KR102328497B1 - 자궁내막증 진단용 조성물 및 이를 이용한 자궁내막증 진단방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 셀레늄 결합 단백질 1(SELENBP1) 유전자 또는 AT-hook 전사 인자 (AKNA) 유전자 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 자궁내막증 진단용 조성물, 및 상기 조성물을 포함하는, 자궁내막증 진단용 키트, 상기 자궁내막증 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.
본 발명은, 자궁내막중 진단용 조성물을 제공함으로서, 자궁내막증 환자에게서 발현이 변화하는 단백질 또는 그 유전자의 발현 수준을 측정 및 비교함으로서, 자궁내막증의 조기진단 및 질병 정도를 유의적으로 예측 또는 파악할 수 있다.
아울러, 본 발명의 진단용 조성물은 비침습성 진단을 가능하게 하여 혈액, 뇨 검사 등으로 간단하고 유효성 있는, 자궁내막증을 초기 진단을 할 수 있다.

Description

자궁내막증 진단용 조성물 및 이를 이용한 자궁내막증 진단방법{Endometriosis diagnostic composition and method using the same}

본 발명은 셀레늄 결합 단백질 1(SELENBP1) 또는 AT-hook 전사 인자(AKNA) 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 자궁내막증 진단용 조성물 및 이를 이용한 진단방법에 관한 것이다.

양성 에스트로겐 의존성 장애인 자궁내막증은 생식 연령의 여성에서 대략 10-15%의 유병률에 영향을 미치는 고통스럽고 만성적인 부인과 질환이다. 증가하는 심한 자궁내막증의 주요 원인중의 하나는 환경적 영향으로 인한 후성 유전학적 요인이다.

지금까지 복강경 검사를 제외하고 자궁내막증을 정확하게 예측하기 위한 적절한 검사는 거의 없으며, 외과적 위험을 줄이고 진단 및 치료 결과를 높이기 위해서는 자궁내막증에 대한 고도의 예측 분석이 필요하다. 외과적 위험을 줄이고 진단 및 치료 결과를 높이기 위해서는 자궁내막증에 대한 고도의 예측 분석이 필요하다. 발전하고 있는 최신기법인 차세대 염기서열 분석 기술은 뚜렷한 관점에서 바이오 마커 발견을 할 수 있는 기회를 제공한다.

대한민국 공개특허 제10-2013-0008899호

본 발명의 목적은 셀레늄 결합 단백질 1(SELENBP1) 또는 AT-hook 전사 인자(AKNA) 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 자궁내막증 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 자궁내막증 진단용 조성물을 포함하는 자궁내막증 진단키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 자궁내막증 의심개체에서 분리된 생물학적 시료에서 셀레늄 결합 단백질 1(SELENBP1) 또는 AT-hook 전사 인자(AKNA) 단백질 발현 수준 또는 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계 및 상기 측정된 단백질의 발현 수준 또는 mRNA의 발현 수준을 정상 대조구 시료와 비교하는 단계를 포함하는, 자궁내막증 진단을 위한 정보의 제공방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하고자 본 발명자는 우리는 DNA 시퀀싱과 RNA 시퀀싱 분석을 결합하는 차세대 시퀀싱(NGS) 기법을 이용하여 난소 자궁내막증과 관련성이 높은 유전자를 탐색하였다. 두 가지 통합적인 시퀀싱 분석으로부터 셀레늄 결합 단백질 1(SELENBP1)과 AT-hook 전사 인자(AKNA) 유전자 선별하였고, SELENBP1 유전자 메틸화는 낮은 CpG 부위 프로모터 영역(LCP)에서 과 메틸화되었고, 마찬가지로, AKNA 유전자의 프로모터 영역의 메틸화는 LCP 영역에서 과 메틸화 패턴을 나타냄을 확인하였으며, mRNA의 발현은 SELENBP1 및 AKNA 유전자에서 RNA 시퀀싱 폴드 체인지(fold change) 수준과 유사하게 증가하고, 단백질 수준에서, 발현 수준은 SELENBP1 및 AKNA 둘 다에서 정상 난소와 비교하여 증가함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 양태로 셀레늄 결합 단백질 1(SELENBP1) 또는 AT-hook 전사 인자(AKNA) 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 자궁내막증 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 자궁내막증 진단용 조성물은 셀레늄 결합 단백질 1(SELENBP1) 또는 AT-hook 전사 인자(AKNA) 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함한다.

본 발명에서 사용된 용어“자궁내막증”은 자궁내막조직이 자궁 이외의 장소(난소, 복강, 장관, 방광)에서 비정상적으로 증식하는 질환이다.

본 발명에서 사용된 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 자궁내막증의 발병 여부를 확인하는 것으로서, 자궁내막증 발병 여부를 조기에 확인 할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 “셀레늄 결합 단백질 1(SELENBP1)”은 SBP1로도 알려져 있으며, 생체 내에서 인산화 된 티로신(tyr12 및 tyr335)인 사이토졸 단백질이다. 상기 셀레늄 결합 단백질 1(SELENBP1)를 코딩하는 유전자 염기서열 및 단백질 정보는 Ensembl에 공지되어 있다(ENSG00000143416)

본 발명에서 사용된 용어 “AT-hook 전사 인자(AKNA)”는 AT-hook 단백질 모티프를 포함하는 전사인자로 AT-리치 영역의 DNA 이중가닥과 결합되어 표적 유전자 전사하는 것으로 알려져 있다. 상기 AT-hook 전사 인자 (AKNA)를 코딩하는 유전자 염기서열 및 단백질 정보는 Ensembl에 공지되어 있다(ENSG00000106948).

본 발명의 일실시예에서 DNA 시퀀싱과 RNA 시퀀싱 분석을 결합하는 차세대 시퀀싱(NGS) 기법을 통해 셀레늄 결합 단백질 1(SELENBP1)과 AT-hook 전사 인자 (AKNA) 유전자가 자궁내막증과 관련성이 높음을 확인하였으며, 구체적으로 SELENBP1 유전자 메틸화는 프로모터 영역 (LCP)에서 과 메틸화되었고, 마찬가지로, AKNA 유전자의 프로모터 영역의 메틸화는 LCP 영역에서 과 메틸화 패턴을 나타냄을 확인하였다. 또한, mRNA의 발현은 SELENBP1 및 AKNA 유전자에서 RNA 시퀀싱 fold change 수준과 유사하게 증가하고, 단백질 수준에서, 발현 수준은 SELENBP1 및 AKNA 둘 다에서 정상 난소와 비교하여 증가함을 확인하였다.

즉, 셀레늄 결합 단백질 1 (SELENBP1) 또는 AT-hook 전사 인자(AKNA)의 mRNA 또는 단백질 발현이 증가하는 경우, 자궁내막증으로 진단할 수 있음을 확인하였다.

또한, 셀레늄 결합 단백질 1 (SELENBP1) 또는 AT-hook 전사 인자(AKNA)의 유전자의 메틸화 패턴이 정상 대조군과 비교하여 과 메틸화된 경우, 자궁내막증으로 진단할 수 있음을 확인하였다.

따라서 본 발명의 진단용 조성물은 셀레늄 결합 단백질 1(SELENBP1) 또는 AT-hook 전사 인자(AKNA)의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어 "마커(marker)"란 정상군 개체와 자궁내막증을 가진 개체를 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 본 발명의 자궁내막증을 가지는 개체에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산, 유전자, 지질, 당지질, 당단백질 또는 당 등과 같은 유기 생체 분자들을 모두 포함한다. 특히 본 발명에서는 자궁내막증을 가지는 개체에서 변화되는 폴리펩티드, 단백질, 핵산 또는 유전자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 사용된 용어 "mRNA 수준 측정"이란 자궁내막증을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 자궁내막증 진단용 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 프라이머 쌍 또는 프로브이며, 상기 유전자들의 핵산 정보가 GeneBank 등에 알려져 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.

상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

바람직하게 자궁내막증 진단을 위하여, 상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 셀레늄 결합 단백질 1(SELENBP1) 또는 AT-hook 전사 인자(AKNA)의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "프라이머 쌍"은 표적 유전자 서열을 인지하는 정방향 및 역방향의 프라이머로 이루어진 모든 조합의 프라이머쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성을 부여할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브 분자의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA (peptide nucleic acid), LNA (locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체외에서 제조된 것을 포함하는 것으로 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체로서, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열은 상기 유전자들의 mRNA에 상보적이고 상기 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미한다. 이는 상기 유전자 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이는 6 내지 100 염기, 바람직하게는 8 내지 60 염기, 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기일 수 있다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 통상의 방법으로 시험관 내에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드를 합성하는 한가지 예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 다중클로닝부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 상기 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 실시예에서 SELENBP1는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트를 이용하여 검출하고, AKNA는 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트를 이용하여 검출하였다.

따라서 상기 프라이머 세트는 SELENBP1에 특이적인 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트를 포함할 수 있으며, AKNA에 특이적인 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트를 포함할 수 있다.

본 발명에 사용된 용어 "단백질 수준 측정"이란 자궁내막증 진단을 위하여 생물학적 시료에서 자궁내막증 진단용 마커 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정이다. 상기 마커 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있으며, 바람직하게는 항체를 이용하지 않고 단백질 발현 수준 자체를 측정한다.

상기 단백질 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학(immunohistochemistry) 분석, 면역세포화학(immunocytochemistry) 분석, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

자궁내막증 진단을 위하여 바람직하게 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 셀레늄 결합 단백질 1(SELENBP1) 또는 AT-hook 전사 인자(AKNA)의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함할 수 있다.

본 발명에 사용된 용어 "항체"는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 상기 셀레늄 결합 단백질 1 (SELENBP1) 또는 AT-hook 전사 인자(AKNA)의 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.

또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

본 발명은 다른 양태로서, 상기 자궁내막증 진단용 조성물을 포함하는, 자궁내막증 진단용 키트를 제공한다.

바람직하게, 상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트 또는 래피드(rapid) 키트 일 수 있다.

또한, 바람직하게, 상기 자궁내막증 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.

바람직하게, 상기 진단용 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. RT-PCR (역전사 중합효소반응) 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 상기 각 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

바람직하게 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

또한 바람직하게는, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

또한, 바람직하게는, 5분내 분석결과를 알 수 있는 신속한 테스트를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 래피드(rapid) 키트 일 수 있다. 래피드 키트는 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 래피드 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 래피드 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 특이항체와 2차 항체가 고정된 나이트로 셀룰로오스 멤브레인, 항체가 결합된 비드에 결합된 멤브레인, 흡수패드와 샘플 패드 등 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 양태로 자궁내막증 의심개체에서 분리된 생물학적 시료에서 셀레늄 결합 단백질 1(SELENBP1) 또는 AT-hook 전사 인자(AKNA) 단백질 발현 수준 또는 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계 및 상기 측정된 단백질의 발현 수준 또는 mRNA의 발현 수준을 정상 대조구 시료와 비교하는 단계를 포함하는, 자궁내막증 진단을 위한 정보의 제공방법을 제공한다.

본 발명에서 사용된 용어 "생물학적 시료"란 자궁내막증 발병에 의해 유전자 발현 수준 또는 단백질 발현 수준이 차이가 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

상기 생물학적 시료는 인체에서 분리된 시료이다.

상기 셀레늄 결합 단백질 1(SELENBP1) 또는 AT-hook 전사 인자(AKNA)은 모두 정상 대조군과 비교하여, 자궁내막증이 있는 개체에서 유전자 발현 수준 또는 해당 단백질의 발현 수준이 변화하는 특징을 가지므로, 상기 수준이 변화하면 자궁내막증으로 진단할 수 있다.

또한, 자궁내막증 의심 개체의 분리된 시료의 상기 단백질의 발현 수준 또는 mRNA의 발현 수준이 정상 대조군 시료의 단백질의 발현 수준 또는 mRNA의 발현 수준보다 높은 경우 자궁내막증으로 판단할 수 있다.

상기 mRNA 발현 수준 측정 또는 비교는 역전사 중합효소반응, 경쟁적 역전사 중합효소반응, 실시간 역전사 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩 등을 사용할 수 있으나, 본 발명은 이들에 제한되는 것이 아니다. 상기 측정 방법들을 통하여 정상 대조군에서의 mRNA 발현량과 자궁내막증 환자의 mRNA 발현량을 확인할 수 있고, 이들 발현량 정도를 비교함으로써 자궁내막증 발병 여부를 진단 또는 예측할 수 있다.

바람직하게 본 발명의 상기 단백질 발현 수준은 해당 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 측정 및 비교할 수 있다. 상기 항체와 생물학적 시료 내의 해당 단백질이 항원-항체 복합체를 형성하도록 하고, 이를 검출하는 방법을 이용한다.

본 발명에서 사용된 용어 "항원-항체 복합체"는 생물학적 시료 중의 해당 단백질 항원과 이를 인지하는 항체의 결합물을 의미한다. 상기 항원-항체 복합체의 검출은 당업계에 공지된 바와 같은 방법, 예를 들어 분광학적, 광화학적, 생물화학적, 면역화학적, 전기적, 흡광적, 화학적 및 기타 방법을 이용하여 검출할 수 있다.

본 발명의 목적상, 상기 단백질 발현 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학(immunohistochemistry) 분석, 면역세포화학(immunocytochemistry) 분석, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LCMS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 전술한 실시예에서 셀레늄 결합 단백질 1(SELENBP1) 또는 AT-hook 전사 인자 (AKNA)이 자궁내막증 환자에서 과메틸화됨을 확인하였는바, 자궁내막증 의심 개체의 분리된 시료에서 셀레늄 결합 단백질 1(SELENBP1) 또는 AT-hook 전사 인자(AKNA) 메틸화 수준을 측정하고 정상대조구와 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다.

또한 상기 자궁내막증 의심 개체의 분리된 시료의 셀레늄 결합 단백질 1(SELENBP1) 또는 AT-hook 전사 인자(AKNA) 메틸화 수준이 정상대조군과 비교하여 높은 경우, 자궁내막증으로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명은 셀레늄 결합 단백질 1(SELENBP1) 또는 AT-hook 전사 인자(AKNA) 단백질 또는 mRNA의 발현의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 자궁내막증 진단용 조성물, 및 상기 조성물을 포함하는, 자궁내막증 진단용 키트, 상기 자궁내막증 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.

본 발명은, 자궁내막중 진단용 조성물을 제공함으로서, 자궁내막증 환자에게서 발현이 변화하는 단백질 또는 그 유전자의 발현 수준을 측정 및 비교함으로서, 자궁내막증의 조기진단 및 질병 정도를 유의적으로 예측 또는 파악할 수 있다.

아울러, 본 발명의 진단용 조성물은 비침습성 진단을 가능하게 하여 혈액, 뇨 검사 등으로 간단하고 유효성 있는, 자궁내막증을 초기 진단을 할 수 있다.

도 1은 바이설파이트 시퀀싱 실험에 대한 개략도이다.
도 2는 시퀀싱 리드 총 수를 나타난 것이다. (A) 각 단계에서 매핑된 리드의 깊이 분포, DNA 메틸화 시퀀싱에서 CG 사이트의 평균 깊이 비율이다. (B) 사이토신 위치에 정렬된 리드의 평균 깊이 및 이들의 누적(cummultative) 깊이 비율과 해당 깊이(X)에 해당하는 분포이다.
도 3은 메틸화 시퀑싱에 대한 품질 컨트롤 데이터이다. 시퀸징 품질 컨트롤 필터 이후 리드 품질 점수는 (A) 필터 전, (B) 필터 후 리드 위치에 따라 증가하였다. 품질 컨트롤 필터 시퀀싱 후 피드 위치에 따라 리드 품질 점수를 높였다. 기준 위치에 따른 각 표본의 A,C,G,T의 여과 분포는 비율의 필터 이전 분포와 유사했다. 시퀀스 컨텐츠 (C) 필터 전 (D) 필터 후에서 AT 대비 CG의 비율이 낮음을 확인하였다. 마찬가지로, 리드 시퀀스 컨탠츠의 CG 분포와 평균 CG 비율은 (E) 필터 전 (E), 필터 후 (F)과 비슷했다.
도 4는 시료의 메틸화 평균 분포이다. (A) 자궁내막증과 정상대조군에서 각 염색체에 대한 평균의 평균 메틸화 수준을 확인하였다. (B) 히트맵은 각 시료의 메틸화 수준과 계층적 군집화한 것이다. 계층적 클러스터링 방법 및 이와 유사한 메틸화 수준의 값을 사용하는 Pierson 상관 관계 값은 계층적으로 클러스터링된다. R 값은 대조군 난소와 자궁내막증 내에서의 유의한 상관관계에 대해 비교하였다.
도 5는 (A) 필터 전의 CpG 위치 수를 요약한 것이고, 필터 조건을 통해 샘플 사이에 공통적으로 정렬된 CpG 위치를 기반으로 한 벤다이어그램이다.
도 6은 난소 자궁내막증에서 유의한 DMR에 대한 DNA 메틸화 수준의 염색체 분포를 나타난 것이다. X축은 각 염색체 위치 유의한 메틸화 수준(Log2 비율)에 대한 게놈 조정이다. Y축은 하이퍼메틸화(과메틸화, 빨간색 선) 또는 하이메틸화(저메틸화, 파란색 선)의 메틸화 수준 차이를 나타낸다.
도 7은 모든 시료의 RNA 서열 분석 데이터의 품질 평가로, (A) RNA 시퀀싱 및 (B) 리드의 정렬 개요 (C) 발현은 유전자 유형 수를 나타낸다.
도 8은 시료 유전자의 FPKM 간의 피어슨 상관 계수로, 분홍색 표시는 0.7 보다 높은 유전자 및 FPKM 사이의 높은 상관관계를 나타낸다.
도 9는 정상 대조군 난소와 자궁내막증 사이에서 차등 발현된 유전자 수를 나타낸 것이다.
도 10은 (SELENBP1, AKNA)에 대한 정량적 RT-PCR 결과로, (A) SELENBP1 및 AKNA의 mRNA의 발현 수준은 정상대조군 난소 에 비해 유의미하게 상승 하였다. (B) RNA 시퀀싱 분석에서 차등적으로 발현 된 유전자 폴드 변화의 값 역시 유의하게 자궁내막증에서 높았다.
도 11은 난소 자궁내막증 및 정상대조군 난소에서 SELENBP1 및 AKNA의 발현을 웨스턴 블랏하여 비교한 결과이다.
도 12는 난소 자궁내막증 및 정상대조군 난소에서 SELENBP1 및 AKNA의 발현을 면역화학염색 분석한 결과이다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

<재료 및 방법>

<실시예1> 시료의 준비

모든 시료는 사전서면동의를 얻은 후 채취하였으며, 본 발명은 위한 환자 유전자 검사는 윤리심의위원회(SCHBC 2015-08-026)에 의해 승인되었다.

산부인과 환자 20명의 환자를 모집하였으며, 자궁내막 생검 시료는 난소 자궁 내막종(ovarian endometrioma) 환자에서 외과적 치료(treatment)를 통해 분리하였다.

대조군 난소 및 자궁내막증 조직의 크기는 1cm³ 이상이었으며, 대조군 및 자궁내막증 병변 조직은 상기 1cm³ 부분에서 분리하였다. 자궁내막증 환자의 임상 단계는 미국 불임협회(American Fertility Society classification system)의 분리 기준에 따라 최소(Stage I), 경미 (Stage Ⅱ), 중등 (Stage Ⅲ) 및 중증 (Stage Ⅳ)의 4개 단계로 평가하였다. 대조군 생검 시료는 자궁근종(myoma) 또는 낭성기형종(cystic teratoma) 환자의 비병변 난소에서 분리하였다.

또한, 최근 10년 이내의 난소 암 또는 경계성 종양 환자는 대상에서 제외하였다. 분리한 조직은 즉시 의료연구소로 보냈으며, 나머지 반은 4% 파라포름알데이트를 첨가하여 -70℃로 보관하였다.

<실시예2> 게놈 DNA 및 RNA 분리

냉동조직에서 QIAAmp DNA 미니 키트 (Qiagen, Hilden, 독일)를 이용하여 게놈(Genomic) DNA를 추출하였다. 분리된 DNA는 품질분석을 위해 230㎚, 260㎚ 및 280㎚에서 흡광도(Absorbance, A)를 측정하였다. DNA 메틸화 분석을 통해 A 260㎚/ A 280㎚ 비율은 1.8 이상 및 2.0 미만인 시료를 이용하였으며, 230㎚에서 과잉한 흡광도를 보이는 게놈 DNA 시료는 시퀀싱 분석에서 제외하였다.

겔 전기 영동은 30 ng의 DNA를 0.7% 아가로스겔에 로딩하여 50V에서 40분간 수행하였으며, λ Hind III 마커를 이용하였다.

TRIzol reagent (TaKaRa Biotechnology Co. Ltd., Dalian, 중국)을 이용하여 조직(tissues)에서 전체 RNA를 추출하였다. 총 RNA의 무결정성은 Agilent 2100 BioAnalyzer를 사용하여 확인하였다.

<실시예3> 표적 DNA 메틸화 분석(Targeted DNA Methylation analysis)

Agilent SureSelect Human Methyl-Seq 키트(Illumina, Inc., San Diego, CA, USA))를 이용하여 시퀀싱 라이브러리를 구축하였다. 평균 QS 20 이상, N 10% 미만의 품질기준을 충족하지 않는 대상(매핑된 리드)은 제거하였다. 바이설파이트(bisulfite) 변환을 고려하여 게놈에 맵핑하였고, 소프트웨어 비스 마크 0.9.1를 이용하였다.

사이토신 콜링(Cytosine calling)은 고유하게 맵핑된 리드를 이용하였고 사이토신 위치(CG) 기반으로 메틸레이션 콜링(methylation calling)을 수행하였다. 사이토신 리스트에서 표적 부위의 사이토신 위치를 추출하였다.

DNA 샘플에 대한 시퀀싱 라이브러리는 Agilent SureSelect Human Methyl-Seq 키트를 이용하여 제조사의 매뉴얼에 대로 제조하였다. 라이브러리에는 Illumina HiSeq 2500 플랫폼(Illumina)을 사용하여 리드 깊이로 페어링된 엔드 시퀀싱(paired-end sequencing)이 적용하였다.

표적 메틸화 시퀀싱은 게놈의 어느 영역이 메틸화되었는지 조사하기 위해 수행하였으며, 특히 유전자 내(inter genomic) - 유전자간(intra genomic) 영역, 프로모터, CG 풍부 지역, 전사인자 결합 사이트(transcription factor biding sites, TFBS), 인핸서 및 전위요소(transposable element, TE) 조사를 수행하였다.

<실시예4> RNA 시퀀싱 분석(RNA-sequencing methodology and analysis)

전사체 스쿼싱 라이브러리는 TruSeq RNA 접근 라이브러리 준비 키트 (Illumina, CA, USA)를 이용하여 준비하였다. 페어링된 엔드 시퀀싱(paired-end sequencing)(100bp)은 Illumina Hiseq 2500 기기를 이용하여 수행하였다. 데이터 가공 전의 페어링된 100 bp의 리드(raw read) 모두 품질검사를 수행하였으며, 품질평가가 낮은 리드는 매핑 전에 데이터 세트에서 필터하였다.

페어링된 엔드 리드는 2009 년 2 월 발표된 인간 게놈 참조(UCSC 데이터베이스에서 다운로드, GRCh37/hg19)에 정렬하였다. 정렬은 HISAT 프로그램(버전 0.1)을 이용하여 수행하였다. 정렬된 리드는 cufflinks 프로그램을 사용하여 유전자와 전사체의 발현을 예측하는데 이용하였으며, 각각의 유전자 및 전사체에 대해 FPKM/RPKM (Fragment per kilo per million/Read per kilo per million) 단위로 보고하였다.

차등 유전자 발현 분석은 cuffdiff (버전 2.2.1)를 사용하여 수행하였다. 유의한 mRNA 폴드 체인지(Fold change)를 Benjamini 및 Hochberg 다중 시험 보정에 기초하여 0.05 미만의 조정 된 p- 값에 의해 결정하였다.

<실시예5> AKNA 및 SELENBP1 발현 분석

5.1. 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응 (qRT-PCR)

RNA 순도 및 농도는 나노드롭(Nanodrop) 장치를 사용하여 측정하였다. RNA 순도는 A 260/280 비율을 특정하고, 아가로스겔 전기영동으로 확인하였다. cDNA는 SensiFastTM cDNA 합성 키트에 매뉴얼대로 합성하였으며, 합성된 cDNA는 SensiFAST™ Real-Time PCR 키드를 이용하여 실시간 PCR에 사용하였다.

인간 SELENBP1는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트를 이용하여 검출하였다.

서열번호 1(SELENBP1 정방향 프라이머) : 5'-atc acc gac atc ctg ctc tc-3'

서열번호 2(SELENBP1 역방향 프라이머) : 5'-ccg ttt tcc ctt gac cac ta-3'

인간 AKNA는 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트를 이용하여 검출하였다.

서열번호 3(AKNA 정방향 프라이머) : 5'-gag cca ggt ctt cct cag tg-3

서열번호 4(AKNA 역방향 프라이머): 5'-tgg tat tcg tgg cct gtg ta-3'

인간 GAPDH는 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 세트를 이용하여 검출하였다.

서열번호 5(GAPDH정방향 프라이머) : 5'-ctg agc tga acg gga agc tc-3'

서열번호 6(GAPDH역방향 프라이머) : 5'-aaa ggt gga gtg ggt-3'

5.2. 단백질 추출(Protein extraction)

단백질 용해물은 미리 냉각된 4℃ 버퍼를 이용하여 분리하였다. 수집된 조직은 막자사발로 파쇄하였다. 분쇄된 조직을 프로테이스(protease) 및 포스파타아제 억제제(phosphatase inhibitors)가 첨가된 RIPA 버퍼에 현탁하고 고무찰자(rubber policeman)를 이용하여 분리하였다. 상기 혼합물은 1.5㎖ 튜브에 옮기고, 5분마다 부드럽게 볼텍싱하며, 얼음에서 30분간 인큐베이션 하였다.

그 후 상기 혼합물을 4℃, 13,000 × g로 20분간 원심분리하여 세포파편(펠렛)과 총 단백질(상청액)을 분리하였다. 상청액은 추가 분석을 위해 새로운 튜브에 옮기고, 단백질 농도는 Lowry 분석법을 이용하여 측정하였다.

5.3. 웨스턴 블랏팅(Western blot analysis)

각 웰에 전체 단백질 40㎍을 로딩하고 10% SDS- 폴리 아크릴 아미드 겔 전기영동하여 분리하였다. 그 후 분리된 단백질을 폴리비닐리덴 플루오라이드(polyvinylidene fluoride)에 75V로 2 시간 동안 트랜스퍼(transfer)하였다.

상기 막을 1 시간 동안 5% 소 혈청 알부민으로 블락킹한 후, SELENBP1 항체, β- 액틴 항체, AKNA 항체로 4℃에서 밤새 인큐베이션 하였다. 그 후 막을 PBS-T (Tween 20을 함유하는 포스페이트 완충액)로 3 회 (각각 10 분) 세척한 후 2 차 항체 (비오티닐화 범용 항체, 염소 항-토끼 IgG (H + L) -HRP)와 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션 하였다. 그 후 막을 PBS-T로 3 회 (각각 10 분) 세척 하였다.

5.4. 면역화학염색(Immunohistochemical analysis)

수집한 대조군 난소 및 자궁내막증 조직 시료는 4% 파라 포름 알데히드에 고정시키고 파라핀에 포매시켰다. 조직을 5 ㎛ 섹션으로 절단한 후 코팅된 슬라이드 (Hydrophilic Plus Slides, Bio SB Inc)에서 부착하였다. 이후 자일렌(xylene)을 이용하여 파리핀을 제거하고, 100%, 85%, 70%, 50% 알코올로 연속적으로 처리하여 재수화하였다.

시트르산 나트륨 완충제(pH 6)을 20분 처리하여 항원복구(Antigen retrieval)를 수행하였다. 0.3% 과산화수소를 포함하는 메탄올을 처리하여 30분간 투과화(Permeabilization)를 수행하였다. 슬라이드를 TBS를 이용하여 5분씩 3회 세탁하였고, 실온의 습도 챔버에서 1시간 동안 블랏킹 버퍼(항-염소 세럼을 포함하는 TBS)로 인큐베이션 하였다. 이후 항 셀레늄 결합 단백질 1 항체 (1 : 200; Abcam, Cambridge, CA, USA) 및 항 AKNA 항체 (1 : 100; Ptoeintech)를 슬라이드에 첨가하고, 이를 4℃ 습도 챔버에서 밤새 인큐베이션 하였다. 그후 2차 항체(biotinylated universal antibody, goat anti-rabbit IgG (H+L)-HRP, 1:500)로 30분간 인큐베이션한 후, 애비딘 바이오딘 복합체(avidin-biotin complex)로 30분간 반응시켰다. 상기 슬라이드는 실온에서 다이아미노벤지딘(diaminobenzidine)을 이용하여 현상하였으며, 헤마톡실린(Mayer’s hematoxylin)을 이용하여 대조염색하였다.

슬라이드 상의 갈색 염색에 대해 백분율을 계산하고, 다음과 같은 H-점수를 계산하여 발현(Expression)을 정량화 하였다.

H 점수 기준 :

0% 염색 : 0점 (발현없음)

1-9% 염색 : 1점 (약함)

10-19% 염색 : 2점 (중간)

20% 이상 염색 : 3점 (강함)

상기 점수는 두 명의 독립된 관찰자에 의해 측정되었다.

5.5 통계분석(Statistical analyses)

결과는 평균 ± 표준 편차로 표시하였다. 두 그룹의 차이는 Student 's t-tests 또는 Mann-Whitney U test를 사용하여 수행하였다. 모든 통계적 분석은 p <0.05의 유의 수준에서 Windows 용 SPSS 19.0 소프트웨어 (미국 일리노이 주 시카고에있는 SPSS Inc.)를 사용하여 수행하였다.

<결과>

<실험예1> 임상 데이터(환자)

총 20명의 환자를 대상으로 차세대 시퀀싱 분석을 수행하였다. 대조군 난소(control ovary, CO) 및 난소 자궁내막증(ovarian endometriosis, EM) 조직 시료를 제공한 대상 환자의 임상 특성은 표 1과 같다.

본 발명의 실시예에서 채취한 자궁내막증 시료는 모두 rASRM 기준을 Stage Ⅲ 이상이었다. 모든 자궁내막증 환자의 시료는 Stage Ⅳ(중등도)였다. 10명 중 5명의 환자는 Stage Ⅳ에서 자궁내막증이 재발하였다.

이상적인 정상 대조군 시료를 얻기 위해 복강경 자궁 적출술 또는 난소 방광 절제술을 받은 환자에서 정상 난소를 채취하였다. 이들 중 60%는 자궁근종(uterine myomas) 환자이며, 나머지 40%는 양성낭기형종(benign cystic teratoma) 환자였다.

각 그룹의 평균 연령은 자궁내막증(EM) 그룹 28.6세, 정상 대조군 46.3세로 차이가 있었으나, 모든 대상환자는 모두 폐경 전의 여성이었다. 임신력(gravidity)은 EM 그룹 1.37 명, 정상 대조군 그룹 2.0 명으로 차이가 있었다. 그러나 두 그룹간의 신체질량지수(body mass index, BMI)는 차이가 없었다.

<실험예2> DNA 메탈화 분석

자궁내막증에서 DNA 메틸화 차이가 나타나는 유전자를 분석하고자, 자궁내막증 환자(n=10)와 정상 대조군 환자(n=10)에서 분리된 조직에서 DNA를 분리하고 DNA 메틸화를 비교 분석하였다.

NGS 테스트 결과는 다음과 같다. 표적화된 DNA 메틸화를 쌍으로 비교한 결과, 자궁내막증 환자 그룹과 정상 대조군 환자 그룹에서 메틸화 패턴에서 강한 차이가 검출되었다. DNA 메틸화 프로파일은 자궁내막증 및 정상 대조군 그룹으로 쉽게 구별했다.

맵핑 비율(rate) 동안, 자궁내막증 및 정상 대조군의 타겟 리드(Read)에서 497171758 및 581704727개의 시퀸스 리드(sequence reads)를 추출하였다(도 2).

맵핑 비율 평균 깊이는 자궁내막증 그룹에서 454.01, 정상 대조군 그룹에서 532.92였다. 또한, CG 위치(sites)에서 평균 깊이(300x)의 비율은 자궁내막증 그룹 361.15와 정상 대조군 그룹 416.53으로 필터되었다.

메틸화 시퀸싱에 대한 시퀀싱 데이터 품질 컨트롤 결과는 도 3과 같다. 시퀸싱 품질 컨트롤 필터 후, 리드(read) 품질 점수는 리드(read)의 위치에 따라 증가하였다. 필터된 기본 위치에 따른 각 시료의 A, C, G, T의 비율 분포는 필터 전의 분포와 유사하였다. 이는 시료의 시퀸스 함량에서 AT와 비교하여 CG 비율이 낮음을 보여준다. 마찬가지로 리드 시퀸스 콘텐츠의 CG 분포와 CG 평균는 이전 분포와 유사하였다. 모든 필터가 완료된 후 사이토신 레벨 분석을 수행하였다. 평균 메틸화 수준 분포는 도 4A와 같다. 시료의 각 염색체에 대한 평균의 평균 메틸화 수준은 자궁내막증과 정상 대조군에서 유사하였다. 마찬가지로 그룹간 메틸화 수준의 상관관계를 도 4B의 히트맵으로 나타냈다. 도 4B에서 자궁내막증과 정상대조군 그룹간의 상대적인 상관관계를 확인하였다.

표 2는 차등적 메틸화 영역(Differential methylated regions, DMRs) 분석결과로, 정상 대조군보다 20% 이상의 메틸화 수준을 차이나는 영역을 분석하였다. DMR의 수는 프로모터, CG 리치 지역, TFBS, 인핸서(Enhancer), TE를 포함하는 다양한 타겟 메틸화 영역을 포함한다.

이러한 DNA 메틸화 영역은 전달조절 요소(trans-regulatory element)를 조절하여 유전자 전사에 영향을 미치는 것으로 잘 알려져 있었기 때문에, 벤 다이어그램은 깊이 필터링 조건과 각 시료 사이에 공통적으로 정렬된 CpG 사이트를 기초로 그렸다.

도 5를 참조하며, 유의한 DMR을 확인하기 위해, 필터 조건은 전사시작 위치 (transcription start site, TSS)로부터 p- 값 <0.05 및 log2FC ≥1.2 내부 1 Kbase로 측정하였다. TSS DMR 데이터로부터 유의한 내부 1K 염기의 목록은 표 3과 같다. 또한, DMR의 과 메틸화(hypermethylation) 또는 저 메틸화(hypomethylation) 패턴은 도 6에서 총 염색체에 나타냈다.

<실험예3> 차등적 유전자 발현 분석(Differential gene expression analysis )

메틸화 변화의 생물학적 관련성을 분석하기 위해 동일한 조직 시료(specimens)에서 유전자 발현을 조사했다. 실험에 사용된 정상대조군 시료를 포함한 모든 시료의 RNA는 RIN 값이 7보다 크며 RNA 시료가 우수한 품질임을 확인했습니다.

최종적으로 자궁내막증 환자(n=3)에서 분리된 시료와 정상대조군 환자(n=3)에서 분리된 시료의 RNA 시퀸싱 분석하고 비교하였다. 도 7은 6개의 조직 시료, 자궁내막증(E1 내지 E3) 및 정상대조군(C1 내지 C3)의 RNA 분석 데이터 개요이다. 도 7을 참조하면 E1 환자에서 75M, E2 환자에서 53M, E3 환자에서 60M, C1에서 67M, C2에서 96M, C3에서 82M의 시컨스 리드를 얻었다. 낮은 품질의 베이스 및 리드는 리드 맵핑에서 필터되었다. 유전자의 상대적 발현은 cufflinks를 이용한 FPKM으로 추정하였다. 시료 유전자와 FPKM 사이의 피어슨 상관계수(Pearson correlation coefficient)는 도 8과 같다.

자궁내막증 그룹에서 전사 레벨의 RNA Seq 피어슨 상관계수는 0.8보다 컸으며, 이는 이 두 그룹 사이의 실험설계의 합리성과 그룹 내의 발현 유사성을 나타낸다.

도 9는 대조군과 자궁내막증 환자사이의 차등적 발현 유전자 수를 분석한 것이다. 차등적 발현 유전자(DEG) 분석은 자궁내막증 환자군에서 상향조절 유전자는 128, 하향조절 유전자는 325으로 나타났다(q- 값 <0.05 인). q- 값은 최적화된 FDR (False Discovery Rate) 방식을 사용하여 찾은 조정 된 p- 값이다.

<실험예4> 자궁내막증에서 차등적으로 메틸화되는 유전자의 선별

자궁내막증에서 유의하게 차등적으로 메탈화되는 유전자를 선별하고자, 유의한 DMR(Differential methylated regions) 및 DEG(Differentially expressed genes) 목록을 통합하고, DEG를 p-값 <0.05 및 log2FC ≥1.2를 기준으로 필터를 수행하였다.

총 338개의 유전자가 유의한 DEG임을 확인하였다. 마지막으로, 유의한 DMR과 유의한 DEG에서 공통되는 유전자를 선택하였다. 이들 유전자는 셀레늄 결합 단백질 1(SELENBP1) AT-훅 전사 인자(AKNA)이다. 상기 3개의 유전자 정보는 표 4와 같다.

Accession No.	Gene name	Gene description	log2fc	p -value	q-value	DEG
ENSG00000106948	AKNA	AT-hook transcription factor	2.51	19.3	2.516297262	UP
ENSG00000143416	SELENBP1	selenium binding protein 1	2.35	60.3	2.35546875	UP

상기 SELENBP1 유전자는 프로모터의 LCP 영역이 난소 자궁내막증에서 현저하게 과 메틸화되었으며 RNA 발현이 상향 조정되었으며, AKNA 유전자 역시 이와 같은 경향을 나타냄을 확인하였다.

<실험예5> AKNA 및 SELENBP1 유전자 발현 검증

다음으로 상기에서 선택한 SELENBP1 또는 AKNA 유전자가 난소 자궁내막증에서 발현 변화를 검증하고자 유전자 발현을 분석하였다. 자궁내막증 시료 6 개와 난소 낭종의 샘플 6 개로 qRT-PCR을 수행했습니다. 분석결과는 도 10과 같다.

분석결과, SELENBP1의 mRNA 수준은 정상대조군 그룹에 비해 대략 1.90 배 증가하였으며, AKNA의 mRNA 수준은 정상대조군 그룹에 비해 1.60배 증가하였다. SELENBP1 및 AKNA의 RNA 서열 분석에 의해 나타난 바와 같이 통계적으로 유의미하고 실제 난소 자궁내막증 시료에서 mRNA 발현이 증가하였다.

RNA 시퀀싱 데이터의 분석에서, RNA 발현은 정상대조군 그룹에 비해 SELENBP1 유전자에서 2.35 배 증가하였으며, AKNA 유전자는 2.51 배 증가하였다.

또한 상기 유전자의 단백질 발현 수준 및 발현 위치(localization)를 확인하고자, 시퀀싱 분석과 동일한 샘플을 이용하여 웨스턴 블롯팅 및 면역조직 화학을 수행하였다. 웨스턴 블롯팅의 단백질 발현이 도 11과 같다. SELENBP1의 발현은 대조군 난소 샘플 0.70 ± 0.52과 비교하여 자궁내막증 환자군에서 1.03 ± 0.56로 증가하는 경향을 보였다. AKNA의 발현은 정상대조군의 0.64 ± 0.22에 비해 자궁내막증 환자에서 0.66 ± 0.34로 약간 증가하였다. 도 12에 표시된 면역학 데이터 h-점수는 h-점수의 평균(0), 약한(1), 중간 (2) 또는 강한(3)으로 표시되었다. SELENBP1과 AKNA 단백질의 평균 h-점수는 정상대조군의 1.3 ± 1.26, 1.65 ± 0.65에 비해 각각 1.8 ± 0.89, 1.84 ± 0.64로 증가하였다.

<110> Soonchunhyang University Industry Academy Cooperation Foundation <120> Endometriosis diagnostic composition and method using the same <130> DP20200011 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SELENBP1 forward primer <400> 1 atcaccgaca tcctgctctc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SELENBP1 reverse primer <400> 2 ccgttttccc ttgaccacta 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AKNA forward primer <400> 3 gagccaggtc ttcctcagtg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AKNA reverse primer <400> 4 tggtattcgt ggcctgtgta 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 5 ctgagctgaa cgggaagctc 20 <210> 6 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 6 aaaggtggag tgggt 15

Claims (6)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 자궁내막증 의심개체에서 분리된 생물학적 시료에서 셀레늄 결합 단백질 1(SELENBP1) 또는 AT-hook 전사 인자(AKNA) 단백질 발현 수준 또는 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계;
   상기 측정된 단백질의 발현 수준 또는 mRNA 발현 수준을 정상 대조구 시료와 비교하는 단계 및
   측정된 상기 단백질의 발현 수준 또는 mRNA 발현 수준이, 정상 대조군 시료의 단백질의 발현 수준 또는 mRNA 발현 수준보다 높은 경우 자궁내막증으로 판단하는 단계를 포함하는, 자궁내막증 진단을 위한 정보의 제공방법.
6. 삭제

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