JPH046358B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔技術分野〕 本発明は、胃低分化型腺癌由来細胞株（MKN
−45）を免疫原として作成されたハイブリドーマ
の産生する特定の特性を持つモノクローナル抗体
に関する。 癌研究の究極の目標は、抗癌、制癌作用を示す
物質の探索と、癌の早期発見、即ち早期診断法の
確立にあるといえる。従来、癌に関して種々の薬
剤、治療法、試薬が開発されているが、これらは
いずれも癌細胞ばかりでなく、正常組織、正常細
胞にも影響を与え、如何に有効な薬剤とはいえ、
その副作用のために使用が著しく制限されている
のが現状である。 免疫反応（抗原−抗体反応）は、非常に特異性
が高いものであるが、従来のポリクローナル抗体
ではいかに吸収操作を繰り返しても、例えばリン
パ球間のサブセツトのような、非常にマイナーな
抗原決定基によつて区別されるものを認識するこ
とは困難であつた。ミルステイン（Milstein）ら
によつて開発されたモノクローナル抗体〔ケーラ
ー、ジーおよびミルステイン、シー：ネーチヤー
（Ko¨hler、G.and Milstein、C.：Nature）256、
495（1975）〕は、この壁を打ち破るものであり、
癌細胞上の癌特異抗原、あるいは癌関連抗原を特
異的に認識するモノクローナル抗体を得ることに
より、正常組織へのダメージを与えずに癌細胞の
みを特異的に排除できるものと期待される。ま
た、モノクローナル抗体を用いた診断薬あるいは
検査試薬は、正常血清成分に対する交叉反応がな
く、感度良く、癌関連抗原、癌特異抗原を検出で
きるものと思われる。 〔発明が解決しようとする問題点〕 本発明は、特定の癌抗原に対して特異的に反応
するモノクローナル抗体を提供するものである。
さらに本発明は、上記特定癌に対する抗原検出用
試薬を提供するものである。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明は、胃癌、特に胃癌の細胞膜抗原に対し
て特異的に反応するモノクローナル抗体よりなる
ものである。 本発明のモノクローナル抗体は、いわゆる細胞
融合によつて製造される。すなわち、抗体産生細
胞と骨髄腫細胞との間に、融合ハイブリツドを形
成させ、該ハイブリツドをクローン化し、上記癌
細胞（即ち、上記特性を有する特定抗原）に対し
特異性を示す抗体を産生するクローンを選択する
ことによつて製造される。その操作は、免疫用細
胞として下記細胞を使用する以外は、従来既知の
方法に準ずればよい。 抗体産生細胞は、例えば株化癌細胞より得られ
る抗原によつて免疫させた動物からの脾細胞、リ
ンパ節細胞、Ｂ−リンパ球である。株化癌細胞と
しては、胃低分化型腺癌由来の株化癌細胞
（MKN−45）が例示される。 免疫させる動物としてはマウス、ラツト、馬、
ヤギ、ウサギなどが例示される。 抗体産生細胞は、例えば次のようにして製造さ
れる。即ち、胃癌由来細胞株MKN−45（低分化
型腺癌）を超音波処理等で破壊し、遠心分離
（例、10000〜20000G、10〜60分）を行つて細胞
抽出液を得、この上清を分子量10万〜200万の物
質の分離が可能なゲル濾過担体（例、セフアデツ
クス、セフアクリル、セフアロース、バイオゲル
等）を使用して分子篩し、高分子画分と低分子画
分とに分離する。かくして得られた分子量が約70
万〜150万の高分子画分は、例えば完全フロイン
ドアジユバント（Freund Complete Adjuvant）
と混和後、動物の免疫用として使用する。免疫は
動物の皮下、筋肉内あるいは腹腔内に約1.5×10⁵
〜10⁸cell相当分／回を週１〜２回、３〜７週間
投与することによつて行われる。最終免疫より約
３〜５日後、免疫動物から抗体産生細胞を分取す
る。 骨髄腫細胞としては、マウス、ラツト、ヒト等
由来のものが使用される。抗体産生細胞と骨髄細
胞とは同動物由来のものであることが好ましい。 細胞融合は、例えばジー、ケーラー（G.
Ko¨hler）〔ネーチヤー（Nature）256、495
（1975）〕に記載の方法又はこれに準ずる方法によ
つて行われる。この際、30〜50％ポリエチレング
リコール（平均分子量1000〜4000）を用いて30〜
40℃の温度下、約１〜３分間程度反応させること
によつて行われる。 細胞融合によつて得られた細胞はクローニング
に付される。すなわち、当該細胞を、例えばマイ
クロプレート中で培養し、増殖の見られたウエル
の培養上清中の抗体価を、例えば酵素抗体法など
によつて測定し、さらに例えば限界希釈法によつ
てクローニングを行つてクローンを得る。このク
ローンは、例えばあらかじめプリスタンを投与し
たBALB／Ｃマウスの腹腔内へ移植し、10〜14
日後にモノクローナル抗体を高濃度に含む腹水を
採取し、検定する。得られたクローンは、次い
で、目的とするモノクローナル抗体を産生するク
ローンのスクリーニングに付される。スクリーニ
ングは、酵素抗体法などによつて追跡される。選
ばれたクローンの産生するモノクローナル抗体の
回収は、1gGの精製法として従来既知の硫安分画
法、PEG分画法、エタノール分画法、陰イオン
変換体を応用することで、容易に達成される。 〔発明の効果〕 本発明によつて得られたモノクローナル抗体
は、腺癌系に特異的と考えられ、細胞膜表在型抗
原を認識し、かつ正常組織由来培養細胞、赤血
球、白血球及び正常組織とは反応せず、癌特異的
な抗原を認識するものと推測される。すなわち、
本発明からなるモノクローナル抗体は腫瘍のイメ
ージング及び制癌剤とコンジエゲートさせ、ター
ゲテイングセラピイ（targeting therapy）等へ
の臨床応用が期待される。 実施例 (1) 免疫用癌関連抗原の調製： 株化胃癌細胞（MKN−45株）を超音波処理
法で破壊し、遠心分離（15000G、30分）を行
い細胞抽出液を得た。この上清をセフアロース
4Bのカラムを用い、ゲル濾過し、高分子画分
と低分子画とに分離した。 分子量が約70万〜150万の高分子画分を、完
全フロインドアジユバントと混和後、マウスへ
週１回、５週間免疫した。 最終免疫より４日後にマウス脾臓を取り出
し、以下の細胞融合に用いた。 (2) 細胞融合およびクローニング： 上記のマウス脾細胞と、マウスミエローマ
P3U1〔カレント トピカルマイクロバイオロジ
カル イムノロジー（Curr.top.Microbiol.
Immunol.）、81、１（1970）〕とを４：１の割合
で混合し、ケーラー（Ko¨hler）の方法〔イム
ノロジカル メソツド（アカデミツク プレ
ス）、ニユーヨーク（Immunological Method
（Academic Press）、New York）、391、
（1979）〕を一部改変して、42.6％ポリエチレン
グリコール（平均分子量1000）を用いて２分間
反応させることにより細胞融合を行つた。 本細胞を96ウエルマイクロプレートに植え込
み、HAT培地（表１）で19〜14日間培養後、
HT培地（表１）に移行し、さらにフラスコ
（25cm²）に培養できるようになつてからＤ−
MEM培地（表１）で培養した。増殖の見られ
たウエルの培養上清中の抗体価を酵素抗体法に
より測定し、適切なウエルから限界希釈法によ
り、求めるハイブリドーマのクローニングを行
つた。 すなわち、マイクロタイタープレートにウエ
ル当たり25000個のマウス腹腔浸出細胞を植え
込み、次にＤ−MEM培地で、10、５、2.5、１
個／0.1mlとなるようにハイブリドーマを希釈
し、これをマイクロタイタープレートに0.1ml
ずつ植え込み培養した。４日後にＤ−MEM培
地を0.1ml加え、以後４〜７日に１度培地の半
量交換を行つた。培養開始後10〜20日で肉眼で
認められるコロニーが形成され、クローン株を
得た。

【表】 (3) スクリーニング法 得られたハイブリドーマについて目的とする
モノクローナル抗体を産生するクローンのスク
リーニングを次のようになつた。 (イ) 方法の説明 以下のようにして酵素抗体法を行つた。 抗原（各種株化癌細胞または部分精製癌関
連抗原または正常細胞をコートしたマイクロ
プレートに検体を加え、37℃で１時間反応さ
せ、洗浄後ペルオキシダーゼ標識抗マウス免
疫マウス免疫グロブリン（IgG＋IgA＋IgM）
ウサギ抗体を加え、さらに37℃で１時間反応
させた。未反応の標識抗体を洗浄後、Ｏ−フ
エニレンジアミン液を加え、室温にて30分間
反応させた後、2M硫酸を加えて反応を停止
させ、490nmの吸光度を測定した。この方法
で各種細胞との反応性を調べた。なお白血球
との交叉反応性はＢ−ガラクトシダーゼ（Ｂ
−Galactosidase）標識抗体を用いた。その
他、ヒト赤血球との交叉反応性は、ヒトＡ、
Ｂ、Ｏ型赤血球を混合し、PHA法で検討し
た。癌胎児性抗原（Carcinoembryonic
antigen（CEA）との交叉反応性は、CEA感
作血球を用いPHA法で行つた。 モノクローナル抗体がMKN−45の分泌物
抗原か或いは細胞膜抗原のどちらかを認識し
ているかの検討のために、MKN−45の培養
上清でモノクローナル抗体とMKN−45細胞
そのものとの反応性が阻害されるかどうかを
調べた。 酵素抗体法を用いたインヒビシヨン テス
ト（Inhibition Test）の具体的な方法は、
以下の通りである。即ち、ハイブリドーマの
培養上清を酵素抗体法でタイトレーシヨンを
行い、それより判断して適当な希釈培率を決
める。次にMKN−45培養上清を５〜25培濃
縮したものを原液として１：５、１：5²……
１：5ⁿ希釈したものを、適当に希釈したハイ
ブリドーマ培養上清にそれぞれ等量加え、１
時間37℃でインキユベーシヨンする。そし
て、通常の酵素抗体法（ターゲツト：MKN
−45）の系でアツセイ（assay）を行つた。 (ロ) スクリーニングの流れ １次スクリーニング：ターゲツトセル
（MKN−45）及び正常由来細胞
（Flow2000）を用いた酵素抗体法で、MKN
−45に対して陽性でFlow2000に対して陰性
なウエルを選抜。 ２次スクリーニング：さらに他の正常由来
細胞株及び赤血球、白血球を用いたアツセイ
系ですべてに陰性のウエルを選抜。 ３次スクリーニング：以上で選抜された細
胞株を２〜３回クローニングし、その培養上
清を多くの癌由来のセルラインとの反応性を
検討する〔測定はCELISA法（ア ニユーデ
イメンシヨン イン バイオロジカル アナ
リシス、第376頁、プレナム プレス、ニユ
ーヨーク、ロンドン、1980年：Ａ New
Dimension in Biological Analysis、p.376、
Plenum Press、New York、London、
1980）によつた。〕とともに、分泌型或いは
細胞膜型抗原のどちらかを認識するかを、酵
素抗体法を用いたインヒビシヨン テストで
同定する。 (4) モノクローナル抗体の回収、精製 (イ) 上記のスクリーニングによつて得られたクロ
ーン株を予め0.5ml／匹プリスタンを投与した
４週令以後のBALB／Ｃマウス（雄）の腹腔
内へ2.0〜3.0×10⁷cell／匹移植し、10〜14日後
にモノクローナル抗体を高濃度に含む腹水を採
取した。 この腹水を0.9％NaCl液を加え５〜10倍希釈
した後、硫酸アンモニウムを40％濃度となるよ
うに加え、沈澱画分を分取した。この沈澱画分
をなるべく少量の0.9％NaCl液で溶解させた
後、0.9％NaCl液を外液として透析した。透析
終了後、高速液体クロマトグラフイー（TSK
−Gell Ｇ−3000SW）を行い、IgG画分を得、
精製モノクローナル抗体とした。 (ロ) 本クローン株は、BSA含無血清培地中でも
増殖させることができる。すなわち、0.5％
BSA含無血清培地（RITC55−９培地）中で増
殖させ、培養上清を集めた。この上清に硫酸ア
ンモニウムを40％濃度となるように加え、沈澱
画分を分取し、これに0.9％NaCl液を加え、溶
解させた後、さらに硫酸アンモニウムを40％濃
度となるように加え沈澱画分を分取した。この
沈澱画分をなるべく少量の0.9％NaCl液で溶解
させた後、0.02M生理的リン酸緩衝液を外液と
して透析した。透析終了後、この溶液を再び抗
牛胎児血清抗体（ウサギ）を結合したセフアロ
ース4Bカラムに通した後DEAE−セルロフア
インカラムに加え、カラムクロマトグラフイー
を行つた。 DEAE−セルロフアインクロマトグラフイー
の最初のピーク部分を精製モノクローナル抗体
とした。 (5) モノクローナル抗体の特性 かくしてスクリーニングされたクローンの産
生するモノクローナル抗体の性状は、表２及び
表３のとおりである。免疫グロブリンのクラス
はオクタロニー法で検定した。

【表】 ※〓インヒビシヨン テストにおいて、インヒ
ビシヨンがかからなかつた。

【表】

【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 胃低分化型腺癌由来細胞株（MKN−45）を
   免疫原として作成されたハイブリドーマの産生す
   る以下の特性を持つモノクローナル抗体： Igクラス（Light 鎖）：IgG₁（Ｋ） 認識抗原タイプ：細胞表面抗原 癌細胞との反応性：次の癌細胞に対して陽性
   を示す。 食道癌（TE−３）、肺癌（PC−３）、胃癌
   （MKN−45）、胃癌（KATO−）、肝癌
   （HEK）。