JPS63179895A

JPS63179895A - モノクロ−ナル抗体

Info

Publication number: JPS63179895A
Application number: JP1114687A
Authority: JP
Inventors: Yoshiaki Kano; 加納　義明; Tomokuni Taniguchi; 谷口　友邦; Masako Hayashi; 真子林; Yatsuhiro Kamimura; 上村　八尋
Original assignee: Green Cross Corp Japan
Current assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1987-01-20
Filing date: 1987-01-20
Publication date: 1988-07-23

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔技術分野〕本発明は、胆管癌由来株（ＨＥＫ）を免疫原として作製
されたハイブリドーマの産生ずる特定の特性を持つモノ
クローナル抗体に関する。

〔従来技術〕

癌研究の究極の目標は、抗癌、制癌作用を示す物質の探
索と、癌の早期発見、即ち早期診断法の確立にあるとい
える。従来、癌に関して種々の薬剤、治療法、試薬が開
発されているが、これらはいずれも癌細胞ばかりでなく
、正常組織、正常細胞にも影響を与え、いかに有効な薬
剤とはいえ、その副作用のために使用が著しく制限され
ているのが現状である。

免疫反応（抗原−抗体反応）は、非常に特異性が高いも
のであるが、従来のポリクローナル抗体ではいかに吸収
操作を繰り返しても、例えばリンパ球間のサブセットの
ような、非常にマイナーな抗原決定基によって区別され
るものを認識することは困難であった。ミルスティン（
Ｍｉ　ｌ５ｔｅｉｎ）らによって開発されたモノクロー
ナル抗体〔ケーラー、ジー、およびミルスティン、シー
、：ネーチ’ｐ−（Ｋ′６ｈｌｅｒ、　Ｇ、　ａｎｄ　
Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｃ，：　Ｎａｔｕｒｅ、）％ｉ６
．４９５．（１９７５）　）は、この壁を打ち破るもの
であり、癌細胞上の癌特異抗原、あるいは癌関連抗原を
特異的に認識するモノクローナル抗体を得ることにより
、正常組織へのダメージを与えずに癌細胞のみを特異的
に排除できるものと期待される。

また、モノクローナル抗体を用いた診断薬あるいは検査
試薬は、正常血清成分に対する交叉反応がなく、感度良
く、癌関連抗原、癌特異抗原を検出できるものと思われ
る。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明の目的は、特定の癌抗原に対して特異的に反応す
るモノクローナル抗体を提供することにある。さらには
、上記特定癌に対する抗原検出用試薬を提供することに
ある。

〔問題点を解決するための手段〕本発明は、胃癌、肺癌、食道癌、結腸癌、肝癌、子宮内
膜癌に対して特異的に反応するモノクローナル抗体より
なるものである。

本発明のモノクローナル抗体は、［１］Ｉｇクラス（サブクラス）：ＩｇＧ、［２］認識
抗原タイプ：分泌型抗原■癌細胞との反応性：少なくと
も胃癌（ＫＡＴＯ−ＤＩ）、肺癌、食道癌、結腸癌、肝
癌、子宮内膜癌に対して陽性を示す。

等の特性を有する。

本発明のモノクローナル抗体は、いわゆる細胞融合によ
って製造される。すなわち、抗体産生細胞と骨髄腫細胞
との間に、融合ハイブリッドを形成させ、該ハイブリッ
ドをクローン化し、上記癌細胞（即ち、上記特性を有す
る特定抗原）に対し特異性を示す抗体を産生ずるクロー
ンを選択することによって製造される。その操作は、免
疫用細胞として下記細胞を使用する以外は、従来既知の
方法に準ずればよい。

抗体産生細胞は、例えば株化癌細胞より得られる抗原に
よって免疫された動物からの肺細胞、リンパ節細胞、Ｂ
−リンパ球である。株化癌細胞としては、胆管癌由来の
株化癌細胞（ＨＥＫ）が例示される。この細胞の性質は
継代用培地ＲＰＭｒ１６４０＋１０％牛脂子血清であり
、産生ずる腫瘍マーカーはＣＥＡ、ＫＭＯＩ、シアル化
ルイスＸである。

免疫される動物としては、例えばマウス、ラット、ウマ
、ヤギ、ウサギなどが例示される。

抗体産生細胞は、例えば次のようにして製造される。即
ち、胆管癌由来細胞株を例えば完全フロインドアジュバ
ント（Ｆｒｅｕｎｄ　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ａｄｊｕｖａ
ｎｔ）と混和後、動物の免疫用として使用する。免疫は
動物の皮下、筋肉内あるいは腹腔内に、約１．５×１０
５〜１０”ｃｅｌｌ相当分／回を注射することにより行
われ、初回免疫より約３〜５週間ごとに２度免疫を行い
、さらに１〜３ケ月後に最終免疫を行う。最終免疫より
約３〜５日後、免疫動物から抗体産生細胞を分取する。

骨髄腫細胞としては、たとえばマウス、ラット、ヒト等
由来のものが使用される。抗体産生細胞と骨髄腫細胞と
は同種動物由来のものであることが好ましい。

細胞融合は、例えばジー、ガルファ（Ｇ、Ｇａ１ｆｒｅ
）〔ネーチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）　２６６、５５０　
（１９７７）　）に記載の方法又はこれに準する方法に
よって行われる。

この際、３０〜５０％ポリエチレングリコール（平均分
子量（１、０００〜４，０００）を用い、て３０〜４０
℃の温度下、約１〜３分間程度反応させることによって
行われる。

細胞融合によって得られた細胞は目的とするモノクロー
ナル抗体を産生ずるクローンのスクリーニングに付され
る。即ち、当該細胞を、例えばマイクロプレート中で培
養し、増殖の見られたウェルの培養上清中の抗体価を、
例えば酵素抗体法などによって測定し、適切な抗体を産
生しているウェルを得る。このようなウェルから更に例
えば限界希釈法によってクローニングを行ってクローン
を得る。このクローンは、例えばあらかじめプリスタン
を投与したＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内へ移植し、１０
〜１４日後にモノクローナル抗体を高濃度に含む腹水を
採取し、検定する。選ばれたクローンの産生ずるモノク
ローナル抗体の回収は、免疫グロブリンの精製法として
従来既知の硫安分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画
法、陰イオン変換体を応用することで、容易に達成され
る。

〔発明の効果〕

本発明によって得られたモノクローナル抗体は、正常組
織由来培養細胞、赤血球、白血球及び正常組織とは反応
せず、食道癌、肺癌、胃癌、結腸癌、肝癌、子宮内膜癌
と特異的に反応するものと推測される。すなわち、本発
明からなるモノクローナル抗体は癌の早期発見、予後の
追跡調査に有用な診断薬として、および腫瘍のイメージ
ングあるいは制癌剤とコンジュゲートさせ、ターゲティ
ング療法等への臨床応用が期待される。

実施例（１）免疫用癌関連抗原の調製：培養面積１５０ｄのフラスコにほぼ全面に増殖した株化
胆管癌細胞（ＨＥＫ細胞）（１，５〜２．０×１０７個
）を抗ヒト白血球マウス抗体と室温で１時間インキュベ
ートした後、Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ系マウスの腹腔内
へ免疫した。１０日〜１ケ月間隔で４回免疫した後、２
週目に採血し、血中抗体価を測定した。最終免疫の３ケ
月後、２．０Ｘ１０’個のＨＥＫ細胞を腹腔内へ免疫し
、４日後に融合に供した。

最終免疫より４日後にマウス肺臓を取り出し、以下の細
胞融合に用いた。

（２）細胞融合およびクローニング：上記のマウス牌細胞と、マウスミエローマＰ３Ｕｌ（カ
レント　トビツク　イン　マイクロバイオロジー　アン
ド　イムノロジー（Ｃｕｒｒ、　Ｔｏｐ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｉｍｍｕｎｏ＋、　）　、　８
１．１　（１９７Ｂ））とを３：１の割合で混合し、ケ
ーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）　らの方法〔イムノロジカル　
メソッド（アカデミツクプレス）、ニューヨーク　（Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄ（Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）、　３９
１．　（１９７９））を一部改変して、４５％ポリエチ
レングリコール（平均分子量４，０００）を用いて２分
間反応させることにより細胞融合を行った。

本細胞を９６ウエルマイクロプレートに植え込み、ＨＡ
Ｔ培地（表１）で９〜１４日間培養後、ＨＴ培地（表１
）に移行し、更にフラスコ（２５ｃｉ）に培養できるよ
うになってからＤ−ＭＥＭ培地（表１）で培養した。増
殖の見られたウェルの培養上清中の抗体価を酵素抗体法
により測定し、適切なウェルから限界希釈法により、求
めるハイプリドーマのクローニングを行った。

すなわち、マイクロタイタープレートにウェル当たり２
５．０００個のマウス腹腔浸出細胞を植え込み、次にＤ
−ＭＥＭ培地で、１０．５．２．５．１個１０．１−と
なるようにハイブリドーマを希釈し、これをマイクロタ
イタープレートに０．１−ずつ植え込み培養した。４日
後にＤ−ＭＥＭ培地を０．１　ｍ７加え、以後４〜７日
に１度、培地の半量交換を行った。培養開始後１０〜２
０日で肉眼で認められるコロニーが形成され、クローン
株を得た。

（以下余白）表１（３）　　スクリーニング法得られたハイプリドーマについて目的とするモノクロー
ナル抗体を産生ずるクローンのスクリーニングを次のよ
うに行った。

（イ）方法の説明以下のようにして酵素抗体法を行った。

抗原（各種株化癌細胞、部分精製癌関連抗原または正常
細胞）をコートしたマイクロプレートに検体を加え、３
７℃で１時間反応させ、洗浄後ペルオキシダーゼ標識抗
マウス免疫グロブリン（■ｇＧ＋　Ｅ　ｇＡ＋　ｒ　ｇ
Ｍ）ウサギ抗体を加え、さらに３７℃で１時間反応させ
た。未反応の標識抗体を洗浄除去後、Ｏ−フェニレンジ
アミン液を加え、室温にて３０分間反応させた後、２Ｍ
硫酸を加えて反応を停止させ、４９０ｎｍの吸光度を測
定した。

この方法で各種細胞との反応性を調べた。癌胎児性抗原
（ＣＥ　Ａ）との交叉反応性は、（、ＥＡ感作血球を用
いＰＨＡ法で行った。

（ロ）スクリーニングの流れ１次スクリーニング：ターゲットセル（ＨＥＫ細胞）お
よび正常皮膚繊維芽細胞（ＣＣＤ４Ｓ−３Ｋ）を用いた
酵素抗体法で、ＨＥＫ細胞に対して陽性でＣＣＤ、５−
３Ｋに対して陰性なウェルを選抜。

２次スクリーニング：　１次スクリーニングで選抜され
た細胞株を２〜３回クローニングし、その培養上清を多
くの癌由来の株化細胞（ｃｅｌｌ　１ｉｎｅ）や他の正
常組織由来細胞との反応性を検討するとともに、分泌型
或いは細胞膜表覆型抗原のどちらを認識するかを、酵素
抗体法を用いたインヒビジョンテストで同定する。

（４）モノクローナル抗体の回収、精製（イ）上記のス
クリーニングによって得られたクローン株を予め０．５
＋ｗｌ／匹プリスタンを投与した４週令以後のＢＡＬＢ
／Ｃマウス（雄）の腹腔内へ１．０〜３．Ｏｘ　１０’
　ｃｅｌｌ／匹移植し、１０〜１４日後にモノクローナ
ル抗体を高濃度に含む腹水を採取した。

この腹水に０．９％Ｎａ　ＣＪ液を加え５〜ｌＯ倍希釈
した後、硫酸アンモニウムを４０％濃度となるように加
え、沈澱画分を分取した。この沈澱画分をなるべく少量
の０．９％ＮａＣＪ！液で溶解させた後、０．９％Ｎａ
Ｃ１液を外液として透析した。

透析終了後、高速液体クロマトグラフィー（ＴＳＫ−Ｇ
ｅｌｌ　Ｇ−３０００５Ｗ）を行い、免疫グロブリン画
分を得、精製モノクローナル抗体とした。

（ロ）本りローン株は、ＢＳＡ含無血清培地中でも増殖
させることができる。すなわち、０．５％ＢＳＡ含無血
清培地（ｔＴｃ５５−９培地）中で増殖させ、培養上清
を集めた。この上清に硫酸アンモニウムを４０％濃度と
なるように加え、沈澱画分を分取し、これに０．９％Ｎ
ａＣｊ！液を加え、溶解させた後、さらに硫酸アンモニ
ウムを４０％濃度となるように加え沈澱画分を分取した
。この沈澱画分をなるべく少量の０．９％ＮａＣｌ１液
で溶解させた後、０．０２Ｍ生理的リン酸緩衝液を外液
として透析した。透析終了後、この溶液をＤＥＡＥ−セ
ルロファインカラムに加え、カラムクロマトグラフィー
を行った。

（５）モノクローナル抗体の特性かくしてスクリーニングされたクローンの産生ずるモノ
クローナル抗体の性状は、表２及び表３のとおりである
。免疫グロブリンのクラスはオフタロニー法で検定した
。なお、スクリーニングに供した細胞株は以下のように
入手した。

ＰＡ−１，ＨＥｐ−２，ＫＢ、　ＰＡＮＣ−１，旧ＡＰ
ａＣａ−２，Ｃ０ＬＯ−２０１、ＣＯＬＯ−３２００Ｍ
、　ＺＲ７５−１ノ各細胞は大日本製薬■から、ＮＲＣ
−１２，ＮＢＴ−２，ＰＣ−１，ＰＣ−３，ＰＣ−９，
ＰＣ−１０、ＭＫＮ−２８，ＭＫＮ−４５，ＮＡＴＯ−
１）１の各細胞は日本免疫生物研究所から、ＴＢ−１，
ＴＩ！−２，ＴＢ−３，ＴＢ−４，ＴＩ！−５，ＴＥ−
６，ＴＥ−７，ＴＥ−８，７Ｅ−９，ＴＥ−１０，ＴＥ
−１）は東北大学から、ｌ５ＨＩＫＡＷＡ株は大阪大学
から、Ｇ−４１５は筑波大学から、ＰＡは近畿大学から
入手した。

以上の癌細胞株はいずれも１０％ＦＣ５（Ｆｉｌｔｒｏ
ｎ）、２ｍＭのし一グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナ
トリウム、１００１）／ｍｌのペニシリン、１）００ｐ
／−のストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０培
地で継代培養した。

Ｆｌｏｎ−２０００，Ｆｌｏｗ−１）０００，ＣＣＤ＋
５−Ｃｏ、　ＣＣＤ４ｓ−３Ｋ。

ＷＩＳＩ（、ＦＬの各細胞は大日本製薬−から入手した
。

１）ＫＧ、　ＮＫ−３は■ミドリ十字のものである。

以上の細胞はいずれも１０％Ｆ　ＣＳ　（Ｆｉｌｔｒｏ
ｎ）、１００Ｉυ／ａｆのペニシリン、１）００Ｐ／−
のストレプトマイシンを含むＭＥＭ培地で継代培養した
。

マウスミエローマＰ３Ｕ１株は大日本製薬から入手した
。この細胞は１０％馬血清（Ｆｌｏｗ）、２ｍＭのし一
グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１００１
０／−のペニシリン、１）００Ｐ／−のストレプトマイ
シンを含むＤ−ＭＥＭ培地で継代培養した。

なお、本発明で用いた酵素抗体法は、ケネット（Ｋｅｎ
ｎｅｔｔ）らの方法〔モノクローナル　アンチボディー
（ブレニウム　プレス）ニューヨーク　ロンドン、　３
７６、　（１９８０））に準じて細胞をそのまま利用す
るエリザ（ＥＬＩＳ＾）法（エンザイム　リンクド　イ
ムノソルベント　アッセイ（１！ｎｚｙｍｅ　Ｌｉｎｋ
ｅｄ１＋＊ｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓ５ａｙ））　
（以下、ＣＥＬＩＳ＾と略す）である。

（以下余白）表２（以下余白）ＣＥＬ　Ｉ　ＳＡ反応性は、＋＋＋、＋＋、＋は反応陽
性と判定、士は縦隔性と判定される測定検体の程度で示
した。−は陰性を示した。

ＣＥＬ　Ｉ　ＳＡ法におけるＯ　Ｄ　４　ｑ。値は、−
：Ｏ，ＯＳ未満 ±　　：　０．０５以上０．１未満＋　　　’：ｏ、ｘ以上０．４未満＋＋：０．４以上０．７未満＋＋十：０．７以上である。

（／’７）、　　（１ｇ）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）胆管癌由来株（ＨＥＫ）を免疫原として作製され
たハイブリドーマの産生する以下の特性を持つモノクロ
ーナル抗体。［１］Ｉｇクラス（サブクラス）：ＩｇＧ、［２］認識
抗原タイプ：分泌型抗原［３］癌細胞との反応性：少なくとも胃癌（ＫＡＴＯ−
III）（ＭＫＮ−４５）（ＣＯＬＯ−２０１）に対して
陽性を示す。
（２）癌細胞との反応性が、さらに食道癌（ＴＥ−３）
（ＴＥ−７）（ＴＥ−９）、肺癌（ＰＣ−３）に対して
陽性を示す特許請求の範囲第（１）項記載のモノクロー
ナル抗体。