JPS6236398A - モノクロ−ナル抗体 - Google Patents
モノクロ−ナル抗体Info
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- JPS6236398A JPS6236398A JP17567085A JP17567085A JPS6236398A JP S6236398 A JPS6236398 A JP S6236398A JP 17567085 A JP17567085 A JP 17567085A JP 17567085 A JP17567085 A JP 17567085A JP S6236398 A JPS6236398 A JP S6236398A
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- cell
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- cells
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔技術分野〕
本発明は、胃低分化型腺癌由来細胞株（Ｍｌ−４５）を
免疫原として作製されたハイブリドーマの産生ずる特定
の特性を持つモノクローナル抗体に関する。
免疫原として作製されたハイブリドーマの産生ずる特定
の特性を持つモノクローナル抗体に関する。
癌研究の究極の目標は、抗癌、制癌作用を示す物質の探
索と、癌の早期発見、即ち早期診断法の確立にあるとい
える。従来、癌に関して種々の薬剤、治療法、試薬が開
発されているが、これらはいずれも癌細胞ばかシでなく
、正常組織、正常細胞にも影響を与え、如何に有効な薬
剤とはいえ、その副作用のために使用が著しく制限され
ているのが現状である。
索と、癌の早期発見、即ち早期診断法の確立にあるとい
える。従来、癌に関して種々の薬剤、治療法、試薬が開
発されているが、これらはいずれも癌細胞ばかシでなく
、正常組織、正常細胞にも影響を与え、如何に有効な薬
剤とはいえ、その副作用のために使用が著しく制限され
ているのが現状である。
免疫反応（抗原−抗体反応）は、非常に特異性が高いも
のであるが、従来のポリクローナル抗体ではいかに吸収
操作を繰り返しても、例えばリンノ球間のサブセットの
ような、非常にマイナーな抗原決定基によって区別され
るものを認識することは困難であった。ミルスティン（
Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）らによって開発されたモノクローナ
ル抗体〔ケーラー、ジーおよびミルスティン、シー：ネ
ーチャー（Ｋｏｈｌｅｒ、 Ｇ、 ａｎｄ Ｍｉｌｓｔ
ｅｉｎ、 Ｇ、 ： Ｎａｔｕｒｅ） ２５６゜４９５
、 （１９７５））は、この壁を打ち破るものであシ、
癌細胞上の癌特異抗原、あるいは癌関連抗原を特異的に
認識するモノクローナル抗体を得ることによυ、正常紅
織へのダメージを与えずに癌細胞のみを特異的に排除で
きるものと期待される。また、モノクローナル抗体を用
いた診断薬あるいは検査試薬は、正常血清成分に対する
交叉反応がなく、感度良く、癌関連抗原、癌特異抗原を
検出できるものと思われる。
のであるが、従来のポリクローナル抗体ではいかに吸収
操作を繰り返しても、例えばリンノ球間のサブセットの
ような、非常にマイナーな抗原決定基によって区別され
るものを認識することは困難であった。ミルスティン（
Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）らによって開発されたモノクローナ
ル抗体〔ケーラー、ジーおよびミルスティン、シー：ネ
ーチャー（Ｋｏｈｌｅｒ、 Ｇ、 ａｎｄ Ｍｉｌｓｔ
ｅｉｎ、 Ｇ、 ： Ｎａｔｕｒｅ） ２５６゜４９５
、 （１９７５））は、この壁を打ち破るものであシ、
癌細胞上の癌特異抗原、あるいは癌関連抗原を特異的に
認識するモノクローナル抗体を得ることによυ、正常紅
織へのダメージを与えずに癌細胞のみを特異的に排除で
きるものと期待される。また、モノクローナル抗体を用
いた診断薬あるいは検査試薬は、正常血清成分に対する
交叉反応がなく、感度良く、癌関連抗原、癌特異抗原を
検出できるものと思われる。
本発明は、特定の癌抗原に対して特異的に反応するモノ
クローナル抗体を提供するものである。
クローナル抗体を提供するものである。
さらに本発明は、上記特定癌に対する抗原検出用試薬を
提供するもめである。
提供するもめである。
本発明は、胃癌、特に胃癌の細胞膜表布型抗原に対して
特異的に反応するモノクローナル抗体よりなるものであ
る。
特異的に反応するモノクローナル抗体よりなるものであ
る。
本発明のモノクローナル抗体は、いわゆる細胞融合によ
って製造される。すなわち、抗体産生細胞と骨髄腫細胞
との間に、融合ハイブリッドを形成させ、該ハイブリッ
ドをクローン化し、上記癌細胞（即ち、上記特性を有す
る特定抗原）に対し特異性を示す抗体を産生ずるクロー
ンを選択することによって製造される。その操作は、免
疫用細胞として下記細胞を使用する以外は、従来既知の
方法に準ずればよい。
って製造される。すなわち、抗体産生細胞と骨髄腫細胞
との間に、融合ハイブリッドを形成させ、該ハイブリッ
ドをクローン化し、上記癌細胞（即ち、上記特性を有す
る特定抗原）に対し特異性を示す抗体を産生ずるクロー
ンを選択することによって製造される。その操作は、免
疫用細胞として下記細胞を使用する以外は、従来既知の
方法に準ずればよい。
抗体産生細胞は、例えば株化癌細胞よシ得られる抗原に
よ・つて免疫された動物からの牌細胞、リンパ節細胞、
Ｂ−リンパ球である。株化癌細胞としては、前低分化型
腺癌由来の株化癌細胞（ＭＫＮ−４５）が例示される。
よ・つて免疫された動物からの牌細胞、リンパ節細胞、
Ｂ−リンパ球である。株化癌細胞としては、前低分化型
腺癌由来の株化癌細胞（ＭＫＮ−４５）が例示される。
免疫される動物としてはマウス、ラット、馬、ヤギ、ウ
サギなどが例示される。
サギなどが例示される。
抗体産生細胞は、たとえば次のようにして製造される。
すなわち、胃癌由来細胞株ＭＫＮ−４５（低分化型腺癌
）を超音波処理等で破壊し、遠心分離（例、１０，００
０〜２０，０００ Ｇ、１０〜６０分）を行って細胞抽
出液を得、この上清を分子量１０万〜２００万の物質の
分離が可能なゲル濾過担体（例、セファデックス、セフ
ァクリル、セファロース、）２イオゲル等）を使用して
分子篩し、高分子画分と低分子画分とに分離する。かく
して得られた分子量が約７０万〜１５０万の高分子画分
は、たとえば、完全７０インｒアジユバント（Ｆｒθｕ
ｎｉＣｏｍｐ１ｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ）と混和後、
動物の免疫用として使用する。免疫は動物の皮下、筋肉
内あるいは腹腔内に約１．５ Ｘ １０〜１０ ｃｅｌ
ｌ相当分／回を週１〜２回、３〜７週間投与することに
よって行われる。最終免疫より約３〜５日後、免疫動物
から抗体産生細胞を分取する。
）を超音波処理等で破壊し、遠心分離（例、１０，００
０〜２０，０００ Ｇ、１０〜６０分）を行って細胞抽
出液を得、この上清を分子量１０万〜２００万の物質の
分離が可能なゲル濾過担体（例、セファデックス、セフ
ァクリル、セファロース、）２イオゲル等）を使用して
分子篩し、高分子画分と低分子画分とに分離する。かく
して得られた分子量が約７０万〜１５０万の高分子画分
は、たとえば、完全７０インｒアジユバント（Ｆｒθｕ
ｎｉＣｏｍｐ１ｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ）と混和後、
動物の免疫用として使用する。免疫は動物の皮下、筋肉
内あるいは腹腔内に約１．５ Ｘ １０〜１０ ｃｅｌ
ｌ相当分／回を週１〜２回、３〜７週間投与することに
よって行われる。最終免疫より約３〜５日後、免疫動物
から抗体産生細胞を分取する。
骨髄肺細胞としては、マウス、ラット、ヒト等由来のも
のが使用される。抗体産生細胞と骨髄細胞とは同種動物
由来のものであることが好ましい。
のが使用される。抗体産生細胞と骨髄細胞とは同種動物
由来のものであることが好ましい。
細胞融合は１例えばジー、ガルファー（Ｇ。
Ｇａ１ｆｒｅ ） （ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ） ２
６６、５５０（１９７７））に記載の方法またはこれに
準する方法によって行われる。この際、３０〜５０チポ
リエチレンダリコール（平均分子量１，０００〜４，０
００ ＞を用いて３０〜４０℃の温度下、約１〜３分間
程度反応させることによって行われる。
６６、５５０（１９７７））に記載の方法またはこれに
準する方法によって行われる。この際、３０〜５０チポ
リエチレンダリコール（平均分子量１，０００〜４，０
００ ＞を用いて３０〜４０℃の温度下、約１〜３分間
程度反応させることによって行われる。
細胞融合によって得られた細胞は目的とするモノクロー
ナル抗体を産生ずるクローンのスクリーニングに付され
る。すなわち、当該細胞を１例えばマイクロプレート中
で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清中の抗体価
を、例えば酵素抗体法などによって測定し、適切な抗体
を産生じているウェルを得る。このようなウェルからさ
らに例えば限界希釈法によってクローニングを行ってク
ローンを得る。このクローンは、例えばあらかじめプリ
スタンを投与したＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内へ移植し
、１０〜３０日後にモノクローナル抗体を高濃度に含む
腹水を採取し、検定する。選ばれたクローンの産生ずる
モノクローナル抗体の回収は、免疫グロブリンの精製法
として従来既知の硫安分画法、ＰＥＧ分画法、エタノー
ル分画法、陰イオン交換体を応用することで、容易に達
成される。
ナル抗体を産生ずるクローンのスクリーニングに付され
る。すなわち、当該細胞を１例えばマイクロプレート中
で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清中の抗体価
を、例えば酵素抗体法などによって測定し、適切な抗体
を産生じているウェルを得る。このようなウェルからさ
らに例えば限界希釈法によってクローニングを行ってク
ローンを得る。このクローンは、例えばあらかじめプリ
スタンを投与したＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内へ移植し
、１０〜３０日後にモノクローナル抗体を高濃度に含む
腹水を採取し、検定する。選ばれたクローンの産生ずる
モノクローナル抗体の回収は、免疫グロブリンの精製法
として従来既知の硫安分画法、ＰＥＧ分画法、エタノー
ル分画法、陰イオン交換体を応用することで、容易に達
成される。
本発明によって得られたモノクローナル抗体は、腺癌系
に特異的と考えられ、細胞膜表布型抗原を認識し、かつ
正常組織由来培養細胞とは反応せず。
に特異的と考えられ、細胞膜表布型抗原を認識し、かつ
正常組織由来培養細胞とは反応せず。
癌特異的な抗原を認識するものと推測される。すなわち
、本発明からなるモノクローナル抗体は腫瘍のイメージ
ングおよび制癌剤とコンジュゲートさせ ｔａｒｇｅｔ
ｉｎｇ ｔｈｅｒａｐｙ （ターゲテイング セラビイ
）等への臨床応用が期待される。
、本発明からなるモノクローナル抗体は腫瘍のイメージ
ングおよび制癌剤とコンジュゲートさせ ｔａｒｇｅｔ
ｉｎｇ ｔｈｅｒａｐｙ （ターゲテイング セラビイ
）等への臨床応用が期待される。
実施例
（１）免疫用癌関連抗原の調製：
株化胃癌細胞（ＭＫＮ−４５株）を超音波処理法で破壊
し、遠心分離（１５，０ＯＯＧ、３０分）を行い細胞抽
出液を得た。この上清をセファロース４Ｂのカラムを用
い、ゲル濾過し、高分子画分と低分子画分とに分離した
。
し、遠心分離（１５，０ＯＯＧ、３０分）を行い細胞抽
出液を得た。この上清をセファロース４Ｂのカラムを用
い、ゲル濾過し、高分子画分と低分子画分とに分離した
。
分子量が約７０万〜１５０万の高分子画分を、完全７０
インド１アジユバントと混和後、マウスへ週１回、５週
間免疫した。
インド１アジユバントと混和後、マウスへ週１回、５週
間免疫した。
最終免疫より３日後にマウス肺臓を取り出し、以下の細
胞融合に用いた。
胞融合に用いた。
（２）細胞融合およびクローニング：
上記のマウス牌細胞と、マウスミエローマＸ ６３．６
．５．３ジヤーナル オブ イムノロジー（；ｆ、Ｉｍ
ｔｎｕｎｏｌ、 Ｉｓ狙、 １５４８． （１９７９）
）とをｌ＝１の割合で混合し、ケーラー（Ｋ６ｈ１ｅｒ
） らの方法〔イムノロジカル メソッド（アカデ
ミツク プレス）、ニューヨーク（工ｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ（Ａｃａａａｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ）、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 ３９１．’ １９７９）
）を一部改変して、４２．６１ポリエチレンダリコール
（平均分子ｉ１１，０００ ）を用いて１分間反応させ
ることにより細胞融合を行った。
．５．３ジヤーナル オブ イムノロジー（；ｆ、Ｉｍ
ｔｎｕｎｏｌ、 Ｉｓ狙、 １５４８． （１９７９）
）とをｌ＝１の割合で混合し、ケーラー（Ｋ６ｈ１ｅｒ
） らの方法〔イムノロジカル メソッド（アカデ
ミツク プレス）、ニューヨーク（工ｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ（Ａｃａａａｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ）、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 ３９１．’ １９７９）
）を一部改変して、４２．６１ポリエチレンダリコール
（平均分子ｉ１１，０００ ）を用いて１分間反応させ
ることにより細胞融合を行った。
本細胞を９６ウエルマイクロプレートに植え込み、ＨＡ
Ｔ培地Ｃ表１）で９〜１４日間培養後、ＨＴ培地（表１
）に移行し、更にフラスコ（２５♂）に培養セきるよう
になってからＤ−ＭＥＭ培地（表１）で培養した。増殖
の見られたウェルの培養上清中の抗体価を酵素抗体法に
よシ測定し、適切なウェルから限界希釈法により、求め
るノ・イブリドーマのクローニングを行った。
Ｔ培地Ｃ表１）で９〜１４日間培養後、ＨＴ培地（表１
）に移行し、更にフラスコ（２５♂）に培養セきるよう
になってからＤ−ＭＥＭ培地（表１）で培養した。増殖
の見られたウェルの培養上清中の抗体価を酵素抗体法に
よシ測定し、適切なウェルから限界希釈法により、求め
るノ・イブリドーマのクローニングを行った。
すなわち、マイクロタイタープレートにウェル当た。！
２２５，０００個のマウス腹腔浸出細胞を植え込み、次
にＤ−ＭＥＭ培地で、１０．５．２．５．１個７０．１
−となるようにハイプリドーマを希釈し、これをマイク
ロタイタープレートに０．１ ｔｘｌずつ植え込み培養
した。４日後にＤ−ＭＥＭ培地を０．１１ＬＬ７？加、
ｔ、以後４〜７日に１度培地の半量交換を行った。培養
開始後１０〜２０日で肉眼で認められるコロニーが形成
され、クローン株を得た。
２２５，０００個のマウス腹腔浸出細胞を植え込み、次
にＤ−ＭＥＭ培地で、１０．５．２．５．１個７０．１
−となるようにハイプリドーマを希釈し、これをマイク
ロタイタープレートに０．１ ｔｘｌずつ植え込み培養
した。４日後にＤ−ＭＥＭ培地を０．１１ＬＬ７？加、
ｔ、以後４〜７日に１度培地の半量交換を行った。培養
開始後１０〜２０日で肉眼で認められるコロニーが形成
され、クローン株を得た。
表 １
（イ）Ｄ−ＭＥＭ培地：
ダルベツコの修正イーグル培地（Ｄｕ１ｂｅｃｃｏ’ｓ
ｍｏｄ１ｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ （
日水製薬社製月に以下の添加物を加えたもの。
ｍｏｄ１ｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ （
日水製薬社製月に以下の添加物を加えたもの。
添加物：
（終濃度） （成分）
１０チ 馬血清 （Ｆ’１ＯＷ）３００〜／
ｌ ジーグルタミン １１０ １１１Ｊ／７３ ソディウム ピルベー
ト１００ 工、υ、／ｒｔｌ−！ニジリン１００ １１
１１〆−ストレプトマイシン３５ ｇ／ｌ グル
コース ３．７ｇ／１ＮａＨＣＯ３ 仲） ＨＡＴ培地： Ｄ−ＭＥＭ培地に以下の添加物を添加 ｌＸｌ０−４Ｍ ヒポキサンチン ４Ｘ１０’７Ｍ アミノプテリン １．６ Ｘ １０−５Ｍ チミジン（ハ） ＨＴ培
地： ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地（３）
スクリーニング法 得られたバイブリド９−マについて目的とするモノクロ
ーナル抗体を産生ずるクローンのスクリーニングを次の
ように行った。
ｌ ジーグルタミン １１０ １１１Ｊ／７３ ソディウム ピルベー
ト１００ 工、υ、／ｒｔｌ−！ニジリン１００ １１
１１〆−ストレプトマイシン３５ ｇ／ｌ グル
コース ３．７ｇ／１ＮａＨＣＯ３ 仲） ＨＡＴ培地： Ｄ−ＭＥＭ培地に以下の添加物を添加 ｌＸｌ０−４Ｍ ヒポキサンチン ４Ｘ１０’７Ｍ アミノプテリン １．６ Ｘ １０−５Ｍ チミジン（ハ） ＨＴ培
地： ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地（３）
スクリーニング法 得られたバイブリド９−マについて目的とするモノクロ
ーナル抗体を産生ずるクローンのスクリーニングを次の
ように行った。
（イ）方法の説明
以下のようにして酵素抗体法を行った。
抗原（各種株化癌細胞または部分精製癌関連抗原または
正常細胞）をコートしたマイクロプレートに検体を加え
、３７℃で１時間反応させ、洗浄後イルオキシダーゼ標
識抗マウス免疫グロブリン（工ｇＧ十工ｇＡ＋ＩｇＭ）
ウサギ抗体を加え、さらに３７℃で１時間反応させた。
正常細胞）をコートしたマイクロプレートに検体を加え
、３７℃で１時間反応させ、洗浄後イルオキシダーゼ標
識抗マウス免疫グロブリン（工ｇＧ十工ｇＡ＋ＩｇＭ）
ウサギ抗体を加え、さらに３７℃で１時間反応させた。
未反応の標識抗体を洗浄除去後、０−フェニレンジアミ
ン液を加え、室温にて３００分間反応せた後、２Ｍ硫酸
を加えて反応を停止させ、４９０ｎｍの吸光度を測定し
た。
ン液を加え、室温にて３００分間反応せた後、２Ｍ硫酸
を加えて反応を停止させ、４９０ｎｍの吸光度を測定し
た。
この方法で各種細胞との反応性を調べた。なお白血球と
の交叉反応性はβ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａ１ａｃ
ｔｏｓｉｄａａｅ ）標識抗体を用いた。その他、ヒト
赤血球との交叉反応性は、ヒ）Ａ、Ｂ、０型赤血球を混
合し、ＰＨＡ法で検討した。との交叉反応性は、ＣＥＡ
感作血球を用いＰＨＡ法で行った。
の交叉反応性はβ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａ１ａｃ
ｔｏｓｉｄａａｅ ）標識抗体を用いた。その他、ヒト
赤血球との交叉反応性は、ヒ）Ａ、Ｂ、０型赤血球を混
合し、ＰＨＡ法で検討した。との交叉反応性は、ＣＥＡ
感作血球を用いＰＨＡ法で行った。
モノクローナル抗体がＭＫＮ−４５の分泌物抗原か或い
は細胞膜抗原のどちらを認識しているかの検討のために
、ＭＫＮ−４５の培養上清でモノクローナル抗体とＭＫ
Ｎ−４５細胞そのものとの反応性が阻害されるかどうか
を調べた；酵素抗体法を用いたインヒビショ／ テスト
（工ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ Ｔｅａｔ、）の具体的な方法
は、以下＋７）通υである。即ち、ハイシリドーマの上
清を酵素抗体法でタイトレージョン（ｔｉｔｒａｔｉｏ
ｎ ）を行い、それよ）判断して適当な希釈倍率を決め
る。次に、ＭＫＮ−４５培養上清を５〜２５倍濃縮した
ものを原液として、１：５．１：５２・・・・・・１：
５ｎ希釈した亀のを適当に希釈したハイプリドーマ上清
にそれぞれ等量加え、１時間、３７℃でインキュベーシ
ョンする。そして、通常の酵素抗体法（ターゲット：
ＭＩＮ−４５）の系でアッセイ（ａｓｓａｙ）を行った
。
は細胞膜抗原のどちらを認識しているかの検討のために
、ＭＫＮ−４５の培養上清でモノクローナル抗体とＭＫ
Ｎ−４５細胞そのものとの反応性が阻害されるかどうか
を調べた；酵素抗体法を用いたインヒビショ／ テスト
（工ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ Ｔｅａｔ、）の具体的な方法
は、以下＋７）通υである。即ち、ハイシリドーマの上
清を酵素抗体法でタイトレージョン（ｔｉｔｒａｔｉｏ
ｎ ）を行い、それよ）判断して適当な希釈倍率を決め
る。次に、ＭＫＮ−４５培養上清を５〜２５倍濃縮した
ものを原液として、１：５．１：５２・・・・・・１：
５ｎ希釈した亀のを適当に希釈したハイプリドーマ上清
にそれぞれ等量加え、１時間、３７℃でインキュベーシ
ョンする。そして、通常の酵素抗体法（ターゲット：
ＭＩＮ−４５）の系でアッセイ（ａｓｓａｙ）を行った
。
（ロ）スクリーニングの流れ
１次スクリーニング：ターゲットセル（ＭＫＮ−４５）
および正常由来細胞（Ｆ’１ｏｗ ２０００）を用いた
酵素抗体法で、ＭＫＮ−４５に対して陽性でＦ’ｌｏｗ
２０００に対して陰性なウェルを選抜。
および正常由来細胞（Ｆ’１ｏｗ ２０００）を用いた
酵素抗体法で、ＭＫＮ−４５に対して陽性でＦ’ｌｏｗ
２０００に対して陰性なウェルを選抜。
２次スクリーニング：さらに他の正常由来細胞株（Ｆ’
１ｏｖｒ １０００． Ｃ０Ｄ−４５ｓｋ、 ＴＣＬ−
５９１８゜ＷＩＳＨ，Ｆ’Ｌ ）及び赤血球、白血球を
用いたアッセイ系ですべてに陰性のウェルを選抜。
１ｏｖｒ １０００． Ｃ０Ｄ−４５ｓｋ、 ＴＣＬ−
５９１８゜ＷＩＳＨ，Ｆ’Ｌ ）及び赤血球、白血球を
用いたアッセイ系ですべてに陰性のウェルを選抜。
３次スクリーニング二以上で選抜された細胞株を２〜３
回クローニングし、その培養上清を多くの癌由来の株化
細胞（ｃｅｌｌｘｔｎｅ）との反応性を検討するととも
に、分泌型或いは細胞膜表布型抗原のどちらを認識する
かを、酵素抗体法を用いたインヒビジョンテストで同定
する。
回クローニングし、その培養上清を多くの癌由来の株化
細胞（ｃｅｌｌｘｔｎｅ）との反応性を検討するととも
に、分泌型或いは細胞膜表布型抗原のどちらを認識する
かを、酵素抗体法を用いたインヒビジョンテストで同定
する。
（４１モノクローナル抗体の回収、精製（イ）上記のス
クリーニングによって得られたクローン株を予め０．５
ｔｄ／匹シクシリスタン与した４週令以後のＢＡＬＢ
／Ｃマウス（雄）の腹腔内へ２．０〜３．ＯＸ １０
ｃｅ１１／匹移植し、１０〜３０日後にモノクローナ
ル抗体を高濃度に含む腹水を採取した。
クリーニングによって得られたクローン株を予め０．５
ｔｄ／匹シクシリスタン与した４週令以後のＢＡＬＢ
／Ｃマウス（雄）の腹腔内へ２．０〜３．ＯＸ １０
ｃｅ１１／匹移植し、１０〜３０日後にモノクローナ
ル抗体を高濃度に含む腹水を採取した。
この腹水を０．９４ ＮａＣ１液を加える５〜１０倍希
釈した後、硫酸アンモニウムを４０４Ｊ濃度となるよう
に加え、沈澱画分を分取した。この沈澱画分をなるべく
少量の０．９％Ｎ＆Ｃ１液で溶解させた後、０．９％Ｎ
ａＣＪ液を外液として透析した。透析終了後高速液体ク
ロマトグラフィー（ＴＳＫ −Ｇθ１１Ｇ−３０００Ｓ
Ｗ）を行い、１１０画分を得、精製モノクローナル抗体
とした。
釈した後、硫酸アンモニウムを４０４Ｊ濃度となるよう
に加え、沈澱画分を分取した。この沈澱画分をなるべく
少量の０．９％Ｎ＆Ｃ１液で溶解させた後、０．９％Ｎ
ａＣＪ液を外液として透析した。透析終了後高速液体ク
ロマトグラフィー（ＴＳＫ −Ｇθ１１Ｇ−３０００Ｓ
Ｗ）を行い、１１０画分を得、精製モノクローナル抗体
とした。
（ロ）本りローン株は、ＢＳＡ含無血清培地中でも増殖
させることができる。すなわち、Ｑ、５％ＢＳＡ含無血
清培地（Ｒ工ＴＣ５５−９培地）中で増殖させ、培養上
清を集めた。この上清に硫酸アンモニウムを４０％濃度
となるように加え、沈澱画分を分取し、これに０．９
％ Ｎａ（Ｉｌ液を加え、溶解させた後、さらに硫酸ア
ンモニウムを４０チ濃度となるように加え沈澱画分を分
取した。この沈澱画分をなるべく少量の９．９４ Ｎａ
Ｃ４液で溶解させた後、０．０２Ｍ生理的リン酸緩衝液
を外液として透析しし透析終了後、ＤＥＡＥ−セルロフ
ァインカラムに加え、カラムクロマトダラフイーを行っ
た。
させることができる。すなわち、Ｑ、５％ＢＳＡ含無血
清培地（Ｒ工ＴＣ５５−９培地）中で増殖させ、培養上
清を集めた。この上清に硫酸アンモニウムを４０％濃度
となるように加え、沈澱画分を分取し、これに０．９
％ Ｎａ（Ｉｌ液を加え、溶解させた後、さらに硫酸ア
ンモニウムを４０チ濃度となるように加え沈澱画分を分
取した。この沈澱画分をなるべく少量の９．９４ Ｎａ
Ｃ４液で溶解させた後、０．０２Ｍ生理的リン酸緩衝液
を外液として透析しし透析終了後、ＤＥＡＥ−セルロフ
ァインカラムに加え、カラムクロマトダラフイーを行っ
た。
Ｄｌｌｉ：ＡＥ−セルロファインクロマトダラフイーの
最初のピーク部分を精製モノクローナル抗体とした。
最初のピーク部分を精製モノクローナル抗体とした。
（５）モノクローナル抗体の特性
かくしてスクリーニングされたクローンの産生ずるモノ
クローナル抗体の性状は、表２及び表３のとおシである
。免疫グロブリンのクラスはオフタロニー法で検定した
。
クローナル抗体の性状は、表２及び表３のとおシである
。免疫グロブリンのクラスはオフタロニー法で検定した
。
なお、本発明で用いた酵素抗体法は、ケネット（Ｋｅｎ
ｎｅｔｔ ）らの方法〔モノクロナル アンチボデ（−
（フレニウム プレス）ニューヨーク リント０ン、ｙ
互、 （１９８０））に準じて細胞をそのまま利用す
るエリザ（ＥＬ工ＺＡ）法〔エンザイム リンクトウ
イムノソルイント アッセイ（ＥｎｚｙｍθＬｉｎｋｅ
ｄ工ｍｍｕｎｏａｏｒｂｅｎｔ Ａｓ５ａｙ） ） （
以下、ＣＥＬＩＳＡと略す〕である。
ｎｅｔｔ ）らの方法〔モノクロナル アンチボデ（−
（フレニウム プレス）ニューヨーク リント０ン、ｙ
互、 （１９８０））に準じて細胞をそのまま利用す
るエリザ（ＥＬ工ＺＡ）法〔エンザイム リンクトウ
イムノソルイント アッセイ（ＥｎｚｙｍθＬｉｎｋｅ
ｄ工ｍｍｕｎｏａｏｒｂｅｎｔ Ａｓ５ａｙ） ） （
以下、ＣＥＬＩＳＡと略す〕である。
ＣＥＬ工ＳＡ反応性は、士は反応陽性と判定される測定
検体の程度で示した。−は陰性を示した。
検体の程度で示した。−は陰性を示した。
ＣＥＬＩＳＡ法における０Ｄ４９０値
−二 ０〜０．１
＋ ：ｏ、２〜０．４９
＋＋：ｏ、５〜０．９９
＋＋＋：１．Ｑ以上
手続補正書
昭和６０年１０月２９日
１；「配・
」（ｊ
１、事件の表示
昭和６０年特許願第 １７５６７０ 号２、発明の名
称 モノクローナル抗体 ３、補正をする者 事件との関係°特許出願人 名称株式会社 ミドリ十字 霞が関ビル内郵便局 私古箱第４９９ ）、ｈ ６、補正により増加する発明の数 ０ Ｌ 明細書の「発明の詳細な説明」の記載を以下の如く
補正する。
称 モノクローナル抗体 ３、補正をする者 事件との関係°特許出願人 名称株式会社 ミドリ十字 霞が関ビル内郵便局 私古箱第４９９ ）、ｈ ６、補正により増加する発明の数 ０ Ｌ 明細書の「発明の詳細な説明」の記載を以下の如く
補正する。
（１）第２頁１８行目の「Ｍｉｌｓｔｅｉｎ＊Ｇ、Ｊを
「Ｍｉ １ｓｔｅｉｎ、 Ｃ，Ｊと補正ｆる。
「Ｍｉ １ｓｔｅｉｎ、 Ｃ，Ｊと補正ｆる。
（２）第９頁１４行目の「レーグルタミン」を「Ｌ−グ
ルタミン」と補正する。
ルタミン」と補正する。
（３）第１０頁１３〜１４行目の「マイクロプレート」
を「マイクロプレート」と補正する。
を「マイクロプレート」と補正する。
（４） 第１１頁５行目の「どの交叉」の前に「癌胎
児性抗原（ＣＥＡ （ｃａ ｒｃ ｉｎｏ ｅｍｂトｙ
６ｒｙｔｃａｎｔｉｇｅｎ））ｊを挿入する。
児性抗原（ＣＥＡ （ｃａ ｒｃ ｉｎｏ ｅｍｂトｙ
６ｒｙｔｃａｎｔｉｇｅｎ））ｊを挿入する。
（５）第１２頁１１行目のｒＦｌｏｗｌｏｏｏｊを「Ｆ
１ｏｗ２００口」と補正する。
１ｏｗ２００口」と補正する。
（６）第１４頁１８行目のｒＥＬＩＺＡＪをｒＥＬＩｓ
Ａｊと補正する。
Ａｊと補正する。
（７） 第１４頁１８〜１９行目の「リンクトウ」を
「リンクド」と補正する。
「リンクド」と補正する。
特許請求の範囲
冑低分化型豚癌由来細胞株（ＭＫＮ−４５）を免疫原と
して作製されたハイシリドーマの産生ずる以下ノ特性を
持つモノクローナル抗体。
して作製されたハイシリドーマの産生ずる以下ノ特性を
持つモノクローナル抗体。
■ Ｉ＆クラス（Ｌ鎖） ： １．！７Ｇ１Ｃｋ’）■
認識抗原タイプ：細胞膜表在型抗原［３］ 癌細胞と
の反応性： 次の癌細胞に対して陽性を示す。
認識抗原タイプ：細胞膜表在型抗原［３］ 癌細胞と
の反応性： 次の癌細胞に対して陽性を示す。
肺癌（ＰＣ−３）、冑癌（ＫＡＴＯ−１１ｔ）、冑癌（
ＭＫＮ−４５）、結腸癌（ＣＯＬＯ−２０１）。
ＭＫＮ−４５）、結腸癌（ＣＯＬＯ−２０１）。
肝１（ＨＥＫ）。
Claims (1)
- （１）胃低分化型腺癌由来細胞株（ＭＫＮ−４５）を免
疫原として作製されたハイブリドーマの産生する以下の
特性を持つモノクローナル抗体。 ［１］Ｉｇクラス（Ｌ鎖）：ＩｇＧ＿１（ｋ）［２］認
識抗原タイプ：細胞膜表在型抗原 ［３］癌細胞との反応性： 次の癌細胞に対して陽性を示す。 肺癌（ＰＣ−３）、胃癌（ＫＡＴＯ−III）、胃癌（Ｍ
ＫＮ−４５）、結腸癌（ＣＯＬＯ２０１）、肝癌（ＨＥ
Ｋ）。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17567085A JPS6236398A (ja) | 1985-08-12 | 1985-08-12 | モノクロ−ナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17567085A JPS6236398A (ja) | 1985-08-12 | 1985-08-12 | モノクロ−ナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6236398A true JPS6236398A (ja) | 1987-02-17 |
Family
ID=16000176
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17567085A Pending JPS6236398A (ja) | 1985-08-12 | 1985-08-12 | モノクロ−ナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6236398A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6321562A (ja) * | 1986-07-15 | 1988-01-29 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 抗ヒト胃癌単クロ−ン性抗体ａｍｃ−４６２ |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61167699A (ja) * | 1985-01-19 | 1986-07-29 | Green Cross Corp:The | モノクロ−ナル抗体 |
| JPS61250000A (ja) * | 1985-04-27 | 1986-11-07 | Green Cross Corp:The | モノクロ−ナル抗体 |
-
1985
- 1985-08-12 JP JP17567085A patent/JPS6236398A/ja active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61167699A (ja) * | 1985-01-19 | 1986-07-29 | Green Cross Corp:The | モノクロ−ナル抗体 |
| JPS61250000A (ja) * | 1985-04-27 | 1986-11-07 | Green Cross Corp:The | モノクロ−ナル抗体 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6321562A (ja) * | 1986-07-15 | 1988-01-29 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 抗ヒト胃癌単クロ−ン性抗体ａｍｃ−４６２ |
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