WO2021182838A1 - 약제 내성 진단용 조성물 및 이를 이용한 진단 키트 - Google Patents

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WO2021182838A1
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drug
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carcinoma
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PCT/KR2021/002888
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정재호
김정민
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연세대학교 산학협력단
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Definitions

  • the present invention relates to a composition for diagnosing OXPHOS inhibitor resistance and a diagnostic kit using the same.
  • Cancer is one of the incurable diseases that civilization needs to solve, and huge capital is being invested in development to cure it worldwide. Diagnosed and more than 60,000 people have died.
  • various anticancer therapies have been developed rapidly in the diagnosis and treatment of cancer, but the fatality rate due to cancer is still high.
  • side effects that accompany various anticancer drugs and various anticancer therapies still exist. Research to reduce these side effects is being actively conducted, and recently, as a new treatment regimen with few side effects, drugs for treating cancer by regulating the cancer metabolic process are emerging.
  • mitochondria involved in metabolic processes have emerged (Trends Mol Med. 2004 Aug;10(8):372-8.), and these mitochondria serve as major components of cell survival through ATP production.
  • it is known to act as an important factor in cell death by determining cell fate by mitochondrial membrane-dependent apoptosis signaling (Cell Death Differ. 2003 Aug;10(8):870-80.) .
  • the process of ATP synthesis through electron transfer and chemical osmosis occurring in mitochondria is called oxidative phosphorylation (OXPHOS). Almost all oxygen-breathing organisms synthesize ATP more efficiently compared to the anaerobic fermentation process. Performs phosphorylation oxidative phosphorylation.
  • OXPHOS inhibitors Drugs that inhibit such oxidative phosphorylation are called OXPHOS inhibitors, and the inhibitors include IM156, metformin, rotenone, methylmalonate, BAM 15, BAY 87-2243, nitropropionic acid (3 -Nitropropionic acid; 3NPA) and Atovaquone exist.
  • anticancer drugs that have been found to have anticancer effects include IM156, metformin, phenformin, and rotenone, but there are patients with anticancer resistance who do not respond to these drugs. do.
  • One object of the present invention is to provide a composition for diagnosing resistance to an anticancer drug, an OXPHOS inhibitor drug.
  • Another object of the present invention is to provide a diagnostic kit capable of predicting the presence or absence of resistance to OXPHOS inhibitor drug treatment in cancer patients.
  • Another object of the present invention is to provide a method of providing information for diagnosing the presence or absence of resistance that will appear during OXPHOS inhibitor drug treatment in cancer patients.
  • Another object of the present invention relates to a screening method of a candidate substance for overcoming OXPHOS inhibitor drug resistance in cancer patients, therapeutic candidates, or OXPHOS inhibitor drug sensitivity enhancement.
  • the present invention relates to a composition for diagnosing drug resistance.
  • the diagnostic composition may include an agent for measuring the expression level of MEC17 (alpha Tubulin Acetyltransferase 1; aTAT1) protein or a gene encoding the same.
  • MEC17 alpha Tubulin Acetyltransferase 1; aTAT1
  • MEC17 alpha Tubulin Acetyltransferase 1; aTAT1
  • aTAT1 alpha Tubulin Acetyltransferase 1
  • the ATAT1 gene encodes a clathrin protein that plays an important role in vesicle formation and acetylates alpha tubulin on lysine 40 (K40). This process is known to be important in the growth of microtubules during chemotaxis and cilium formation.
  • the information on the "MEC17 protein or a gene encoding it" is registered with the National Center for Biotechnology Information (NCBI) (Gene ID: 79969, NM_001031722.4), and the MEC17 protein is an amino acid represented by SEQ ID NO: 1 sequence, and the gene encoding the MEC17 protein may consist of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • drug in the present invention, “drug”, “anticancer agent” and “anticancer agent” may be used interchangeably, and the agent corresponds to an anticancer agent having a new mechanism to kill cancer cells by inhibiting oxidative phosphorylation of mitochondria. Since various types of immune cells utilize specific cellular metabolic processes to maintain cell survival, development and function, the drug can be used to enhance the effectiveness of cancer treatment by inhibiting ATP production.
  • the anticancer agent is an OXPHOS inhibitor, nitrogen mustard, imatinib, oxaliplatin, rituximab, erlotinib, neratinib, lapatinib, gefitinib, vandetanib, nirotinib, semasanib, bosutinib, axiplatin nib, cediranib, restaurtinib, trastuzumab, gefitinib, bortezomib, sunitinib, carboplatin, bevacizumab, cisplatin, cetuximab, viscumalbum, asparaginase, tretinoin, hydroxy Carbamide, Dasatinib, Estramustine, Gemtuzumab Ozogamycin, Ibritumomab Tucetan, Heptaplatin, Methylaminolevulinic Acid, Amsacrine, Alemtuzumab, Procarbazine
  • the "OXPHOS inhibitor” refers to one selected from the group consisting of a ubiquinone reduction activity inhibitor, a mitochondrial electron transport chain I iinhibitor, or an iron chelator. It may include the above, and any drug having a mechanism to kill cancer cells by inhibiting oxidative phosphorylation of mitochondria may be included without being limited thereto.
  • the ubiquinone reducing activity inhibitor may be IACS-010759, but is not limited thereto as long as it corresponds to a drug that affects the activity of ubiquinone, a fat-soluble electron transporter present in the inner mitochondrial membrane.
  • the mitochondrial electron transport chain I inhibitor may be at least one selected from the group consisting of IM156, metformin, phenformin, and rotenone, more preferably IM156 or rotenone.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the iron chelator may be VLX 600, but is not limited thereto as long as it is a compound having a function of inhibiting mitochondrial respiration.
  • the "IM156 drug” has a CAS number of 1422365-94-3 and is a kind of a new biguanide derivative compound previously known as HL156A, similar to other biguanide drugs, mitochondrial complex I (mitochondrial complex I). It is a drug that blocks complex I). It is a small molecule oral drug derived from biguanide and is known as a potent oxidative phosphorylation (OXPHOS) inhibitor.
  • OXPHOS potent oxidative phosphorylation
  • AMPK activity was more effective than other AMPK (AMP-activated protein kinase) such as metformin ( Am J Physiol Renal Physiol. 2016 Mar 1 ;310(5):F342-50.).
  • AMP-activated protein kinase AMP-activated protein kinase
  • metformin Am J Physiol Renal Physiol. 2016 Mar 1 ;310(5):F342-50.
  • the "rotenone drug” is a drug that functions to inhibit tumor growth dependent on oxidative metabolism by acting on mitochondrial respiratory chain complex I (Mitochondrial Complex I). It is a lipophilic, naturally occurring product obtained from the roots and stems of the legumes Lonchocarpus and Derris species. It has been widely used as an insecticide, but its toxic effect has limited its use in many countries. did.
  • rotenone is known to inhibit cell proliferation by causing apoptosis in various human cancer cell lines, and is being developed for use in cancer treatment. Examples of mitochondrial electron transport chain I inhibitors that act on mitochondrial respiratory chain complex I other than rotenone include IM156, metformin, and phenformin.
  • drug resistance refers to a decrease in the effect of the drug when the drug is used repeatedly in a quantitative manner, and in order to obtain the same effect previously experienced in patients with drug resistance, increase the amount of the drug or increase the frequency of use It is a condition in which the same effect as before is not obtained even if the dose must be increased or the same dose of the substance is administered.
  • drug resistance was diagnosed when the change in the expression level of the MEC17 protein or the gene encoding it is increased compared to the control group, drug resistance was diagnosed.
  • the "diagnosis” refers to determining susceptibility to a drug, determining whether an onset disease currently has drug resistance, or prognosis of drug-resistant cancer (eg, cancer to the drug) It is defined as a broad concept that includes determining the reactivity of
  • the prognosis of the present invention refers to an act of predicting in advance the course of a disease and the outcome of death or survival.
  • the prognosis or prognostic diagnosis may be interpreted to mean any act of predicting the course of a disease before/after treatment by comprehensively considering the patient's condition, as the course of the disease may vary depending on the physiological or environmental condition of the patient.
  • the prognosis is an act of predicting the therapeutic response in advance after an anticancer drug treatment, preferably an OXPHOS inhibitor treatment, or predicting whether resistance to an OXPHOS inhibitor develops, or whether to use an OXPHOS inhibitor based on this It can be interpreted as an act of choice.
  • tumor or “cancer” is a disease in which the cell cycle is not regulated and continues to divide, and is divided into Carcinoma and Sarcoma depending on the site of occurrence.
  • Carcinoma refers to a malignant tumor that arises from epithelial cells such as mucous membranes and skin
  • sarcoma refers to a malignant tumor that arises from non-epithelial cells such as muscle, connective tissue, bone, cartilage, and blood vessels.
  • the cancer is thyroid cancer, parathyroid cancer, stomach cancer, ovarian cancer, colorectal cancer, pancreatic cancer, liver cancer, breast cancer, cervical cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gallbladder cancer, biliary tract cancer, non-Hodgkin's lymphoma, Hodgkin's lymphoma, blood cancer , bladder cancer, kidney cancer, melanoma, colon cancer, bone cancer, skin cancer, head cancer, uterine cancer, rectal cancer, brain tumor, perianal cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, vaginal cancer, vulvar carcinoma, esophageal cancer, small intestine cancer, endocrine adenocarcinoma, adrenal cancer , soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, ureter cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, CNS central nervoussystem tumor, primary CNS lymphoma, spinal cord tumor, brainstem glioma or pituitary ade
  • the agent for measuring the expression level of the MEC17 protein is an antibody, oligopeptide, ligand, PNA (peptide nucleic acid) and an aptamer that specifically binds to the MEC17 protein. It may include one or more selected from, but is not limited thereto.
  • the "antibody” refers to a substance that specifically binds to an antigen and causes an antigen-antibody reaction.
  • an antibody refers to an antibody that specifically binds to the MEC17 protein.
  • Antibodies of the present invention include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies and recombinant antibodies.
  • the antibody can be easily prepared using techniques well known in the art.
  • the polyclonal antibody can be produced by a method well known in the art, including the process of injecting an antigen of the protein into an animal and collecting blood from the animal to obtain a serum containing the antibody.
  • Such polyclonal antibodies can be prepared from any animal such as goat, rabbit, sheep, monkey, horse, pig, cow, dog, and the like.
  • monoclonal antibodies can be prepared using the hybridoma method well known in the art (see Kohler and Milstein (1976) European Journal of Immunology 6:511-519), or the phage antibody library technology (Clackson et al, Nature, 352). :624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991).
  • the antibody prepared by the above method may be separated and purified using methods such as gel electrophoresis, dialysis, salt precipitation, ion exchange chromatography, and affinity chromatography.
  • the antibodies of the present invention include functional fragments of antibody molecules as well as complete forms having two full-length light chains and two full-length heavy chains.
  • a functional fragment of an antibody molecule means a fragment having at least an antigen-binding function, and includes Fab, F(ab'), F(ab')2 and Fv.
  • the "oligopeptide” is a peptide consisting of 2 to 20 amino acids and may include a dipeptide, a tripeptide, a tetrapeptide, and a pentapeptide, but is not limited thereto.
  • PNA Peptide Nucleic Acid
  • DNA has a phosphate-ribose sugar backbone
  • PNA has a repeated N-(2-aminoethyl)-glycine backbone linked by peptide bonds, which greatly increases binding strength and stability to DNA or RNA, resulting in molecular biology , diagnostic assays and antisense therapy.
  • PNA is described in Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O (December 1991). "Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide". Science 254 (5037): 1497-1500.
  • the "aptamer” is an oligonucleic acid or a peptide molecule, and the general content of the aptamer is described in Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide” aptamers: powerful new tools for molecular medicine”. J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R. "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library”. Proc Natl Acad Sci USA. 95(24): 142727(1998)).
  • the agent for measuring the expression level of the gene encoding the MEC17 protein may include one or more selected from the group consisting of primers, probes, and antisense nucleotides that specifically bind to the gene encoding the MEC17 protein. , but is not limited thereto.
  • the "primer” is a fragment that recognizes a target gene sequence, and includes a pair of forward and reverse primers, but preferably, a primer pair that provides analysis results with specificity and sensitivity. High specificity can be conferred when the primer's nucleic acid sequence is a sequence that is inconsistent with the non-target sequence present in the sample, so that only the target gene sequence containing the complementary primer binding site is amplified and the primer does not cause non-specific amplification. .
  • the "probe” refers to a substance capable of specifically binding to a target substance to be detected in a sample, and refers to a substance capable of specifically confirming the presence of a target substance in a sample through the binding.
  • the type of probe is not limited as a material commonly used in the art, but preferably PNA (peptide nucleic acid), LNA (locked nucleic acid), peptide, polypeptide, protein, RNA or DNA, and most preferably It is PNA.
  • the probe includes a biomaterial derived from or similar thereto or manufactured in vitro, for example, enzymes, proteins, antibodies, microorganisms, animal and plant cells and organs, neurons, DNA, and It may be RNA, DNA includes cDNA, genomic DNA, and oligonucleotides, RNA includes genomic RNA, mRNA, and oligonucleotides, and examples of proteins include antibodies, antigens, enzymes, peptides, and the like.
  • RNA includes cDNA, genomic DNA, and oligonucleotides
  • RNA includes genomic RNA, mRNA, and oligonucleotides
  • proteins include antibodies, antigens, enzymes, peptides, and the like.
  • LNA Locked nucleic acids
  • LNA nucleosides include common nucleic acid bases in DNA and RNA, and can form base pairs according to Watson-Crick base pairing rules. However, due to the 'locking' of the molecule due to the methylene bridge, the LNA does not form an ideal shape in the Watson-Crick bond.
  • LNAs When LNAs are incorporated into DNA or RNA oligonucleotides, LNAs can pair with complementary nucleotide chains more rapidly, increasing the stability of the double helix.
  • the "antisense” means that the antisense oligomer is hybridized with a target sequence in RNA by Watson-Crick base pairing, and typically mRNA and RNA in the target sequence: A sequence of nucleotide bases allowing the formation of an oligomeric heteroduplex. and oligomers having an inter-subunit backbone. An oligomer may have exact sequence complementarity or approximate complementarity to a target sequence.
  • kits for diagnosing drugs comprising the composition for diagnosing drug resistance of the present invention.
  • kit refers to a tool capable of evaluating the expression level of a biomarker by labeling a probe or antibody that specifically binds to a biomarker component with a detectable label.
  • a detectable substance with respect to a probe or antibody by reaction with a substrate
  • indirect labeling in which a color-generating label is conjugated by reactivity with another directly labeled reagent. It may include a chromogenic substrate solution, a washing solution, and other solutions to undergo a color reaction with the label, and may be prepared including reagent components used.
  • the kit may be a kit including essential elements necessary for performing RT-PCR, and in addition to each primer pair specific for a marker gene, a test tube, reaction buffer, deoxynucleotides (dNTPs), Taq-polymerization enzymes, reverse transcriptase, DNase, RNase inhibitors, sterile water, and the like.
  • the kit may be a kit for detecting a gene for predicting drug resistance including essential elements necessary for performing a DNA chip.
  • the DNA chip kit may include a substrate to which cDNA corresponding to a gene or fragment thereof is attached as a probe, and the substrate may include cDNA corresponding to a quantitative control gene or fragment thereof.
  • the kit of the present invention is not limited thereto, as long as it is known in the art.
  • the kit may be an RT-PCR kit, a DNA chip kit, an ELISA kit, a protein chip kit, a rapid kit, or a multiple reaction monitoring (MRM) kit.
  • MRM multiple reaction monitoring
  • the kit of the present invention may further include one or more other component compositions, solutions or devices suitable for the assay method.
  • the kit may further include essential elements necessary for performing the reverse transcription polymerase reaction.
  • the reverse transcription polymerase reaction kit includes a pair of primers specific for a gene encoding a marker protein.
  • the primer is a nucleotide having a sequence specific to the nucleic acid sequence of the gene, and may have a length of about 7 bp to 50 bp, more preferably about 10 bp to 30 bp. It may also include primers specific for the nucleic acid sequence of the control gene.
  • reverse transcription polymerase reaction kits include test tubes or other suitable containers, reaction buffers (with varying pH and magnesium concentrations), deoxynucleotides (dNTPs), enzymes such as Taq-polymerase and reverse transcriptase, DNase, RNase inhibitor DEPC -Water (DEPC-water), sterile water, etc. may be included.
  • the kit for diagnosing drug resistance of the present invention may include essential elements necessary for performing a DNA chip.
  • the DNA chip kit may include a substrate to which cDNA or oligonucleotide corresponding to a gene or fragment thereof is attached, and reagents, agents, enzymes, etc. for preparing a fluorescently-labeled probe.
  • the substrate may also contain cDNA or oligonucleotides corresponding to control genes or fragments thereof.
  • the kit for diagnosing drug resistance of the present invention may include essential elements necessary for performing ELISA.
  • the ELISA kit contains an antibody specific for this protein.
  • Antibodies are antibodies with high specificity and affinity for a marker protein and little cross-reactivity with other proteins, and are monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, or recombinant antibodies.
  • the ELISA kit may also include an antibody specific for a control protein.
  • Other ELISA kits include reagents capable of detecting bound antibody, such as labeled secondary antibodies, chromophores, enzymes (eg, conjugated with an antibody) and substrates thereof or capable of binding the antibody. other materials and the like.
  • a nitrocellulose membrane, a PVDF membrane, a polyvinyl resin or a polystyrene resin, a well plate synthesized from a glass, A slide glass or the like may be used, but is not limited thereto.
  • the label of the secondary antibody is preferably a color developing agent, which has a color reaction, HRP (horseradish peroxidase), basic dephosphorylation enzyme (alkaline phosphatase), colloidal gold (colloid gold), Labels such as fluorescein and dye such as FITC (poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate) and RITC (rhodamine-B-isothiocyanate) may be used, but are limited thereto it is not
  • the chromogenic substrate for inducing color development in the kit for diagnosing drug resistance of the present invention is preferably used according to a color-reacting marker, TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)], OPD(o-phenylenediamine), etc. can be used.
  • the chromogenic substrate is more preferably provided in a dissolved state in a buffer solution (0.1 M NaAc, pH 5.5).
  • a chromogenic substrate such as TMB is decomposed by HRP used as a label of the secondary antibody conjugate to generate chromogenic deposits, and the presence or absence of the marker proteins is detected by visually confirming the degree of deposition of the chromogenic deposits.
  • the washing solution preferably contains a phosphate buffer solution, NaCl and Tween 20, and a buffer solution consisting of 0.02 M phosphate buffer, 0.13 M NaCl, and 0.05% Tween 20 (PBST). ) is more preferable.
  • PBST 0.05% Tween 20
  • the secondary antibody is reacted with the antigen-antibody conjugate, and an appropriate amount is added to the immobilizer and washed 3 to 6 times.
  • a sulfuric acid solution H 2 SO 4
  • it relates to a method of providing information for diagnosing drug resistance.
  • the method of the present invention may include measuring the expression level of the MEC17 protein or a gene encoding the protein in a biological sample isolated from the subject of interest.
  • the "target subject” refers to an individual having cancer or a high probability of developing cancer, and may be a mammal including a human, for example, a human, a rat, a mouse, a guinea pig, a hamster, a rabbit, a monkey, a dog. , may be selected from the group consisting of cats, cows, horses, pigs, sheep and goats, preferably humans, but is not limited thereto.
  • the biological sample refers to any material, biological fluid, tissue or cell obtained from or derived from an individual, whole blood, leukocytes, peripheral blood mononuclear cells ), buffy coat, plasma, serum, sputum, tears, mucus, nasal washes, nasal aspirate, respiration (breath), urine, semen, saliva, peritoneal washings, ascites, cystic fluid, meningeal fluid, amniotic fluid , glandular fluid, pancreatic fluid, lymph fluid, pleural fluid, nipple aspirate, bronchial aspirate, synovial fluid, joint aspirate (joint aspirate), organ secretions (organ secretions), cells (cell), cell extract (cell extract), and may be at least one selected from the group consisting of cerebrospinal fluid (cerebrospinal fluid), but is not limited thereto.
  • the agent for measuring the expression level of the MEC17 protein is at least one selected from the group consisting of an antibody, oligopeptide, ligand, PNA (peptide nucleic acid) and aptamer that specifically binds to the MEC17 protein. may include.
  • Radioimmunoassay radioimmunodiffusion method, octeroni immunodiffusion method, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, complement fixation assay, 2D electrophoresis analysis, liquid chromatography-mass spectrometry (liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS (liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), Western blotting, or ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) may be performed.
  • liquid chromatography-mass spectrometry liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS
  • LC-MS/MS liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry
  • Western blotting or ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)
  • the measurement of the expression level of the MEC17 protein may be performed by a multiple reaction monitoring (MRM) method.
  • MRM multiple reaction monitoring
  • a synthetic peptide in which a specific amino acid constituting a target peptide is substituted with an isotope or E. coli beta galactosidase may be used as the internal standard material.
  • the MEC17 protein may consist of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
  • the agent for measuring the expression level of the gene encoding the MEC17 protein may include one or more selected from the group consisting of primers, probes and antisense nucleotides that specifically bind to the gene encoding the MEC17 protein. .
  • the measurement of the expression level of the gene encoding the MEC17 protein is reverse transcription polymerase reaction (RT-PCR), competitive reverse transcription polymerase reaction (Competitive RT-PCR), real-time reverse transcription polymerase reaction (Real-time RT-PCR) ), RNase protection assay (RPA), Northern blotting or DNA chip.
  • RT-PCR reverse transcription polymerase reaction
  • Competitive RT-PCR competitive reverse transcription polymerase reaction
  • Real-time RT-PCR real-time reverse transcription polymerase reaction
  • RNase protection assay RPA
  • Northern blotting or DNA chip.
  • the description of the antibody, oligopeptide, ligand, PNA (peptide nucleic acid), aptamer, etc. and the description of primers, probes, etc. are overlapped with those described above. The detailed description is omitted.
  • the expression level of the MEC17 protein or the gene encoding it measured with respect to the biological sample of the subject of interest is higher than that of the control group, drug resistance is predicted to occur or is highly likely to occur in the subject of interest, It can be predicted that the treatment responsiveness to the drug is low or, furthermore, the prognosis of cancer treatment is poor.
  • control group may be a normal control in which drug resistance does not occur, or an average to median value of the expression level of the MEC17 protein or a gene encoding the same in drug-sensitive cells.
  • the expression level of the marker protein or nucleic acid molecule encoding it in the control group can be compared with the expression level of the marker protein or the nucleic acid molecule encoding the same in a biological sample derived from a cancer patient to be analyzed, and whether there is a significant change in the expression level can be determined to diagnose drug resistance.
  • the agent corresponds to an anticancer agent having a new mechanism to kill cancer cells by inhibiting oxidative phosphorylation of mitochondria. Since various types of immune cells utilize specific cellular metabolic processes to maintain cell survival, development and function, the drug can be used to enhance the effectiveness of cancer treatment by inhibiting ATP production.
  • the anticancer agent is an OXPHOS inhibitor, nitrogen mustard, imatinib, oxaliplatin, rituximab, erlotinib, neratinib, lapatinib, gefitinib, vandetanib, nirotinib, semasanib, bosutinib, axiplatin nib, cediranib, restaurtinib, trastuzumab, gefitinib, bortezomib, sunitinib, carboplatin, bevacizumab, cisplatin, cetuximab, viscumalbum, asparaginase, tretinoin, hydroxy Carbamide, Dasatinib, Estramustine, Gemtuzumab Ozogamycin, Ibritumomab Tucetan, Heptaplatin, Methylaminolevulinic Acid, Amsacrine, Alemtuzumab, Procarbazine
  • the cancer is thyroid cancer, parathyroid cancer, stomach cancer, ovarian cancer, colorectal cancer, pancreatic cancer, liver cancer, breast cancer, cervical cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gallbladder cancer, biliary tract cancer, non-Hodgkin's lymphoma, Hodgkin's lymphoma , blood cancer, bladder cancer, kidney cancer, melanoma, colon cancer, bone cancer, skin cancer, head cancer, uterine cancer, rectal cancer, brain tumor, perianal cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, vaginal cancer, vulvar carcinoma, esophageal cancer, small intestine cancer, endocrine adenocarcinoma , adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, ureter cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, CNS central nervoussystem tumor, primary CNS lymphoma, spinal cord tumor, brainstem glioma or pituit
  • it relates to a screening method of a drug for overcoming drug resistance or a drug for treatment or drug sensitivity enhancement.
  • the screening method of the present invention comprises the steps of treating a candidate substance with respect to cancer cells or cancer tissues expressing the MEC17 protein or a gene encoding the same in vitro; and measuring the activity or expression level of the MEC17 protein or measuring the expression level of a gene encoding the protein in the cancer cells or cancer tissue after treatment with the candidate substance.
  • the "screening” refers to selecting a substance having a specific target property from a candidate group consisting of several substances by a specific manipulation or evaluation method.
  • the cancer cell may be a target individual, preferably one isolated from an individual resistant to or likely to have an anticancer agent, or engineered to overexpress the MEC17 protein or a gene encoding the same, preferably A recombinant vector containing a gene encoding the MEC17 protein may be introduced into and transfected into cancer cells.
  • the "vector” refers to a means for expressing a target gene in a host cell.
  • the vector includes elements for expression of a target gene, and may include an origin of replication, a promoter, an operator, a transcription termination sequence, and the like, into the genome of a host cell. Appropriate enzymatic sites (eg, restriction enzyme sites) for introduction of and/or ribosome binding sites (RBS) for translation into selectable markers and/or proteins to confirm successful introduction into host cells, IRES (Internal Ribosome Entry Site) and the like may be additionally included.
  • the vector may be engineered by a conventional genetic engineering method to have the above-described fusion polynucleotide (fusion promoter) as a promoter.
  • the vector may further include a transcriptional control sequence (eg, enhancer, etc.) other than the promoter.
  • the recombinant vector may be a viral or non-viral vector
  • the viral vector may be an adenoviral vector, a retroviral vector including a lentivirus, an adeno-associated viral vector, or a herpes simplex virus vector.
  • the non-viral vector may be a plasmid vector, a bacteriophage vector, a liposome, a bacterial artificial chromosome, an artificial yeast chromosome, and the like, but is not limited thereto.
  • the target gene in the recombinant vector may be operably linked to the fusion polynucleotide.
  • operatively linked refers to a functional linkage between a gene expression control sequence and another nucleotide sequence.
  • the gene expression control sequences may be "operatively linked" to control the transcription and/or translation of other nucleotide sequences.
  • the fusion polynucleotide in order for the fusion polynucleotide to be operably linked to the target gene, the fusion polynucleotide may be linked to the 5' end of the target gene.
  • the recombinant vector of the present invention can be used as an expression vector for a target protein capable of expressing the target protein with high efficiency in an appropriate host cell when the gene encoding the target protein to be expressed is operably linked.
  • the recombinant vector of the present invention may further include a transcriptional control sequence.
  • the transcriptional regulatory sequence may include a transcription termination sequence such as a polyadenylation sequence (pA); It may be one or more selected from the group consisting of replication origins such as f1 replication origin, SV40 replication origin, pMB1 replication origin, adeno replication origin, AAV replication origin, BBV replication origin, etc., but is not limited thereto.
  • the recombinant vector may further include a selection marker.
  • the selection marker is a gene for confirming whether the recombinant vector has been successfully introduced into the host cell or for constructing a stable cell line, for example, one selected from the group consisting of drug resistance genes such as antibiotics, metabolism-related genes, gene amplification genes, and the like. may be more than
  • a delivery method well known in the art may be used for the delivery (introduction) of the recombinant vector into cancer cells.
  • the delivery method includes, for example, microinjection, calcium phosphate precipitation, electroporation, sonoporation, magnetofection using a magnetic field, liposome-mediated transfection, gene bambadment (gene). bombardment), dendrimers, and the use of inorganic nanoparticles, but is not limited thereto.
  • the candidate material may be at least one selected from the group consisting of natural compounds, synthetic compounds, RNA, DNA, polypeptides, enzymes, proteins, ligands, antibodies, antigens, bacterial or fungal metabolites and bioactive molecules. , but is not limited thereto.
  • the agent for measuring the activity or expression level of the protein is not particularly limited, but for example, an antibody, oligopeptide, ligand, PNA (peptide nucleic acid) and aptamer that specifically binds to the protein. ) may include one or more selected from the group consisting of.
  • a method for measuring or comparing the activity or expression level of the protein protein chip analysis, immunoassay, ligand binding assay, MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) analysis, SELDI- TOF (Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) analysis, radioimmunoassay, radioimmunodiffusion method, Oukteroni immunodiffusion method, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, complement fixation assay, two-dimensional electrophoresis analysis, Liquid chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS), LC-MS/MS (liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), Western blotting or ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), etc., but are limited thereto it's not going to be
  • the agent for measuring the expression level of the gene encoding the protein may include one or more selected from the group consisting of primers, probes, and antisense nucleotides that specifically bind to the gene.
  • RT-PCR reverse transcription polymerase reaction
  • Competitive RT-PCR competitive reverse transcription polymerase reaction
  • Real-time RT-PCR real-time reverse transcription polymerase reaction
  • RPA RNase protection assay
  • the candidate substance when the activity or expression level of the MEC17 protein measured in the cancer cells or cancer tissue is decreased after the treatment of the candidate substance, or the expression level of the gene encoding the protein is decreased, the candidate substance is treated with anticancer agent resistance It may further comprise the step of determining a drug for overcoming or therapeutic or anticancer drug sensitivity enhancement.
  • the present invention relates to a composition for diagnosing resistance to OXPHOS inhibitors and a diagnostic kit using the same, and predicts the suitability of the use of OXPHOS inhibitors for cancer patients before dosing, so that clinicians can use an appropriate alternative anticancer agent in future treatment plans.
  • a composition for diagnosing resistance to OXPHOS inhibitors and a diagnostic kit using the same, and predicts the suitability of the use of OXPHOS inhibitors for cancer patients before dosing, so that clinicians can use an appropriate alternative anticancer agent in future treatment plans.
  • FIG. 1 is a view confirming the MEC17(aTAT1) gene expression level measured in the gastric cancer cell lines SK4, MKN45, and AGS through western blot analysis according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a western blot analysis of MEC17 (aTAT1) expression levels after drug treatment with the OXPHOS inhibitor drug rotenone or IM156 in a resistant cell line with no sensitivity to an OXPHOS inhibitor, according to an embodiment of the present invention. It is a diagram showing the results confirmed through.
  • FIG. 3 is an OXPHOS inhibitor-sensitive cell line and a resistant cell line without sensitivity, according to an embodiment of the present invention, before and after drug treatment of the OXPHOS inhibitor drug rotenone or IM156 ImageJ the amount of change in MEC17 (aTAT1) gene expression It is a diagram confirmed by comparison by quantification.
  • One embodiment of the present invention relates to a composition for diagnosing drug resistance, comprising an agent for measuring the expression level of MEC17 (alpha tubulin acetyltransferase 1; aTAT1) protein or a gene encoding the same.
  • MEC17 alpha tubulin acetyltransferase 1; aTAT1
  • Another embodiment of the present invention relates to a kit for diagnosing drug resistance comprising the composition for diagnosing drug resistance of the present invention.
  • it relates to a method for providing information for diagnosing drug resistance, comprising measuring the expression level of the MEC17 protein or a gene encoding the protein in a biological sample isolated from a subject of interest. .
  • the present invention relates to a screening method of a candidate substance for overcoming drug resistance or treatment or a candidate substance for enhancing drug sensitivity.
  • the inventors of the present invention performed all experiments with the approval of the Yonsei University School of Medicine Evaluation Committee (Institutional Review Board, IRB).
  • Human gastric cancer cell lines SK4, MKN45, and AGS were obtained from the Korean Cell Line Bank, and 1% penicillin-streptomycin (Gibco) was added in RPMI 1640 medium containing 10% FBS according to the guide of the Korean Cell Line Bank.
  • RPMI 1640 medium containing 10% FBS 1% penicillin-streptomycin
  • it was cultured in an incubator (HERAcell 150i, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) at 37° C., 5% CO 2 and used for the experiment.
  • Example 2 Comparison of expression levels of MEC17 (alpha Tubulin Acetyltransferase 1; aTAT1) markers in various gastric cancer cell lines
  • the parent cell which is the cell line cultured in Example 1, is referred to as a P cell (parent cell; P cell) in the specification below, and the cells (stem cells) that survived passage culture for 30 days in an environment without glucose from the P cells.
  • P cell parent cell
  • stem cells stem cells
  • S cell selected cell
  • the gastric cancer cell lines SK4, MKN45, and AGS were separated into P cells and S cells, and Western blot was performed to measure the expression level of the MEC17 (aTAT1) gene, and the results are shown in FIG. 1 .
  • FIG. 1 it can be seen that the gene expression level of aTAT1 in S cells, which has characteristics similar to those in cancer stem cells, was higher than that in the parental P cells, and the expression level of aTAT1 in S cells in all cell lines was It was confirmed that it appeared significantly higher than that of P cells.
  • Example 3 Confirmation of MEC17 (aTAT1) expression as an OXPHOS inhibitor drug resistance (drug resistance) marker
  • the expression of the MEC17 gene in SSK4 cells, a resistant cell line was significantly increased by 50% or more after drug treatment, and the expression of the MEC17 gene in PSK4 cells, a drug-sensitive cell line, was at a similar level. , or it was confirmed that rotenone had a tendency to decrease again. This means that when the expression of the MEC17 (aTAT1) gene is increased, the treatment responsiveness of the drug is low, and the prognosis of the patient may be poor.
  • composition according to the present invention can more easily and accurately diagnose whether a cancer patient is resistant to an OXPHOS inhibitor, and through this, it is widely used in the customized precision medicine field by providing accurate basic information so that an appropriate alternative anticancer agent can be used in a future treatment plan. can be utilized.

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Abstract

본 발명은 OXPHOS 억제제 내성 암을 진단하기 위한 것으로, 보다 상세하게는 항암 치료에 사용되는 IM156, 로테논 등 미토콘드리아 전자 수송 사슬Ⅰ 억제제 약물 내성 진단용 조성물 및 이를 이용한 진단 키트에 관한 것이다.

Description

약제 내성 진단용 조성물 및 이를 이용한 진단 키트
본 발명은 OXPHOS 억제제 내성을 진단하기 위한 조성물 및 이를 이용한 진단 키트에 관한 것이다.
암은 인류가 해결해야 할 난치병 중의 하나로, 전 세계적으로 이를 치유하기 위한 개발에 막대한 자본이 투자되고 있는 실정이며, 우리나라의 경우, 질병 사망 원인 중 제 1위의 질병으로서 연간 약 10만 명 이상이 진단되고, 약 6만 명 이상이 사망하고 있다. 지난 10년간 암 진단과 치료에 있어 다양한 항암 요법이 비약적으로 발전하고 있지만, 암 발병으로 인한 치사율은 여전히 높다. 또한 다양한 항암제 및 여러 항암 요법을 시도할 때 수반되는 부작용도 여전히 존재한다. 이러한 부작용을 줄이기 위한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 최근 부작용이 적은 새로운 치료 요법으로 암 대사 과정을 조절하여 암을 치료하는 약제가 떠오르고 있다.
항암 요법에 있어 효과적인 표적으로서 대사 과정과 관련이 있는 미토콘드리아가 부상되었으며(Trends Mol Med. 2004 Aug;10(8):372-8.), 이러한 미토콘드리아는 ATP 생성을 통해 세포 생존의 주요 구성 성분으로 기능할 뿐만 아니라, 미토콘드리아 막-의존적 세포 사멸 신호에 의해 세포 운명을 결정하기에 세포 사멸에 중요한 인자로 작용하는 것으로도 알려져 있다(Cell Death Differ. 2003 Aug;10(8):870-80.). 미토콘드리아에서 일어나는 전자전달과 화학삼투를 통한 ATP의 합성 과정을 산화적 인산화(oxidative phosphorylation; OXPHOS)라고 하는데, 거의 모든 산소 호흡을 하는 생물들은 혐기성 발효 과정과 비교했을 때 보다 효율적으로 ATP를 합성하는 방법인 산화적 인산화를 수행한다. 이러한 산화적 인산화를 억제하는 약물을 OXPHOS 억제제라고 하며, 상기 억제제로는 IM156, 메트포민(Metformin), 로테논(Rotenone), 메틸말론산(Methylmalonate), BAM 15, BAY 87-2243, 니트로 프로피온산(3-Nitropropionic acid; 3NPA), 아토바쿠온(Atovaquone) 등이 존재한다. 이들 중에 항암 효과가 있는 것으로 밝혀진 항암 약물로는 IM156, 메트포민(Metformin), 펜포르민(Phenformin), 로테논(Rotenone) 등이 있으나, 이러한 약물에 대해서 반응을 하지 않는 항암 내성을 가진 환자도 존재한다. 따라서 이러한 내성을 지닌 환자에게는 해당 약물로 치료한다 할지라도 치료의 효과를 보장할 수 없으므로, 임상 의사 및 환자들의 시간 및 비용이 불필요하게 소모되는 상황이 발생할 가능성이 존재하게 된다. 따라서 항암 치료를 시작할 시에는 개개인의 특성에 맞는 맞춤형 약제를 선택적으로 사용할 수 있도록 미리 치료 효율을 가늠할 수 있는 척도가 현실적으로 필요한 상황이다.
이렇듯 약물에 대한 내성과 관련된 연구는 거의 없는 실정이기에 본 발명자들은 OXPHOS 억제제(oxidative phosphorylation inhibitor)에 내성이 있는 환자를 미리 선별할 수 있는 마커를 발굴함으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 일 목적은 항암 약물인 OXPHOS 억제제 약물에 대한 내성 진단용 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 암 환자의 OXPHOS 억제제 약물 치료 시 내성 발생 유무를 예측할 수 있는 진단 키트를 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 환자의 OXPHOS 억제제 약물 치료 시에 나타날 내성 발생 유무를 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 환자의 OXPHOS 억제제 약물 내성 극복, 치료용 후보 물질 또는 OXPHOS 억제제 약물 감수성 증진용 후보 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세 사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
명세서 내에 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
1. 약제 내성 진단의 용도
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 약제 내성 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 진단용 조성물은 MEC17(alpha Tubulin Acetyltransferase 1; aTAT1) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 "MEC17(alpha Tubulin Acetyltransferase 1; aTAT1)"이란 알파 튜뷸린 아세틸트랜스퍼라제라는 ATAT1 유전자에 의해 인코딩되는 단백질로서, TAT, C6orf134, Nbla00487, alpha-TAT, 또는 alpha-TAT1으로도 불린다. 트랜스퍼라제 패밀리에 해당하며, 보다 구체적으로 아실 트랜스퍼라제에 속한다. 상기 ATAT1 유전자는 소포 형성에 중요한 역할을 하는 클라트린 단백질을 암호화하며, 라이신 40(lysine 40; K40) 상의 알파 튜뷸린을 아세틸화시킨다. 이 과정은 화학 주성(chemotaxis)과 실륨(cilium)을 형성하는 동안 미세소관의 성장에 있어 중요한 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 상기 "MEC17 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자"의 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 등록되어 있고(Gene ID: 79969, NM_001031722.4), 상기 MEC17 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있고, MEC17 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 비제한적인 예에서 상기 MEC17의 서열과 99% 이상 내지 100% 미만, 95% 이상 내지 99% 미만, 90% 이상 내지 95% 미만, 85% 이상 내지 90% 미만, 또는 80% 이상 내지 85% 미만의 상동성을 가지는 경우일 수 있으며, 당해 분야의 통상의 기술자에게 본 발명의 목적하는 효과를 발휘한다는 것이 자명한 범위 내에서 이에 제한 없이 모두 포함할 수 있다.
본 발명에서 "약제", "항암 치료제"와 "항암제"는 혼용하여 사용될 수 있으며, 상기 약제는 미토콘드리아의 산화적 인산화를 억제하여 암 세포를 사멸시키는 새로운 기전을 갖는 항암제에 해당한다. 다양한 유형의 면역 세포는 세포 생존, 발달 및 기능을 유지하기 위해 특정한 세포 대사 과정을 이용하므로 상기 약제는 ATP 생성을 억제함으로써 암 치료 효과를 높이는 데에 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 항암제는 OXPHOS 억제제, 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 네라티닙, 라파티닙, 제피티닙, 반데타닙, 니로티닙, 세마사닙, 보수티닙, 악시티닙, 세디라닙, 레스타우르티닙, 트라스투주맙, 게피티니브, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 5-플루오로우라실, 플루다가빈, 에노시타빈, 플루타미드, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레로마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 템시롤리무스, 테모졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 레우코보린, 트레토닌, 엑스메스탄, 아미노글루테시미드, 아나그렐리드, 나벨빈, 파드라졸, 타목시펜, 토레미펜, 테스토락톤, 아나스트로졸, 레트로졸, 보로졸, 비칼루타미드, 로무스틴 및 카르무스틴으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 약물을 이용한 것일 수 있으며, 바람직하게는 OXPHOS 억제제일 수 있고, 보다 바람직하게는 OXPHOS 억제제의 예시로서 유비퀴논 환원 활성 억제제(ubiquinone reduction activity inhibitor), 미토콘드리아 전자 수송 사슬Ⅰ 억제제(mitochondrial electron transport chain I iinhibitor) 또는 철 킬레이터(iron chelator)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에 해당할 수 있다.
본 발명에서 상기 "OXPHOS 억제제"란 유비퀴논 환원 활성 억제제(ubiquinone reduction activity inhibitor), 미토콘드리아 전자 수송 사슬Ⅰ 억제제(mitochondrial electron transport chain I iinhibitor) 또는 철 킬레이터(iron chelator)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으며, 미토콘드리아의 산화적 인산화를 억제하여 암 세포를 사멸시키는 기전을 가진 약물이라면 이에 제한되지 않고 모두 포함될 수 있다.
본 발명에서 상기 유비퀴논 환원 활성 억제제는 IACS-010759일 수 있으나, 미토콘드리아 내막에 존재하는 지용성 전자운반체인 유비퀴논의 활성에 영향을 미치는 약물에 해당한다면 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 미토콘드리아 전자 수송 사슬Ⅰ 억제제는 IM156, 메트포민(Metformin), 펜포르민(Phenformin) 및 로테논(Rotenone)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 보다 바람직하게는 IM156 또는 로테논일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 철 킬레이터는 VLX 600일 수 있으나, 미토콘드리아 호흡을 억제하는 기능을 가진 화합물이라면 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 "IM156 약물"은 CAS 번호가 1422365-94-3로, 이전에 HL156A로 알려진 새로운 비구아니드 유도체(biguanide derivative) 화합물의 일종으로 다른 비구아니드 약물과 유사하게 미토콘드리아 복합체 I(mitochondrial complex I)을 차단하는 작용을 하는 약물에 해당한다. 비구아니드에서 추출한 소분자 경구 약물로 강력한 산화성인산화(OXPHOS) 억제제로 알려져 있다. 최근 연구 결과에 따르면 IM156을 이용한 시험관내 배양된 쥐 복막 중피 세포 및 쥐 신장 근위관 세포의 치료 후, AMPK 활성은 메트포민과 같은 다른 AMPK (AMP-activated protein kinase)보다 효과가 더욱 좋다는 것이 밝혀져 있다(Am J Physiol Renal Physiol. 2016 Mar 1;310(5):F342-50.). 그러나 IM156 약물은 세포 유형에 따라 상이한 작용 방식으로 영향을 미치기 때문에 다양한 작용 기전에 관한 연구가 진행 중에 있다.
본 발명에서 상기 "로테논 약물"은 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체 I(Mitochondrial Complex I)에 작용하여, 산화적 대사에 의존하는 종양 생장을 억제하는 기능을 하는 약물이다. 친유성을 띠며 콩과 식물인 론코카르푸스(Lonchocarpus) 및 데리스(Derris) 종의 뿌리와 줄기에서 자연적으로 발생하여 얻어지는 산물로 살충제로 널리 사용되었지만, 독성 효과가 있어 많은 국가에서 사용이 제한되기도 하였다. 또한, 로테논은 다양한 인간 암 세포주에서 세포 사멸을 일으켜 세포 증식을 억제하는 것으로 알려져 암 치료에 이용될 수 있도록 개발 중이다. 로테논 외 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체 I에 작용하는 미토콘드리아 전자 수송 사슬I 억제제의 예로는 IM156, 메트포민(Metformin), 펜포르민(Phenformin) 등이 있다.
본 발명에서 상기 "약제 내성"이란 약물을 정량 반복적으로 사용했을 때 해당 약물의 효과가 감소하는 것을 말하며, 약제 내성이 있는 환자에게 이전에 경험한 동일한 효과를 얻기 위해서는 그 사용량을 늘리거나 사용 빈도를 증가시켜야 하거나 혹은 이전과 같은 용량의 물질을 투여해도 전과 똑같은 효과를 얻지 못하는 상태를 말한다. 본 발명에서 MEC17 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준의 변화를 대조군과 비교하여 증가하는 경우 약제 내성이 있는 것으로 진단하였다.
본 발명에서 상기 "진단"은 약제에 대한 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 발병한 질환이 약제 내성을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 또는 약제 내성 암의 예후(예컨대, 해당 약물에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 상기 진단에 대한 정보를 제공하는 것을 포함하는 넓은 개념으로 정의한다.
본 발명의 "예후"란, 질병의 경과 및 사망 또는 생존의 결과를 미리 예측하는 행위를 말한다. 상기 예후 또는 예후 진단이란 질환의 경과가 환자의 생리적 또는 환경적 상태에 따라 달라질 수 있으며, 이러한 환자의 상태를 종합적으로 고려하여 치료 전/후 질병의 경과를 예측하는 모든 행위를 의미하는 것으로 해석될 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 예후는 항암제 치료, 바람직하게는 OXPHOS 억제제 치료 후 치료 반응성을 미리 예상하는 행위 또는 OXPHOS 억제제에 대한 내성이 발생하는지 여부를 예측하는 것이거나, 또는 이를 토대로 OXPHOS 억제제 사용 여부를 적절하게 선택하는 행위로 해석될 수 있다.
본 발명에서 "종양" 또는 "암"은 세포 주기가 조절되지 않아 세포 분열을 계속하는 질병으로서, 발생 부위에 따라 암종(Carcinoma)과 육종(Sarcoma)으로 나뉜다. 암종(Carcinoma)은 점막, 피부 같은 상피성 세포에서 발생한 악성 종양을 뜻하고, 육종(Sarcoma)은 근육, 결합 조직, 뼈, 연골, 혈관 등의 비상피성 세포에서 발생한 악성 종양을 뜻한다. 상기 암은 갑상선암, 부갑상선암, 위암, 난소암, 대장암, 췌장암, 간암, 유방암, 자궁경부암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종일 수 있으나, 종양의 분화 및/또는 증식 등 암의 진행이 본 발명에서 기술하는 암 세포 및/또는 암 줄기세포에 의존적인 암의 종류라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 약제 내성 진단용 조성물에서 상기 MEC17 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 MEC17 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질을 가리킨다. 본 발명의 목적상, 항체는 상기 MEC17 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 본 발명의 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 상기 항체는 당 업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 다클론 항체는 상기 단백질의 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 과정을 포함하는 당 업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물로부터 제조될 수 있다. 또한, 단클론 항체는 당 업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method; Kohler 및 Milstein (1976) European Journal of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리 기술(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991 참조)을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전장의 경쇄 및 2개의 전장의 중쇄를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
본 발명에서 상기 "올리고펩타이드"는 펩타이드로 2 내지 20 개의 아미노산으로 구성되며 디 펩티드, 트리 펩티드, 테트라 펩티드 및 펜타 펩티드를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 상기 "PNA(Peptide Nucleic Acid)"는 인공적으로 합성된, DNA 또는 RNA와 비슷한 중합체를 가리키며, 1991년 덴마크 코펜하겐 대학교의 Nielsen, Egholm, Berg와 Buchardt 교수에 의해 처음으로 소개되었다. DNA는 인산-리보스당 골격을 갖는데 반해, PNA는 펩타이드 결합에 의해 연결된 반복된 N-(2-아미노에틸)-글리신 골격을 가지며, 이로 인해 DNA 또는 RNA에 대한 결합력과 안정성이 크게 증가되어 분자 생물학, 진단 분석 및 안티센스 치료법에 사용되고 있다. PNA는 문헌[Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O (December 1991). "Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide". Science 254 (5037): 1497-1500]에 상세하게 개시되어 있다.
본 발명에서 상기 "앱타머"는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 문헌(Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R. "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24): 142727(1998))에 상세하게 개시되어 있다.
본 발명에서 상기 MEC17 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 MEC17 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 "프라이머"는 표적 유전자 서열을 인지하는 단편으로서, 정방향 및 역방향의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료 내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성이 부여될 수 있다.
본 발명에서 상기 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브의 종류는 당 업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함하는 것으로, 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 "LNA(Locked nucleic acids)"란, 2'-O, 4'-C 메틸렌 브릿지를 포함하는 핵산 아날로그를 의미한다(J Weiler, J Hunziker and J Hall Gene Therapy (2006) 13, 496.502). LNA 뉴클레오사이드는 DNA와 RNA의 일반적 핵산 염기를 포함하며, Watson-Crick 염기 쌍 규칙에 따라 염기 쌍을 형성할 수 있다. 하지만, 메틸렌 브릿지로 인한 분자의 'locking'으로 인해, LNA는 Watson-Crick 결합에서 이상적 형상을 형성하지 못하게 된다. LNA가 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드에 포함되면, LNA는 보다 빠르게 상보적 뉴클레오티드 사슬과 쌍을 이루어 이중 나선의 안정성을 높일 수 있다.
본 발명에서 상기 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서 전형적으로 mRNA와 RNA: 올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 의미한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 MEC17 단백질이나, 이들을 코딩하는 유전자의 정보는 알려져 있으므로, 당 업자라면 이를 바탕으로 상기 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 용이하게 디자인할 수 있을 것이다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 상기 약제 내성 진단용 조성물을 포함하는 약제 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명에서 "키트"는 바이오 마커 성분에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 항체를 검출 가능한 표지로 표지하여 바이오 마커의 발현 수준을 평가할 수 있는 도구를 말한다. 프로브 또는 항체 관련하여 검출 가능한 물질을 기질과의 반응에 의해서 직접적으로 표지하는 것뿐만 아니라, 직접적으로 표지된 다른 시약과의 반응성에 의한 발색하는 표지체가 접합된 간접적 표지도 포함한다. 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액 및 기타 다른 용액 등을 포함할 수 있으며, 사용되는 시약 성분을 포함하여 제작될 수 있다. 본 발명에서 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있으며, 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합효소, 역전사효소, DNase, RNase 억제제, 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 약제 내성 예측용 유전자를 검출하기 위한 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 당 업계에 공지되어 있는 것이라면, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있다.
본 발명의 상기 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에서 상기 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 더 포함할 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 단백질을 코딩하는 유전자에 대해 특이적인 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 상기 유전자의 핵산 서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오티드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp의 길이를 가질 수 있다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 용기, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약제 내성 진단용 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표지 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약제 내성 진단용 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대해 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 약제 내성 진단용 키트에서 항원-항체 결합반응을 위한 고정체로는 니트로셀룰로오즈 막, PVDF 막, 폴리비닐(polyvinyl) 수지 또는 폴리스티렌(polystyrene) 수지로 합성된 웰 플레이트(Well plate), 유리로 된 슬라이드 글래스 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 약제 내성 진단용 키트에서 2차 항체의 표지체는 발색 반응을 하는 통상의 발색제가 바람직하며, HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(coloid gold), FITC(폴리 L-라이신-플루오르세인 아이소티오시아네이트), RITC(로다민-B-아이소티오시아네이트) 등의 형광물질(fluorescein) 및 색소(dye) 등의 표지체가 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 약제 내성 진단용 키트에서 발색을 유도하기 위한 발색 기질은 발색 반응을 하는 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, TMB(3,3',5,5'-테트라메틸 베지딘), ABTS[2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)], OPD(o-페닐렌다이아민) 등을 사용할 수 있다. 이때, 발색 기질은 완충 용액(0.1 M NaAc, pH 5.5)에 용해된 상태로 제공되는 것이 더욱 바람직하다. TMB와 같은 발색기질은 이차 항체 접합체의 표지체로 사용된 HRP에 의해 분해되어 발색 침적체를 생성하고, 이 발색 침적체의 침적 정도를 육안으로 확인함으로써 상기 마커 단백질들의 존재 유무를 검출한다.
본 발명의 약제 내성 진단용 키트에서 세척액은 인산염 완충 용액, NaCl 및 트윈 20(Tween 20)을 포함하는 것이 바람직하며, 0.02 M 인산염 완충용액, 0.13 M NaCl, 및 0.05% 트윈 20으로 구성된 완충 용액(PBST)이 더욱 바람직하다. 세척액은 항원-항체 결합 반응 후 항원-항체 결합체에 2차 항체를 반응시킨 다음 적당량을 고정체에 첨가하여 3 내지 6회 세척한다. 반응 정지 용액은 황산 용액(H2SO4)이 바람직하게 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 약제 내성 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 상기 방법은 상기 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 상기 MEC17 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 방법은 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서, 약제 내성 발생의 유무를 선별하기 위한 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 "목적하는 개체"란 암이 발병하였거나 발병 가능성이 높은 개체로, 인간을 포함하는 포유 동물일 수 있고, 예를 들면, 인간, 래트, 마우스, 모르모트, 햄스터, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 양 및 염소로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 인간일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 생물학적 시료는 개체로부터 얻어지거나 개체로부터 유래된 임의의 물질, 생물학적 체액, 조직 또는 세포를 의미하는 것으로, 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 복수(ascites), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 및 뇌척수액(cerebrospinal fluid) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 MEC17 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 MEC17 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 MEC17 단백질의 발현 수준의 측정은 단백질 칩 분석, 면역 측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역 분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 또는 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay)에 의해 수행될 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 MEC17 단백질의 발현 수준의 측정은 다중 반응 모니터링 (multiple reaction monitoring; MRM) 방법에 의할 수 있다.
본 발명에서 상기 다중 반응 모니터링 방법 시 내부 표준 물질은 타깃 펩타이드를 구성하는 특정 아미노산을 동위원소로 치환한 합성 펩타이드 또는 대장균 베타 갈락토시다아제를 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 MEC17 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 MEC17 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 MEC17 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 MEC17 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준의 측정은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩에 의할 수 있다.
본 발명의 정보 제공 방법에서 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid), 앱타머(aptamer) 등에 관한 기재와 프라이머, 프로브 등에 관한 기재는 앞서 기재된 바와 중복되어 명세서의 과도한 복잡을 피하기 위하여 이하 그 자세한 기재를 생략한다.
본 발명에서 상기 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 MEC17 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 대조군에 비하여 높을 경우, 상기 목적하는 개체에 약제 내성이 발생하였거나 발생할 가능성이 높을 것으로 예측되어, 상기 약제에 대한 치료 반응성이 낮거나 더 나아가서는 암 치료 예후가 좋지 않을 것으로 예측할 수 있다.
본 발명에서 "대조군"이란 약제 내성이 발생하지 아니한 정상 대조군이거나, 약제 감수성 세포에서의 MEC17 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준의 평균 내지 중간 값일 수 있다. 대조군에서의 마커 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산분자의 발현량과 분석 대상이 되는 암 환자 유래의 생물학적 시료에서의 마커 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산분자의 발현량을 비교할 수 있으며, 상기 발현량의 유의한 변화 여부를 판단하여 약제 내성 여부를 진단할 수 있다.
본 발명에서 상기 약제는 미토콘드리아의 산화적 인산화를 억제하여 암 세포를 사멸시키는 새로운 기전을 갖는 항암제에 해당한다. 다양한 유형의 면역 세포는 세포 생존, 발달 및 기능을 유지하기 위해 특정한 세포 대사 과정을 이용하므로 상기 약제는 ATP 생성을 억제함으로써 암 치료 효과를 높이는 데에 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 항암제는 OXPHOS 억제제, 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 네라티닙, 라파티닙, 제피티닙, 반데타닙, 니로티닙, 세마사닙, 보수티닙, 악시티닙, 세디라닙, 레스타우르티닙, 트라스투주맙, 게피티니브, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 5-플루오로우라실, 플루다가빈, 에노시타빈, 플루타미드, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레로마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 템시롤리무스, 테모졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 레우코보린, 트레토닌, 엑스메스탄, 아미노글루테시미드, 아나그렐리드, 나벨빈, 파드라졸, 타목시펜, 토레미펜, 테스토락톤, 아나스트로졸, 레트로졸, 보로졸, 비칼루타미드, 로무스틴 및 카르무스틴으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 약물을 이용한 것일 수 있으며, 바람직하게는 OXPHOS 억제제일 수 있고, 보다 바람직하게는 OXPHOS 억제제의 예시로서 유비퀴논 환원 활성 억제제(ubiquinone reduction activity inhibitor), 미토콘드리아 전자 수송 사슬Ⅰ 억제제(mitochondrial electron transport chain I inhibitor) 또는 철 킬레이터(iron chelator)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에 해당할 수 있다.
본 발명에서 상기 암은 갑상선암, 부갑상선암, 위암, 난소암, 대장암, 췌장암, 간암, 유방암, 자궁경부암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종일 수 있으나, 종양의 분화 및/또는 증식 등 암의 진행이 본 발명에서 기술하는 암 세포 및/또는 암 줄기세포에 의존적인 암의 종류라면 이에 제한되지 않는다.
2. 약제 내성 극복 또는 치료용 약물 또는 약제 감수성 증진용 약물의 스크리닝 방법
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 약제 내성 극복 또는 치료용 약물 또는 약제 감수성 증진용 약물의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명의 스크리닝 방법은, 인-비트로(in vitro)에서 MEC17 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 발현하는 암 세포 또는 암 조직에 대하여 후보 물질을 처리하는 단계; 및 상기 후보 물질의 처리 후 상기 암 세포 또는 암 조직에 대하여 MEC17 단백질의 활성 또는 발현 수준을 측정하거나 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 "스크리닝"이란, 여러 물질로 이루어진 후보군으로부터 목적으로 하는 어떤 특정한 성질을 갖는 물질을 특정한 조작 또는 평가 방법으로 선별하는 것이다.
본 발명에서 상기 암 세포는 목적하는 개체, 바람직하게는 항암제에 대해 내성이 있거나 있을 가능성이 높은 개체로부터 분리된 것이거나, MEC17 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자가 과발현되도록 조작된 것일 수 있고, 바람직하게는 MEC17 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 암 세포 내로 도입되어 형질 감염된 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 상기 벡터는 목적 유전자 발현을 위한 요소 (elements)를 포함하는 것으로, 복제원점 (replication origin), 프로모터, 작동 유전자 (operator), 전사 종결 서열 (terminator) 등을 포함할 수 있고, 숙주 세포의 게놈 내로의 도입을 위한 적절한 효소 부위 (예컨대, 제한 효소 부위) 및/또는 숙주 세포 내로의 성공적인 도입을 확인하기 위한 선별 마커 및/또는 단백질로의 번역을 위한 리보좀 결합 부위 (ribosome binding site; RBS), IRES (Internal Ribosome Entry Site) 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 벡터는 프로모터로서 상기한 융합 폴리뉴클레오타이드 (융합 프로모터)를 갖도록 통상적인 유전공학적 방법으로 조작된 것일 수 있다. 상기 벡터는 상기 프로모터 이외의 전사 조절 서열 (예컨대 인핸서 등)을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 재조합 벡터는 바이러스성 또는 비바이러스성 벡터일 수 있으며, 상기 바이러스성 벡터는 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스를 포함하는 레트로바이러스 벡터, 아데노-부속 바이러스 벡터 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터 등일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 비바이러스성 벡터로는 플라스미드 벡터, 박테리오파지 벡터, 리포솜, 세균인공염색체, 효모인공염색체 등일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 상기 재조합 벡터에서 상기 목적 유전자는 상기 융합 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 연결될 수 있다. 용어 "작동 가능하게 연결된(operatively linked)"은 유전자 발현 조절 서열과 다른 뉴클레오타이드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 유전자 발현 조절 서열은 "작동 가능하게 연결(operatively linked)"됨으로써 다른 뉴클레오타이드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다. 상기 재조합 벡터에 있어서, 상기 융합 폴리뉴클레오타이드가 상기 목적 유전자에 작동 가능하게 연결되기 위해서, 상기 융합 폴리뉴클레오타이드는 상기 목적 유전자의 5' 말단에 연결된 것일 수 있다. 본 발명의 재조합 벡터는, 발현시키고자 하는 목적 단백질의 암호화 유전자가 작동 가능하게 연결될 경우, 적절한 숙주 세포에서 상기 목적 단백질을 높은 효율로 발현시킬 수 있는 목적 단백질의 발현 벡터로 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 재조합 벡터는 전사 조절 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 전사 조절 서열은 폴리아데닐화 서열(pA)과 같은 전사 종결 서열; f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점, BBV 복제원점 등의 복제 원점 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 재조합 벡터는 선별 마커를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 재조합 벡터가 숙주 세포 내에 성공적으로 도입되었는지 여부를 확인하거나 안정적인 세포주 구축을 위한 유전자로서, 예컨대, 항생제와 같은 약물 저항 유전자, 대사 관련 유전자, 유전자 증폭 유전자 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명에서 상기 재조합 벡터의 암 세포 내로의 운반(도입)은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예컨대, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법(electroporation), 초음파 천공법(sonoporation), 자기장을 이용한 자기주입법(magnetofection), 리포좀-매개 형질감염법, 유전자 밤바드먼트 (gene bombardment), 덴드리머 및 무기(inorganic) 나노 입자의 사용 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 후보 물질은 천연 화합물, 합성 화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사 산물 및 생활성 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기한 단백질의 활성 또는 발현 수준을 측정하는 제제는 특별히 제한하지는 않으나, 예를 들면 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 단백질의 활성 또는 발현 수준을 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역 분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 또는 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 단백질이나 이를 코딩하는 유전자의 정보는 알려져 있으므로, 당업자라면 이를 바탕으로 상기 단백질을 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 용이하게 디자인할 수 있을 것이다.
본 발명에서 상기 유전자의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 후보 물질의 처리 후 상기 암 세포 또는 암 조직에서 측정된 MEC17 단백질의 활성 또는 발현 수준이 감소하거나, 혹은 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준이 감소한 경우, 상기 후보 물질을 항암제의 내성 극복 또는 치료용 약물 또는 항암제 감수성 증진용 약물로 판별하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법에서 약제, 약제 내성 및 암 등에 대한 기재는 항암제 내성 진단용 조성물에서 기재한 바와 동일하여, 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 생략한다.
본 발명은 OXPHOS 억제제에 대한 내성 진단용 조성물 및 이를 이용한 진단 키트에 대한 것으로, 암 환자에 대한 OXPHOS 억제제 사용의 적합성을 투약 전에 예측하여 임상의에 의한 향후 치료 계획에 있어 적절한 대체 항암제를 사용할 수 있도록 정확한 기초 정보를 제공함으로써 환자의 비용 부담을 줄이는 동시에 치료 효과를 높여 궁극적으로 생존율을 높일 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 위암 세포주인 SK4, MKN45, 및 AGS에서 측정된 MEC17(aTAT1) 유전자 발현 수준을 웨스턴블랏 분석을 통해 확인한 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, OXPHOS 억제제에 대한 감수성이 있는 세포주와 감수성이 없는 내성 세포주에 OXPHOS 억제제 약물인 로테논 또는 IM156의 약물 처리 후 MEC17(aTAT1) 발현 수준을 웨스턴블랏 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, OXPHOS 억제제에 대한 감수성이 있는 세포주와 감수성이 없는 내성 세포주에 OXPHOS 억제제 약물인 로테논 또는 IM156의 약물 처리 전후 MEC17(aTAT1) 유전자 발현 수준의 변화량을 ImageJ로 정량화하여 비교 확인한 도이다.
본 발명의 일 구현 예에서는 MEC17(alpha Tubulin Acetyltransferase 1; aTAT1) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 약제 내성 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 구현 예에서는 본 발명의 상기 약제 내성 진단용 조성물을 포함하는 약제 내성 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 구현 예에서는 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 상기 MEC17 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 약제 내성 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 구현 예에서는 본 발명의 상기 약제 내성 극복 또는 치료용 후보 물질 또는 약제 감수성 증진용 후보 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 위암 세포주의 배양
본 발명의 발명자들은 연세대학교 의과대학 평가위원회 (Institutional Review Board, IRB)의 승인을 얻어 모든 실험을 수행하였다. 한국 세포주 은행(Korean Cell Line Bank)으로부터 인간 위암 세포주인 SK4, MKN45, 및 AGS를 수득하여 한국 세포주 은행의 가이드에 따라 10% FBS가 포함된 RPMI 1640 배지에 1% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco)을 추가하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터(incubator)(HERAcell 150i, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)에서 배양하여 실험에 이용하였다.
실시예 2: 다양한 위암 세포주에서의 MEC17(alpha Tubulin Acetyltransferase 1; aTAT1) 마커의 발현 정도 비교
상기 실시예 1에서 배양한 세포주인 모세포를 이하 명세서 상에서 P 세포(parent cell; P cell)라고 칭하며, 상기 P 세포로부터 글루코스가 없는 환경에서 30일에 걸친 계대 배양을 과정을 거쳐 살아남은 세포(줄기세포성 암 세포; cancer stem cell; CSC)만을 일컬어 이하 명세서 상에서 S-세포(selected cell; S cell)라 칭한다. 상기의 위암 세포주인 SK4, MKN45, 및 AGS를 P 세포와 S 세포로 분리하여 MEC17(aTAT1) 유전자의 발현 정도를 측정하기 위하여 웨스턴 블롯을 수행하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1을 참조하면, 암 줄기세포에서와 유사한 특징을 가지는 S 세포에서의 aTAT1의 유전자 발현 정도가 모세포인 P 세포에 비하여 높게 나타난 것을 확인할 수 있으며, 모든 세포주에서 S 세포에서의 aTAT1의 발현 정도가 P 세포에 비교하여 현저하게 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
이를 통하여 치료가 상대적으로 어려운 암 줄기세포 유사 특징을 가지는 세포에서 aTAT1의 유전자의 발현이 높은 것은 내성 진단의 마커로 활용될 수 있음을 시사한다.
실시예 3: OXPHOS 억제제 약물 저항성(약물 내성) 마커로서의 MEC17(aTAT1) 발현 확인
아세틸화 단백질과 관련된 MEC17(aTAT1)의 유전자 발현과 OXPHOS 억제제인 로테논(Rotenone) 또는 IM156 약물로 인한 환자 예후의 상관관계를 확인하기 위하여 로테논과 IM156의 각 약물을 감수성이 있는 세포주(PSK4)와 감수성이 없는 내성 세포주(SSK4)에 처리하고, 동량의 세포에서 유전자 발현량의 변화를 분석하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었으며, 이를 보다 명확히 비교하기 위하여 ImageJ를 활용하여 상기 결과를 약물 처리 전 aTAT1 발현량을 기준으로 정량화(fold change)하여 도 3 및 표 1에 나타내었다.
aTAT1
발현 변화량 		약물 처리 전 로테논(Rotenone) 약물 IM156 약물
PSK4 1.0 0.9375 1.0100
SSK4 1.0 1.5199 1.6454
도 2 및 도 3과 표 1에서 보는 바와 같이, 내성 세포주인 SSK4 세포에서의 MEC17 유전자의 발현이 약물 처리 후 50% 이상 확연하게 증가하였고, 약물 감수성 세포주인 PSK4 세포에서 MEC17 유전자의 발현이 비슷한 수준으로 나타나거나 로테논 약물의 경우 되레 감소하는 경향을 띠는 것을 확인하였다. 이는 MEC17(aTAT1) 유전자의 발현이 증가되는 경우에 상기 약물의 치료 반응성이 낮아 이후 환자의 예후가 좋지 않게 나타날 수 있음을 의미한다.
이러한 결과를 종합할 때, MEC17 유전자의 발현량을 통하여 OXPHOS 억제제 내성 세포주를 선별할 수 있을 것이고, 상기 약물 치료 후의 MEC17(aTAT1) 발현량이 대조군에 비하여 높게 나타난 경우 해당 약물에 내성이 생긴 것으로 볼 수 있고 이는 해당 약물에 대한 예후가 좋지 않을 것을 예측할 수 있다. 따라서, 약물 처리 전 또는 약물 처리 후 반응성에 대한 정확한 예측을 통해 환자의 선제적 선별이 가능할 것으로 기대된다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 암 환자의 OXPHOS 억제제에 대한 내성 여부를 보다 용이하고 정확하게 진단할 수 있고, 이를 통하여 향후 치료 계획에 적절한 대체 항암제를 사용할 수 있도록 정확한 기초 정보를 제공함으로써 맞춤형 정밀 의료 분야에 널리 활용될 수 있다.

Claims (19)

  1. MEC17(alpha Tubulin Acetyltransferase 1; aTAT1) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 약제 내성 진단용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA (peptide nucleic acid) 및 앱타머 (aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상을 포함하는, 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상을 포함하는, 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 약제는 OXPHOS(Oxidative Phosphorylation) 억제제인, 조성물.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 OXPHOS 억제제는 유비퀴논 환원 활성 억제제, 미토콘드리아 전자 수송 사슬Ⅰ 억제제 및 철 킬레이터로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 조성물.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 유비퀴논 환원 활성 억제제는 IACS-010759인, 조성물.
  7. 제 5항에 있어서,
    상기 미토콘드리아 전자 수송 사슬Ⅰ 억제제는 IM156, 메트포민(Metformin) 및 로테논(Rotenone)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인, 조성물.
  8. 제 5항에 있어서,
    상기 철 킬레이터는 VLX 600인, 조성물.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 약제는 갑상선암, 부갑상선암, 위암, 난소암, 대장암, 췌장암, 간암, 유방암, 자궁경부암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 암을 치료하기 위한 용도로 사용되는 것인, 조성물.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 약제 내성 진단용 키트.
  11. 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 MEC17(alpha Tubulin Acetyltransferase 1; aTAT1) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 약제 내성 진단을 위한 정보 제공 방법.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 생물학적 시료에서 측정된 MEC17 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 대조군에 비하여 높을 경우, 상기 목적하는 개체에 약제 내성이 발생하였거나 발생할 가능성이 높은 것으로 예측하는 것인, 방법.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 약제는 OXPHOS(Oxidative Phosphorylation) 억제제인, 방법.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 OXPHOS 억제제는 유비퀴논 환원 활성 억제제, 미토콘드리아 전자 수송 사슬Ⅰ 억제제 및 철 킬레이터로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 방법.
  15. 제 11항에 있어서,
    상기 약제는 갑상선암, 부갑상선암, 위암, 난소암, 대장암, 췌장암, 간암, 유방암, 자궁경부암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 암을 치료하기 위한 용도로 사용되는 것인, 방법.
  16. 인-비트로(in vitro)에서 MEC17(alpha Tubulin Acetyltransferase 1; aTAT1) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 발현하는 암 세포 또는 암 조직에 대하여 후보 물질을 처리하는 단계; 및
    상기 후보 물질의 처리 후 상기 암 세포 또는 암 조직에 대하여 MEC17 단백질의 활성 또는 발현 수준을 측정하거나 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 약제 내성 치료용 약물의 스크리닝 방법.
  17. 제 16항에 있어서,
    상기 후보 물질의 처리 후 측정된 MEC17 단백질의 활성 또는 발현 수준이 감소하거나, 혹은 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준이 감소한 경우, 상기 후보 물질을 약제의 내성 치료용 약물로 판별하는 단계를 더 포함하는, 스크리닝 방법.
  18. 제 16항에 있어서,
    상기 약제는 OXPHOS(Oxidative Phosphorylation) 억제제인, 스크리닝 방법.
  19. 제 16항에 있어서,
    상기 약제는 갑상선암, 부갑상선암, 위암, 난소암, 대장암, 췌장암, 간암, 유방암, 자궁경부암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 암을 치료하기 위한 용도로 사용되는 것인, 스크리닝 방법.
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