 항체(1:200 희석)와 함께 배양되었다. 결합되지 않은 1차 항체는 0.01%(v/v) Nonidet P-40 함유 PBS로 3회의 10분간 세척함으로써 제거되었다. 상기 막은 그 후 퍼옥시다제 결합된 항-쥐 IgG(Santacruz, CA, USA, 2차항체) 와 함께 2시간동안 배양되었다. DBP에 대하여 향상된 화학발광 검출(Enhanced chemiluminescence, ECL)이 수행되었다(Boehringer Mannheim, Germany).

4. 기도 내 염증에 대한 형태 분석 및 면역조직화학

상기 표본을 탈수하고 파라핀에 묻었다. 조직검사를 위하여 상기 조직 중 4마이크론 크기의 부분을 파라핀제거하였다. 상기 조직은 대비염색으로서 헤마톡실린 및 에오신(H & E)염색되었다. 기관지주변 염증의 심각성은 반정량적으로 다음과 같이 등급매겨졌다. 0은 정상; 1은 염증성 세포가 거의 없음; 2는 세포 한 층 깊이로 염증성 세포가 고리를 형성; 3은 세포 4 층 이상의 깊이로 염증성 세포가 고리를 형성.

PAS 양성 상피세포 및 총 상피세포는 250μm 기저 막 위 예정된 4군데 각각(12, 3, 6, 9시 방향, 12시방향은 막 부분이다)에서 프로그램 (Nikon DXM 1200, Nikon Inc. N.Y. USA & Image Pro Plus 4.01 software, Media Cybernetics, Maryland, USA)을 사용하여 계수되었다.

DBP 의 면역조직화학염색을 위한 슬라이드 위의 기관 및 폐는 원래의 퍼옥시다제를 억제하기 위하여 20분동안 0.3% H₂O₂ 로 처리되었다. 그리고 쥐의 항-DBP 폴리클로날 항체(1:50 희석; Santacruz, CA, USA)와 함께 4℃에서 밤새도록 배양되었다. 상기 슬라이드가 ABC 키트 (아비딘-비오틴 퍼옥시다제 복합체 키트, Vector Laboratories, CA, USA)와 배양된 후에 3,3'-디아미노벤지딘 테트라클로라이드(Zymed Laboratory Inc, San Francisco, CA, USA)로 발색시켰다.

5. 결과

Ova 민감화는 생리식염수 흡입(대조군)에 비하여 분무된 메타콜린을 흡입한 후의 기도 과민반응성에 있어서 유효한 향상을 일으켰다. OVA 공격 후, 에오시노필, 마크로파지 및 뉴트로필과 같은 염증성 세포 및 BAL 액 내의 림프구의 수는 현저하게 증가되었다. 조직 검사를 폐 조직에 수행할 때, OVA 공격은 염증성 세포들을 기도 주변의 기관지 주변 조직 및 폐 혈관으로 침투하도록 유도하였고, 상피세포를 포함하는 많은 점액이 명백하게 나타났다.

도 3은 OVA 유도된 천식 모델에서의 DBP발현 증가를 나타낸 것으로서, DBP의 mRNA (도 3a)및 단백질 (도 3b)발현 수준도 대조군 쥐와 비교하여 OVA 민감화/공격된 쥐의 폐 조직 호모제네이트에서 증가하였다는 것을 알 수 있다.

또한 면역조직화학염색을 이용한 폐 내 기관지에서의 DBP단백질의 발현 조사도 수행되었다. 상기 면역조직화학적 염색에서, 도 3c에 의하면, DBP는 대조군 쥐와 비교하여 OVA 민감화/공격된 쥐의 마크로파지 및 기관지상피세포 및 세기관지 상피세포에서 뚜렷하게 증가하였고, 쥐 BAL 세포내 DBP 발현의 면역세포화학(ICC) 염색 결과를 나타낸 도 3d에 의하면, 대조군 쥐와 비교하여 OVA 민감화/공격된 쥐의 BAL 세포 마크로파지 내 DBP 도 역시 증가하였다.

[실시예 4]

1. DBP 항체 처리로 인한 기도 과민반응성의 감소

비강 경로를 통한 항-DBP 투여가 기관지 천식의 발생을 생체 내에서도 억제할 수 있는지에 대하여 조사하기 위하여, 대조군 항체(Goat IgG, Zymed), 및 항- DBP 항체(Santa-Cruz) 가 OVA 민감화/공격된 쥐에 비강 내 투여되었다.

2. 결과

1.5, 8, 40 fmol의 항-DBP 항체를 비강내 처리한 경우에 도 4a에 나타난 바와 같이 메타콜린에 대한 기도 과민반응성(AHR)이 감소되었다. 항체 분무 후 호흡 지표가 3분 동안 읽혀졌으며 향상된 정지 수치(enhanced pause value)가 결정되었다. 24시간 째, OVA 공격은 항원-민감화된 쥐에서 메타콜린에 대한 반응을 유효하게 증가시켰고, 이러한 반응은 항-DBP 항체에 의하여 투여량에 의존하여 억제되었다. 도 4b는 항-DBP 항체 처리 후 기도에서 염증성 세포(에오시노필, 뉴트로필, 및 림프구)의 축적이 억제된 것을 나타내는데, 항-DBP 항체를 40 fmol 비강내 처리하면 OVA 공격으로 야기된 BAL 에오시노필리아가 최종 공격 이후 24시간 후에 7.19 ± 0.62 x 10⁴/ml에서 1.52 ± 0.54 x 10⁴/ml로 억제된다.(평균±표준오차(8명), p < 0.005). 그러나, 대조군 항체 300ng/kg는 BAL액 내 에오시노필 및 림프구의 증가에 아무런 영향도 없다.

도 4c는 폐조직 조직검사를 수행한 결과를 나타내는데(스케일 바는 100 μm), OVA 공격은 기도 주변 기관지 주변조직 및 폐 혈관안으로 염증성 세포의 침투를 유도하였다. 그리고 상피세포를 포함하는 많은 점액이 명백하게 나타났다(도 4c의 OVA참고). 항-DBP 항체 1.5, 8 및 40 fmol 처리는 기관주변 조직으로의 염증성 세포의 침투를 억제하였고, 잔모양세포가 기관지 기도 주변에서 거의 검출되지 않았다(도 4C OVA+DBP Ab 참고). 도 4d 및 도 4e에 의하면, H&E-염색된 이미지로부터의 '염증 지표'의 반정량적 수치(도 4d), 및 상피세포 내 PAS-양성 잔모양 세포의 백분율(도 4e) 은 항-DBP 항체로 미리 처리된 OVA 공격 쥐에서 현저하게 감소되었다.

OVA 에 의하여 유도된 염증성 사이토카인의 분비에 있어서 항-DBP 항체의 억제 효과를 조사하기 위하여, OVA 공격된 쥐의 BAL 액 내 에오택신, Th2 사이토카인(예를 들어 IL-4, IL-5, IL-13) 및 Th1 사이토카인(IFN-γ, TGF-β) 농도를 측정하였다. OVA 공격은 모든 사이토카인 분비를 유효하게 증가시켰지만, OVA 공격 쥐를 1.5, 8 및 40 fmol 의 항 DBP 항체로 미리 처리한 것은 에오택신 및 IL-4, IL-5 및 IL-13와 같은 Th2 타입 사이토카인 생산이 IFN-γ 와 함께 현저하게 억제되었다(p < 0.05, 도 4f). 그러나 TGF-β 및 혈청 IgE의 농도는 억제되지 못했다. 전체적으로, 상기 결과는 비강을 통한 기도로 항-DBP 항체를 투여시키면 염증성 세포 및 림프구의 침투를 효과적으로 억제시킬 수 있고, OVA -유도된 알레르기성 천식 동물 모델에서 생체 내 Th2 타입 사이토카인의 생산 및 기도 과민반응성을 효과적으로 억제할 수 있다는 것을 나타낸다.

[실시예 5]

1. DBP 에 의한 민감화

기도에서 알레르기성 염증에 대한 DBP 의 역할을 밝혀내기 위하여, 생후 6주된 수컷 BALB/c (Charles River Technology) 쥐를 다양한 양의 DBP용액(0.05, 0.5, 5 ng/ml, 20 μl)으로 실험 1, 2 및 3일 째 날에 비강 주입을 통하여 공격하였다. 대조군 쥐는 PBS로 민감화되었다. 쥐는 메타콜린 에어로졸에 1분간 노출되었고, 기도 수축은 다음 5분 동안 측정되었다. 결과는 시간당 8마리의 쥐에 대한 Penh의 평균±표준오차로 나타내었다(p < 0.05). 재채기 및 코긁는 행동의 회수는 공격 후 10분동안 계수되었다. BALF 내 염증성 세포의 개수는 최종 공격 이후 24시간 이후에 결정되고, 데이터는 평균±표준오차(8명)로 표시되었다. 공격 48시간 이후, 상기 동물을 깊이 마취하고 표본을 획득하였다. 도 5a는 상기 프로토콜의 모식도이다.

2. 결과

DBP 처리는 투여량에 의존하여 기도 과민반응성을 증가시켰다. 도 5b에는 기관지 수축 정도를 측정한 결과이다. 또한 그것은 기도에서 국부적 염증을 유도하였으며, 염증성 세포의 침투를 현저하게 유도하고(도 5c, p < 0.05), IL-4의 분비를 투여량에 의존하여 유도하였다(도 5d, p < 0.05). 에오택신 및 IFN-γ의 유효한 증가는 많은 투여량(5ng) 처리 샘플에서만 관찰되었다(도 5d * p < 0.05). 실험대상 쥐의 BAL 내 IL-5 의 농도는 검출한계에 가깝거나 그 미만이었다.

DBP 처리 쥐의 폐에서의 조직학적 발견은 OVA 유도 천식 환자에서 관찰된 것과 매우 유사하였다. 도 5e에 의하면 DBP 처리 쥐의 폐에서도 염증성 세포의 증가 및 잔모양 세포의 과생성이 발견되었다. H&E-염색된 이미지로부터의 '염증 지표'의 반정량적 수치(도 5f), 및 상피세포 내 PAS-양성 잔모양 세포의 백분율(도 5g)은 DBP로 처리된 쥐에서 현저하게 증가되었다.

비록 본 발명이 상기 언급된 바람직한 실시예와 관련하여 설명되었지만, 본 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 따라서 첨부된 특허청구의 범위는 본 발명의 요지에서 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함할 것이다.

도 1은 천식 환자 BALF 내 차등 발현된 단백질 스폿의 강도를 비교한 그래프이다(기관지 천식 환자(BA) 및 정상인 대조군(NC)).

도 2a-c는 인간 BALF 내 DBP농도의 면역학적 조사의 결과로서, 2a는 기관지 천식 환자(BA) 및 정상인 대조군(NC) 으로부터의 기관지폐포 세척액(BALF) 내 DBP의 웨스턴블럿 분석결과, 2b는 ELISA를 이용한 기관지 천식 환자(BA, 색칠된 막대, 69명) 및 정상인 대조군(NC, 색칠되지 않은 마개, 27명) 으로부터의 BALF 내 DBP농도, 2c는 BAL세포 내에서의 DBP 발현을 면역세포화학(immunocytochemistry, ICC) 방법으로 염색한 결과를 나타낸다.

도 3a-d는 OVA 유도된 천식 모델에서의 DBP발현 증가를 나타내는 것으로서, 3a는 차등 발현된 DBP의 mRNA 발현을 RT-PCR 분석한 결과, 3b는 쥐의 BALF에서 DBP를 웨스턴 블럿 검출한 결과, 3c는 OVA 처리 쥐 및 대조군 쥐의 폐 조직 내에서의 DBP 발현에 대한 면역조직화학염색 결과(스케일바= 100μm), 3d는 쥐 BAL 세포 내 DBP 발현에 대한 면역세포화학(ICC)염색 결과를 나타낸다.

도 4a-f는 DBP 항체 처리로 OVA-유도된 천식이 억제된 결과를 나타내는데, 4a는 DBP 항체 처리로 OVA-유도된 기도 과민반응성(AHR)이 억제된 것, 4b는 BALF 내 백혈구 축적이 억제된 것, 4c는 폐조직 조직검사 결과 OVA 처리 쥐에서 기도 염증이 억제된 것, 4d는 기관지 주변 염증의 심각성에 대한 반정량적 분석결과, 4e는 상피세포 내 PAS-양성 세포의 백분율, 4f는 BALF 내 사이토카인 생산이 억제된 것을 나타낸다.

도 5a-g는 DBP로 유도된 기도 과민반응성을 나타내는데, 5a는 상기 적용된 DBP 프로토콜의 모식적인 그림이고, 5b는 공격 이후 기관지 수축의 정도를 측정된 것을 나타내며, 5c는 DBP 공격 이후 BALF 내 백혈구 축적이 증가된 것, 5d는 BALF 내 사이토카인 생산이 증가된 것, 5e는 폐조직 조직검사 결과 DBP를 처리한 쥐에서 기도 염증이 관찰되는 것, 5f는 기관지 주변 염증의 심각성에 대한 반정량적 분석결과, 5g는 상피세포 내 PAS-양성 세포의 백분율을 나타낸다.

<110> Soonchunhyang University Industry Academy Cooperation Foundation <120> Biomarker for diagnosing asthma and therapeutic agent of asthma controlling expression of vitamin D binding protein <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1801 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tttaataata attctgtgtt gcttctgaga ttaataattg attaattcat agtcaggaat 60 ctttgtaaaa aggaaaccaa ttacttttgg ctaccacttt tacatggtca cctacaggag 120 agaggaggtg ctgcaagact ctctggtaga aaaatgaaga gggtcctggt actactgctt 180 gctgtggcat ttggacatgc tttagagaga ggccgggatt atgaaaagaa taaagtctgc 240 aaggaattct cccatctggg aaaggaggac ttcacatctc tgtcactagt cctgtacagt 300 agaaaatttc ccagtggcac gtttgaacag gtcagccaac ttgtgaagga agttgtctcc 360 ttgaccgaag cctgctgtgc ggaaggggct gaccctgact gctatgacac caggacctca 420 gcactgtctg ccaagtcctg tgaaagtaat tctccattcc ccgttcaccc aggcactgct 480 gagtgctgca ccaaagaggg cctggaacga aagctctgca tggctgctct gaaacaccag 540 ccacaggaat tccctaccta cgtggaaccc acaaatgatg aaatctgtga ggcgttcagg 600 aaagatccaa aggaatatgc 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acctgctacg acaccagga 19 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tggagaacgt tctgccacta 20

Claims (6)

1. 삭제
2. 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 가지는 단백질에 대한 항체를 유효성분으로 하는 천식 치료제.
3. 서열번호 1에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가지고, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 가지는 단백질의 생산을 저해하는 안티센스 뉴클레오티드를 유효성분으로 하는 천식 치료제.
4. 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 가지는 단백질에 시험 물질을 결합시키는 단계; 및

   상기 시험 물질이 상기 단백질의 작용을 억제하는지를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 천식 억제제 스크리닝 방법.
5. 시험 물질에 대하여 천식 억제 여부를 스크리닝하는 방법으로서,

   상기 시험 물질이 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 가지는 단백질의 발현을 억제하는지를 확인하는 단계를 포함하는 천식 억제제 스크리닝 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 발현 억제 여부 확인은 ELISA 또는 웨스턴블럿(immuno blot) 방법으로 수행되는 천식 억제제 스크리닝 방법.

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