WO2021172923A1 - 암의 진단용 조성물 - Google Patents

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WO2021172923A1
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cancer
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PCT/KR2021/002441
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김성수
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㈜베르티스
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a composition capable of diagnosing cancer, a diagnostic kit comprising the same, and a method of providing information for diagnosing cancer using the composition.
  • breast cancer is the second most common cancer after lung cancer and the fifth most dangerous cancer in mortality.
  • women who are undergoing physiologically vigorous physical changes such as low fertility, short lactation period, early menarche, and late menopause
  • the sensitivity of the mammary gland tissue increases due to the rapid increase in the number of stimulation by female hormones, westernization of diet, and living environment
  • the incidence of breast cancer is rapidly increasing due to contamination of
  • early detection is more important than other cancers because it is difficult to cure once cancer cells invade surrounding tissues or metastasize to lymph nodes.
  • breast cancer In order to reduce the mortality rate due to breast cancer, it is important to first diagnose breast cancer early, and second, to diagnose the prognosis after treatment by primary surgery and provide appropriate adjuvant therapy.
  • mammography In addition to self-diagnosis by primary palpation, mammography, ultrasonography, etc. are used as preventive screening methods, and these methods are the most widely used for diagnosing early breast cancer.
  • mammography has a disadvantage in that the diagnosis rate is low due to the fact that dense breasts, which are commonly found in Korean women, contain a lot of fibers.
  • X-rays since X-rays are used, the possibility of developing breast cancer during the diagnosis process cannot be excluded.
  • One object of the present invention is to provide a composition capable of accurately and conveniently diagnosing breast cancer, particularly among cancers.
  • Another object of the present invention is to provide a kit capable of accurately and conveniently diagnosing breast cancer, particularly among cancers.
  • Another object of the present invention is to provide a method for providing information for diagnosing breast cancer, among other cancers.
  • Another object of the present invention is to provide a method for predicting the therapeutic responsiveness of cancer, particularly breast cancer.
  • Another object of the present invention is to provide a method for predicting the prognosis of breast cancer, among other cancers.
  • Another object of the present invention is to provide a method for predicting the stage of cancer, particularly breast cancer.
  • Another object of the present invention is to provide a method for predicting the recurrence probability of cancer, particularly breast cancer.
  • Another object of the present invention is to provide a method for screening a drug for treating cancer, particularly breast cancer.
  • Another object of the present invention is to provide a diagnostic apparatus for diagnosing breast cancer among cancers.
  • composition for diagnosis of cancer comprising an agent for measuring the expression level of a polypeptide represented by at least one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 5, 7 and 9 or a gene encoding the same will be.
  • the cancer is breast cancer, ovarian cancer, colorectal cancer, stomach cancer, liver cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gallbladder cancer, biliary tract cancer, non-Hodgkin's lymphoma, Hodgkin's Lymphoma, blood cancer, bladder cancer, kidney cancer, melanoma, colon cancer, bone cancer, skin cancer, head cancer, uterine cancer, rectal cancer, brain tumor, perianal cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, vaginal cancer, vulvar carcinoma, esophageal cancer, small intestine cancer, endocrine adenocarcinoma, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, ureter cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, CNS central nervoussystem tumor, primary CNS lymphoma, spinal cord tumor, brainstem glioma or pituitary
  • the agent for measuring the expression level of the polypeptide represented by at least one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 5, 7 and 9 is an antibody, oligopeptide, ligand, PNA ( It relates to a composition for diagnosis of cancer, comprising at least one selected from the group consisting of peptide nucleic acid) and aptamer.
  • the agent for measuring the expression level of a gene encoding a polypeptide represented by at least one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 5, 7 and 9 is a primer that specifically binds to a gene encoding the polypeptide , It relates to a composition for diagnosis of cancer, comprising at least one selected from the group consisting of probes and antisense nucleotides.
  • kits for diagnosing cancer comprising a composition for diagnosing cancer.
  • the kit may be an RT-PCR kit, a DNA chip kit, an ELISA kit, a protein chip kit, a rapid kit, or a multiple reaction monitoring (MRM) kit, a kit for diagnosing cancer.
  • MRM multiple reaction monitoring
  • measuring the expression level of a polypeptide represented by at least one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 5, 7 and 9 or a gene encoding the same in a biological sample isolated from a subject of interest It may be an information providing method for diagnosing cancer, including the steps.
  • the "biological sample” to “sample” refer to whole blood, leukocytes, peripheral blood mononuclear cells, buffy coat, plasma, and serum. ), sputum, tears, mucus, nasal washes, nasal aspirate, breath, urine, semen, saliva ), peritoneal washings, ascites, cystic fluid, meningeal fluid, amniotic fluid, glandular fluid, pancreatic fluid, lymph fluid ), pleural fluid, nipple aspirate, bronchial aspirate, synovial fluid, joint aspirate, organ secretions, cells, It may be a cell extract or cerebrospinal fluid, but is not limited thereto.
  • the agent for measuring the expression level of a polypeptide represented by at least one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 5, 7 and 9 is at least one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 5, 7 and 9 It may include one or more selected from the group consisting of an antibody, oligopeptide, ligand, PNA (peptide nucleic acid) and aptamer that specifically binds to the displayed polypeptide.
  • the expression level of the polypeptide represented by at least one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 5, 7 and 9 is measured by protein chip analysis, immunoassay, ligand binding assay, MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption).
  • the measurement of the expression level of the polypeptide represented by at least one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 5, 7 and 9 is a multiple reaction monitoring (MRM) method for the diagnosis of cancer. It may be a method of providing information.
  • MRM multiple reaction monitoring
  • the mass to charge ratio of the parent ion of SEQ ID NO: 2 of the target peptide of the polypeptide represented by at least one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 5, 7 and 9 may be 443.753 m/z, and the daughter ion
  • the mass to charge ratio of may be 672.367515, 558.324588, 461.271824, 333.213246, 234.144832 m/z, but is not limited thereto.
  • the mass to charge ratio of the parent ion of SEQ ID NO: 5 of the target peptide of the polypeptide represented by at least one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 5, 7 and 9 may be 395.216 m/z, and the daughter ion
  • the mass to charge ratio of may be, but is not limited to, 718.3883, 605.3042, 476.2616, 419.2401 and 272.1717 m/z.
  • the mass to charge ratio of the parent ion of SEQ ID NO: 7 of the target peptide of the polypeptide represented by at least one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 5, 7 and 9 may be 336.607 m/z, and daughter ions
  • the mass to charge ratio of may be, but is not limited to, 447.235, 403.719, 360.203, 286.669, 218.139, and 144.605 m/z.
  • the mass to charge ratio of the parent ion of SEQ ID NO: 9 of the target peptide of the polypeptide represented by at least one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 5, 7 and 9 may be 455.7113 m/z, and the daughter ion
  • the mass to charge ratio of may be, but is not limited to, 634.3042, 535.2358, 420.2089, 333.1769, and 276.1554 m/z.
  • the internal standard material may be an information providing method for diagnosing cancer using a synthetic peptide in which a specific amino acid constituting a target peptide is substituted with an isotope or E. coli beta galactosidase.
  • the target peptide of E. coli beta galactosidase is composed of the polypeptide represented by SEQ ID NO: 3, and the mother ion and the daughter ion may be 542.3 m/z and 636.3 m/z, respectively.
  • the agent for measuring the expression level of a gene encoding a polypeptide represented by at least one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 5, 7 and 9 is a primer that specifically binds to a gene encoding the polypeptide; It may include one or more selected from the group consisting of probes and antisense nucleotides.
  • the expression level of a gene encoding a polypeptide represented by at least one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 5, 7 and 9 is measured by reverse transcription polymerase reaction (RT-PCR), competitive reverse transcription polymerase reaction ( Competitive RT-PCR), real-time reverse transcription polymerase reaction (Real-time RT-PCR), RNase protection assay (RPA), Northern blotting, or DNA chip.
  • RT-PCR reverse transcription polymerase reaction
  • Competitive RT-PCR competitive reverse transcription polymerase reaction
  • Real-time RT-PCR real-time reverse transcription polymerase reaction
  • RPA RNase protection assay
  • the expression level of at least one polypeptide selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 5, 7 and 9 measured in a biological sample of a subject of interest or a gene encoding the same is normal
  • it may be a method of providing information for diagnosing cancer, including predicting that the cancer is highly likely to develop.
  • the information providing method may be to predict the prognosis of a target subject after a surgical operation.
  • the information providing method may be to diagnose the stage of cancer of the target individual.
  • the information providing method may be to predict the possibility of cancer recurrence of the target individual.
  • the cancer is breast cancer, ovarian cancer, colorectal cancer, stomach cancer, liver cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gallbladder cancer, biliary tract cancer, non-Hodgkin's lymphoma, Hodgkin's lymphoma , blood cancer, bladder cancer, kidney cancer, melanoma, colon cancer, bone cancer, skin cancer, head cancer, uterine cancer, rectal cancer, brain tumor, perianal cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, vaginal cancer, vulvar carcinoma, esophageal cancer, small intestine cancer, endocrine adenocarcinoma , adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, ureter cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, CNS central nervoussystem tumor, primary CNS lymphoma, spinal cord tumor, brainstem glioma or pituit
  • a candidate drug to a sample isolated from a cancer subject or an animal model of a cancer disease; and (b) measuring the expression level of a polypeptide represented by at least one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 5, 7 and 9 or a gene encoding the same in a sample treated with the candidate agent or in an animal model of cancer disease It may relate to a method of screening a drug for the prevention or treatment of cancer, including.
  • the sample may be a cell or tissue isolated from a cancer subject.
  • the method may further include determining the candidate drug as a drug for preventing or treating cancer when it is increased or decreased compared to that of the drug.
  • the cancer is breast cancer, ovarian cancer, colorectal cancer, stomach cancer, liver cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gallbladder cancer, biliary tract cancer, non-Hodgkin's lymphoma, Hodgkin's lymphoma , blood cancer, bladder cancer, kidney cancer, melanoma, colon cancer, bone cancer, skin cancer, head cancer, uterine cancer, rectal cancer, brain tumor, perianal cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, vaginal cancer, vulvar carcinoma, esophageal cancer, small intestine cancer, endocrine adenocarcinoma , adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, ureter cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, CNS central nervoussystem tumor, primary CNS lymphoma, spinal cord tumor, brainstem glioma or pituit
  • a sample portion comprising a sample obtained from a patient, a polypeptide represented by at least one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 5, 7 and 9 in the sample included in the sample, or the same a detection unit for detecting the coding gene; and a comparison unit for comparing the expression level of a polypeptide represented by at least one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 5, 7 and 9 of the patient obtained from the detection unit or a gene encoding the same with that of a normal person, wherein the It may be a diagnostic device for diagnosing cancer according to a result obtained through the comparison unit.
  • the at least one polypeptide selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 5, 7 and 9 or a gene encoding the same is detected in the comparison unit, it may be a diagnostic device for diagnosing breast cancer.
  • cancer in particular, breast cancer can be diagnosed easily and accurately at an early stage, and more Furthermore, it is possible to diagnose the stage of cancer and predict treatment responsiveness or prognosis after treatment.
  • Example 1 is a graph showing the results of confirming the difference in the expression level of mammaglobin A (Mammaglobin-A) between a breast cancer patient, a benign tumor patient, and a non-patient control in Example 1 of the present invention.
  • mammaglobin-A mammaglobin A
  • Example 2 is a graph showing the results of confirming the difference in the expression level of matrix metalloproteinase-11 (MMP-11) between breast cancer patients and non-patient controls in Example 2 of the present invention.
  • MMP-11 matrix metalloproteinase-11
  • Figure 3 is based on the quantitative results of the biomarker of Neurogenic locus notch homolog protein 1 (NOTCH 1) using the target peptide of the polypeptide represented by SEQ ID NO: 7 between breast cancer patients and non-patient controls in Example 3 of the present invention. Recipient-Operating Characteristics (ROC) graphs are shown.
  • NOTCH 1 Neurogenic locus notch homolog protein 1
  • ROC Recipient-Operating Characteristics
  • Example 4 is a graph showing the results of confirming the difference in the expression level of Proto-oncogene Wnt-1 between breast cancer patients, benign tumor patients, and non-patient controls in Example 4 of the present invention.
  • mammaglobin-A mammaglobin A
  • SEQ ID NO: 2 of the present invention can diagnose breast cancer with high accuracy.
  • MMP-11 matrix metalloproteinase-11
  • the target peptide of the polypeptide represented by SEQ ID NO: 7 when used, it is shown as a receptor-operating characteristic (ROC) graph for breast cancer patients and normal controls.
  • ROC receptor-operating characteristic
  • AUC area under the curve
  • NOTCH 1 Neurogenic locus notch homolog protein 1
  • the agent for measuring the expression level of the polypeptide may be an agent for measuring the expression level of mammaglobin-A.
  • Mammaglobin A (Mammaglobin-A, MGB1) is a protein expressed in SCGB2A2, a breast-specific gene of the euteroglobin gene family on chromosome 11 (11q13), which encodes a 10 kDa glycoprotein.
  • Mammaglobin A (Mammaglobin-A) is known to be overexpressed in breast epithelium and breast cancer tissue, and thus attracts attention as a molecular marker for breast cancer.
  • it exists on the surface of breast cancer cells it has been proposed as a useful molecular marker for delivery of targeted drugs to breast cancer tissues.
  • the mammaglobin A may consist of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
  • the agent for measuring the expression level of the polypeptide in the present invention may be an agent for measuring the expression level of matrix metalloproteinase-11 (Stromelysin-3, matrix metalloproteinase-11; MMP-11).
  • MMP-11 matrix metalloproteinase
  • MMP-11 is a protein of the matrix metalloproteinase (MMP) family and is involved in the degradation of extracellular matrix in normal physiological processes such as embryonic development, reproduction and tissue remodeling, as well as in disease processes such as arthritis and cancer metastasis. do.
  • MMPs matrix metalloproteinase
  • Most MMPs are secreted as inactive proproteins that are activated when cleaved by extracellular proteinases.
  • the enzyme encoded by this gene is activated intracellularly by furins within the constitutive secretory pathway.
  • this enzyme cleaves alpha 1-protease inhibitors, but weakly degrades structural proteins in the extracellular matrix.
  • the matrix metalloproteinase-11 may consist of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, but is not limited thereto.
  • the agent for measuring the expression level of the polypeptide in the present invention may be an agent for measuring the expression level of Neurogenic locus notch homolog protein 1 (NOTCH 1).
  • the NOTCH gene is a human gene encoding a single-pass transmembrane receptor.
  • Notch 1 transmembrane protein family share structural properties including an extracellular domain composed of multiple epidermal growth factor-like (EGF) repeats and an intracellular domain composed of a number of different domain types.
  • EGF epidermal growth factor-like
  • the NOTCH family regulates various developmental processes by controlling cell fate decisions
  • the NOTCH signaling network is an evolutionarily conserved intercellular signaling pathway that regulates interactions between physically adjacent cells.
  • the Neurogenic locus notch homolog protein 1 may consist of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, but is not limited thereto.
  • the agent for measuring the expression level of the polypeptide in the present invention may be an agent for measuring the expression level of Proto-oncogene Wnt-1.
  • the WNT1 gene is a member of the WNT gene family and consists of structurally related genes encoding secreted signal transduction proteins. These proteins have been implicated in cancer development during carcinogenesis and in several developmental processes, including regulatory patterns of cellular development. This gene is evolutionarily highly conserved, and the protein encoded by it is known to be 98% identical to the mouse Wnt1 protein at the amino acid level. Studies in mice indicate that the Wnt1 protein functions in the induction of the midbrain and cerebellum.
  • the Proto-oncogene Wnt-1 may consist of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, but is not limited thereto.
  • cancer refers to or refers to a physiological condition characterized by uncontrolled cell growth typically in mammals.
  • Cancers to be diagnosed in the present invention include breast cancer, ovarian cancer, colorectal cancer, stomach cancer, liver cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gallbladder cancer, biliary tract cancer, and non-Hodgkin's lymphoma.
  • Hodgkin's lymphoma Hodgkin's lymphoma, blood cancer, bladder cancer, kidney cancer, melanoma, colon cancer, bone cancer, skin cancer, head cancer, uterine cancer, rectal cancer, brain tumor, perianal cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, vaginal cancer, vulvar carcinoma, esophageal cancer, small intestine Cancer, endocrine adenocarcinoma, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, ureter cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, CNS central nervoussystem tumor, primary CNS lymphoma, spinal cord tumor, brainstem glioma or pituitary gland It may be an adenoma, but preferably breast cancer.
  • the "diagnosis” refers to determining the susceptibility of a subject to a specific disease or disorder, determining whether the subject currently has a specific disease or disorder, or having a specific disease or disorder Determining a subject's prognosis (e.g., identifying a pre-metastatic or metastatic cancer state, staging the cancer, or determining the responsiveness of a cancer to treatment), or using therametrics (e.g., for therapeutic efficacy); monitoring the state of an object to provide information).
  • the diagnosis is to determine whether or not the above-mentioned cancer is onset or the possibility (risk) of the occurrence.
  • the agent for measuring the expression level of the polypeptide represented by at least one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 5, 7 and 9 is not particularly limited, for example, an antibody that specifically binds to the polypeptide; It may include one or more selected from the group consisting of an oligopeptide, a ligand, a peptide nucleic acid (PNA), and an aptamer.
  • an antibody refers to a substance that specifically binds to an antigen and causes an antigen-antibody reaction.
  • an antibody refers to an antibody that specifically binds to a polypeptide represented by at least one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 5, 7 and 9.
  • the antibodies of the present invention include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies and recombinant antibodies.
  • the antibody can be readily prepared using techniques well known in the art.
  • the polyclonal antibody can be produced by a method well known in the art, including the process of injecting an antigen of the protein into an animal and collecting blood from the animal to obtain a serum containing the antibody.
  • Such polyclonal antibodies can be prepared from any animal such as goat, rabbit, sheep, monkey, horse, pig, cow, dog, and the like.
  • monoclonal antibodies can be prepared using a hybridoma method well known in the art, or a phage antibody library technique.
  • the antibody prepared by the above method may be separated and purified using methods such as gel electrophoresis, dialysis, salt precipitation, ion exchange chromatography, and affinity chromatography.
  • the antibodies of the present invention include functional fragments of antibody molecules as well as complete forms having two full-length light chains and two full-length heavy chains.
  • a functional fragment of an antibody molecule means a fragment having at least an antigen-binding function, and includes Fab, F(ab'), F(ab')2 and Fv.
  • PNA Peptide Nucleic Acid
  • DNA has a phosphate-ribose sugar backbone
  • PNA has a repeated N-(2-aminoethyl)-glycine backbone linked by peptide bonds, which greatly increases binding strength and stability to DNA or RNA, resulting in molecular biology , diagnostic assays and antisense therapy.
  • the "aptamer” is an oligonucleic acid or a peptide molecule, and refers to a ligand-specific DNA or RNA molecule having a high affinity for a protein.
  • Aptamer refers to single-stranded DNA or RNA having a specific binding ability to a specific substance, and has its own unique tertiary structure. It can be mass-produced in a short time and at low cost by using the chemical synthesis technique, and there is little variation between batches, so it has excellent advantages in terms of productivity.
  • due to its high stability against changes in the surrounding environment, such as pH or temperature the potential for application in various fields such as the detection of target substances and the development of disease diagnosis sensors is highly evaluated.
  • the agent for measuring the expression level of a gene encoding a polypeptide represented by at least one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 5, 7 and 9 is a primer, probe and antisense nucleotide that specifically binds to the gene. It may include one or more selected from the group consisting of.
  • the "primer” is a fragment that recognizes a target gene sequence, and includes a pair of forward and reverse primers, but preferably, a primer pair that provides analysis results with specificity and sensitivity. High specificity can be conferred when the primer's nucleic acid sequence is a sequence that is inconsistent with the non-target sequence present in the sample, so that only the target gene sequence containing the complementary primer binding site is amplified and the primer does not cause non-specific amplification. .
  • the "probe” refers to a substance capable of specifically binding to a target substance to be detected in a sample, and refers to a substance capable of specifically confirming the presence of a target substance in a sample through the binding.
  • the type of probe is not limited as a material commonly used in the art, but preferably PNA (peptide nucleic acid), LNA (locked nucleic acid), peptide, polypeptide, protein, RNA or DNA, and most preferably is PNA.
  • the probe includes a biomaterial derived from or similar thereto or manufactured in vitro, for example, enzymes, proteins, antibodies, microorganisms, animal and plant cells and organs, neurons, DNA, and It may be RNA, and DNA includes cDNA, genomic DNA, and oligonucleotides, RNA includes genomic RNA, mRNA, and oligonucleotides, and examples of proteins include antibodies, antigens, enzymes, peptides, and the like.
  • RNA includes cDNA, genomic DNA, and oligonucleotides
  • RNA includes genomic RNA, mRNA, and oligonucleotides
  • proteins include antibodies, antigens, enzymes, peptides, and the like.
  • LNA locked nucleic acids
  • LNA nucleosides include common nucleic acid bases in DNA and RNA, and can form base pairs according to Watson-Crick base pairing rules. However, due to the 'locking' of the molecule due to the methylene bridge, the LNA does not form an ideal shape in the Watson-Crick bond.
  • LNAs When LNAs are incorporated into DNA or RNA oligonucleotides, LNAs can pair with complementary nucleotide chains more rapidly, increasing the stability of the double helix.
  • the "antisense” means that the antisense oligomer is hybridized with a target sequence in RNA by Watson-Crick base pairing, and typically mRNA and RNA in the target sequence: A sequence of nucleotide bases allowing the formation of an oligomeric heteroduplex. and oligomers having an inter-subunit backbone. An oligomer may have exact sequence complementarity or approximate complementarity to a target sequence.
  • amino acid sequence information of the polypeptide according to the present invention is represented by at least one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2 and 4, those skilled in the art can determine a primer, probe or antisense nucleotide that specifically binds to a gene encoding the polypeptide based on this information. It will be easy to design.
  • kits for diagnosing cancer comprising the composition for diagnosing cancer according to the present invention.
  • the diagnostic kit by using the diagnostic kit, it is possible to diagnose the onset of a cancer disease, the possibility of onset, the responsiveness to treatment, the prognosis, the stage, the possibility of recurrence, and the like.
  • the kit may be an RT-PCR kit, a DNA chip kit, an ELISA kit, a protein chip kit, a rapid kit, or a multiple reaction monitoring (MRM) kit, but is not limited thereto.
  • MRM multiple reaction monitoring
  • the cancer diagnostic kit of the present invention may further include one or more other component compositions, solutions or devices suitable for the analysis method.
  • the diagnostic kit for cancer may further include essential elements necessary for performing a reverse transcription polymerase reaction.
  • the reverse transcription polymerase reaction kit includes a pair of primers specific for a gene encoding a marker protein.
  • the primer is a nucleotide having a sequence specific to the nucleic acid sequence of the gene, and may have a length of about 7 bp to 50 bp, more preferably about 10 bp to 30 bp. It may also include primers specific for the nucleic acid sequence of the control gene.
  • reverse transcription polymerase reaction kits include test tubes or other suitable containers, reaction buffers (with varying pH and magnesium concentrations), deoxynucleotides (dNTPs), enzymes such as Taq-polymerase and reverse transcriptase, DNase, RNase inhibitor DEPC -Water (DEPC-water), sterile water, etc. may be included.
  • the diagnostic kit of the present invention may include essential elements necessary for performing a DNA chip.
  • the DNA chip kit may include a substrate to which cDNA or oligonucleotide corresponding to a gene or fragment thereof is attached, and reagents, agents, enzymes, etc. for preparing a fluorescently-labeled probe.
  • the substrate may also contain cDNA or oligonucleotides corresponding to control genes or fragments thereof.
  • the diagnostic kit of the present invention may include essential elements necessary for performing ELISA.
  • the ELISA kit contains an antibody specific for this protein.
  • Antibodies are antibodies with high specificity and affinity for a marker protein and little cross-reactivity with other proteins, and are monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, or recombinant antibodies.
  • the ELISA kit may also include an antibody specific for a control protein.
  • Other ELISA kits include reagents capable of detecting bound antibody, such as labeled secondary antibodies, chromophores, enzymes (eg, conjugated with an antibody) and substrates thereof or capable of binding the antibody. other materials and the like.
  • a well plate synthesized from a nitrocellulose membrane, a PVDF membrane, a polyvinyl resin or polystyrene resin, and a glass slide glass and the like may be used, but is not limited thereto.
  • the label of the secondary antibody is preferably a conventional color developing agent that reacts with color, and HRP (horseradish peroxidase), basic dephosphorylation enzyme (alkaline phosphatase), colloidal gold (colloid gold), FITC ( Poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC (rhodamine-B-isothiocyanate), such as a fluorescent substance (fluorescein) and a label such as a dye (dye) may be used, but is not limited thereto. .
  • HRP horseradish peroxidase
  • basic dephosphorylation enzyme alkaline phosphatase
  • colloidal gold colloid gold
  • FITC Poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate
  • RITC rhodamine-B-isothiocyanate
  • fluorescent substance fluorescein
  • dye dye
  • the chromogenic substrate for inducing color development in the diagnostic kit of the present invention is preferably used according to a marker that undergoes a color reaction, TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS [ 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)], OPD (o-phenylenediamine), etc. can be used.
  • TMB 3,3',5,5'-tetramethyl bezidine
  • ABTS 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)]
  • OPD o-phenylenediamine
  • the color development substrate is provided in a dissolved state in a buffer solution (0.1 M NaAc, pH 5.5).
  • a chromogenic substrate such as TMB is decomposed by HRP used as a marker of the secondary antibody conjugate to generate chromogenic deposits, and the presence or absence of the marker proteins is detected by visually confirming the degree of deposition of the chromogenic deposits.
  • the washing solution preferably contains a phosphate buffer, NaCl and Tween 20, and a buffer solution (PBST) composed of 0.02 M phosphate buffer, 0.13 M NaCl, and 0.05% Tween 20. more preferably.
  • PBST buffer solution
  • the secondary antibody is reacted with the antigen-antibody conjugate, and an appropriate amount is added to the immobilizer and washed 3 to 6 times.
  • a sulfuric acid solution H 2 SO 4
  • H 2 SO 4 sulfuric acid solution
  • a polypeptide represented by at least one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 5, 7 and 9 in a biological sample isolated from a subject of interest Or it relates to a method of providing information for the diagnosis of cancer comprising the step of measuring the expression level of the gene encoding the same.
  • the "target individual” refers to an individual who is uncertain whether or not the onset of the cancer has a high probability of developing it.
  • the "biological sample” refers to any material, biological fluid, tissue or cell obtained from or derived from an individual, for example, whole blood, leukocytes, peripheral blood mononuclear peripheral blood mononuclear cells, buffy coat, plasma, serum, sputum, tears, mucus, nasal washes, nasal aspirate (nasal aspirate), breath, urine, semen, saliva, peritoneal washings, ascites, cystic fluid, meningeal fluid , amniotic fluid, glandular fluid, pancreatic fluid, lymph fluid, pleural fluid, nipple aspirate, bronchial aspirate, synovial fluid), joint aspirate, organ secretions, cells, cell extract, or cerebrospinal fluid, but preferably in patients with a high risk of developing the disease.
  • Liquid biopsy collected for pathological examination by inserting a hollow needle into an in vivo organ without incision of the skin may be
  • the method may include measuring the expression level of a polypeptide or a gene encoding the polypeptide represented by at least one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 5, 7 and 9 in the biological sample isolated as described above.
  • the step of measuring the expression level may be a step of measuring the expression level of mammaglobin-A or a gene encoding the same.
  • the step of measuring the expression level in the present invention may be a step of measuring the expression level of matrix metalloproteinase-11 (MMP-11) or a gene encoding the same.
  • MMP-11 matrix metalloproteinase-11
  • the step of measuring the expression level in the present invention may be a step of measuring the expression level of Neurogenic locus notch homolog protein 1 (NOTCH 1) or a gene encoding the same.
  • NOTCH 1 Neurogenic locus notch homolog protein 1
  • the step of measuring the expression level in the present invention may be a step of measuring the expression level of Proto-oncogene Wnt-1 or a gene encoding the same.
  • the agent for measuring the expression level of the polypeptide represented by at least one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 5, 7 and 9 is not particularly limited, for example, an antibody that specifically binds to the polypeptide; It may include one or more selected from the group consisting of an oligopeptide, a ligand, a peptide nucleic acid (PNA), and an aptamer.
  • the present invention as a method for measuring or comparing the expression level of the polypeptide, protein chip analysis, immunoassay, ligand binding assay, MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) analysis, SELDI-TOF ( Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry (Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) analysis, radioimmunoassay, radioimmunodiffusion method, Oakteroni immunodiffusion method, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, complement fixation assay, 2D electrophoresis analysis, liquid chromatography Graph-mass spectrometry (liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS (liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), Western blotting and ELISA (enzyme linked immunosorbent
  • the expression level of the polypeptide represented by at least one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 5, 7 and 9 may be measured or comparatively analyzed by a multiple reaction monitoring (MRM) method.
  • MRM multiple reaction monitoring
  • the multiple reaction monitoring method may be performed using mass-spectrometry, preferably, triple quadrupole mass-spectrometry.
  • the multiple reaction monitoring (MRM) method using mass-spectrometry is an analysis technique capable of selectively separating, detecting, and quantifying a specific analyte to monitor the change in its concentration.
  • MRM is a method that can quantitatively and accurately measure multiple substances, such as trace biomarkers, present in a biological sample.
  • the mother ions among the ion fragments generated in the ionization source are selectively collided with each other. delivered to the tube
  • the mother ions arriving at the colliding tube collide with the internal colliding gas are split to generate daughter ions, and are sent to the second mass filter Q2, where only characteristic ions are delivered to the detection unit.
  • MRM is used for quantitative analysis of small molecules and is used to diagnose specific genetic diseases.
  • the MRM method has the advantage of being easy to simultaneously measure multiple peptides and confirming the relative concentration difference of protein diagnostic marker candidates between normal people and cancer patients without antibodies.
  • the MRM analysis method is being introduced for the analysis of complex proteins and peptides in blood, especially in proteome analysis using mass spectrometry.
  • the present invention it is possible to measure the expression level of the polypeptide represented by at least one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 5, 7 and 9 by the multiple reaction monitoring method.
  • the mother ion / daughter ion in the selected target peptide A pair can be selected, and the information of the mother ion/daughter ion pair is as shown in Table 1 below, but is not limited thereto.
  • the polypeptide is mammaglobin A (Mammaglobin-A), matrix metalloproteinase-11 (MMP-11), Neurogenic locus notch homolog protein 1 (NOTCH 1), and Proto-oncogene It may be represented by at least one selected from the group consisting of Wnt-1.
  • Mamma globin A Mammaglobin-A
  • matrix metalloproteinase- 11 matrix metalloproteinase-11; MMP-11
  • Neurogenic locus notch homolog protein 1 (NOTCH 1) or the expression level of Proto-oncogene Wnt-1 can be measured.
  • the mammaglobin A (Mammaglobin-A), matrix metalloproteinase-11 (MMP-11), Neurogenic locus notch homolog protein 1 (NOTCH 1), or Proto-oncogene Wnt-1
  • MMP-11 matrix metalloproteinase-11
  • NOTCH 1 Neurogenic locus notch homolog protein 1
  • Proto-oncogene Wnt-1 the absolute amount of the protein in the blood can also be measured. The accuracy of the analysis can be further improved.
  • E. coli beta galactosidase any internal standard generally used in the multi-reaction monitoring analysis may be used, for example, E. coli beta galactosidase may be used.
  • the target peptide representative of E. coli beta galactosidase consists of the polypeptide represented by SEQ ID NO: 3, and the mother ion and the daughter ion may be 542.3 m/z and 636.3 m/z, respectively, but is not limited thereto.
  • the mammaglobin A (Mammaglobin-A), matrix metalloproteinase-11 (MMP-11), Neurogenic locus notch homolog protein 1 (NOTCH 1), or Proto-oncogene Wnt
  • MMP-11 matrix metalloproteinase-11
  • NOTCH 1 Neurogenic locus notch homolog protein 1
  • Proto-oncogene Wnt In order to measure the absolute amount of -1 in blood, when a specific peptide in which some amino acids of the target peptide are substituted with stable isotopes is synthesized as an internal standard, the amino acid substituted with the isotope is lysine or arginine Preferably, but not limited thereto.
  • an agent for measuring the expression level of a gene encoding a polypeptide represented by at least one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 5, 7 and 9 includes a primer, probe and It may include one or more selected from the group consisting of antisense nucleotides.
  • reverse transcription is a process for determining the presence and expression level of a gene encoding a polypeptide represented by at least one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 5, 7 and 9.
  • RT-PCR Polymerase reaction
  • RPA RNase protection assay
  • Northern blotting Northern blotting
  • DNA chips etc., but are not limited thereto.
  • treatment responsiveness preferably Responsiveness to chemotherapy or immunotherapy can be predicted.
  • the prognosis of the subject by measuring the expression level of a polypeptide represented by at least one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 5, 7 and 9 measured with respect to the biological sample of the subject of interest, or the gene encoding the same, the prognosis of the subject, preferably It can predict the prognosis after surgery.
  • the target subject may be an individual who has had cancer and has undergone surgical resection.
  • the stage of cancer in the individual can be predicted
  • the "stage” refers to the extent to which cancer cells have spread and the stage of cancer progression
  • the international classification according to the progress of cancer generally follows the TNM stage classification.
  • 'T(Tumor Size)' is a classification according to the size of the primary tumor
  • 'N(Lymph Node)' is a classification according to the degree of lymph node metastasis
  • 'M(Metastasis)' is a classification according to whether it has metastasized to other organs.
  • T, N, and M is shown in Table 2
  • the stage classification of cancer according to this is shown in Table 3 below.
  • TNM Ordnance Justice size of primary tumor Size of the primary tumor (T stage) T0 Tumor cells that show the appearance of a malignant tumor, but are confined to the mucous membrane or epithelium, and have not yet invaded the basement membrane T1 Limited lesions in the primary organ, the tumor is mobile, and there is no invasion of adjacent and surrounding tissues T2 The size of the tumor is about 2-5 cm.
  • T3 Tumor is larger than T2 but localized within an organ T4 Adhesion and infiltration with surrounding tissues Lymph node metastasis (N stage) Lymph node status (N stage) N0 No evidence of lymph node lesions N1 Invasion of a single palpable, mobile, limited lymph node (1 to 2 cm or larger, usually up to 3 cm in size) N2 Palpable, partially mobile or hard or hard lymph nodes, microscopically evidence of involvement, clinically entangled, contralateral or bilateral (3-5 cm) N3 It is completely fixed and passes through the capsule and is completely fixed to bones, large blood vessels, skin, nerves, etc., and has a size of 6 cm or more. Whether distant metastasis (Army M) Distant metastasis (M stage) M0 No distant metastases M1 have distant metastases
  • the possibility of cancer recurrence can be predicted by measuring the expression level of a polypeptide represented by at least one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 5, 7 and 9 measured with respect to a biological sample of an individual of interest or a gene encoding the same.
  • a polypeptide represented by at least one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 5, 7 and 9 measured with respect to a biological sample of an individual of interest or a gene encoding the same.
  • a) treating a candidate drug to a sample isolated from a cancer subject or an animal model of a cancer disease; and (b) measuring the expression level of at least one polypeptide selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 5, 7 and 9 in the sample or cancer disease animal model treated with the candidate agent or the gene encoding the same It relates to a method of screening a drug for the prevention or treatment of cancer, including.
  • these biological samples can be manipulated or reacted with candidate agents for the prevention or treatment of cancer in a state in which they are not manipulated.
  • cancer disease animal model refers to an animal other than a human, which is in a state that can be determined by a person skilled in the art to be in a pathological state of cancer.
  • a polypeptide represented by at least one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 5, 7 and 9 or a gene encoding the same may be performed prior to treating the candidate drug to the sample isolated from the cancer individual or the cancer disease animal model.
  • the expression level of a polypeptide represented by at least one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 5, 7 and 9 in a sample or an animal model of cancer disease or a gene encoding the same is measured.
  • the method and the formulation used therefor overlap with those described in the method for providing information for diagnosis of cancer, and thus detailed description thereof will be omitted.
  • step (c) the expression level of a polypeptide represented by at least one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 5, 7 and 9 measured in step (b) or a gene encoding the same before the candidate agent is treated
  • the method may further include determining the candidate drug as a drug for preventing or treating cancer when it is increased or decreased compared to the above.
  • a sample portion comprising a sample obtained from a patient, a polypeptide represented by at least one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 5, 7 and 9 in the sample included in the sample, or the same a detection unit for detecting the coding gene; and a comparison unit for comparing the expression level of a polypeptide represented by at least one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 5, 7 and 9 of the patient obtained from the detection unit or a gene encoding the same with that of a normal person, wherein the A diagnostic apparatus for diagnosing cancer according to a result obtained through the comparison unit may be provided.
  • breast cancer can be diagnosed.
  • plasma was isolated from blood samples obtained from 10 breast cancer patients, 10 benign tumor patients, and 10 normal controls, and total protein was quantified through Bradford assay. .
  • 200 ⁇ g of total protein was modified with urea, reduced with dithiothreitol (DTT), and alkylated with iodoacetamide. Thereafter, trypsin was added to peptide, and salts were removed using a C18 column.
  • DTT dithiothreitol
  • salts were removed using a C18 column.
  • a synthetic product in which the amino acid group attached to the end of the peptide is substituted with an isotope was used.
  • a target peptide of mammaglobin-A of the present invention and a pair of a mother ion and a daughter ion were selected, and the results are shown in Table 4 below.
  • the final sample prepared in 1-1 above was subjected to reverse-phase resin chromatography to separate plasma peptide fragments, and MRM spectra of each peptide were obtained using a triple quadrupole mass spectrometer (instrument: 5500 Qtrap, AB Sciex, USA).
  • reversed-phase resin chromatography was performed using a acetonitrile concentration gradient of 5% to 40% for 45 minutes with a HALOTM C18 column (Eksigent, USA) column.
  • Quantitative information was confirmed by calculating the peak area of the MRM chromatogram of the target peptide with MultiQuantTM computer quantitative analysis program (AB Sciex, USA).
  • the quantitative value of each target peptide was expressed as a ratio to the peak area of the MRM chromatogram of E. coli beta-galactosidase added as an internal standard.
  • Example 1 is a graph showing the results of confirming the difference in the expression level of mammaglobin A (Mammaglobin-A) between a breast cancer patient, a benign tumor patient, and a non-patient control in Example 1 of the present invention.
  • mammaglobin-A mammaglobin A
  • mammaglobin-A mammaglobin A
  • the mammaglobin-A marker using the target peptide represented by SEQ ID NO: 2 of the present invention can diagnose breast cancer with high accuracy.
  • plasma was isolated from blood samples obtained from 10 breast cancer patients, 10 benign tumor patients, and 10 controls, and total protein was quantified through Bradford assay. Of these, 200 ⁇ g of total protein was modified with urea, reduced with dithiothreitol (DTT), and alkylated with iodoacetamide. Thereafter, trypsin was added to peptide, and salts were removed using a C18 column. As an internal standard, a synthetic product in which the amino acid group attached to the end of the peptide is substituted with an isotope was used.
  • DTT dithiothreitol
  • MMP-11 matrix metalloproteinase-11
  • the final sample prepared in 2-1. was subjected to reverse-phase resin chromatography to separate plasma peptide fragments, and MRM spectra of each peptide were obtained using a triple quadrupole mass spectrometer (instrument: 5500 Qtrap, AB Sciex, USA).
  • reversed-phase resin chromatography was performed using a acetonitrile concentration gradient of 5% to 40% for 45 minutes with a HALOTM C18 column (Eksigent, USA) column. Quantitative information was confirmed by calculating the peak area of the MRM chromatogram of the target peptide with MultiQuantTM computer quantitative analysis program (AB Sciex, USA).
  • Example 2 is a graph showing the results of confirming the difference in the expression level of matrix metalloproteinase-11 (MMP-11) between breast cancer patients, benign tumor patients and non-patient controls in Example 2 of the present invention; am.
  • MMP-11 matrix metalloproteinase-11
  • MMP-11 matrix metalloproteinase-11
  • MMP-11 matrix metalloproteinase-11
  • plasma was separated from blood samples obtained from breast cancer patients and normal controls, and total protein was quantified through Bradford assay.
  • a target peptide of Neurogenic locus notch homolog protein 1 (NOTCH 1) of the present invention and a pair of mother and daughter ions were selected, and the results are shown in Table 6 below.
  • Plasma peptide fragments were separated by subjecting the final sample prepared in 3-1. above to reverse-phase resin chromatography, and the MRM spectrum of each peptide was obtained using a triple quadrupole mass spectrometer (instrument: 5500 Qtrap, AB Sciex, USA). At this time, reversed-phase resin chromatography was performed using a acetonitrile concentration gradient of 5% to 40% for 45 minutes with a HALOTM C18 column (Eksigent, USA) column. Quantitative information was confirmed by calculating the peak area of the MRM chromatogram of the target peptide with MultiQuantTM computer quantitative analysis program (AB Sciex, USA). At this time, the quantitative value of each target peptide was expressed as a ratio to the peak area of the MRM chromatogram of E. coli beta-galactosidase added as an internal standard.
  • the Neurogenic locus notch homolog protein 1 (NOTCH 1) marker using the target peptide represented by SEQ ID NO: 7 of the present invention can diagnose breast cancer with high accuracy.
  • Plasma peptide fragments were separated by subjecting the final sample prepared in 4-1. above to reverse-phase resin chromatography, and the MRM spectrum of each peptide was obtained using a triple quadrupole mass spectrometer (instrument: 5500 Qtrap, AB Sciex, USA). At this time, reversed-phase resin chromatography was performed using a acetonitrile concentration gradient of 5% to 40% for 45 minutes with a HALOTM C18 column (Eksigent, USA) column. Quantitative information was confirmed by calculating the peak area of the MRM chromatogram of the target peptide with MultiQuantTM computer quantitative analysis program (AB Sciex, USA).
  • Example 4 is a graph showing the results of confirming the difference in the expression level of Proto-oncogene Wnt-1 between breast cancer patients and non-patient controls in Example 4 of the present invention.
  • the Proto-oncogene Wnt-1 marker using the target peptide represented by SEQ ID NO: 9 of the present invention can diagnose breast cancer with high accuracy.
  • cancer in particular, breast cancer can be diagnosed easily and accurately at an early stage, and more Furthermore, it is possible to diagnose the stage of cancer and predict treatment responsiveness or prognosis after treatment.

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Abstract

Mammaglobin-A, MMP-11, NOTCH1, Wnt-1 유래 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 암의 진단용 조성물, 이를 포함하는 진단용 키트 및 상기 조성물을 이용하여 암의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

Description

암의 진단용 조성물
본 발명은 암을 진단할 수 있는 조성물, 이를 포함하는 진단용 키트 및 상기 조성물을 이용하여 암의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
전 세계에서 유방암은 폐암에 이어 두 번째로 흔히 발생되는 암이며, 사망률은 5위에 해당하는 위험한 암이다. 특히 최근에는 저출산, 짧은 수유기간, 이른 초경, 늦은 폐경 등 생리적으로 왕성한 신체적 변화를 겪는 시기의 여성들에서는 여성호르몬의 자극을 받는 횟수의 급격한 증가로 인한 유선조직의 민감도 증가, 식생활의 서구화, 생활환경의 오염 등의 이유로 유방암 발생이 급격하게 증가하고 있다. 유방암의 경우 일단 암세포가 주변 조직에 침범하거나 림프절로 전이가 시작되면 완치가 어렵기 때문에 조기 발견이 다른 암보다 더 중요하다고 할 수 있다.
유방암으로 인한 사망률을 줄이기 위해서는 첫째, 유방암을 조기 진단하고, 둘째, 일차 수술에 의한 치료 이후 예후를 진단하여 적절한 부가 치료 (Adjuvant therapy)를 하는 것이 중요하다. 현재 유방암 진단에는 1차 촉진에 의한 자가 진단 외에, 유방 X-선 조영술, 초음파검사법 등이 예방차원에서의 검진방법으로 사용되고 있으며 이 방법은 초기의 유방암을 진단하는 데에도 가장 널리 사용되는 방법이다. 그러나 유방 X-선 조영술은 우리나라 여성들에서 흔히 발견되는 조밀유방일 경우 섬유질이 많아서, 진단율이 떨어지는 단점이 있으며, 특히 젊은 여성같이 유선이 많이 발달되어 있어도 진단율이 떨어진다. 또한, X-선을 사용하기 때문에 진단 과정에서 오히려 유방암이 생길 가능성도 배제할 수 없다. 그래서 대안으로 초음파검사법이 사용되고 있지만 이 역시 악성종양(cancer)과 양성종양(non-cancer)을 구별하기는 쉽지 않다. 실제 임상에서는 이상 소견이 있으면 세침흡입세포검사법, 자기공명촬영법 등을 부가적으로 사용하여 진단율을 높이고 있다. 그러나 이 방법들을 사용하더라도 정상조직과 비 정상조직을 형태상으로 구분할 뿐 악성종양(cancer)과 양성종양(non-cancer)을 구분하기가 쉽지 않기 때문에 확진을 위해서는 더욱 정밀한 조직검사를 하게 된다. 이와 같은 이유들로 인해 유방암은 다른 암에 비해 비교적 분자 유전학적인 방법으로 유방암을 진단하는 방법이 발달되어 있다.
본 발명과 관련해, 유전자 또는 단백질의 발현과 유방암과의 관계를 좀 더 빠르고 확실하게 탐지하여 진단하기 위한 시도가 다양하게 이루어지고 있다.
본 발명의 일 목적은 암 중에서도 특히 유방암을 정확하고 간편하게 진단할 수 있는 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 암 중에서도 특히 유방암을 정확하고 간편하게 진단할 수 있는 키트를 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 중에서도 특히 유방암을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 중에서도 특히 유방암의 치료 반응성을 예측하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 중에서도 특히 유방암의 예후를 예측하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 중에서도 특히 유방암의 병기를 예측하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 중에서도 특히 유방암의 재발 가능성을 예측하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 중에서도 특히 유방암을 치료하기 위한 약물을 스크리닝하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 중에서도 특히 유방암을 진단하기 위한 진단 장치를 제공하고자 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 암의 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 암은 유방암, 난소암, 대장암, 위암, 간암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종인, 암의 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩티드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 암의 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 암의 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 암의 진단용 조성물을 포함하는 암의 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트인, 암의 진단용 키트 일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 암의 진단을 위한 정보 제공 방법일 수 있다.
본 발명에서 상기 "생물학적 시료" 내지 "시료"는 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 복수(ascites), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 또는 뇌척수액(cerebrospinal fluid)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩티드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드의 발현 수준의 측정은 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 또는 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay)에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드의 발현 수준의 측정은 다중 반응 모니터링 (multiple reaction monitoring; MRM) 방법에 의하는, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법일 수 있다.
본 발명에서 상기 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드의 타겟 펩티드의 서열번호 2의 어미이온의 질량 대 전하비는 443.753 m/z일 수 있고, 딸이온의 질량 대 전하비는 672.367515, 558.324588, 461.271824, 333.213246, 234.144832 m/z일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드의 타겟 펩티드의 서열번호 5의 어미이온의 질량 대 전하비는 395.216 m/z일 수 있고, 딸이온의 질량 대 전하비는 718.3883, 605.3042, 476.2616, 419.2401 및 272.1717 m/z일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드의 타겟 펩티드의 서열번호 7의 어미이온의 질량 대 전하비는 336.607 m/z일 수 있고, 딸이온의 질량 대 전하비는 447.235, 403.719, 360.203, 286.669, 218.139 및 144.605 m/z일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드의 타겟 펩티드의 서열번호 9의 어미이온의 질량 대 전하비는 455.7113 m/z일 수 있고, 딸이온의 질량 대 전하비는 634.3042, 535.2358, 420.2089, 333.1769 및 276.1554 m/z일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 모니터링 방법 시 내부 표준 물질은 타겟 펩티드를 구성하는 특정 아미노산을 동위원소로 치환한 합성 펩티드 또는 대장균 베타 갈락토시다아제를 사용하는, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법일 수 있다.
본 발명에서 상기 대장균 베타 갈락토시다아제의 타겟 펩티드는 서열번호 3으로 표시되는 폴리펩티드로 이루어지며 어미이온과 딸이온은 각각 542.3 m/z 와 636.3 m/z일 수 있다.
본 발명에서 상기 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현 수준의 측정은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩에 의하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 증가한 경우, 상기 암의 발병 가능성이 높은 것으로 예측하는 단계를 포함하는 암의 진단을 위한 정보 제공 방법일 수 있다.
본 발명에서 상기 정보 제공 방법은 목적하는 개체가 외과적 수술 후 예후를 예측하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 정보 제공 방법은 상기 목적하는 개체의 암의 병기를 진단하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 정보 제공 방법은 상기 목적하는 개체의 암의 재발 가능성을 예측하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 암은 유방암, 난소암, 대장암, 위암, 간암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, (a) 암 개체로부터 분리한 시료 또는 암 질환 동물 모델에 후보 약제를 처리하는 단계; 및 (b) 상기 후보 약제가 처리된 시료 또는 암 질환 동물 모델에서 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약물을 스크리닝하는 방법에 관한 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 시료는 암 개체로부터 분리된 세포 또는 조직일 수 있다.
본 발명에서 (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 상기 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 후보 약제가 처리되기 전에 비하여 증가하거나 감소한 경우 상기 후보 약제를 암의 예방 또는 치료용 약제로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 암은 유방암, 난소암, 대장암, 위암, 간암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 환자로부터 수득된 시료를 포함하는 시료부, 상기 시료에 포함된 시료에서 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자를 검출하는 검출부; 및 상기 검출부로부터 수득된 환자의 상기 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준과 정상인의 수준을 비교하는 비교부를 포함하고, 상기 비교부를 통해서 얻는 결과에 따라 암을 진단하는, 진단 장치 일 수 있다.
본 발명에서, 상기 비교부에서 상기 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자가 검출된 경우 유방암으로 진단하는, 진단 장치일 수 있다.
본 발명의 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드를 포함하는 바이오마커를 사용하는 경우, 암, 특히는 유방암을 조기에 간편하고 정확하게 진단할 수 있으며, 더 나아가서는 암의 병기를 진단할 수 있고, 치료 반응성 또는 치료 후 예후를 예측할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에서 유방암 환자, 양성 종양 환자 및 비 환자 대조군 사이에 맘마글로빈 A(Mammaglobin-A) 발현량의 차이를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예 2에서 유방암 환자와 비 환자 대조군 사이에 매트릭스 메탈로프로테이나제-11(matrix metalloproteinase-11; MMP-11) 발현량의 차이를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실시예 3에서 유방암 환자와 비 환자 대조군 사이에 서열번호 7로 표시되는 폴리펩티드의 타겟 펩티드를 이용한 Neurogenic locus notch homolog protein 1(NOTCH 1)의 바이오마커의 정량 결과를 바탕으로 한 수용자-조작 특성(ROC) 그래프를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 실시예 4에서 유방암 환자, 양성 종양 환자 및 비 환자 대조군 사이에 Proto-oncogene Wnt-1 발현량의 차이를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 1에서 보는 바와 같이, 유방암 환자는 양성종양 환자군 및 비 환자 대조군 사이에 맘마글로빈 A(Mammaglobin-A)의 단백질 발현량이 차이가 있었다. 이처럼 본 발명의 서열번호 2로 표시되는 타겟 펩티드를 이용한 맘마글로빈 A(Mammaglobin-A) 마커는 높은 정확도로 유방암을 진단할 수 있음을 알 수 있었다.
또한, 도 2에서 보는 바와 같이, 유방암 환자, 양성 종양 환자 및 비 환자 대조군 사이에 매트릭스 메탈로프로테이나제-11(matrix metalloproteinase-11; MMP-11)의 단백질 발현량의 차이를 확인하였다. 이처럼 본 발명의 서열번호 5로 표시되는 타겟 펩티드를 이용한 매트릭스 메탈로프로테이나제-11(matrix metalloproteinase-11; MMP-11) 마커는 높은 정확도로 유방암을 진단할 수 있음을 알 수 있었다.
또한, 도 3에서 보는 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 서열번호 7로 표시되는 폴리펩티드의 타겟 펩티드를 이용한 경우 유방암 환자들과 정상 대조군들에 대한 수용자-조작 특성(ROC) 그래프로 도시한 결과 AUC(area under the curve) 값이 0.8875로 매우 높은 진단의 정확도를 보였다. 이처럼 본 발명의 서열번호 7로 표시되는 타겟 펩티드를 이용한 Neurogenic locus notch homolog protein 1(NOTCH 1) 마커는 높은 정확도로 유방암을 진단할 수 있음을 알 수 있었다.
또한, 도 4에서 보는 바와 같이, 유방암 환자와 비 환자 대조군 사이에 Proto-oncogene Wnt-1의 단백질 발현량의 차이를 확인하였다. 이처럼 본 발명의 서열번호 9로 표시되는 타겟 펩티드를 이용한 Proto-oncogene Wnt-1 마커는 높은 정확도로 유방암을 진단할 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 암의 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 폴리펩티드의 발현 수준을 측정하는 제제는 맘마글로빈 A(Mammaglobin-A)의 발현 수준을 측정하는 제제일 수 있다.
맘마글로빈 A(Mammaglobin-A, MGB1)는 10 kDa 당단백질을 암호화하는 11번 염색체 상(11q13)에 있는 유테로글루빈 유전자 패밀리의 유방-특이적 유전자인 SCGB2A2에서 발현되는 단백질이다. 맘마글로빈 A(Mammaglobin-A)는 유방 상피 및 유방암 조직에서 과발현하는 것이 알려져 있어 유방암에 대한 분자적 마커로 주목받고 있다. 또한, 유방암 세포 표면에 존재함에 따라 유방암 조직으로의 표적 약물(targeted-drug)의 전달을 위한 유용한 분자적 마커로 제안되고 있다.
본 발명에서 상기 맘마글로빈 A(Mammaglobin-A)는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 폴리펩티드의 발현 수준을 측정하는 제제는 매트릭스 메탈로프로테이나제-11(Stromelysin-3, matrix metalloproteinase-11; MMP-11)의 발현 수준을 측정하는 제제일 수 있다. 상기 MMP-11은 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP) 패밀리의 단백질로, 배아 발달, 생식 및 조직 리모델링과 같은 정상적인 생리 학적 과정뿐만 아니라 관절염 및 암 전이와 같은 질병 과정에서 세포 외 기질의 분해에 관여한다. 대부분의 MMP는 세포 외 프로테이나아제에 의해 절단될 때 활성화되는 불활성 전구단백질로서 분비된다. 그러나, 이 유전자에 의해 암호화된 효소는 구성 분비 경로 내에서 푸린에 의해 세포 내에서 활성화된다. 또한 다른 MMP와는 달리, 이 효소는 알파 1-단백 분해 효소 억제제를 절단하지만 세포 외 기질의 구조 단백질을 약하게 분해한다.
본 발명에서 상기 매트릭스 메탈로프로테이나제-11(matrix metalloproteinase-11; MMP-11)은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 폴리펩티드의 발현 수준을 측정하는 제제는 Neurogenic locus notch homolog protein 1(NOTCH 1)의 발현 수준을 측정하는 제제일 수 있다. 상기 NOTCH 유전자는 단일-통과 막 횡단 수용체를 암호화하는 인간 유전자이다.
Notch 1 막 횡단 단백질 패밀리의 구성원은 다중 표피 성장 인자-유사 (EGF) 반복으로 구성된 세포 외 도메인 및 다수의 상이한 도메인 유형으로 구성된 세포 내 도메인을 포함하는 구조적 특성을 공유한다. NOTCH 패밀리는 세포 운명 결정을 제어하여 다양한 발생 과정을 조절한다 NOTCH 신호 전달 네트워크는 물리적으로 인접한 세포 사이의 상호 작용을 조절하는 진화적으로 보존된 세포 간 신호 전달 경로이다.
본 발명에서 상기 Neurogenic locus notch homolog protein 1(NOTCH 1)은 서열번호 6로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 폴리펩티드의 발현 수준을 측정하는 제제는 Proto-oncogene Wnt-1의 발현 수준을 측정하는 제제일 수 있다. 상기 WNT1 유전자는 WNT 유전자 패밀리의 하나로, 분비된 신호 전달 단백질을 암호화하는 구조적으로 관련된 유전자로 구성된다. 이들 단백질은 발암 동안 및 세포 발달의 조절 패턴을 비롯한 여러 발달 과정에서 암 발생에 연루되어있다. 이 유전자는 진화적으로 매우 보존되며, 이 유전자에 의해 코딩된 단백질은 아미노산 수준에서 마우스 Wnt1 단백질과 98 % 동일한 것으로 알려져있다. 마우스에서의 연구는 Wnt1 단백질이 중뇌 및 소뇌의 유도에서 기능한다는 것을 나타낸다.
본 발명에서 상기 Proto-oncogene Wnt-1은 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 진단의 대상이 되는 질환으로 상기 "암"은 포유류에서 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장으로 특징 지어진 생리적 상태를 나타내거나 가리킨다. 본 발명에서 진단의 대상이 되는 암은 유방암, 난소암, 대장암, 위암, 간암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종일 수 있으나, 바람직하게는 유방암일 수 있다.
본 발명에서 상기 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 대상(subject)의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 대상이 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 대상의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함한다. 본 발명의 목적상, 상기 진단은 상기한 암의 발병 여부 또는 발병 가능성(위험성)을 확인하는 것이다.
본 발명에서 상기 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드의 발현 수준을 측정하는 제제는 특별히 제한하지는 않으나, 예를 들면 상기 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩티드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에 상기 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질을 가리킨다. 본 발명의 목적상, 항체는 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다.
본 발명의 상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 상기 항체는 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 다클론 항체는 상기 단백질의 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 과정을 포함하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물로부터 제조될 수 있다. 또한, 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method), 또는 파지 항체 라이브러리 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전장의 경쇄 및 2개의 전장의 중쇄를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
본 발명에 상기 "PNA(Peptide Nucleic Acid)"는 인공적으로 합성된, DNA 또는 RNA와 비슷한 중합체를 가리키며, 1991년 덴마크 코펜하겐 대학교의 Nielsen, Egholm, Berg와 Buchardt 교수에 의해 처음으로 소개되었다. DNA는 인산-리보스당 골격을 갖는데 반해, PNA는 펩티드 결합에 의해 연결된 반복된 N-(2-아미노에틸)-글리신 골격을 가지며, 이로 인해 DNA 또는 RNA에 대한 결합력과 안정성이 크게 증가되어 분자 생물학, 진단 분석 및 안티센스 치료법에 사용되고 있다.
본 발명에서 상기 "앱타머"는 올리고핵산 또는 펩티드 분자이며, 단백질에 대하여 고친화도를 가지는 리간드-특이 DNA 또는 RNA 분자를 의미한다. 앱타머는 특정 물질에 대해 특이적 결합 능력을 가지는 단일가닥의 DNA 또는 RNA를 말하며, 그 자체로 고유한 3차 구조를 갖는다. 화학적 합성 기법을 이용하여 짧은 시간과 낮은 비용으로 대량 생산이 가능하며 배치 간 변이가 거의 없어 생산적인 측면에서 탁월한 장점을 갖고 있다. 뿐만 아니라, pH나 온도와 같이 주변 환경의 변화에 대한 안정성이 높아 최근 표적 물질의 탐지 및 질환 진단 센서 개발과 같이 다양한 분야에서의 활용 가능성이 높이 평가되고 있다.
본 발명에서 상기 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 "프라이머"는 표적 유전자 서열을 인지하는 단편으로서, 정방향 및 역방향의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료 내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성이 부여될 수 있다.
본 발명에서 상기 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, RNA 또는 DNA일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함하는 것으로, 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩티드 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 "LNA(Locked nucleic acids)"란, 2'-O, 4'-C 메틸렌 브릿지를 포함하는 핵산 아날로그를 의미한다. LNA 뉴클레오사이드는 DNA와 RNA의 일반적 핵산 염기를 포함하며, Watson-Crick 염기 쌍 규칙에 따라 염기 쌍을 형성할 수 있다. 하지만, 메틸렌 브릿지로 인한 분자의 'locking'으로 인해, LNA는 Watson-Crick 결합에서 이상적 형상을 형성하지 못하게 된다. LNA가 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드에 포함되면, LNA는 보다 빠르게 상보적 뉴클레오티드 사슬과 쌍을 이루어 이중 나선의 안정성을 높일 수 있다. 본 발명에서 상기 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 의미한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드의 아미노산 서열 정보는 서열번호 2 및 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되므로, 당업자라면 이를 바탕으로 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 용이하게 디자인할 수 있을 것이다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에 따른 암의 진단용 조성물을 포함하는 암의 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명에서는 상기 진단용 키트를 이용하여 암 질환의 발병 여부, 발병 가능성, 치료 반응성, 예후, 병기, 재발 가능성 등을 진단할 수 있다.
본 발명에서 상기 진단의 대상이 되는 상기 암에 관한 기재는 앞서 기재된 바와 중복되어 명세서의 과도한 복잡을 피하기 위하여 이하 그 자세한 기재를 생략한다.
본 발명에서 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 암의 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 발명에서 상기 암의 진단용 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 더 포함할 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 단백질을 코딩하는 유전자에 대해 특이적인 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 상기 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오티드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp의 길이를 가질 수 있다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 용기, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 진단용 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표지 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 진단용 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대해 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 진단용 키트에서 항원-항체 결합반응을 위한 고정체로는 니트로셀룰로오즈 막, PVDF 막, 폴리비닐(polyvinyl) 수지 또는 폴리스티렌(polystyrene) 수지로 합성된 웰 플레이트(Well plate), 유리로 된 슬라이드 글래스 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 진단용 키트에서 2차 항체의 표지체는 발색 반응을 하는 통상의 발색제가 바람직하며, HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(coloid gold), FITC(폴리 L-라이신-플루오르세인 아이소티오시아네이트), RITC(로다민-B-아이소티오시아네이트) 등의 형광물질(fluorescein) 및 색소(dye) 등의 표지체가 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 진단용 키트에서 발색을 유도하기 위한 발색 기질은 발색 반응을 하는 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, TMB(3,3',5,5'-테트라메틸 베지딘), ABTS[2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)], OPD(o-페닐렌다이아민) 등을 사용할 수 있다. 이때, 발색기질은 완충용액(0.1 M NaAc, pH 5.5)에 용해된 상태로 제공되는 것이 더욱 바람직하다. TMB와 같은 발색기질은 이차항체 접합체의 표지체로 사용된 HRP에 의해 분해되어 발색 침적체를 생성하고, 이 발색 침적체의 침적 정도를 육안으로 확인함으로써 상기 마커 단백질들의 존재 유무를 검출한다.
본 발명의 진단용 키트에서 세척액은 인산염 완충용액, NaCl 및 트윈 20(Tween 20)을 포함하는 것이 바람직하며, 0.02 M 인산염 완충용액, 0.13 M NaCl, 및 0.05% 트윈 20으로 구성된 완충용액(PBST)이 더욱 바람직하다. 세척액은 항원-항체 결합반응 후 항원-항체 결합체에 2차 항체를 반응시킨 다음 적당량을 고정체에 첨가하여 3 내지 6회 세척한다. 반응 정지용액은 황산 용액(H2SO4)이 바람직하게 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 암의 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 "목적하는 개체"란, 상기 암의 발병 여부가 불확실한 개체로, 발병 가능성이 높은 개체를 의미한다.
본 발명에서 상기 "생물학적 시료"는 개체로부터 얻어지거나 개체로부터 유래된 임의의 물질, 생물학적 체액, 조직 또는 세포를 의미하는 것으로, 예를 들면, 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 복수(ascites), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 또는 뇌척수액(cerebrospinal fluid)을 포함할 수 있지만, 바람직하게는 발병 가능성이 높은 환자의 피부를 절개하지 않고 중공침 등을 생체 내 기관에 자입하여 병리조직학적 검사용으로 채취한 액체 생검(예를 들면, 환자의 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 객담 또는 복수(ascites) 등)일 수 있다.
본 발명에서는 상기와 같이 분리된 생물학적 시료에서 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 발현 수준을 측정하는 단계는 맘마글로빈 A(Mammaglobin-A) 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 발현 수준을 측정하는 단계는 매트릭스 메탈로프로테이나제-11(matrix metalloproteinase-11; MMP-11) 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 발현 수준을 측정하는 단계는 Neurogenic locus notch homolog protein 1(NOTCH 1) 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 발현 수준을 측정하는 단계는 Proto-oncogene Wnt-1 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계일 수 있다.
본 발명에서 상기 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드의 발현 수준을 측정하는 제제는 특별히 제한하지는 않으나, 예를 들면 상기 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩티드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에 상기 폴리펩티드의 발현 수준을 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드의 발현 수준을 측정 또는 비교 분석 방법으로는 다중 반응 모니터링 (multiple reaction monitoring; MRM) 방법에 의할 수 있다.
본 발명에서 상기 다중 반응 모니터링 방법은 질량분석기 (mass-spectrometry), 바람직하게는 삼중 사극자 질량분석기 (triple quadrupole mass-spectrometry)를 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명에서 질량분석기 (mass-spectrometry)를 이용한 다중 반응 모니터링 (multiple reaction monitoring; MRM) 방법은 특정 분석물질을 선택적으로 분리하여 검출하고 정량하여 그 농도변화를 모니터링할 수 있는 분석기술이다. MRM은 생체 시료 중에 존재하는 미량의 바이오마커와 같은 물질을 정량적으로 정확하게 다중 측정할 수 있는 방법으로 제1 질량필터 (Q1)를 이용하여 이온화원에서 생성된 이온 단편들 중 어미이온을 선택적으로 충돌관으로 전달한다. 이어 충돌관에 도달한 어미이온은 내부 충돌기체와 충돌하여, 쪼개져 딸이온을 생성하여 제2 질량 필터 (Q2)로 보내지고, 여기서 특징적인 이온만이 검출부로 전달된다. 이런 방식으로 목적하는 성분의 정보만을 검출할 수 있는 선택성 및 민감도가 높은 분석방법이다. MRM은 작은 분자의 정량분석에 활용되어 특정 유전병을 진단하는데 쓰이고 있다. MRM 방법은 다수의 펩티드를 동시에 측정하기에 용이하며, 항체가 없이 정상인과 암환자 사이에서 단백질 진단 마커 후보들의 상대적 농도차를 확인할 수 있다는 장점이 있다. 또한 민감도와 선택성이 탁월하여 특히, 질량분석기를 이용한 프로테옴 분석에서 혈액 내에 있는 복잡한 단백질과 펩티드의 분석을 위해 MRM 분석방법이 도입되고 있다.
본 발명에서 상기 다중 반응 모니터링 방법에 의해 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드의 발현 수준의 측정을 할 수 있다.
본 발명에서 상기 다중 반응 모니터링 방법에 의해 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드의 발현 수준을 분석하기 위하여, 상기 선정된 타겟 펩티드에서의 어미이온/딸이온 쌍을 선정할 수 있고, 이때 어미이온/딸이온 쌍의 정보는 하기 표 1에 나타낸 바와 같으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구분 유전자 명칭 단백질 명칭 uniprotKB 펩티드 서열 어미이온 딸이온
1 SCGB2A2 맘마글로빈 A Q13296 TINPQVSK
(서열번호 2)		 443.753 672.367515 2Y6
558.324588 2Y5
461.271824 2Y4
333.213246 2Y3
234.144832 2Y2
2 MMP11 Stromelysin-3
(MMP-11)		 P24347 ALEGFPR
(서열번호 5)		 395.216 718.3883 2Y6
605.3042 2Y5
476.2616 2Y4
419.2401 2Y3
272.1717 2Y2
3 NOTCH Neurogenic locus notch homolog protein 1 P46531 NSSFHFLR
(서열번호 7)		 336.607 447.235 3y7+2
403.719 3y6+2
360.203 3y5+2
286.669 3y4+2
218.139 3y3+2
144.605 3y2+2
4 WNT1 WNT-1 P04628 EFVDSGEK (서열번호 9) 455.7113 634.3042 2Y6
535.2358 2Y5
420.2089 2Y4
333.1769 2Y3
276.1554 2Y2
본 발명에서 폴리펩티드는 폴리펩티드는 맘마글로빈 A(Mammaglobin-A), 매트릭스 메탈로프로테이나제-11(matrix metalloproteinase-11; MMP-11), Neurogenic locus notch homolog protein 1(NOTCH 1), 및 Proto-oncogene Wnt-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 것일 수 있다. 상기 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드의 타겟 펩티드를 이용하여 목적하는 개체의 생물학적 시료 속의 맘마글로빈 A(Mammaglobin-A), 매트릭스 메탈로프로테이나제-11(matrix metalloproteinase-11; MMP-11), Neurogenic locus notch homolog protein 1(NOTCH 1), 또는 Proto-oncogene Wnt-1의 발현 수준을 측정할 수 있다.
본 발명에서는 상기 맘마글로빈 A(Mammaglobin-A), 매트릭스 메탈로프로테이나제-11(matrix metalloproteinase-11; MMP-11), Neurogenic locus notch homolog protein 1(NOTCH 1), 또는 Proto-oncogene Wnt-1을 검출하기 위하여, 상기한 각각의 단백질의 타겟 펩티드 중 일부 아미노산이 안정한 동위원소로 치환된 펩티드를 합성하고, 다중 반응 모니터링 분석 시 내부 표준 물질로 사용하면 상기 단백질의 혈액 내 절대량도 측정할 수 있어 분석의 정확도를 더욱 높일 수 있다.
본 발명에 있어서 내부 표준 물질은 상기 다중 반응 모니터링 분석 시 일반적으로 사용되는 임의의 내부 표준 물질이 사용될 수 있으나, 예를 들어, 대장균 베타 갈락토시다아제가 사용될 수 있다. 대장균 베타 갈락토시다아제를 대표하는 타겟 펩티드는 서열번호 3으로 표시되는 폴리펩티드로 이루어지며 어미이온과 딸이온은 각각 542.3 m/z 와 636.3 m/z 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 맘마글로빈 A(Mammaglobin-A), 매트릭스 메탈로프로테이나제-11(matrix metalloproteinase-11; MMP-11), Neurogenic locus notch homolog protein 1(NOTCH 1), 또는 Proto-oncogene Wnt-1의 혈액 내 절대량을 측정하기 위하여 타겟 펩티드의 일부 아미노산이 안정한 동위원소로 치환된 특정 펩티드를 내부 표준물질로서 합성하는 경우, 동위 원소로 치환된 아미노산은 리신(Lysine)이나 아르기닌(Arginine)이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 여기서 합성된 펩티드는 95% 이상 순수 분리된 펩티드를 사용하는 것이 바람직하다.
한편, 본 발명에서 상기 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에 상기 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정하는 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 증가하거나 감소한 경우, 상기 암의 발병 가능성이 높은 것으로 예측할 수 있다.
본 발명에서 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하여 치료 반응성, 바람직하게는 화학적 항암 치료 또는 면역 치료에 대한 반응성을 예측할 수 있다.
본 발명에서 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하여 상기 개체의 예후, 바람직하게는 외과적 수술 후 예후를 예측할 수 있다. 여기서 상기 목적하는 개체는 암이 발병하여 외과적 절제 수술을 받은 개체일 수 있다.
본 발명에서 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하여 상기 개체에서 암의 병기를 예측할 수 있다.
본 발명에서 상기 "병기(stage)"란 암세포가 퍼진 정도, 암의 진행 단계를 의미하는 것으로, 암의 진행상황에 따른 국제적분류는 일반적으로 TNM 병기 분류에 따른다. 여기서 'T(Tumor Size)'는 원발 종양의 크기에 따른 분류이고, 'N(Lymph Node)'은 림프절 전이 정도에 따른 분류이며, 'M(Metastasis)'은 다른 장기로의 전이 여부에 따른 분류에 해당한다. T, N, M에 있어서 상세 분류는 하기 표 2와 같으며 이에 따른 암의 병기 분류는 하기 표 3과 같다.
TNM 병기 정의
원발 종양의 크기
(T 병기)
Size of the primary tumor
(T stage)		 T0 종양세포의 형태가 악성종양의 모습을 보이나 발생한 점막 또는 상피에 국한돼 있고 아직 기저막을 침윤하지 않은 종양
T1 원발된 장기에 제한된 병변, 종양이 가동성이 있으며 인접 및 주위조직에 침범이 없음
T2 종양의 크기가 2~5cm 정도
T3 종양의 크기가 T2 보다 크나 장기 내에 국한됨
T4 주변 조직과 유착 및 침윤한 상태
림프절 전이 여부
(N 병기)
Lymph node status
(N stage)		 N0 림프절 병변의 증거가 없음
N1 촉지되고 가동성이 있으며 첫 번째 위치에 제한되어 있는 림프절(1~2cm 이상, 보통 3cm까지의 크기) 하나에 침범
N2 촉지되고 부분적으로 가동성이 있는 또는 단단하거나 딱딱한 림프절, 현미경적으로 침범의 증거가 있고 임상적으로 서로 엉켜있으며 반대측 또는 양측에서 나타남(3~5cm)
N3 완전히 고정되어 있고 피막을 통과해 뼈나 큰 혈관, 피부, 신경 등에 완전히 고정되어 있으며 6cm 이상의 크기
원격전이 여부
(M 병기)
Distant metastasis
(M stage)		 M0 원격전이가 없음
M1 원격전이가 있음
병기분류 T1 T2 T3 T4
N0 1기 2기
N1 3기
N2
N3
M1 4기
본 발명에서 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하여 암의 재발 가능성을 예측할 수 있다. 본 발명에서 상기 암에 관한 기재는 앞서 기재된 바와 중복되어 명세서의 과도한 복잡을 피하기 위하여 이하 그 자세한 기재를 생략한다. 본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, (a) 암 개체로부터 분리한 시료 또는 암 질환 동물 모델에 후보 약제를 처리하는 단계; 및 (b) 상기 후보 약제가 처리된 시료 또는 암 질환 동물 모델에서 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 시료 및 상기 암에 관한 기재는 앞서 기재된 바와 중복되어 명세서의 과도한 복잡을 피하기 위하여 이하 그 자세한 기재를 생략한다.
본 발명에서 이들 생물학적 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 암의 예방 또는 치료용 후보 약제와 반응시킬 수 있다.
본 발명에 상기 "암 질환 동물 모델"이란 인간을 제외한 동물로서, 암의 병리학적 상태에 있다고 통상의 기술자가 판단할 수 있는 상태에 있는 동물을 의미한다.
본 발명에서는 상기 암 개체로부터 분리한 시료 또는 암 질환 동물 모델에 후보 약제를 처리하기에 앞서, 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 수행할 수 있다.
본 발명에서의 용어 "후보 물질"은 암 환자에 적용하여 암에 의한 환자의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경할 수 있는 물질을 의미하며 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 감소시킬 수 있는 물질로, 저분자 화합물, 항체, 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA), 핵산, 단백질, 펩티드, 기타 추출물 또는 천연물을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않고 제한없이 포함될 수 있다.
본 발명에서 상기 후보 약제의 처리 전 또는 후에 있어서, 시료 또는 암 질환 동물 모델에서 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 방법 및 그에 사용되는 제제는 상기 암의 진단을 위한 정보 제공 방법에 기재된 바와 중복되어 이하 자세한 기재를 생략한다.
본 발명에서는, (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 후보 약제가 처리되기 전에 비하여 증가하거나 감소한 경우 상기 후보 약제를 암의 예방 또는 치료용 약제로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 환자로부터 수득된 시료를 포함하는 시료부, 상기 시료에 포함된 시료에서 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자를 검출하는 검출부; 및 상기 검출부로부터 수득된 환자의 상기 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준과 정상인의 수준을 비교하는 비교부를 포함하고, 상기 비교부를 통해서 얻는 결과에 따라 암을 진단하는, 진단 장치를 제공할 수 있다.
본 발명의 상기 비교부에서 상기 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자가 검출된 경우 유방암으로 진단할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
[실시예 1] 맘마글로빈 A(Mammaglobin-A) 측정을 위한 타겟 펩티드의 검출
1-1. 시료의 준비
본 발명의 바이오마커 조합의 유방암 진단의 정확도를 확인하기 위하여, 유방암 환자 10명, 양성 종양 환자 10명 및 정상 대조군 10명으로부터 얻은 혈액 시료에서 혈장을 분리하고, Bradford assay를 통하여 총 단백질을 정량하였다. 이 중 총 단백질 200 ㎍을 우레아(urea)로 변형시킨 뒤 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT)로 환원시키고, 이오도아세트아미드(iodoacetamide)를 통해 알킬화 시켰다. 이후, 트립신을 넣어주어 펩티드화 시키고, C18 컬럼을 이용하여 염을 제거하였다. 내부표준물질로는 펩티드의 말단에 붙어있는 아미노산기가 동위원소로 치환된 합성품을 이용하였다.
1-2. 삼중 사극자 질량분석기(텐덤메스 질량분석기)를 이용한 다중 반응 모니터링 수행
삼중 사극자 질량분석을 위하여 본 발명의 맘마글로빈 A(Mammaglobin-A)의 타겟 펩티드와 어미이온과 딸이온 쌍을 선정하여 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다.
구분 유전자 명칭 단백질 명칭 uniprotKB 펩티드 서열 어미이온 딸이온
1 SCGB2A2 맘마글로빈 A Q13296 TINPQVSK (서열번호 2) 443.753 672.367515 2Y6
558.324588 2Y5
461.271824 2Y4
333.213246 2Y3
234.144832 2Y2
상기 1-1.에서 준비된 최종 시료를 역상 수지 크로마토그래피에 걸어 혈장 펩티드 절편을 분리하였고, 삼중 사극자 질량분석기(기기: 5500 Qtrap, AB Sciex, USA)를 사용해 각 펩티드의 MRM 스펙트럼을 얻었다. 이때, 역상 수지 크로마토그래피는 HALOTM C18 컬럼 (Eksigent, USA) 컬럼으로 45분간 5%~40%의 아세토니트릴 농도 구배를 이용하여 실시하였다. MultiQuantTM 컴퓨터 정량 분석 프로그램 (AB Sciex, USA)으로 타깃 펩티드의 MRM 크로마토그램의 피크 면적을 계산하여 정량 정보를 확인하였다. 이때 각 타깃 펩티드의 정량값은 내부 표준물질로 넣어준 대장균 베타 갈락토시다아제의 MRM 크로마토그램의 피크 면적에 대한 비율로 표시하였다.
1-3. 각 타겟 펩티드의 유방암 진단의 정확도 확인
도 1은 본 발명의 실시예 1에서 유방암 환자, 양성 종양 환자 및 비 환자 대조군 사이에 맘마글로빈 A(Mammaglobin-A) 발현량의 차이를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 1에서 보는 바와 같이, 유방암 환자는 양성종양 환자군 및 비 환자 대조군 사이에 맘마글로빈 A(Mammaglobin-A)의 단백질 발현량이 차이가 있었다.
이처럼 본 발명의 서열번호 2로 표시되는 타겟 펩티드를 이용한 맘마글로빈 A(Mammaglobin-A) 마커는 높은 정확도로 유방암을 진단할 수 있음을 알 수 있었다.
[실시예 2] 매트릭스 메탈로프로테이나제-11(matrix metalloproteinase-11; MMP-11) 측정을 위한 타겟 펩티드의 검출
2-1. 시료의 준비
본 발명의 바이오마커 조합의 유방암 진단의 정확도를 확인하기 위하여, 유방암 환자 10명, 양성 종양 환자 10명 및 대조군 10으로부터 얻은 혈액 시료에서 혈장을 분리하고, Bradford assay를 통하여 총 단백질을 정량하였다. 이 중 총 단백질 200 ㎍을 우레아(urea)로 변형시킨 뒤 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT)로 환원시키고, 이오도아세트아미드(iodoacetamide)를 통해 알킬화 시켰다. 이후, 트립신을 넣어주어 펩티드화 시키고, C18 컬럼을 이용하여 염을 제거하였다. 내부표준물질로는 펩티드의 말단에 붙어있는 아미노산기가 동위원소로 치환된 합성품을 이용하였다.
2-2. 삼중 사극자 질량분석기(텐덤메스 질량분석기)를 이용한 다중 반응 모니터링 수행
삼중 사극자 질량분석을 위하여 본 발명의 매트릭스 메탈로프로테이나제-11(matrix metalloproteinase-11; MMP-11)의 타겟 펩티드와 어미이온과 딸이온 쌍을 선정하여 그 결과는 하기 표 5에 나타내었다.
구분 유전자 명칭 단백질 명칭 uniprotKB 펩티드 서열 어미이온 딸이온
1 MMP11 Stromelysin-3
(MMP-11)		 P24347 ALEGFPR
(서열번호 5)		 395.216 718.3883 2Y6
605.3042 2Y5
476.2616 2Y4
419.2401 2Y3
272.1717 2Y2
상기 2-1.에서 준비된 최종 시료를 역상 수지 크로마토그래피에 걸어 혈장 펩티드 절편을 분리하였고, 삼중 사극자 질량분석기(기기: 5500 Qtrap, AB Sciex, USA)를 사용해 각 펩티드의 MRM 스펙트럼을 얻었다. 이때, 역상 수지 크로마토그래피는 HALOTM C18 컬럼 (Eksigent, USA) 컬럼으로 45분간 5%~40%의 아세토니트릴 농도 구배를 이용하여 실시하였다. MultiQuantTM 컴퓨터 정량 분석 프로그램 (AB Sciex, USA)으로 타깃 펩티드의 MRM 크로마토그램의 피크 면적을 계산하여 정량 정보를 확인하였다. 이때 각 타깃 펩티드의 정량값은 내부 표준물질로 넣어준 대장균 베타 갈락토시다아제의 MRM 크로마토그램의 피크 면적에 대한 비율로 표시하였다. 도 2은 본 발명의 실시예 2에서 유방암 환자, 양성 종양 환자 및 비 환자 대조군 사이에 매트릭스 메탈로프로테이나제-11(matrix metalloproteinase-11; MMP-11) 발현량의 차이를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2에서 보는 바와 같이, 유방암 환자, 양성 종양 환자 및 비 환자 대조군 사이에 매트릭스 메탈로프로테이나제-11(matrix metalloproteinase-11; MMP-11)의 단백질 발현량의 차이를 확인하였다.
이처럼 본 발명의 서열번호 5로 표시되는 타겟 펩티드를 이용한 매트릭스 메탈로프로테이나제-11(matrix metalloproteinase-11; MMP-11) 마커는 높은 정확도로 유방암을 진단할 수 있음을 알 수 있었다.
[실시예 3] Neurogenic locus notch homolog protein 1(NOTCH 1) 측정을 위한 타겟 펩티드의 검출
3-1. 시료의 준비
본 발명의 바이오마커 조합의 유방암 진단의 정확도를 확인하기 위하여, 유방암 환자들과 정상 대조군들로부터 얻은 혈액 시료에서 혈장을 분리하고, Bradford assay를 통하여 총 단백질을 정량하였다.
실험에 사용된 샘플은 암 환자 10명/ 양성 종양 환자 10명/ 정상 10명 이며, 양성 종양 환자도 정상으로 하여 악성 종양만을 더욱 분별 할 수 있도록 설계했다. 도출되는 ROC 커브는 하기와 같으며, AUC = 0.8875 이며(그림 1), 특히 특이도 300%에서 암환자 중 5명의 수치가 특이적으로 높아 확실한 암 선별성을 보이고 있음을 확인했다.
이 중 총 단백질 200 ㎍을 우레아(urea)로 변형시킨 뒤 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT)로 환원시키고, 이오도아세트아미드(iodoacetamide)를 통해 알킬화 시켰다. 이후, 트립신을 넣어주어 펩티드화 시키고, C18 컬럼을 이용하여 염을 제거하였다. 내부표준물질로는 펩티드의 말단에 붙어있는 아미노산기가 동위원소로 치환된 합성품을 이용하였다.
3-2. 삼중 사극자 질량분석기(텐덤메스 질량분석기)를 이용한 다중 반응 모니터링 수행
삼중 사극자 질량분석을 위하여 본 발명의 Neurogenic locus notch homolog protein 1(NOTCH 1)의 타겟 펩티드와 어미이온과 딸이온 쌍을 선정하여 그 결과는 하기 표 6에 나타내었다.
구분 유전자 명칭 단백질 명칭 uniprotKB 펩티드 서열 어미이온 딸이온
1 NOTCH Neurogenic locus notch homolog protein 1 P46531 NSSFHFLR
(서열번호 7)		 336.607 447.235 3y7+2
403.719 3y6+2
360.203 3y5+2
286.669 3y4+2
218.139 3y3+2
144.605 3y2+2
상기 3-1.에서 준비된 최종 시료를 역상 수지 크로마토그래피에 걸어 혈장 펩티드 절편을 분리하였고, 삼중 사극자 질량분석기(기기: 5500 Qtrap, AB Sciex, USA)를 사용해 각 펩티드의 MRM 스펙트럼을 얻었다. 이때, 역상 수지 크로마토그래피는 HALOTM C18 컬럼 (Eksigent, USA) 컬럼으로 45분간 5%~40%의 아세토니트릴 농도 구배를 이용하여 실시하였다. MultiQuantTM 컴퓨터 정량 분석 프로그램 (AB Sciex, USA)으로 타깃 펩티드의 MRM 크로마토그램의 피크 면적을 계산하여 정량 정보를 확인하였다. 이때 각 타깃 펩티드의 정량값은 내부 표준물질로 넣어준 대장균 베타 갈락토시다아제의 MRM 크로마토그램의 피크 면적에 대한 비율로 표시하였다.
3-3. 각 타겟 펩티드의 유방암 진단의 정확도 확인
상기 3-2.에서 확인된 Neurogenic locus notch homolog protein 1(NOTCH 1)의 서열번호 7에 대한 유방암 진단 효율을 확인하여, 도 3에 유방암 환자, 양성 종양 환자 및 비 환자 대조군에 대한 수용자-조작 특성(ROC) 그래프로 도시하였다.
도 3에서 보는 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 서열번호 7로 표시되는 폴리펩티드의 타겟 펩티드를 이용한 경우 유방암 환자들과 정상 대조군들에 대한 수용자-조작 특성(ROC) 그래프로 도시한 결과 AUC(area under the curve) 값이 0.8875로 매우 높은 진단의 정확도를 보였다.
이처럼 본 발명의 서열번호 7로 표시되는 타겟 펩티드를 이용한 Neurogenic locus notch homolog protein 1(NOTCH 1) 마커는 높은 정확도로 유방암을 진단할 수 있음을 알 수 있었다.
[실시예 4] Proto-oncogene Wnt-1 측정을 위한 타겟 펩티드의 검출
4-1. 시료의 준비
본 발명의 바이오마커 조합의 유방암 진단의 정확도를 확인하기 위하여, 유방암 환자들과 정상 대조군들로부터 얻은 혈액 시료에서 혈장을 분리하고, Bradford assay를 통하여 총 단백질을 정량하였다. 이 중 총 단백질 200 ㎍을 우레아(urea)로 변형시킨 뒤 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT)로 환원시키고, 이오도아세트아미드(iodoacetamide)를 통해 알킬화 시켰다. 이후, 트립신을 넣어주어 펩티드화 시키고, C18 컬럼을 이용하여 염을 제거하였다. 내부표준물질로는 펩티드의 말단에 붙어있는 아미노산기가 동위원소로 치환된 합성품을 이용하였다.
4-2. 삼중 사극자 질량분석기(텐덤메스 질량분석기)를 이용한 다중 반응 모니터링 수행
삼중 사극자 질량분석을 위하여 본 발명의 Proto-oncogene Wnt-1의 타겟 펩티드와 어미이온과 딸이온 쌍을 선정하여 그 결과는 하기 표 7에 나타내었다.
구분 유전자 명칭 단백질 명칭 uniprotKB 펩티드 서열 어미이온 딸이온
1 WNT1 WNT-1 P04628 EFVDSGEK (서열번호 9) 455.7113 634.3042 2Y6
535.2358 2Y5
420.2089 2Y4
333.1769 2Y3
276.1554 2Y2
상기 4-1.에서 준비된 최종 시료를 역상 수지 크로마토그래피에 걸어 혈장 펩티드 절편을 분리하였고, 삼중 사극자 질량분석기(기기: 5500 Qtrap, AB Sciex, USA)를 사용해 각 펩티드의 MRM 스펙트럼을 얻었다. 이때, 역상 수지 크로마토그래피는 HALOTM C18 컬럼 (Eksigent, USA) 컬럼으로 45분간 5%~40%의 아세토니트릴 농도 구배를 이용하여 실시하였다. MultiQuantTM 컴퓨터 정량 분석 프로그램 (AB Sciex, USA)으로 타깃 펩티드의 MRM 크로마토그램의 피크 면적을 계산하여 정량 정보를 확인하였다. 이때 각 타깃 펩티드의 정량값은 내부 표준물질로 넣어준 대장균 베타 갈락토시다아제의 MRM 크로마토그램의 피크 면적에 대한 비율로 표시하였다. 도 4은 본 발명의 실시예 4에서 유방암 환자와 비 환자 대조군 사이에 Proto-oncogene Wnt-1 발현량의 차이를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4에서 보는 바와 같이, 유방암 환자와 비 환자 대조군 사이에 Proto-oncogene Wnt-1의 단백질 발현량의 차이를 확인하였다.
이처럼 본 발명의 서열번호 9로 표시되는 타겟 펩티드를 이용한 Proto-oncogene Wnt-1 마커는 높은 정확도로 유방암을 진단할 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명의 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드를 포함하는 바이오마커를 사용하는 경우, 암, 특히는 유방암을 조기에 간편하고 정확하게 진단할 수 있으며, 더 나아가서는 암의 병기를 진단할 수 있고, 치료 반응성 또는 치료 후 예후를 예측할 수 있다.

Claims (28)

  1. 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 암의 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 암은 유방암, 난소암, 대장암, 위암, 간암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종인, 암의 진단용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩티드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 암의 진단용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 암의 진단용 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 암의 진단용 조성물을 포함하는, 암의 진단용 키트.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트인, 암의 진단용 키트.
  7. 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 복수(ascites), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 또는 뇌척수액(cerebrospinal fluid)인, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩티드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드의 발현 수준의 측정은 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 또는 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay)에 의해 수행되는, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  11. 제7항에 있어서,
    상기 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드의 발현 수준의 측정은 다중 반응 모니터링 (multiple reaction monitoring; MRM) 방법에 의하는, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드의 타겟 펩티드에서 서열번호 2의 어미이온의 질량 대 전하비는 443.753 m/z 이고, 딸이온의 질량 대 전하비는 672.367515, 558.324588, 461.271824, 333.213246 또는 234.144832 m/z 이고,
    서열번호 5의 어미이온의 질량 대 전하비는 395.216 m/z 이고, 딸이온의 질량 대 전하비는 718.3883, 605.3042, 476.2616, 419.2401 및 272.1717 m/z 이고,
    서열번호 7로 표시되는 폴리펩티드의 타겟 펩티드에서 어미이온의 질량 대 전하비는 336.607 m/z 이고, 딸이온의 질량 대 전하비는 447.235, 403.719, 360.203, 286.669, 218.139 및 144.605 m/z 이며,
    서열번호 9로 표시되는 폴리펩티드의 타겟 펩티드에서 어미이온의 질량 대 전하비는 455.7113 m/z이고, 딸이온의 질량 대 전하비는 634.3042, 535.2358, 420.2089, 333.1769 및 276.1554 m/z 인, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 다중 반응 모니터링 방법 시 내부 표준 물질은 타겟 펩티드를 구성하는 특정 아미노산을 동위원소로 치환한 합성 펩티드 또는 대장균 베타 갈락토시다아제를 사용하는, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 대장균 베타 갈락토시다아제의 타겟 펩티드는 서열번호 3으로 표시되는 폴리펩티드로 이루어지며 어미이온과 딸이온은 각각 542.3 m/z 와 636.3 m/z 인, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  15. 제7항에 있어서,
    상기 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  16. 제7항에 있어서,
    상기 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현 수준의 측정은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩에 의하는, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  17. 제7항에 있어서,
    상기 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 상기 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 증가한 경우, 상기 암의 발병 가능성이 높은 것으로 예측하는, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  18. 제7항에 있어서,
    상기 정보 제공 방법은 목적하는 개체의 화학적 항암 치료 또는 면역 치료에 대한 반응성을 예측하는 것인, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  19. 제7항에 있어서,
    상기 정보 제공 방법은 목적하는 개체가 외과적 수술 후 예후를 예측하는 것인, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  20. 제7항에 있어서,
    상기 정보 제공 방법은 상기 목적하는 개체의 암의 병기를 진단하는 것인, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  21. 제7항에 있어서,
    상기 정보 제공 방법은 상기 목적하는 개체의 암의 재발 가능성을 예측하는 것인, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  22. 제7항에 있어서,
    상기 암은 유방암, 난소암, 대장암, 위암, 간암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종인, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  23. (a) 암 개체로부터 분리한 시료 또는 암 질환 동물 모델에 후보 약제를 처리하는 단계; 및
    (b) 상기 후보 약제가 처리된 시료 또는 암 질환 동물 모델에서 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약물을 스크리닝하는 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 시료는 암 개체로부터 분리된 세포 또는 조직인, 암의 예방 또는 치료용 약물을 스크리닝하는 방법.
  25. 제23항에 있어서,
    (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 상기 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 후보 약제가 처리되기 전에 비하여 증가하거나 감소한 경우 상기 후보 약제를 암의 예방 또는 치료용 약제로 판단하는 단계를 추가로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약물을 스크리닝하는 방법.
  26. 제23항에 있어서,
    상기 암은 유방암, 난소암, 대장암, 위암, 간암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종인, 암의 예방 또는 치료용 약물을 스크리닝하는 방법.
  27. 환자로부터 수득된 시료를 포함하는 시료부,
    상기 시료에 포함된 시료에서 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자를 검출하는 검출부; 및
    상기 검출부로부터 수득된 환자의 상기 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준과 정상인의 수준을 비교하는 비교부를 포함하고,
    상기 비교부를 통해서 얻는 결과에 따라 암을 진단하는, 진단 장치.
  28. 제 27항에 있어서,
    상기 비교부에서 상기 서열번호 2, 5, 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로 표시되는 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 유전자가 검출된 경우 유방암으로 진단하는, 진단 장치.
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