KR20230030228A - 암의 진단용 조성물 - Google Patents

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KR20230030228A
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Abstract

본 발명은 암을 진단할 수 있는 조성물, 이를 포함하는 진단용 키트 및 상기 조성물을 이용하여 암의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

Description

암의 진단용 조성물{A Composition for Diagnosing Cancer}
본 발명은 암을 진단할 수 있는 조성물, 이를 포함하는 진단용 키트 및 상기 조성물을 이용하여 암의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
전 세계에서 유방암은 폐암에 이어 두 번째로 흔히 발생되는 암이며, 사망률은 5위에 해당하는 위험한 암이다. 특히 최근에는 저출산, 짧은 수유기간, 이른 초경, 늦은 폐경 등 생리적으로 왕성한 신체적 변화를 겪는 시기의 여성들에서는 여성호르몬의 자극을 받는 횟수의 급격한 증가로 인한 유선조직의 민감도 증가, 식생활의 서구화, 생활환경의 오염 등의 이유로 유방암 발생이 급격하게 증가하고 있다. 유방암의 경우 일단 암세포가 주변 조직에 침범하거나 림프절로 전이가 시작되면 완치가 어렵기 때문에 조기 발견이 다른 암보다 더 중요하다고 할 수 있다.
유방암으로 인한 사망률을 줄이기 위해서는 첫째, 유방암을 조기 진단하고, 둘째, 일차 수술에 의한 치료 이후 예후를 진단하여 적절한 부가 치료 (Adjuvant therapy)를 하는 것이 중요하다. 현재 유방암 진단에는 1차 촉진에 의한 자가 진단 외에, 유방 X-선 조영술, 초음파검사법 등이 예방차원에서의 검진방법으로 사용되고 있으며 이 방법은 초기의 유방암을 진단하는 데에도 가장 널리 사용되는 방법이다. 그러나 유방 X-선 조영술은 우리나라 여성들에서 흔히 발견되는 조밀유방일 경우 섬유질이 많아서, 진단율이 떨어지는 단점이 있으며, 특히 젊은 여성같이 유선이 많이 발달되어 있어도 진단율이 떨어진다. 또한, X-선을 사용하기 때문에 진단 과정에서 오히려 유방암이 생길 가능성도 배제할 수 없다. 그래서 대안으로 초음파검사법이 사용되고 있지만 이 역시 악성종양(cancer)과 양성종양(non-cancer)을 구별하기는 쉽지 않다. 실제 임상에서는 이상 소견이 있으면 세침흡입세포검사법, 자기공명촬영법 등을 부가적으로 사용하여 진단율을 높이고 있다. 그러나 이 방법들을 사용하더라도 정상조직과 비 정상조직을 형태상으로 구분할 뿐 악성종양(cancer)과 양성종양(non-cancer)을 구분하기가 쉽지 않기 때문에 확진을 위해서는 더욱 정밀한 조직검사를 하게 된다. 이와 같은 이유들로 인해 유방암은 다른 암에 비해 비교적 분자 유전학적인 방법으로 유방암을 진단하는 방법이 발달되어 있다.
본 발명과 관련해, 유전자 또는 단백질의 발현과 유방암과의 관계를 좀 더 빠르고 확실하게 탐지하여 진단하기 위한 시도가 다양하게 이루어지고 있다.
본 발명의 일 목적은 암 중에서도 특히 유방암을 정확하고 간편하게 진단할 수 있는 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 암 중에서도 특히 유방암을 정확하고 간편하게 진단할 수 있는 키트를 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 중에서도 특히 유방암을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 중에서도 특히 유방암의 치료 반응성을 예측하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 중에서도 특히 유방암의 예후를 예측하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 중에서도 특히 유방암의 병기를 예측하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 중에서도 특히 유방암의 재발 가능성을 예측하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 중에서도 특히 유방암을 치료하기 위한 약물을 스크리닝하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 중에서도 특히 유방암을 진단하기 위한 진단 장치를 제공하고자 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 서열번호 2, 4, 6, 8, 9 및 11로 표시되는 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 둘 이상의 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 암의 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 서열번호 2, 4, 6, 8, 9 및 11로 표시되는 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 셋 이상의 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하며, 보다 구체적으로는 넷 이상의 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하고, 보다 더 구체적으로는 다섯 이상의 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하며, 가장 구체적으로는 서열번호 2, 4, 6, 8, 9 및 11로 표시되는 폴리펩티드 모두 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함한다.
본 발명에서, 상기 암은 유방암, 난소암, 대장암, 위암, 간암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종인, 암의 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 본 발명의 폴리펩티드의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩티드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 암의 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 암의 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 암의 진단용 조성물을 포함하는 암의 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트인, 암의 진단용 키트 일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 상기 본 발명의 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 암의 진단을 위한 정보 제공 방법일 수 있다.
본 발명에서 상기 "생물학적 시료" 내지 "시료"는 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 복수(ascites), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 또는 뇌척수액(cerebrospinal fluid)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 본 발명의 폴리펩티드의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩티드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함 할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 발현 수준의 측정은 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 또는 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay)에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 폴리펩티드의 발현 수준의 측정은 다중 반응 모니터링 (multiple reaction monitoring; MRM) 방법에 의하는, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법일 수 있다.
본 발명에서 본 발명의 상기 서열번호 2로 표시되는 폴리펩티드의 타겟 펩티드의 서열번호 2의 어미이온의 질량 대 전하비는 443.753 m/z일 수 있고, 딸이온의 질량 대 전하비는 672.367515, 558.324588, 461.271824, 333.213246, 234.144832 m/z일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 서열번호 4로 표시되는 폴리펩티드의 타겟 펩티드의 서열번호 4의 어미이온의 질량 대 전하비는 395.216 m/z일 수 있고, 딸이온의 질량 대 전하비는 718.3883, 605.3042, 476.2616, 419.2401 및 272.1717 m/z일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 서열번호 6으로 표시되는 폴리펩티드의 타겟 펩티드의 서열번호 6의 어미이온의 질량 대 전하비는 336.607 m/z일 수 있고, 딸이온의 질량 대 전하비는 447.235, 403.719, 360.203, 286.669, 218.139 및 144.605 m/z일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 서열번호 8로 표시되는 폴리펩티드의 타겟 펩티드의 서열번호 8의 어미이온의 질량 대 전하비는 461.753 m/z일 수 있고, 딸이온의 질량 대 전하비는 823.4308, 660.3675, 559.3198, 345.2245 및 232.1404 m/z일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 서열번호 9로 표시되는 폴리펩티드의 타겟 펩티드의 서열번호 9의 어미이온의 질량 대 전하비는 345.7053 m/z일 수 있고, 딸이온의 질량 대 전하비는 589.3556, 488.3079, 및 260.1969 m/z일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 서열번호 11로 표시되는 폴리펩티드의 타겟 펩티드의 서열번호 2의 어미이온의 질량 대 전하비는 455.7113 m/z일 수 있고, 딸이온의 질량 대 전하비는 634.3042, 535.2358, 420.2089, 333.1769 및 276.1554 m/z일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 모니터링 방법 시 내부 표준 물질은 타겟 펩티드를 구성하는 특정 아미노산을 동위원소로 치환한 합성 펩티드 또는 대장균 베타 갈락토시다아제를 사용하는, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법일 수 있다.
본 발명에서 상기 대장균 베타 갈락토시다아제의 타겟 펩티드는 서열번호 12로 표시되는 폴리펩티드로 이루어지며 어미이온과 딸이온은 각각 542.3 m/z 와 636.3 m/z일 수 있다.
본 발명에서 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현 수준의 측정은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩에 의하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 서열번호 2, 4, 6, 8, 9 및 11로 표시되는 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 둘 이상의 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 증가한 경우, 상기 암의 발병 가능성이 높은 것으로 예측하는 단계를 포함하는 암의 진단을 위한 정보 제공 방법일 수 있다.
본 발명에서 상기 정보 제공 방법은 목적하는 개체가 외과적 수술 후 예후를 예측하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 정보 제공 방법은 상기 목적하는 개체의 암의 병기를 진단하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 정보 제공 방법은 상기 목적하는 개체의 암의 재발 가능성을 예측하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 암은 유방암, 난소암, 대장암, 위암, 간암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, (a) 암 개체로부터 분리한 시료 또는 암 질환 동물 모델에 후보 약제를 처리하는 단계; 및 (b) 상기 후보 약제가 처리된 시료 또는 암 질환 동물 모델에서 서열번호 2, 4, 6, 8, 9 및 11로 표시되는 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 둘 이상의 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약물을 스크리닝하는 방법에 관한 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 시료는 암 개체로부터 분리된 세포 또는 조직일 수 있다.
본 발명에서 (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 상기 서열번호 2로 표시되는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 후보 약제가 처리되기 전에 비하여 증가하거나 감소한 경우 상기 후보 약제를 암의 예방 또는 치료용 약제로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 암은 유방암, 난소암, 대장암, 위암, 간암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 환자로부터 수득된 시료를 포함하는 시료부, 상기 시료에 포함된 시료에서 서열번호 2, 4, 6, 8, 9 및 11로 표시되는 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 둘 이상의 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자를 검출하는 검출부; 및 상기 검출부로부터 수득된 환자의 상기 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준과 정상인의 수준을 비교하는 비교부를 포함하고, 상기 비교부를 통해서 얻는 결과에 따라 암을 진단하는, 진단 장치 일 수 있다.
본 발명에서, 상기 비교부에서 상기 서열번호 2, 4, 6, 8, 9 및 11로 표시되는 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 둘 이상의 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자가 검출된 경우 유방암으로 진단하는, 진단 장치일 수 있다.
본 발명의 서열번호 2, 4, 6, 8, 9 및 11로 표시되는 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 둘 이상의 폴리펩티드를 포함하는 바이오마커를 사용하는 경우, 암, 특히는 유방암을 조기에 간편하고 정확하게 진단할 수 있으며, 더 나아가서는 암의 병기를 진단할 수 있고, 치료 반응성 또는 치료 후 예후를 예측할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에서 유방암 환자, 양성 종양 환자 및 비 환자 대조군 사이에 맘마글로빈 A(Mammaglobin-A) 발현량의 차이를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예 2에서 유방암 환자와 비 환자 대조군 사이에 매트릭스 메탈로프로테이나제-11(matrix metalloproteinase-11; MMP-11) 발현량의 차이를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실시예 3에서 유방암 환자와 비 환자 대조군 사이에 서열번호 6으로 표시되는 폴리펩티드의 타겟 펩티드를 이용한 Neurogenic locus notch homolog protein 1(NOTCH 1)의 바이오마커의 정량 결과를 바탕으로 한 수용자-조작 특성(ROC) 그래프를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 실시예 4에서 방암 환자, 양성 종양 환자 및 비 환자 정상 대조군 사이에 서열번호 8을 사용한 다중면역글로불린수용체(polymeric immunoglobulin receptor; PIGR) 발현량의 차이를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실시예 4에서 유방암 환자 및 비 환자 정상 대조군 사이에 서열번호 9를 사용한 다중면역글로불린수용체(polymeric immunoglobulin receptor; PIGR) 발현량의 차이를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6는 본 발명의 실시예 5에서 유방암 환자, 양성 종양 환자 및 비 환자 대조군 사이에 Proto-oncogene Wnt-1 발현량의 차이를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 서열번호 2, 4, 6, 8, 9 및 11로 표시되는 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 둘 이상의 폴리펩티드를; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 암의 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 폴리펩티드의 발현 수준을 측정하는 제제는 맘마글로빈 A(Mammaglobin-A), 메탈로프로테이나제-11(Stromelysin-3, matrix metalloproteinase-11; MMP-11), NOTCH 1(Neurogenic locus notch homolog protein 1), 다중면역글로불린수용체(polymeric immunoglobulin receptor; PIGR) 또는 Proto-oncogene Wnt-1의 발현 수준을 측정하는 제제일 수 있다.
맘마글로빈 A(Mammaglobin-A, MGB1)는 10 kDa 당단백질을 암호화하는 11번 염색체 상(11q13)에 있는 유테로글루빈 유전자 패밀리의 유방-특이적 유전자인 SCGB2A2에서 발현되는 단백질이다. 맘마글로빈 A(Mammaglobin-A)는 유방 상피 및 유방암 조직에서 과발현하는 것이 알려져 있어 유방암에 대한 분자적 마커로 주목받고 있다. 또한, 유방암 세포 표면에 존재함에 따라 유방암 조직으로의 표적 약물(targeted-drug)의 전달을 위한 유용한 분자적 마커로 제안되고 있다.
본 발명에서 상기 맘마글로빈 A(Mammaglobin-A)는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 MMP-11은 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP) 패밀리의 단백질로, 배아 발달, 생식 및 조직 리모델링과 같은 정상적인 생리 학적 과정뿐만 아니라 관절염 및 암 전이와 같은 질병 과정에서 세포 외 기질의 분해에 관여한다. 대부분의 MMP는 세포 외 프로테이나아제에 의해 절단될 때 활성화되는 불활성 전구단백질로서 분비된다. 그러나, 이 유전자에 의해 암호화된 효소는 구성 분비 경로 내에서 푸린에 의해 세포 내에서 활성화된다. 또한 다른 MMP와는 달리, 이 효소는 알파 1-단백 분해 효소 억제제를 절단하지만 세포 외 기질의 구조 단백질을 약하게 분해한다.
본 발명에서 상기 매트릭스 메탈로프로테이나제-11(matrix metalloproteinase-11; MMP-11)은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
Notch 1 막 횡단 단백질 패밀리의 구성원은 다중 표피 성장 인자-유사 (EGF) 반복으로 구성된 세포 외 도메인 및 다수의 상이한 도메인 유형으로 구성된 세포 내 도메인을 포함하는 구조적 특성을 공유한다. NOTCH 패밀리는 세포 운명 결정을 제어하여 다양한 발생 과정을 조절한다 NOTCH 신호 전달 네트워크는 물리적으로 인접한 세포 사이의 상호 작용을 조절하는 진화적으로 보존된 세포 간 신호 전달 경로이다.
본 발명에서 상기 Neurogenic locus notch homolog protein 1(NOTCH 1)은 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
PIGR 유전자는 점막상피세포막에 특이적으로 발현하여 N말단을 세포외영역으로 하는 I막형 단백질이다. 구조상, 세포외영역은 5개의 면역글로불린유사 영역이 있기 때문에 면역글로불린상과의 하나로 가해지고 있다. 분비성분(SC)은 이 세포외영역에 상당한다. 이 세포외영역은 J사슬을 보유하는 중합체 IgA, IgM와 접촉하면 그것과 결합한다. 이 결합은 α사슬 또는 μ사슬와의 결합으로 J사슬와의 직접적인 결합은 아니다.
결합의 초기단계는 비공유결합이지만 최종적으로는 2황화 교환반응을 매개하여 견고한 2황화결합을 유도한다. pIgR은 점막상피세포내에서 생산한 후 바로 점막상피세포 기저막면에 발현하지만 바로 피복소포로서 재차 세포내에 이입하여 세포내소포의 형태로 세포내를 통과하여 대극의 점막외측의 막면에 발현하며, 이어서 세포외에 노출한 세포외영역부는 막직상에서 효소분해하여 점막외에 방출하는 대사경로를 갖는다.
본 발명에서 상기 다중면역글로불린수용체(polymeric immunoglobulin receptor; PIGR)은 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
WNT1 유전자는 WNT 유전자 패밀리의 하나로, 분비된 신호 전달 단백질을 암호화하는 구조적으로 관련된 유전자로 구성된다. 이들 단백질은 발암 동안 및 세포 발달의 조절 패턴을 비롯한 여러 발달 과정에서 암 발생에 연루되어있다. 이 유전자는 진화적으로 매우 보존되며, 이 유전자에 의해 코딩된 단백질은 아미노산 수준에서 마우스 Wnt1 단백질과 98 % 동일한 것으로 알려져있다. 마우스에서의 연구는 Wnt1 단백질이 중뇌 및 소뇌의 유도에서 기능한다는 것을 나타낸다.
본 발명에서 상기 Proto-oncogene Wnt-1은 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 진단의 대상이 되는 질환으로 상기 "암"은 포유류에서 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장으로 특징지어진 생리적 상태를 나타내거나 가리킨다. 본 발명에서 진단의 대상이 되는 암은 유방암, 난소암, 대장암, 위암, 간암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종일 수 있으나, 바람직하게는 유방암일 수 있다.
본 발명에서 상기 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 대상(subject)의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 대상이 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 대상의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함한다. 본 발명의 목적상, 상기 진단은 상기한 암의 발병 여부 또는 발병 가능성(위험성)을 확인하는 것이다.
본 발명에서 본 발명의 폴리펩티드의 발현 수준을 측정하는 제제는 특별히 제한하지는 않으나, 예를 들면 상기 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩티드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에 상기 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질을 가리킨다. 본 발명의 목적상, 항체는 서열번호 2로 표시되는 폴리펩티드에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다.
본 발명의 상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 상기 항체는 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 다클론 항체는 상기 단백질의 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 과정을 포함하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물로부터 제조될 수 있다. 또한, 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method; Kohler 및 Milstein (1976) European Journal of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리 기술(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991 참조)을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전장의 경쇄 및 2개의 전장의 중쇄를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
본 발명에 상기 "PNA(Peptide Nucleic Acid)"는 인공적으로 합성된, DNA 또는 RNA와 비슷한 중합체를 가리키며, 1991년 덴마크 코펜하겐 대학교의 Nielsen, Egholm, Berg와 Buchardt 교수에 의해 처음으로 소개되었다. DNA는 인산-리보스당 골격을 갖는데 반해, PNA는 펩티드 결합에 의해 연결된 반복된 N-(2-아미노에틸)-글리신 골격을 가지며, 이로 인해 DNA 또는 RNA에 대한 결합력과 안정성이 크게 증가되어 분자 생물학, 진단 분석 및 안티센스 치료법에 사용되고 있다. PNA는 문헌[Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O (December 1991). "Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide". Science 254(5037): 1497-1500]에 상세하게 개시되어 있다.
본 발명에서 상기 "앱타머"는 올리고핵산 또는 펩티드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 문헌[Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R. "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24): 142727(1998)]에 상세하게 개시되어 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 "프라이머"는 표적 유전자 서열을 인지하는 단편으로서, 정방향 및 역방향의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료 내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성이 부여될 수 있다.
본 발명에서 상기 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, RNA 또는 DNA일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함하는 것으로, 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩티드 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 "LNA(Locked nucleic acids)"란, 2'-O, 4'-C 메틸렌 브릿지를 포함하는 핵산 아날로그를 의미한다 [J Weiler, J Hunziker and J Hall Gene Therapy (2006) 13, 496.502]. LNA 뉴클레오사이드는 DNA와 RNA의 일반적 핵산 염기를 포함하며, Watson-Crick 염기 쌍 규칙에 따라 염기 쌍을 형성할 수 있다. 하지만, 메틸렌 브릿지로 인한 분자의 'locking'으로 인해, LNA는 Watson-Crick 결합에서 이상적 형상을 형성하지 못하게 된다. LNA가 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드에 포함되면, LNA는 보다 빠르게 상보적 뉴클레오티드 사슬과 쌍을 이루어 이중 나선의 안정성을 높일 수 있다. 본 발명에서 상기 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 의미한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드의 아미노산 서열 정보는 서열번호 2, 4, 6, 8, 9 및 11로 각각 표시되므로, 당업자라면 이를 바탕으로 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 용이하게 디자인할 수 있을 것이다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에 따른 암의 진단용 조성물을 포함하는 암의 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명에서는 상기 진단용 키트를 이용하여 암 질환의 발병 여부, 발병 가능성, 치료 반응성, 예후, 병기, 재발 가능성 등을 진단할 수 있다.
본 발명에서 상기 진단의 대상이 되는 상기 암에 관한 기재는 앞서 기재된 바와 중복되어 명세서의 과도한 복잡을 피하기 위하여 이하 그 자세한 기재를 생략한다.
본 발명에서 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 암의 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 발명에서 상기 암의 진단용 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 더 포함할 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 단백질을 코딩하는 유전자에 대해 특이적인 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 상기 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오티드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp의 길이를 가질 수 있다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 용기, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 진단용 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표지 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 진단용 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대해 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 진단용 키트에서 항원-항체 결합반응을 위한 고정체로는 니트로셀룰로오즈 막, PVDF 막, 폴리비닐(polyvinyl) 수지 또는 폴리스티렌(polystyrene) 수지로 합성된 웰 플레이트(Well plate), 유리로 된 슬라이드 글래스 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 진단용 키트에서 2차 항체의 표지체는 발색 반응을 하는 통상의 발색제가 바람직하며, HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(coloid gold), FITC(폴리 L-라이신-플루오르세인 아이소티오시아네이트), RITC(로다민-B-아이소티오시아네이트) 등의 형광물질(fluorescein) 및 색소(dye) 등의 표지체가 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 진단용 키트에서 발색을 유도하기 위한 발색 기질은 발색 반응을 하는 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, TMB(3,3',5,5'-테트라메틸 베지딘), ABTS[2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)], OPD(o-페닐렌다이아민) 등을 사용할 수 있다. 이때, 발색기질은 완충용액(0.1 M NaAc, pH 5.5)에 용해된 상태로 제공되는 것이 더욱 바람직하다. TMB와 같은 발색기질은 이차항체 접합체의 표지체로 사용된 HRP에 의해 분해되어 발색 침적체를 생성하고, 이 발색 침적체의 침적 정도를 육안으로 확인함으로써 상기 마커 단백질들의 존재 유무를 검출한다.
본 발명의 진단용 키트에서 세척액은 인산염 완충용액, NaCl 및 트윈 20(Tween 20)을 포함하는 것이 바람직하며, 0.02 M 인산염 완충용액, 0.13 M NaCl, 및 0.05% 트윈 20으로 구성된 완충용액(PBST)이 더욱 바람직하다. 세척액은 항원-항체 결합반응 후 항원-항체 결합체에 2차 항체를 반응시킨 다음 적당량을 고정체에 첨가하여 3 내지 6회 세척한다. 반응 정지용액은 황산 용액(H2SO4)이 바람직하게 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 서열번호 2, 4, 6, 8, 9 및 11로 표시되는 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 둘 이상의 폴리펩티드를; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 암의 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 "목적하는 개체"란, 상기 암의 발병 여부가 불확실한 개체로, 발병 가능성이 높은 개체를 의미한다.
본 발명에서 상기 "생물학적 시료"는 개체로부터 얻어지거나 개체로부터 유래된 임의의 물질, 생물학적 체액, 조직 또는 세포를 의미하는 것으로, 예를 들면, 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 복수(ascites), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 또는 뇌척수액(cerebrospinal fluid)을 포함할 수 있지만, 바람직하게는 발병 가능성이 높은 환자의 피부를 절개하지 않고 중공침 등을 생체 내 기관에 자입하여 병리조직학적 검사용으로 채취한 액체 생검(예를 들면, 환자의 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 객담 또는 복수(ascites) 등)일 수 있다.
본 발명에서는 상기와 같이 분리된 생물학적 시료에서 서열번호 2, 4, 6, 8, 9 및 11로 표시되는 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 둘 이상의 폴리펩티드를 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 발현 수준을 측정하는 단계는 맘마글로빈 A(Mammaglobin-A), 메탈로프로테이나제-11(matrix metalloproteinase-11; MMP-11), NOTCH 1(Neurogenic locus notch homolog protein 1), 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계일 수 있다.
본 발명에서 본 발명의 폴리펩티드의 발현 수준을 측정하는 제제는 특별히 제한하지는 않으나, 예를 들면 상기 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩티드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에 상기 폴리펩티드의 발현 수준을 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 본 발명의 폴리펩티드의 발현 수준을 측정 또는 비교 분석 방법으로는 다중 반응 모니터링 (multiple reaction monitoring; MRM) 방법에 의할 수 있다.
본 발명에서 상기 다중 반응 모니터링 방법은 질량분석기 (mass-spectrometry), 바람직하게는 삼중 사극자 질량분석기 (triple quadrupole mass-spectrometry)를 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명에서 질량분석기 (mass-spectrometry)를 이용한 다중 반응 모니터링 (multiple reaction monitoring; MRM) 방법은 특정 분석물질을 선택적으로 분리하여 검출하고 정량하여 그 농도변화를 모니터링할 수 있는 분석기술이다. MRM은 생체 시료 중에 존재하는 미량의 바이오마커와 같은 물질을 정량적으로 정확하게 다중 측정할 수 있는 방법으로 제1 질량필터 (Q1)를 이용하여 이온화원에서 생성된 이온 단편들 중 어미이온을 선택적으로 충돌관으로 전달한다. 이어 충돌관에 도달한 어미이온은 내부 충돌기체와 충돌하여, 쪼개져 딸이온을 생성하여 제2 질량 필터 (Q2)로 보내지고, 여기서 특징적인 이온만이 검출부로 전달된다. 이런 방식으로 목적하는 성분의 정보만을 검출할 수 있는 선택성 및 민감도가 높은 분석방법이다. MRM은 작은 분자의 정량분석에 활용되어 특정 유전병을 진단하는데 쓰이고 있다. MRM 방법은 다수의 펩티드를 동시에 측정하기에 용이하며, 항체가 없이 정상인과 암환자 사이에서 단백질 진단 마커 후보들의 상대적 농도차를 확인할 수 있다는 장점이 있다. 또한 민감도와 선택성이 탁월하여 특히, 질량분석기를 이용한 프로테옴 분석에서 혈액 내에 있는 복잡한 단백질과 펩티드의 분석을 위해 MRM 분석방법이 도입되고 있다(Anderson L. et al., Mol CellProteomics, 5: 375-88, 2006; DeSouza, L. V. et al., Anal. Chem., 81: 3462-70, 2009).
본 발명에서 상기 다중 반응 모니터링 방법에 의해 본 발명의 폴리펩티드의 발현 수준의 측정을 할 수 있다.
본 발명에서 상기 다중 반응 모니터링 방법에 의해 본 발명의 폴리펩티드의 발현 수준을 분석하기 위하여, 상기 선정된 타겟 펩티드에서의 어미이온/딸이온 쌍을 선정할 수 있고, 이때 어미이온/딸이온 쌍의 정보는 하기 표 3 내지 7에 나타낸 바와 같으나, 이에 제한되는 것은 아니다
본 발명에서는 상기 본 발명의 펩타이드를 검출하기 위하여, 상기한 각각의 단백질의 타겟 펩티드 중 일부 아미노산이 안정한 동위원소로 치환된 펩티드를 합성하고, 다중 반응 모니터링 분석 시 내부 표준 물질로 사용하면 상기 단백질의 혈액 내 절대량도 측정할 수 있어 분석의 정확도를 더욱 높일 수 있다.
본 발명에 있어서 내부 표준 물질은 상기 다중 반응 모니터링 분석 시 일반적으로 사용되는 임의의 내부 표준 물질이 사용될 수 있으나, 예를 들어, 대장균 베타 갈락토시다아제가 사용될 수 있다. 대장균 베타 갈락토시다아제를 대표하는 타겟 펩티드는 서열번호 3으로 표시되는 폴리펩티드로 이루어지며 어미이온과 딸이온은 각각 542.3 m/z 와 636.3 m/z 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 맘마글로빈 A(Mammaglobin-A), 메탈로프로테이나제-11(matrix metalloproteinase-11; MMP-11), NOTCH 1(Neurogenic locus notch homolog protein 1), 다중면역글로불린수용체(polymeric immunoglobulin receptor; PIGR) 또는 Proto-oncogene Wnt-1의 혈액 내 절대량을 측정하기 위하여 타겟 펩티드의 일부 아미노산이 안정한 동위원소로 치환된 특정 펩티드를 내부 표준물질로서 합성하는 경우, 동위 원소로 치환된 아미노산은 리신(Lysine)이나 아르기닌(Arginine)이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 여기서 합성된 펩티드는 95% 이상 순수 분리된 펩티드를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정하는 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 본 발명의 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 증가하거나 감소한 경우, 상기 암의 발병 가능성이 높은 것으로 예측할 수 있다.
본 발명에서 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 서열번호 2, 4, 6, 8, 9 및 11로 표시되는 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 둘 이상의 폴리펩티드를 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하여 치료 반응성, 바람직하게는 화학적 항암 치료 또는 면역 치료에 대한 반응성을 예측할 수 있다.
본 발명에서 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 본 발명의 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하여 상기 개체의 예후, 바람직하게는 외과적 수술 후 예후를 예측할 수 있다. 여기서 상기 목적하는 개체는 암이 발병하여 외과적 절제 수술을 받은 개체일 수 있다.
본 발명에서 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 본 발명의 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하여 상기 개체에서 암의 병기를 예측할 수 있다.
본 발명에서 상기 "병기(stage)"란 암세포가 퍼진 정도, 암의 진행 단계를 의미하는 것으로, 암의 진행상황에 따른 국제적분류는 일반적으로 TNM 병기 분류에 따른다. 여기서 'T(Tumor Size)'는 원발 종양의 크기에 따른 분류이고, 'N(Lymph Node)'은 림프절 전이 정도에 따른 분류이며, 'M(Metastasis)'은 다른 장기로의 전이 여부에 따른 분류에 해당한다. T, N, M에 있어서 상세 분류는 하기 표 1과 같으며 이에 따른 암의 병기 분류는 하기 표 2과 같다.
TNM 병기 정의
원발 종양의 크기
(T 병기)
Size of the primary tumor
(T stage)		 T0 종양세포의 형태가 악성종양의 모습을 보이나 발생한 점막 또는 상피에 국한돼 있고 아직 기저막을 침윤하지 않은 종양
T1 원발된 장기에 제한된 병변, 종양이 가동성이 있으며 인접 및 주위조직에 침범이 없음
T2 종양의 크기가 2~5cm 정도
T3 종양의 크기가 T2 보다 크나 장기 내에 국한됨
T4 주변 조직과 유착 및 침윤한 상태
림프절 전이 여부
(N 병기)
Lymph node status
(N stage)		 N0 림프절 병변의 증거가 없음
N1 촉지되고 가동성이 있으며 첫 번째 위치에 제한되어 있는 림프절(1~2cm 이상, 보통 3cm까지의 크기) 하나에 침범
N2 촉지되고 부분적으로 가동성이 있는 또는 단단하거나 딱딱한 림프절, 현미경적으로 침범의 증거가 있고 임상적으로 서로 엉켜있으며 반대측 또는 양측에서 나타남(3~5cm)
N3 완전히 고정되어 있고 피막을 통과해 뼈나 큰 혈관, 피부, 신경 등에 완전히 고정되어 있으며 6cm 이상의 크기
원격전이 여부
(M 병기)
Distant metastasis
(M stage)		 M0 원격전이가 없음
M1 원격전이가 있음
병기분류 T1 T2 T3 T4
N0 1기 2기
N1 3기
N2
N3
M1 4기
본 발명에서 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 본 발명의 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하여 암의 재발 가능성을 예측할 수 있다. 본 발명에서 상기 암에 관한 기재는 앞서 기재된 바와 중복되어 명세서의 과도한 복잡을 피하기 위하여 이하 그 자세한 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, (a) 암 개체로부터 분리한 시료 또는 암 질환 동물 모델에 후보 약제를 처리하는 단계; 및
(b) 상기 후보 약제가 처리된 시료 또는 암 질환 동물 모델에서 서열번호 2, 4, 6, 8, 9 및 11로 표시되는 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 둘 이상의 폴리펩티드를 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 시료 및 상기 암에 관한 기재는 앞서 기재된 바와 중복되어 명세서의 과도한 복잡을 피하기 위하여 이하 그 자세한 기재를 생략한다.
본 발명에서 이들 생물학적 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 암의 예방 또는 치료용 후보 약제와 반응시킬 수 있다.
본 발명에 상기 "암 질환 동물 모델"이란 인간을 제외한 동물로서, 암의 병리학적 상태에 있다고 통상의 기술자가 판단할 수 있는 상태에 있는 동물을 의미한다.
본 발명에서는 상기 암 개체로부터 분리한 시료 또는 암 질환 동물 모델에 후보 약제를 처리하기에 앞서, 본 발명의 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 수행할 수 있다.
본 발명에서의 용어 "후보 물질"은 암 환자에 적용하여 암에 의한 환자의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경할 수 있는 물질을 의미하며 본 발명의 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 감소시킬 수 있는 물질로, 저분자 화합물, 항체, 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA), 핵산, 단백질, 펩티드, 기타 추출물 또는 천연물을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않고 제한없이 포함될 수 있다.
본 발명에서 상기 후보 약제의 처리 전 또는 후에 있어서, 시료 또는 암 질환 동물 모델에서 서열번호 2로 표시되는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 방법 및 그에 사용되는 제제는 상기 암의 진단을 위한 정보 제공 방법에 기재된 바와 중복되어 이하 자세한 기재를 생략한다.
본 발명에서는, (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 서열번호 2로 표시되는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 후보 약제가 처리되기 전에 비하여 증가하거나 감소한 경우 상기 후보 약제를 암의 예방 또는 치료용 약제로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 환자로부터 수득된 시료를 포함하는 시료부, 상기 시료에 포함된 시료에서 본 발명의 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자를 검출하는 검출부; 및 상기 검출부로부터 수득된 환자의 상기 서열번호 2로 표시되는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준과 정상인의 수준을 비교하는 비교부를 포함하고, 상기 비교부를 통해서 얻는 결과에 따라 암을 진단하는, 진단 장치를 제공할 수 있다.
본 발명의 상기 비교부에서 서열번호 2, 4, 6, 8, 9 및 11로 표시되는 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 둘 이상의 폴리펩티드를 또는 이를 코딩하는 유전자가 검출된 경우 유방암으로 진단할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
[실시예 1] 맘마글로빈 A(Mammaglobin-A) 측정을 위한 타겟 펩티드의 검출
1. 시료의 준비
본 발명의 바이오마커 조합의 유방암 진단의 정확도를 확인하기 위하여, 유방암 환자 10명, 양성 종양 환자 10명 및 정상 대조군 10명으로부터 얻은 혈액 시료에서 혈장을 분리하고, Bradford assay를 통하여 총 단백질을 정량하였다. 이 중 총 단백질 200 ㎍을 우레아(urea)로 변형시킨 뒤 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT)로 환원시키고, 이오도아세트아미드(iodoacetamide)를 통해 알킬화 시켰다. 이후, 트립신을 넣어주어 펩티드화 시키고, C18 컬럼을 이용하여 염을 제거하였다. 내부표준물질로는 펩티드의 말단에 붙어있는 아미노산기가 동위원소로 치환된 합성품을 이용하였다.
2. 삼중 사극자 질량분석기(텐덤메스 질량분석기)를 이용한 다중 반응 모니터링 수행
삼중 사극자 질량분석을 위하여 본 발명의 맘마글로빈 A(Mammaglobin-A)의 타겟 펩티드와 어미이온과 딸이온 쌍을 선정하여 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다.
구분 유전자 명칭 단백질 명칭 uniprotKB 펩티드 서열 어미이온 딸이온
1 SCGB2A2 맘마글로빈 A Q13296 TINPQVSK (서열번호 2) 443.753 672.367515 2Y6
558.324588 2Y5
461.271824 2Y4
333.213246 2Y3
234.144832 2Y2
상기 1.에서 준비된 최종 시료를 역상 수지 크로마토그래피에 걸어 혈장 펩티드 절편을 분리하였고, 삼중 사극자 질량분석기(기기: 5500 Qtrap, AB Sciex, USA)를 사용해 각 펩티드의 MRM 스펙트럼을 얻었다. 이때, 역상 수지 크로마토그래피는 HALOTM C18 컬럼 (Eksigent, USA) 컬럼으로 45분간 5%~40%의 아세토니트릴 농도 구배를 이용하여 실시하였다. MultiQuantTM 컴퓨터 정량 분석 프로그램 (AB Sciex, USA)으로 타깃 펩티드의 MRM 크로마토그램의 피크 면적을 계산하여 정량 정보를 확인하였다. 이때 각 타깃 펩티드의 정량값은 내부 표준물질로 넣어준 대장균 베타 갈락토시다아제의 MRM 크로마토그램의 피크 면적에 대한 비율로 표시하였다.
3. 각 타겟 펩티드의 유방암 진단의 정확도 확인
도 1은 본 발명의 실시예 1에서 유방암 환자, 양성 종양 환자 및 비 환자 대조군 사이에 맘마글로빈 A(Mammaglobin-A) 발현량의 차이를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 1에서 보는 바와 같이, 유방암 환자는 양성종양 환자군 및 비 환자 대조군 사이에 맘마글로빈 A(Mammaglobin-A)의 단백질 발현량이 차이가 있었다.
이처럼 본 발명의 서열번호 2로 표시되는 타겟 펩티드를 이용한 맘마글로빈 A(Mammaglobin-A) 마커는 높은 정확도로 유방암을 진단할 수 있음을 알 수 있었다.
[실시예 2] 매트릭스 메탈로프로테이나제-11(matrix metalloproteinase-11; MMP-11) 측정을 위한 타겟 펩티드의 검출
1. 시료의 준비
129본 발명의 바이오마커 조합의 유방암 진단의 정확도를 확인하기 위하여, 유방암 환자 10명, 양성 종양 환자 10명 및 대조군 10으로부터 얻은 혈액 시료에서 혈장을 분리하고, Bradford assay를 통하여 총 단백질을 정량하였다. 이 중 총 단백질 200 ㎍을 우레아(urea)로 변형시킨 뒤 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT)로 환원시키고, 이오도아세트아미드(iodoacetamide)를 통해 알킬화 시켰다. 이후, 트립신을 넣어주어 펩티드화 시키고, C18 컬럼을 이용하여 염을 제거하였다. 내부표준물질로는 펩티드의 말단에 붙어있는 아미노산기가 동위원소로 치환된 합성품을 이용하였다.
2. 삼중 사극자 질량분석기(텐덤메스 질량분석기)를 이용한 다중 반응 모니터링 수행
삼중 사극자 질량분석을 위하여 본 발명의 매트릭스 메탈로프로테이나제-11(matrix metalloproteinase-11; MMP-11)의 타겟 펩티드와 어미이온과 딸이온 쌍을 선정하여 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다.
구분 유전자 명칭 단백질 명칭 uniprotKB 펩티드 서열 어미이온 딸이온
1 MMP11 Stromelysin-3
(MMP-11)		 P24347 ALEGFPR
(서열번호 4)		 395.216 718.3883 2Y6
605.3042 2Y5
476.2616 2Y4
419.2401 2Y3
272.1717 2Y2
상기 1.에서 준비된 최종 시료를 역상 수지 크로마토그래피에 걸어 혈장 펩티드 절편을 분리하였고, 삼중 사극자 질량분석기(기기: 5500 Qtrap, AB Sciex, USA)를 사용해 각 펩티드의 MRM 스펙트럼을 얻었다. 이때, 역상 수지 크로마토그래피는 HALOTM C18 컬럼 (Eksigent, USA) 컬럼으로 45분간 5%~40%의 아세토니트릴 농도 구배를 이용하여 실시하였다. MultiQuantTM 컴퓨터 정량 분석 프로그램 (AB Sciex, USA)으로 타깃 펩티드의 MRM 크로마토그램의 피크 면적을 계산하여 정량 정보를 확인하였다. 이때 각 타깃 펩티드의 정량값은 내부 표준물질로 넣어준 대장균 베타 갈락토시다아제의 MRM 크로마토그램의 피크 면적에 대한 비율로 표시하였다.
도 2는 본 발명의 실시예 1에서 유방암 환자, 양성 종양 환자 및 비 환자 대조군 사이에 매트릭스 메탈로프로테이나제-11(matrix metalloproteinase-11; MMP-11) 발현량의 차이를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2에서 보는 바와 같이, 유방암 환자, 양성 종양 환자 및 비 환자 대조군 사이에 매트릭스 메탈로프로테이나제-11(matrix metalloproteinase-11; MMP-11)의 단백질 발현량의 차이를 확인하였다.
이처럼 본 발명의 서열번호 4로 표시되는 타겟 펩티드를 이용한 매트릭스 메탈로프로테이나제-11(matrix metalloproteinase-11; MMP-11) 마커는 높은 정확도로 유방암을 진단할 수 있음을 알 수 있었다.
[실시예 3] Neurogenic locus notch homolog protein 1(NOTCH 1) 측정을 위한 타겟 펩티드의 검출
1. 시료의 준비
본 발명의 바이오마커 조합의 유방암 진단의 정확도를 확인하기 위하여, 유방암 환자들과 정상 대조군들로부터 얻은 혈액 시료에서 혈장을 분리하고, Bradford assay를 통하여 총 단백질을 정량하였다.
실험에 사용된 샘플은 암 환자 10명/ 양성 종양 환자 10명/ 정상 10명 이며, 양성 종양 환자도 정상으로 하여 악성 종양만을 더욱 분별 할 수 있도록 설계했다. 도출되는 ROC 커브는 하기와 같으며, AUC = 0.8875 이며(그림 1), 특히 특이도 100%에서 암환자 중 5명의 수치가 특이적으로 높아 확실한 암 선별성을 보이고 있음을 확인했다.
이 중 총 단백질 200 ㎍을 우레아(urea)로 변형시킨 뒤 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT)로 환원시키고, 이오도아세트아미드(iodoacetamide)를 통해 알킬화 시켰다. 이후, 트립신을 넣어주어 펩티드화 시키고, C18 컬럼을 이용하여 염을 제거하였다. 내부표준물질로는 펩티드의 말단에 붙어있는 아미노산기가 동위원소로 치환된 합성품을 이용하였다.
2. 삼중 사극자 질량분석기(텐덤메스 질량분석기)를 이용한 다중 반응 모니터링 수행
삼중 사극자 질량분석을 위하여 본 발명의 Neurogenic locus notch homolog protein 1(NOTCH 1)의 타겟 펩티드와 어미이온과 딸이온 쌍을 선정하여 그 결과는 하기 표 5에 나타내었다.
구분 유전자 명칭 단백질 명칭 uniprotKB 펩티드 서열 어미이온 딸이온
1 NOTCH Neurogenic locus notch homolog protein 1 P46531 NSSFHFLR
(서열번호 6)		 336.607 447.235 3y7+2
403.719 3y6+2
360.203 3y5+2
286.669 3y4+2
218.139 3y3+2
144.605 3y2+2
상기 1.에서 준비된 최종 시료를 역상 수지 크로마토그래피에 걸어 혈장 펩티드 절편을 분리하였고, 삼중 사극자 질량분석기(기기: 5500 Qtrap, AB Sciex, USA)를 사용해 각 펩티드의 MRM 스펙트럼을 얻었다. 이때, 역상 수지 크로마토그래피는 HALOTM C18 컬럼 (Eksigent, USA) 컬럼으로 45분간 5%~40%의 아세토니트릴 농도 구배를 이용하여 실시하였다. MultiQuantTM 컴퓨터 정량 분석 프로그램 (AB Sciex, USA)으로 타깃 펩티드의 MRM 크로마토그램의 피크 면적을 계산하여 정량 정보를 확인하였다. 이때 각 타깃 펩티드의 정량값은 내부 표준물질로 넣어준 대장균 베타 갈락토시다아제의 MRM 크로마토그램의 피크 면적에 대한 비율로 표시하였다.
3. 각 타겟 펩티드의 유방암 진단의 정확도 확인
상기 2.에서 확인된 Neurogenic locus notch homolog protein 1(NOTCH 1)의 서열번호 2에 대한 유방암 진단 효율을 확인하여, 도 1에 유방암 환자, 양성 종양 환자 및 비 환자 대조군에 대한 수용자-조작 특성(ROC) 그래프로 도시하였다.
도 3에서 보는 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 서열번호 6으로 표시되는 폴리펩티드의 타겟 펩티드를 이용한 경우 유방암 환자들과 정상 대조군들에 대한 수용자-조작 특성(ROC) 그래프로 도시한 결과 AUC(area under the curve) 값이 0.8875로 매우 높은 진단의 정확도를 보였다.
이처럼 본 발명의 서열번호 6으로 표시되는 타겟 펩티드를 이용한 Neurogenic locus notch homolog protein 1(NOTCH 1) 마커는 높은 정확도로 유방암을 진단할 수 있음을 알 수 있었다.
[실시예 4] 다중면역글로불린수용체(polymeric immunoglobulin receptor; PIGR) 측정을 위한 타겟 펩티드의 검출
1. 시료의 준비
본 발명의 바이오마커 조합의 유방암 진단의 정확도를 확인하기 위하여, 유방암 환자 10명, 양성 종양 환자 10명 및 정상 대조군 10명들로부터 얻은 혈액 시료에서 혈장을 분리하고, Bradford assay를 통하여 총 단백질을 정량하였다. 이 중 총 단백질 200 ㎍을 우레아(urea)로 변형시킨 뒤 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT)로 환원시키고, 이오도아세트아미드(iodoacetamide)를 통해 알킬화 시켰다. 이후, 트립신을 넣어주어 펩티드화 시키고, C18 컬럼을 이용하여 염을 제거하였다. 내부표준물질로는 펩티드의 말단에 붙어있는 아미노산기가 동위원소로 치환된 합성품을 이용하였다.
2. 삼중 사극자 질량분석기(텐덤메스 질량분석기)를 이용한 다중 반응 모니터링 수행
삼중 사극자 질량분석을 위하여 본 발명의 다중면역글로불린수용체(polymeric immunoglobulin receptor; PIGR)의 타겟 펩티드와 어미이온과 딸이온 쌍을 선정하여 그 결과는 하기 표 6에 나타내었다.
구분 유전자 명칭 단백질 명칭 uniprotKB 펩티드 서열 어미이온 딸이온
1 PIGR Polymeric immunoglobulin receptor P01833 VYTVDLGR
(서열번호 8)		 461.753 823.4308 2Y7
660.3675 2Y6
559.3198 2Y5
345.2245 2Y3
232.1404 2Y2
2 PIGR Polymeric immunoglobulin receptor P01833 TTVEIK
(서열번호 9)		 345.7053 589.3556 +2y5
488.3079 +2y4
260.1969 +2y2
상기 1.에서 준비된 최종 시료를 역상 수지 크로마토그래피에 걸어 혈장 펩티드 절편을 분리하였고, 삼중 사극자 질량분석기(기기: 5500 Qtrap, AB Sciex, USA)를 사용해 각 펩티드의 MRM 스펙트럼을 얻었다. 이때, 역상 수지 크로마토그래피는 HALOTM C18 컬럼 (Eksigent, USA) 컬럼으로 45분간 5%~40%의 아세토니트릴 농도 구배를 이용하여 실시하였다. MultiQuantTM 컴퓨터 정량 분석 프로그램 (AB Sciex, USA)으로 타깃 펩티드의 MRM 크로마토그램의 피크 면적을 계산하여 정량 정보를 확인하였다. 이때 각 타깃 펩티드의 정량값은 내부 표준물질로 넣어준 대장균 베타 갈락토시다아제의 MRM 크로마토그램의 피크 면적에 대한 비율로 표시하였다.
도 4는 본 발명의 실시예 4에서 유방암 환자, 양성 종양 환자 및 비 환자 정상 대조군 사이에 서열번호 8를 사용한 다중면역글로불린수용체(polymeric immunoglobulin receptor; PIGR) 발현량의 차이를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실시예 4에서 유방암 환자 및 비 환자 정상 대조군 사이에 서열번호 9를 사용한 다중면역글로불린수용체(polymeric immunoglobulin receptor; PIGR) 발현량의 차이를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4 및 도 5에서 보는 바와 같이, 유방암 환자와 비 환자 정상 대조군 사이에 서열번호 8 또는 서열번호 9를 사용한 다중면역글로불린수용체(polymeric immunoglobulin receptor; PIGR)의 단백질 발현량의 차이를 확인하였다.
이처럼 본 발명의 서열번호 8 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 타겟 펩티드를 이용한 다중면역글로불린수용체(polymeric immunoglobulin receptor; PIGR) 마커는 높은 정확도로 유방암을 진단할 수 있음을 알 수 있었다.
[실시예 5] Proto-oncogene Wnt-1 측정을 위한 타겟 펩티드의 검출
1. 시료의 준비
본 발명의 바이오마커 조합의 유방암 진단의 정확도를 확인하기 위하여, 유방암 환자들과 정상 대조군들로부터 얻은 혈액 시료에서 혈장을 분리하고, Bradford assay를 통하여 총 단백질을 정량하였다. 이 중 총 단백질 200 ㎍을 우레아(urea)로 변형시킨 뒤 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT)로 환원시키고, 이오도아세트아미드(iodoacetamide)를 통해 알킬화 시켰다. 이후, 트립신을 넣어주어 펩티드화 시키고, C18 컬럼을 이용하여 염을 제거하였다. 내부표준물질로는 펩티드의 말단에 붙어있는 아미노산기가 동위원소로 치환된 합성품을 이용하였다.
2. 삼중 사극자 질량분석기(텐덤메스 질량분석기)를 이용한 다중 반응 모니터링 수행
삼중 사극자 질량분석을 위하여 본 발명의 Proto-oncogene Wnt-1의 타겟 펩티드와 어미이온과 딸이온 쌍을 선정하여 그 결과는 하기 표 7에 나타내었다.
구분 유전자 명칭 단백질 명칭 uniprotKB 펩티드 서열 어미이온 딸이온
1 WNT1 WNT-1 P04628 EFVDSGEK (서열번호 11) 455.7113 634.3042 2Y6
535.2358 2Y5
420.2089 2Y4
333.1769 2Y3
276.1554 2Y2
상기 1.에서 준비된 최종 시료를 역상 수지 크로마토그래피에 걸어 혈장 펩티드 절편을 분리하였고, 삼중 사극자 질량분석기(기기: 5500 Qtrap, AB Sciex, USA)를 사용해 각 펩티드의 MRM 스펙트럼을 얻었다. 이때, 역상 수지 크로마토그래피는 HALOTM C18 컬럼 (Eksigent, USA) 컬럼으로 45분간 5%~40%의 아세토니트릴 농도 구배를 이용하여 실시하였다. MultiQuantTM 컴퓨터 정량 분석 프로그램 (AB Sciex, USA)으로 타깃 펩티드의 MRM 크로마토그램의 피크 면적을 계산하여 정량 정보를 확인하였다. 이때 각 타깃 펩티드의 정량값은 내부 표준물질로 넣어준 대장균 베타 갈락토시다아제의 MRM 크로마토그램의 피크 면적에 대한 비율로 표시하였다.
도 6은 본 발명의 실시예 5에서 유방암 환자와 비 환자 대조군 사이에 Proto-oncogene Wnt-1 발현량의 차이를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6에서 보는 바와 같이, 유방암 환자와 비 환자 대조군 사이에 Proto-oncogene Wnt-1의 단백질 발현량의 차이를 확인하였다.
이처럼 본 발명의 서열번호 11로 표시되는 타겟 펩티드를 이용한 Proto-oncogene Wnt-1 마커는 높은 정확도로 유방암을 진단할 수 있음을 알 수 있었다.
<110> BERTIS CO., LTD. <120> A Composition for Diagnosing Cancer <130> PDPB201908 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 93 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Lys Leu Leu Met Val Leu Met Leu Ala Ala Leu Ser Gln His Cys 1 5 10 15 Tyr Ala Gly Ser Gly Cys Pro Leu Leu Glu Asn Val Ile Ser Lys Thr 20 25 30 Ile Asn Pro Gln Val Ser Lys Thr Glu Tyr Lys Glu Leu Leu Gln Glu 35 40 45 Phe Ile Asp Asp Asn Ala Thr Thr Asn Ala Ile Asp Glu Leu Lys Glu 50 55 60 Cys Phe Leu Asn Gln Thr Asp Glu Thr Leu Ser Asn Val Glu Val Phe 65 70 75 80 Met Gln Leu Ile Tyr Asp Ser Ser Leu Cys Asp Leu Phe 85 90 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MGB1 fragment <400> 2 Thr Ile Asn Pro Gln Val Ser Lys 1 5 <210> 3 <211> 488 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Ala Pro Ala Ala Trp Leu Arg Ser Ala Ala Ala Arg Ala Leu Leu 1 5 10 15 Pro Pro Met Leu Leu Leu Leu Leu Gln Pro Pro Pro Leu Leu Ala Arg 20 25 30 Ala Leu Pro Pro Asp Ala His His Leu His Ala Glu Arg Arg Gly Pro 35 40 45 Gln Pro Trp His Ala Ala Leu Pro Ser Ser Pro Ala Pro Ala Pro Ala 50 55 60 Thr Gln Glu Ala Pro Arg Pro Ala Ser Ser Leu Arg Pro Pro Arg Cys 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Pro Ser Asp Gly Leu Ser Ala Arg Asn Arg Gln Lys 85 90 95 Arg Phe Val Leu Ser Gly Gly Arg Trp Glu Lys Thr Asp Leu Thr Tyr 100 105 110 Arg Ile Leu Arg Phe Pro Trp Gln Leu Val Gln Glu Gln Val Arg Gln 115 120 125 Thr Met Ala Glu Ala Leu Lys Val Trp Ser Asp Val Thr Pro Leu Thr 130 135 140 Phe Thr Glu Val His Glu Gly Arg Ala Asp Ile Met Ile Asp Phe Ala 145 150 155 160 Arg Tyr Trp His Gly Asp Asp Leu Pro Phe Asp Gly Pro Gly Gly Ile 165 170 175 Leu Ala His Ala Phe Phe Pro Lys Thr His Arg Glu Gly Asp Val His 180 185 190 Phe Asp Tyr Asp Glu Thr Trp Thr Ile Gly Asp Asp Gln Gly Thr Asp 195 200 205 Leu Leu Gln Val Ala Ala His Glu Phe Gly His Val Leu Gly Leu Gln 210 215 220 His Thr Thr Ala Ala Lys Ala Leu Met Ser Ala Phe Tyr Thr Phe Arg 225 230 235 240 Tyr Pro Leu Ser Leu Ser Pro Asp Asp Cys Arg Gly Val Gln His Leu 245 250 255 Tyr Gly Gln Pro 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Pro Arg Leu Val Gly Pro Asp Phe Phe Gly Cys 465 470 475 480 Ala Glu Pro Ala Asn Thr Phe Leu 485 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP11 fragment <400> 4 Ala Leu Glu Gly Phe Pro Arg 1 5 <210> 5 <211> 2555 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Pro Pro Leu Leu Ala Pro Leu Leu Cys Leu Ala Leu Leu Pro Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Gly Pro Arg Cys Ser Gln Pro Gly Glu Thr Cys Leu 20 25 30 Asn Gly Gly Lys Cys Glu Ala Ala Asn Gly Thr Glu Ala Cys Val Cys 35 40 45 Gly Gly Ala Phe Val Gly Pro Arg Cys Gln Asp Pro Asn Pro Cys Leu 50 55 60 Ser Thr Pro Cys Lys Asn Ala Gly Thr Cys His Val Val Asp Arg Arg 65 70 75 80 Gly Val Ala Asp Tyr Ala Cys Ser Cys Ala Leu Gly Phe Ser Gly Pro 85 90 95 Leu Cys Leu Thr Pro Leu Asp Asn Ala Cys Leu Thr Asn Pro Cys Arg 100 105 110 Asn Gly Gly Thr Cys Asp Leu Leu Thr Leu Thr Glu Tyr Lys Cys Arg 115 120 125 Cys Pro Pro Gly Trp Ser Gly Lys Ser Cys Gln Gln Ala Asp Pro Cys 130 135 140 Ala Ser Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Gln Cys Leu Pro Phe Glu Ala 145 150 155 160 Ser Tyr Ile Cys His Cys Pro Pro Ser Phe His Gly Pro Thr Cys Arg 165 170 175 Gln Asp Val Asn Glu Cys Gly Gln Lys Pro Gly Leu Cys Arg His Gly 180 185 190 Gly Thr Cys His Asn Glu Val Gly Ser Tyr Arg Cys Val Cys Arg Ala 195 200 205 Thr His Thr Gly Pro Asn Cys Glu Arg Pro Tyr Val Pro Cys Ser Pro 210 215 220 Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys Arg Pro Thr Gly Asp Val Thr 225 230 235 240 His Glu Cys Ala Cys Leu Pro Gly Phe Thr Gly Gln Asn Cys Glu Glu 245 250 255 Asn Ile Asp Asp Cys Pro Gly Asn Asn Cys Lys Asn Gly Gly Ala Cys 260 265 270 Val Asp Gly Val Asn Thr Tyr Asn Cys Arg Cys Pro Pro Glu Trp Thr 275 280 285 Gly Gln Tyr Cys Thr Glu Asp Val Asp Glu Cys Gln Leu Met Pro Asn 290 295 300 Ala Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys His Asn Thr His Gly Gly Tyr Asn 305 310 315 320 Cys Val Cys Val Asn Gly Trp Thr Gly Glu Asp Cys Ser Glu Asn Ile 325 330 335 Asp Asp Cys Ala Ser Ala Ala Cys Phe His Gly Ala Thr Cys His Asp 340 345 350 Arg Val Ala Ser Phe Tyr Cys Glu Cys Pro His Gly Arg Thr Gly Leu 355 360 365 Leu Cys His Leu Asn Asp Ala Cys Ile Ser Asn Pro Cys Asn Glu Gly 370 375 380 Ser Asn Cys Asp Thr Asn Pro Val Asn Gly Lys Ala Ile Cys Thr Cys 385 390 395 400 Pro Ser Gly Tyr Thr Gly Pro Ala Cys Ser Gln Asp Val Asp Glu Cys 405 410 415 Ser Leu Gly Ala Asn Pro Cys Glu His Ala Gly Lys Cys Ile Asn Thr 420 425 430 Leu Gly Ser Phe Glu Cys Gln Cys Leu Gln Gly Tyr Thr Gly Pro Arg 435 440 445 Cys Glu Ile Asp Val Asn Glu Cys Val Ser Asn Pro Cys Gln Asn Asp 450 455 460 Ala Thr Cys Leu Asp Gln Ile Gly Glu Phe Gln Cys Ile Cys Met Pro 465 470 475 480 Gly Tyr Glu Gly Val His Cys Glu Val Asn Thr Asp Glu Cys Ala Ser 485 490 495 Ser Pro Cys Leu His Asn Gly Arg Cys Leu Asp Lys Ile Asn Glu Phe 500 505 510 Gln Cys Glu Cys Pro Thr Gly Phe Thr Gly His Leu Cys Gln Tyr Asp 515 520 525 Val Asp Glu Cys Ala Ser Thr Pro Cys Lys Asn Gly Ala Lys Cys Leu 530 535 540 Asp Gly Pro Asn Thr Tyr Thr Cys Val Cys Thr Glu Gly Tyr Thr Gly 545 550 555 560 Thr His Cys Glu Val Asp Ile Asp Glu Cys Asp Pro Asp Pro Cys His 565 570 575 Tyr Gly Ser Cys Lys Asp Gly Val Ala Thr Phe Thr Cys Leu Cys Arg 580 585 590 Pro Gly Tyr Thr Gly His His Cys Glu Thr Asn Ile Asn Glu Cys Ser 595 600 605 Ser Gln Pro Cys Arg His Gly Gly Thr Cys Gln Asp Arg Asp Asn Ala 610 615 620 Tyr Leu Cys Phe Cys Leu Lys Gly Thr Thr Gly Pro Asn Cys Glu Ile 625 630 635 640 Asn Leu Asp Asp Cys Ala Ser Ser Pro Cys Asp Ser Gly Thr Cys Leu 645 650 655 Asp Lys Ile Asp Gly Tyr Glu Cys Ala Cys Glu Pro Gly Tyr Thr Gly 660 665 670 Ser Met Cys Asn Ile Asn Ile Asp Glu Cys Ala Gly Asn Pro Cys His 675 680 685 Asn Gly Gly Thr Cys Glu Asp Gly Ile Asn Gly Phe Thr Cys Arg Cys 690 695 700 Pro Glu Gly Tyr His Asp Pro Thr Cys Leu Ser Glu Val Asn Glu Cys 705 710 715 720 Asn Ser Asn Pro Cys Val His Gly Ala Cys Arg Asp Ser Leu Asn Gly 725 730 735 Tyr Lys Cys Asp Cys Asp Pro Gly Trp Ser Gly Thr Asn Cys Asp Ile 740 745 750 Asn Asn Asn Glu Cys Glu Ser Asn Pro Cys Val Asn Gly Gly Thr Cys 755 760 765 Lys Asp Met Thr Ser Gly Tyr Val Cys Thr Cys Arg Glu Gly Phe Ser 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980 985 990 Phe Asn Gly Gly Thr Cys Val Asp Gly Ile Asn Ser Phe Thr Cys Leu 995 1000 1005 Cys Pro Pro Gly Phe Thr Gly Ser Tyr Cys Gln His Asp Val Asn Glu 1010 1015 1020 Cys Asp Ser Gln Pro Cys Leu His Gly Gly Thr Cys Gln Asp Gly Cys 1025 1030 1035 1040 Gly Ser Tyr Arg Cys Thr Cys Pro Gln Gly Tyr Thr Gly Pro Asn Cys 1045 1050 1055 Gln Asn Leu Val His Trp Cys Asp Ser Ser Pro Cys Lys Asn Gly Gly 1060 1065 1070 Lys Cys Trp Gln Thr His Thr Gln Tyr Arg Cys Glu Cys Pro Ser Gly 1075 1080 1085 Trp Thr Gly Leu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Val Ser Cys Glu Val Ala 1090 1095 1100 Ala Gln Arg Gln Gly Val Asp Val Ala Arg Leu Cys Gln His Gly Gly 1105 1110 1115 1120 Leu Cys Val Asp Ala Gly Asn Thr His His Cys Arg Cys Gln Ala Gly 1125 1130 1135 Tyr Thr Gly Ser Tyr Cys Glu Asp Leu Val Asp Glu Cys Ser Pro Ser 1140 1145 1150 Pro Cys Gln Asn Gly Ala Thr Cys Thr Asp Tyr Leu Gly Gly Tyr Ser 1155 1160 1165 Cys Lys Cys Val Ala Gly Tyr His Gly Val Asn Cys Ser Glu Glu Ile 1170 1175 1180 Asp Glu Cys Leu Ser His Pro Cys 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2185 2190 Ser Ser Gly Met Leu Ser Pro Val Asp Ser Leu Glu Ser Pro His Gly 2195 2200 2205 Tyr Leu Ser Asp Val Ala Ser Pro Pro Leu Leu Pro Ser Pro Phe Gln 2210 2215 2220 Gln Ser Pro Ser Val Pro Leu Asn His Leu Pro Gly Met Pro Asp Thr 2225 2230 2235 2240 His Leu Gly Ile Gly His Leu Asn Val Ala Ala Lys Pro Glu Met Ala 2245 2250 2255 Ala Leu Gly Gly Gly Gly Arg Leu Ala Phe Glu Thr Gly Pro Pro Arg 2260 2265 2270 Leu Ser His Leu Pro Val Ala Ser Gly Thr Ser Thr Val Leu Gly Ser 2275 2280 2285 Ser Ser Gly Gly Ala Leu Asn Phe Thr Val Gly Gly Ser Thr Ser Leu 2290 2295 2300 Asn Gly Gln Cys Glu Trp Leu Ser Arg Leu Gln Ser Gly Met Val Pro 2305 2310 2315 2320 Asn Gln Tyr Asn Pro Leu Arg Gly Ser Val Ala Pro Gly Pro Leu Ser 2325 2330 2335 Thr Gln Ala Pro Ser Leu Gln His Gly Met Val Gly Pro Leu His Ser 2340 2345 2350 Ser Leu Ala Ala Ser Ala Leu Ser Gln Met Met Ser Tyr Gln Gly Leu 2355 2360 2365 Pro Ser Thr Arg Leu Ala Thr Gln Pro His Leu Val Gln Thr Gln Gln 2370 2375 2380 Val Gln Pro Gln Asn Leu Gln Met Gln Gln Gln Asn Leu Gln Pro Ala 2385 2390 2395 2400 Asn Ile Gln Gln Gln Gln Ser Leu Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gln 2405 2410 2415 Pro His Leu Gly Val Ser Ser Ala Ala Ser Gly His Leu Gly Arg Ser 2420 2425 2430 Phe Leu Ser Gly Glu Pro Ser Gln Ala Asp Val Gln Pro Leu Gly Pro 2435 2440 2445 Ser Ser Leu Ala Val His Thr Ile Leu Pro Gln Glu Ser Pro Ala Leu 2450 2455 2460 Pro Thr Ser Leu Pro Ser Ser Leu Val Pro Pro Val Thr Ala Ala Gln 2465 2470 2475 2480 Phe Leu Thr Pro Pro Ser Gln His Ser Tyr Ser Ser Pro Val Asp Asn 2485 2490 2495 Thr Pro Ser His Gln Leu Gln Val Pro Glu His Pro Phe Leu Thr Pro 2500 2505 2510 Ser Pro Glu Ser Pro Asp Gln Trp Ser Ser Ser Ser Pro His Ser Asn 2515 2520 2525 Val Ser Asp Trp Ser Glu Gly Val Ser Ser Pro Pro Thr Ser Met Gln 2530 2535 2540 Ser Gln Ile Ala Arg Ile Pro Glu Ala Phe Lys 2545 2550 2555 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NOTCH fragment <400> 6 Asn Ser Ser Phe His Phe Leu Arg 1 5 <210> 7 <211> 764 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Leu Leu Phe Val Leu Thr Cys Leu Leu Ala Val Phe Pro Ala Ile 1 5 10 15 Ser Thr Lys Ser Pro Ile Phe Gly Pro Glu Glu Val Asn Ser Val Glu 20 25 30 Gly Asn Ser Val Ser Ile Thr Cys Tyr Tyr Pro Pro Thr Ser Val Asn 35 40 45 Arg His Thr Arg Lys Tyr Trp Cys Arg Gln Gly Ala Arg Gly Gly Cys 50 55 60 Ile Thr Leu Ile Ser Ser Glu Gly Tyr Val Ser Ser Lys Tyr Ala Gly 65 70 75 80 Arg Ala Asn Leu Thr Asn Phe Pro Glu Asn Gly Thr Phe Val Val Asn 85 90 95 Ile Ala Gln Leu Ser Gln Asp Asp Ser Gly Arg Tyr Lys Cys Gly Leu 100 105 110 Gly Ile Asn Ser Arg Gly Leu Ser Phe Asp Val Ser Leu Glu Val Ser 115 120 125 Gln Gly Pro Gly Leu Leu Asn Asp Thr Lys Val Tyr Thr Val Asp Leu 130 135 140 Gly Arg Thr Val Thr Ile Asn Cys Pro Phe Lys Thr Glu Asn Ala Gln 145 150 155 160 Lys Arg Lys Ser Leu Tyr Lys Gln Ile Gly Leu Tyr Pro Val Leu Val 165 170 175 Ile Asp Ser Ser Gly Tyr Val Asn Pro Asn Tyr Thr Gly Arg Ile Arg 180 185 190 Leu Asp Ile Gln Gly Thr Gly Gln Leu Leu Phe Ser Val Val Ile Asn 195 200 205 Gln Leu Arg Leu Ser Asp Ala Gly Gln Tyr Leu Cys Gln Ala Gly Asp 210 215 220 Asp Ser Asn Ser Asn Lys Lys Asn Ala Asp Leu Gln Val Leu Lys Pro 225 230 235 240 Glu Pro Glu Leu Val Tyr Glu Asp Leu Arg Gly Ser Val Thr Phe His 245 250 255 Cys Ala Leu Gly Pro Glu Val Ala Asn Val Ala Lys Phe Leu Cys Arg 260 265 270 Gln Ser Ser Gly Glu Asn Cys Asp Val Val Val Asn Thr Leu Gly Lys 275 280 285 Arg Ala Pro Ala Phe Glu Gly Arg Ile Leu Leu Asn Pro Gln Asp Lys 290 295 300 Asp Gly Ser Phe Ser Val Val Ile Thr Gly Leu Arg Lys Glu Asp Ala 305 310 315 320 Gly Arg Tyr Leu Cys Gly Ala His Ser Asp Gly Gln Leu Gln Glu Gly 325 330 335 Ser Pro Ile Gln Ala Trp Gln Leu Phe Val Asn Glu Glu Ser Thr Ile 340 345 350 Pro Arg Ser Pro Thr Val Val Lys Gly Val Ala Gly Gly Ser Val Ala 355 360 365 Val Leu Cys Pro Tyr Asn Arg Lys Glu Ser Lys Ser Ile Lys Tyr Trp 370 375 380 Cys Leu Trp Glu Gly Ala Gln Asn Gly Arg Cys Pro Leu Leu Val Asp 385 390 395 400 Ser Glu Gly Trp Val Lys Ala Gln Tyr Glu Gly Arg Leu Ser Leu Leu 405 410 415 Glu Glu Pro Gly Asn Gly Thr Phe Thr Val Ile Leu Asn Gln Leu Thr 420 425 430 Ser Arg Asp Ala Gly Phe Tyr Trp Cys Leu Thr Asn Gly Asp Thr Leu 435 440 445 Trp Arg Thr Thr Val Glu Ile Lys Ile Ile Glu Gly Glu Pro Asn Leu 450 455 460 Lys Val Pro Gly Asn Val Thr Ala Val Leu Gly Glu Thr Leu Lys Val 465 470 475 480 Pro Cys His Phe Pro Cys Lys Phe Ser Ser Tyr Glu Lys Tyr Trp Cys 485 490 495 Lys Trp Asn Asn Thr Gly Cys Gln Ala Leu Pro Ser Gln Asp Glu Gly 500 505 510 Pro Ser Lys Ala Phe Val Asn Cys Asp Glu Asn Ser Arg Leu Val Ser 515 520 525 Leu Thr Leu Asn Leu Val Thr Arg Ala Asp Glu Gly Trp Tyr Trp Cys 530 535 540 Gly Val Lys Gln Gly His Phe Tyr Gly Glu Thr Ala Ala Val Tyr Val 545 550 555 560 Ala Val Glu Glu Arg Lys Ala Ala Gly Ser Arg Asp Val Ser Leu Ala 565 570 575 Lys Ala Asp Ala Ala Pro Asp Glu Lys Val Leu Asp Ser Gly Phe Arg 580 585 590 Glu Ile Glu Asn Lys Ala Ile Gln Asp Pro Arg Leu Phe Ala Glu Glu 595 600 605 Lys Ala Val Ala Asp Thr Arg Asp Gln Ala Asp Gly Ser Arg Ala Ser 610 615 620 Val Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Gln Gly Gly Ser Ser Arg Ala Leu 625 630 635 640 Val Ser Thr Leu Val Pro Leu Gly Leu Val Leu Ala Val Gly Ala Val 645 650 655 Ala Val Gly Val Ala Arg Ala Arg His Arg Lys Asn Val Asp Arg Val 660 665 670 Ser Ile Arg Ser Tyr Arg Thr Asp Ile Ser Met Ser Asp Phe Glu Asn 675 680 685 Ser Arg Glu Phe Gly Ala Asn Asp Asn Met Gly Ala Ser Ser Ile Thr 690 695 700 Gln Glu Thr Ser Leu Gly Gly Lys Glu Glu Phe Val Ala Thr Thr Glu 705 710 715 720 Ser Thr Thr Glu Thr Lys Glu Pro Lys Lys Ala Lys Arg Ser Ser Lys 725 730 735 Glu Glu Ala Glu Met Ala Tyr Lys Asp Phe Leu Leu Gln Ser Ser Thr 740 745 750 Val Ala Ala Glu Ala Gln Asp Gly Pro Gln Glu Ala 755 760 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PIGR fragment <400> 8 Val Tyr Thr Val Asp Leu Gly Arg 1 5 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PIGR fragment <400> 9 Val Tyr Thr Val Asp Leu Gly Arg 1 5 <210> 10 <211> 370 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Gly Leu Trp Ala Leu Leu Pro Gly Trp Val Ser Ala Thr Leu Leu 1 5 10 15 Leu Ala Leu Ala Ala Leu Pro Ala Ala Leu Ala Ala Asn Ser Ser Gly 20 25 30 Arg Trp Trp Gly Ile Val Asn Val Ala Ser Ser Thr Asn Leu Leu Thr 35 40 45 Asp Ser Lys Ser Leu Gln Leu Val Leu Glu Pro Ser Leu Gln Leu Leu 50 55 60 Ser Arg Lys Gln Arg Arg Leu Ile Arg Gln Asn Pro Gly Ile Leu His 65 70 75 80 Ser Val Ser Gly Gly Leu Gln Ser Ala Val Arg Glu Cys Lys Trp Gln 85 90 95 Phe Arg Asn Arg Arg Trp Asn Cys Pro Thr Ala Pro Gly Pro His Leu 100 105 110 Phe Gly Lys Ile Val Asn Arg Gly Cys Arg Glu Thr Ala Phe Ile Phe 115 120 125 Ala Ile Thr Ser Ala Gly Val Thr His Ser Val Ala Arg Ser Cys Ser 130 135 140 Glu Gly Ser Ile Glu Ser Cys Thr Cys Asp Tyr Arg Arg Arg Gly Pro 145 150 155 160 Gly Gly Pro Asp Trp His Trp Gly Gly Cys Ser Asp Asn Ile Asp Phe 165 170 175 Gly Arg Leu Phe Gly Arg Glu Phe Val Asp Ser Gly Glu Lys Gly Arg 180 185 190 Asp Leu Arg Phe Leu Met Asn Leu His Asn Asn Glu Ala Gly Arg Thr 195 200 205 Thr Val Phe Ser Glu Met Arg Gln Glu Cys Lys Cys His Gly Met Ser 210 215 220 Gly Ser Cys Thr Val Arg Thr Cys Trp Met Arg Leu Pro Thr Leu Arg 225 230 235 240 Ala Val Gly Asp Val Leu Arg Asp Arg Phe Asp Gly Ala Ser Arg Val 245 250 255 Leu Tyr Gly Asn Arg Gly Ser Asn Arg Ala Ser Arg Ala Glu Leu Leu 260 265 270 Arg Leu Glu Pro Glu Asp Pro Ala His Lys Pro Pro Ser Pro His Asp 275 280 285 Leu Val Tyr Phe Glu Lys Ser Pro Asn Phe Cys Thr Tyr Ser Gly Arg 290 295 300 Leu Gly Thr Ala Gly Thr Ala Gly Arg Ala Cys Asn Ser Ser Ser Pro 305 310 315 320 Ala Leu Asp Gly Cys Glu Leu Leu Cys Cys Gly Arg Gly His Arg Thr 325 330 335 Arg Thr Gln Arg Val Thr Glu Arg Cys Asn Cys Thr Phe His Trp Cys 340 345 350 Cys His Val Ser Cys Arg Asn Cys Thr His Thr Arg Val Leu His Glu 355 360 365 Cys Leu 370 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> WNT1 fragment <400> 11 Glu Phe Val Asp Ser Gly Glu Lys 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 12 Gly Asp Phe Gln Phe Asn Ile Ser Arg 1 5

Claims (26)

  1. 서열번호 2, 4, 6, 8, 9 및 11로 표시되는 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 둘 이상의 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 암의 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 암은 유방암, 난소암, 대장암, 위암, 간암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종인, 암의 진단용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 폴리펩티드의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩티드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 암의 진단용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 암의 진단용 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 암의 진단용 키트.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트인, 암의 진단용 키트.
  7. 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 서열번호 2, 4, 6, 8, 9 및 11로 표시되는 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 둘 이상의 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 복수(ascites), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 또는 뇌척수액(cerebrospinal fluid)인, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 폴리펩티드의 발현 수준의 측정은 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 또는 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay)에 의해 수행되는, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 폴리펩티드의 발현 수준의 측정은 다중 반응 모니터링 (multiple reaction monitoring; MRM) 방법에 의하는, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 서열번호 2로 표시되는 폴리펩티드의 타겟 펩티드에서 어미이온의 질량 대 전하비는 443.753 m/z 이고, 딸이온의 질량 대 전하비는 672.367515, 558.324588, 461.271824, 333.213246 또는 234.144832 m/z 인, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 서열번호 4로 표시되는 폴리펩티드의 타겟 펩티드에서 어미이온의 질량 대 전하비는 395.216 m/z 이고, 딸이온의 질량 대 전하비는 718.3883, 605.3042, 476.2616, 419.2401 및 272.1717 m/z 인, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 서열번호 6으로 표시되는 폴리펩티드의 타겟 펩티드에서 어미이온의 질량 대 전하비는 336.607 m/z 이고, 딸이온의 질량 대 전하비는 447.235, 403.719, 360.203, 286.669, 218.139 및 144.605 m/z 인, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  14. 상기 서열번호 8로 표시되는 폴리펩티드의 타겟 펩티드에서 어미이온의 질량 대 전하비는 461.753 m/z 이고, 딸이온의 질량 대 전하비는 823.4308, 660.3675, 559.3198, 345.2245 및 232.1404 m/z 인, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  15. 제10항에 있어서,
    상기 서열번호 9로 표시되는 폴리펩티드의 타겟 펩티드에서 어미이온의 질량 대 전하비는 395.216 m/z 이고, 딸이온의 질량 대 전하비는 345.7053 m/z일 수 있고, 딸이온의 질량 대 전하비는 589.3556, 488.3079, 및 260.1969 m/z 인, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  16. 제10항에 있어서,
    상기 서열번호 11로 표시되는 폴리펩티드의 타겟 펩티드에서 어미이온의 질량 대 전하비는 455.7113 m/z이고, 딸이온의 질량 대 전하비는 634.3042, 535.2358, 420.2089, 333.1769 및 276.1554 m/z 인, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  17. 제11 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 다중 반응 모니터링 방법 시 내부 표준 물질은 타겟 펩티드를 구성하는 특정 아미노산을 동위원소로 치환한 합성 펩티드 또는 대장균 베타 갈락토시다아제를 사용하는, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 대장균 베타 갈락토시다아제의 타겟 펩티드는 서열번호 12로 표시되는 폴리펩티드로 이루어지며 어미이온과 딸이온은 각각 542.3 m/z 와 636.3 m/z 인, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  19. 제7항에 있어서,
    상기 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 상기 서열번호 2, 4, 6, 8, 9 및 11로 표시되는 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 둘 이상의 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 증가한 경우, 상기 암의 발병 가능성이 높은 것으로 예측하는, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  20. 제7항에 있어서,
    상기 정보 제공 방법은 목적하는 개체의 화학적 항암 치료 또는 면역 치료에 대한 반응성을 예측하는 것인, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  21. 제7항에 있어서,
    상기 정보 제공 방법은 목적하는 개체가 외과적 수술 후 예후를 예측하는 것인, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  22. 제7항에 있어서,
    상기 정보 제공 방법은 상기 목적하는 개체의 암의 병기를 진단하는 것인, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  23. 제7항에 있어서,
    상기 정보 제공 방법은 상기 목적하는 개체의 암의 재발 가능성을 예측하는 것인, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  24. (a) 암 개체로부터 분리한 시료 또는 암 질환 동물 모델에 후보 약제를 처리하는 단계; 및
    (b) 상기 후보 약제가 처리된 시료 또는 암 질환 동물 모델에서 서열번호 2, 4, 6, 8, 9 및 11로 표시되는 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 둘 이상의 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약물을 스크리닝하는 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 시료는 암 개체로부터 분리된 세포 또는 조직인, 암의 예방 또는 치료용 약물을 스크리닝하는 방법.
  26. 제24항에 있어서,
    (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 상기 서열번호 2, 4, 6, 8, 9 및 11로 표시되는 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 둘 이상의 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 후보 약제가 처리되기 전에 비하여 증가하거나 감소한 경우 상기 후보 약제를 암의 예방 또는 치료용 약제로 판단하는 단계를 추가로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약물을 스크리닝하는 방법.
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