JPS6321562A - 抗ヒト胃癌単クロ−ン性抗体ａｍｃ−４６２ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ＩｇＧ１クラスに属し、消化器癌に対して反
応性を有する単クローン性抗体ＡＭＣ−４６２右よびこ
れを用いる消化器癌の検出方法に関する。本発明は消化
器癌の診断、とくに膵癌の診断に使用することができ、
診断薬の分野で利用可能である。

従来技術 従来、消化器癌の腫瘍マーカーとして癌胎児性抗原（Ｃ
ＥＡ）が知られており、ＣＥＡを抗ＣＥＡ血清（ポリク
ローナル抗体）を用いて測定することにより消化器癌を
検出する方法が知られている。また抗ＣＥＡ単クローン
性抗体を用いる消化器癌の検出法も開発されている。Ｃ
ＥＡ測定による血清診断は、その陽性率が３０〜６０％
であり、消化器癌患者のスクリーニングには十分でない
。

最近、大腸癌細胞株に対する単クローン性抗体Ｎ５１９
　９を用いる血清診断で、膵癌、胆管癌などが８０％近
い陽性率で検出され、また膵癌細胞株に対する単クロー
ン性抗体ＤｕＰａｎ−２を用いる血清診断で、膵癌が６
０〜７０％の陽性記で検出されている〔治療学、１５　
、４８４（１９８５））。

発明が解決すべき問題点 上述のごとく、Ｎ５１９−９やＤｕＰａｎ−２の単クロ
ーン性抗体を用いる血清診断で、膵癌は８０％近く検出
できるが、なお２０％近くが陰性と判断されてしまう。

残る２０％についても検出できる単クローン性抗体が有
れば膵癌の診断にとって非常に有利である。

問題点を解決するための手段 本発明者は、ヒト胃癌膜成分を免疫源として樹立したハ
イブリドーマが生産する単クローン性抗体ＡＭＣ−４６
２が、消化器癌とくに膵癌で高い陽性率を示し、Ｎ５１
９−９やＤｕＰａｎ−２を用いる血清診断で陰性と診断
された例をも陽性として検出できることを見出し本発明
を完成した。

以下本発明について詳細に説明する。

本発明は、ヒト胃癌組織膜成分で免疫したマウスの牌細
抱とマウス骨Ｎ腫細胞とを融合させてハイブリドーマを
作製し、ヒト胃癌に反応性を有する単クローン性抗体を
選択し、該ハイブリドーマを培地中に培養するかマウス
に投与して該マウスで腹水化し、該培養物または腹水よ
り採取することにより１辱られ、かつシアル酸化された
糖蛋白質または糖脂質を抗原として認識する抗ヒト胃癌
反応性単クローン性抗体を提供する。

本発明の単クローン性抗体は、ＩｇＧ１クラスに属し、
消化器癌細胞に反応し、シアル酸化された糖蛋白質また
は糖脂質を抗原として認識する。

本発明単クローン性抗体の具体例としては、ハイブリド
ーマ細胞株ＡＭＣ−４６２（ＥＣＡＣＣｇ６θＳＯＪ？
０／　）が生産するＡＭＣ−４６２があげられる。

以下に本発明単クローン性抗体の製造法を詳細に説明す
る。

（１）動物の免疫と抗体産生細胞の調製３〜１０焉令、
望ましくは８退会のマウスに、ヒト胃癌の細胞１組織あ
るいはそれらの膜成分を免疫して、その動物の牌、リン
パ節、末哨血中の抗体産生細胞を調製する。免疫するマ
ウスはヒト正常前細胞で前処理して免疫寛容にしたマウ
スを用いるのが好ましい。免疫の方法は、動物の皮下あ
るいは静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュバント〔
例えば、７０インドの完全アジュバント（Ｃｏｍｐｌｅ
ｔｅ　Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　Ａｄｊｕｖａｎｔ）または、
水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕とと
もにヒト胃癌細胞（１０６〜１０７細胞／匹）、ヒト胃
癌組織もしくはそれらの膜成分（膜断片）（１０〜５０
０Ｍｇ／匹）を投与する。以後、１〜２週問おきに抗原
を２〜５回投与する。各免疫後３〜７日目に眼底静脈叢
より採血し、その血清がヒト胃癌と反応することを以下
に示す酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）
：医学書腕利１９７６年〕などで調べる。

酵素免疫測定法： ９６大のＥＩＡ用プレート〔フロー・ラボラトリーズ（
Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製〕に、正常
あるいは腫瘍細胞１組織の膜成分（蛋白量として１０〜
１．０００Ｍｇ／ｍｌ含有する膜断片）を１００〜２０
０μｊ２／穴ずつ分注し、４℃で１〜２晩放置して、上
清を抜き去った後、レジン水あるいは、ＰＢＳ　（リン
酸二ナトリウム１．８３ｇ、　　リン酸−カリウム０．
２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸溜水ＩＣｐＨ７，２）でよ
く洗浄後、１％ＢＳＡ　（牛血清アルブミン）−ＰＢＳ
を１００〜２００μβ／大分注し、４℃で１〜２晩放置
して、プレート上に残った蛋白質との結合残基をブロッ
ク（ブロッキング）した。その後、ＢＳＡ−ＰＢＳを捨
て、レジン水あるいはＰＢＳでよく洗浄した後、第１抗
体として、ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈した試料（マウス血清
。

ハイブリドーマ培養上清、粗精製モノクローナル抗体）
を１００μＡ／大分注し、４℃で１晩放置する。レジン
水で１回、２Ｍ　　ＮａＣｊ！溶液で６回洗浄した後、
第２抗体としてウサギの抗マウスイムノグロブリンＩｇ
Ｇ−ペルオキシダーゼ結合物〔ダコ（ＤＡＫＯ）社製、
販売元協和メデックス〕の１００倍希釈液を１００μｇ
／穴分注し、室温で２時間放置する。

ＰＢＳでよく洗浄後、ＡＢＴＳ基質液〔２゜２′〜アジ
ノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸
）ニアンモニウム５５０ｍｇを０、１　Ｍクエン酸緩衝
液（１）８４．２）ＩＩｌに溶かした溶液に、使用直前
に過酸化水素１　ｄ　／＋１１１を加えた溶液〕を用い
、発色をＯＤ、、Ｓ。、の吸光度で測定する。このとき
、胃癌細胞、組織あるいはそれらの膜成分に対して強く
反応するマウスをヒト胃癌免疫マウスとしてハイブリド
ーマ作製のための抗体産生細胞の供給源として用いる。

酵素免疫測定法を行うにあたって、抗原として、細胞そ
のものを用いる場合は、ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）　
３０７２プレート中で、標的細胞を培養し、０．２５％
ゲルタールアルデヒド−ＰＢＳを加え、室温に１〜２時
間放置し、ＰＢＳでよく洗浄後、１％ＢＳ、Ａ−ＰＢＳ
１００〜２００４を加え、２時間放置し、レジン水また
はＰＢＳでよく洗浄し、そのプレートを用いて、一般の
抗原コートプレートを用いるのと同様の方法にて、抗体
価の測定を行った。

細胞融合に供するにあたって、免疫化マウスに融合処理
の３〜４日前に、ヒト胃癌細胞１粗織あるいはその膜成
分を２〜５　Ｘ　１０６細胞／匹あるいは２０〜４００
Ｍｇ／匹復腔内に投与し、膵臓細胞を摘出し、膵細胞を
調製する。

膵臓をＭＥＭ　（田水製薬社製）中で細断し、ピンセッ
トでほぐし、１２０Ｏｒｐｍ、５分間遠心分離にかけ、
上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム媛衡液（ｐｉ４
７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去し、Ｍ　Ｅ
　Ｍで３回洗浄して融合用肺細胞として提供する。

（２）骨髄腫細胞の調製 骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使
用する。たとえば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡ
ＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕｌ
　（Ｐ３−ＵＬ）〔カレント・トピックス・イン・ミク
ロバイオロジイーアンド・イムノロシイ−１（Ｃｕｒｒ
ｅｎｔＴｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　−１）　〕〔ヨーロ
ピアン・ジャーナル・オブ・イムノロシイ（Ｆｉｕｒｏ
ｐｅａｎ　Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）　　６．　
５１１−５１９（１９７６））　、ＳＰ２１０−Ａｇ　
１４　（ＳＰ−２）〔ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）　
２７６、２６９−２７０　（１９７８））Ｐ３−Ｘ６３
−Ａｇ８６５３　（６５３）　（ジャーナル・オブ・イ
Ａ１０シイ（Ｊ、ＩｍｍｕｎｏｌｏｇＹ）　１２３．１
５４８−１５５０　（１９７９）　）　、Ｐ　３−Ｘ６
３−Ａｇ　８　（Ｘ６３）〔ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒ
ｅ）　２５６．４９５−４９７（１９７５）　）などが
用いられる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地
ＣＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン（１，５ｍＭ）
、２メルカプトエタノール（５Ｘ　１０−５Ｍ）　、ジ
ェンタマイシン（１０Ｍｇ／ｍｌ）および牛胎児血清（
ＦＣ５）ＣＣ３Ｌ社製）（１０％）を加えた正常培地に
、さらに８−アザグアニン（１５μｇ／ｍｌ　）を加え
た培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培
地に継代し、融合当日２Ｘ１０’以上の細胞数を確保す
る。

（３）細胞融合 （１）で免疫した抗体産生細胞と（２）で得られた骨髄
腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳでよく洗浄し、細胞数
が、抗体産生細胞；骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよ
う混合し、遠心分離（１，２００ｒｐｍ　５分）した後
、上清を捨て、沈殿した細胞群をよくほぐした後、攪拌
しながら、３７℃で、ポリエチレングライコール１．０
００　（ＰＥＧ−１，０００）２ｇ、ＭＥＭ２ｍｌおよ
びジメチルスルホキシド０．７１Ｔｌｌの混液０．２〜
１ｍｌ／１０’抗体産生細胞を加え、１〜２分間毎にＭ
ＥＭ１〜２ｍｌを数回加えた後、ＭＥＭを加えて全量が
５０ｍ１になるようにする。遠心分離（９００ｒｐｍ５
分）後、上清を檜で、ゆるやかに細胞をほぐした後、正
常培地（ＲＰＭＩ−１６４０，ＦＣ５１０％）　１００
ｍｌを加え、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆる
やかに細胞を懸濁する。

この懸濁液を２４穴培養用プレートに１ｍ１／穴ずつ分
注し、５％ＣＯ□インキュベーター中、３７℃で２４時
間培養する。培養プレートに１ｍｌ／穴のＨΔＴ培地〔
正常培地にヒポキサンチア　（１０−’Ｍ）　、　ｆミ
シ７　（１，５Ｘ１０−’Ｍ）およびアミノプテリン（
４Ｘ１０−’Ｍ）を加えた培地〕を加え、さらに２４時
間培養する。以後２日間、２４時間毎に、培養上清１ｍ
ｌを捨て、新たに同量のＨＡＴ培地を加え、Ｃｏ２イン
キュベーター中、３７℃でｌＯ〜１４日間培養する。

コロニー状に生育してきた融合細胞の認められる穴につ
いて、上清１ｍｌを捨て、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からア
ミノプテリンを除いた培地）を同量加え、以後２日間２
４時間毎にＨＴ培地への変換を行う。

ＨＴ培地で３〜４日間培養後、培養上清の一部をとり上
記の酵素免疫測定法により、ヒト胃癌に対する抗体価を
測定する。このとき、同様の方法で、ヒト正常細胞９粗
織あるいはその膜成分などとの反応性も測定し、ヒト胃
癌細胞。

組織あるいはその膜成分に特異的に反応するものを選択
する。ヒト胃癌細胞１岨織あるいはその膜成分に強く反
応し、ヒト正常細胞１綱織あるいはその膜成分などに反
応しない穴について、限界希釈法によりクローニングを
２回操り返し、安定してヒト胃癌細胞１岨織あるいはそ
の膜成分に強い抗体価の認められたものを抗ヒト胃癌単
クローン性抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。

（４）単クローン性抗体の調製 ブリスタン処理（２，６，１０，１４−テトラメチルペ
ンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）　Ｑ、　５＋＋＋］を
腹腔的投与し、２週間飼育する〕した８〜１０週令の退
会７ＢＬ／６雌マウスに、（３）で得られた抗ヒト胃癌
単クローン性抗体産生ハイブリドーマ細胞２〜４Ｘ１０
’細胞／匹を腹腔的注射する。１０〜２１日でハイブリ
ドーマは腹水層化する。このマウスから腹水を採取し、
遠心分離（３，０００ｒｐｍ　。

５分）して固形分を除去後、５０％硫酸アンモニウムに
て塩析し、０．０４　Ｍリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ８，０，
０，０３Ｍ　　ＮａＣｊ！を含む）テ透析後、Ｄ　Ｅ　
５２　（Ｗｈａｔｍａｎ社製）のカラムニ通塔し、Ｉｇ
Ｇ画分を集め、ｖＪ製単クり−ン性抗体とする。

抗体のイソタイプの決定は、オクタロニイ（Ｏｕｃｈｔ
ｅｒｌｏｎｙ）法（二重免疫拡散法）（免疫学実験入門
、生物化学実験法１５、学会出版センター刊、Ｐ、７４
．１９８１年）によって行う。

蛋白量の定量は、フォーリン法および２８０ｎｍでの吸
光度ｆ：１．４（○ＤＯＯ）−イムノグロブリン１ｍｇ
／ｍｌ：］より算出する。

得られた単クローン性抗体の特異性の決定は複数の検体
から得られたヒトの各種の臓器由来の正常あるいは腫瘍
組織あるいはその膜成分との反応性、各種ヒト正常ある
いは腫瘍細胞培養株またはヒト胎児細胞培養株もしくは
それらの膜成分との反応性、従来から知られている癌胎
児性抗原（例えばＣＥＡ）との反応性、正常。

患者ヒト血清との反応性などを、酵素免疫測定法、螢光
抗体法、免疫組織学的判定法（ＰＡＰ法）などにより行
い、いずれの測定法においてもヒト胃癌以外とは、なる
べく反応しないものを選択する。

（５）血清診断法 血清診断は次の通り行う。

９６穴ＥＩＡ用プレートに、第一抗体１０〜１００■／
ｍｌを５０〜２００■／穴ずつ分注し、４℃で１〜２晩
あるいは、室温で２〜４時間放置する。ＰＢＳで洗浄後
、ＢＳΔ−ＰＢＳ　２００４／穴を加え、さらに４℃で
１晩あるいは室温で２時間放置する。このプレートをＰ
ＢＳでよく洗浄後、各穴に血清検体を１〜１００倍希釈
で、５０〜１００４を加える。４℃で、１晩あるいは室
温で２時間放置後、ＰＢＳでよく洗浄する。次に、ビオ
チン化した第二抗体あるいは、ペルオキシダーゼ標識し
た第二抗体（１０〜１００■／μｇ）を５０〜１００１
１ｔ！／穴加え、さらに４℃で１晩あるいは室温で２〜
４時間放置する。第二抗体として、ビオチン化抗体を使
用した場合には、プレートをＰＢＳでよく洗浄後、アビ
ジン−ペルオキシダーゼまたはアビジン−ビオチン−ペ
ルオキシダーゼ（１０■／ｍｌ）　ヲ５０〜１００ｄ／
穴加え、室温で３０分間放■後ＰＢＳでよく洗浄する。

次に基質液として、ＡＢＴＳ基質液を５０〜１００ＪＬ
１／穴加え、室温で１０〜３０分間放置し、５％ＳＤＳ
溶液５０〜１００Ｊｄ！／穴を加え反応を停止させる。

各穴のＯＤ　Ａ　１　Ｓ値を測定し、その発色度より、
血清検体中の抗原量を算出する。このようにして得られ
た健常人血清中の抗原量と各種癌患者血清中の抗原量を
比較することにより、正常値を決定し、その正常値を超
えるものを陽性とした。

（６）抗原解析 前述の酵素免疫抗体法、免疫組織化学的染色法あるいは
血清診断法の実施に際して、抗原（胃癌膜成分、胃癌培
養細胞株、胃癌組織）をノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａ
ｍｉｎ、１ｄａｓｅ）、　　プロテアーゼ（ρｒｏｔｅ
ａｓｅ）などの酵素や過ヨウ素酸などの試薬で前処理し
た後、単クローン性抗体と反応させ、それらの処理をし
ていない元の抗原と単クローン性抗体の反応性との差よ
り、抗原の化学的性状（単クローン性抗体の認識する抗
原部位の化学的性状）を明らかにした。すなわち、ノイ
ラミニダーゼ処理により抗原性が消失すれば、シアル酸
が、プロテアーゼ処理により消失すれば蛋白質が、また
過ヨウ累酸処理により消失すれば糖鎖が、抗原決定基に
関与していると推定される。

以下本発明の実施例を示す。

実施例１゜ （１）抗体産生細胞の調製 ヒト正常両膜成分（１００■蛋白質／匹）を、生後２４
時朋以内の新生子Ｃ５７ＢＬ／６マウス（静岡実験動物
製）に静脈内投与した。８週間経過後のマウスにヒト胃
癌膜断片１００μｇ（蛋白質換算）７匹を水酸化アルミ
ニウムゲル２ｍｇ／匹、百日咳菌死菌ワクチンｌＸｌ０
’／匹とともに腹腔的投与した。以後１〜２週おおきに
、同一抗原１００μｇ（蛋白質換算）７匹で３〜５回免
疫した。これら免疫処理したマウスのうち、その抗血清
が、ヒト胃癌細胞または組織あるいはそれらの膜断片と
強く反応したマウスを免疫マウスとして、そのマウスよ
り、肺細胞を調製して、細胞融合に供した。

（２）マウス骨髄腫細胞の調製 ８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｕｌを
正常培地で培養し、細胞融合時に２×１０７以上の細胞
を得、細胞融合に親株として供した。

（３）ハイブリドーマの作製 （１）と（２）で得られた肺細胞と骨髄腫細胞とを５：
１の割合で用い、前述した方式で融合させ、ＨＡＴ培地
で３７・℃、１４日間Ｃ０２５％下で培養して、融合細
胞を選択し、ＨＴ培地に変えてさらに培養し、抗ヒト胃
癌に対する抗体価の測定をして、活性な穴を選び、さら
に正常培地に変え、２回クローニングを繰り返して、種
々の測定法により、ヒト正常細胞や組織あるいは他の癌
に全く反応せず、ヒト胃癌に反応する単クローン性抗体
を産生ずるハイプリドーマ株ＡＭＣ−４６２を選択した
。

（４）単クローン性抗体の精製 ブリスタン処理した８退会Ｃ５７ＢＬ／６ａマウスに（
３）で得られたハイブリドーマ株ＡＭＣ−４６２を４Ｘ
１０’細胞／匹腹腔内注射した。

１０〜２１日後に、ハイブリドーマは復水癌化する。腹
水のたまったマウスから、腹水を採取（５〜１０ｍ１／
匹）し、遠心分離（３，００Ｏｒｐｍ。

５分）して固形分を除去した。４０％硫酸アンモニウム
にて塩析し、０．０４　Ｍ　Ｕン酸緩衝液（ｐ　Ｈ８，
０，０，０３Ｍ　　ＮａＣｊ２を含む）で透析後、Ｄ　
Ｅ　５２　（Ｗｈａｔｍａｎ社製）（ヘットポリｘ−ム
５０ｍ１　）のカラムに流速２０〜３０ｍｌ／ｈｒで通
塔しＩｇＧ画分を集め、精製単クローン性抗体とする。

（５）　　ＡＭＣ−４６２の特異性 このようにして得られた抗ヒト胃癌反応性単クローン性
抗体ＡＭＣ−４６２の反応特異性を第１表に示した。

測定は、酵素結合免疫分析（ＥＬ［ＳＡ）により以下の
とおり行った。

組織（膜成分）を標的とする場合： 酵素免疫分計用９６穴プレー）　（Ｌｉｎｂｒｏ社製）
に０．１ｍｇ／ｍｌの組織（膜成分）液を５０ｍ／ｍ／
札入３７℃で２時間または４℃で１晩放置して組織（膜
成分）を固定した。ＰＢＳで洗浄後、１０％牛脂児血清
含有ＰＢＳを１００１ｄ１／大分注し、固定組織（膜成
分）の活性残基を保護した。

ＰＢＳで洗浄後、第１抗体（ＡＭＣ−４６２）５０４／
穴を入れ、３７℃で１〜２時間または４℃で１晩放置し
て標的と抗体を反応させた。

０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（和光純薬工業社製）含有
ＰＢＳで５回洗浄して未反応の抗体を除去した。第２抗
体としてパーオキシダーゼ結合ウサギ抗マウス免疫グロ
ブリン（Ｍｉｌｅｓ−Ｙｅｄａ社＝２００倍希釈）５０
ρ／穴を入れ、３７℃で１時間反応させた。０．０５％
Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳで５回洗浄後、レジン水で
３回洗浄した。

ＡＢＴ３５０ｍ／穴を加えて反応を開始し、５％ラウリ
ル硫酸ナトリウム水溶液５０ｍ／穴を加えて反応を停止
させた。

培養株細胞を標的とする場合： 細胞を培養用９６穴プレー）　（Ｌｉｎｂｒｏ社製）で
培ｌし、コンフルエントになった時点で上記の組織（膜
成分）の場合と同様に反応させた。ただし第１抗体、第
２抗体とも反応条件は室温で３０分間とし、発色後に反
応液を分析用９６穴プレート移すことにより反応を停止
させた。

抗原ＣＥＡの場合は組織（膜成分）に替えてＣＥＡを用
いる以外は組織の場合と同様に行った。

いずれの場合も、４９０１ｍを対照波長として４１５ｎ
ｍの吸光度を測定した。

第　　　１　　　表 第１表に示すごとく、ＡＭＣ−４６２は、胃癌のみなら
ず、膵癌や大腸癌などの消化器癌に広い反応性を有して
いる。しかし、ＣＥＡと反応しないことから、抗−ＣＥ
Ａ抗体とは異なることがわかる。これらの結果より、Ａ
ＭＣ−４６２を用いる免疫組織化学染色により、消化器
癌の病理診断が可能であった。

実施例２゜ ９６穴ＥＩＡ用プレート〔フロー・ラボラトリーズ（Ｐ
ｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製〕に、ＡＭＣ
−４６２（１０ｇ／ｍｌ）を５０ＡＩ２／穴加え、４℃
で１晩放置後、ＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ２
００ＡＩ２／穴加え１晩放置し、ＰＢＳでよく洗浄した
プレートに”、健常人血ａ（８５検体）右よび胃癌患者
血清（８６検体）、膵癌患者血清（２２検体）、肝癌患
者血清（１５検体）、結腸癌患者血清（１６検体）、直
腸癌患者血清（１２検体）、胆嚢癌患者血清（２０検体
）、乳癌患者血清（３検体）、胃腸良性疾患患者血清（
２１検体）、膵癌患者血清（３８検体）、胆嚢良性疾患
患者血清（１１検体）、肝硬変患者血清（３検体）を５
倍希釈して５０ｄ／穴加え、４℃で１晩放置後、ＰＢＳ
でよく洗浄した。次に、第二抗体として、ビオチン化抗
胃癌モノクローナル抗体ＡＭＣ−４６２’　（１０Ｊ１
ｇ／ｍｌ）を１００μＮ／穴加え、４℃で１晩放置し、
ＰＢＳでよく洗浄した後、アビジン−ビオチン−ペルオ
キシダーゼ〔ベクトール（ＶＥＣＴＯＲ）社製〕（１０
ｇ／ｍｌ）　１００＃／穴加え、室温で１時間放置した
後、ＰＢＳで洗浄した。

次にＡＢＴＳ基質液を１００Ｊ１１／穴加え、室温で３
０分間反応させ、５％ＳＤＳ溶液１００ｄ／穴を加え反
応を停止した。各穴の発色を吸光光度計（ＯＤ４＋ｓ　
）で測定した。その結果、第１図に示した様に、健常人
血清では、カットオフ渣（健常人の平均値＋７３Ｄ）を
こえる陽性例は８５例中１例もなかった（０％）が、胃
癌患者血清では、８６例中１６例（１８，６％）、膵癌
では２２例中１８例（８１，８％）、肝癌では１５例中
５例（３３，３％）、結腸癌では１６例中１例（６，７
％）、直腸癌では、１２例中０例（０％）、胆嚢癌でハ
２０例中８例（４０％）、乳癌では３例中１例（３３，
３％）で陽性となった。−刃長性疾患では、胃腸良性疾
患で２１例中０例（０％）、膵良性疾患３８例中１例（
２，６％）、胆嚢良性疾患１１例中０例（０％）、肝硬
変３例中０例（０％）と陽性率は、極めて低かった。

以上の結果より、ＡＭＣ−４６２を用いる本血清診断系
は、消化器癌の、特に膵癌の血清診断に極めて有用であ
ることがわかる。

実猪例３ 実施例２で使用した膵癌患者血清と同じ検体を用いて、
既知の膵癌マーカーであるＣＡ１９−９（ＮＳ１９−９
の抗原）値およびＤｕＰａｎ−２（ＤｕＰａｎ−２の抗
原）値を測定した。第２図および第３図に、同−血１青
倹体中のＣＡ１９−９量およびＤｕＰａｎ−２で測定さ
れる抗原量と、本願発明の単クローン性抗体ＡＭＣ−４
６２を用いて測定される抗原量の比較を示した。

第２図より明らかなように、本願発明のＡＭＣ−４６２
を用いる血清診断系で測定される膵癌患者血清中の癌抗
原量は、ＣＡ１９−９の場合とかなり高い相関性を有し
ている。しかし、ＣＡ１９−９陰性例でもＡＭＣ−４６
２診断系で陽性となる場合が５％あった。

第３図より、本発明で検出される癌抗原は、ＤｕＰａｎ
−２とは、余り相関せず、陽性率からみても、膵癌の血
清診断法として、ＤｕＰａｎ−２よりも、優れたもので
あると言える。

実施例４ 実施例１および実施例３に示した結果より、ＡＭＣ−４
６２を用いる血清診断系で検出される抗原が、消化器癌
、特に膵癌マーカーとして既知のＣＥＡやＤｕＰａｎ−
２と異なるものであることは明らかとなったが、ＣＡ１
９−９との異同をさらに詳しく検討するために、サンド
ウィッチＥＬＩＳＡ系での阻害試験を実施した。

即ち、９６穴ＥＩＡ用プレートに、１０ｇ／ｍｌのＡＭ
Ｃ−４６２または、Ｎ５１９−９　（第１抗体）を吸着
させ、１％ＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキングしたプレート
に、ＣＡ１９−９およびＡＭＣ−４６２の認識する抗原
の両方を含む膵癌患者血清を５０４加え、よく洗浄後、
０．１〜５０■／ｎ＋１ＯＮＳ１９−９あるいは、ＡＭ
Ｃ−４６２単クロ一ン性抗体（阻害抗体）を加え、よく
洗浄した。

さらに、１０■／ｍｌのビオチン化したＮ５１９−９あ
るいはビオチン化したＡＭＣ−４６２単クロ一ン性抗体
（第２抗体）を加え、よく洗浄後、アビジン−ビオチン
−ペルオキシダーゼ試薬を加え、再びよく洗浄後、ＡＢ
ＴＳ基質を加え、酵素反応を行わした後、ＳＤＳ溶液で
反応を停止させ、ＯＤ　Ａ　、ｓを測定した。その結果
を第４図に示した。

第４図中Ａ−Ｆは下記組合せを示す。

Ａ）第１抗体：ＡＭＣ−４６２　（１０％ｇ／ｍｌ）阻
害抗体：なし Ｂ、）１１抗体：　ＡＭＣ−４６２（１０ｘｒ／ｍｌ）
阻害抗体：ＡＭＣ−４６２（０，１〜５ｈｇ／ｍ１）Ｃ
）第１抗体：ＡＭＣ−４６２　（１０ｘ／ｍり阻害抗体
：Ｎ５１９−９　　（０，１〜５ｈｇ／ｍ１）Ｄ）第１
抗体：Ｎ５１９−９　　（１０ｇ／ｍｌ）第２抗体：ビ
オチン化Ｎ５１９−９ （１０■／ｍｌ） 阻害抗体；なし Ｅ）第１抗体：Ｎ５１９−９　　（１０ｘ／ｍｌ）阻害
抗体：　Ｎ　Ｓ　１９−９　　（０，１〜５０ｘ／ｍ１
）Ｆ）第１抗体：Ｎ５１９−９　　（１０ｘｒ／ｍｌ）
阻害抗体：ＡＭＣ−４６２（０，１〜５ｈｇ／ｍｌ）第
４図より、明らかなように、Ｎ５１９−９およびＡＭＣ
−４６２の反応性はＮ５１９−９およびＡ″□ＡＣ−４
６２自体によっては、それぞれ完全に阻害されるが、お
互いには全く阻害しないことからＡＭＣ−４６２によっ
て認識される抗原は、Ｎ５１９−９とは異なるものであ
ることがわかる。

発明の効果 本発明によれば消化器癌の診断、とくに膵癌の診断に有
用な単クローン性抗体が供給される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＡＭＣ−４６２による各種疾患患者の血清診
断の結果を示す。 第２図は、膵癌患者血清中のＣＡ１９−９量とＡＭＣ−
４６２で検出される抗原量の比較を示す。 第３図は、膵癌患者血清中のＤｕＰａｎ−２量とＡＭＣ
−４６２で検出される抗原量の比較を示す。 第４図は、Ｎ５１９−９に対するＡＭＣ−４６２の阻害
試験結果を示す。 第り図 ＡＩ’ＩＣ−（ｌｂ２で・栂栖る截原（。／４）第２図 二 ｃＡ　１９−９Ｃｕ／、１） 富３図

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ＩｇＧ１クラスに属し、消化器癌に対して反応性
   を有する抗ヒト胃癌単クローン性抗体ＡＭＣ−４６２。
2. （２）抗ヒト胃癌単クローン性抗体ＡＭＣ−４６２を生
   産する能力を有するハイブリドーマを培地中に培養する
   かマウスに投与して腹水化し、培養物または腹水中に抗
   ヒト胃癌単クローン性抗体ＡＭＣ−４６２を蓄積させ、
   該培養物または腹水からこれを採取することによる抗ヒ
   ト胃癌単クローン性抗体ＡＭＣ−４６２の製造法。