WO2021210905A1 - 암의 예후 예측용 조성물 - Google Patents

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WO2021210905A1
WO2021210905A1 PCT/KR2021/004683 KR2021004683W WO2021210905A1 WO 2021210905 A1 WO2021210905 A1 WO 2021210905A1 KR 2021004683 W KR2021004683 W KR 2021004683W WO 2021210905 A1 WO2021210905 A1 WO 2021210905A1
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prognosis
protein
predicting
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PCT/KR2021/004683
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노동영
김유미
김성수
한승만
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㈜베르티스
서울대학교병원
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    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Definitions

  • the present invention relates to a composition capable of predicting the prognosis of cancer, a kit for predicting prognosis including the same, and a method of providing information for predicting the prognosis of cancer using the composition.
  • breast cancer is the second most common cancer after lung cancer and the fifth most dangerous cancer in mortality.
  • women who are undergoing physiologically vigorous physical changes such as low fertility, short lactation period, early menarche, and late menopause
  • the sensitivity of the mammary gland tissue increases due to the rapid increase in the number of stimulation by female hormones, westernization of diet, and living environment
  • the incidence of breast cancer is rapidly increasing due to contamination of
  • early detection is more important than other cancers because it is difficult to cure once cancer cells invade surrounding tissues or metastasize to lymph nodes.
  • One object of the present invention is to provide a composition for predicting the prognosis of breast cancer in particular among cancers.
  • Another object of the present invention is to provide a kit for predicting the prognosis of breast cancer among cancers.
  • Another object of the present invention is to provide an information providing method for predicting the prognosis of breast cancer among cancers.
  • apolipoprotein CI (APOC1), carbonic anhydrase 1 protein (Carbonic anhydrase 1; CA1), and neural cell adhesion molecule L1-like protein (Neural cell adhesion molecule L1-like protein) CHL1) at least one protein; fragments of the protein; Or it relates to a composition for predicting the prognosis of cancer, including an agent for measuring the expression level of the gene encoding the protein or the fragment.
  • the "apolipoprotein” C1 is encoded by the APOC1 gene of human chromosome 19, and is a member of the apolipoprotein C family.
  • the APOC1 gene is mainly expressed in the liver and is activated when monocytes differentiate into macrophages. Alternatively spliced transcriptional variants have been found for this gene, but the biological effectiveness of some variants has not been determined.
  • Apolipoprotein C1 is 57 amino acids in length and is normally found in plasma.
  • the apolipoprotein C1 may consist of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
  • the fragment of the apolipoprotein C1 may consist of an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 4 to 7.
  • carbonic anhydrase 1 is an enzyme encoded by the CA1 gene, and carbonic anhydrase is a large family of zinc metalloenzymes, and serves to catalyze the dehydration of carbon dioxide. They are known to be involved in various biological reactions, for example, cellular respiration, calcification, acid-base balance, bone resorption, production of cerebrospinal fluid, saliva, gastric acid, and the like.
  • the carbonic anhydrase 1 may consist of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.
  • the carbonic anhydrase 1 protein fragment may consist of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 or 9.
  • the "neuron cell adhesion molecule L1-like protein” is also called a close homolog of L1, and is a protein encoded by the CHL1 gene.
  • CHL1 is a cell adhesion molecule closely related to L1.
  • CHL1 gene expression in melanocytes is regulated by MITF and also acts as a helix enzyme in the interphase of mitosis.
  • the neuronal adhesion molecule L1-like protein may consist of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, but is not limited thereto.
  • the fragment of the neuron adhesion molecule L1-like protein may consist of an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 10 to 14.
  • the agent for measuring the expression level of the apolipoprotein C1, the carbonic anhydrase 1 protein, the nerve cell adhesion molecule L1-like protein or a fragment thereof is the apolipoprotein C1, the carbonic anhydrase 1 protein, and at least one selected from the group consisting of an antibody, oligopeptide, ligand, peptide nucleic acid (PNA) and aptamer that specifically binds to the neuronal adhesion molecule L1-like protein.
  • PNA peptide nucleic acid
  • an antibody refers to a substance that specifically binds to an antigen and causes an antigen-antibody reaction.
  • an antibody refers to an antibody that specifically binds to a polypeptide represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 14.
  • Antibodies of the present invention include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies and recombinant antibodies.
  • the antibody can be readily prepared using techniques well known in the art.
  • the polyclonal antibody can be produced by a method well known in the art, including the process of injecting an antigen of the protein into an animal and collecting blood from the animal to obtain a serum containing the antibody.
  • Such polyclonal antibodies can be prepared from any animal such as goat, rabbit, sheep, monkey, horse, pig, cow, dog, and the like.
  • monoclonal antibodies can be prepared using a hybridoma method well known in the art, or a phage antibody library technique.
  • the antibody prepared by the above method may be separated and purified using methods such as gel electrophoresis, dialysis, salt precipitation, ion exchange chromatography, and affinity chromatography.
  • the antibodies of the present invention include functional fragments of antibody molecules as well as complete forms having two full-length light chains and two full-length heavy chains.
  • a functional fragment of an antibody molecule means a fragment having at least an antigen-binding function, and includes Fab, F(ab'), F(ab')2 and Fv.
  • PNA Peptide Nucleic Acid
  • DNA has a phosphate-ribose sugar backbone
  • PNA has a repeated N-(2-aminoethyl)-glycine backbone linked by peptide bonds, which greatly increases binding strength and stability to DNA or RNA, resulting in molecular biology , diagnostic assays and antisense therapy.
  • the "aptamer” is an oligonucleic acid or a peptide molecule, and refers to a ligand-specific DNA or RNA molecule having a high affinity for a protein.
  • Aptamer refers to single-stranded DNA or RNA having a specific binding ability to a specific substance, and has its own unique tertiary structure. It can be mass-produced in a short time and at low cost by using the chemical synthesis technique, and there is little variation between batches, so it has excellent advantages in terms of productivity.
  • due to its high stability against changes in the surrounding environment, such as pH or temperature the potential for application in various fields such as the detection of target substances and the development of disease diagnosis sensors is highly evaluated.
  • the agent for measuring the expression level of the gene encoding the apolipoprotein C1, the carbonic anhydrase 1 protein, the neuronal adhesion molecule L1-like protein, or a fragment thereof is the apolipoprotein C1, the carbonic acid It may include one or more selected from the group consisting of a dehydratase 1 protein, and a primer, a probe, and an antisense nucleotide that specifically binds to a gene encoding the neuronal adhesion molecule L1-like protein.
  • the "primer” is a fragment that recognizes a target gene sequence, and includes a pair of forward and reverse primers, but preferably, a primer pair that provides analysis results with specificity and sensitivity. High specificity can be conferred when the primer's nucleic acid sequence is a sequence that is inconsistent with the non-target sequence present in the sample, so that only the target gene sequence containing the complementary primer binding site is amplified and the primer does not cause non-specific amplification. .
  • the "probe” refers to a substance capable of specifically binding to a target substance to be detected in a sample, and refers to a substance capable of specifically confirming the presence of a target substance in a sample through the binding.
  • the type of probe is not limited as a material commonly used in the art, but preferably PNA (peptide nucleic acid), LNA (locked nucleic acid), peptide, polypeptide, protein, RNA or DNA, and most preferably is PNA.
  • the probe includes a biomaterial derived from or similar thereto or manufactured in vitro, for example, enzymes, proteins, antibodies, microorganisms, animal and plant cells and organs, neurons, DNA, and It may be RNA, and DNA includes cDNA, genomic DNA, and oligonucleotides, RNA includes genomic RNA, mRNA, and oligonucleotides, and examples of proteins include antibodies, antigens, enzymes, peptides, and the like.
  • RNA includes cDNA, genomic DNA, and oligonucleotides
  • RNA includes genomic RNA, mRNA, and oligonucleotides
  • proteins include antibodies, antigens, enzymes, peptides, and the like.
  • LNA locked nucleic acids
  • LNA nucleosides include common nucleic acid bases in DNA and RNA, and can form base pairs according to Watson-Crick base pairing rules. However, due to the 'locking' of the molecule due to the methylene bridge, the LNA does not form an ideal shape in the Watson-Crick bond.
  • LNAs When LNAs are incorporated into DNA or RNA oligonucleotides, LNAs can pair with complementary nucleotide chains more rapidly, increasing the stability of the double helix.
  • the "antisense” means that the antisense oligomer is hybridized with a target sequence in RNA by Watson-Crick base pairing, and typically mRNA and RNA in the target sequence: A sequence of nucleotide bases allowing the formation of an oligomeric heteroduplex. and oligomers having an inter-subunit backbone. An oligomer may have exact sequence complementarity or approximate complementarity to a target sequence.
  • amino acid sequence information of the polypeptide according to the present invention is represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 14, those skilled in the art can easily design primers, probes or antisense nucleotides that specifically bind to the gene encoding the polypeptide based on this. There will be.
  • cancer as a disease subject to prognostic prediction indicates or refers to a physiological condition characterized by unregulated cell growth typically in mammals.
  • the cancer is breast cancer, ovarian cancer, colorectal cancer, stomach cancer, liver cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gallbladder cancer, biliary tract cancer, non-Hodgkin's lymphoma, Hodgkin's Lymphoma, blood cancer, bladder cancer, kidney cancer, melanoma, colon cancer, bone cancer, skin cancer, head cancer, uterine cancer, rectal cancer, brain tumor, perianal cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, vaginal cancer, vulvar carcinoma, esophageal cancer, small intestine cancer, endocrine Adenocarcinoma, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, ureter cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, central nervous system (CNS) tumor, primary CNS lymphoma, spinal cord tumor, brainstem glioma or pituitary
  • CNS
  • the "prediction of prognosis” means predicting whether a cancer patient will respond favorably or unfavorably to cancer treatment.
  • Prognosis prediction in the present invention is cancer treatment, for example, surgical resection, chemotherapy method, immunotherapy method or radiotherapy method, preferably treatment responsiveness after surgical resection, appropriate treatment by predicting the recurrence of cancer Information for selecting a method can be provided.
  • the present invention relates to a kit for predicting the prognosis of cancer, including the composition for predicting the prognosis of cancer.
  • the prognosis prediction kit it is possible to predict whether a cancer patient will respond favorably or unfavorably to cancer treatment by using the prognosis prediction kit, and specifically, as a cancer treatment, for example, surgical resection, After chemotherapy, immunotherapy, or radiation therapy, preferably surgical resection, the reactivity of the cancer can be predicted.
  • the cancer to be predicted for the prognosis is breast cancer, ovarian cancer, colorectal cancer, stomach cancer, liver cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gallbladder cancer, biliary tract cancer, Non-Hodgkin's lymphoma, Hodgkin's lymphoma, blood cancer, bladder cancer, kidney cancer, melanoma, colon cancer, bone cancer, skin cancer, head cancer, uterine cancer, rectal cancer, brain tumor, perianal cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, vaginal cancer, vulvar carcinoma, Esophageal cancer, small intestine cancer, endocrine adenocarcinoma, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, ureter cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, central nervous system (CNS) tumor, primary CNS lymphoma, spinal cord tumor, It may be a
  • the kit may be an RT-PCR kit, a DNA chip kit, an ELISA kit, a protein chip kit, a rapid kit, or a multiple reaction monitoring (MRM) kit, a kit for predicting cancer prognosis.
  • MRM multiple reaction monitoring
  • the kit of the present invention may further include one or more other component compositions, solutions or devices suitable for the assay method.
  • the kit for predicting the prognosis of cancer may further include essential elements necessary for performing a reverse transcription polymerase reaction.
  • the reverse transcription polymerase reaction kit includes a pair of primers specific for a gene encoding a marker protein.
  • the primer is a nucleotide having a sequence specific to the nucleic acid sequence of the gene, and may have a length of about 7 bp to 50 bp, more preferably about 10 bp to 30 bp. It may also include primers specific for the nucleic acid sequence of the control gene.
  • reverse transcription polymerase reaction kits include test tubes or other suitable containers, reaction buffers (with varying pH and magnesium concentrations), deoxynucleotides (dNTPs), enzymes such as Taq-polymerase and reverse transcriptase, DNase, RNase inhibitor DEPC -Water (DEPC-water), sterile water, etc. may be included.
  • the kit may include essential elements necessary for performing the DNA chip.
  • the DNA chip kit may include a substrate to which cDNA or oligonucleotide corresponding to a gene or fragment thereof is attached, and reagents, agents, enzymes, etc. for preparing a fluorescently-labeled probe.
  • the substrate may also contain cDNA or oligonucleotides corresponding to control genes or fragments thereof.
  • the kit may include essential elements necessary for performing the ELISA.
  • the ELISA kit contains an antibody specific for this protein.
  • Antibodies are antibodies with high specificity and affinity for a marker protein and little cross-reactivity with other proteins, and are monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, or recombinant antibodies.
  • the ELISA kit may also include an antibody specific for a control protein.
  • Other ELISA kits include reagents capable of detecting bound antibody, such as labeled secondary antibodies, chromophores, enzymes (eg, conjugated with an antibody) and substrates thereof or capable of binding the antibody. other materials and the like.
  • a well plate synthesized from a nitrocellulose membrane, a PVDF membrane, a polyvinyl resin or a polystyrene resin, and a glass slide Glass or the like may be used, but is not limited thereto.
  • the label of the secondary antibody is preferably a conventional coloring agent that develops a color reaction, HRP (horseradish peroxidase), basic dephosphorylation enzyme (alkaline phosphatase), colloidal gold (colloid gold), Labels such as fluorescein and dye such as FITC (poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate) and RITC (rhodamine-B-isothiocyanate) may be used, but are limited thereto it is not
  • the chromogenic substrate for inducing color development in the kit is preferably used according to the label for the color reaction, TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS[2,2 '-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)], OPD (o-phenylenediamine), etc. can be used.
  • TMB 3,3',5,5'-tetramethyl bezidine
  • OPD o-phenylenediamine
  • the color development substrate is provided in a dissolved state in a buffer solution (0.1 M NaAc, pH 5.5).
  • a chromogenic substrate such as TMB is decomposed by HRP used as a marker of the secondary antibody conjugate to generate chromogenic deposits, and the presence or absence of the marker proteins is detected by visually confirming the degree of deposition of the chromogenic deposits.
  • the washing solution preferably contains a phosphate buffer, NaCl and Tween 20, and more preferably a buffer solution (PBST) composed of 0.02 M phosphate buffer, 0.13 M NaCl, and 0.05% Tween 20.
  • PBST buffer solution
  • the secondary antibody is reacted with the antigen-antibody conjugate, and then an appropriate amount is added to the immobilizer and washed 3 to 6 times.
  • a sulfuric acid solution H 2 SO 4
  • H 2 SO 4 sulfuric acid solution
  • apolipoprotein C1 Polipoprotein C1
  • APOC1 carbonic anhydrase 1
  • CA1 neuronal adhesion molecule L1-like proteins in a biological sample isolated from a subject of interest
  • CHL1 Neuronal adhesion molecule L1-like protein
  • it relates to a method for providing information for predicting the prognosis of cancer, comprising measuring the expression level of the gene encoding the protein or the fragment.
  • the "target individual” refers to an individual who has or is highly likely to have cancer, or is diagnosed with cancer and is treated with anticancer treatment, for example, surgical resection, chemical treatment, immunotherapy, or radiation.
  • the subject may be scheduled to undergo a method of treatment, preferably surgical resection.
  • the "biological sample” to “sample” refer to whole blood, leukocytes, peripheral blood mononuclear cells, buffy coat, plasma, and serum. ), sputum, tears, mucus, nasal washes, nasal aspirate, breath, urine, semen, saliva ), peritoneal washings, ascites, cystic fluid, meningeal fluid, amniotic fluid, glandular fluid, pancreatic fluid, lymph fluid ), pleural fluid, nipple aspirate, bronchial aspirate, synovial fluid, joint aspirate, organ secretions, cells, It may be a cell extract or cerebrospinal fluid, but is not limited thereto.
  • the agent for measuring the expression level of the apolipoprotein C1, the carbonic anhydrase 1 protein, and the neuronal adhesion molecule L1-like protein or a fragment thereof is the apolipoprotein C1, the carbonic anhydrase 1 protein, and It may include at least one selected from the group consisting of an antibody, oligopeptide, ligand, peptide nucleic acid (PNA) and aptamer that specifically binds to the neuronal adhesion molecule L1-like protein.
  • PNA peptide nucleic acid
  • the apolipoprotein C1 may consist of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
  • the carbonic anhydrase 1 may consist of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.
  • the CHL1 may consist of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, but is not limited thereto.
  • the measurement of the expression level of the apolipoprotein C1, the carbonic anhydrase 1 protein, the neuronal adhesion molecule L1-like protein or a fragment thereof is a protein chip analysis, immunoassay, ligand binding assay, MALDI -TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) analysis, SELDI-TOF (Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) analysis, radioimmunoassay, radioimmunodiffusion method, Oukteroni immunodiffusion method, Rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, complement fixation assay, two-dimensional electrophoresis analysis, liquid chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS), LC-MS/MS (liquid chromatography-Mass Spectrometry/Mass) Spectrometry), Western blotting or ELISA (enzyme linked immunosorbent as
  • the expression level of the apolipoprotein C1, the carbonic anhydrase 1 protein, and the neuron adhesion molecule L1-like protein may be measured by a multiple reaction monitoring (MRM) method.
  • MRM multiple reaction monitoring
  • the multiple reaction monitoring method may be performed using mass-spectrometry, preferably, triple quadrupole mass-spectrometry.
  • the multiple reaction monitoring (MRM) method using mass-spectrometry is an analysis technique capable of selectively separating, detecting, and quantifying a specific analyte to monitor the change in its concentration.
  • MRM is a method that can quantitatively and accurately measure multiple substances, such as trace biomarkers, present in a biological sample.
  • the mother ions among the ion fragments generated in the ionization source are selectively collided with each other. delivered to the tube
  • the mother ions arriving at the colliding tube collide with the internal colliding gas are split to generate daughter ions, and are sent to the second mass filter Q2, where only characteristic ions are delivered to the detection unit.
  • MRM is used for quantitative analysis of small molecules and is used to diagnose specific genetic diseases.
  • the MRM method is easy to simultaneously measure multiple peptides, and has the advantage of being able to confirm the relative concentration difference of protein prognostic marker candidates between normal people and cancer patients without antibodies.
  • the MRM analysis method is being introduced for the analysis of complex proteins and peptides in blood, especially in proteome analysis using mass spectrometry.
  • the target peptide of the apolipoprotein C1 may consist of an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 4 to 7.
  • the parent ion/daughter ion pair of the target peptide of the apolipoprotein C1 is 526.75 m/z and 605.31 m/z, 526.75 m/z and 776.38 m/z, 526.75 m/z and 719.36 m/z, respectively. , 526.75 m/z and 504.27 m/z, 526.75 m/z and 391.18 m/z, but are not limited thereto.
  • the target peptide of the carbonic anhydrase 1 protein may consist of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 or 9.
  • the parent ion/daughter ion pair of the target peptide of carbonic anhydrase 1 is 485.80 m/z and 758.44 m/z, 485.80 m/z and 643.41 m/z, 485.80 m/z and 572.38 m/z, respectively. , may be 485.80 m/z and 459.29 m/z, but is not limited thereto.
  • the target peptide of the neuronal adhesion molecule L1-like protein may consist of an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 10 to 14.
  • the parent ion/daughter ion pair of the target peptide of the neuron adhesion molecule L1-like protein is 642.81 m/z and 836.42 m/z, 642.81 m/z and 689.35 m/z, 642.81 m/z and 618.31, respectively. m/z, 642.81 m/z, and 504.27 m/z, but is not limited thereto.
  • the carbonic anhydrase 1 protein, the nerve cell adhesion molecule L1-like protein, or a fragment thereof some amino acids of the target peptides of each protein are substituted with stable isotopes.
  • a peptide is synthesized and used as an internal standard for multiple reaction monitoring analysis, the absolute amount of the protein in blood can also be measured, thereby further increasing the accuracy of the analysis.
  • the internal standard material any internal standard material generally used in the multi-reaction monitoring analysis may be used, but in the monitoring method, the internal standard material is a synthetic peptide in which a specific amino acid constituting the target peptide is substituted with an isotope.
  • E. coli beta galactosidase may be used.
  • the target peptide of E. coli beta-galactosidase is composed of the polypeptide represented by SEQ ID NO: 15, and the mother ion and the daughter ion may be 542.3 m/z and 636.3 m/z, respectively.
  • a specific peptide in which some amino acids of the target peptide are substituted with stable isotopes is preferably lysine or arginine, but is not limited thereto.
  • the amino acid substituted with the isotope is preferably lysine or arginine, but is not limited thereto.
  • the agent for measuring the expression level of the gene encoding the apolipoprotein C1, the carbonic anhydrase 1 protein, the neuron adhesion molecule L1-like protein or a fragment thereof is the apolipoprotein C1, the carbonic anhydrase 1 protein and at least one selected from the group consisting of primers, probes and antisense nucleotides that specifically bind to a gene encoding the neuronal adhesion molecule L1-like protein.
  • the expression level of the gene encoding the apolipoprotein C1, the carbonic anhydrase 1 protein, the neuronal adhesion molecule L1-like protein, or a fragment thereof is measured by reverse transcription polymerase reaction (RT-PCR), competitive Competitive RT-PCR, Real-time RT-PCR, RNase protection assay (RPA), Northern blotting or DNA chip.
  • RT-PCR reverse transcription polymerase reaction
  • competitive Competitive RT-PCR Real-time RT-PCR
  • RNase protection assay RNase protection assay
  • Northern blotting or DNA chip.
  • the step of measuring the expression level may be performed on a biological sample isolated before a target subject receives cancer treatment.
  • the biological sample separated before receiving cancer treatment may be collected before the date of performing or scheduled to perform cancer treatment, and the collection time is not particularly limited, but for example, 48 from the date of performing or scheduled to perform cancer treatment.
  • It may be a biological sample isolated an hour ago, two hours ago, or an hour ago.
  • the cancer treatment may be performed one or more times, and in the case of being performed multiple times, it may be separated 48 months prior to the time of cancer treatment at any one time.
  • the present invention provides at least one of apolipoprotein C1 (APOC1), carbonic anhydrase 1 protein (CA1), and neuronal adhesion molecule L1-like protein (CHL1) for a biological sample isolated after a subject of interest has received cancer treatment of protein; fragments of the protein; Or it may further comprise the step of measuring the expression level of the gene encoding the protein or the fragment.
  • APOC1 apolipoprotein C1
  • CA1 carbonic anhydrase 1 protein
  • the biological sample isolated after receiving the cancer treatment may be collected after the date of performing or scheduled to perform the cancer treatment, and the collection time is not particularly limited, but for example, within 48 months or 36 months from the cancer treatment. Within 24 months, within 12 months, within 10 months, within 8 months, within 6 months, within 4 months, within 10 weeks, within 8 weeks, within 1 to 8 weeks, within 2 to 8 weeks, or within 4 weeks It may be a biological sample isolated within to 8 weeks.
  • the cancer treatment may be performed one or more times, and when performed multiple times, it may be separated within 48 months from the time of any one cancer treatment.
  • the expression level of the apolipoprotein C1, a fragment thereof, or a gene encoding the same measured with respect to the biological sample of the subject of interest increases after cancer treatment compared to before cancer treatment, it can be predicted that the prognosis is good.
  • the prognosis when the expression level of the carbonic anhydrase 1 protein, a fragment thereof, or a gene encoding the same measured with respect to the biological sample of the subject of interest decreases after cancer treatment compared to before cancer treatment, the prognosis can be predicted to be good have.
  • the prognosis is expected to be good predictable.
  • the prognosis can be predicted to be good.
  • the prognosis may be therapeutically responsive to cancer treatment for the subject of interest, for example, surgical resection, chemical treatment method, immunotherapy method or radiation treatment method, preferably after surgical resection, more Preferably, it may be whether the cancer recurs after the above treatment.
  • the cancer is breast cancer, ovarian cancer, colorectal cancer, stomach cancer, liver cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gallbladder cancer, biliary tract cancer, non-Hodgkin's lymphoma, Hodgkin's Lymphoma, blood cancer, bladder cancer, kidney cancer, melanoma, colon cancer, bone cancer, skin cancer, head cancer, uterine cancer, rectal cancer, brain tumor, perianal cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, vaginal cancer, vulvar carcinoma, esophageal cancer, small intestine cancer, endocrine Adenocarcinoma, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, ureter cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, central nervous system (CNS) tumor, primary CNS lymphoma, spinal cord tumor, brainstem glioma or pituitary
  • CNS
  • the prognosis after treatment for cancer, particularly breast cancer is predicted, and an appropriate treatment method is selected. information can be provided.
  • apolipoprotein C1 (Apolipoprotein C-I; APOC1) before and after breast cancer surgery in a breast cancer patient in Example 1 of the present invention
  • Carbonic anhydrase 1 protein (CA1)
  • CHL1 neural cell adhesion molecule L1-like protein
  • Figure 2 shows apolipoprotein C1 (Apolipoprotein C-I; APOC1) before and after breast cancer surgery in a breast cancer patient in Example 1 of the present invention; Carbonic anhydrase 1 protein (CA1); and a receptor-operating characteristic (ROC) graph based on the quantification result of a biomarker of a neural cell adhesion molecule L1-like protein (CHL1).
  • apolipoprotein C1 Polipoprotein C-I; APOC1
  • CA1 Carbonic anhydrase 1 protein
  • ROC receptor-operating characteristic
  • Apolipoprotein CI APOC1
  • CA1 carbonic anhydrase 1
  • CA1 neuronal cell adhesion molecule L1-like protein using the target peptides represented by SEQ ID NOs: 4 to 14 of the present invention
  • CHL1 adhesion molecule L1-like protein
  • Apolipoprotein CI APOC1
  • CA1 Carbonic anhydrase 1
  • CHL1 Neural cell adhesion molecule L1-like protein of the present invention for triple quadrupole mass spectrometry ; CHL1 target peptide and parent ion and daughter ion pairs were selected, and the results are shown in Table 1 below.
  • the final sample prepared in 1. was subjected to reverse phase resin chromatography to separate plasma peptide fragments, and MRM spectra of each peptide were obtained using a triple quadrupole mass spectrometer (instrument: 5500 Qtrap, AB Sciex, USA). At this time, reverse phase resin chromatography was performed using a acetonitrile concentration gradient of 5% to 40% for 45 minutes with a HALOTM C18 column (Eksigent, USA) column. Quantitative information was confirmed by calculating the peak area of the MRM chromatogram of the target peptide with MultiQuantTM computer quantitative analysis program (AB Sciex, USA). At this time, the quantitative value of each target peptide was expressed as a ratio to the peak area of the MRM chromatogram of E. coli beta-galactosidase added as an internal standard.
  • Apolipoprotein CI APOC1
  • CA1 Carbonic anhydrase 1
  • CHL1 neuronal cell adhesion molecule L1-like protein
  • the concentration of apolipoprotein C1 was mainly increased after surgery, and the concentration of carbonic anhydrase 1 protein and the neuron adhesion molecule L1-like protein was mainly decreased after surgery.
  • apolipoprotein C1 (Apolipoprotein CI; APOC1), carbonic anhydrase 1 protein (Carbonic anhydrase 1; CA1), and nerve cell adhesion molecule L1-like protein (Neural) It was found that the combination of cell adhesion molecule L1-like protein (CHL1) markers can predict the prognosis of breast cancer with high accuracy.
  • the prognosis after treatment for cancer, particularly breast cancer is predicted, and an appropriate treatment method is selected. information can be provided.

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Abstract

본 발명은 암의 예후 예측을 위한 조성물, 이를 포함하는 예후 예측용 키트 및 상기 조성물을 이용하여 암의 예후 예측을 위해 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

Description

암의 예후 예측용 조성물
본 발명은 암의 예후를 예측할 수 있는 조성물, 이를 포함하는 예후 예측용 키트 및 상기 조성물을 이용하여 암의 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
전 세계에서 유방암은 폐암에 이어 두 번째로 흔히 발생되는 암이며, 사망률은 5위에 해당하는 위험한 암이다. 특히 최근에는 저출산, 짧은 수유기간, 이른 초경, 늦은 폐경 등 생리적으로 왕성한 신체적 변화를 겪는 시기의 여성들에서는 여성호르몬의 자극을 받는 횟수의 급격한 증가로 인한 유선조직의 민감도 증가, 식생활의 서구화, 생활환경의 오염 등의 이유로 유방암 발생이 급격하게 증가하고 있다. 유방암의 경우 일단 암세포가 주변 조직에 침범하거나 림프절로 전이가 시작되면 완치가 어렵기 때문에 조기 발견이 다른 암보다 더 중요하다고 할 수 있다.
유방암으로 인한 사망률을 줄이기 위해서는 첫째, 유방암을 조기 진단하고, 둘째, 일차 수술에 의한 치료 이후 예후를 예측하여 적절한 부가 치료 (Adjuvant therapy)를 하는 것이 중요하다.
실제 임상에서는 이상 소견이 있으면 세침흡입세포검사법, 자기공명촬영법 등을 부가적으로 사용하여 진단율을 높이고 있으나, 정상조직과 비 정상조직을 형태상으로 구분할 뿐 악성종양(cancer)과 양성종양(non-cancer)을 구분하기가 쉽지 않기 때문에 확진을 위해서는 더욱 정밀한 조직검사를 하게 된다. 이와 같은 이유들로 인해 유방암은 다른 암에 비해 비교적 분자 유전학적인 방법으로 유방암을 진단하는 방법이 발달되어 있다.
따라서, 지금까지 대부분의 연구는 유방암의 조기 발견에 초점을 맞추고 있어 유방암에 대한 선행항암요법과의 관계 및 예후 예측에 대한 성공적인 연구 결과는 거의 없었다. 따라서, 유방암 환자를 수술하기 전에 수술 후의 치료에 따른 예후를 예측할 수 있는 바이오 마커에 대한 연구가 필요한 실정이다.
본 발명의 일 목적은 암 중에서도 특히 유방암의 예후를 예측하는 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 중에서도 특히 유방암의 예후를 예측하는 키트를 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 중에서도 특히 유방암의 예후를 예측하는 정보 제공 방법을 제공하고자 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구현예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구현예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구현예" 또는 "구현예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구현예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구현예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구현예에서" 또는 "구현예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구현예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구현예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
본 발명 내 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 아포리포단백질 C1(Apolipoprotein C-I; APOC1), 탄산탈수효소 1 단백질(Carbonic anhydrase 1; CA1), 및 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질(Neural cell adhesion molecule L1-like protein; CHL1) 중 적어도 하나의 단백질; 상기 단백질의 단편; 또는 상기 단백질 또는 상기 단편을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 암의 예후 예측을 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 "아포리포단백질" C1은 인간 19번 염색체의 APOC1 유전자에 의해 코딩되며, 아포리포단백질 C 패밀리의 구성원이다. 상기 APOC1 유전자는 주로 간에서 발현되며 단핵구가 대식세포로 분화될 때 활성화된다. 대안적으로 이 유전자에 대해 접합된 전사 변이체가 발견되었지만, 일부 변이체의 생물학적 유효성은 결정되지 않았다. 아포리포단백질 C1은 57개의 아미노산 길이를 갖고, 혈장에서 정상적으로 발견된다.
본 발명에서, 상기 아포리포단백질 C1은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 아포리포단백질 C1의 단편은 서열번호 4 내지 7 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명에서, 상기 "탄산무수화효소 1"은 CA1 유전자에 의해 암호화되는 효소로, 탄산무수화효소는 아연 금속효소(zinc metalloenzymes)의 큰 패밀리로서, 이산화탄소의 역수화를 촉매하는 역할을 한다. 이들은 다양한 생물학적 반응으로 예를 들면, 세포 호흡, 석회화, 산-염기 균형, 뼈 재흡수, 뇌척수액, 타액, 위산의 생성 등에 관여하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 상기 탄산무수화효소 1은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 탄산탈수효소 1 단백질의 단편은 서열번호 8 또는 9로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명에서 상기 "신경세포 접착분자 L1 유사 단백질"은 L1의 근접 상동체(close homolog of L1)라고도 불리우며, CHL1 유전자에 의해 암호화되는 단백질이다. CHL1은 L1과 매우 밀접하게 관련된 세포 접착 분자로, 멜라닌 세포에서 CHL1 유전자 발현은 MITF에 의해 조절되며 유사 분열의 간기 단계에서 나선 효소로 작용하기도 한다.
본 발명에서, 상기 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질의 단편은 서열번호 10 내지 14 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명에서, 상기 아포리포단백질 C1, 상기 탄산탈수효소 1 단백질, 상기 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질 또는 이들의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 아포리포단백질 C1, 상기 탄산탈수효소 1 단백질, 및 상기 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에 상기 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질을 가리킨다. 본 발명의 목적상, 항체는 서열번호 1 내지 14 중 어느 하나로 표시되는 폴리펩티드에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다.
본 발명의 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 상기 항체는 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 다클론 항체는 상기 단백질의 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 과정을 포함하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물로부터 제조될 수 있다. 또한, 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method), 또는 파지 항체 라이브러리 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전장의 경쇄 및 2개의 전장의 중쇄를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
본 발명에 상기 "PNA(Peptide Nucleic Acid)"는 인공적으로 합성된, DNA 또는 RNA와 비슷한 중합체를 가리키며, 1991년 덴마크 코펜하겐 대학교의 Nielsen, Egholm, Berg와 Buchardt 교수에 의해 처음으로 소개되었다. DNA는 인산-리보스당 골격을 갖는데 반해, PNA는 펩티드 결합에 의해 연결된 반복된 N-(2-아미노에틸)-글리신 골격을 가지며, 이로 인해 DNA 또는 RNA에 대한 결합력과 안정성이 크게 증가되어 분자 생물학, 진단 분석 및 안티센스 치료법에 사용되고 있다.
본 발명에서 상기 "앱타머"는 올리고핵산 또는 펩티드 분자이며, 단백질에 대하여 고친화도를 가지는 리간드-특이 DNA 또는 RNA 분자를 의미한다. 앱타머는 특정 물질에 대해 특이적 결합 능력을 가지는 단일가닥의 DNA 또는 RNA를 말하며, 그 자체로 고유한 3차 구조를 갖는다. 화학적 합성 기법을 이용하여 짧은 시간과 낮은 비용으로 대량 생산이 가능하며 배치 간 변이가 거의 없어 생산적인 측면에서 탁월한 장점을 갖고 있다. 뿐만 아니라, pH나 온도와 같이 주변 환경의 변화에 대한 안정성이 높아 최근 표적 물질의 탐지 및 질환 진단 센서 개발과 같이 다양한 분야에서의 활용 가능성이 높이 평가되고 있다.
본 발명에서, 상기 아포리포단백질 C1, 상기 탄산탈수효소 1 단백질, 상기 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질, 또는 이들의 단편을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 아포리포단백질 C1, 상기 탄산탈수효소 1 단백질, 및 상기 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 "프라이머"는 표적 유전자 서열을 인지하는 단편으로서, 정방향 및 역방향의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료 내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성이 부여될 수 있다.
본 발명에서 상기 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, RNA 또는 DNA일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함하는 것으로, 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩티드 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 "LNA(Locked nucleic acids)"란, 2'-O, 4'-C 메틸렌 브릿지를 포함하는 핵산 아날로그를 의미한다. LNA 뉴클레오사이드는 DNA와 RNA의 일반적 핵산 염기를 포함하며, Watson-Crick 염기 쌍 규칙에 따라 염기 쌍을 형성할 수 있다. 하지만, 메틸렌 브릿지로 인한 분자의 'locking'으로 인해, LNA는 Watson-Crick 결합에서 이상적 형상을 형성하지 못하게 된다. LNA가 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드에 포함되면, LNA는 보다 빠르게 상보적 뉴클레오티드 사슬과 쌍을 이루어 이중 나선의 안정성을 높일 수 있다. 본 발명에서 상기 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 의미한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드의 아미노산 서열 정보는 서열번호 1 내지 14 중 어느 하나로 표시되므로, 당업자라면 이를 바탕으로 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 용이하게 디자인할 수 있을 것이다.
본 발명에서 예후 예측의 대상이 되는 질환으로 상기 "암"은 포유류에서 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장으로 특징 지어진 생리적 상태를 나타내거나 가리킨다.
본 발명에서, 상기 암은 유방암, 난소암, 대장암, 위암, 간암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(central nerve system; CNS) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종일 수 있으나, 바람직하게는 유방암일 수 있다.
본 발명에서 상기 "예후(prognosis) 예측"은 암 환자가 암 치료에 대해 선호적으로 또는 비선호적으로 반응할 지 여부를 예측하는 것을 의미한다. 본 발명에서 예후 예측은 암 치료로, 예를 들어, 외과적 절제술, 화학적 치료 방법, 면역 치료 방법 또는 방사선 치료 방법, 바람직하게는 외과적 절제술 후 치료 반응성으로, 암의 재발 여부를 예측함으로써 적절한 치료 방식을 선택하기 위한 정보를 제공할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 암의 예후 예측용 조성물을 포함하는 암의 예후 예측용 키트에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 예후 예측용 키트를 이용하여 암 환자가 암 치료에 대하여 선호적으로 또는 비선호적으로 반응할 지 여부를 예측할 수 있고, 상세하게는 암 치료로, 예를 들어, 외과적 절제술, 화학적 치료 방법, 면역 치료 방법 또는 방사선 치료 방법, 바람직하게는 외과적 절제술 후 치료 반응성으로, 암의 재발 여부를 예측할 수 있다.
본 발명에서, 상기 예후 예측의 대상이 되는 암은 유방암, 난소암, 대장암, 위암, 간암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(central nerve system; CNS) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종일 수 있으나, 바람직하게는 유방암일 수 있다.
본 발명에서 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트인, 암의 예후 예측용 키트 일 수 있다.
본 발명의 상기 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 발명에서 상기 암의 예후 예측용 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 더 포함할 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 단백질을 코딩하는 유전자에 대해 특이적인 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 상기 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오티드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp의 길이를 가질 수 있다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 용기, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또한, 상기 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표지 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또한, 상기 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대해 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 키트에서 항원-항체 결합반응을 위한 고정체로는 니트로셀룰로오즈 막, PVDF 막, 폴리비닐(polyvinyl) 수지 또는 폴리스티렌(polystyrene) 수지로 합성된 웰 플레이트(Well plate), 유리로 된 슬라이드 글래스 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 예후 예측용 키트에서 2차 항체의 표지체는 발색 반응을 하는 통상의 발색제가 바람직하며, HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(coloid gold), FITC(폴리 L-라이신-플루오르세인 아이소티오시아네이트), RITC(로다민-B-아이소티오시아네이트) 등의 형광물질(fluorescein) 및 색소(dye) 등의 표지체가 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 키트에서 발색을 유도하기 위한 발색 기질은 발색 반응을 하는 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, TMB(3,3',5,5'-테트라메틸 베지딘), ABTS[2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)], OPD(o-페닐렌다이아민) 등을 사용할 수 있다. 이때, 발색기질은 완충용액(0.1 M NaAc, pH 5.5)에 용해된 상태로 제공되는 것이 더욱 바람직하다. TMB와 같은 발색기질은 이차항체 접합체의 표지체로 사용된 HRP에 의해 분해되어 발색 침적체를 생성하고, 이 발색 침적체의 침적 정도를 육안으로 확인함으로써 상기 마커 단백질들의 존재 유무를 검출한다.
상기 키트에서 세척액은 인산염 완충용액, NaCl 및 트윈 20(Tween 20)을 포함하는 것이 바람직하며, 0.02 M 인산염 완충용액, 0.13 M NaCl, 및 0.05% 트윈 20으로 구성된 완충용액(PBST)이 더욱 바람직하다. 세척액은 항원-항체 결합반응 후 항원-항체 결합체에 2차 항체를 반응시킨 다음 적당량을 고정체에 첨가하여 3 내지 6회 세척한다. 반응 정지용액은 황산 용액(H2SO4)이 바람직하게 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 아포리포단백질 C1(Apolipoprotein C-I; APOC1), 탄산탈수효소 1 단백질(Carbonic anhydrase 1; CA1) 및 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질(Neural cell adhesion molecule L1-like protein; CHL1) 중 적어도 하나의 단백질; 상기 단백질의 단편; 또는 상기 단백질 또는 상기 단편을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 암의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 "목적하는 개체"란, 암이 발병하였거나 발병 가능성이 높은 개체, 혹은 암이 발병한 것으로 진단되어 항암 치료로, 예를 들면, 외과적 절제술, 화학적 치료 방법, 면역 치료 방법 또는 방사선 치료 방법, 바람직하게는 외과적 절제술을 받을 것이 예정된 개체일 수 있다.
본 발명에서 상기 "생물학적 시료" 내지 "시료"는 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 복수(ascites), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 또는 뇌척수액(cerebrospinal fluid)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 아포리포단백질 C1, 상기 탄산탈수효소 1 단백질, 및 상기 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 아포리포단백질 C1, 상기 탄산탈수효소 1 단백질, 및 상기 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩티드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 아포리포단백질 C1은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 탄산무수화효소 1은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 CHL1은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로, 상기 아포리포단백질 C1, 상기 탄산탈수효소 1 단백질, 상기 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준의 측정은 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 또는 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay)에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 예시로, 상기 아포리포단백질 C1, 상기 탄산탈수효소 1 단백질, 및 상기 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질의 발현 수준의 측정은 다중 반응 모니터링 (multiple reaction monitoring; MRM) 방법에 의할 수 있다.
본 발명에서 상기 다중 반응 모니터링 방법은 질량분석기 (mass-spectrometry), 바람직하게는 삼중 사극자 질량분석기 (triple quadrupole mass-spectrometry)를 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명에서 질량분석기 (mass-spectrometry)를 이용한 다중 반응 모니터링 (multiple reaction monitoring; MRM) 방법은 특정 분석물질을 선택적으로 분리하여 검출하고 정량하여 그 농도변화를 모니터링할 수 있는 분석기술이다. MRM은 생체 시료 중에 존재하는 미량의 바이오마커와 같은 물질을 정량적으로 정확하게 다중 측정할 수 있는 방법으로 제1 질량필터 (Q1)를 이용하여 이온화원에서 생성된 이온 단편들 중 어미이온을 선택적으로 충돌관으로 전달한다. 이어 충돌관에 도달한 어미이온은 내부 충돌기체와 충돌하여, 쪼개져 딸이온을 생성하여 제2 질량 필터 (Q2)로 보내지고, 여기서 특징적인 이온만이 검출부로 전달된다. 이런 방식으로 목적하는 성분의 정보만을 검출할 수 있는 선택성 및 민감도가 높은 분석방법이다. MRM은 작은 분자의 정량분석에 활용되어 특정 유전병을 진단하는데 쓰이고 있다. MRM 방법은 다수의 펩티드를 동시에 측정하기에 용이하며, 항체가 없이 정상인과 암환자 사이에서 단백질 예후 예측 마커 후보들의 상대적 농도차를 확인할 수 있다는 장점이 있다. 또한 민감도와 선택성이 탁월하여 특히, 질량분석기를 이용한 프로테옴 분석에서 혈액 내에 있는 복잡한 단백질과 펩티드의 분석을 위해 MRM 분석방법이 도입되고 있다.
본 발명에서, 상기 아포리포단백질 C1의 타겟 펩티드는 서열번호 4 내지 7 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명에서, 상기 아포리포단백질 C1의 타겟 펩티드의 어미이온/딸이온 쌍은 각각 526.75 m/z 과 605.31 m/z, 526.75 m/z 과 776.38 m/z, 526.75 m/z 과 719.36 m/z, 526.75 m/z 과 504.27 m/z, 526.75 m/z 과 391.18 m/z 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 탄산탈수효소 1 단백질의 타겟 펩티드는 서열번호 8 또는 9로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명에서, 상기 탄산탈수효소 1의 타겟 펩티드의 어미이온/딸이온 쌍은 각각 485.80 m/z 과 758.44 m/z, 485.80 m/z 과 643.41 m/z, 485.80 m/z 과 572.38 m/z, 485.80 m/z 과 459.29 m/z 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질의 타겟 펩티드는 서열번호 10 내지 14 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명에서, 상기 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질의 타겟 펩티드의 어미이온/딸이온 쌍은 각각 642.81 m/z 과 836.42 m/z, 642.81 m/z 과 689.35 m/z, 642.81 m/z 과 618.31 m/z, 642.81 m/z 과 504.27 m/z 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서는 상기 아포리포단백질 C1, 상기 탄산탈수효소 1 단백질, 상기 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질 또는 이의 단편을 검출하기 위하여, 상기한 각각의 단백질의 타겟 펩티드 중 일부 아미노산이 안정한 동위원소로 치환된 펩티드를 합성하고, 다중 반응 모니터링 분석 시 내부 표준 물질로 사용하면 상기 단백질의 혈액 내 절대량도 측정할 수 있어 분석의 정확도를 더욱 높일 수 있다.
본 발명에서 내부 표준 물질은 상기 다중 반응 모니터링 분석 시 일반적으로 사용되는 임의의 내부 표준 물질이 사용될 수 있으나, 상기 모니터링 방법 시 내부 표준 물질은 타겟 펩티드를 구성하는 특정 아미노산을 동위원소로 치환한 합성 펩티드 또는 대장균 베타 갈락토시다아제를 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 대장균 베타 갈락토시다아제의 타겟 펩티드는 서열번호 15로 표시되는 폴리펩티드로 이루어지며 어미이온과 딸이온은 각각 542.3 m/z 와 636.3 m/z일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 아포리포단백질 C1, 상기 탄산탈수효소 1 단백질, 상기 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질의 혈액 내 절대량을 측정하기 위하여 타겟 펩티드의 일부 아미노산이 안정한 동위원소로 치환된 특정 펩티드를 내부 표준물질로서 합성하는 경우, 동위 원소로 치환된 아미노산은 리신(Lysine)이나 아르기닌(Arginine)이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 여기서 합성된 펩티드는 95% 이상 순수 분리된 펩티드를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서, 상기 아포리포단백질 C1, 상기 탄산탈수효소 1 단백질, 상기 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 아포리포단백질 C1, 상기 탄산탈수효소 1 단백질 및 상기 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 아포리포단백질 C1, 상기 탄산탈수효소 1 단백질, 상기 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질, 또는 이의 단편을 코딩하는 유전자의 발현 수준의 측정은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩에 의하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 발현 수준을 측정하는 단계는 목적하는 개체가 암 치료를 받기 전에 분리된 생물학적 시료에 대하여 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기 암 치료를 받기 전에 분리된 생물학적 시료는, 암 치료 수행일 또는 수행 예정일 이전에 채취된 것이면 무방하고 채취 시점을 특별히 제한하지는 않으나, 예를 들면, 암 치료 수행일 또는 수행 예정일로부터 48 개월 이전, 36 개월 이전, 24 개월 이전, 12 개월 이전, 10 개월 이전, 8 개월 이내, 6 개월 이전, 4 개월 이전, 10 주 이전, 8 주 이전, 7 주 이전, 6 주 이전, 5 주 이전, 4 주 이전, 3 주 이전, 2 주 이전, 1 주 이전, 6 일 이전, 5 일 이전, 4 일 이전, 3 일 이전, 2 일 이전, 1 일 이전, 12 시간 이전, 6 시간 이전, 4 시간 이전, 2 시간 이전 또는 1 시간 이전에 분리된 생물학적 시료일 수 있다. 여기서 상기 암 치료는 1회 이상 수행될 수 있고, 복수 회 수행되는 경우 어느 일 암 치료 시점을 기준으로 48 개월 이전에 분리된 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 목적하는 개체가 암 치료를 받은 후에 분리된 생물학적 시료에 대하여 아포리포단백질 C1(APOC1), 탄산탈수효소 1 단백질(CA1) 및 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질(CHL1) 중 적어도 하나의 단백질; 상기 단백질의 단편; 또는 상기 단백질 또는 상기 단편을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 암 치료를 받은 후에 분리된 생물학적 시료는, 암 치료 수행일 또는 수행 예정일 이후에 채취된 것이면 무방하고 채취 시점을 특별히 제한하지는 않으나, 예를 들면, 암 치료로부터 48 개월 이내, 36 개월 이내, 24 개월 이내, 12 개월 이내, 10 개월 이내, 8 개월 이내, 6 개월 이내, 4 개월 이내, 10 주 이내, 8 주 이내, 1 주 내지 8 주 이내에, 2 주 내지 8 주 이내에 또는 4 주 내지 8 주 이내에 분리된 생물학적 시료일 수 있다. 여기서 상기 암 치료는 1회 이상 수행될 수 있고, 복수 회 수행되는 경우 어느 일 암 치료 시점을 기준으로 48 개월 이내에 분리된 것일 수 있다.
본 발명에서, 상기 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 상기 아포리포단백질 C1, 이의 단편 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 암 치료 전에 비하여 암 치료 후에 증가한 경우, 상기 예후가 좋을 것으로 예측할 수 있다.
본 발명에서, 상기 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 상기 탄산탈수효소 1 단백질, 이의 단편 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 암 치료 전에 비하여 암 치료 후에 감소한 경우, 상기 예후가 좋을 것으로 예측할 수 있다.
본 발명에서, 상기 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 상기 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질, 이의 단편 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 암 치료 전에 비하여 암 치료 후에 감소한 경우, 상기 예후가 좋을 것으로 예측할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 예시에서, 상기 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된,
1) 상기 아포리포단백질 C1, 이의 단편 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 암 치료 전에 비하여 암 치료 후에 증가한 경우;
2) 상기 탄산탈수효소 1 단백질, 이의 단편 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 암 치료 전에 비하여 암 치료 후에 감소한 경우; 및
3) 상기 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질, 이의 단편 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 암 치료 전에 비하여 암 치료 후에 감소한 경우; 중 적어도 하나의 경우, 바람직하게는 상기 1) 내지 3) 중 두가지의 경우에 해당하는 경우, 보다 바람직하게는 상기 1) 내지 3) 모두에 해당하는 경우, 상기 예후가 좋을 것으로 예측할 수 있다.
본 발명에서, 상기 예후는 목적하는 개체에 대한 암 치료로, 예를 들어, 외과적 절제술, 화학적 치료 방법, 면역 치료 방법 또는 방사선 치료 방법, 바람직하게는 외과적 절제술 후 치료 반응성일 수 있고, 보다 바람직하게는 상기의 치료 후 암의 재발 여부일 수 있다.
본 발명에서, 상기 암은 유방암, 난소암, 대장암, 위암, 간암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(central nerve system; CNS) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종일 수 있으나, 바람직하게는 유방암일 수 있다.
본 발명에서는 아포리포단백질 C1, 탄산탈수효소 1 단백질 및 신경세포 접착분자 L1 유사 바이오마커의 발현 수준을 측정함으로써, 암, 특히는 유방암에 대한 치료 후 예후를 예측하여, 적절한 치료 방식을 선택하기 위한 정보를 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에서 유방암 환자에서 유방암 수술 전후로 아포리포단백질 C1(Apolipoprotein C-I; APOC1); 탄산탈수효소 1 단백질(Carbonic anhydrase 1; CA1); 및 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질(Neural cell adhesion molecule L1-like protein; CHL1) 발현량의 차이를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1에서 유방암 환자에서 유방암 수술 전후로 아포리포단백질 C1(Apolipoprotein C-I; APOC1); 탄산탈수효소 1 단백질(Carbonic anhydrase 1; CA1); 및 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질(Neural cell adhesion molecule L1-like protein; CHL1)의 바이오마커의 정량 결과를 바탕으로 한 수용자-조작 특성(ROC) 그래프를 나타낸 것이다.
본 발명의 서열번호 4 내지 14로 표시되는 타겟 펩티드를 이용한 아포리포단백질 C1(Apolipoprotein C-I; APOC1), 탄산탈수효소 1 단백질(Carbonic anhydrase 1; CA1), 및 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질(Neural cell adhesion molecule L1-like protein; CHL1) 마커의 조합은 높은 정확도로 유방암의 예후를 예측할 수 있음을 알 수 있었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
[실시예 1] 유방암 절제술 후 예후 예측을 위한 타겟 펩티드의 검출
1. 시료의 준비
본 발명의 바이오마커 조합의 유방암 예후 예측의 정확도를 확인하기 위하여, 유방암 환자 중 유방 절제술 치료를 받은 뒤 재발이 없는 예후가 좋은 환자 36명을 선별하였다. 이들 환자에 대하여 수술 전 채혈로 혈액 샘플을 수집하였고, 같은 환자에게서 수술 후 4 내지 8주에 채혈로 혈액 샘플을 수집하였다. 수집된 혈액 샘플에서 혈장을 분리하고, Bradford assay를 통하여 총 단백질을 정량하였다. 이 중 총 단백질 200 ㎍을 우레아(urea)로 변형시킨 뒤 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT)로 환원시키고, 이오도아세트아미드(iodoacetamide)를 통해 알킬화 시켰다. 이후, 트립신을 넣어주어 펩티드화 시키고, C18 컬럼을 이용하여 염을 제거하였다. 내부표준물질로는 펩티드의 말단에 붙어있는 아미노산기가 동위원소로 치환된 합성품을 이용하였다.
2. 삼중 사극자 질량분석기(텐덤메스 질량분석기)를 이용한 다중 반응 모니터링 수행
삼중 사극자 질량분석을 위하여 본 발명의 아포리포단백질 C1(Apolipoprotein C-I; APOC1), 탄산탈수효소 1 단백질(Carbonic anhydrase 1; CA1) 및 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질(Neural cell adhesion molecule L1-like protein; CHL1)의 타겟 펩티드와 어미이온과 딸이온 쌍을 선정하여 그 결과는 하기 표 1에 나타내었다.
유전자명칭 단백질 명칭 uniprotKB 서열번호 펩티드 서열 어미이온 딸이온
APOC1 Apolipoprotein C-I P02654 5 EFGNTLEDK 526.75 605.31
526.75 776.38
526.75 719.36
526.75 504.27
526.75 391.18
CA1 Carbonic anhydrase 1 P00915 8 VLDALQAIK 485.80 758.44
485.80 643.41
485.80 572.38
485.80 459.29
CHL1 Neural cell adhesion molecule L1-like protein O00533 12 GDLYFANVEEK 642.81 836.42
642.81 689.35
642.81 618.31
642.81 504.27
상기 1.에서 준비된 최종 시료를 역상 수지 크로마토그래피에 걸어 혈장 펩티드 절편을 분리하였고, 삼중 사극자 질량분석기(기기: 5500 Qtrap, AB Sciex, USA)를 사용해 각 펩티드의 MRM 스펙트럼을 얻었다. 이때, 역상 수지 크로마토그래피는 HALOTM C18 컬럼 (Eksigent, USA) 컬럼으로 45분간 5%~40%의 아세토니트릴 농도 구배를 이용하여 실시하였다. MultiQuantTM 컴퓨터 정량 분석 프로그램 (AB Sciex, USA)으로 타깃 펩티드의 MRM 크로마토그램의 피크 면적을 계산하여 정량 정보를 확인하였다. 이때 각 타깃 펩티드의 정량값은 내부 표준물질로 넣어준 대장균 베타 갈락토시다아제의 MRM 크로마토그램의 피크 면적에 대한 비율로 표시하였다.
3. 각 타겟 펩티드의 유방암 예후 예측의 정확도 확인
상기 2.에서 확인된 유방 절제술 전과 후에서의 혈액 샘플 내 아포리포단백질 C1(Apolipoprotein C-I; APOC1), 탄산탈수효소 1 단백질(Carbonic anhydrase 1; CA1), 및 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질(Neural cell adhesion molecule L1-like protein; CHL1) 발현량의 차이를 정량하였다.
그 결과 수술이 성공적으로 이루어져서 예후가 양호한 경우 아포리포단백질 C1은 수술 후 농도의 상승이 주로 나타났으며, 탄산탈수효소 1 단백질 및 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질은 수술 후 농도의 하락이 주로 나타났다.
이들 개별 값을 마스토체크 (식약처 제조허가19-5호, 체외진단용소프트웨어)에 대입 시, 도 1의 결과에 대하여 수술 전의 민감도는 67%, 수술 후의 특이도는 64%를 보였다. 또한 상기 아포리포단백질 C1, 탄산탈수효소 1 및 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질 3종 바이오마커 농도값의 조합을 로지스틱회귀분석을 통해 최적화시켰을 때, 도 2와 같이 AUC 값은 0.72 이며, 민감도 67%, 특이도 75%를 나타났다.
이처럼 본 발명의 서열번호 4 내지 14로 표시되는 타겟 펩티드를 이용한 아포리포단백질 C1(Apolipoprotein C-I; APOC1), 탄산탈수효소 1 단백질(Carbonic anhydrase 1; CA1), 및 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질(Neural cell adhesion molecule L1-like protein; CHL1) 마커의 조합은 높은 정확도로 유방암의 예후를 예측할 수 있음을 알 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명에서는 아포리포단백질 C1, 탄산탈수효소 1 단백질 및 신경세포 접착분자 L1 유사 바이오마커의 발현 수준을 측정함으로써, 암, 특히는 유방암에 대한 치료 후 예후를 예측하여, 적절한 치료 방식을 선택하기 위한 정보를 제공할 수 있다.

Claims (27)

  1. 아포리포단백질 C1(Apolipoprotein C-I; APOC1), 탄산탈수효소 1 단백질(Carbonic anhydrase 1; CA1), 및 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질(Neural cell adhesion molecule L1-like protein; CHL1) 중 적어도 하나의 단백질; 상기 단백질의 단편; 또는 상기 단백질 또는 상기 단편을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 암의 예후 예측을 위한 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 단백질 또는 상기 단편의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질 또는 상기 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 암의 예후 예측을 위한 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 단백질 또는 상기 단편을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질 또는 상기 단편을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 암의 예후 예측을 위한 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 암은 유방암, 난소암, 대장암, 위암, 간암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(central nerve system; CNS) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종인, 암의 예후 예측을 위한 조성물.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 예후 예측은 상기 암의 치료 후 치료 반응성을 예측하는 것인, 암의 예후 예측을 위한 조성물.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 예후 예측은 상기 암의 외과적 절제술 후 치료 반응성을 예측하는 것인, 암의 예후 예측을 위한 조성물.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 암의 예후 예측용 조성물을 포함하는 암의 예후 예측용 키트.
  8. 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 아포리포단백질 C1(Apolipoprotein C-I; APOC1), 탄산탈수효소 1 단백질(Carbonic anhydrase 1; CA1), 및 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질(Neural cell adhesion molecule L1-like protein; CHL1) 중 적어도 하나의 단백질; 상기 단백질의 단편; 또는 상기 단백질 또는 상기 단편을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 암의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 복수(ascites), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 또는 뇌척수액(cerebrospinal fluid)인, 암의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  10. 제 8항에 있어서,
    상기 단백질 또는 상기 단편의 발현 수준의 측정은 상기 단백질 또는 상기 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 암의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  11. 제 8항에 있어서,
    상기 단백질 또는 상기 단편의 발현 수준 측정은 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 또는 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay)에 의해 수행되는, 암의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  12. 제 8항에 있어서,
    상기 단백질 또는 상기 단편의 발현 수준 측정은 다중 반응 모니터링 (multiple reaction monitoring; MRM) 방법에 의하는, 암의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 아포리포단백질 C1의 타겟 펩티드는 서열번호 4 내지 7 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는, 암의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  14. 제 12항에 있어서,
    상기 아포리포단백질 C1의 타겟 펩티드의 어미이온/딸이온 쌍은 각각 526.75 m/z 과 605.31 m/z, 526.75 m/z 과 776.38 m/z, 526.75 m/z 과 719.36 m/z, 526.75 m/z 과 504.27 m/z, 526.75 m/z 과 391.18 m/z 인, 암의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  15. 제 12항에 있어서,
    상기 탄산탈수효소 1 단백질의 타겟 펩티드는 서열번호 8 또는 9로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는, 암의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  16. 제 12항에 있어서,
    상기 탄산탈수효소 1의 타겟 펩티드의 어미이온/딸이온 쌍은 각각 485.80 m/z 과 758.44 m/z, 485.80 m/z 과 643.41 m/z, 485.80 m/z 과 572.38 m/z, 485.80 m/z 과 459.29 m/z 인, 암의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  17. 제 12항에 있어서,
    상기 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질의 타겟 펩티드는 서열번호 10 내지 14 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는, 암의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  18. 제 12항에 있어서,
    상기 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질의 타겟 펩티드의 어미이온/딸이온 쌍은 각각 642.81 m/z 과 836.42 m/z, 642.81 m/z 과 689.35 m/z, 642.81 m/z 과 618.31 m/z, 642.81 m/z 과 504.27 m/z 인, 암의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  19. 제 12항에 있어서,
    상기 다중 반응 모니터링 방법 시 내부 표준 물질은 타겟 펩타이드를 구성하는 특정 아미노산을 동위원소로 치환한 합성 펩타이드 또는 대장균 베타 갈락토시다아제를 사용하는, 암의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  20. 제 19항에 있어서,
    상기 대장균 베타 갈락토시다아제의 타겟 펩티드는 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지며 어미이온과 딸이온은 각각 542.3 m/z 와 636.3 m/z 인, 암의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  21. 제 8항에 있어서,
    상기 예후 예측은 상기 암의 외과적 절제술 후 치료 반응성을 예측하는 것인, 암의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  22. 제 21항에 있어서,
    상기 발현 수준을 측정하는 단계는 목적하는 개체가 암 치료를 받기 전에 분리된 생물학적 시료에 대하여 수행되는 것인, 암의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  23. 제 22항에 있어서,
    상기 정보 제공 방법은 목적하는 개체가 암 치료를 받은 후에 분리된 생물학적 시료에 대하여 아포리포단백질 C1(APOC1), 탄산탈수효소 1 단백질(CA1) 및 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질(CHL1) 중 적어도 하나의 단백질; 상기 단백질의 단편; 또는 상기 단백질 또는 상기 단편을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 더 포함하는, 암의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  24. 제 23항에 있어서,
    상기 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 상기 아포리포단백질 C1, 이의 단편 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 암 수술 전에 비하여 수술 후에 증가한 경우, 상기 암의 예후가 좋을 것으로 예측하는, 암의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  25. 제 23항에 있어서,
    상기 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 상기 탄산탈수효소 1 단백질, 이의 단편 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 수술 전에 비하여 수술 후에 감소한 경우, 상기 암의 예후가 좋을 것으로 예측하는, 암의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  26. 제 23항에 있어서,
    상기 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 상기 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질, 이의 단편 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 수술 전에 비하여 수술 후에 감소한 경우, 상기 암의 예후가 좋을 것으로 예측하는, 암의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  27. 제8항에 있어서,
    상기 암은 유방암, 난소암, 대장암, 위암, 간암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(central nerve system; CNS) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종인, 암의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
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