JPS63159763A - 逆受身凝集反応試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、消化器癌、特に膵穢癌の診断に重要な手がか
りとなる糖鎖抗原ＣＡ１９−９の検出用逆受身凝集反応
試薬に関する。

〔従来の技術〕

ＣＡ１９−９の検出方法として、酵素免疫測定法および
放射免疫測定法が開発されている。

しかし、これらの方法は操作が煩雑であったり、時間が
かかったシまた特別な測定機器を必要とするためＣＡ１
９−９を簡便かつ安価に測定する方法としては採用しが
たい。

そこで凝集反応を採用することにより前記欠点を克服す
ることができる。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明者等は、抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体（Ｉ
ｇ−Ｇクラス）として知られている（％公表昭５９−５
０１５１９参照）　Ｎ５１９−９抗体と同様の親和性と
特異性を有するＩｇＧクラスの抗ＣＡ１９−９モノクロ
ーナル抗体を作成して逆受身凝集反応試薬を作成したが
目的の感度が得られずＣＡ１９−９検出用逆受身凝集反
応試薬としては使用できなかった。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者等は、従来知られていなかったＣＡ１９−９を
認識するＩｇＭクラスのモノクローナル抗体を新たに見
出し、このモノクローナル抗体を使用することによシ、
スクリーニング・試薬として必要かつ十分な感度を有す
る逆受身凝集反応試薬をつくることに成功し、本発明を
完成するに至った。

本発明は、認識する抗原決定基がＣＡ１９−９であルＩ
ｇＭクラスのモノクローナル抗体を担体粒子に感作させ
てなる逆受身凝集反応試薬である。

従来、受身凝集反応、例えば血液型の判定において、Ｉ
ｇＭ抗体を用いた例は知られている（松橋−直、浅用英
男“免疫血清学”Ｐ２Ｏ，１９３９ｍ談社サイエンティ
フィック）。しかし、逆受身凝集反応にＩｇＭクラスの
モノクローナル抗体を使用した例は未だ知られていない
。本発明者等は、ＨＢＩ抗原を検出するＩｇＭクラスモ
ノクローナル抗体として知られている５Ｄ３（特公表昭
５７−５０１４９３）と同等の高い親和性を有するＩｇ
Ｍクラスのモノクローナル抗体を作成し、それを用いて
受身凝集反応と逆受身凝集反応行って両者を比較検討し
たところ、Ｈ８Ｉ抗原を吸着した血球はこの抗体によシ
容易に凝集し、　ＩｇＧクラスのモノクローナル抗体に
比べ１７１０〜１／１００程度の量で凝集同程度の凝集
力価を示した。しかし逆受身凝集反応においては、Ｉｇ
Ｍクラスのモノクローナル抗体は％プリクローナル抗体
及びＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を用いたときよ
シカ価が低下し、感度の上昇は認められなかった。この
ことは、同じＩｇＭクラス七ツクツクローナル抗体身凝
集反応と逆受身凝集反応とでは異った結果をもたらし、
　　ＩｇＭ抗体が凝集反応全てに有効ではないととを示
している。

本発明において使用する認識する抗原決定基がＣＡ１９
−９であるＩｇＭクラスのモノクローナル抗体は、以下
の方法で作成した。

培養した胃癌由来細胞株ＫＡＴＯ−Ｉｎの上清１ｒＡ／
’ｖ’過によシ精製し、得られた高分子糖蛋白質を免疫
抗原とし、これをフロインドコンデリートアジエパント
とともにＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫した。１力月後に追
加免疫し、３日後に膵臓細胞を取シ出し、／　ジエチレ
ングリコール法によシマウスミエローマＰ３ｕｌ細胞と
細胞融合を行った後、抗原決定基ＣＡ１９−９を認識す
るＩｇＭクラスのモノクローナル抗体をクローニングし
た。得られたモノクローナル抗体の性質を調べた。

市販のＣＡ１９−９　Ｅ４Ａ検査試薬「イムノクロンＣ
Ａ１９−９　Ｊ　（富士レビオ株製）の力価がＫＡ３Ａ
３によシ阻害されること、ＫＡ３Ａ３　ｔ−使用したＥ
ＬｒｓＡ法とＣＡ１９−９　ＥＩＡによる測定値が互い
によく相関するととなどの点からＫＡ３Ａ３はＣＡ１９
−９を認識するモノクローナル抗体であることを確認し
た。

モノクローナル抗体を感作させる担体粒子は通常の逆受
身凝集反応用のものを用いればよく、ヒト、羊、ニワト
リ等の動物の赤血球、セラチア菌などの微生物画体、ゼ
ラチン粒子（特開昭５７−１５３６５８号）、ポリスチ
レンラテックス、カオリン、炭末などを使用することが
できる。

抗体を担体粒子に感作する方法も一般の抗体を感作する
方法によればよく、例えば、タンニン酸、ゲルタールア
ルデヒド、ビスシアｌベンジジン、トリレンジイソシア
ナート、ジフロロジニトロベンゼン、カルボジイミド類
、キノン類、及び塩化クロム等のいわゆるカップリング
剤を使用する方法あるいは物理吸着法などによって行な
うことができる。

こうして得られた抗体感作粒子は通常は常法により凍結
乾燥し、復元液、血清希釈用液、標準血清、未感作担体
、非特異反応吸収液などと組合せて測定に供される。

本発明の試薬を用いてＣＡ１９−９を測定する方法も逆
受身凝集反応を利用した測定方法の常法に準じて行えば
よく、例えば、マイクログレートのウニ察すればよい。

この方法のほか、例えば被検血清と感作粒子をスライド
板上で混ぜ合わせ、１〜３分後の凝集状態を観察するこ
ともできる。

本発明の試薬を利用した測定方法は簡便であシ、特殊な
装置を必要としないところから何処でも容易に実施しう
るという利点がある。

〔効果〕

本発明の試薬はＣＡ１９−９を高感度で正確に測定でき
るので消化器癌殊に膵臓癌の診断に有用である。

ＣＡ１９−９は通常３７μ鷹をカットオフ値とし、３７
〜１００μ鷹では消化器癌以外の膵炎、肝炎を検出する
場合があり、１００μへ以上では癌である確率が高いと
言われている。本発明の試薬はこれらの診断薬として、
　ＥＩＡ　、　ＲＩＡ等に比べ同等の検出能力を有し、
かつ極めて簡便に用いることができる。

〔実施例〕

実施例１（モノクローナル抗体の調製と特異性）１、免
疫用抗原の！！１製 胃癌由来株化癌細胞ＫＡＴＯ−Ｉ１１をカルチャーｙ３
４’）ル内で単層培養した後、無血清ＲＰＭＩ−１６４
０培地にて２回洗浄し、血清蛋白質を除去した。１時間
無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地で培養後、新しい培地に
交換し２０時間無血清培％を行い、培養上清を回収した
。この上清を目処２０００で濃縮後、セファローズ４Ｂ
ａカラムを用い、グル口過を行った。？イドが９為−ム
（Ｖｏｉｄ　Ｖｏｌｃｕｎｏ　）付近に溶出される高分
子画分を免疫原として用いた。免疫はフロイドコンプリ
ートアジ−パントと混和後、マウス腹腔内に免疫した。

約１ケ月後、゛静脈内に追加免疫し、免疫後３日日にｉ
ウス膵臓を取シ出し、以下の細胞融合に用いた。

２、細胞融合、クローニング及び精製 上記のマウス牌細胞と、マウスさエローマＰ３Ｖ１細胞
を３＝１の割合で混合し、５０チポリエチレングリコー
ル（平均分子量４０００）ｔ−用いて、融合を行っ九。

細胞はマイクロプレート中で培養し、増殖がみられ九り
エルの培養上清の活性を酵素免疫測定法にて測定し活性
の認められたウェルの細胞は限界希釈法によシクローニ
ングを行った。

得られたクローンをプリスタン投与ＢＡＬＢ／ｃ　マウ
スの腹腔内へ移植し、１０日〜１４日後にモノクローナ
ル抗体を高濃度に含む腹水を採取した。このモノクロー
ナル抗体をグル口過及びＤＥＡＥカラムで精製した。

この抗体を高速液クロ（ダル口過）によシ分析すると分
子量が８０〜１００万であることが分つ九。これはＩｇ
Ｍ抗体に相当する分子量であるととを示している。また
、この抗体（１００μｔ７ｍｌ　）をＥＩＡ用のグレー
トのウェルに１００μ！加え、３７℃で２時間放置後、
洗浄した。さらに発色剤（ＡＢＴＳ　）と抗マウスＩｇ
Ｇ１ｐ　ｌ［ｇＧ２ａ　ｔ　ＩｇＧ２ｂ　ｐ■ｇＧ３　
ｔ　ＩｇＡ　ｅ　ＩｇＭの各ＰＯＤ標識抗体をそれぞれ
１００μ！ずつ加えて３７℃で１時間反応させ、洗浄後
、発色の差を比較した。その結果この抗体は抗マウスＩ
７Ｍ抗体とのみ反応し、マウスＩｇＭクラスの抗体であ
ることが明らかになった。なおこの抗体をＫＡ３Ａ　３
と命名した。

戸、　ＫＡ３Ａ３の反応性及び特異性 ３−１各種株化細胞に対する反応性 株化細胞に対する反応性は抗原として各種株化細胞の音
波処理物を用い、９６ウエルアツセイグレートによる酵
素免疫測定法にて行った。シアル酸関与抗原であるか否
かは上記抗ｉを固相化したプレートを０．　Ｉ　Ｕ／ｄ
のノイラミニダーゼで処理し、反応性が変化するかどう
かで調べた。

表１よシＫＡ３Ａ３抗体はＫＡＴＯ−Ｉｎ、Ｃｏ１ｏ−
２０５に強く反応し、５Ｗ１１１６とも弱いが反応する
。又株化細胞ではないが、メコニウムをセファローズ４
Ｂでグル口過した高分子画分とも強く反応する。又、仁
れら反応性抗原をノイラミニダーゼで処理すると反応性
は消失し、　ＫＡ３Ａ３が認識する抗原はシアル酸を含
んでいることがわ力する。

３−２阻試験 ９６ウエルツツセイグレートにＫＡＴＯ−Ｉ１１音波処
理抗原を吸着させたのち、阻止抗体として濃度を変化さ
せたＫＡ３Ａ３抗体を各ウェルに入れ３７℃で１時間反
応させた。洗浄後、各ウェルにベルオ°キシダーゼ（Ｐ
ＯＤ　）で標識し九ＫＡ３Ａ３抗体又は７Ｍ１９−９抗
体「イムノクロンＣＡ１９−９　Ｊ　（富士レビオ（株
）製）中ブト中のＰＯＤ標識モノクローナル抗体（以下
ＴＭ１９−９とい５）を反応させ、阻止抗体による阻止
効果をみた。（第１図） 図中、・・・０・・・はＰＯＤ標識ＫＡ３Ａ３　　・・
・Δ・・・は７Ｍ１９−９のＫＡ３Ａ３抗体による阻止
反応を示している。その結果、ＫＡ３Ａ３抗体はＫＡ３
Ａ３標識抗体の反応及び７Ｍ１９−９の反応を阻止する
ことが明らかになった。

３−３血清での相関 ＣＡ１９−９陽性血清６２例について、ＣＡ１９−９を
ＰＯＤ標識ＴＭ１９−９とＫＡ３Ａ３のモノクローナル
抗体を用いた酵素免疫測定法によシ測定し、その相関を
調べた。第２図よシ、相関係数ｒ＝０．８２と強い相関
がみら、このことは７Ｍ１９−９とＫＡ３Ａ３がＣＡ１
９−９を認識していることを示した。

性の比較 ＰＣ−９−００ ＰＣ−１０００ Ａ５４９　　　　　　　　０　　　　　０ＮＲＣ−１２
００ ｘＡｒｏ−ｍ　　　　　　　　６（ｔ）”　　　　３（
０）ＳＷ１１１６　　　　　　　４　　　　　２ＣＯＬ
Ｏ−２０５１０（１）　　　　　６（１）ＣＥＭ　　　
　　　　　　　Ｏ０ Ｒａｊｉ　　　　　　　　　　ＯＯ 正常白血球　　　　　　　００ ＣＥＡ　　　　　　　　　　　０　　　　　　０胎児糞
便（ＣＡ１９−９＋）　　　　８（１）　　　　　６（
０）本（）＝フイラミニダーゼ処理 ロホルム、水を２：１：０．８で混合した溶媒で糖脂質
を抽出し、これ７ｋＤＥＡＥ−８＠ｐｈｄｅｘＡ２５酢
岐型カラムで中性糖脂質と酸性糖脂質の両分に分けた。

この画分を標識された各種モノクローナル抗体を用いて
検討した。

中性糖脂質画分は抗しψａ抗体と強く反応したがＫＡ３
Ａ３抗体とは反応しなかった。酸性糖脂質画分はこれと
は逆にＫＡ３Ａ３抗体には強く反応するが、抗Ｌｅ＆抗
体とは反応しなかった。しかし、この酸性画分をノイラ
ミニダーゼで処理するとＫＡ３Ａ３抗体とは反応せず抗
Ｌｅａ抗体と反応するようになりた。このことよｊ５　
ＫＡ３Ａ３はＳｉａｌｇｌ−Ｌｅａの可能性が高い７Ｍ
１９−９もＫＡＢＡ３と同じ反応ノリーンを示した。

以上の結果よシＫＡ３Ａ３抗体の認識する抗原決定基は
ＣＡ−１９−９（５ｉａｌｙｌＬｅａ　）であることが
わかった。

実施例２（感作粒子の調製） 常法に従ってホルマリンで固定した羊赤血球を５　Ｙ／
Ｙ　％になるようにＰＨ６，０の０．１５　Ｍリン酸塩
緩衝液（０，１５ＭＰＢ（６，０））に浮遊した。この
血球浮遊液にベンゾキノンの０．１５ＭＰＨ（６，０）
溶液を加え、ときどき攪拌しながら３７℃で３０分間反
応させた。この血球を生理食塩液で３回洗浄後、０．１
５ＭＰＨ（７，２）で５７７７％になるように浮遊させ
てベンゾキノン処理血球液を得た。

このベンゾキノン処理血球液に、０．１５ＭＰＨ（７，
２）で４０μ？鷹に調製したＫＡａＡ３を等量加え、３
７℃で１時間加温した。血球を生理食塩液で３回洗浄後
、浮遊分散液に浮遊させて凍結乾燥した。　　。

この凍結乾燥品に、測定対象の抗原と異なる抗原に対す
るモノクローナル抗体を゛上記の方法で感作した対照血
球の乾燥品、対照用陽性血清及び血清希釈用液を組み合
わせ、　ＣＡ１９−９検出用試薬キツトとした。

特開昭５８−１１３７５４号公報の実施例１に記載され
た方法で製造したゼラチン粒子をタンニン酸を含む、ｐ
’　７．２の０．１５　Ｍ　Ｉ）ン酸塩緩衝生理食塩液
（０，１５ＭＰＢＳ　（７，２）　）中に粒子濃度が２
．５マ／ｖ　％になるように分散させ、３７℃で１０分
間加温した。この粒子を生理食塩液で３回洗浄後０．１
５　Ｍ　ＰＢＳ　（７，２）によシ分散させ、タンニン
酸処理粒子液を得た。このタンニン酸処理粒子液に０．
１５ＭＰＢＳ　（７，２）で４０μに−に調製したＫＡ
３Ａ３を等量加え、３７℃で１時間加温した。粒子を生
理食塩液で３回洗浄後浮遊分散液に浮遊させて凍結乾燥
し次。

ニワトリ赤血球を常法によ）ホルマリン処理して固定ニ
ワトリ赤血球を調製し、この血球１ｆｔ０．１ＭＰＨ（
７，２）にて５　ｖ／ｖ　％に浮遊させた。この血球浮
遊液にトルエンジイソシアナート（ＴＤＩ　）のエマル
ジ曹ン液を最終濃度加え、３７℃で４５分間攪拌した。

血球を生理食塩液で３回洗浄後、遠心分離し、　ＴＤＩ
処理血球沈渣を得た。このＴＤＩ処理血球沈渣に、０．
１ＭＰＨ（７，２）で４０μ？鷹に調製したＫＡＢＡ３
を、血球濃度が５　ｖ／マチになるように加え、３７℃
で１時間加温した。血球を生理使用例１ １−１低力価血清の検出率 ＲＩＡ値２００　Ｕ／ｄ以下の血清検体４１９例を本発
明の逆受身凝集試薬を用いて測定し、その結果を表２に
示した。

１−２％異性試験 ＫＡ３Ａを用いた逆受身凝集試薬とＣＡ１９−９　ＲＩ
Ａとの比較試験を行ない、その結果を第４図に示した。

１−３各程癌患者血清群におけるＣＡ１９−９　ＥＩＡ
と逆受身′Ｉｉ８集反応試薬との検出率の比較各種癌患
者血清検体３４６例を用いて、ＥｒＡと逆受身凝集反応
を行ない、その結果を表３に示した。その結果両者は同
程度の陽性率を示した。

【図面の簡単な説明】

第１図はＰＯＤ標識ＫＡ３Ａ３　（・ｏ　・）と７Ｍ１
９−９（・・・Δ・・・）による反応阻止の比較を示し
た図である。 第２図はＰＯＤ標＠ＫＡ３Ａ３と７Ｍ１９−９とを用い
てＥＬＩＳＡによシ測定した結果を示した図である。 第３図はＤＨＡＩによシ分画したＣＡ１９−９抗厘のノ
イラミニダーゼ処理による影響を示したものであシ、　
ＣＡ１９−９抗原の分画成分（−）及びノイラミニダー
ゼ処理された分画（・・・）の抗原性をＰＯＤ標識ＫＡ
３Ａ３　（ｏ　）、７Ｍ１９−９　（Δ）及びアンティ
ーＬ＠’（−）によシ比較し九図である。 第４図は各種検体に対するＣＡ１９−Ｑ　ＲＬＡと本発
明の逆受身凝集反応との相関図でちる。 特許出願人　富士レビオ株式会社 阻害剤（μｖｍｌｌ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）認識する抗原決定基がＣＡ１９−９であるＩｇＭ
   クラスのモノクローナル抗体を担体粒子に感作させてな
   る、ＣＡ１９−９検出用逆受身凝集反応試薬。