KR20230143958A - 면역항암치료에 대한 치료 반응성 예측용 바이오마커 및 이를 이용하는 방법 - Google Patents

면역항암치료에 대한 치료 반응성 예측용 바이오마커 및 이를 이용하는 방법 Download PDF

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김재환
표경호
허용민
장은지
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연세대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은, PD-(L)1 및 TGF-beta 면역항암제의 병용치료의 암 면역 치료 반응성 또는 예후 예측용 바이오마커에 대한 것으로, 본 발명의 바이오마커를 이용할 경우 병용치료시 치료반응율이 높은 환자의 선별이 가능하므로, 병용치료 의 효과가 높을 것으로 예측되는 환자군에의 맞춤형 치료가 가능하다.

Description

면역항암치료에 대한 치료 반응성 예측용 바이오마커 및 이를 이용하는 방법{Biomarkers for predicting the response of cancer immunotherapy and method using the same}
본 발명은, 면역항암치료에 대한 치료 반응성 예측용 바이오마커 및 이를 이용하는 방법에 관한 것이다.
면역관문 억제제 (immune checkpoint inhibitor)는 면역 활성 억제에 관여하는 면역 체크포인트 단백질 (immune checkpoint protein) 활성을 차단함으로써 면역 세포(특히 면역 독성 T 세포, cytotoxic T cells)의 활성을 유지시켜 암 세포의 사멸을 유도하는 약제를 말한다. PD-L1은 종양 세포에서 발현하는 대표적인 면역관문 단백질이다. 종양세포와 T 세포의 상호작용 과정에서 PD-L1/PD-1 결합이 이뤄지면 T 세포의 활성을 억제하는 신호전달계가 활성화되고 결국 T cell의 세포독성 활성은 줄어들고, 결합이 지속/반복되면 결국 T 세포는 세포 독성 능력을 상실하게 된다. PD-1 (또는 PD-L1) 억제제는 T 세포의 PD-1 수용체(또는 종양세포에 발현된 PD-L1)에 결합하여 암 세포의 면역 회피 기능을 억제함으로서 결과적으로 면역독성 T 세포의 활성이 유지된다. 중화항체 형태로 만들어지는 PD-(L)1 억제제는 종양 주변에 존재하는 암세포 특이적 T 림프구의 기능을 증진시켜 암세포를 살상케 하는 치료제로 사용되고 있다. 이러한 면역 항암제는 기존의 항암약물치료에 비해 상대적으로 다양한 암종에 사용 가능하며, 반응기간이 상당히 오래 지속되고, 현저히 낮은 부작용을 보여주는 효과적인 방법으로 잘 알려져 있다.
PD-(L)1 기반 면역 항암제는 획기적인 치료제임에는 분명하나 평균 치료 반응율이 약 20%정도로 낮아 임상적인 한계를 보이고 있다. 따라서 PD-(L)1 기반 면역 항암제의 한계를 극복하기 위해 다양한 병용치료 요법 (방사선 치료, 표적 치료제, 면역항암 치료와 병용) 개발이 요구되고 있다.
TGF-beta (Transforming growth factor-β는 림프구, 자연살해세포 (NK cell), 수지상세포 (dendritic cell) 등 면역세포의 성장, 분화 및 생존을 조절하여 면역 항상성 (homeostatsis) 유지에 매우 중요한 사이토카인이다. 그러나 종양미세환경에서 TGF-beta의 증가는 세포독성 T 세포, NK 세포, 수지상 (dendritic) 세포의 기능 억제를 유도하고, 염증 억제에 중요한 regulatory T 세포 (Treg 세포)의 활성은 항진시키는 효과를 가져와 결과적으로 암세포의 면역 회피 (immune evasion)가 일어난다. 특히, TGF-beta 시그널 활성화는 상피간엽이행 (epithelial-mesenchymal transition)을 촉진하여 나쁜 예후와 관련이 깊으며, PD-(L)1 면역 항암제에 저항성에도 관여하는 것으로 알려져 있다. 최근 유럽 Immuno-Oncology Congress에서 방광암 환자에서 PD-L1 억제 단일클론 항체 테센트릭 (Tecenriq)에 대한 저항성 기전으로 TGF-beta의 과발현이 보고된 바 있다. TGF-beta가 과발현되어 있는 종양에서는 T 림프구의 종양내 침윤이 적으나, TGF-beta 억제제를 PD-L1 억제제와 병용하여 치료할 경우 T 세포의 침윤이 증가함이 보고되었다. 또한, 방광암 이외에도, 악성 흑색종, 위암, 대장암, 폐암 등 다양한 고형암에서 TGF-beta 또는 연관된 시그널 (Mesenchymal transition, cell adhesion, ECM remodeling, angiogenesis, wound healing) 의 과발현은 불량한 예후와 PD-(L)1 면역 항암제에 대한 저항성과 관련이 보고 되었다.
앞서 설명된 발명의 배경이 되는 기술은 본 발명에 대한 이해를 보다 용이하게 하기 위해 작성되었다. 발명의 배경이 되는 기술에 기재된 사항들이 선행기술로 존재한다고 인정하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
본 발명의 발명자들은 PD-(L)1 면역항암제가 획기적인 치료법임에도 불구하고 평균 치료 반응율이 약 20% 로 낮아 임상적인 한계가 있다는 문제점을 인지하였다.
이에, 본 발명의 발명자들은, PD-(L)1 면역항암제의 치료 반응율을 높이기 위해 PD-(L)1 면역항암제의 저항성에도 관여하는 TGF-beta 면역항암제와 병용치료를 하는 경우 치료 반응율을 높일 수 있다는 점에 주목하였다.
특히, 본 발명의 발명자들은 PD-(L)1 면역항암제와 TGF-beta 면역항암제의 병용치료시 반응율이 높을 것으로 예측되는 환자군을 선별하는 것에 대한 중요성을 인지할 수 있었다.
그 결과, 본 발명의 발명자들은 인간의 면역세포를 갖는 인간화마우스(humanized mouse)에 환자 유래 종양을 이식한 모델을 대상으로 약물치료를 진행하고 치료 반응군과 비반응군의 종양 및 혈액을 분석(omic analysis) 하여 새로운 병용치료 예측 바이오마커를 이용하여 병용치료의 치료 반응율이 높을 것으로 예측되는 환자군 선별이 가능함을 확인할 수 있었다.
결과적으로, 본 발명의 발명자들은, 본 발명의 PD-(L)1 면역항암제와 TGF-beta 면역항암제의 병용치료의 치료반응율에 대한 통합형 바이오마커를 개발하기에 이르렀다.
이에, 본 발명의 발명자들은 본 발명의 통합형 바이오마커의 도입으로 종래의 진단 및 정보 제공 시스템이 갖는 한계들의 보완이 가능하며 이에 따른 효율적인 치료 방법 제시가 가능함을 인지할 수 있었다.
이에, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 본 발명의 통합형 바이오 마커를 통한 면역항암치료에 대한 치료 반응성 예측용 바이오 마커 및 이를 이용하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 과제들은 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
전술한 바와 같은 과제를 해결하기 위하여 본 발명의 일 실시예에 따른 암 면역 치료 반응성 또는 예후 예측용 바이오마커를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 바이오마커는 NCAM1((neural cell adhesion molecule 1) transcript variant 1 (NCBI ID:　NM_000615.7)), VIM((vimentin) (NCBI ID: NM_003380.5)) 및 POSTN ((periostin) isoform 1 (NCBI ID:　NM_006475.3)) 의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 본 발명의 일 실시예에서 상기 바이오마커는 MAGEC2 ((Homo sapiens　MAGE family member C2)(NCBI ID:　NM_016249.4)), MPPED2((metallophosphoesterase domain containing 2) transcript variant 1 (NCBI ID:　NM_001584.3)), FGF2 ((fibroblast growth factor 2)transcript variant 1a (NCBI ID:　NM_002006.6)) 및 HMOX1((heme oxygenase 1)(NCBI ID:　NM_002133.3)) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 더 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 본 발명의 일 실시예에서 상기 바이오마커는 CCND2((cyclin D2) (NCBI ID:　NM_001759.4)), FBLN2((fibulin 2) transcript variant 1 (NCBI ID:　NM_001004019.2)), REEP2((receptor accessory protein 2) transcript variant 1 (NCBI ID: NM_001271803.2)) 및 ITGA5((integrin subunit alpha 5) (NCBI ID: NM_002205.5)) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 더 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 본 발명의 일 실시예에서 상기 바이오마커는 INHBA((inhibin beta A chain preproprotein) (NCBI ID: NM_002192.4), ADAMTS2((ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif 2) transcript variant 1 (NCBI ID: NM_014244.5)), ANGPTL2((angiopoietin like 2)(NCBI ID: NM_012098.3)), ASPN((asporin)(NCBI ID: NM_017680.6), CDK6(cyclin dependent kinase 6)(NCBI ID: NM_001259.8)), COL1A2((collagen type I alpha 2 chain)(NCBI ID: NM_000089.4)), COL3A1((collagen type I alpha 3 chain)(NCBI ID: NM_000090.4)), CSPG4((chondroitin sulfate proteoglycan 4)(NCBI ID: NM_001897.5)), CXCL14((C-X-C motif chemokine ligand 14)(NCBI ID: NM_004887.5)), FABP7((fatty acid binding protein) transcript variant 1 (NCBI ID: NM_001446.5), FGF19((fibroblast growth factor 19) (NCBI ID: NM_005117.3)), IL-11((interleukin-11) (NCBI ID: NM_000641.4)), LGALS1((galectin 1)(NCBI ID: NM_002305.4)), LTBP4((latent transforming growth factor beta binding protein 4) transcript variant 1(NCBI ID: NM_001042544.1)), MMP2((matrix metallopeptidase 2) transcript variant 1(NCBI ID: 　NM_004530.6)), PDGFRA((platelet derived growth factor receptor alpha) transcript variant 1(NCBI ID: NM_006206.6)), SULF1((sulfatase 1) transcript variant 1(NCBI ID: NM_001128205.2)) 및 TGFB2((transforming growth factor beta 2) transcript variant 1(NCBI ID: NM_001135599.4)) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 더 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 암 면역 치료는 PD-(L)1 면역항암제와 TGF-beta 면역항암제의 병용치료를 의미할 수 있다.
보다 구체적으로 상기 암 면역 치료는 PD-1 발현 억제제, PD-L1 발현 억제제, 항 PD-1 항체, 및 항 PD-L1 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 면역관문 억제제 및 TGF beta 억제제를 이용한 병용치료를 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 암은 유방암, 자궁암, 식도암, 위암, 뇌암, 직장암, 대장암, 폐암, 피부암, 난소암, 자궁경부 암, 신장암, 혈액암, 췌장암, 전립선암, 고환암, 후두암, 구강암, 두경부암, 갑상선암, 간암, 방광암, 골육종, 림프종, 백혈병 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 암일 수 있고, 바람직하게는 폐암일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 의하면, 본 발명은 NCAM1, VIM 및 POSTN 의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 암 면역 치료 반응성 또는 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 NCAM1, VIM 및 POSTN 의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 NCAM1, VIM 및 POSTN 의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머 (aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 NCAM1, VIM 및 POSTN 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 CCR7, CD45RA 또는 TIGIT 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 일 실시예에서 상기 암 면역 치료 반응성 또는 예후 예측용 조성물은 MAGEC2, MPPED2, FGF2 및 HMOX1 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 더 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 MAGEC2, MPPED2, FGF2 및 HMOX1 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 MAGEC2, MPPED2, FGF2 및 HMOX1 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머 (aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 MAGEC2, MPPED2, FGF2 및 HMOX1 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 MAGEC2, MPPED2, FGF2 및 HMOX1 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 일 실시예에서 상기 암 면역 치료 반응성 또는 예후 예측용 조성물은 CCND2, FBLN2, REEP2 및 ITGA5 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 더 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 CCND2, FBLN2, REEP2 및 ITGA5 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 CCND2, FBLN2, REEP2 및 ITGA5 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머 (aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 CCND2, FBLN2, REEP2 및 ITGA5 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 CCND2, FBLN2, REEP2 및 ITGA5 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 일 실시예에서 상기 암 면역 치료 반응성 또는 예후 예측용 조성물은 INHBA, ADAMTS2, ANGPTL2, ASPN, CDK6, COL1A2, COL3A1, CSPG4, CXCL14, FABP7, FGF19, IL-11, LGALS1, LTBP4, MMP2, PDGFRA, SULF1 및 TGFB2 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 더 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 INHBA, ADAMTS2, ANGPTL2, ASPN, CDK6, COL1A2, COL3A1, CSPG4, CXCL14, FABP7, FGF19, IL-11, LGALS1, LTBP4, MMP2, PDGFRA, SULF1 및 TGFB2 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 INHBA, ADAMTS2, ANGPTL2, ASPN, CDK6, COL1A2, COL3A1, CSPG4, CXCL14, FABP7, FGF19, IL-11, LGALS1, LTBP4, MMP2, PDGFRA, SULF1 및 TGFB2 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머 (aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 INHBA, ADAMTS2, ANGPTL2, ASPN, CDK6, COL1A2, COL3A1, CSPG4, CXCL14, FABP7, FGF19, IL-11, LGALS1, LTBP4, MMP2, PDGFRA, SULF1 및 TGFB2 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 INHBA, ADAMTS2, ANGPTL2, ASPN, CDK6, COL1A2, COL3A1, CSPG4, CXCL14, FABP7, FGF19, IL-11, LGALS1, LTBP4, MMP2, PDGFRA, SULF1 및 TGFB2 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 의하면, 본 발명은 NCAM1, VIM, POSTN, MAGEC2, MPPED2, FGF2, HMOX1, CCND2, FBLN2, REEP2, ITGA5, INHBA, ADAMTS2, ANGPTL2, ASPN, CDK6, COL1A2, COL3A1, CSPG4, CXCL14, FABP7, FGF19, IL-11, LGALS1, LTBP4, MMP2, PDGFRA, SULF1 및 TGFB2 의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 암 면역 치료 반응성 또는 예후 예측용 조성물을 포함하는 암 환자의 면역 치료 후 예후 예측용 키트를 제공한다.
본 발명에서 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있다.
본 발명의 상기 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에서 상기 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 더 포함할 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 단백질을 코딩하는 유전자에 대해 특이적인 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 상기 유전자의 핵산 서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오티드로써, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp의 길이를 가질 수 있다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적 절한 용기, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역 전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 예후 예측용 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표지 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 예후 예측용 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대해 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백 질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 예후 예측용 키트에서 항원-항체 결합반응을 위한 고정체로는 니트로셀룰로오즈 막, PVDF 막, 폴리비닐(polyvinyl) 수지 또는 폴리스티렌(polystyrene) 수지로 합성된 웰 플레이트(Well plate), 유리로 된 슬라이 드 글래스 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 예후 예측용 키트에서 2차 항체의 표지체는 발색 반응을 하는 통상의 발색제가 바람직하며, HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(coloid gold), 공개특허 10-2021-0050278 - 11 - FITC(폴리 L-라이신-플루오르세인 아이소티오시아네이트), RITC(로다민-B-아이소티오시아네이트) 등의 형광물질 (fluorescein) 및 색소(dye) 등의 표지체가 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 예후 예측용 키트에서 발색을 유도하기 위한 발색 기질은 발색 반응을 하는 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, TMB(3,3',5,5'-테트라메틸 베지딘), ABTS[2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)], OPD(o-페닐렌다이아민) 등을 사용할 수 있다. 이때, 발색 기질은 완충 용액(0.1 M NaAc, pH 5.5)에 용해된 상태로 제공되는 것이 더욱 바람직하다. TMB와 같은 발색기질은 이차 항체 접합체의 표지체로 사용된 HRP에 의해 분해되어 발색 침적체를 생성하고, 이 발색 침적체의 침적 정도를 육안으로 확인함으로써 상기 마커 단백질들의 존재 유무를 검출한다.
본 발명의 예후 예측용 키트에서 세척액은 인산염 완충 용액, NaCl 및 트윈 20(Tween 20)을 포함하는 것이 바람 직하며, 0.02 M 인산염 완충용액, 0.13 M NaCl, 및 0.05% 트윈 20으로 구성된 완충 용액(PBST)이 더욱 바람직하다. 세척액은 항원-항체 결합 반응 후 항원-항체 결합체에 2차 항체를 반응시킨 다음 적당량을 고정체에 첨가하여 3 내지 6회 세척한다. 반응 정지 용액은 황산 용액(H2SO4)이 바람직하게 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 의하면, 본 발명은 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 NCAM1, VIM 및 POSTN 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 암 면역 치료 반응성 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
이때, 본 발명에서 상기 암 면역 치료 반응성 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법은 NCAM1, VIM 및 POSTN 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계 이후, 상기 측정된 NCAM1, VIM 및 POSTN 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준이 대조군에 비하여 증가한 경우, 암 면역 치료시 치료반응율이 높을 것으로 예측하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 다른 실시예에서 상기 NCAM1, VIM 및 POSTN 으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계는,
MAGEC2, MPPED2, FGF2 및 HMOX1 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
이때, 상기 MAGEC2, MPPED2, FGF2 및 HMOX1 으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계 이후,
상기 측정된 MAGEC2, MPPED2, FGF2 및 HMOX1 으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준이 대조군에 비하여 감소한 경우, 암 면역 치료시 치료반응율이 높을 것으로 예측하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에서 상기 NCAM1, VIM 및 POSTN 으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계는,
CCND2, FBLN2, REEP2 및 ITGA5 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 어느 하나 이상의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
이때, 상기 CCND2, FBLN2, REEP2 및 ITGA5 으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계 이후,
상기 측정된 CCND2, FBLN2, REEP2 및 ITGA5 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 어느 하나 이상의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준이 대조군에 비하여 증가한 경우, 암 면역 치료시 치료반응율이 높을 것으로 예측하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머 (aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 단백질의 발현 수준의 측정은 단백질 칩 분석, 면역 측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역 분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 또는 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay)에 의해 수행될 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 단백질의 발현 수준의 측정은 다중 반응 모니터링 (multiple reaction monitoring; MRM) 방법에 의할 수 있다.
본 발명에서 상기 다중 반응 모니터링 방법 시 내부 표준 물질은 타깃 펩타이드를 구성하는 특정 아미노산을 동 위원소로 치환한 합성 펩타이드 또는 대장균 베타 갈락토시다아제를 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준의 측정은 역전사 중합효소반 응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RTPCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩에 의할 수 있다.
본 발명에서 상기 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 상기 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 대조군에 비하여 증가하거나 감소한 경우, 상기 암 면역 치료 후의 예후가 나쁠 것으로 예측할 수 있다.
본 발명에서 상기 정보 제공 방법은 목적하는 개체의 면역 치료에 대한 반응성을 예측하는 것일 수 있다.
구체적으로 상기 개체의 면역 치료에 대한 반응성은 암 면역 치료에 대한 것으로, PD-1 발현 억제제, PD-L1 발현 억제제, 항 PD-1 항체, 및 항 PD-L1 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 면역관문 억제제 및 TGF beta 억제제를 이용한 병용치료를 의미할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
기타 실시예의 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다.
본 발명은, PD-(L)1 면역항암제와 TGF-beta 면역항암제의 병용치료의 치료반응율에 대한 통합형 바이오마커를 제공할 수 있다.
특히, 본 발명은 PD-(L)1 면역항암제와 TGF-beta 면역항암제의 병용치료의 치료반응율에 대한 통합형 바이오마커를 제공함으로서, PD-(L)1 면역항암제와 TGF-beta 의 병용치료시 반응율이 높을 것으로 예측되는 환자군을 선별할 수 있다.
즉, 본 발명은 발명은 PD-(L)1 면역항암제와 TGF-beta 면역항암제의 병용치료의 치료반응율에 대한 통합형 바이오마커를 활용함으로써, 개개인에 대한 치료 방향의 설정이 보다 정용하게 수행될 수 있고, 맞춤형 치료방법 선정에 기여할 수 있다.
또한 본 발명은 발명은 PD-(L)1 면역항암제와 TGF-beta 면역항암제의 병용치료의 치료반응율에 대한 통합형 바이오마커를 활용함으로써 병용치료시 반응율이 높을 것으로 예상되는 환자군 선별을 가능케 하여 기존의 PD-(L)1 면역항암제가 가지는 치료 반응율이 낮다는 한계들의 보완이 가능하다.
본 발명에 따른 효과는 이상에서 예시된 내용에 의해 제한되지 않으며, 더욱 다양한 효과들이 본 명세서 내에 포함되어 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 인간화마우스 PDX 모델 구축 및 PD-(L)1 억제제와 TGF-beta 억제제 병용처리 반응군 선별과정을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 인간화마우스 PDX모델 종양억제 실험을 통한 종양 크기 변화를 추적 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 병용치료 반응군 예측을 위한 전사체 바이오마커 발굴 과정 흐름도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 Differential gene expressions (DEGs)을 확인하기 위한 volcano plot 을 도시한 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 선정된 8종의 ROC curve를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 Multiplex RNA kit의 OR, AUC, cut-off 데이터를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 종양 내 면역세포 바이오마커 분석 및 발굴 흐름도를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 종양 면역세포 바이오마커 분석 대상 리스트를 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 종양 침윤 면역세포 중 lymphocyte의 침윤비율 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 종양 내 cytotoxic T cell 활성 분석을 위한 flow-cytometry를 이용한 cell population 구분 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 종양 내 T lymphocyte의 활성 비교분석(student t-Test; *, p<0.0001) 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따라 선정된 종양 면역세포 바이오마커들의 ROC curve 를 나타낸 도이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 전사체와 면역세포 두가지 통합형 바이오마커의 OR, AUC, cut-off 데이터를 나타낸 도이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 도면의 설명과 관련하여, 유사한 구성요소에 대해서는 유사한 참조부호가 사용될 수 있다.
본 문서에서, "가진다," "가질 수 있다," "포함한다," 또는 "포함할 수 있다" 등의 표현은 해당 특징(예: 수치, 기능, 동작, 또는 부품 등의 구성요소)의 존재를 가리키며, 추가적인 특징의 존재를 배제하지 않는다.
본 문서에서, "A 또는 B," "A 또는/및 B 중 적어도 하나," 또는 "A 또는/및 B 중 하나 또는 그 이상" 등의 표현은 함께 나열된 항목들의 모든 가능한 조합을 포함할 수 있다. 예를 들면, "A 또는 B," "A 및 B 중 적어도 하나," 또는 "A 또는 B 중 적어도 하나"는, (1) 적어도 하나의 A를 포함, (2) 적어도 하나의 B를 포함, 또는(3) 적어도 하나의 A 및 적어도 하나의 B 모두를 포함하는 경우를 모두 지칭할 수 있다.
본 문서에서 사용된 "제1," "제2," "첫째," 또는 "둘째," 등의 표현들은 다양한 구성요소들을, 순서 및/또는 중요도에 상관없이 수식할 수 있고, 한 구성요소를 다른 구성요소와 구분하기 위해 사용될 뿐 해당 구성요소들을 한정하지 않는다. 예를 들면, 제1 사용자 기기와 제2 사용자 기기는, 순서 또는 중요도와 무관하게, 서로 다른 사용자 기기를 나타낼 수 있다. 예를 들면, 본 문서에 기재된 권리범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 바꾸어 명명될 수 있다.
본 문서에서 사용된 용어들은 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 다른 실시예의 범위를 한정하려는 의도가 아닐 수 있다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함할 수 있다. 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 용어들은 본 문서에 기재된 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가질 수 있다. 본 문서에 사용된 용어들 중 일반적인 사전에 정의된 용어들은, 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 동일 또는 유사한 의미로 해석될 수 있으며, 본 문서에서 명백하게 정의되지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다. 경우에 따라서, 본 문서에서 정의된 용어일지라도 본 문서의 실시 예들을 배제하도록 해석될 수 없다.
본 발명의 여러 실시예들의 각각 특징들이 부분적으로 또는 전체적으로 서로 결합 또는 조합 가능하며, 당업자가 충분히 이해할 수 있듯이 기술적으로 다양한 연동 및 구동이 가능하며, 각 실시예들이 서로에 대하여 독립적으로 실시 가능할 수도 있고 연관 관계로 함께 실시 가능할 수도 있다.
본 명세서의 해석의 명확함을 위해, 이하에서는 본 명세서에서 사용되는 용어들을 정의하기로 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "개체"는 PD-(L)1 면역항암제와 TGF-beta 의 병용치료의 치료반응율을 예측하고자 하는 모든 대상을 의미할 수 있다. 예를 들어 개체는, 암이 발생한 개체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "생물학적 시료"는, 개체로부터 얻어지거나 개체로부터 유래된 임의의 물질, 생물학적 체액, 조 직 또는 세포를 의미하는 것으로, 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물 (tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 복수(ascites), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액 (lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물 (cell extract) 및 뇌척수액(cerebrospinal fluid) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게 생물학적 시료는 개체로부터 분리된 PD-(L)1 면역항암제와 TGF-beta 의 병용치료의 치료반응율을 예측하고자 하는 조직 또는 혈액 샘플일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "암의 면역 치료제"와 "면역 항암제(cancer immunotherapy)"는 혼용하여 사용될 수 있으며, 이는 억제되어 있던 체내 면역 세포를 활성화시켜 암세포를 사멸시키는 새로운 기전을 갖고 있는 항암제에 해당한다. 상기 면역 항암제는 환자 스스로의 면역 강화를 통해 치료를 한다는 점에서 부작용이 적으며, 암 환자의 삶의 질을 높이고 생존 기간도 대폭 연장되는 효과를 가지고 있다. 면역 항암제는 면역 체계의 특이성(specificity), 기억 능력(memory), 적응력(adaptiveness)을 증강시킴으로써 항암 효과를 나타낸다. 즉 인체의 면역 시스템을 이용하여 정확하게 암 세포만 공격해 부작용이 적고 면역 시스템의 기억 능력과 적응력을 이용하기 때문에 면역 항암제에 효과가 있는 환자는 지속적인 항암 효과를 볼 수 있다. 이처럼, 면역 항암제는 1세대 화학 항암제의 부작용과 2세대 표적 항암제의 내성을 개선하였고, 장기간 효과 지속(durable response), 장기 생존 가능(longterm survival), 폭넓은 항암 효과(broad anti-tumor activity) 및 낮은 부작용(low toxicity profile) 등을 특징으로 한다. 면역 항암제는 크게 수동 면역과 능동 면역 치료로 구분되며, 수동 면역 치료에는 면역관문 억제제(immune checkpoint inhibitor)와 면역 세포 치료제(immune cell therapy), 치료용 항체 등이 있다. 능동 면역 치료에는 암 치료 백신, 면역 조절제(immune-modulation agents) 등이 있다.
본 명세서에서 사용되는, "PD-(L)1 면역항암제와 TGF-beta 면역항암제”는 미국 FDA 또는 한국 FDA에서 승인되어 임상에서 사용될 수 있는 PD-(L)1 면역항암제와 TGF-beta 면역항암제라면 모두 포함될 수 있고, 예를 들면, 폐암에서 사용되는 PD-1/PD-L1 억제제와 TGF-beta 억제제가 포함될 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 PD-1/PD-L1 억제제와 TGF-beta 억제제로서 vactosertib (Medpacto 개발), durvalumab (상품명 Imfinzi, Medimmune과 AstraZeneca 개발), 또는 bintrafusp alfa (또는 M7824, Merck 개발)를 이용하였다. Vactosertib은 단일 저분자 화합물로 구성된 TGF-beta 1형 수용체 억제제로 TGF-beta가 세포의 수용체와 결합하였을 때 세포 내 신호전달을 차단하는 기능을 가지며, 현재 항암제로서 임상 개발중이다. Durvalumab (상품명은 Imfinzi)는 FDA 승인 면역항암제(human immunoglobulin G1 kappa [IgG1 kapa] monoclonal antibody)이다. 세포 표면 PD-L1과 결합하는 기능을 가지므로 PD-L1과 PD-1의 결합을 저해할 수 있으며, 결과적으로 T 세포의 세포독성 활성을 유지할 수 있도록 하는 기전을 갖는다. Bintrafusp alfa (또는 M7824)는 면역항암제이며, 약물의 구조는 'PD-L1을 차단하는 인간 IgG1 monoclonal antibody'에 'TGF-beta receptor 2 (TGF-β의 세포 외 도메인' 영역이 결합(fusion)된 이중기능 결합 단백질(bifunctional fusion protein) 이다. 'TGF-beta receptor 2 (TGF-β의 세포 외 도메인' 단백질은 TGF-beta와 결합할 수 있는 'trap'의 기능을 가지고 있으므로 종양미세환경에서 TGF-beta의 활성을 억제하는 기능을 갖는다. 따라서 Bintrafusp alfa는 암세포가 면역계를 회피하는 데 이용하는 두 가지 면역 억제 경로를 동시에 차단하도록 설계되었다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "바이오마커"란, 체내 세포나 혈관, 단백질, DNA, RNA, 대사 물질 등을 이용하여 체내 변화를 알아낼 수 있는 생물학적 지표로, 미국 국립보건원(NIH)은 상기 바이오 마커를 정상적인 생물학적 과정, 질병 진행 상황, 치료 방법에 대한 약물의 반응성을 객관적으로 측정하고 평가할 수 있는 지표라고 정의하였다. 즉, 특정 질병이나 암의 경우 정상이나 병적인 상태를 구분할 수 있거나 치료 반응을 예측할 수 있고 이를 객관적으로 측정할 수 있는 표지자를 의미한다. 따라서 바이오마커는 정상적인 생물학적 과정, 질병 진행 상황, 치료 방법에 대한 약물의 반응성을 객관적으로 측정하고 평가할 수 있는 역할을 하여야 한다. 활용도에 따라 약물 타깃의 존재를 확인하는 타깃 마커, 병의 유무를 진단하는 진단 마커, 특정 약물에 대한 반응군과 비반응군을 구별할 수 있는 예상 마커, 약물 치료 효과를 모니터링 할 수 있는 대리 표지자 마커, 질병의 예후를 알려주는 예후 바이오 마커 등이 존재한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "치료반응율"이란, PD-(L)1 면역항암제와 TGF-beta 면역항암제의 병용치료 후 환자에서 암세포 사멸효과가 나타남에 따라 암화 진행 속도가 더뎌지고, 생존율이 높아지는 것을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "예후"란, 질병의 경과 및 사망 또는 생존의 결과를 미리 예측하는 행위를 말한다. 상기 예후 또는 예후 예측이란 질환의 경과가 환자의 생리적 또는 환경적 상태에 따라 달라질 수 있으며, 이러한 환자의 상태를 종합적으로 고려하여 치료 전/후 질병의 경과를 예측하는 모든 행위를 의미하는 것으로 해석될 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 예후는 암의 면역 치료, 바람직하게는 PD-(L)1 면역항암제와 TGF-beta 면역항암제의 병용치료 후 병용치료의 반응율이 높을 것으로 예측되는 환자를 치료전에 선별하기 위한 행위로 해석될 수 있다. 구체적으로, 예후가 나쁠 수 있음은 PD-(L)1 면역항암제와 TGF-beta 의 병용치료 이후 환자의 암화 진행 속도가 가속화되어 생존율이 낮아지고 빠른 시일 내로 사망할 가능성이 높을 수 있음을 의미한다.
본 발명은 PD-(L)1 면역항암제와 TGF-beta 면역항암제의 병용치료 전 치료반응율이 높은 환자군을 미리 예측함으로써 환자 개개인에 적합한 치료방법을 선택할 수 있게 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "종양" 또는 "암"은 세포 주기가 조절되지 않아 세포 분열을 계속하는 질병으로서, 발생 부위에 따라 암종(Carcinoma)과 육종(Sarcoma)으로 나뉜다. 암종(Carcinoma)은 점막, 피부 같은 상피성 세포에서 발생한 악성 종양을 뜻하고, 육종(Sarcoma)은 근육, 결합 조직, 뼈, 연골, 혈관 등의 비상피성 세포에서 발생한 악성 종양을 뜻한다. 상기 암은 바람직하게는 고형암으로서 방광암, 악성 흑색종, 위암, 대장암, 폐암 등 다양한 고형암을 포함 할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "항체"는 항원과 특이적으로 결합하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질을 가리킨다. 본 발명의 목적상, 항체는 상기 NCAM1, VIM 및 POSTN 각각의 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 본 발명의 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 상기 항체는 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 다클론 항체는 상기 단백질의 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 과정을 포함하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물로부터 제조될 수 있다. 또한, 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method; Kohler 및 Milstein (1976) European Journal of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리 기술(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991 참조)을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전장의 경쇄 및 2개의 전장의 중쇄를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "올리고펩타이드"는 펩타이드로 2 내지 20 개의 아미노산으로 구성되며 디 펩티드, 트리 펩티드, 테트라 펩티드 및 펜타 펩티드를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "PNA(Peptide Nucleic Acid)"는 인공적으로 합성된, DNA 또는 RNA와 비슷한 중합체를 가리키며, 1991년 덴마크 코펜하겐 대학교의 Nielsen, Egholm, Berg와 Buchardt 교수에 의해 처음으로 소개되었다. DNA는 인산-리보스당 골격을 갖는데 반해, PNA는 펩타이드 결합에 의해 연결된 반복된 N-(2-아미노에틸)-글리신 골격을 가지며, 이로 인해 DNA 또는 RNA에 대한 결합력과 안정성이 크게 증가되어 분자 생물학, 진단 분석 및 안티센스 치료법에 사용되고 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "앱타머"는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자를 의미한다.
본 발명에서 상기 NCAM1, VIM 및 POSTN 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 NCAM1, VIM 및 POSTN 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "프라이머"는 표적 유전자 서열을 인지하는 단편으로서, 정방향 및 역방향의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료 내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성이 부여될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브의 종류는 당 업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함하는 것으로, 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고 뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "LNA(Locked nucleic acids)"란, 2'-O, 4'-C 메틸렌 브릿지를 포함하는 핵산 아날로그를 의미한다. LNA 뉴클레오사이드는 DNA와 RNA의 일반적 핵산 염기를 포함하며, Watson-Crick 염기 쌍 규칙에 따라 염기 쌍을 형성할 수 있다. 하지만, 메틸렌 브릿지로 인한 분자의 'locking'으로 인해, LNA는 Watson-Crick 결합에서 이상적 형상을 형성하지 못하게 된다. LNA가 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드에 포함되면, LNA는 보다 빠르게 상보적 뉴클레오티드 사슬과 쌍을 이루어 이중 나선의 안정성을 높일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 의미한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 NCAM1, VIM 및 POSTN 단백질이나, 이들을 코딩하는 유전자의 정보는 알려져 있으므로, 당업자라면 이를 바탕으로 상기 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 용이하게 디자인할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "키트"는 바이오 마커 성분에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 항체를 검출 가능한 표지로 표지하여 바이오 마커의 발현 수준을 평가할 수 있는 도구를 말한다. 프로브 또는 항체 관련하여 검출 가능한 물질을 기질과의 반응에 의해서 직접적으로 표지하는 것뿐만 아니라, 직접적으로 표지된 다른 시약과의 반응성에 의한 발색하는 표지체가 접합된 간접적 표지도 포함한다. 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액 및 기타 다른 용액 등을 포함할 수 있으며, 사용되는 시약 성분을 포함하여 제작될 수 있다. 본 발명에서 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있으며, 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합효소, 역전사효소, DNase, RNase 억제제, 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 HPD 예후 예측용 유전자를 검출하기 위한 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 당업계에 공지되어 있는 것이라면, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "대조군"이란 면역 항암제가 투여되지 않은 대조군이거나, 암 환자의 면역 치료 후 모집단의 중앙값 (해당 환자의 평균값)일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 인간화 마우스 모델 구축 및 전사체 바이오마커 선별을 위한 분석
인간화 마우스 모델을 구축하기 위하여 암 환자군, 구체적으로는 폐암 환자군에서 암 종양 조직을 얻은 뒤 이를 마우스에 이종 인식(xeno-transplantation) 하였다.
이후 상기 마우스 모델을 이용하여 PD-L1 억제제(anti-PD-L1 monoclonal antibody, durvalumab)와 TGF-beta 억제제의 병용치료 효과군을 선별하기 위해, 각 1PDX 모델은 (1) 대조군(vehicle group, 3-4 mice), (2) PD-L1 억제제 단독치료 실험군(anti-PDL1 antibody treatment group, 3 mice), (3) PD-L1 억제제 및 TGF-beta 억제제 병용치료 실험군 (anti-PDL1 antibody and anti-TGF-beta drug combined treatment group, 3 mice) 으로 구성하여 실험을 진행하였다. 약물은 인간화 마우스 모델에 종양이 이식된 후 종양의 부피가 100 mm3이 되는 시점부터 주 2회 투여하였다.
도 1을 참조하면, 병용치료 효과를 나타내는 PDX 모델(반응군)에 대한 정의는 'anti-PD-L1 단독 치료에 대해 종양이 억제되지 않고 anti-PD-L1 및 anti-TGF-beta 병용치료에 대해서 종양이 억제되는 모델'로 설정하였다.
도 2를 참조하면 종양 크기 변화를 확인하기 위한 통계적 유의성 분석은 one-way ANOVA로 수행하였으며, 도 2a는 병용치료에 대한 실험을 진행한 결과 종양 크기가 유의미하게 변하지 않은 비반응군에 대한 결과를 나타낸 도이며, 도 2b는 병용치료에 대한 실험결과 유의미한 종양 크기 변화를 보인 반응군의 실험결과를 나타낸 도이다.
도 2b를 참조하면, PDX 인간화마우스 모델 100례 중 병용치료효과가 관찰된 모델은 총 4개 모델로서 YHIM-2004, YHIM-1015, YHIM-1053, YHIM-1040 로 확인되었다.
이후 PD-L1 과 TGF beta 병용치료 반응군을 예측하는 바이오마커를 찾기 위해 병용치료 반응군과 비반응군의 '치료 전 종양'에 해당되는 '대조군의 종양'에 대해 비교분석을 진행하였다.
실시예 2 : 머신러닝 및 TBRs (Targetable TGF-beta signal gene) 교집합을 이용한 최종 전사체 바이오마커 선별
종양 미세환경에서 전사체 (transcriptome, mRNA) 의 발현 정도를 비교 분석하는 것은 종양미세환경의 변화 및 차이를 기능적으로 추적할 수 있는 수 많은 단서를 제공하기 때문에 바이오마커 발굴 측면에서 매우 중요하다.
도 3을 참조하면 상기 실시예 1과 같이 얻어진 종양에 대한 RNA 서열분석(RNAseq) 후 일차적으로 differential expression gene (DEGs)를 실시하여 이를 토대로 반응군의 특이 유전자를 1차 분류 (1st selection) 하였다.
구체적으로, 도 4를 참조하면 TGF-beta 억제제는 두 종류(vactosertib 또는 bintrafusp alfa)를 사용하였고 각 약물을 이용한 PD-L1 억제제와의 병용치료를 통해 반응군을 예측하기 위한 유전자 후보군을 추출하였다. 전체 전사체 (transcriptome) 중 병용치료 반응군에서 발현이 증가 또는 감소된 유전자는 log fold change (LogFC)가 1.5배 이상이며 동시에 p-value가 0.05이하를 동시에 만족하는 것으로 정하여 선별하였다.
이후, 다시 도 3을 참조하면, 상기와 같이 분류한 유전자를 논리적으로 재분류하고 의미를 부여하기 위해 'Machine Learning Interface to RNASeq Data (Mlseq) package'을 반복하여 수행하였다. 이를 설명하면 다음과 같다. MLSeq package (contains 90 microarray-based classifiers)이 포함하는 여러 알고리즘을 이용하여 각각의 치료 예측 모델을 만들며, 예측 모델을 만드는 방법은 전체 데이터 중 일부를 'training set'으로 정하여 학습시키고 나머지 데이터를 'test set (또는 validation set)'으로 정하여 데이터를 분류(classification)하는 방식을 사용한다. 각 알고리즘을 사용하여 각각의 classification 모델을 만들고, model performances를 비교하였을 때 가장 정확도(accuracy)가 높은 모델에서 selectedGenes() function으로 약물별 반응군의 significant feature genes을 도출한다. Vactosertib/durvalumab 치료의 경우 voom-based discriminant analysis classifiers (voomNSC) 알고리즘을 사용하였을 때 가장 높은 정확도(96.08%), 민감도(100%), 특이도(95.35%)를 나타내는 significant feature genes을 얻었다. bintrafusp alfa 치료의 경우에는 Poisson Linear Discriminant Analysis (PLDA) 알고리즘을 사용했을 때 가장 높은 정확도(92.05%), 민감도(66.67%), 특이도(93.9%)를 나타내는 significant feature genes을 얻었다. 그 결과, 하기 표 1과 같이 240 개의 특이 유전자를 재분류하여 2차 분류 (2nd selection) 하였다.
Machine learning 분석기법(MIseq)을 사용하여 2차로 추출된 유전자 리스트 (240 gene) ADAMTS18, ADCY8, ADGRG2, ADGRV1, ADH1C, ADH7, ANKRD30B, ARL10, BCHE, BRINP3, CACNA1E, CALN1, CBLN2, CBS, CCDC102B, CCND2, CD177, CDH18, CDH6, CEACAM7, CHI3L1, CLDN2, CNTNAP3B, COL9A3, CTSF, DAZ2, DCC, DLGAP1, DPY19L2P2, EFNB3, EPHA5, EPS8L3, ERBB4, FGF12, FGF19, FGF3, FGFBP2, FLG, FLG2, FLJ16779, FMO3, GATA4, GDF6, GPAT2, GPHB5, GSTM1, HGF, HMOX1, HNF1A, IGFBP1, IRS4, IRX4, ITGA4, KCNG3, KCNJ2, KCNMA1, KIRREL3, KLHDC8A, KLK13, KRT1, KRT77, KRTDAP, LIFR, LONRF2, LRRTM4, LTBP4, MAGEA11, MAGEC2, MAGI2-AS3, MDGA1, MGAT3, MMP16, MPPED2, MT1L, MYBPH, MYH11, NCAM1, NCAM2, NCR3LG1, NPW, NR2F1, NTF3, NTRK2, NTS, NXPH4, PCP4, PDZRN4, PINLYP, PLAC8, PLPPR3, PNMA3, PNMA8A, PNPLA5, PROC, PTDSS1, PTPRT, RARRES2, RASSF9, REEP2, RET, RHBDL3, RIPOR3, RND2, RPTN, RYR2, SBSPON, SCN9A, SELP, SEMA5B, SFMBT2, SLC13A4, SLC35G1, SLC38A3, SLC39A14, SLC47A1, SLITRK1, SMR3A, SMR3B, SOST, SPANXA2, SPANXC, SPRR4, SULT1E1, SUSD2, SV2A, SYTL5, TAFA5, TDRD12, TEX15, TGFB2, TNFRSF8, TPPP3, TRPM6, TSPAN18, TSPEAR-AS1, UGT1A7, UNC5D, VGF, VGLL2, VIL1, WIF1, ZDHHC2, ACADSB, ACAN, ACTA1, ADAMTS2, AK3, AKR1A1, ALDH1A3, ANGPTL2, ANXA6, ART3, ASPN, AXL, BCL2, CCL22, CCNA2, COL12A1, COL1A2, COL2A1, COL3A1, COL4A1, COL5A2, COL6A3, CRABP1, CSPG4, CTSV, CXCL10, CXCL14, CXCL9, DCN, DNAJA2, DPT, DSE, EN1, EXOSC8, EXT1, FABP7, FBLN2, FEZ1, FGF2, FXR2, GALK1, GBP4, GBP5, GET3, GREM1, GZMB, H2AZ1, HBB, HCK, HDAC5, HLA-G, HNRNPLL, HRH2, IL1B, IL1R2, INHBA, ITGA5, ITLN1, JAK2, LGALS1, LMX1A, LTF, MMP2, MMP9, MYB, MYH1, MYH2, MYH4, MYL9, NCAPH2, NREP, NRP2, NTRK3, OVOS2, PCBP4, PDGFRA, PI15, POSTN, POU2F3, PTGFR, RCAN1, RPSAP58, S100A7A, SAA1, SARS1, SLC1A2, STRIP1, SULF1, TLX1, TMPRSS3, TNN, TPM1, TPM2, TUBA1A, TXNL1, UBB, VIM, WLS
계속하여 도 3을 참조하면, 이후 병용치료 반응군을 대표하는 상기 240 개의 유전자에 대해 세포신호전달 분석을 진행하여 TGF-beta signal과 관련이 높은 유전자를 선별하고 이를 다시 문헌을 통해 알려진 TGF-beta signal-related gene set (4646 개)에 대입하여 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 공통유전자 29개를 추출하였다 (3rd selection).
공통유전자 MAGEC2, MPPED2, FGF2, HMOX1, CCND2, FBLN2, NCAM1, REEP2, VIM, ITGA5, INHBA, ADAMTS2, ANGPTL2, ASPN, CDK6, COL1A2, COL3A1, CSPG4, CXCL14, FABP7, FGF19, IL-11, LGALS1, LTBP4, MMP2, PDGFRA, POSTN, SULF1, TGFB2
실시예 3 : 최종 전사체 바이오마커 선별
병용치료 반응군에서 증감이 확인된 유전자 각각에 대한 반응군 예측 성능을 확인함과 동시에 이들 유전자 중 최적의 조합을 도출하기 위해 ROC 분석을 시행하였다.
도 5를 참조하면, 상기 실시예 2에서와 같이 선정된 29종의 바이오마커들의 ROC 분석으로부터, 도출된 AUC가 높은 유전자들을 다시 선별하여 NCAM1, VIM, HMOX1, FGF2, POSTN, INHBA, PDGFRA 및 TGFB2 유전자를 선별하였다.
다음으로 표 3을 참조하면, NCAM1, VIM, HMOX1, FGF2, POSTN, INHBA, PDGFRA, TGFB2에 대해 logistic regression analysis을 진행한 결과 odd ratio (OR)를 기준으로 NCAM1, VIM, POSTN, INHBA, PDGFRA가 재선별 되었으며, 마지막으로 'OR' 의 p-value 가 0.05 이하를 만족하면서, PD-L1 (TPS)의 AUC인 '0.586'보다 큰 값을 가지며, PD-L1 (TPS)의 AUC와 비교하 였을 때('p-value (~vs. PD-L1)') p-value가 작을수록 가장 반응군 예측을 정확하게 하는 바이오마커 군으로 규정하였다.
상기와 같이 바이오마커를 선별한 결과, 종양 전사체 바이오마커로서 NCAM1, VIM, POSTN이 최종 선정되었으며 동시에 반응군 예측을 위한 마커의 cut-off value 를 표 3과 같이 확보하여 cut-off value (dCq)' 보다 높은 NCAM1 및 VIM 발현을 나타냄과 동시에 'cut-off value (dCq)' 보다 낮은 POSTN 발현을 갖는 환자는 병용치료에 대해 반응할 가능성이 가장 높을 것으로 예측가능함을 확인하였다.
실시예 4 : 전사체 바이오마커의 효능 확인
상기 실시예 1 내지 3과 같이 추출된 유전자를 사용하여 유전자 발현 정도를 상대적으로 비교할 수 있는 multiplex gene array kit 을 제작하였다. 마지막으로 인간화 마우스 PDX모델 실험에서 얻어진 '모든 대조군의 RNA' 을 제작한 multiplex gene array kit으로 유전자 발현 정량값(delta Cq data)을 측정하여 각 유전자에 대해 병용치료 반응군 예측 성능을 분석하였다.
이때, 상기 유전자 발현 정도를 상대적으로 비교할 수 있는 multiplex gene array kit 는 실시예 1 내지 3에서와 같이 추출한 바이오마커, 특히 표 2의 29종의 바이오마커 검출이 가능한 키트이다. 그 결과, 도 6을 참조하면, 본 발명의 실시예 3에서와 같이 도출한 바이오마커 3종에 대한 암 면역 치료 반응성 또는 예후 예측 성능을 비교 검증한 결과 병용치료 반응군 예측율(양성 예측율)은 62.5%로 PD-L1 (TPS)의 2-30%의 두 배 이상의 결과를 보임을 확인하였다.
상기 결과를 바탕으로 본 발명의 바이오마커를 이용하는 경우, PD-(L)1 및 TGF-beta 면역항암제의 병용치료의 암 면역 치료 반응성 또는 예후 예측이 높은 정확도로 가능하므로 병영치료 반응율이 높은 환자를 미리 예측하여 병용치료 여부를 결정함으로서 환자의 기대 수명을 늘리는 것에 기여할 것으로 예상된다.
실시예 5 : 종양미세환경 면역세포 바이오마커 선별
종양세포를 사멸시키는 중추적 역할을 담당하는 cytotoxic CD8 T 세포는 종양면역체계와 환자의 치료 반응 예측 및 예후 예측에 있어 가장 중요한 요소이다.
따라서 도 7 및 도 8을 참조하면, 종양 내에 침윤된 lymphocyte의 population의 비율 그리고 이들 세포의 활성 상태에 따른 분류를 통해 다양한 종양 침윤 기반의 면역세포 바이오마커를 분석하였다.
도 9를 참조하면, 도 9의 (A)는 종양을 구성하는 모든 세포 중 면역세포 (TIL) 가 차지하는 비율이며, 도 9의 (B)는 종양을 구성하는 모든 세포 중 cytotoxic T 또는 CD4 helper T cell이 차지하는 비율, 도 9의 (C)는 종양을 구성하는 모든 세포 중 regulatory T cell (Treg)이 차지하는 비율 및 도 9의 (D) 는 종양을 구성하는 모든 세포 중 CD8+ FoxP3+ Treg 또는 CD4+ FoxP+ Treg이 차지하는 비율(student t-Test; *, p<0.05; **, p<0.001; ***, p<0.0001) 을 의미한다.
도 9에 따르면, 31개의 종양침윤 lymphocyte의 종류별 비율을 관찰한 결과 병용치료 반응군의 경우 전체 종양 내 세포(종양세포 포함, TME cells) 중 CD45+ cell이 차지하는 비율 (도 9의 (B)) 이 비반응군에 비해 유의하게 높았으며, lymphocyte population을 세분화하였을 때 반응군의 cytotoxic T cell의 비율 또한 유의하게 증가하여 바이오마커로서의 가능성이 확인되었다.
또한 도 10을 참조하면, 도 10은 종양 내 cytotoxic T cell 활성 분석을 위한 flow-cytometry를 이용한 cell population 구분에 대한 도이며, 병용치료 비반응군(A) 및 반응군(B)의 T cell 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 10에 따르면, CD4 helper T cell, regulatory T cell의 경우는 유의성이 관찰되지 않았으며 오히려 감소되는 경향이 있음을 확인하였다.
도 11을 참조하면, 이들 T cell의 활성상태에 따른 차이를 관찰하기 위해, CD45RO(PTPRC (CD45, protein tyrosine phosphatase receptor type C) transcript variant 1 (NCBI ID:　NM_002838.5)), CCR7((C-C motif chemokine receptor 7) transcript variant 1 (NCBI ID:　NM_001838.4))을 이용하여 central memory cell (CD45RO+CCR7+ T cell) 그리고 effector/memory T cell (CD45RO+CCR7- T cell) 에 대한 분석을 실시하였다.
그 결과, 도 11a 및 11b를 참조하면 반응군의 경우 cytotoxic T cell, 특히 central memory cytotoxic T cell의 비율이 현저하게 높았고, 이들 세포들은 주로 PD1+ cell 임을 확인하였다.
도 11c를 참조하면, 반응군의 effector memory cytotoxic T cell의 경우 예상과 달리 비반응군에 비해 유의하게 낮은 비율이 침윤되어 있음을 확인하였다.
도 11d, 11e 및 11f를 참조하면, CD4 helper T cell의 경우, 비반응군과 반응군의 두 치료군 사이에 유의한 차이는 없었으나, cytotoxic T cell과 다르 게 central memory type의 helper T cell은 종양 내에서 거의 관찰되지 않았고 주로 effector cell로 구성된다는 특징을 확인하였다.
이상과 같은 결과로 보아, 이는 종양 사멸에 중요한 effector memory cytotoxic T cell이 약물치료 반응군에서 더 많이 존재할 것이라는 예상과 달리, 병용치료 반응군은 전반적인 T cell 의 침윤량이 증가되어 있고, 이러한 증가는 central memory cytotoxic T cell의 증가에 기인하며, 반대로 effector memory cytotoxic T cell의 침윤은 감소되어 있음을 확인하였다.
병용치료 반응군에서 증감이 확인된 종양 내 lymphocyte 침윤비율의 반응군 예측 성능을 확인함과 동시에 최적의 예측 조합을 도출하기 위해 ROC 분석을 시행하였다.
그 결과 도 12를 참조하면, 'cytotoxic T cell of TME lymphocytes'와 'Cytotoxic effector memory T cell of total cytotoxic T cell' 두 종류의 마커가 높은 AUC를 갖는 것으로 확인되었다.
표 4를 참조하면, 이들은 모두 'OR'의 p-value 가 0.05 이하를 만족하였고, PD-L1 (TPS)의 AUC인 '0.586'보다 큰 값을 갖는 바이오마커군(반응군 예측을 위한 마커의 cut-off value 역시 확보) 으로 규정하였다.
마지막으로, 도 13을 참조하면, 본 발명의 전사체와 면역세포의 두 가지 바이오마커를 통합 적용한 경우 양성 예측율, 음성 예측율, 민감도가 각각 81.8%, 99.3%, 90.0%으로 가장 큰 수치가 확인되었고 비반응군 예측율(음성 예측율) 역시 1.4%으로 가장 낮은 수치를 보임을 확인하였다.
이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시 예들을 더욱 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 반드시 이러한 실시 예로 국한되는 것은 아니고, 본 발명의 기술사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양하게 변형 실시될 수 있다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시 예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시 예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 그러므로, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (23)

  1. NCAM1, VIM 및 POSTN 의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는,
    암 면역 치료 반응성 또는 예후 예측용 바이오마커.
  2. 제1 항에 있어서,
    상기 암 면역 치료는 PD-1 발현 억제제, PD-L1 발현 억제제, 항 PD-1 항체, 및 항 PD-L1 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 면역관문 억제제 및 TGF beta 억제제를 이용한 병용치료인 것인,
    암 면역 치료 반응성 또는 예후 예측용 바이오마커.
  3. 제1 항에 있어서,
    상기 암은 유방암, 자궁암, 식도암, 위암, 뇌암, 직장암, 대장암, 폐암, 피부암, 난소암, 자궁경부암, 신장암, 혈액암, 췌장암, 전립선암, 고환암, 후두암, 구강암, 두경부암, 갑상선암, 간암, 방광암, 골육종, 림프종, 백혈병 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 암인 것인,
    암 면역 치료 반응성 또는 예후 예측용 바이오마커.
  4. 제1 항에 있어서,
    상기 바이오마커는,
    MAGEC2, MPPED2, FGF2 및 HMOX1 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 더 포함하는 것인,
    암 면역 치료 반응성 또는 예후 예측용 바이오마커.
  5. 제1 항에 있어서,
    상기 바이오마커는,
    CCND2, FBLN2, REEP2 및 ITGA5 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 더 포함하는 것인,
    암 면역 치료 반응성 또는 예후 예측용 바이오마커.
  6. 제1 항에 있어서,
    상기 바이오마커는,
    INHBA, ADAMTS2, ANGPTL2, ASPN, CDK6, COL1A2, COL3A1, CSPG4, CXCL14, FABP7, FGF19, IL-11, LGALS1, LTBP4, MMP2, PDGFRA, SULF1 및 TGFB2 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 더 포함하는 것인,
    암 면역 치료 반응성 또는 예후 예측용 바이오마커.
  7. 제1 항에 있어서,
    상기 바이오마커는,
    세포독성 T 세포 및 세포독성 효과 기억 T 세포를 더 포함하는 것인,
    암 면역 치료 반응성 또는 예후 예측용 바이오마커.
  8. NCAM1, VIM 및 POSTN 의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는,
    암 면역 치료 반응성 또는 예후 예측용 조성물.
  9. 제8 항에 있어서,
    상기 암 면역 치료는 PD-1 발현 억제제, PD-L1 발현 억제제, 항 PD-1 항체, 및 항 PD-L1 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 면역관문 억제제 및 TGF beta 억제제를 이용한 것인,
    암 면역 치료 반응성 또는 예후 예측용 조성물.
  10. 제1 항에 있어서,
    상기 암은 유방암, 자궁암, 식도암, 위암, 뇌암, 직장암, 대장암, 폐암, 피부암, 난소암, 자궁경부암, 신장암, 혈액암, 췌장암, 전립선암, 고환암, 후두암, 구강암, 두경부암, 갑상선암, 간암, 방광암, 골육종, 림프종, 백혈병 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 암인 것인,
    암 면역 치료 반응성 또는 예후 예측용 조성물.
  11. 제8 항에 있어서,
    NCAM1, VIM 및 POSTN 의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상 기 NCAM1, VIM 및 POSTN 의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고 펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는,
    암 면역 치료 반응성 또는 예후 예측용 조성물.
  12. 제8 항에 있어서,
    NCAM1, VIM 및 POSTN 의 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 NCAM1, VIM 및 POSTN 의 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는,
    암 면역 치료 반응성 또는 예후 예측용 조성물.
  13. 제8 항에 있어서,
    MAGEC2, MPPED2, FGF2 및 HMOX1 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 더 포함하는,
    암 면역 치료 반응성 또는 예후 예측용 조성물.
  14. 제8 항에 있어서,
    CCND2, FBLN2, REEP2 및 ITGA5 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 더 포함하는,
    암 면역 치료 반응성 또는 예후 예측용 조성물.
  15. 제8 항에 있어서,
    INHBA, ADAMTS2, ANGPTL2, ASPN, CDK6, COL1A2, COL3A1, CSPG4, CXCL14, FABP7, FGF19, IL-11, LGALS1, LTBP4, MMP2, PDGFRA, SULF1 및 TGFB2 의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 더 포함하는,
    암 면역 치료 반응성 또는 예후 예측용 조성물.
  16. NCAM1, VIM, POSTN, MAGEC2, MPPED2, FGF2, HMOX1, CCND2, FBLN2, REEP2, ITGA5, INHBA, ADAMTS2, ANGPTL2, ASPN, CDK6, COL1A2, COL3A1, CSPG4, CXCL14, FABP7, FGF19, IL-11, LGALS1, LTBP4, MMP2, PDGFRA, SULF1 및 TGFB2 의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 암 면역 치료 반응성 또는 예후 예측용 조성물을 포함하는,
    암 면역 치료 반응성 또는 예후 예측용 키트.
  17. 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 NCAM1, VIM 및 POSTN 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는,
    암 면역 치료 반응성 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  18. 제17 항에 있어서,
    상기 NCAM1, VIM 및 POSTN 으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계는,
    MAGEC2, MPPED2, FGF2 및 HMOX1 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 더 포함하는,
    암 면역 치료 반응성 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  19. 제17 항에 있어서,
    상기 NCAM1, VIM 및 POSTN 으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계는,
    CCND2, FBLN2, REEP2 및 ITGA5 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 어느 하나 이상의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 더 포함하는,
    암 면역 치료 반응성 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  20. 제17 항에 있어서,
    상기 NCAM1, VIM 및 POSTN 으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계 이후,
    상기 측정된 NCAM1, VIM 및 POSTN 으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준이 대조군에 비하여 증가한 경우, 암 면역 치료시 치료반응율이 높을 것으로 예측하는 단계를 더 포함하는,
    암 면역 치료 반응성 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  21. 제18 항에 있어서,
    상기 MAGEC2, MPPED2, FGF2 및 HMOX1 으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계 이후,
    상기 측정된 MAGEC2, MPPED2, FGF2 및 HMOX1 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준이 대조군에 비하여 감소한 경우, 암 면역 치료시 치료반응율이 높을 것으로 예측하는 단계를 더 포함하는,
    암 면역 치료 반응성 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  22. 제19 항에 있어서,
    상기 CCND2, FBLN2, REEP2 및 ITGA5 으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계 이후,
    상기 측정된 CCND2, FBLN2, REEP2 및 ITGA5 으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준이 대조군에 비하여 증가한 경우, 암 면역 치료시 치료반응율이 높을 것으로 예측하는 단계를 더 포함하는,
    암 면역 치료 반응성 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  23. 제17 항에 있어서,
    상기 암 면역 치료는 PD-1 발현 억제제, PD-L1 발현 억제제, 항 PD-1 항체, 및 항 PD-L1 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 면역관문 억제제 및 TGF beta 억제제를 이용한 병용치료인 것인,
    암 면역 치료 반응성 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
KR1020230044998A 2022-04-05 2023-04-05 면역항암치료에 대한 치료 반응성 예측용 바이오마커 및 이를 이용하는 방법 KR20230143958A (ko)

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