KR20230127098A - 대기오염물질 흡입 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이의 용도 - Google Patents

대기오염물질 흡입 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 출원에 의해 개시되는 기술의 일 양태에 따르면, 본 발명은 대기오염물질 노출여부 확인용 바이오마커에 관한 것으로, (i) VEGFR3 유전자; (ii) VEGFA 유전자; 및 (iii) VEGFC 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함하는 대기오염물질 흡입 노출 여부 확인용 바이오마커에 관한 것이다.

Description

대기오염물질 흡입 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이의 용도{BIMOARKER FOR IDENTIFYING INHALATION EXPOSURE TO AIR POLLUTANTS AND USE THEREOF}
본 발명은 대기오염물질의 일종인 디젤배기입자(Diesel exhaust particle, DEP)의 흡입 노출 여부를 확인하기 위한 바이오마커, 상기 바이오마커를 포함하는 대기오염물질 흡입 노출 여부 확인용 조성물, 상기 바이오마커를 포함하는 중이염 진단용 조성물, 이를 포함하는 키트, 상기 바이오마커를 이용한 대기오염물질 흡입 노출 여부에 대한 정보 제공 방법, 상기 바이오마커를 이용한 대기오염물질 흡입 노출 확인용 DNA 마이크로어레이 칩 및 상기 바이오마커를 이용한 DEP에 의하여 유발된 중이염 억제 또는 완화 물질 스크리닝 방법에 관한 것이다.
대기오염, 미세먼지 등은 호흡기 질환에 영향을 주는 것으로 알려져 있는데, 특히, 디젤 유형의 내연기관에 의해 생성되는 미립자 물질인 DEP는 독성을 가지고 있고, 인체 내 상피세포를 자극하여 호흡기 관련 면역 알레르기 증상을 유발한다. 최근 연구에 따르면, 대기오염, 미세먼지 등은 호흡기 질환 외에도 중이염을 일으킬 수도 있는 것으로 알려졌으며, DEP의 세포독성은 급성 중이염(Acute otitis media, AOM)의 원인이 될 수 있다.
중이염은 귀의 중이강 내에 발생하는 염증성 질환으로서, 발병 시기에 따라 급성 중이염과 만성 중이염 (Chronic otitis media, COM)으로 나뉜다. AOM은 3주 이내에 급성 염증을 동반하여 귀의 통증, 발열 등의 증상이 나타나며 중이 내의 유체를 특징으로 한다. AOM은 비염, 기침, 열, 인후통, 이통, 난청, 안절부절증, 과민, 식욕부진, 구토 또는 설사를 동반할 수 있다. 고막의 천공에 의한 화농 이루도 AOM에서 발생될 수 있는 것으로 알려져 있다.
한편, VEGF 단백질은 내피 세포의 증식을 유발하고 혈관 투과성을 증가시키는 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 또한, 마우스 중이강 내로 내독소를 투여하여 삼출성 중이염을 발생시킨 경우, 마우스 중이 조직에서 VEGF120, VEGF164 및 VEGF188 단백질의 발현량이 증가한다고 보고된 바가 있으나(Myung Won Kim et al., Korean J Otolaryngol, 559-64, 1999), DEP와 같은 대기오염 물질 노출시 특이적으로 발현이 증가되는 VEGF 단백질의 종류에 대해서는 알려진 바 없다.
또한, 급성 중이염의 발병 원인을 알아내는 것은 급성 중이염의 치료전략 수립 및 질환 만성화를 예방하기 위하여 매우 중요하다. 그러나, 대기오염, 대기 중의 미세먼지 등의 감축이 용이하지 않은 상황임에도 불구하고, DEP와 같은 대기오염 물질 노출 여부 및 상기 대기오염 물질 노출에 의하여 유발된 급성 중이염을 특이적으로 확인할 수 있는 이용가능한 바이오마커는 없는 실정이다.
(특허문헌 1) 한국 등록특허 제1900428호
본 발명자들은 DEP 노출시 중이 조직 또는 중이 점막 상피세포에서 발현이 증가하는 단백질을 탐색하기 위하여 in vitro 및 in vivo 실험을 실시하였고, DEP 노출이 (i) VEGFR3 단백질, (ii) VEGFA 단백질, 및 (iii) VEGFC 단백질로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질의 발현을 증가시키고, (i) VEGFR3 단백질, (ii) VEGFA 단백질 및 (iii) VEGFC 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질 발현 증가와 급성 중이염의 상관관계를 발견함으로써 DEP와 같은 대기오염 물질 노출 여부 및/또는 상기 대기오염 물질 노출 등에 의하여 유발될 수 있는 중이염을 특이적으로 확인할 수 있는 바이오마커를 확인하였다.
본 발명의 일 측면에 따르면, (i) VEGFR3 유전자; (ii) VEGFA 유전자 및 (iii) VEGFC 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함하는 대기오염물질 흡입 노출 여부 확인용 바이오마커를 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, (i) VEGFR3 유전자, (ii) VEGFA 유전자 및 (iii) VEGFC 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 암호화되는 단백질의 발현 정도를 측정하는 제제를 포함하는, 대기오염물질 흡입 노출 여부 확인용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 대기오염물질 흡입 노출 여부 확인용 조성물을 포함하는, 대기오염물질 흡입 노출 여부 확인용 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, (i) VEGFR3 유전자, (ii) VEGFA 유전자 및 (iii) VEGFC 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 암호화되는 단백질의 발현 정도를 측정하는 제제를 포함하는, 중이염 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 중이염 진단용 조성물을 포함하는, 중이염 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 대기오염물질 흡입 노출이 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 (i) VEGFR3 유전자, (ii) VEGFA 유전자 및 (iii) VEGFC 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 암호화되는 단백질의 발현량을 측정하는 단계; 상기 발현량과 정상 대조군 시료의 발현량을 비교하는 단계; 및 상기 발현량이 대조군에 비해 높은 경우, 개체가 대기오염물질에 노출된 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 대기오염물질 흡입 노출 여부에 대한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, (i) VEGFR3 유전자, (ii) VEGFA 유전자 및 (iii) VEGFC 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 그와 상보적인 핵산이 집적된 대기오염물질 흡입 노출 확인용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 중이 점막 상피세포에 DEP를 처리하는 단계; 상기 DEP를 처리한 중이 점막 상피세포에 시험 물질을 처리하는 단계; 및 상기 시험 물질을 처리한 중이 점막 상피세포에서, 시험 물질 처리 전후의 (i) VEGFR3 유전자, (ii) VEGFA 유전자 및 (iii) VEGFC 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자로부터 암호화되는 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계를 포함하는, 중이염 억제 또는 완화 물질 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 바이오마커인 (i) VEGFR3 유전자, (ii) VEGFA 유전자 및 (iii) VEGFC 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자는 대기오염물질, 예컨대 DEP 흡입 노출에 의하여 그 발현이 증가되고, (i) VEGFR3 유전자, (ii) VEGFA 유전자 및 (iii) VEGFC 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 증가는 급성 중이염 증상 악화 및 급성 중이염 발병과 밀접한 상관관계가 있는바, DEP 흡입 노출 여부 확인, 중이염 예후 예측 및 중이염 진단 등의 바이오마커로서 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 급성 중이염 마우스 모델에서 DEP 흡입 노출시 고막의 구조적 변화 및 급성 중이염 증상점수를 나타낸다(*: p value <0.05).
도 2는 급성 중이염 마우스 모델에서 DEP 흡입 노출시 중이 조직의 점막 두께 증가를 나타낸다(* p value <0.05 Control 그룹과 비교, *** p value <0.005 AOM 그룹과 비교).
도 3은 DEP 흡입에 노출된 급성 중이염 마우스 모델의 중이 점막 상피세포에서의 VEGFA와 VEGFR3의 mRNA 수준에서 발현 증가를 확인한 결과를 나타낸다(* p value <0.05 Control 그룹과 비교, *** p value <0.005 AOM 그룹과 비교).
도 4는 DEP 흡입에 노출된 급성 중이염 마우스 모델의 중이 조직 점막에서 VEGFC와 VEGFR3의 발현 증가를 확인한 결과를 나타낸다(* p value <0.05 Control 그룹과 비교, *** p value <0.005 AOM 그룹과 비교).
도 5는 DEP에 노출된 인간 중이 점막 상피세포에서의 VEGFA와 VEGFR3의 mRNA 수준에서 발현 증가를 확인한 결과를 나타낸다(* p value <0.05 Control 그룹과 비교).
본 발명의 일 측면에서, 본 발명은 (i) VEGFR3 유전자, (ii) VEGFA 유전자 및 (iii) VEGFC 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함하는 대기오염물질 흡입 노출 여부 확인용 바이오마커를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “VEGFR3”는 혈관 내피 성장 인자 수용체 3(Vascular endothelial growth factor receptor 3) 또는 fms 관련 수용체 티로신 키네이스 4(fms related receptor tyrosine kinase 4)를 지칭한다. 또한, 용어 “VEGFA”는 혈관 내피 성장 인자 A (Vascular Endothelial Growth Factor A)를 지칭한다. 또한, 용어 “VEGFC”는 혈관 내피 성장 인자 C를 지칭한다. 상기 VEGFR3, VEGFA 및 VEGFC 유전자는 세포 생존과 영양공급, 기질 분해효소 분비, 혈관 형성, 림프관 형성 등 경로의 주요 인자로서 많은 암 및 혈관 질환에서 중요한 역할을 한다.
나아가, 상기 VEGFR3, VEGFA 및 VEGFC 유전자는 NM_001354989.2(NCBI), NM_001025366.3(NCBI) 및 NM_005429.5(NCBI)를 참고할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 VEGFR3, VEGFA 및 VEGFC 유전자에 의하여 코딩되는 단백질의 아미노산 서열은 공지된 데이터베이스(예컨대, UniProt)에서 수득할 수 있다. 구체적으로, 마우스 VEGFR3, VEGFA 및 VEGFC 단백질의 Accession No.는 각각 P35917, Q00731 및 P97953이며, 인간 VEGFR3, VEGFA 및 VEGFC 단백질의 Accession No.는 각각 P35916, P15692 및 P49767이다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 대기오염물질은 디젤배기입자(Diesel exhaust particle, DEP)일 수 있다. 구체적으로, DEP는 디젤연료의 연소 시 발생되어 도시에서 대기오염을 시키는 가장 대표적인 물질을 통칭한다. DEP는 질소 산화물과 배기의 미립자 물질, 알데하이드, 일산화탄소, 황산화물, 케톤, 다환 방향족 탄화수소 등 많은 암을 포함하는 질병을 유발하는 물질들을 포함하는 복잡한 혼합물이다. 세계보건기구(WHO)에서는 DEP를 1등급 발암물질로 분류하고 있으며, 호흡기로의 DEP 노출은 다양한 질환을 유발할 수 있으며 개별 질환의 증상을 악화시킬 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 (i) VEGFR3 유전자, (ii) VEGFA 유전자 및 (iii) VEGFC 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 암호화되는 단백질의 발현 정도를 측정하는 제제를 포함하는, 대기오염물질 흡입 노출 여부 확인용 조성물을 제공할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 VEGFR3 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 암호화되는 단백질의 발현 정도를 측정하는 제제; VEGFA 유전자 및 VEGFR3 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자들로부터 암호화되는 단백질의 발현 정도를 측정하는 제제; VEGFA 유전자 및 VEGFC 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자들로부터 암호화되는 단백질의 발현 정도를 측정하는 제제; VEGFR3 유전자 및 VEGFC 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자들로부터 암호화되는 단백질의 발현 정도를 측정하는 제제; 또는 VEGFR3 유전자, VEGFA 유전자 및 VEGFC 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자들로부터 암호화되는 단백질의 발현 정도를 측정하는 제제를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, (i) VEGFR3 유전자, (ii) VEGFA 유전자 및 (iii) VEGFC 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 암호화되는 단백질의 발현 정도를 측정하는 제제를 포함하는, 중이염 진단용 조성물을 제공할 수 있다. 또한, 상기 진단용 조성물은 VEGFR3 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 암호화되는 단백질의 발현 정도를 측정하는 제제; VEGFA 유전자 및 VEGFR3 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자들로부터 암호화되는 단백질의 발현 정도를 측정하는 제제; VEGFA 유전자 및 VEGFC 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자들로부터 암호화되는 단백질의 발현 정도를 측정하는 제제; VEGFR3 유전자 및 VEGFC 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자들로부터 암호화되는 단백질의 발현 정도를 측정하는 제제; 또는 VEGFR3 유전자, VEGFA 유전자 및 VEGFC 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자들로부터 암호화되는 단백질의 발현 정도를 측정하는 제제를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 진단용 조성물은 급성 중이염 진단, 또는 DEP 노출에 의하여 유발된 급성 중이염 진단에 사용될 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 유전자의 mRNA의 발현 정도를 측정하는 제제는 특별히 제한하지는 않으나, 상기 유전자의 mRNA에 상보적인 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편, 상기 유전자를 증폭시킬 수 있는 프라이머 또는 프로브, 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다. 또한, 상기 유전자로부터 암호화되는 단백질의 발현 정도를 측정하는 제제는 특별히 제한하지는 않으나, 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서 있어서, 상기 용어 "프라이머"는 표적 유전자 서열을 인지하는 단편으로서, 정방향 및 역방향의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료 내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성이 부여될 수 있다.
본 발명에서 상기 용어 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함하는 것으로, 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.
상기 용어 "PNA(Peptide Nucleic Acid)"는 인공적으로 합성된, DNA 또는 RNA와 비슷한 중합체를 가리키며, 1991년 덴마크 코펜하겐 대학교의 Nielsen, Egholm, Berg와 Buchardt 교수에 의해 처음으로 소개되었다. DNA는 인산-리보스당 골격을 갖는데 반해, PNA는 펩타이드 결합에 의해 연결된 반복된 N-(2-아미노에틸)-글리신 골격을 가지며, 이로 인해 DNA 또는 RNA에 대한 결합력과 안정성이 크게 증가되어 분자 생물학, 진단 분석 및 안티센스 치료법에 사용되고 있다. PNA는 문헌[Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O (December 1991). "Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide". Science 254 (5037): 1497-1500]에 상세하게 개시되어 있다.
또한, 상기 용어"LNA(Locked nucleic acids)"란, 2'-O, 4'-C 메틸렌 브릿지를 포함하는 핵산 아날로그를 의미한다 [J Weiler, J Hunziker and J Hall Gene Therapy (2006) 13, 496.502]. LNA 뉴클레오사이드는 DNA와 RNA의 일반적 핵산 염기를 포함하며, Watson-Crick 염기 쌍 규칙에 따라 염기 쌍을 형성할 수 있다. 하지만, 메틸렌 브릿지로 인한 분자의 'locking'으로 인해, LNA는 Watson-Crick 결합에서 이상적 형상을 형성하지 못하게 된다. LNA가 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드에 포함되면, LNA는 보다 빠르게 상보적 뉴클레오티드 사슬과 쌍을 이루어 이중 나선의 안정성을 높일 수 있다.
상기 용어 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서 전형적으로 mRNA와 RNA: 올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 의미한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다.
상기 용어 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질을 가리킨다. 또한, 본 발명의 항체는 상기 VEGFR3 단백질, VEGFA 단백질 또는 VEGFC 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 본 발명의 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 상기 항체는 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 다클론 항체는 상기 VEGFR3 단백질, VEGFA 단백질 또는 VEGFC 단백질의 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 과정을 포함하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물로부터 제조될 수 있다. 또한, 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method; Kohler 및 Milstein (1976) European Journal of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리 기술(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991 참조)을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전장의 경쇄 및 2개의 전장의 중쇄를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
본 발명에서 상기 "앱타머"는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 문헌[Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R. "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24): 142727(1998)]에 상세하게 개시되어 있다.
본 발명에 따른 VEGFR3 단백질, VEGFA 단백질 또는 VEGFC 단백질이나, 이를 코딩하는 유전자의 정보는 공지되어 있으므로, 당업자라면 이를 바탕으로 상기 단백질을 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 용이하게 디자인할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 대기오염물질 흡입 노출 여부 확인용 조성물을 포함하는 대기오염물질 흡입 노출여부 확인용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 측면에서, 본 발명은 중이염 진단용 조성물을 포함하는 중이염 진단용 키트를 제공한다.
상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 키트는 분석 방법에 적합한 1종 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 더 포함할 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 바이오마커 단백질을 코딩하는 유전자에 대해 특이적인 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 상기 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오티드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp의 길이를 가질 수 있다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 용기, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 키트는 DNA 칩 기능에 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표지 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 구체예에서, 상기 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대해 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 본 발명은 대기오염물질 흡입 노출이 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 (i) VEGFR3 유전자, (ii) VEGFA 유전자 및 (iii) VEGFC 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 암호화되는 단백질의 발현량을 측정하는 단계; 상기 발현량과 정상 대조군 시료의 발현량을 비교하는 단계; 및 상기 발현량이 대조군에 비해 높은 경우, 개체가 대기오염물질에 노출된 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 대기오염물질 흡입 노출 여부에 대한 정보 제공 방법을 제공한다. 상기 시료는 개체의 고막, 중이 조직 또는 중이 점막에서 유래한 생물학적 시료일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에서, 역전사 중합효소반응, 경쟁적 역전사 중합효소반응, 실시간 역전사 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩을 이용하여 상기 mRNA 발현 수준을 측정할 수 있으나 이로 제한되지는 않는다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 단백질 발현 수준 측정 또는 비교는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학(immunohistochemistry) 분석, 면역세포화학(immunocytochemistry) 분석, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 이용하여 수행될 수 있으나, 이로 제한되지는 않는다.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 (i) VEGFR3 유전자, (ii) VEGFA 유전자 및 (iii) VEGFC 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 그와 상보적인 핵산이 집적된 대기오염물질 흡입 노출 확인용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명은 중이 점막 상피세포에 DEP를 처리하는 단계; 상기 DEP를 처리한 중이 점막 상피세포에 시험 물질을 처리하는 단계; 및 상기 시험 물질을 처리한 중이 점막 상피세포에서, 시험 물질 처리 전후의 (i) VEGFR3 유전자, (ii) VEGFA 유전자 및 (iii) VEGFC 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자로부터 암호화되는 단백질 의 발현 정도를 측정하는 단계를 포함하는, 중이염 억제 또는 완화 물질 스크리닝 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. DEP 흡입 노출에 따른 급성 중이염 마우스모델의 VEGFA, VEGFR3 및 VEGFC 발현 변화 확인
실시예 1.1. 급성 중이염 마우스 준비 및 디젤배기입자 흡입 노출
본 실험에 들어가기 앞서 청력에 이상이 있는 마우스 개체가 존재하는지 확인하기 위해 총 52 마리의 마우스를 마취시킨 후 방음 챔버에 넣어 클릭음, 4kHz, 16kHz의 주파수로 양쪽 귀를 자극시켜 청력 측정을 시행하였다.
6주령 BALB/c 암컷 마우스 8마리에 1mg/ml 농도의 지질다당체(lipopolysaccharide; LPS)를 경고막 주사(transtympanic injection)하여 중이염을 유발하였다(AOM 군). 또한, 6주령 BALB/c 암컷 마우스 13 마리에 챔버를 이용하여 일주일 중 5일간 100 ug/m3 농도의 DEP를 노출하여 흡입시킨 뒤, 1mg/ml 농도의 LPS를 경고막 주사하여 디젤배기입자 흡입 노출 후 중이염 유발(Pre DEP+AOM 군), 6주령 BALB/c 암컷 마우스 8마리에 1mg/ml 농도의 LPS를 경고막 주사하여 중이염을 유발한 뒤 5일간 100 ug/m3 농도의 DEP를 노출하여 흡입시켰다(AOM + Post DEP 군). 대조군 마우스 8마리는 LPS 주사 없이 주위의 공기에만 노출시켰다.
실시예 1.2. 급성 중이염 증상 점수 확인
마우스 급성 중이염 증상을 분석하기 위해 LPS 경고막 주사 24시간 뒤, 이경으로 검사하여 급성 중이염 증상을 확인하였다. 이때, 중이염 점수는 정상 고막을 1점, 부분 삼출을 2점, 고막의 구조적 변화 없는 삼출을 3점, 삼출과 고막의 구조적 변화를 4점으로 평가하였다.
이경 검사 결과, 대조군 8마리의 마우스는 모두 정상 고막을 갖는 것으로 나타났다(도 1 상단 및 하단 참조). 또한, LPS 주입으로 급성 중이염을 유발한 마우스 보다 LPS 주입후 DEP에 노출된 마우스의 고막은 구조적 변화가 발생하였고, DEP 노출후 LPS가 주입된 마우스의 고막의 구조적 변화가 가장 심한 것으로 나타났다(도 1 상단 참조).
한편, LPS 주입으로 급성 중이염을 유발한 마우스 8마리 중 2마리에서만 삼출과 고막의 구조적 변화가 관찰되었고, LPS 주입으로 급성 중이염을 유발한 뒤 DEP에 노출시킨 마우스 8마리 중 1마리에서만 삼출과 고막의 구조적 변화가 관찰되었으며, DEP에 노출후 LPS를 주입한 마우스 8마리 중 무려 4마리에서 삼출과 고막의 구조적 변화가 나타났다(도 1 하단 참조). 따라서, DEP 노출은 급성 중이염을 유발할 뿐 아니라, 급성 중이염 증상을 악화시킨다는 점을 알 수 있었다.
실시예 1.3. 마우스 중이 조직에서 점막의 변화 확인
중이염 발병시 및 DEP 노출유무에 따른 유전자 발현량 변화를 측정하기 위해 마우스의 중이 조직을 채취하여 4%(v/v) 완충 파라포름알데히드(4% buffered paraformaldehyde)를 처리하고 파라핀에 고정시켰다. 상기 마우스 중이 조직에 Calci-Clear Rapid(National Diagnostics) 시약을 사용하여 탈석회화를 하였다. 중이 조직을 파라핀에 포매하고 4㎛ 두께의 슬라이스로 잘랐다. 파라핀 절편을 재수화 하고 Hematoxylin & eosin 염색을 통하여 중이 조직에서 점막의 변화를 현미경을 이용하여 관찰하였다. 조직 데이터는 imageJ(National Institute of Health)를 사용하여 정량화 하였다.
조직학적 변화 분석 결과, DEP 노출은 급성 중이염이 유발된 마우스의 중이 점막 두께를 증가시키는 것으로 나타났다(도 2 참조). 중이염을 유발하는 LPS 투여 전 DEP에 노출된 마우스의 중이 점막 두께가 가장 두꺼웠으며, LPS 투여로 인한 중이염 유발 이후 DEP에 노출된 마우스의 중이 점막 두께도 DEP 노출 없이 LPS만 투여한 마우스보다 더 두꺼운 것으로 나타났다.
실시예 1.4. VEGFA 및 VEGFR3 유전자 발현 분석
상기 실시예 1.3의 마우스의 중이 조직을 대상으로, TRIzol(Invitrogen) 시약을 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 추출된 총 RNA를 42℃에서 50분간 그리고 70℃에서 15분간 SuperScriptⅢ First-Strand Synthesis SuperMix(Invitrogen)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 실시간 정량적 중합효소연쇄반응(qRT-PCR)은 QuantiTect SYBR Green PCR Kit(Qiagen)를 사용하여 수행하였다. mRNA의 발현 수준은 Peptidylprolyl isomerase A (PPIA)로 표준화되었다. VEGFA, VEGFR3 및 PPIA의 프라이머 서열이 표 1에 나열되어 있다.
Gene Forward Sequence (5`-3`) Reverse Sequence (5`-3`)
Mouse
PPIA GGCAAATGCTGGACCAAA CATTCCTGGACCCAAAACG
VEGFA CAGGCTGCTGTAACGATGAA CTATGTGCTGGCTTTGGTCA
VEGFR3 CCCGAGAGCATCTTTGATAAG GAAGAGCCTGGAGTCTTAGT
또한, 상기 실시예 1.3의 마우스의 탈석회화된 파라핀 고정된 중이 조직에 Immunohistochemical 염색을 수행하여 VEGFA 및 VEGFR3의 발현을 확인하였다.
VEGFA 및 VEGFR3 발현량은 대조군과 그 외의 군에서 상이한 것으로 나타났다. 대조군 마우스와 달리 중이염을 갖는 마우스는 모두 VEGFA 및 VEGFR3 발현이 증가되어 있는 것으로 나타났다(도 3 참조). 특히, DEP에 노출된 뒤 급성 중이염이 발병된 마우스는 DEP 노출없이 급성 중이염만 노출된 마우스보다 더 높은 VEGFA 및 VEGFR3 발현을 갖는 것으로 나타났다. 따라서, VEGFA 및 VEGFR3으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 중이염 특이적 바이오마커로서 활용될 수 있음이 확인되었다.
실시예 1.5. 면역조직화학분석을 통한 VEGFA 및 VEGFC 발현 분석
상기 실시예 1.3의 마우스의 중이 조직을 대상으로, 면역조직화학분석을 위하여 마우스 중이 조직 절편의 파라핀을 제거하고, 에탄올로 재수화 (rehydrated)하였다. 절편에 내재된 과산화효소를 저해한 후, 1.5% 염소 혈청으로 비특이적 결합을 처리하고 항-VEGFA 항체(1:250, Santa Cruz Biotechnology, Inc)와 항-VEGFC 항체 (1:250, Santa Cruz Biotechnology, Inc)를 결합시켰다. 다음 날에, 절편을 ABC 키트 (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)로 배양하였다. 액상 DAB+ 키트 (Golden Bridge International Inc., Mukilteo, WA, USA)로 색 반응을 유발하였다. 면역조직화학 염색 후에, 1분간 Hematoxylin 으로 비교 염색하였다. ImageJ 프로그램 (National Institutes of Health, Bethesda, Md)으로 이미지를 분석하였다.
분석 결과, 모든 마우스에서 VEGFA 및 VEGFC 발현이 관찰되었다(도 4 참조).
그러나, VEGFA및 VEGFC 발현량은 대조군과 그 외의 군에서 상이한 것으로 나타났다. 대조군 마우스와 달리 중이염을 갖는 마우스는 모두 VEGFA 및 VEGFC 발현이 증가되어 있는 것으로 나타났다(도 4 하단 참조). 특히, DEP에 노출된 뒤 급성 중이염이 발병된 마우스는 DEP 노출없이 급성 중이염만 노출된 마우스보다 더 높은 VEGFA 및 VEGFC 발현을 갖는 것으로 나타났다.
상기 실시예 1.4. 및 실시예 1.5를 통해, VEGFA, VEGFR3 및 VEGFC로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 중이염 특이적 바이오마커로서 활용될 수 있음이 확인되었다.
실시예 2. 대기오염물질 DEP에 노출된 인간 중이 점막 상피세포에서 VEGFA 및 VEGFR3 유전자 발현 확인
인간 중이 점막 상피세포를 T-플라스크에 DMEM(Lonza)과 BEBM(Lonza) 배지를 1대1 비율로 사용하여 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다. 배지는 세포 포화도가 80%에 도달할 때까지 48시간마다 교체하고 실험조건으로 계대배양 하였다. 실험 24시간 전, 배지를 0.1%(v/v) FBS가 첨가된 배지로 교체하여 30분 동안 배양한 후, 1ug/mL 농도의 LPS와 80ug/mL 농도의 대기오염물질 DEP를 사용하여 노출하였다. 인간 중이 점막 상피세포에서 대조군, LPS를 24시간 노출한 그룹, LPS 48시간과 DEP 24시간 노출 그룹, DEP 48시간과 LPS 24시간 노출 그룹으로 진행하였다.
또한, TRIzol(Invitrogen) 시약을 사용하여 각 군별 세포에서 총 RNA를 추출하였다. 추출된 총 RNA를 42°C에서 50분간 그리고 70°C에서 15분간 SuperScriptⅢ First-Strand Synthesis SuperMix(Invitrogen)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 실시간 정량적 중합효소연쇄반응(qRT-PCR)은 QuantiTect SYBR Green PCR Kit(Qiagen)를 사용하여 수행하였다. mRNA의 발현 수준은 Peptidylprolyl isomerase A (PPIA) 로 표준화되었다. VEGFA, VEGFR3, PPIA의 프라이머 서열이 표 2에 나열되어 있다.
Gene Forward Sequence (5`-3`) Reverse Sequence (5`-3`)
Human
PPIA TCCTGGCATCTTGTCCAT TGCTGGTCTTGCCATTCCT
VEGFA ACTTCTGGGCTGTTCTCG TCCTCTTCCTTCTCTTCTTCC
VEGFR3 CTGGACCGAGTTTGTGGAGG CACATAGAAGTAGATGAGCCG
분석 결과, 대조군과 달리 LPS 노출 또는 LPS 및 DEP를 노출한 그룹에서 VEGFA 및 VEGFR3가 모두 증가하는 것으로 나타났다(도 5 참조).
특히, DEP에 노출된 뒤 동물모델은 DEP 노출없이 급성 중이염만 노출된 중이 점막 세포보다 더 높은 VEGFA 및 VEGFR3 발현을 갖는 것으로 나타났다. 따라서, VEGFA 및/또는 VEGFR3가 중이염 특이적 바이오마커로서 활용될 수 있음이 확인되었다.

Claims (14)

  1. (i) VEGFR3 유전자; (ii) VEGFA 유전자; 및 (iii) VEGFC 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함하는 대기오염물질 흡입 노출 여부 확인용 바이오마커.
  2. 제1항에 있어서, 상기 대기오염물질이 디젤배기입자 (Diesel exhaust particle, DEP)인 바이오마커.
  3. (i) VEGFR3 유전자, (ii) VEGFA 유전자 및 (iii) VEGFC 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 암호화되는 단백질의 발현 정도를 측정하는 제제를 포함하는, 대기오염물질 흡입 노출 여부 확인용 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 유전자의 mRNA의 발현 정도를 측정하는 제제는 상기 유전자의 mRNA에 상보적인 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편, 상기 유전자를 증폭시킬 수 있는 프라이머 또는 프로브, 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이고,
    상기 유전자로부터 암호화되는 단백질의 발현 정도를 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 대기오염물질 흡입 노출 여부 확인용 조성물.
  5. 제3항 또는 제4항에 따른 조성물을 포함하는, 대기오염물질 흡입 노출여부 확인용 키트.
  6. (i) VEGFR3 유전자, (ii) VEGFA 유전자; 및 (iii) VEGFC 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 암호화되는 단백질의 발현 정도를 측정하는 제제를 포함하는, 중이염 진단용 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 유전자의 mRNA의 발현 정도를 측정하는 제제는 상기 유전자의 mRNA에 상보적인 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편, 상기 유전자를 증폭시킬 수 있는 프라이머 또는 프로브, 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이고,
    상기 유전자로부터 암호화되는 단백질의 발현 정도를 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 중이염 진단용 조성물.
  8. 제6항 또는 제7항에 따른 조성물을 포함하는, DEP에 의하여 유발된 중이염 진단용 키트.
  9. 대기오염물질 흡입 노출이 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 (i) VEGFR3 유전자, (ii) VEGFA 유전자; 및 (iii) VEGFC 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 암호화되는 단백질의 발현량을 측정하는 단계;
    상기 발현량과 정상 대조군 시료의 발현량을 비교하는 단계; 및
    상기 발현량이 대조군에 비해 높은 경우, 개체가 대기오염물질에 노출된 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 대기오염물질 흡입 노출 여부에 대한 정보 제공 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 시료는 개체의 고막, 중이 조직 또는 중이 점막에서 유래한 생물학적 시료인, 대기오염물질 흡입 노출 여부에 대한 정보 제공 방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 mRNA 발현 수준 측정은 역전사 중합효소반응, 경쟁적 역전사 중합효소반응, 실시간 역전사 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩에 의한 것인, 대기오염물질 흡입 노출에 대한 정보 제공 방법.
  12. 제9항에 있어서, 　단백질 발현 수준 측정 또는 비교는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학(immunohistochemistry) 분석, 면역세포화학(immunocytochemistry) 분석, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는,　대기오염물질 흡입 노출에 대한 정보 제공 방법.
  13. (i) VEGFR3 유전자, (ii) VEGFA 유전자; 및 (iii) VEGFC 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 그와 상보적인 핵산이 집적된 대기오염물질 흡입 노출 확인용 DNA 마이크로어레이 칩.
  14. 중이 점막 상피세포에 DEP를 처리하는 단계;
    상기 DEP를 처리한 중이 점막 상피세포에 시험 물질을 처리하는 단계; 및
    상기 시험 물질을 처리한 중이 점막 상피세포에서, 시험 물질 처리 전후의 (i) VEGFR3 유전자, (ii) VEGFA 유전자; 및 (iii) VEGFC 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자로부터 암호화되는 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계를 포함하는, 중이염 억제 또는 완화 물질 스크리닝 방법.

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR101900428B1 (ko) 2016-12-29 2018-09-20 순천향대학교 산학협력단 공기오염물질 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법

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KR101900428B1 (ko) 2016-12-29 2018-09-20 순천향대학교 산학협력단 공기오염물질 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법

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