KR102065594B1 - 항암제에 대한 저항성 예측용 바이오마커 - Google Patents

항암제에 대한 저항성 예측용 바이오마커 Download PDF

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Abstract

본 발명은 CLDN7, CRIP1, ERSP1 및 TYMP 로 이루어지는 군에서 선택된 1 종 이상의 유전자를 포함하는 항암제 저항성 예측용 마커 조성물, 상기 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 항암제 저항성 예측용 마커 조성물 및 키트, 상기 유전자의 발현 분석을 통한 항암제 저항성 진단에 대한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 CLDN7, CRIP1, ERSP1 및 TYMP 유전자는 항암제 저항성 세포주에서는 그 발현이 현저하게 감소되는 유전자로, 이를 이용하여 항암제에 대한 저항성을 효과적으로 예측할 수 있다. 또한, 본 발명의 마커를 이용하여 항암제에 효과가 나타나는 환자를 선별함으로써 효율적인 항암 치료가 가능하며, 상기 유전자를 타겟으로 하여 항암제 민감성을 높이는 약물을 개발하는데도 활용할 수 있다

Description

항암제에 대한 저항성 예측용 바이오마커 {Biomarker for predicting resistance to anticancer agent}
본 발명은 CLDN7, CRIP1, ERSP1 및 TYMP 로 이루어지는 군에서 선택된 1 종 이상의 유전자를 포함하는 항암제 저항성 예측용 마커 조성물, 상기 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 항암제 저항성 예측용 마커 조성물 및 키트, 상기 유전자의 발현 분석을 통한 항암제 저항성 진단에 대한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
의학 관련 기술이 급속도로 발전한 오늘날에 있어서도 암은 아직 완전히 인류에게 위협적인 질병 중 하나이며, 많은 사람들이 암 진단을 받고, 암 또는 그와 관련된 합병증으로 인해 사망하고 있다. 유병률에 따른 우리나라 7대 암은 위암, 간암, 폐암, 대장암, 자궁암, 유방암, 두경부암으로 알려져 있다.
현재까지 많은 항암제들이 효과적인 치료제로 사용되고 있지만 새롭게 대두되고 있는 문제점은 항암제에 대한 암세포의 내성(resistance)이다 (Tsuruo et al., 1984). 항암제에 대한 내성은 장기적인 항암제 사용으로 약물에 노출된 세포들이 약물의 세포 내 축적을 감소시키거나, 해독 작용 또는 배출을 활성화하거나, 표적이 되는 단백질을 변형시키는 등의 여러 가지 기전을 통하여 일어나게 된다. 이러한 과정은 암 치료에 가장 큰 장애 요소일 뿐만 아니라 치료의 실패와도 깊은 관련이 있다. 실제 암 환자에 화학요법을 시도할 때 어떤 항암제가 효력을 발휘하지 못하는 경우에 이후 다른 항암제에 대해서도 내성을 보이는 사례가 빈번하며, 초기 치료 시 작용기전이 다른 여러 종류의 항암제를 동시에 투여하는 복합화학요법을 시도했음에도 불구하고 치료효과가 없는 현상을 자주 관찰할 수 있다. 이로 인하여 사용 가능한 항암제의 범위가 매우 제한되는 것은 암의 화학요법에 있어서 중요한 문제점으로 지적되고 있으며, 항암제 감수성을 예측하는 것이 암환자의 치료 방향을 결정하는데 필수적인 요소로 대두되고 있다. 그러나 특정약제에 대한 생체반응 관련 요소의 복합적 작용, 치료제 및 투여방식의 다양성과 방대한 시료 확보의 어려움으로 인해, 항암제 반응성을 예측하는 데는 한계가 있다.
후성유전학(epigenetics) 또는 후생유전학은 DNA의 염기서열이 변화하지 않는 상태에서 이루어지는 유전자 발현의 조절인 후생유전적 유전자 발현 조절을 연구하는 유전학의 하위 학문이다. 이를 매개하는 분자적 수준의 이해는 아직 완벽하지 않지만, 일반적으로 CpG 염기서열 가운데 시토신 염기에 특이적으로 일어나는 DNA 메틸화와 히스톤 단백질의 변형에 의해 조절되는 두가지의 기전이 주요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 최근 원발암 유전자 또는 종양 억제 유전자와 DNA 메틸화가 관계가 있으며, 메틸화 여부에 따라 암의 발생이나 전이가 극대화 될 수 있다는 등의 보고가 있어, 메틸화와 암 발생과의 관계 등에 대한 관심이 높아지고 있다.
이에 본 발명자들은, 후생유전학 관점에서 항암제 저항성과 관련된 유전자의 발현을 연구하던 중, CLDN7, CRIP1, ERSP1 및 TYMP 유전자의 하향 발현과 이의 과메틸화가 항암제 저항성과 관련이 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은, 항암제에 대한 저항성 예측용 마커 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 바이오마커의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 항암제에 대한 저항성 예측용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 조성물을 포함하는 항암제에 대한 저항성 예측용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 마커를 이용한 항암제에 대한 저항성 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 마커를 이용한 항암제 저항성 억제 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 CLDN7, CRIP1, ERSP1 및 TYMP 로 이루어지는 군에서 선택된 1 종 이상의 유전자를 포함하는 항암제 저항성 예측용 마커 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 CLDN7, CRIP1, ERSP1 및 TYMP 로 이루어지는 군에서 선택된 1 종 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 항암제 저항성 예측용 마커 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 항암제 저항성 예측용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 생물학적 시료에서, CLDN7, CRIP1, ERSP1 및 TYMP 로 이루어지는 군에서 선택된 1 종 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 CLDN7, CRIP1, ERSP1 및 TYMP 로 이루어지는 군에서 선택된 1 종 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준이 대조군에 비해 낮은 경우 항암제에 대한 저항성이 있는 것으로 판단하는 단계;를 포함하는 항암제 저항성 진단에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한 (a) CLDN7, CRIP1, ERSP1 및 TYMP 로 이루어지는 군에서 선택된 1 종 이상의 유전자를 하향 발현하는 암 세포에 후보 물질을 처리하는 단계; 및 (b) CLDN7, CRIP1, ERSP1 및 TYMP 로 이루어지는 군에서 선택된 1 종 이상의 유전자의 발현을 증가시키거나 상기 유전자의 메틸화를 억제시키는 물질을 선별하는 단계; 를 포함하는 항암제 저항성 억제 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 CLDN7, CRIP1, ERSP1 및 TYMP 유전자는 항암제 저항성 세포주에서는 그 발현이 현저하게 감소되는 유전자로, 이를 이용하여 항암제에 대한 저항성을 효과적으로 예측할 수 있다. 또한, 본 발명의 마커를 이용하여 항암제에 효과가 나타나는 환자를 선별함으로써 효율적인 항암 치료가 가능하며, 상기 유전자를 타겟으로 하여 항암제 민감성을 높이는 약물을 개발하는데도 활용할 수 있다
도 1은 항암제 저항성 위암 세포주를 얻기 위한 방법의 모식도이다.
도 2는 항암제 저항성 위암 세포주에서 발현이 하향 조절된 유전자와 과메틸화된 유전자의 교집합 결과를 나타낸 모식도이다.
도 3은 항암제 저항성 위암 세포주 (M1-5FU, M1-cis, M2-5FU, M2-cis, M2-PTX) 에서 CLDN7, CRIP1, ERSP1 및 TYMP 유전자의 발현을 RT-PCR 을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다 (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001).
도 4는 CLDN7, ESRP1, CRIP1, TYMP의 발현 억제 후, 항암제 처리에 의한 저항성 세포주의 세포 생존률을 확인한 결과를 나타낸 도이다(*P<0.001, -: 약물 처리하지 않음 +: 약물 처리함).
도 5는 항암제 저항성 세포주 (SNU638-cis, SNU638-PTX) 에서 CRIP1 유전자의 하향 발현(A) 및 메틸화 억제에 따른 유전자 발현의 증가(B)를 확인한 결과를 나타낸 도이다(*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001).
도 6은 항암제 저항성 세포주 (SNU638-cis, SNU638-PTX) 에서 CLDN7 유전자의 하향 발현(A) 및 메틸화 억제에 따른 유전자 발현의 증가(B)를 확인한 결과를 나타낸 도이다(*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001).
도 7은 항암제 저항성 세포주 (SNU638-cis, SNU638-PTX) 에서 ESRP1 유전자의 하향 발현(A) 및 메틸화 억제에 따른 유전자 발현의 증가(B)를 확인한 결과를 나타낸 도이다(*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001).
도 8은 항암제 저항성 세포주 (SNU638-cis, SNU638-PTX) 에서 TYMP 유전자의 하향 발현(A) 및 메틸화 억제에 따른 유전자 발현의 증가(B)를 확인한 결과를 나타낸 도이다(*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001).
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 CLDN7 (NCBI Gene ID: 1366), CRIP1 (NCBI Gene ID: 1396) , ERSP1(NCBI Gene ID: 54845) 및 TYMP (NCBI Gene ID: 1890) 로 이루어지는 군에서 선택된 1 종 이상의 유전자를 포함하는 항암제 저항성 예측용 마커 조성물 및 CLDN7, CRIP1, ERSP1 및 TYMP 로 이루어지는 군에서 선택된 1 종 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 항암제 저항성 예측용 마커 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, "마커"란 항암제에 대한 반응성을 예측할 수 있는 물질로, 항암제에 대한 저항성을 나타내는 개체와 민감성을 나타내는 개체간에서 유의적인 차이를 보이는 폴리펩타이드, 핵산 (예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 상기 마커는 CLDN7, CRIP1, ERSP1 및 TYMP 단백질 및 이를 코딩하는 핵산 분자(DNA 또는 mRNA)를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, “저항성"은 항암제에 의해 쉽게 영향을 받지 않으며, 항암제 처리에도 불구하고 세포 증식에 유의적인 변화가 없는 상태를 말한다.
본 발명에 있어서, "민감성"은 항암제에 의해 효과적으로 세포 증식이 변화하는 상태, 즉 암세포가 사멸하는 상태를 말한다.
본 발명에 있어서, "항암제에 대한 저항성 예측"은 특정 개체가 항암제 치료에 대해 선호적으로 또는 비선호적으로 반응할지 여부를 예측하는 것, 또는 항암제 저항성의 위험성을 예측하는 것을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 예측은 암 환자에 대한 가장 적절한 치료 방식을 선택함으로써 치료를 결정하는데 임상적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 예측은 환자가 치료 처치, 예컨대 주어진 치료적 처치, 예를 들어 주어진 치료제 또는 조합물의 투여, 수술적 개입, 화학요법 등에 유리하게 반응할 것인지를 예측하는데 있어서 유용한 도구이다.
본 발명에 있어서, 상기 암은 위암, 대장암, 폐암, 두경부암으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 위암일 수 있다.
또한 본 발명에 있어서, 상기 항암제는 이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는5-FU, 시스플라틴 및 파클리탁셀로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 본 발명에 따른 CLDN7, CRIP1, ERSP1 및 TYMP 바이오 마커는 상기 3종의 항암제에 대한 저항성을 나타내는 세포에서 공통적으로 유전자 발현이 햐향 조절된 것으로, 다양한 항암제의 저항성을 예측하는 마커로 유용하게 사용 가능하다.
본 발명의 저항성 예측용 마커 조성물은 CLDN7, CRIP1, ERSP1 및 TYMP 로 이루어지는 군에서 선택된 1 종 이상의 유전자의 메틸화를 측정하는 제제를 더 포함할 수 있다.
항암제 저항성과 관련된 CLDN7, CRIP1, ERSP1 및 TYMP 유전자의 하향 조절은 이들 유전자의 과메틸화에 기인한 것으로, 상기 유전자에서 민감성 세포 대조군과 비교하여 과메틸화가 확인되는 경우, 이는 항암제에 저항성을 갖는 것으로 판단할 수 있다. 상기 메틸화를 측정하는 제제 및 방법은 당 분야의 통상적으로 알려진 방법을 제한없이 사용할 수 있다.
또 하나의 양태로서 본 발명은 상기 예측용 조성물을 포함하는 항암제 저항성 예측용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 “키트”란 CLDN7, CRIP1, ERSP1 및 TYMP 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 조성물을 포함함으로써, 항암제에 대한 암세포의 저항성을 예측할 수 있도록 하는 도구를 의미한다. 본 발명의 키트에는 상기 조성물 외에도 저항성 예측에 필요한 다른 구성성분 조성물, 용액, 장치가 포함될 수 있다.
구체적인 일례로서, 본 발명의 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 상기 RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 마이크로어레이 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 상기 마이크로어레이 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있으며, 본 발명의 마커를 이용하여 당업계에서 통상적으로 사용되는 제조 방법에 의하여 용이하게 제조될 수 있다. 마이크로어레이 칩을 제작하기 위해서, 상기 탐색된 마커를 탐침 DNA 분자로 이용하여 DNA 칩의 기판상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 마이크로어레이 칩의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-Llysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등이 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC등이 사용될 수 있고, 발색기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)), OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.
또 하나의 양태로서 본 발명은 (a) 생물학적 시료에서, CLDN7, CRIP1, ERSP1 및 TYMP 로 이루어지는 군에서 선택된 1 종 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 CLDN7, CRIP1, ERSP1 및 TYMP 로 이루어지는 군에서 선택된 1 종 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준이 대조군에 비해 낮은 경우 항암제에 대한 저항성이 있는 것으로 판단하는 단계;를 포함하는 항암제 저항성 진단에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 생물학적 시료는 세포, 조직, 전혈, 혈청 또는 혈장일 수 있으며, 바람직하게는 암 조직 또는 암 세포이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 mRNA 수준 측정은 생물학적 시료에서 마커 유전자들의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 중합효소반응(PCR), 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 마이크로어레이 분석법 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 단백질 수준 측정은 생물학적 시료에서 마커 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 웨스턴 블랏팅(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석법(Radioimmunoassay), 방사면역 확산법(Radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(Rocket) 면역전기영동, 조직면역염색법, 면역 침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complete fixation assay), 유세포분석법(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 또는 단백질 칩(protein chip) 분석법 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기와 같은 진단 방법을 통해, 항암제에 대한 저항성을 극복하고 항암 효과를 얻을 수 있는 암 환자를 조기에 선별할 수 있으며, 환자 맞춤형 치료를 수행할 수 있다.
또한 본 발명은 (a) CLDN7, CRIP1, ERSP1 및 TYMP 로 이루어지는 군에서 선택된 1 종 이상의 유전자를 하향 발현하는 암 세포에 후보 물질을 처리하는 단계; 및 (b) CLDN7, CRIP1, ERSP1 및 TYMP 로 이루어지는 군에서 선택된 1 종 이상의 유전자의 발현을 증가시키거나 상기 유전자의 메틸화를 억제시키는 물질을 선별하는 단계; 를 포함하는 항암제 저항성 억제 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, CLDN7, CRIP1, ERSP1 및 TYMP 유전자의 발현이 항암제 저항성과 관련있으며, 상기 유전자들의 추가적인 발현 억제가 암세포의 생존률을 높이는 것을 통해 유전자 발현과 항암제 저항성의 관련성을 검증하였는 바, 상기 유전자의 하향 발현을 완화시키거나 이들의 메틸화를 억제시키는 물질을 도출하여, 항암제 저항성을 억제하고 민감성을 높이는 새로운 항암제 또는 항암 보조제로 스크리닝할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 항암제 저항성 위암 세포주의 제작
시스플라틴, 5-FU, 파클리탁셀 각각에 대하여 저항성을 가지는 위암 세포주 SNU638 을 제작하고 NGS (RNA sequencing, MBD sequencing, exome sequencing)을 의뢰하였다. 저항성을 갖는 위암 세포주를 제작하기 위해서 2가지 방법을 이용하였으며, 제작 방법은 도 1에 도식화하여 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 첫번째는 낮은 농도의 항암제를 오랜 기간 처리하여 저항성을 갖는 세포주를 수득하는 방법 (M1) 이며, 두번째는 높은 농도의 항암제를 짧은 기간 처리하여 저항성을 갖는 세포주를 수득하는 방법 (M2)이다.
보다 구체적으로 위암 저항성 세포를 만들기 위해, 먼저 각 약물의 IC50를 MTT 어세이를 통해 측정하였다. 그 후 M1은 세포를 IC30의 농도에서 배양하고, 세포가 dish에 가득 차게 되면 sub-culture를 하여 각 약물의 농도를 1.1배씩 증가시켜 배양하였다. 그리고 최종 농도가 10배 이상이 되면 MTT 어세이를 통해 IC50를 측정하였다. M2는 각 약물의 IC50의 농도로 24시간 처리하고 약물이 없는 배지로 배지를 교환한 다음 세포를 배양시켰다. 세포가 가득차면 sub-culture를 수행하였으며, 이 단계에서는 앞의 배양 방법과 똑같이 각 약물을 IC50의 농도로 24시간 처리하고 약물이 없는 배지로 교환한 다음 세포를 배양시켰다. 그리고 최종 농도가 10배 이상이 되면 MTT 에세이를 통해 IC50를 측정하였다. 상기와 같은 방법으로 M1 및 M2 방법을 통해 확인된 정상 세포 대비 저항성 세포가 가지는 약물의 최종 농도 비율을 하기 표 1에 나타내었다.
[표 1]
Figure 112017020373962-pat00001
이하의 실험에서는 총 6개의 시료를 이용하여 실험을 수행하였으며, 각 시료는 다음과 같다.
-SNU638: 약물 미처리군
- SNU638(M1-5FU): M1 방법으로 5FU에 저항성을 획득한 세포군
- SNU638 (M1-cis): M1 방법으로 시스플라틴에 저항성을 획득한 세포군
- SNU638 (M2-5FU): M2 방법으로 5FU에 저항성을 획득한 세포군
- SNU638 (M2-cis): M2 방법으로 시스플라틴에 저항성을 획득한 세포군
- SNU638 (M2-PTX): M2 방법으로 파클리탁셀에 저항성을 획득한 세포군
실시예 2. NGS 분석 결과를 통한, 저항성 관련 유전자 도출
유전자의 발현을 확인하는 RNA 서열분석과 DNA 메틸화를 확인할 수 있는 MBD 서열분석 (Methylation Binding Domain) 결과를 맵핑하여 메틸화에 의한 유전자 발현 목록을 제작하였다.
먼저 RNA 서열분석 결과의 48906 전사체에서 FPKM 값이 0인 것을 제외한 23810 전사체 중 유전자 발현율이 대조군에 비해 감소한 값이 절대값 2배 이상인 유전자를 선택하였다. 그리고 MBD 서열분석 결과의 79612 영역 중 메틸화 정도가 대조군에 비해 증가한 값이 절대값 2배 이상이고, p value 값이 0.05 이하인 유전자를 선택하였다. 각각의 서열분석을 통해 선택된 유전자들을 맵핑하여 총 4개의 유전자를 확인하였다. 즉, RNA 서열분석 결과에서 발현이 낮은 유전자와 MBD 서열분석 결과에서 메틸화 정도가 높은 유전자의 교집합을 구하였으며, 이의 모식도를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 유전자 발현이 하향 조절되면서 메틸화가 증가되어 있는 교집합 영역에 해당하는 유전자는 총 4종이 확인되었으며, 이는 구체적으로 M1-cis와 M2-PTX에서 확인되는 CLDN7, ESRP1, M1-cis에서 확인되는 CRIP1, TYMP이다.
NGS분석 결과, 4가지의 유전자의 기능과 fold change값은 다음 표 2와 같다.
[표 2]
Figure 112017020373962-pat00002
실시예 3. RT- PCR 을 통한 유전자 발현 분석
상기 실시예2 를 통해, 항암제에 저항성을 갖는 세포주에서 총 4개의 유전자 종이 확인되었으므로 약물 미처리 SNU638에 비해, 약물에 저항성을 갖는 세포주에서 상기 유전자의 발현량의 변화를 RT-PCR을 통해 추가적으로 분석하였다. RT-PCR 은 95℃ 에서 10분 → (95℃ 에서 40초 → 55℃ 에서 40초 → 72℃ 에서 40초) 40 cycles → 72℃ 에서 10분 조건으로 수행하였으며, 사용된 프라이머 서열은 표 3에, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
[표 3]
Figure 112017020373962-pat00003
도 3에 나타낸 바와 같이, 약물을 처리하지 않은 SNU638의 값을 1로 보았을 때, 각 유전자의 발현을 Real-time PCR로 확인한 결과, NGS분석 결과와 마찬가지로 4개의 유전자들은 저항성을 가지는 대부분의 저항성세포에서 감소하는 경향을 보였다. 이를 통해 최종적으로CLDN7, CRIP1, ERSP1, TYMP 4가지의 유전자가 선정되었고, 유의성 있게 감소하는 유전자들이 약물에 대한 저항성 메커니즘에 직접적으로 관련이 있는지 확인하고, 이 유전자들이 저항성을 획득하며 감소하는 원인을 찾고자 추가적인 실험을 진행하였다.
실시예 4. 항암제 저항성과 도출 유전자의 관련성 확인
항암제 저항성과 관련있는 유전자로 CLDN7, ESRP1, CRIP1, TYMP가 도출되었고, 이들 유전자가 실제 항암제 저항성과 관련있는지 여부를 확인하기 위하여, 각각의 세포주에 siRNA를 처리하여 유전자의 발현을 억제시킨 뒤, 다시 항암제를 처리하고 MTT 어세이를 수행하였다. 보다 구체적으로 항암제에 저항성을 갖는 세포주를 6 웰 플레이트에 1x105 로 시딩하고 24 시간 후, siRNA 를 각각 50nM 씩 처리하여 각 유전자의 넉다운을 유도하였다. 항암제 저항성 세포주로는 실시예 1에서 제조된 세포 중 SNU638 (M1-cis) 및 SNU638 (M2-PTX) 를 사용하였다. siRNA 처리 48시간 후 항암제인 5-FU 150uM, 시스플라틴 100uM, 파클리탁셀 300uM 를 처리하였으며, 24시간 경과 후 MTT 어세이를 통해 세포 생존률을 확인하였다. 사용된 siRNA 서열 정보는 다음과 같으며, 세포 생존률 확인 결과를 도 4에 나타내었다.
[표 4]
Figure 112017020373962-pat00004
도 4에 나타낸 바와 같이, CLDN7, ESRP1, CRIP1, TYMP 의 발현을 siRNA를 통해 더욱 억제한 경우, 각각의 항암제 처리시 세포 생존률이 더욱 증가하는 것을 확인하였으며, 이와 같은 결과는 상기 4종 유전자의 하향 발현이 항암제 저항성과 관련있음을 나타내는 것이다.
실시예 5. 5-AD 에 의한 유전자 발현의 증가 확인
항암제에 대한 저항성을 가지는 위암 세포주에서 나타나는 CLDN7, ESRP1, CRIP1, TYMP 4가지 유전자의 발현 감소가 메틸화의 의한 것인지를 확인하기 위해 탈메틸화제인 5-aza-2'-deoxycytidine (5-AD)를 처리하였으며, 5-AD를 처리하여 감소되었던 유전자의 발현이 증가가 되는지 여부를 RT PCR로 확인하였다. 또한 이를 1.5% 아가로오스 겔 전기영동을 통해 추가적으로 확인하였다. 각각의 유전자에 5-AD 를 처리한 후, 유전자 발현의 증감을 확인한 결과를 도 5 내지 8에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, CRIP1 유전자의 발현은 SNU638와 비교하여 SNU638-cis, SNU638-PTX 에서 현저하게 감소되어 있었으나, 5-AD (2uM, 4uM) 을 0 내지 3일 간 처리하여 메틸화를 억제한 결과, 메틸화 억제에 따라 CRIP1 유전자의 발현이 점차적으로 증가되는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과는 상기 유전자 발현의 감소가 유전자의 과메틸화에 의한 것임을 나타낸다.
도 6 내지 도 8에 나타낸 바와 같이, CLDN7, ESRP1, TYMP 의 유전자 하향 발현과 메틸화와의 관계를 CRIP1 과 동일한 방식으로 확인하였으며, 그 결과 저항성 세포주에서 하향 조절된 CLDN7, ESRP1, TYMP 유전자들은 메틸화 억제에 의하여 점차적으로 발현이 증가되는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과 역시 상기 유전자들의 감소가 유전자의 과메틸화에 의한 것임을 나타낸다.
상기 결과를 통해, 항암제 (5-FU, 시스플라틴, 파클리탁셀)에 대한 암 세포의 저항성은 CRIP1, CLDN7, ESRP1, TYMP 유전자의 하향 발현 조절과 관련이 있다는 것을 확인하였으며, 이러한 결과는 상기 유전자들의 과메틸화에 기인한 것임을 확인하였다. 따라서, CRIP1, CLDN7, ESRP1, TYMP 유전자 발현 및 과메틸화 여부를 확인함으로써, 항암제에 저항성을 갖는 환자를 선별할 수 있으며, 이를 통해 환자 맞춤형 치료가 가능함을 알 수 있다.

Claims (8)

  1. CLDN7, CRIP1 및 ERSP1로 이루어지는 군에서 선택된 1 종 이상의 유전자를 포함하는, 시스플라틴, 5-FU 또는 파클리탁셀 저항성 위암 예측용 마커 조성물.
  2. CLDN7, CRIP1 및 ERSP1로 이루어지는 군에서 선택된 1 종 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 시스플라틴, 5-FU 또는 파클리탁셀 저항성 위암 예측용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 TYMP 유전자를 더 포함하는, 시스플라틴, 5-FU 또는 파클리탁셀 저항성 위암 예측용 마커 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 조성물은 TYMP 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 더 포함하는, 시스플라틴, 5-FU 또는 파클리탁셀 저항성 위암 예측용 조성물.
  5. CLDN7, CRIP1, ERSP1 및 TYMP로 이루어지는 군에서 선택된 1 종 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제 및 CLDN7, CRIP1, ERSP1 및 TYMP 로 이루어지는 군에서 선택된 1 종 이상의 유전자의 메틸화를 측정하는 제제를 포함하는, 시스플라틴, 5-FU 또는 파클리탁셀 저항성 위암 예측용 조성물.
  6. 제2항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 시스플라틴, 5-FU 또는 파클리탁셀 저항성 위암 예측용 키트.
  7. (a) 생물학적 시료에서, CLDN7, CRIP1, ERSP1 및 TYMP 로 이루어지는 군에서 선택된 1 종 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 CLDN7, CRIP1, ERSP1 및 TYMP 로 이루어지는 군에서 선택된 1 종 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준이 대조군에 비해 낮은 경우 시스플라틴, 5-FU 또는 파클리탁셀에 대한 저항성이 있는 것으로 판단하는 단계;를 포함하며, 시스플라틴, 5-FU 또는 파클리탁셀 저항성 위암 진단에 대한 정보를 제공하는 방법.
  8. TYMP 유전자를 포함하는, 시스플라틴 또는 파클리탁셀 저항성 위암 예측용 마커 조성물.
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