KR101997142B1 - 넥틴-4를 포함하는 천식 진단용 바이오마커 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 넥틴-4 (nectin-4)의 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 천식 진단용 조성물, 및 상기 조성물을 포함하는, 천식 진단용 키트, 상기 천식 진단을 위한 정보의 제공 방법, 천식치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은, 천식 진단용 조성물을 제공함으로서, 천식환자에게서 발현이 변화하는 단백질 또는 그 유전자의 발현 수준을 측정 및 비교함으로서, 천식의 조기진단 및 질병 정도를 유의적으로 예측 또는 파악할 수 있다.
아울러, 본 발명의 천식 진단용 조성물은 비침습성 진단을 가능하게 하여 혈액, 뇨 검사 등으로 간단하고 유효성 있는, 천식의 초기 진단방법이다.

Description

넥틴-4를 포함하는 천식 진단용 바이오마커 및 이의 용도{A biomarker for diagnosing asthma comprising nectin-4 and the uses thereof}

본 발명은 천식 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는, 천식 진단용 키트, 상기 천식 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.

천식(asthma)은 만성 기도 염증 및 기도과민성을 특징으로 하는 폐질환으로, 대기오염물질, 황사, 알러젠(allergen) 등에 의하여 발생한다. 특히, 천식은 호흡곤란을 야기하는 염증성 호흡기 질환으로 우리나라 인구 중 약 300만명이 천식을 앓고 있다. 천식은 색색거리는 천명, 호흡곤란, 재채기, 심한 경우 산소부족으로 인한 청색증 및 흉통을 나타내는 질환으로 최근 들어 대기오염 및 각종 화학물질에 대한 노출과 식생활의 서구화로 인하여 급격히 증가하고 있으며, 특히 소아에서 발병률이 증가하고 있고 식습관의 변화 및 서구화에 따라 증가하고 있는 추세이다. 그러나 천식 환자들에서는 질병의 원인 및 발병기전이 명확하게 밝혀지지 않은 상태이다. 이러한 발병 기전 중에 Th2(T helper type 2) 타입의 면역반응이 항진되어 이에 따라 인터루킨(interluekin)-4, 5, 13 등의 분비가 증가되게 되며(Liu et al., 2006; Williams et al., 2012), 이러한 반응과 연계하여 호산구를 비롯한 많은 염증세포들이 폐조직 내로 이동 및 침윤하게 된다(Zhou et al., 2011). 또한 염증세포들은 다양한 전염증인자 및 화학주성인자들을 방출하여, 염증반응을 더욱 악화시키며, 기도 내 배상세포의 점액분비를 증가시키고, 기도 과민성을 야기하게 된다(Chibana et al., 2008). 이러한 일련의 반응으로 인하여 천식환자들은 호흡곤란, 청색증 및 흉통 등의 임상증상을 나타내게 된다.

현재, 천식의 치료에 사용되고 있는 약물은 스테로이드제제, 기관지 확장제 및 항생제가 주로 사용되고 있다. 스테로이드제제와 항생제의 경우 면역반응 및 염증반응 억제를 통하여 천식치료에 사용되고 있으며, 기관지 확장제의 경우 호흡곤란 등의 임상증상이 발현 시에 이를 상쇄시키고자 사용되고 있다. 현재 가장 광범위하게 사용되고 있는 흡입형 코르티코스테로이드(corticosteroid) 제제는 뛰어난 치료 효과를 나타내지만 장기적으로 사용할 경우 용량과 사용시간에 비례하여 부신 억제, 골밀도 감소, 성장 장애, 눈과 피부의 합병증, 콜라겐의 합성 증가 등을 유발하는 것으로 알려져 있다. 또한, 살메테롤(salmeterol)과 포르메테롤(formeterol)과 같은 지속성 베타-2 길항제(beta-2 agonist)는 천식 발작에 대해 예방 효과를 나타내지만 경우에 따라서는 환자를 사망케 할 수도 있다고 경고된 바 있다. 그리고 장기 사용시 부작용이 발견되어 천식치료제로서 사용이 제한적이다.

현재까지 개발된 천식 치료제는 여러 가지 부작용들을 가지고 있는 바, 천식을 조기에 발견하여 치료하는 것이 무엇보다 중요하다. 이에, 천식을 조기에 진단할 수 있는 바이오마커의 발굴이 시급한 실정이다.

대한민국 공개특허 제10-2012-0104690호

본 발명의 하나의 목적은, 넥틴-4 (nectin-4)의 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 천식 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는, 천식 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 천식 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 천식치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서, 넥틴-4 (nectin-4)의 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 천식 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 상기 천식 진단용 조성물은 넥틴-4 (nectin-4)의 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 천식 진단용 조성물일 수 있다.

본 발명에서 용어, “천식”은 기관, 기관지, 세기관지, 그리고 폐포로 이어지는 기도의 염증반응과 이로 인한 기도조직의 손상 및 변화를 특징으로 하는 여러 가지 질환들을 통칭하는 포괄적인 질환명이다(Wardlaw A 등, Clin Exp Allergy 2005;35:1254-62). 구체적으로, 천식은 폐 속에 있는 기관지가 아주 예민해진 상태로, 때때로 기관지가 좁아져서 숨이 차고 가랑가랑하는 숨소리가 들리면서 기침을 심하게 하는 증상을 나타내는 질환으로, 기관지의 알레르기 염증 반응 때문에 발생하는 알레르기 질환이다. 천식의 대표적인 증상은 호흡곤란, 기침, 천명(쌕쌕거리는 거친 숨소리) 등이며, 좁아진 기관지를 짧은 시간 내에 완화시키는 증상 완화제(기관지 확장제) 또는 기관지의 알레르기 염증을 억제하여 천식발작을 예방하는 질병 조절제(항염증제, 류코트리엔 조절제) 등이 대표적인 치료제로 사용된다. 본 발명에서 상기 천식은 기관지성 천식, 알러지성 천식, 아토피형 천식, 비아토피형 천식, 운동유발 천식, 아스피린 천식, 심인성 천식 또는 폐포성 천식일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용된 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 천식발병 여부를 확인하는 것으로서, 천식발병 여부를 조기에 확인 할 수 있다.

본 발명에서 상기 넥틴 (nectin)은 F-액틴 결합 단백질인 아파딘(afadin)을 통해 액틴 세포 골격과 연결되고, 최근에 세포간 유착의 형성에 상당한 기여를 하는 것으로 확인되었고, 세포 분극, 분화, 운동, 증식 및 생존을 포함한 세포 활성에 대한 새로운 조절물질로 보고되었다 (Takahashi K, et al., 1999; Takai et al., 2008; Ogita et al., 2010). 특히, 넥틴-4는 인간 폐 선암종 세포에서 Rac1 신호 전달 경로를 통해 세포 성장, 혈관 신생, 나쁜 예후 및 종양의 증식에 기여한다고 보고되었다 (Takano A, et al.,2009; Nishiwada S, et al., 2015). 본 발명에서 넥틴-4 (nectin-4)와 천식과의 관련성에 대하여 최초로 규명하였다.

본 발명의 일 실시예에서, 대조군에 비해, OVA으로 감작한 마우스에서 기도과민성(AHR, airway hyperresponsiveness)이 증가되었고, 기관지 폐포세척액(Bronchoalveolar lavage fluid, BALF)에서 염증 세포의 수가 증가된 것을 확인하였으며, 넥틴-4와 afadin(아파딘) 그리고 아파딘의 다운스트림 단백질인 src, rac1, JNK(c-Jun N-terminal kinase)의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 또한, OVA로 감작한 마우스의 폐 조직의 단핵 염증 세포와 내피 세포, 및 상피 세포에서 넥틴-4, 아파딘의 면역 조직 화학 염색이 증가되는 것을 관찰하였으며, 천식 환자의 혈장에서 넥틴-4의 수준이 대조군에 비해 증가하는 것을 확인하였는바, 상기 넥틴-4 단백질이 천식을 조기에 진단할 수 있는 마커로 활용할 수 있음을 확인하였다.

따라서, 대조군에 비해 OVA으로 감작한 마우스에서 넥틴-4 뿐만 아니라, afadin(아파딘)과 아파딘의 다운스트림 단백질인 src, rac1, JNK(c-Jun N-terminal kinase)의 발현이 증가하는 것을 확인하였는 바, 넥틴-4 뿐만 아니라, 아파딘(afadin), Src, Rac1, 또는 JNK(c-Jun N-terminal kinase)의 단백질을 마커로 활용하여 천식을 조기 진단할 수 있다.

본 발명에서 용어 "마커(marker)"란 정상군 개체와 천식을 가진 개체를 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 본 발명의 천식을 가지는 개체에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산, 유전자, 지질, 당지질, 당단백질 또는 당 등과 같은 유기 생체 분자들을 모두 포함한다. 특히 본 발명에서는 본 발명의 천식을 가지는 개체에서 변화되는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 사용된 용어 "mRNA 수준 측정"이란 천식을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 천식 진단용 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 프라이머 쌍 또는 프로브이며, 상기 유전자들의 핵산 정보가 GeneBank 등에 알려져 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.

상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

바람직하게 천식 진단을 위하여, 상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 넥틴-4 (nectin-4)의 단백질의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "프라이머 쌍"은 표적 유전자 서열을 인지하는 정방향 및 역방향의 프라이머로 이루어진 모든 조합의 프라이머쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성을 부여할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브 분자의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA (peptide nucleic acid), LNA (locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체외에서 제조된 것을 포함하는 것으로 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체로서, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열은 상기 유전자들의 mRNA에 상보적이고 상기 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미한다. 이는 상기 유전자 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이는 6 내지 100 염기, 바람직하게는 8 내지 60 염기, 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기일 수 있다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 통상의 방법으로 시험관 내에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드를 합성하는 한가지 예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 다중클로닝부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 상기 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명에 사용된 용어 "단백질 수준 측정"이란 천식 진단을 위하여 생물학적 시료에서 천식 진단용 마커 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정이다. 상기 마커 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있으며, 바람직하게는 항체를 이용하지 않고 단백질 발현 수준 자체를 측정한다.

상기 단백질 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학(immunohistochemistry) 분석, 면역세포화학(immunocytochemistry) 분석, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

천식 진단을 위하여 바람직하게 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 넥틴-4 (nectin-4)의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함할 수 있다.

본 발명에 사용된 용어 "항체"는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 상기 넥틴-4 (nectin-4), 아파딘(afadin), Src, Rac1, 또는 JNK(c-Jun N-terminal kinase)의 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.

또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

본 발명은 다른 양태로서, 상기 천식 진단용 조성물을 포함하는, 천식 진단용 키트를 제공한다.

바람직하게, 상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트 또는 래피드(rapid) 키트 일 수 있다.

또한, 바람직하게, 상기 천식 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.

바람직하게, 상기 진단용 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. RT-PCR (역전사 중합효소반응) 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 상기 각 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

바람직하게 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

또한 바람직하게는, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

또한, 바람직하게는, 5분내 분석결과를 알 수 있는 신속한 테스트를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 래피드(rapid) 키트 일 수 있다. 래피드 키트는 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 래피드 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 래피드 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 특이항체와 2차 항체가 고정된 나이트로 셀룰로오스 멤브레인, 항체가 결합된 비드에 결합된 멤브레인, 흡수패드와 샘플 패드 등 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

본 발명은 다른 양태로서, 천식 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.

바람직하게, 본 발명의 방법은 생물학적 시료로부터 넥틴-4 (nectin-4)의 단백질 또는 이의 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및

상기 단계에서 측정된 단백질의 발현 수준 또는 유전자의 발현 수준을 정상 대조구 시료와 비교하는 단계를 포함하는, 천식 진단을 위한 정보의 제공 방법일 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "생물학적 시료"란 천식발병에 의해 유전자 발현 수준 또는 단백질 발현 수준이 차이가 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

상기 넥틴-4 (nectin-4)은 모두 정상 대조군과 비교하여, 천식이 있는 개체에서 유전자 발현 수준 또는 해당 단백질의 발현 수준이 변화하는 특징을 가지므로, 상기 수준이 변화하면 천식으로 진단할 수 있다.

또한, 천식 의심 개체의 분리된 시료의 상기 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준이 정상 대조군 시료의 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준보다 높을 경우, 천식으로 판단할 수 있다.

또한, 상기 아파딘(afadin), Src, Rac1 또는 JNK(c-Jun N-terminal kinase)의 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA의 수준을 추가로 측정할 수 있으며, 천식 의심 개체의 분리된 시료의 상기 아파딘(afadin), Src, Rac1 또는 JNK(c-Jun N-terminal kinase) 단백질의 발현 수준 또는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군 시료의 단백질의 발현 수준 또는 유전자의 발현 수준보다 높을 경우 천식으로 진단할 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 상기 유전자의 발현 수준은 mRNA 발현 수준을 측정하거나 비교할 수 있다.

상기 mRNA 발현 수준 측정 또는 비교는 역전사 중합효소반응, 경쟁적 역전사 중합효소반응, 실시간 역전사 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩 등을 사용할 수 있으나, 본 발명은 이들에 제한되는 것이 아니다. 상기 측정 방법들을 통하여 정상 대조군에서의 mRNA 발현량과 천식환자의 mRNA 발현량을 확인할 수 있고, 이들 발현량 정도를 비교함으로써 천식발병 여부를 진단 또는 예측할 수 있다.

바람직하게 본 발명의 상기 단백질 발현 수준은 해당 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 측정 및 비교할 수 있다. 상기 항체와 생물학적 시료 내의 해당 단백질이 항원-항체 복합체를 형성하도록 하고, 이를 검출하는 방법을 이용한다.

본 발명에서 사용된 용어 "항원-항체 복합체"는 생물학적 시료 중의 해당 단백질 항원과 이를 인지하는 항체의 결합물을 의미한다. 상기 항원-항체 복합체의 검출은 당업계에 공지된 바와 같은 방법, 예를 들어 분광학적, 광화학적, 생물화학적, 면역화학적, 전기적, 흡광적, 화학적 및 기타 방법을 이용하여 검출할 수 있다.

본 발명의 목적상, 상기 단백질 발현 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학(immunohistochemistry) 분석, 면역세포화학(immunocytochemistry) 분석, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LCMS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에서는, 넥틴-4 (nectin-4)의 단백질 발현 수준 자체를 측정 및 비교하기 위해서, 면역조직화학(immunohistochemistry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay)을 사용하였다.

본 발명은 다른 양태로서 천식치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 천식치료제의 스크리닝 방법은

분리된 세포, 분리된 조직 또는 인간을 제외한 동물에 천식 치료제 후보물질을 처리하는 단계;

상기 후보물질 처리군에서 넥틴-4 (nectin-4)의 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및

상기 측정된 넥틴-4 (nectin-4)의 단백질의 발현수준이 후보물질을 처리하지 않은 대조군보다 감소하면, 상기 후보물질을 천식치료제로 선택하는 단계를 포함한다.

본 발명의 용어, "천식치료제 후보물질"은 통상적인 선정방식에 따라 천식치료의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 기타 추출물 또는 천연물, 또는 화합물 등이 될 수 있다.

본 발명에서 발현 수준 측정은 넥틴-4 (nectin-4) 단백질의 발현수준을 측정하는 것일 수 있다.

본 발명의 용어 "대조군"이란 천식치료제 후보물질을 처리하지 않은 분리된 세포, 분리된 조직 또는 인간을 제외한 동물로 상기 후보물질을 처리한 군과 병렬 관계에 속하는 분리된 세포, 분리된 조직 또는 인간을 제외한 동물을 의미한다.

본 발명의 “천식치료제의 스크리닝 방법”은, 천식에 넥틴-4 (nectin-4)의 의 발현이 관련됨을 확인함으로써, 넥틴-4 (nectin-4)의 발현을 치료제 후보물질을 처리하지 않은 대조군 세포와 비교하는 방식으로 고안되었다. 천식을 예방 또는 치료할 수 있는 후보물질의 부재 하에 분리된 세포, 분리된 조직 또는 인간을 제외한 동물에서의 넥틴-4 (nectin-4)의 단백질의 수준을 측정하고, 또한, 상기 후보물질의 존재 하에서 넥틴-4 (nectin-4) 단백질의 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 상기 후보물질이 존재할 때의 넥틴-4 (nectin-4) 단백질의 수준이 상기 후보물질의 부존재 하에서의 수준보다 감소시키는 물질을 천식의 예방 또는 치료용 제제로 예측할 수 있다. 상기 분리된 세포로는 인체에서 분리된 primary 세포일 수 있으며, 기관지 상피세포주와 같은 확립된 세포주를 사용할 수도 있다.

또한, 아파딘(afadin), Src, Rac1, 또는 JNK(c-Jun N-terminal kinase)의 단백질의 발현 수준을 추가로 측정하고, 상기 측정된 아파딘(afadin), Src, Rac1 또는 JNK(c-Jun N-terminal kinase)의 단백질의 발현수준이 후보물질을 처리하지 않은 대조군보다 감소하면, 상기 후보물질을 천식치료제로 선택하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기에서 기술한 바와 같이, 본 발명은, 천식 진단용 조성물을 제공함으로서, 천식환자에게서 발현이 변화하는 단백질 또는 그 유전자의 발현 수준을 측정 및 비교함으로서, 천식의 조기진단 및 질병 정도를 유의적으로 예측 또는 파악할 수 있다.

아울러, 본 발명의 진단용 조성물은 비침습성 진단을 가능하게 하여 혈액, 뇨 검사 등으로 간단하고 유효성 있는, 천식의 초기 진단을 제공할 수 있다.

도 1A는 마우스에 OVA(오브알부민)으로 감작 유발하여 기도과민성을 유발한 마우스 실험디자인을 나타낸다. 도 1B는 OVA으로 감작한 마우스에서 유도된 기도과민성(AHR, airway hyperresponsiveness)을 나타낸다. 도 1C는 OVA로 감작된 마우스의 기관지 폐포세척액(Bronchoalveolar lavage fluid, BALF)에서 증가된 염증 세포의 수를 나타낸다. 도 1D는 OVA로 감작 및 유발 (OVA)된 마우스에서의 넥틴-4/아파딘의 단백질 발현을 웨스턴 블럿으로 나타낸 것이고, 이를 β-액틴으로 표준화한 것이다. 평균 ± SEM (n = 8 마우스/그룹). * p<0.05 OVA vs sham.
도 2는 면역조직화학 염색법에 의해 오브알부민으로 감작 유발된 마우스 폐 조직의 넥틴-4와 아파딘 발현을 분석한 것이다.
도 3은 대조군과 천식 환자의 혈장 넥틴-4 수치를 나타낸다. *p<0.05, 대조군 vs. 천식 환자. 본 연구에 사용된 생체표본과 데이터는 한국 바이오뱅크 네트워크 회원인 순천향대학교 부천 병원의 바이오뱅크에서 얻었다.
도 4는 혈장 넥틴-4와 상기 임상변수와의 상관관계를 나타낸다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

< 실시예 1> 천식 환자의 모집

생체 물질의 표본과 임상 자료는 한국 바이오뱅크 네트워크 회원인 순천향대학교 부천 병원의 바이오뱅크에서 얻었다. 모든 피험자는 다음 기준 중 하나 이상인 경우, 천식 (GINA) 지침에 따라 천식의 임상 진단을 받았다.

1) 14일간을 넘어서 20% 초과하는 매일의 최대 피크 호흡 흐름의 가변성

2) 알부테롤(albuterol) 200-400μg을 흡입한 후에 15% 초과의 FEV1 증가

3) 10mg/ml 미만의 흡입된 메타콜린(PC20 methacholine) 자극 농도에 반응한 FEV1에서의 20% 감소

모든 피험자는 완전한 혈액 세포 검사와 분화 카운트 (complete blood cell and differential counts), IgE 측정, 흉부 전후 방사선촬영, 알레르기 피부 단자 검사 및 폐활량 측정을 포함하는 표준화된 평가를 받았다. 모든 데이터는 진단 당시와 천식 약물을 투여하기 전에 수득하였다. 천식 환자는 연령과 BMI (Body mass index)에서 정상 대조군과 일치하였다. 정상 대조군 피험자는 호흡 증상과 기타 알레르기 질환에 대한 스크리닝 조사에서 부정적으로 응답하고, 예측 FEV1 값이 80% 이상이고, PC20 메타콜린이 10 mg/ml 이상이고, 흉부 방사선 사진에서 정상 소견을 갖는 일반인이나 피험자의 배우자로부터 모집하였다.

< 실시예 2> 동물 준비

암컷 생후 6주된 BALB/c 마우스에 0일과 14일에 10 mg 수산화 알루미늄에 유화된 50 μg V급 치킨 에그 오브알부민 OVA (Sigma-Aldrich, St Louis, MO)를 함유한 Dulbecco 인산완충식염수 100 ㎕를 복강내 주사하였다. 21일 내지 23일에, 모든 마우스에 150 ㎍ III급 OVA (Sigma-Aldrich)를 함유하는 50 ㎕ D-PBS를 비강내(intranasal) 투여(challenge)하였다. 대조군 마우스에는 식염수를 투여하였다. 24일에, 2.5 mg/kg 틸레타민(tiletamine)과 자일라진(xylazine) (Zoletil and lumpum; Bayer Korea Co., Seoul, Korea)으로 마우스를 마취하고, 0, 5, 20, 또는 100 mg/ml의 메타콜린 (Sigma-Aldrich)을 투여한 후, 기도과민증 (AHR)을 평가하였다. 다음 날에, 기관지폐포 세척액 (BALF)을 수거하여, 폐 조직을 단백질과 RNA로 가공하였으며, 헤마톡실린과 에오신으로 염색하고 (H&E), 공초점 사진 촬영하였다. BALF을 원심분리하고 상층액을 보관하고, 세포 펠렛은 세포수 측정을 위해 현탁하였고, 세포 감별 계산 (cell differential)을 위해 사이톱신 슬라이드 (cytospin slides) 를 제조하였다 (500 cells/mouse, Diff-Quick 염색). 폐의 일부를 4% 인산 완충 파라포름알데히드에 고정하고, 파라핀에 포매하고, 절편으로 분획하여 (4 μm), H&E 염색하였다.

< 실시예 3> 웨스턴 블럿

마우스 폐 조직을 증류수에 50 mM Tris-HCL (pH 7.4), 50 mM NaCl, 0.1% 도데실 황산 나트륨 (SDS), 1% Triton X-100, 0.5 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) 및 100 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드 (PMSF)를 포함하는 단백질 용해 용액에서 균질화하고, 원심 분리한 후 (20,000g x 30분, 4oC), 수용성 물질 (soluble material)을 수거하였다. 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분리하여 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF) 막으로 옮겼다. 5% 소 혈청 알부민 (BSA)을 포함하는 0.1% Tween-20을 함유하는 트리스 완충 식염수 (TBS)로 막을 블로킹하였고 (21℃, 2시간), 항-넥틴-4, 아파딘, rac1, src, JNK로 배양(4℃, 밤새)한 후에, HRP (horseradish peroxidase)-접합 이차 항체를 사용하여 배양하였다. WEST-ZOL과 웨스턴 블럿 검출 시스템 (iNtRon, SungNam, Korea)을 사용하여 검출하였다. 정량적 농도법으로 상대적인 단백질 수준을 판단하였고 데이터는, 베타-액틴 (Sigma-Aldrich)으로 표준화하였다.

< 실시예 4> 면역조직화학분석

마우스 폐 절편의 파라핀을 제거하고, 에탄올 시리즈 (ethanol series)로 재수화(rehydrated)하였다. 절편을 1.4% 과산화수소 (H2O2)를 포함하는 메탄올로 30분간 처리하여 내재하는 과산화 효소를 저해한 후, 1.5% 말 혈청으로 비특이적 결합을 처리하고 항-넥틴-4, 아파딘 (1:100, Abcam Inc.)으로 배양하였다. 다음 날에, 절편을 아비딘과 비오틴 처리된 HRP 거대분자 복합체 (Vector Laboratories, Burlingame, CA)로 배양하였다. 액상 DAB+ 기질 키트 (Golden Bridge International Inc., Mukilteo, WA, USA)로 염색하여 색 반응을 유발하였다. 면역조직화학 염색 후에, 슬라이드를 1분간 Harris 헤마톡시린으로 비교 염색하였다. ImageJ 프로그램 (National Institutes of Health, Bethesda, Md)으로 사진을 분석하였고, 염색 밀도는 6 내지 8의 필드(fields)에서 얻은 넥틴-4의 임의 밀도 값의 평균치로 정량화하였다.

< 실시예 5> ELISA

인간 혈장 중 넥틴-4의 단백질 수치를 ELISA (R&D System)로 측정하였다. 다른 플레이트와 결과를 비교하기 위해, 양성 및 음성 대조군에 대하여 시험 샘플의 광학 밀도 (OD)를 조정하였다. 두 웰의 평균 OD를 계산하였다. 각 시험 혈청의 지수값 (index value)은 하기 수학식으로 정의된다:

지수 (index) = (시험 혈청의 OD - 음성 대조군의 OD) / (양성 대조군의 OD - 음성 대조군의 OD) × 100. 낮은 검출 한계는 제조사의 권고에 따라 넥틴-4의 경우 6.56 pg/ml로 설정하였다.

통계 분석

데이터는 평균 ± 표준 오차 (SEM)로 나타내고, Mann-Whitney U 테스트를 이용하여 분석한 후, 필요한 경우에 post hoc test (SPSS version 22; SPSS, Chicago, IL)를 수행하였다. 결과 측정치간 상관 관계는 Pearson 또는 Spearman 상관계수(Pearson or Spearman correlation coeffcients)를 계산하여 판단하였다. p<0.05는 통계적 유의성을 의미하는 것으로 간주되었다.

< 실험예 1> OVA으로 유발된 알레르기성 염증에서 넥틴 -4의 활성 증가

도 1A는 마우스에 OVA(오브알부민)으로 감작 유발하여 기도과민성을 유발한 마우스 실험디자인을 나타낸다. 도 1B는 OVA으로 감작한 마우스에서 유도된 기도과민성(AHR, airway hyperresponsiveness)을 나타낸다. 도 1C는 OVA로 감작된 마우스의 기관지 폐포세척액(Bronchoalveolar lavage fluid, BALF)에서 증가된 염증 세포의 수를 나타낸다. 도 1D는 OVA로 감작 및 유발 (OVA)된 마우스에서의 넥틴-4/아파딘의 단백질 발현을 웨스턴 블럿으로 나타낸 것이고, 이를 β-액틴으로 표준화한 것이다.

도 1B에 나타난 바와 같이, OVA로 감작한 (OVA/OVA) 마우스는 식염수를 처리한 sham 마우스보다 기도과민성(AHR, airway hyperresponsiveness)이 증가하였다(도 1B). 또한, OVA/OVA 마우스는 sham 마우스와 비교하여 기관지 폐포세척액(Bronchoalveolar lavage fluid, BALF)의 염증 세포가 증가하였다 (도 1 C). OVA/OVA 마우스에서 넥틴-4와 afadin(아파딘) 그리고 아파딘의 다운스트림 단백질인 src, rac1, JNK가 sham 마우스보다 훨씬 많이 발현됨을 보여주었다 (도 1D). 따라서, 도 1을 통해, OVA으로 유발된 알레르기성 천식 모델 그룹은 sham 그룹에 비해 넥틴-4 활성이 현저하게 증가한 것으로 결론을 내릴 수 있다.

< 실험예 2> 면역조직화학 분석

다음으로, 오브알부민(OVA)으로 감작된 마우스 폐 조직에서 넥틴-4와 아파딘을 분석하였다. 도 2는 면역조직화학 염색법에 의해 오브알부민으로 감작 유발된 마우스 폐 조직의 넥틴-4와 아파딘 발현을 분석한 것이다.

도 2에 나타난 바와 같이, OVA/OVA 마우스의 폐조직은 염증 세포 침투를 가지는 수많은 집중 지역과 삼출되는 주변 기관지(peribronchial) 및 강내(intraluminal) 영역을 가졌다 (도 2). H&E 염색된 사진에서 염증 지수 (inflammatory index)의 반정량적인 값은 OVA/OVA 마우스에서 증가하였다 (도면에 나타내지 않음). 또한, OVA/OVA 마우스 폐 조직의 단핵 염증 세포와 내피 세포, 및 상피 세포에서 증가된 넥틴-4, 아파딘 면역 조직 화학 염색이 관찰되었다 (도 2).

< 실험예 3> 천식 환자의 임상적 특징 분석

표 1은 환자의 기본적인 특성을 보여준다. 기관지 천식 환자 62명의 평균 나이는 47세 (30-83세)였다. 천식 환자의 초기 FEV1 % 예측값 (pred.), FVC % 예측값, FEV1/FVC는 대조군보다 유의하게 낮았다. 천식 환자의 IgE는 대조군보다 유의하게 높았으며, PC20은 대조군보다 낮았다. 체질량 지수(Body mass index)는 천식 환자와 대조군 사이에 차이가 없었다.

< 실험예 4> 천식 환자에서의 넥틴 -4의 변형

다음으로, 천식 환자와 대조군을 대상으로 혈장에서 넥틴-4 발현 정도를 측정하였다. 도 3은 대조군과 천식 환자의 혈장 넥틴-4 수치를 나타낸다. 기관지 천식 환자의 평균 혈장 넥틴-4 수치는 109.15 ± 42.91 pg/ml이었고, 대조군은 71.05 ± 53.03 pg/ml였다. 혈장 넥틴-4 수치는 대조군에 비해 천식 환자에서 유의하게 높았다 (P<0.05, 도 3). 다음으로, 혈장 넥틴-4와 임상 변수, FVC % pred., FEV1 % pred., FEV1/FVC, PC20 간의 상관관계를 분석하였다. 도 4은 혈장 넥틴-4와 상기 임상변수와의 상관관계를 나타낸다. 도 4에 나타난 바와 같이, 혈장 넥틴-4 수치는 FVC % pred. (r=-0.261, P=0.015), FEV1 % pred. (r=-0.294, P=0.006)와 FEV1/FVC (r=-0.324, P=0.002), PC20 (r=-0.222, P=0.025)와 상관 관계가 있었다 (도 4).

이처럼, 천식환자에서 대조군에 비해 넥틴의 발현이 현저한 수준으로 증가하는 것을 확인하였는 바, 넥틴-4의 발현이 증가하는 경우, 천식으로 진단할 수 있다.

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims (15)

1. 넥틴-4 (nectin-4)의 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 천식 진단용 조성물.
2. 제1항에 있어서, 아파딘(afadin), Src, Rac1 또는 JNK(c-Jun N-terminal kinase)의 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 것인, 천식 진단용 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드인 것인, 천식 진단용 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것인, 천식 진단용 조성물.
5. 제1항에 따른 조성물을 포함하는, 천식 진단용 키트.
6. 제5항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트 또는 래피드(rapid) 키트인 것인, 천식 진단용 키트.
7. 생물학적 시료로부터 넥틴-4 (nectin-4)의 단백질 또는 이의 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
   상기 단계에서 측정된 단백질의 발현 수준 또는 유전자의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하며,
   천식 의심 개체의 분리된 시료의 상기 단백질의 발현 수준 또는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군 시료의 단백질의 발현 수준 또는 유전자의 발현 수준보다 높을 경우, 천식으로 판단하는 것을 특징으로 하는, 천식 진단을 위한 정보의 제공 방법.
8. 제7항에 있어서, 아파딘(afadin), Src, Rac1 또는 JNK(c-Jun N-terminal kinase)의 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA의 수준을 추가로 측정하는 것인, 천식 진단을 위한 정보의 제공 방법.
9. 삭제
10. 제7항에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준은 상기 유전자의 mRNA 발현 수준인, 천식 진단을 위한 정보의 제공 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 mRNA 발현 수준 측정은 역전사 중합효소반응, 경쟁적 역전사 중합효소반응, 실시간 역전사 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩에 의한 것인, 천식 진단을 위한 정보의 제공 방법.
12. 제7항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준 측정은 해당 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하는 것인, 천식 진단을 위한 정보의 제공 방법.
13. 제7항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준 측정 또는 비교는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학(immunohistochemistry) 분석, 면역세포화학(immunocytochemistry) 분석, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는, 천식 진단을 위한 정보의 제공 방법.
14. 분리된 세포, 분리된 조직 또는 인간을 제외한 동물에 천식 치료제 후보물질을 처리하는 단계;
    상기 후보물질 처리군에서 넥틴-4 (nectin-4)의 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 넥틴-4 (nectin-4)의 단백질의 발현수준이 후보물질을 처리하지 않은 대조군보다 감소하면, 상기 후보물질을 천식치료제로 선택하는 단계를 포함하는, 천식치료제의 스크리닝 방법.
15. 제14항에 있어서, 아파딘(afadin), Src, Rac1 또는 JNK(c-Jun N-terminal kinase)의 단백질의 발현 수준을 추가로 측정하고, 상기 측정된 아파딘(afadin), Src, Rac1, 또는 JNK(c-Jun N-terminal kinase)의 단백질의 발현수준이 후보물질을 처리하지 않은 대조군보다 감소하면, 상기 후보물질을 천식치료제로 선택하는 단계를 더 포함하는 것인, 천식치료제의 스크리닝 방법.

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