WO2015174585A1 - 보체인자 ｂ 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 카보하이드레이트 안티젠 19-9 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 췌장암 진단용 키트 - Google Patents

보체인자 ｂ 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 카보하이드레이트 안티젠 19-9 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 췌장암 진단용 키트 Download PDF

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이민정
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    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates

Definitions

  • the present application is a pancreatic cancer diagnostic kit comprising an antibody that specifically binds to a complement factor B protein and an antibody that specifically binds to a carbohydrate antigen 19-9 protein, a method for providing information for pancreatic cancer diagnosis using the same, and It relates to the pancreatic cancer diagnostic method used.
  • Pancreatic cancer is the ninth most common cancer in the world, with the fourth highest mortality rate (Lowenfels, AB, et al., Best Pract Res Clin Gastroenterol, 197-209, 2006). In most countries, pancreatic cancer accounts for only 2-3% of all malignant tumors, but the death toll accounts for 6% of all tumor-related deaths. The reason for this is that the two-year survival rate of pancreatic cancer is only around 10%, and the prognosis is poor, with the 5-year survival rate not exceeding 5% (Lee, CN, et al., Pancreas , 94-94, 2012).
  • pancreatic cancers don't show symptoms until they progress significantly, so once the pancreatic cancer is diagnosed, it is already very advanced, so surgery is often impossible. Even when surgery is possible, 80-90% of patients undergo recurrence and death. Radiotherapy and chemotherapy are performed in addition to surgery to treat pancreatic cancer, but most patients have limited effects on the survival of patients. Therefore, early diagnosis of pancreatic cancer is very important.
  • Methods for diagnosing pancreatic cancer include biopsy using computed tomography (CT) or magnetic resonance imaging (MRI). Recently, a clinical sample for diagnosing pancreatic cancer is a body fluid such as plasma. Simultaneous measurement of protein in E. coli is used to determine the presence or possibility of pancreatic cancer.
  • the most commonly used tumor marker associated with pancreatic cancer is carbohydrate antigen 19-9 (CA 19-9), but CA 19-9 is used in the plasma of cancer patients of the gastrointestinal system including biliary tract in addition to pancreatic cancer. It is known to be elevated, and also known to be elevated in cases of cholangitis and biliary obstruction without malignant tumors, there is a problem that the specificity is low. (Source: National Health Information Portal).
  • CA 19-9 carbohydrate antigen 19-9
  • CA 19-9 is used in the plasma of cancer patients of the gastrointestinal system including biliary tract in addition to pancreatic cancer. It is known to be elevated, and also known to be elevated in cases of cholangitis and
  • CFB Complement factor b
  • CFB Complement factor b
  • Alternative pathways are activated by the sugar structure on the surface of pathogen cells, regardless of antigen-antibody complex formation. Activation is induced by first binding a small amount of C3b present in the blood to the microbial surface. When C3b binds to complement factor B in the blood, it is decomposed into C3bBb and Ba by complement factor D, and C3bBb is stabilized by properidine to become an alternative pathway to C3 convertase and produce more C3b. I enter the amplification phase.
  • C3bBb3b complex exhibits the alternative pathway of C5 convertase activity, which breaks down C5 into C5a and C5b and finally forms MAC on the bacterial surface.
  • C5 convertase activity breaks down C5 into C5a and C5b and finally forms MAC on the bacterial surface.
  • bacteria die and antigens are removed.
  • Complement B is known as a secreted protein that plays an important role in c5 production by binding to the c3b protein, an early stage of this alternative pathway, and has five glycan sites as glycoproteins.
  • Complement B is known as ovarian cancer (Wu.J., et al., JPR , 4541-52, 2012), erythroidal cancer (Seriramalu. R., et al., Electrophoresis , 2388-95, 2010), breast cancer (Doustjalali, SR, et al., Electrophoresis , 2392-401, 2004) and are known to be secreted from the serum of various patients.
  • complement factor B is known as ovarian cancer (Wu.J., et al., JPR , 4541-52, 2012)
  • erythroidal cancer Stemasarcomasis , erythroidal cancer
  • breast cancer Dantjalali, SR, et al., Electrophoresis , 2392-401, 2004
  • pancreatic cancer no attempt has been made to diagnose pancreatic cancer by combining complement factor B with carbohydrate.
  • the present application provides a pancreatic cancer diagnostic kit comprising an antibody specifically binding to the complement factor B protein, which is a novel biomarker for diagnosing pancreatic cancer, having an excellent specificity and sensitivity, and an antibody specifically binding to the carbohydrate antigen 19-9 protein,
  • the present invention provides a method for providing information for diagnosing pancreatic cancer and a method for diagnosing pancreatic cancer using the same.
  • the present application provides a method for diagnosing pancreatic cancer comprising measuring the protein expression level of complement factor B in a blood sample isolated from an individual, and a method for providing information for diagnosing pancreatic cancer.
  • the present application also provides the use of complement factor B (CFB) as a diagnostic marker for pancreatic cancer.
  • CFB complement factor B
  • the present application provides a pancreatic cancer diagnostic kit comprising an antibody that specifically binds to the complement factor B protein.
  • the complement factor B protein may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the subject may be a patient suspected of pancreatic cancer.
  • the method may further comprise comparing the protein expression level of complement factor B in the blood sample isolated from the individual to the protein expression level of complement factor B in the normal control.
  • a normal control means a blood sample isolated from a healthy individual without pancreatic cancer or other disease.
  • the two pancreatic cancer samples may be compared and the candidate patient may be classified as a pancreatic cancer patient if the protein expression level of complement factor B of the sample of suspected pancreatic cancer is higher than the protein expression level of complement factor B of the normal control sample.
  • the complement factor B protein level of the sample of the pancreatic cancer candidate patient is two times higher than the complement factor B protein level of the normal control sample, the candidate patient may be classified as a pancreatic cancer patient.
  • the blood sample may be a whole blood, plasma or serum sample.
  • diagnosis in the present application means identifying the presence or characteristic of a pathological condition. In light of the purpose of the present application, the diagnosis is to confirm the production and recurrence of pancreatic cancer.
  • the term "diagnostic marker” or “diagnostic marker” is a substance that can diagnose cancer cells separately from normal cells, and increases or decreases polypeptides or nucleic acids (eg, mRNA) in cells with cancer compared to normal cells.
  • Organic biomolecules such as lipids, glycolipids, glycoproteins or sugars (monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, etc.) and the like.
  • pancreatic cancer diagnostic markers are genes of CA 19-9 and / or complement factor B and proteins encoded thereby that exhibit specific high levels of expression in pancreatic cancer cells as compared to cells of normal pancreatic tissue. .
  • protein expression level measurement refers to a process of confirming the presence and expression level of a protein expressed in a cancer marker gene in a biological sample in order to diagnose cancer.
  • An antibody that specifically binds to the protein of the gene. Check the amount of protein using. Western blotting, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion, rocket ) Immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, FACS and protein chip, but are not limited thereto.
  • Specifically binds in the present application means that the binding force to the target material is superior to other materials to the extent that the presence or absence of the target material can be detected by the binding.
  • an “antibody” in this application refers to a peptide or polypeptide substantially derived from or made from an immunoglobulin gene or immunoglobulin genes, or fragments thereof, that can specifically bind an antigen or epitope.
  • Antibodies in the present application include various forms of antibody structures, including but not limited to whole antibodies and antibody fragments.
  • An antibody fragment comprises a portion of an antibody of full length, the variable domain of the antibody, or at least the antigen binding site of the antibody. Examples of antibody fragments include diabodies, single-chain antibody molecules and multispecific antibodies formed from antibody fragments.
  • the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • Antibodies against complement factor B proteins are commonly known in the art, such as fusion methods (Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6: 511-519 (1976)), recombinant DNA methods (US patents). 4,816,56) or phage antibody library methods (Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991) and Marks et al, J. Mol. Biol., 222: 58, 1-597 (1991)). Can be prepared by General procedures for antibody preparation are described in Harlow, E.
  • sensitivity refers to the probability that the diagnostic test result will be positive when the disease is affected
  • specificity means that the test result is negative when the disease is not affected. Indicates the degree of likelihood.
  • Complement factor B protein was selected as a candidate for pancreatic cancer diagnostic markers, and the presence of complement factor B protein in the plasma of normal and pancreatic cancer patients was confirmed and the change was observed. As a result, it was confirmed that the protein expression level of complement factor B is very high in the plasma of pancreatic cancer patients compared to the normal control (Examples 1 and 2).
  • ELISA and Receiver Operating Characteristic (ROC) curve analysis were performed to verify the efficacy of CFB as a pancreatic cancer diagnostic marker when compared to CA 19-9, which is known as a pancreatic cancer diagnostic marker, and their optimal cut-off values. The sensitivity and specificity of CFB and CA 19-9, respectively, were analyzed based on (Examples 3-6).
  • CA 19-9 was increased in pancreatic cancer, liver cancer, bile duct cancer and gastric cancer, indicating that the specificity was decreased. That means that CA 19-9 alone is not suitable for use as a pancreatic cancer diagnostic marker.
  • CFB expression was specifically increased only in pancreatic cancer, which means that it is suitable as a diagnostic marker for pancreatic cancer due to its excellent sensitivity and specificity.
  • CA 19-9 alone has a problem of inferiority in specificity as a diagnostic marker for pancreatic cancer
  • CA 19-9 was used together with CFB it was found that sensitivity and specificity were the best. This means that CA 19-9 alone is not suitable for use as a marker for diagnosing pancreatic cancer, but when used with CFB, pancreatic cancer can be diagnosed more accurately.
  • the kit may further comprise an antibody that specifically binds carbohydrate antigen 19-9.
  • the present application also provides methods for diagnosing pancreatic cancer and providing information for pancreatic cancer diagnosis comprising measuring protein expression levels of complement factor B and carbohydrate antigen 19-9 in blood samples isolated from the subject.
  • the subject may be a suspected pancreatic cancer group.
  • the blood sample may be a whole blood, plasma or serum sample.
  • the present application also provides a method for diagnosing pancreatic cancer comprising measuring protein expression levels of complement factor B and carbohydrate antigen 19-9 as a biomarker for diagnosing pancreatic cancer,
  • a second step of forming a complex of the antibody and the biomarker by contacting the blood sample with an antibody that specifically binds to the biomarker and is detectably labeled;
  • the fifth step if the amount of the biomarker in the sample is greater than the amount of the control biomarker provides a pancreatic cancer diagnostic method comprising a sixth step of diagnosing pancreatic cancer.
  • biomarker means complement factor B or carbohydrate 19-9.
  • the amount of the biomarker can be known therefrom.
  • the amount of control biomarker refers to the amount of biomarker in the blood sample of an individual without pancreatic cancer.
  • the blood sample may be a whole blood, plasma or serum sample.
  • the first step and the second step may further comprise the step of separating the biomarker and proteins other than the biomarker in the blood sample by immunoprecipitation.
  • the step of separating the biomarker and protein other than the biomarker is
  • the present invention also provides a method for treating pancreatic cancer comprising treating a subject with a pancreatic cancer therapeutic agent when diagnosed with pancreatic cancer according to the above method.
  • Pancreatic cancer therapeutic agents can be used without limitation to known drugs known to be effective in treating pancreatic cancer.
  • According to the present application can provide a diagnostic marker for pancreatic cancer with improved sensitivity and specificity.
  • FIG. 1A shows two-dimensional electrophoresis images of normal plasma and FIG. 1B shows two-dimensional electrophoresis images of plasma of pancreatic cancer patients.
  • the spot indicated by the arrow indicates complement factor B protein.
  • Figure 2 shows the difference in the expression of complement factor B in the plasma of normal and pancreatic cancer patients shows a two-dimensional vertical electrophoresis image of the spot (black point) of Figures 1a and 1b.
  • Figure 3a shows the results of Western blot analysis of the protein expression level of complement factor B in the plasma of normal and pancreatic cancer patients (N: normal, C: pancreatic cancer patients).
  • 3B is a graph showing the intensity of the western blot band of FIG. 3A.
  • Figure 4a shows the results of Western blot analysis of protein expression levels of complement factor B in normal cell lines (HPDE) and pancreatic cancer cell lines (HPAC1, BXPC3, PANC1).
  • 4b shows the results of RT-PCR analysis of protein expression levels of complement factor B in normal cell lines (HPDE) and pancreatic cancer cell lines (HPAC1, BXPC3, PANC1).
  • 4C is a graph showing the band strength of FIG. 1B.
  • Figure 5a is the result of analyzing the protein expression level of complement factor B (CFB) by Western blot.
  • HD is normal
  • CP is pancreatitis
  • PC is pancreatic cancer.
  • 5B is a graph showing the intensity of the western blot band of FIG. 5A.
  • HD is normal
  • CP is pancreatitis
  • PC is pancreatic cancer.
  • CFB CFB
  • CA 19-9 CFB
  • HD normal
  • CP pancreatitis
  • PC pancreatic cancer
  • HCC liver cancer
  • CC cholangiocarcinoma
  • GC gastric cancer.
  • Figure 7 shows the ROC curves of CA 19-9, CFB and CFB + CA 19-9.
  • Example 1-1 CFB Protein Detection in Plasma by Electrophoresis and Mass Spectrometry
  • Electrophoresis and mass spectrometry were performed to detect the presence and amount of CFB in the plasma of normal and pancreatic cancer patients.
  • Plasma was obtained from Severance Hospital Gene Bank and Gastroenterology Internal Medicine and was in accordance with the Institutional Review Board (IRB) regulations. Plasma samples were dispensed 200 ⁇ l each and stored at -70 ° C until the experiment.
  • Complement factor B is a secreted protein, and since plasma contains a large amount of known high abundance proteins, Hu-14 (Agilent) is used to remove proteins other than complement factor B.
  • Two-dimensional fluorescence electrophoresis was performed. For two-dimensional electrophoresis, for each sample of 10 normal plasma and 10 pancreatic cancer patients, 50 ⁇ g of each sample and the corresponding standard sample were treated with dark dye 400 pmol Cy3, Cy5, Cy2 (GE Healthcare).
  • Tributylphosphine buffer [6 M urea, 2% sodium dodecyl sulfate (SDS), 30 mM tris, 20% glycerol, 2.5% acrylamide solution, 5 mM Tributylphosphine] for one-minute reduction and alkylation.
  • FIG. 1A The results of two-dimensional electrophoresis on the plasma of normal persons are shown in FIG. 1A, and the results of two-dimensional electrophoresis on the plasma of pancreatic cancer patients are shown in FIG. 1B.
  • Arrows in the figures represent CFBs. As a result, it was found that the expression of CFB was increased in pancreatic cancer patients.
  • Secondary vertical electrophoresis was performed to investigate the difference in the expression of CFB in the plasma of normal and pancreatic cancer patients. Secondary electrophoresis was performed using 9% ⁇ 16% polyacrylamide gel using Ettan Dalttwelve electrophoresis system (GE Healthcare), and after the electrophoresis, Cy2, using Typhoon 9400 (GE Healthcare) scanner Scanning at a wavelength corresponding to Cy3, Cy5. Each gel image was analyzed using DeCyder 2-D analysis software (GE Healthcare).
  • Anti-Complement Factor B antibody (CFB, Abcam) was firstly diluted 1: 1000-fold in TBS-T buffer solution containing 5% skim milk and anti-mouse IgG-HRP (Santa Cruz) 1: 10000 times was treated secondly. The final NC membrane was reacted for 1 minute with ECL Plus Western Blot Reagent (GE Healthcare) and analyzed by scanning with a Typhoon 9400 scanner.
  • CFB Anti-Complement Factor B antibody
  • RT-PCR was used to confirm mRNA expression levels of CFB.
  • Total RNA was extracted using easy-BLUE (iNtRON, Gyeonggi, Korea), and cDNA was synthesized using an omniscript RT kit (Qiagen, Hilden, Germany).
  • the primers used are as follows:
  • CFB primer (SEQ ID NO: 2): 5'-CAACAGAAGCGGAAGATCGTC-3 '(forward)
  • GAPDH Primer (SEQ ID NO: 4): 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 '(forward)
  • GAPDH Primer (SEQ ID NO: 5): 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3 '(Reverse)
  • Western blots were performed in the same manner as in Example 1-3 using pooled samples. As a result, it was confirmed that CFB was expressed higher in PC than HD and CP (FIG. 5A). As a result, the intensity of these western blot bands was represented by a point p ⁇ 0.05. It was shown to be highly expressed (FIG. 5B). Therefore, even when using a large patient population and independent experiments, it was confirmed that CFB was significantly expressed on the PC twice as high as HD and CP.
  • ELISA tests were performed using plasma of HD, CP, PC, HCC, CC, and GC to compare the expression levels of CA 19-9 and CFB, now known as pancreatic cancer biomarkers.
  • CFB and CA 19-9 ELISA KIT used USCN and Panomics products respectively, and each product was tested according to each protocol.
  • each plasma was diluted 1: 10,000 and then 100 ul each was put in a well coated with antibodies against CFB. Incubate at room temperature for 2 hours. Thereafter, plasma was removed from the well, and 100ul of detection reagent A working solution was added thereto, followed by incubation at room temperature for 1 hour. After 1 hour, the solution was removed from the well, and 350 ul of washing solution was added and washed three times. Thereafter, 100 ul of the detection reagent B working solution was added to each well and reacted at room temperature for 30 minutes. The wash solution was washed five times. Subsequently, 90ul of substrate solution was added to each well, and then reacted under dark conditions for 15 minutes.
  • CA 19-9 ELISA 10ul of each plasma was put on a plate coated with CA 19-9 antibody and 100ul CA 19-9 assay buffer was put thereon. After mixing well for 30 seconds and incubated for 90 minutes at room temperature. The buffer was then removed from the wells and washed four times using wash buffer. Thereafter, 100 ul of working conjugate reagent was added to each well, mixed well for 30 seconds, and then incubated at room temperature for 90 minutes. Reagents were removed from the wells and washed four times using wash buffer. Thereafter, TMB was added to each well, mixed for 10 seconds, and reacted for 20 minutes under dark conditions.
  • CA 19-9 alone is not suitable for use as a pancreatic cancer diagnostic marker
  • CFB whose expression is specifically increased in pancreatic cancer, is suitable as a diagnostic marker for pancreatic cancer.
  • ROC curve analysis was performed using the Mann-Whitney rank sum test program to determine how CFB and CA 19-9 distinguish between pancreatic cancer patients and non-humans (HD, CP, HCC, CC, GC).
  • AUC values were used to compare CFB and CA 19-9.
  • the CFB showed 0.958 (95% CI: 0.956-0.959), which showed higher AUC than 0.833 (95% CI: 0.829-0.837) of CA 19-9.
  • the AUC of the two combinations (CFB + CA 19-9) was 0.986 (0.985-0.986), which was significantly higher than that of CFB and CA 19-9 ( p ⁇ 0.01) alone (Fig. 7).
  • pancreatic cancer can be diagnosed by CFB alone or by a combination of CFB and CA 19-9.
  • CA 19-9 For each group (HD; normal, CP; pancreatitis, PC; pancreatic cancer, HCC; liver cancer, CC; bile duct cancer, GC; gastric cancer), the diagnostic efficiency of CA 19-9 and CFB was confirmed. As a result, as shown in Table 2, both CA 19-9 and CFB showed similar diagnostic efficiency in the PC (CA 19-9: 80.5%, CFB: 73.2%). However, CA 19-9 showed high diagnostic efficiency (HCC: 61.3%, CC: 77.2%, GC: 17.1%) in other cancers (HCC, CC, GC), while CFB showed low diagnostic efficiency in other cancers. HCC: 0%, CC: 0%, GC: 8.6%). This means that CFB is more specific to PC than CA 19-9 when compared to other cancers.
  • CA 19-9 and CFB + CA 19-9 as pancreatic cancer diagnostic indicators, CA 19-9, CFB and according to the optimal cut-off value predicted by the maximum Youden index
  • the sensitivity and specificity (%) of pancreatic cancer diagnosis compared to other diseases of CFB + CA 19-9 were confirmed.
  • Table 3 when comparing the PC and other groups (HD, CP, HCC, CC, GC), the sensitivity of CA 19-9 was 80.4%, specificity was 70.0% and CFB was The sensitivity was 73.1% and specificity 97.9%. When combined with CFB and CA 19-9, the sensitivity was 90.1% and specificity 97.2%. This means that when CA 19-9 and CFB are used alone, better diagnostic efficiency is obtained when CA 19-9 and CFB are used alone.

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Abstract

본 출원은 보체인자 B 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 및 카보하이드레이트 안티젠 19-9 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 췌장암 진단 키트, 이를 이용하여 췌장암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법 및 이를 이용한 췌장암 진단 방법에 관한 것이다. 본 출원에 따르면 민감도 및 특이도가 향상된 췌장암 진단용 마커를 제공할 수 있다.

Description

보체인자 Ｂ 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 카보하이드레이트 안티젠 19-9 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 췌장암 진단용 키트
본 출원은 보체인자 B 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 카보하이드레이트 안티젠 19-9 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 췌장암 진단 키트, 이를 이용하여 췌장암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법 및 이를 이용한 췌장암 진단 방법에 관한 것이다.
췌장암은 세계적으로 9 번째로 많이 발병되는 주요 암으로서 사망률은 4번째로 높은 악성 종양이다(Lowenfels, A.B., et al., Best Pract Res Clin Gastroenterol, 197-209, 2006). 대개의 국가에서 췌장암이 전체 악성 종양 발생에서 차지하는 비중은 2-3% 에 지나지 않지만 사망자 수가 차지하는 비중은 전체 종양 관련 사망 가운데 무려 6%를 차지한다. 그 이유는 췌장암의 2년 생존율이 10% 내외에 불과할 정도로 낮고 5년 생존율도 5%를 넘지 못할 정도로 예후가 불량하기 때문이다(Lee, C.N., et al., Pancreas, 94-94, 2012).
췌장암은 상당히 진행되기 전까지는 증상이 나타나지 않는 경우가 대부분이기 때문에 일단 췌장암이 진단되면 이미 매우 진전된 후여서 수술이 불가능한 경우가 많다. 또한 수술이 가능한 경우에도 수술한 환자의 80~90%가 재발하고 사망에 이르게 된다. 췌장암을 치료하기 위하여 수술요법 외에도 방사선 요법, 화학 요법 등이 시행되고 있지만 환자의 생존 기간에는 제한된 효과를 나타내는 경우가 대부분이다. 따라서 췌장암을 조기에 진단하는 것이 매우 중요하다.
췌장암을 진단하는 방법으로는 전산화 단층촬영(computed tomography; CT)이나 자기공명 영상장치(magnetic resonance imaging; MRI)를 사용하는 조직검사가 있으며 최근에는 췌장암을 진단할 수 있는 임상시료로서 혈장과 같은 체액에서의 단백질 분석을 동시에 측정하여 췌장암 존재 또는 발병 가능성 여부를 판단하고 있다. 현재 췌장암과 관련되어 가장 흔히 쓰이는 종양 표지자는 카보하이드레이트 안티젠 19-9 (carbohydrate antigen 19-9: CA 19-9) 이지만, CA 19-9는 췌장암 이외에도 담도를 포함한 소화기계의 암 환자의 혈장에서 모두 상승된다고 알려져 있고, 또한 악성 종양이 없는 담관염과 담도 폐색이 있는 경우에도 상승 된다고 알려져 있어 특이도가 낮다는 문제점이 있다. (출처: 국가건강정보포털). 또한 조기암에서는 CA 19-9 표지자의 혈중 농도가 정상으로 나타나는 경우가 많으므로 조기 진단에는 사용할 수 없다.
한편, 보체인자 B (Complement factor b; CFB)는 CFB라고도 불려지는 단백질로서, 보체 활성의 대체 경로(Alternative pathway) 중 중요한 성분 중 하나이다. 대체경로는 항원-항체 복합체 형성과 상관없이 병원체 세포 표면의 당 구조에 의해 활성화된다. 먼저 혈액 중에 소량 존재하는 C3b가 미생물 표면에 결합함으로써 활성화가 유도된다. C3b는 혈액중의 보체인자 B와 결합하면 보체인자 D에 의해 C3bBb와 Ba로 분해되고, C3bBb는 프로페리딘에 의해 안정화되어 대체경로의 C3 전환효소(con.vertase)가 되고 보다 많은 C3b를 만들어내는 증폭 과정(amplification phase)에 들어간다. 그 결과 보다 많은 C3 전환효소가 생성되며, 생성된 C3 전환효소와 C3b가 미생물 세포 표면에 결합하여 C3bBb3b 복합체를 형성한다. 형성된 C3bBb3b 복합체는 대체경로의 C5 전환효소 작용을 나타내어, C5를 C5a와 C5b로 분해하고 최종적으로 세균 표면에 MAC을 형성하게 되된다. 그 결과 세균이 죽고 항원이 제거된다. 보체인자 B는 이 대체 경로의 초기 단계인 c3b 단백질과 결합하여 c5 생성에 중요한 역할을 하는 분비 단백질 (secreted protein)로 알려져 있으며 당단백질로서 글라이칸 위치 (glycan site)가 5개가 존재하고 있다.
보체인자 B는 난소암 (Wu.J., et al., JPR, 4541-52, 2012), 상인두암(Seriramalu. R., et al., Electrophoresis, 2388-95, 2010), 유방암 (Doustjalali, S.R., et al., Electrophoresis, 2392-401, 2004) 등의 다양한 환자의 혈청에서 분비된다고 알려져 있다. 그러나, 현재까지 보체인자 B와 카보하이드레이트를 조합하여 췌장암을 진단하고자 하는 시도는 없었다.
따라서, 본 출원은 특이도 및 민감도가 우수한 새로운 췌장암 진단용 바이오 마커인 보체인자 B 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 카보하이드레이트 안티젠 19-9 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 췌장암 진단 키트, 이를 이용하여 췌장암 진단을 위한 정보의 제공 방법 및 이를 이용하여 췌장암을 진단하는 방법을 제공하고자 한다.
본 출원은 개체로부터 분리된 혈액 시료 내의 보체인자 B의 단백질 발현 수준을 측정하는 것을 포함하는 췌장암 진단 방법 및 췌장암 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.
본 출원은 또한 보체인자 B(complement factor B; CFB)의 췌장암 진단 마커로서의 용도를 제공한다. 구체적으로 본 출원은 보체인자 B 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 췌장암 진단용 키트를 제공한다.
한 구체예에서, 보체인자 B 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
서열번호 1:
MGSNLSPQLCLMPFILGLLSGGVTTTPWSLARPQGSCSLEGVEIKGGSFRLLQEGQALEYVCPSGFYPYPVQTRTCRSTGSWSTLKTQDQKTVRKAECRAIHCPRPHDFENGEYWPRSPYYNVSDEISFHCYDGYTLRGSANRTCQVNGRWSGQTAICDNGAGYCSNPGIPIGTRKVGSQYRLEDSVTYHCSRGLTLRGSQRRTCQEGGSWSGTEPSCQDSFMYDTPQEVAEAFLSSLTETIEGVDAEDGHGPGEQQKRKIVLDPSGSMNIYLVLDGSDSIGASNFTGAKKCLVNLIEKVASYGVKPRYGLVTYATYPKIWVKVSEADSSNADWVTKQLNEINYEDHKLKSGTNTKKALQAVYSMMSWPDDVPPEGWNRTRHVIILMTDGLHNMGGDPITVIDEIRDLLYIGKDRKNPREDYLDVYVFGVGPLVNQVNINALASKKDNEQHVFKVKDMENLEDVFYQMIDESQSLSLCGMVWEHRKGTDYHKQPWQAKISVIRPSKGHESCMGAVVSEYFVLTAAHCFTVDDKEHSIKVSVGGEKRDLEIEVVLFHPNYNINGKKEAGIPEFYDYDVALIKLKNKLKYGQTIRPICLPCTEGTTRALRLPPTTTCQQQKEELLPAQDIKALFVSEEEKKLTRKEVYIKNGDKKGSCERDAQYAPGYDKVKDISEVVTPRFLCTGGVSPYADPNTCRGDSGGPLIVHKRSRFIQVGVISWGVVDVCKNQKRQKQVPAHARDFHINLFQVLPWLKEKLQDEDLGFL
한 구체예에서 개체는 췌장암이 의심되는 환자일 수 있다.
한 구체예에 있어서, 개체로부터 분리된 혈액 시료 내의 보체인자 B의 단백질 발현 수준을 정상 대조군 내의 보체인자 B의 단백질 발현 수준과 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 명세서에서, 정상 대조군은 췌장암 기타 질병이 없는 건강한 개체로부터 분리된 혈액 시료를 의미한다. 췌장암 두 시료를 비교하여 췌장암 의심 환자의 시료의 보체인자 B의 단백질 발현 수준이 정상 대조군 시료의 보체인자 B의 단백질 발현 수준보다 높은 경우 상기 후보 환자를 췌장암 환자로 분류할 수 있다. 예를 들어, 췌장암 후보 환자의 시료의 보체인자 B 단백질 수준이 정상 대조군 시료의 보체인자 B 단백질 수준보다 2배 이상 높은 경우 상기 후보 환자를 췌장암 환자로 분류할 수 있다.
한 구체예에서, 혈액 시료는 전혈, 혈장 또는 혈청 시료일 수 있다.
본 출원에서 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 출원의 목적에 비추어, 진단은 췌장암의 생성 및 재발 여부를 확인하는 것이다.
본 출원에서 용어 "진단용 마커" 또는 "진단 마커"는 암 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 암을 가진 세포에서 증가 또는 감소하는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 출원의 목적에 비추어, 췌장암 진단 마커는 정상 췌장 조직의 세포에 비하여, 췌장암 세포에서 특이적으로 높은 수준의 발현을 보이는 CA 19-9 및/또는 보체인자 B의 유전자 및 이에 의해 코딩되는 단백질이다.
본 출원에서 용어 "단백질 발현 수준 측정"이란 암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 암 마커 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인한다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블럿(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 "특이적으로 결합하는"이란 결합에 의해 타겟 물질의 존재 여부를 검출할 수 있을 정도로, 다른 물질에 비하여 타겟 물질에 대한 결합력이 뛰어남을 의미한다.
본 출원에서 "항체"는 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자들, 또는 이것의 단편으로부터 유래되거나 이를 본떠서 만든 실질적으로 이에 의해 암호화된 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 나타낸다. 본 출원에서 항체는 전체 항체 및 항체 단편을 포함하며 이에 제한되지 않는 다양한 형태의 항체 구조를 포함한다. 항체 단편은 전체 길이의 항체의 일부분, 항체의 가변 도메인, 또는 적어도 항체의 항원 결합 부위를 포함한다. 항체 단편의 예는 다이아바디(diabody), 단일-쇄 항체 분자 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
한 구체예에서, 항체는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 보체인자 B 단백질에 대한 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 보체인자 B 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.
본 출원에서 용어, "민감도(sensitivity)"란 해당 질환에 걸렸을 때 그 진단 검사 결과가 양성으로 나타나게 될 확률을 나타내며, "특이도(specificity)"란 어떤 질환에 걸려 있지 않을 경우 검사 결과가 음성이 될 가능성의 정도를 나타낸다.
췌장암 진단용 마커의 후보물질로 보체인자 B 단백질을 선정하고 정상인 및 췌장암 환자의 혈장에서 보체인자 B 단백질의 존재를 확인하고 변화를 관찰하였다. 그 결과, 보체인자 B의 단백질 발현 수준이 췌장암 환자의 혈장에서 정상 대조군에 비해 매우 높다는 것을 확인할 수 있었다 (실시예 1 및 실시예 2). 또한, 기존에 췌장암 진단용 마커로 알려진 CA 19-9와 비교하였을 때, CFB의 췌장암 진단용 마커로서의 효용성을 검증하고자, ELISA 및 ROC(Receiver Operating Characteristic) 곡선 분석을 수행하였고, 이들의 최적 컷-오프 값에 기초하여 CFB 및 CA 19-9 각각의 민감도 및 특이도를 분석하였다 (실시예 3 내지 6). 그 결과, CA 19-9는 췌장암을 비롯하여 간암, 담관암 및 위암에서도 발현이 증가하여, 특이도가 떨어짐을 알 수 있었다. 즉, 이는 CA 19-9 단독으로는 췌장암 진단 마커로 사용하기에 부적합함을 의미한다. 그러나, CFB는 췌장암에서만 특이적으로 발현이 증가하였고, 민감도 및 특이도가 우수하여 췌장암 진단용 마커로 적합함을 의미한다.
한편, CA 19-9 단독으로는 췌장암 진단 마커로서 특이도가 떨어지는 문제가 있으나, CA 19-9를 CFB와 함께 사용하였을 때는, 민감도 및 특이도가 가장 우수함을 알 수 있었다. 이는 CA 19-9 단독의 경우 췌장암 진단을 위한 마커로 사용하기에 적합하지 않으나, CFB와 함께 사용한 경우, 더욱 정확하게 췌장암을 진단할 수 있음을 의미한다.
따라서, 한 구체예에서, 상기 키트는 카보하이드레이트 안티젠 19-9에 특이적으로 결합하는 항체를 추가로 포함할 수 있다.
본 출원은 또한 개체로부터 분리된 혈액 시료 내의 보체인자 B 및 카보하이드레이트 안티젠 19-9의 단백질 발현 수준을 측정하는 것을 포함하는 췌장암 진단 방법 및 췌장암 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.
한 구체예에서, 개체는 췌장암 의심 환자군일 수 있다.
한 구체예에 있어서, 췌장암 의심 환자로부터 분리된 혈액 시료 내의 보체인자 B 및 CA 19-9의 단백질 발현 수준을 정상 대조군 내의 보체인자 B 및 CA 19-9의 단백질 발현 수준과 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 두 시료를 비교하여 췌장암 의심 환자의 시료의 보체인자 B 및 CA 19-9의 단백질 발현 수준이 정상 대조군 시료의 보체인자 B 및 CA 19-9의 단백질 발현 수준보다 모두 높은 경우 상기 후보 환자를 췌장암 환자로 분류할 수 있다. 예를 들어, 췌장암 의심 환자의 시료의 보체인자 B 단백질 수준이 정상 대조군 시료의 보체인자 B 단백질 수준보다 2배 이상 높고, 췌장암 의심 환자의 시료의 CA 19-9의 농도가 37U/ml 이상인 경우 상기 췌장암 의심 환자를 췌장암 환자로 분류할 수 있다.
한 구체예에서, 혈액 시료는 전혈, 혈장 또는 혈청 시료일 수 있다.
본 출원은 또한, 췌장암 진단용 바이오마커로서 보체인자 B 및 카보하이드레이트 안티젠 19-9의 단백질 발현 수준을 측정하는 것을 포함하는 췌장암 진단 방법에 있어서,
개체로부터 혈액 시료를 수집하는 제1단계;
바이오마커에 특이적으로 결합하고 검출 가능하게 표지된 항체에 상기 혈액 시료를 접촉하여 상기 항체 및 상기 바이오마커의 복합체를 형성하는 제2단계;
복합체를 포함하지 않는 표지된 항체로부터 상기 제2단계에서 형성된 복합체를 분리하는 제3단계;
상기 제2단계에서 형성된 복합체를 포함하는 항체의 검출 가능한 표지로부터 신호를 정량하여 상기 혈액 시료 내의 바이오마커의 양을 측정하는 제4단계;
상기 제4단계에서 측정된 바이오마커의 양과 대조군 바이오마커의 양을 비교하는 제5단계; 및
상기 제5단계에서, 시료에서 바이오마커의 양이 대조군 바이오마커의 양보다 많은 경우 췌장암으로 진단하는 제6단계를 포함하는 췌장암 진단 방법을 제공한다.
여기에서, 바이오마커는 보체인자 B 또는 카보하이드레이트 19-9를 의미한다.
상기 제4단계에서, 바이오마커-항체 복합체의 검출 가능한 표지로부터의 신호는 혈액 시료 내의 바이오마커의 양과 비례하므로, 이로부터 상기 바이오마커의 양을 알 수 있다.
한 구체예에서, 대조군 바이오마커의 양은 췌장암이 없는 개체의 혈액 시료 내의 바이오마커의 양을 의미한다.
한 구체예에서, 혈액 시료는 전혈, 혈장 또는 혈청 시료일 수 있다.
한 구체예에서, 상기 제1단계와 제2단계 사이에, 면역 침강에 의하여 혈액 시료 내의 바이오마커 외의 단백질과 바이오마커를 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 바이오마커 외의 단백질과 바이오마커를 분리하는 단계는
i) 개체로부터 분리한 혈액 시료를 바이오마커에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉하여 상기 항체와 상기 바이오마커 사이에 복합체를 형성하는 단계;
ii) 상기 i) 단계에서 형성된 복합체를 침강시키는 단계;
iii) 바이오마커 외의 다른 단백질 및 복합체를 형성하지 않은 항체를 포함하는 시료의 상청액으로부터 침강된 복합체를 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 따라 췌장암으로 진단되는 경우, 개체에게 췌장암 치료제를 처리하는 것을 포함하는 췌장암 치료 방법을 제공한다. 췌장암 치료제는 췌장암 치료 효과가 있다고 알려진 공지의 약물을 제한 없이 이요할 수 있다.
본 출원에 따르면 민감도 및 특이도가 향상된 췌장암 진단용 마커를 제공할 수 있다.
도 1a는 정상인 혈장에 대한 2차원 전기영동 이미지를, 도 1b는 췌장암 환자의 혈장에 대한 2차원 전기영동 이미지를 보여준다. 화살표가 가리키는 스팟은 보체인자 B 단백질을 의미한다.
도 2는 정상인 혈장과 췌장암 환자의 혈장에서 보체인자 B의 발현 차이를 나타낸 것으로 도 1a 및 도 1b의 스팟(검은점) 부분의 2차원 수직 전기영동 이미지를 보여준다.
도 3a는 정상인과 췌장암 환자 혈장의 보체인자 B의 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯으로 분석한 결과를 보여준다 (N: 정상인, C: 췌장암 환자).
도 3b는 도 3a의 웨스턴 블롯 밴드의 강도를 나타낸 그래프이다.
도 4a는 정상 세포주(HPDE)와 췌장암 세포주(HPAC1, BXPC3, PANC1)에서 보체인자 B의 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯으로 분석한 결과를 보여준다.
도 4b는 정상 세포주(HPDE)와 췌장암 세포주(HPAC1, BXPC3, PANC1)에서 보체인자 B의 단백질 발현 수준을 RT-PCR로 분석한 결과를 보여준다.
도 4c는 도 1b의 밴드 강도를 나타낸 그래프이다.
도 5a는 웨스턴 블롯에 의한 보체인자 B(CFB)의 단백질 발현 수준을 분석한 결과이다. HD는 정상, CP는 췌장염, PC는 췌장암을 나타낸다.
도 5b는 도 5a의 웨스턴 블롯 밴드의 강도를 나타낸 그래프이다. HD는 정상, CP는 췌장염, PC는 췌장암을 나타낸다.
도 6은 다양한 암에 있어서, CFB 및 CA 19-9의 발현 수준을 ELISA에 의하여 분석한 결과를 보여준다 (a: CFB, b: CA 19-9). HD는 정상, CP는 췌장염, PC는 췌장암, HCC는 간암, CC는 담관암 및 GC는 위암을 나타낸다.
도 7은 CA 19-9, CFB 및 CFB + CA 19-9의 ROC 곡선을 보여준다.
이하에서, 본 출원을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 출원을 예시하는 것일 뿐 본 출원의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 보체인자 B(CFB)의 단백질 발현 수준 분석
[실시예 1-1] 전기영동 및 질량분석에 의한 혈장에서의 CFB 단백질 검출
정상인 및 췌장암 환자의 혈장에서 CFB의 존재 및 양을 검출하고자, 전기영동 및 질량분석을 수행하였다.
혈장의 수득은 세브란스 병원 유전자 은행과 소화기 내과로부터 공급받았고, 임상시험위원회(IRB) 규정에 따랐다. 혈장시료는 200μl씩 분주하여 -70°C에서 실험전 까지 보관하여 사용하였다. 보체 인자 B는 분비 단백질 (secreted protein)이고, 혈장에는 알려져 있는 많은 양의 단백질들 (high abundance proteins)이 존재하고 있기 때문에 Hu-14 (Agilent)를 이용하여 보체 인자 B 외의 단백질들을 제거 한 후, 2차원 형광 전기영동을 수행하였다. 2차원 전기영동을 위하여, 10명의 정상인 혈장 및 10명의 췌장암 환자 혈장의 시료에 대하여 각 분석시료와 그에 해당하는 표준시료 50 μg은 형광염료인 400 pmol Cy3, Cy5, Cy2 (GE Healthcare)로 암흑 조건에서 30분간 표지시켰고, 1 μL 10 mM 라이신(lysine)으로 반응을 정지시켰다. 형광 염료로 각각 표지된 3개의 시료는 서로 혼합시켜 최종 450 μL가 되도록 시료완충용액[6 M 우레아, 2 M 티오우레아, 4% 챕스, 60 mM 디티오트레이톨(dithiothreitol; DTT), 30 mM 트리스, pH 8.5]을 첨가하였고, 2% IPG 4-7NL 완충용액과 함께 상온에서 16시간 동안 재수화(rehydration)시켰다. 등전집속(isoelectric focusing; IEF)은 이모빌린 드라이스트립(Immobiline DryStrip) pH 4-7NL(GE Healthcare)을 사용하여 MultiPhor II 전기영동(electrophoresis) 시스템(GE Healthcare)에서 최적요건인 95,000 V까지 올려 실시 하였고, 트리부틸포스핀(Tributylphosphine) 완충용액[6 M 우레아, 2% 황산염(Sodium dodecyl sulfate, SDS), 30 mM 트리스, 20% 글리세롤(glycerol), 2.5% 아크릴아미드 용액(acrylamide solution), 5 mM 트리부틸포스핀]으로 25분 동안 원-스텝 환원 및 알킬화하였다.
정상인 혈장에 대한 2차원 전기영동 결과를 도 1a에 도시하고, 췌장암 환자의 혈장에 대한 2차원 전기영동 결과를 도 1b에 도시하였다. 도면 내의 화살표는 CFB를 나타낸다. 그 결과, 췌장암 환자에 있어서, CFB의 발현이 증가함을 알 수 있었다.
또한, 정상인과 췌장암 환자의 혈장에서, CFB의 발현 차이를 알아 보기 위하여, 2차 수직전기영동을 수행하였다. 2차 수직전기영동은 Ettan Dalttwelve 전기영동시스템(GE Healthcare)을 사용하여 9%~16% 폴리아크릴아마이드겔을 사용하여 분리하였고, 전기영동이 끝난 후 Typhoon 9400(GE Healthcare) 스캐너를 이용하여 Cy2, Cy3, Cy5에 해당하는 파장으로 스캔하였다. 각 겔 이미지는 DeCyder 2-D 분석소프트웨어(GE Healthcare)를 이용하여 분석하였다.
그 결과, 2차원 전기영동 결과와 마찬가지로, 췌장암 환자에 있어서, CFB의 발현이 증가함을 알 수 있었다 (도 2).
이미지 분석 후, CFB의 존재를 확인하기 위하여 도 1a 및 도 1b의 화살표가 가리키는 스팟에 대하여 질량 분석을 수행하였다. 단백질 스팟은 쿠마시블루(Coomassie blue) 염료로 염색된 겔로부터 피킹(picking)하였고, 탈색하여 트립신으로 절단(digestion)한 후, 절단된 펩티드들은 포로스(Poros) R2 및 올리고(Oligo) R3 레진(resin) 혼합물을 사용하여 탈염(desalting)시켰다. 단백질 동정은 Q-TOF (Agilent)으로 분석하였으며, Q-TOF-MS로 얻은 스펙트럼은 MASCOT 데이터베이스를 이용하여 동정하였다.
그 결과, 하기 표 1에 도시한 바와 같이, 도 1a 및 도 1b의 화살표가 가리키는 스팟이 CFB임을 확인할 수 있었다.
[표 1]
Figure PCTKR2014008242-appb-I000001
[실시예 1-2] 혈장 내에서의 CFB 단백질 발현 수준 분석
췌장암 환자 혈장에서의 CFB 단백질 발현 수준을 분석하기 위하여, 면역 블롯을 수행하였다. 10명에 대한 정상인 혈장과 10명의 췌장암 환자 혈장에서 동일한 단백질 양으로부터 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 혈장 단백질 10μg을 10% SDS-PAGE 분석 후 웨스턴 블롯을 위해 겔 전체를 니트로셀루로오스(nitrocellulose; NC) 막으로 전환(transfer)한 후 5% 탈지유(skimmed milk)가 포함된 TBS-T 완충용액 [20 mM 트리스, 137 mM 염화나트륨, 0.1% 트윈20(Tween-20), pH 7.6]으로 1시간동안 블로킹하였다. 항-보체인자 B 항체(CFB, Abcam)를 5% 탈지유가 포함된 TBS-T 완충용액에 1:1000배씩 희석하여 1차 처리하고 항-마우스(mouse) IgG-HRP (Santa Cruz)를 1:10000배를 2차 처리하였다. 최종 NC막은 ECL Plus 웨스턴 블롯 시약(GE Healthcare)으로 1분간 반응시켰고, Typhoon 9400 스캐너로 스캔하여 분석하였다.
그 결과, 도 3a에 도시한 바와 같이, 췌장암 환자군에서 CFB의 발현이 증가함을 알 수 있었다.
도 3a의 결과를, 밴드 강도(Band intensity)를 통해 fold ratio를 분석한 결과, 정상군에 비해 췌장암 환자의 혈장에서 CFB가 높게 발현하는 것을 확인하였다(도 3b).
[실시예 1-3] 췌장암 세포 내에서의 CFB 발현 수준 분석
췌장암 세포주에서의 CFB 발현 수준을 확인하기 위해 웨스턴 블롯과 RT-PCR을 수행하였다. 정상 세포주로는 HPDE (human pancreatic duct epithelial cell)를 사용하였고, 췌장암 세포주로는 HPAC1, BXPC3 (human pancreas adenocarcinoma epithelial cell), PANC1 (human pancreas epithelioid carcinoma)을 사용하였다. 각각의 세포 용해물(cell lysate) 1mg을 사용하여 항-보체 인자 B 항체 2ug, 단백질 G 아가로즈 10ul를 함께 1ml 튜브에서 2시간 동안 면역 침강 시킨 후 웨스턴 블롯을 통해 정상 세포와 췌장암 세포 내에서의 CFB 발현 수준을 확인 하였다. 그 결과, CFB가 정상 세포에서는 검출되지 않고 췌장암 세포에서만 검출되는 것을 확인하였다(도 4a).
다음은 RT-PCR을 이용하여 CFB의 mRNA 발현 수준을 확인하였다. 총 RNA는 easy-BLUE (iNtRON, Gyeonggi, Korea) 를 사용하여 추출하였고, cDNA은 옴니스크립트 RT 키트(omniscript RT kit; Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 합성하였다. 사용된 프라이머는 다음과 같다:
CFB 프라이머 (서열번호 2): 5'-CAACAGAAGCGGAAGATCGTC-3' (포워드)
CFB 프라이머 (서열번호 3):5'-TATCTCCAGGTCCCGCTTCTC-3' (리버스)
GAPDH 프라이머 (서열번호 4): 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3' (포워드)
GAPDH 프라이머 (서열번호 5): 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' (리버스)
PCR 조건은 35 사이클, 변성(denaturation) 94℃ 1분, 어닐링 59℃ 1분, 프라이머 신장(primer extension) 72℃ 1분으로 하였다. 그 결과 웨스턴 블롯 데이터와 마찬가지로 정상 세포에서는 CFB가 거의 검출되지 않고 췌장암 세포에서만 CFB가 검출이 되는 것을 확인하였다(도 4b). 도 1b의 결과를, 밴드 강도(Band intensity)를 통해 fold ratio를 분석해 본 결과, 정상 세포주에 비해 췌장암 세포주에서 CFB가 높게 발현하는 것을 확인하였다(도 4c).
[실시예 2] 다수의 샘플을 이용한 보체인자 B(CFB)의 단백질 발현 수준 분석
CFB가 바이오마커 후보로서의 확실한 가능성을 알아보기 위해 독립적이고 대규모 환자 집단(large patient cohorts)를 사용하여 추가 확인 실험을 수행하였다.
정상인 44명, 췌장염 환자 12명, 췌장암 환자 40명의 혈장을 사용하였고, 표준으로 정상인 혈장은 풀링(pooling)한 샘플을 사용하여 실시예 1-3과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하였다. 그 결과 HD와 CP에 비해 PC에서 CFB가 높게 발현하는 것을 확인 할 수 있었고(도 5a) 이 웨스턴 블롯 밴드들의 강도(intensity)를 점으로 나타낸 결과 p < 0.05로 HD와 CP에 비해 PC에서 CFB가 높게 발현하는 것으로 나타났다(도 5b). 따라서 대규모 환자 집단을 사용하고 독립적인 실험을 했을 때에도 CFB가 유의적인 값으로 HD와 CP에 비해 PC에서 2 배 정도 높게 발현하고 있는 것을 확인 할 수 있었다.
[실시예 3] ELISA에 의한 다양한 암 환자에서 CFB 및 CA 19-9의 단백질 발현 수준 분석
현재 췌장암 바이오 마커로 알려져 있는 CA 19-9와 CFB의 발현 수준을 비교하기 위하여 HD, CP, PC, HCC, CC, GC의 혈장을 사용하여 ELISA 테스트를 수행하였다. CFB와 CA 19-9 ELISA KIT는 각각 USCN과 Panomics 제품을 사용하였고 각 제품마다 각각의 프로토콜에 따라 실험을 수행하였다.
먼저 CFB ELISA의 경우 각각의 혈장들을 1:10,000로 희석한 후 CFB에 대한 항체가 깔려 있는 웰에 각각 100ul씩 넣어주었다. 2시간 상온에서 인큐베이션하였다. 그 후, 웰에서 혈장을 제거하고 100ul의 검출 시약 A 워킹 용액(working solution)을 넣어준 후 상온에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 1시간 후, 용액을 웰에서 제거 한 후, 350ul의 세척 용액을 넣어 3번 반복해서 세척하였다. 그 후 각각의 웰에 100ul의 검출 시약 B 워킹 용액을 넣고 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 세척 용액으로 5회 세척하였다. 그 후 90ul의 기질 용액(substrate solution)을 각각의 웰에 넣어준 후 15분 동안 다크 조건에서 반응시켰고 그 이후 50ul의 정지 용액(stop solution)을 넣어 준 후 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450mm에서 정량하였다. 이들 그룹에서 CFB의 발현 수준은 34.0 (범위: 26.1-41.3), 73.5 (범위: 62.3-77.1), 92.0 (범위: 75.2-121.6), 37.0 (범위: 28.8-47.5), 41.5 (범위: 29.1-52.1), 63.0 (범위: 56.3-72.9) ng/ml로 나타났다(도 6a).
CA 19-9 ELISA의 경우 CA 19-9 항체가 깔려있는 플레이트에 각각의 혈장을 10ul씩 넣어주고 100ul CA 19-9 어세이 버퍼를 그 위에 넣어주었다. 그 후 30초 동안 잘 섞어 준 후 상온에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 웰에서 버퍼를 제거하고 워시 버퍼(wash buffer)를 사용하여 4번 반복 세척하였다. 그 후, 워킹 컨쥬게이트 시약(working conjugate reagent) 100ul를 각각의 웰에 넣어주고 30초 동안 잘 섞어 준 후 상온에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 시약을 웰에서 제거하고 워시 버퍼를 사용하여 4번 반복 세척하였다. 그 후, TMB를 각각의 웰에 넣어주고 10초간 섞어 준 후 다크 조건에서 20분 동안 반응시켰다. 그 후, 100ul의 정지 용액(stop solution)을 넣어 준 후 30초 동안 섞어 주고 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450mm에서 정량하였다. 이들 그룹에서 CA 19-9의 수준은 각각 4.6 (범위: 2.8-7.2), 10.2 (범위: 6.0-21.4), 298.8 (범위: 111.4-832.6), 50.5 (범위: 18.1-159.5), 137.5 (범위: 53.8-537.9), 10.0 (범위: 9.4-16.7) U/ml로 나타났다(도 6b). CFB의 혈장 내 발현 수준은 CA 19-9와 마찬가지로 비-PC 군 (HD, CP, HCC, CC, GC)보다 PC 군에서 특히 높게 발현되었다 (p < 0.002). 또한 CFB의 경우 CA 19-9와 비교하여, PC와 비-PC 환자를 더 잘 구별해 내는 것으로 나타났다. (p < 0.0001).
이는 CA 19-9 단독으로는 췌장암 진단 마커로 사용하기에 부적합한 반면에, 췌장암에서만 특이적으로 발현이 증가하는 CFB는 췌장암 진단용 마커로 적합함을 의미한다.
[실시예 4] 췌장암 진단에 있어서, ROC(Receiver Operating Characteristic) 곡선에 의한 CFB 및 CA 19-9의 민감도 및 특이도 분석
CFB와 CA 19-9이 췌장암 환자와 아닌 사람 (HD, CP, HCC, CC, GC)을 얼마나 잘 구별해 내는지를 확인하기 위해 Mann-Whitney rank sum test 프로그램을 이용하여 ROC 곡선 분석을 수행하였다. AUC 밸류를 통해 CFB와 CA 19-9를 비교하였다. 그 결과 CFB의 경우 0.958 (95% CI: 0.956-0.959)으로 CA 19-9의 0.833 (95% CI: 0.829-0.837) 보다 AUC 값이 더 높게 나타났다. 두 가지 (CFB + CA 19-9)를 조합하였을 때의 AUC는 0.986 (0.985-0.986)으로 CFB와 CA 19-9 (p < 0.01)을 단독으로 사용했을 때 보다 상당히 높은 AUC 값을 나타냈다 (도 7).
이는, CFB 단독 또는 CFB 및 CA 19-9의 조합에 의해 췌장암을 진단할 수 있음을 의미한다.
[실시예 5] CFB 및 CA 19-9의 최적 컷-오프 값(cut-off value)에 기초한 췌장암 진단
각각의 그룹 별로 (HD; 정상, CP; 췌장염, PC; 췌장암, HCC; 간암, CC; 담관암, GC; 위암) CA 19-9와 CFB의 진단 효율을 확인하였다. 그 결과, 하기 표 2에 도시한 바와 같이, CA 19-9와 CFB 모두 PC에서 비슷한 진단 효율을 보였다 (CA 19-9: 80.5%, CFB: 73.2%). 하지만 CA 19-9의 경우 다른 암(HCC, CC, GC)에서도 높은 진단 효율(HCC: 61.3%, CC: 77.2%, GC: 17.1%)을 보인 반면 CFB는 다른 암들에서는 낮은 진단 효율을 보였다(HCC: 0%, CC:0%, GC: 8.6%). 이것은 다른 암과 비교했을 때 CFB가 CA 19-9보다 PC에 더욱 특이적임을 의미한다.
[표 2]
Figure PCTKR2014008242-appb-I000002
[실시예 6] CFB 및 CA 19-9의 민감도와 특이도 확인
CFB, CA 19-9 및 CFB + CA 19-9의 췌장암 진단 지표로서의 정확도를 평가하기 위하여, 최대 유덴 인덱스(maximum Youden index)에 의해 예측된 최적 컷-오프 값에 따른 CA 19-9, CFB 및 CFB + CA 19-9의 다른 질병과 비교한 췌장암 진단의 민감도 및 특이도(%)를 확인하였다. 그 결과, 하기 표 3에 나타낸 바와 같이, PC와 다른 군 (HD, CP, HCC, CC, GC)을 비교하였을 때 CA 19-9의 민감도는 80.4%, 특이도 는 70.0%로 나타났고 CFB는 민감도 73.1%, 특이도 97.9%로 나타났다. 그리고 CFB와 CA 19-9를 조합하였을 때에는 민감도 90.1%, 특이도 97.2%로 나타났다. 이는, CA 19-9와 CFB를 단독으로 사용한 경우에 비하여, CA19-9와 CFB를 조합하였을 때에 더 좋은 진단 효율이 나타남을 의미한다.
[표 3]
Figure PCTKR2014008242-appb-I000003

Claims (13)

  1. 개체로부터 분리된 혈액 시료 내의 보체인자 B 및 카보하이드레이트 안티젠 19-9의 단백질 발현 수준을 측정하는 것을 포함하는 췌장암 진단을 위한 정보의 제공 방법.
  2. 제1항에 있어서, 개체로부터 분리된 혈액 시료 내의 보체인자 B 및 카보하이드레이트 안티젠 19-9의 단백질 발현 수준을 정상 대조군 내의 보체인자 B 및 카보하이드레이트 안티젠 19-9의 단백질 발현 수준과 각각 비교하는 단계를 추가로 포함하는 췌장암 진단을 위한 정보의 제공 방법.
  3. 제1항에 있어서, 혈액 시료는 전혈, 혈장 또는 혈청 시료인 췌장암 진단을 위한 정보의 제공 방법.
  4. 제1항에 있어서, 보체인자 B 및 카보하이드레이트 안티젠 19-9의 단백질 발현 수준은 2차원 형광전기영동, 웨스턴블롯팅, ELISA, 방사선 면역분석, 방사면역확산법, 면역전기영동 또는 질량분석을 이용하여 측정하는 것인 췌장암 진단을 위한 정보의 제공 방법.
  5. 보체인자 B에 특이적으로 결합하는 항체 및 카보하이드레이트 안티젠 19-9에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 췌장암 진단용 키트.
  6. 제5항에 있어서, 보체인자 B는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 췌장암 진단용 키트.
  7. 제5항에 있어서, 항체는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체인 췌장암 진단용 키트.
  8. 췌장암 진단용 바이오마커로서 보체인자 B 및 카보하이드레이트 안티젠 19-9의 단백질 발현 수준을 측정하는 것을 포함하는 췌장암 진단 방법에 있어서,
    개체로부터 혈액 시료를 수집하는 제1단계;
    바이오마커에 특이적으로 결합하고 검출 가능하게 표지된 항체에 상기 혈액 시료를 접촉하여 상기 항체 및 상기 바이오마커의 복합체를 형성하는 제2단계;
    복합체를 포함하지 않는 표지된 항체로부터 상기 제2단계에서 형성된 복합체를 분리하는 제3단계;
    상기 제2단계에서 형성된 복합체를 포함하는 항체의 검출 가능한 표지로부터 신호를 정량하여 상기 혈액 시료 내의 바이오마커의 양을 측정하는 제4단계;
    상기 제4단계에서 측정된 바이오마커의 양과 대조군 바이오마커의 양을 비교하는 제5단계; 및
    상기 제5단계에서 시료에서 바이오마커의 양이 대조군 바이오마커의 양보다 많은 경우 췌장암으로 진단하는 제6단계를 포함하는 췌장암 진단 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    대조군 바이오마커의 양은 췌장암이 없는 개체의 혈액 시료 내의 바이오마커의 양인 췌장암 진단 방법.
  10. 제8항에 있어서,
    혈액 시료는 전혈, 혈장 또는 혈청 시료인 췌장암 진단 방법.
  11. 제8항에 있어서,
    제1단계와 제2단계 사이에,
    면역 침강에 의하여 혈액 시료 내의 바이오마커 외의 단백질과 바이오마커를 분리하는 단계를 추가로 포함하는 췌장암 진단 방법.
  12. 제11항에 있어서, 바이오마커 외의 단백질과 바이오마커를 분리하는 단계는
    i) 개체로부터 분리된 혈액 시료를 바이오마커에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉하여 상기 항체와 상기 바이오마커 사이에 복합체를 형성하는 단계;
    ii) 상기 i) 단계에서 형성된 복합체를 침강시키는 단계;
    iii) 바이오마커 외의 다른 단백질 및 복합체를 형성하지 않은 항체를 포함하는 시료의 상청액으로부터 침강된 복합체를 분리하는 단계를 포함하는 췌장암 진단 방법.
  13. 제8항의 방법에 따라 췌장암으로 진단되는 경우, 개체에게 췌장암 치료제를 처리하는 것을 포함하는 췌장암 치료 방법.
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