JPS62207298A - 抗ヒト胃癌単クロ−ン性抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、新規抗ヒト胃癌単クローン性抗体ＡＭＣ−３
８２およびこれを用いる胃癌の血清診、新法に関する。

従来技術 ヒト胃癌に対する単クローン性抗体を、抗体産生細胞と
骨髄腫細胞とを融合させて得られるハイブリドーマを培
養して製造する方法は知られている。〔代謝　２１．臨
時増刊号、　８１９−８２４　（１９８４）。

キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、＞　　
４４．３９５２−３９５６　（１９８４）、　！！ｉ　
　乃、　１０６−１０８　（１９８４）、特開昭５９−
１２８３９７）。

抗ヒト胃癌単クローン性抗体を用いる血清診断について
の報告はある〔第４４回日本癌学会総会記事、１３１頁
（１９８５））。

シアル酸化されたＦｌ鎖を認識する単クローン性抗体を
用いる膵癌の血清診断キットとしては、Ｎ５１９−９　
（インターナショナル・ジャーナル・オブｅキャンサー
（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ
Ｃａｎｃｅｒ）　３３．３３９　（１９８４）、　ｖ＆
床病理　ＸＸＸ　Ｉ。

１２、１３００　（１９８３）　）やＤｕＰａｎ　−２
（プロシイ−ディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミイ・オブ・サイｘンｘ　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾
ｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　８１゜５２４２　（１９８４）
、　　肝胆膵　１１．３７　（１９８５）　）が知られ
ている。

発明が解決すべき問題点および解決方法日本における早
期胃癌（ステージＩ、■期）の発見率は、現在約３５％
といわれている〔癌と化学療法１１（３）　　；　Ｐａ
ｒｔ　ｎ、　７１６−７２６　（１９８４））。

胃癌の早期診断に応用できる簡便で迅速な胃癌の診断法
はいまだ開発されていない。

本発明者は、胃癌に対して特異的に反応する単クローン
性抗体について検索した。その結果、胃癌に対して特に
強い反応性を示し、胃癌の血清診断に応用可能で、かつ
早期胃癌での陽性率が比較的高い単クローン性抗体を製
造し本発明を完成した。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明は、ヒト胃癌細胞と反応し、ヒト正常両組織（ま
たは細胞）とは反応せず、シアル酸化された糖蛋白質ま
たは糖脂質の糖鎖を抗原として認識し、かつ１ｇＭクラ
スに属する抗ヒト胃癌単クローン性抗体ＡＭＣ−３８２
に関する。

本発明の単クローン性抗体は、ヒト胃癌の細胞組織ある
いはそれらの膜成分で免疫したマウスの肺細胞とマウス
骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを作製し、該
ハイブリドーマを培地中に培養するかマウスに投与して
該マウスで腹水化し、該培養物または復水より採取する
ことにより得られる。

以下に本発明単クローン性抗体の製造法を詳細に説明す
る。

（１）動物の免疫と抗体産生細胞の調製３〜１０週令、
退会しくは８退会のマウスを、ヒト胃癌の細胞１組織あ
るいはそれらの膜成分で免疫して、その動物の牌、リン
パ節、末梢血中の抗体産生細胞を調製する。免疫するマ
ウスはヒト正常前細胞で前処理して免疫寛容にしたマウ
スを用いるのが好ましい。免疫の方法は、動物の皮下あ
るいは静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュバント〔
例えば、フロイントの完全アジュバント（Ｃｏｍｐｌｅ
ｔｅ　Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　Ａｄｊｕｖａｎｔ）または、
水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕とと
もにヒト胃癌細胞（１０Ｓ〜１０７細胞／匹）１ヒト胃
癌組織もしくはそれらの膜成分（膜断片）（１０〜５０
０μｇ／匹）を投与する。以後、１〜２週問おきに、抗
原を２〜５回投与する。各免疫後３〜７日目に眼底静脈
叢より採血し、その血清がヒト胃癌と反応することを以
下に示す酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ
）：医学書腕利１９７６年〕などで調べる。

酵素免疫測定法： ９６大のＥＩＡ用プレート〔フロー・ラボラトリーズ（
Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製〕に、正常
あるいは腫瘍細胞１組織の膜成分（蛋白量として１０〜
１．０００．ｌＪｇ／ｍｌ含有する膜断片）を１００〜
２００μ！ｌ／穴ずつ分注し、４℃で１〜２晩放置して
、牛血清アルブミンをプレート穴底面にコートし、上清
を抜き去った後、レジン水あるいは、ＰＢＳ　（リン酸
二ナトリウム１．８３ｇ、　リン酸−カリウム０．２１
ｇ、食塩７、６５　ｇ　、蒸溜水ＩＩｌ、ｐＨ７，２）
でよく洗浄後、第１抗体として、１％ＢＳＡ　（牛血清
アルブミン）−ＰＢＳを１００〜２００μＩｌ／穴分注
し、４℃で１〜２晩放置して、プレート上に残った蛋白
質との結合残基をブロック（ブロッキング）した。その
後、ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、レジン水あるいはＰＢＳで
よく洗浄した後、第１抗体として、ＢＳＡ−ＰＢＳで希
釈した試料（マウス血清、ハイブリドーマ培養上清、粗
精製モノクローナル抗体）を１００μｍ／穴分注し、４
℃で１晩放置する。レジン水で１回、２Ｍ　　ＮａＣ１
溶液で６回洗浄した後、第２抗体としてウサギの抗マウ
スイムノグロブリンＩｇＧ−ペルオキシダーゼ結合物〔
ダコ（ＤＡＫＯ）社製、販売元協和メデックス〕の１０
０倍希釈液をｌ　００ｔａ／穴分注し、室温で２時間放
置する。

ＰＢＳでよく洗浄後、ＡＢＴＳ基質液〔２゜２′−アジ
ノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸
）ニアンモニウム５５０ｍｇをｏ、　ｌ　Ｍクエン酸緩
衝液（ｐＨ４，２）ｌｊ！に溶かした溶液に、使用直前
に過酸化水素１［／ｍｌを加えた溶液〕を用い、発色を
０Ｄ４１５Ｒ１１の吸光度で測定する。このとき、胃癌
細胞、組織あるいはそれらの膜成分に対して強く反応す
るマウスをヒト胃癌免疫マウスとしてハイブリドーマ作
製のための抗体産生細胞の供給源として用い酵素免疫測
定法を行うにあたって、抗原として、細胞そのものを用
いる場合は、ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）　３０７２プ
レート中で、標的細胞を培養し、０．２５％ゲルタール
アルデヒド−ＰＢＳを加え、室温に１〜２時間放置し、
ＰＢＳでよく洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ　１００〜２
ＯＬｃｌ＋を加え、２時間放置し、レジン水またはＰＢ
Ｓ・でよく洗浄し、゛そのプレートを用いて、一般の抗
原コートプレートを用いるのと同様の方法にて、抗体価
の測定を行った。

細胞融合に供するにあたって、免疫化マウスに融合処理
の３〜４日前に、ヒト胃癌細胞１祖織あるいはその膜成
分を２〜５Ｘ１０６細胞／匹あるいは２０〜４００μｇ
／匹腹腔内に投与し、膵臓を摘出し、肺細胞を調製する
。すなわち、膵臓をＭＥＭ　（日永製薬社製）中で細断
し、ビンセットでほぐし、１２０Ｏｒｐｍ、５分間遠心
分離にかけ、上清を揄で、トリス−塩化アンモニウム緩
衝液（ｐＨ７，６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去
し、ＭＥＭで３回洗浄して融合用肺細胞として提供する
。

（２）骨髄腫細胞の調製 骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使
用する。たとえば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡ
ＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕｌ
　（Ｐ３−Ｕｌ）〔カレント・トピックス・イン・ミク
ロハイオロジイ・アンド・イムノロシイ−１（Ｃｕｒｒ
ｅｎｔＴｏｐｉｃｓ　ｉｎ　）、ｌ１ｃｒｏｂｉｏｌｏ
）Ｂｙ　ａｎｄ　１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　−１））〔ヨ
ーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロシイ（εｕｒ
ｏｐｅａｎ　Ｊ、　　１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）　　　６
．　５１１−５１９（１９７６）Ｌ　ＳＰ２１０−Ａｇ
　１４　（ＳＰ−２）〔ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）
　２７６、　２６９−２７０　（１９７８））Ｐ３−Ｘ
６３−Ａｇ８６５３　（６５３）　（ジャーナル・オブ
・イムノロシイ（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）皿１５４
８−’１５５０　（１９７９）　）　、Ｐ３−Ｘ６３−
Ａｇ３　（Ｘ６３）〔ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）　
２５６．４９５−４９７（１９７５）　３などが用いら
れる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地ＣＲＰ
ＭＩ−１６４０培地にグルタミン（１，５ｍＭ）、２メ
ルカプトエタノール（５Ｘ１０−’Ｍ）、ジェンタマイ
シン（１０μｇ／＋＋＋ｌ）および牛胎児血清（ＦＣ３
）（Ｃ３Ｌ社製）（１０％）を加えた正常培地に、さら
に８−アザグアニン（１５μｇ　／ｍｌ　）を加えた培
地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地に
継代し、融合当日２Ｘ’ＩＯ’以上の細胞数を確保する
。

（３）細胞融合 （１）で免疫した抗体産生細胞と（２）で得られた骨髄
腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳでよく洗浄し、細胞数
が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：ｌになるよ
う混合し、遠心分離（１，２０Ｏｒｐｍ　　５分）した
後、上清を捨て、沈殿した細胞群をよくほぐした後、攪
拌しながら、３７℃で、ポリエチレングライコール１．
０００（ＰＥＣ，−１，０００）２ｇ、ＭＥＭ２ｍｌお
よびジメチルス、　ルホキシドＱ、７ｍｌの混液０．２
〜１ｍｌ／　１０″抗体産生細胞を加え、１〜２分間毎
にＭＥＭ１〜２ｍｌを数回加えた後、ＭＥＭを加えて全
量が５０ｍ１になるようにする。遠心分離（９００ｒｐ
ｍ５分）後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後
、正常培地（ＲＰＭＩ−１６４０，ＦＣ３１０％）１０
０ｍｌを加え、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆ
るやかに細胞を懸濁する。

この懸濁液を２４穴培養用プレートに１ｍｌ／穴ずつ分
注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時
間培養する。培養プレートに１ｍｌ／穴のＨＡＴ培地〔
正常培地にヒポキサンチン（１０−’Ｍ）、チミジン（
Ｌ、　５　Ｘ　１０−５Ｍ　）およびアミノプテリン（
４Ｘ１０−’Ｍ）を加えた培地〕を加え、さらに２４時
間培養する。以後２日間、２４時間毎に、培養上清１ｍ
ｌを揄で、新たに同量のＨＡＴ培地を加え、ＣＯ□イン
キュベーク−中、３７℃でｌＯ〜１４日間培養する。

コロニー状に生育してきた融合細胞の認められる穴につ
いて、上清１＋ｎｌを捨て、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地から
アミノプテリンを除いた培地）を同量加え、以後２日間
２４時間毎にＨＴ培地への変換を行う。

ＨＴ培地で３〜４日間培養後、培養上清の一部をとり上
記の酵素免疫測定法により、ヒト胃癌に対する抗体価を
測定する。このとき、同様の方法で、ヒト正常網胞１組
織あるいはその膜成分などとの反応性も測定し、ヒト胃
癌細胞。

組織あるいはその膜成分に特異的に反応するものを選択
する。ヒト胃癌細胞１岨織あるいはその膜成分に強く反
応し、ヒト正常網胞１組織あるいはその膜成分などに反
応しない穴について、限界希釈法によりクローニングを
２回繰り返し、安定してヒト胃癌細胞１岨織あるいはそ
の膜成分に強い抗体価の認められたものを抗ヒト胃癌単
クローン性抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。

（４）単クローン性抗体の調製 ブリスタン処理（２，６，１０，１４−テトラメチルヘ
ンタデカフ（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）　Ｑ、　５ｍｌを腹腔
内投与し、２週間飼育する〕した８〜１０週令の退会７
ＢＬ／６雌マウスに、（３）で得られた抗ヒト胃癌単ク
ローン性抗体産生ハイブリドーマ細胞２〜４　Ｘ　１０
’細胞／匹を腹腔内注射する。１０〜２１日でハイブリ
ドーマは腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、
遠心分離（３，００Ｏｒｐｍ　。

５分）して固形分を除去後、５０％硫酸アンモニウムニ
テ塩析し、ＰＢＳにＮａＣｌ　　０．５Ｍを加えた液で
透析し、セファクリル５３００（ファルマシア・ファイ
ン・ケミカル社製）（ベットボリューム７５０ｍ１　）
のカラムに流速１５ｍ１／ｈｒで通塔し、ＩｇＭ画分を
集め、精製単クローン性抗体とする。

抗体のインタイブの決定は、オククロニイ（Ｏｕｃｈｔ
ｅｒｌｏｎｙ）法（二重免疫拡散法）（免疫学実験入門
、生物化学実験法１５、学会出版センター刊、Ｐ、７４
　１９８１年）によって行う。

蛋白量の定量は、フォーリン法および２８０ｎｍでの吸
光度Ｃ１，４（ＯＤ、、、　）　′、イムノグロブリン
１ｍｇ／ｍｌ）より算出する。

得られた単クローン性抗体の特異性の決定は複数の検体
から得られたヒトの各種の臓器由来の正常あるいは腫瘍
組織あるいはその膜成分との反応性、各種ヒト正常ある
いは腫瘍細胞培養株またはヒト胎児細胞培養株もしくは
それらの膜成分との反応性、従来から知られている癌胎
児性抗原（例えばＣＥＡ）との反応性、正常。

患者ヒト血清との反応性などを、酵素免疫測定法、螢光
抗体法、免疫組織学的判定法（ＰΔＰ法）などにより調
べ、いずれの測定法においてもヒト胃癌以外とは、はと
んど反応しないものを選択する。

また、このようにして得られた、ヒト胃癌に特異的に反
応する単クローン性抗体は、血清検査１組織診断、イメ
ージーングなどによる胃癌の診断、さらには、抗体その
ものを、あるいは、抗体に制癌剤や毒素を結合させた、
いわゆるイムノトキシンを癌患者に投与することにより
胃癌の治療を行うことができるものと期待される。

さらに、この腫瘍特異抗原クローン性抗体を用いるアフ
ィニティーカラムにより、腫瘍特異抗原を精製し、その
抗原の解析ひいては、胃癌ワクチンの開発にも使用でき
るものと期待される。

（５）胃癌血清診断法 血清診断の具体的方法を以下に示す。

サンドウィッチ方式による酵素免疫測定法（ＥＬＩ　５
Ａ） ９６穴ＥｒＡ用プレートに、第一抗体１０〜１００μｇ
／ｍｌを５０〜２００μｇ／穴ずつ分注し、４℃で１〜
２晩あるいは、室温で２〜４時間放置する。ＰＢＳて洗
浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳ　２００〃／穴を加え、さらに４
℃で１晩あるいは室温で２時間放置する。このプレート
をＰＢＳでよく洗浄後、各穴に血清検体を１〜１００倍
希釈で、５０〜１００ｍを加える。４℃で１晩あるいは
室温で２時間放置後、ＰＢＳでよく洗浄する。次に、ビ
オチン化した第二抗体あるいは、ベルオキ、シダーゼ標
識した第二抗体（１０〜１００ｘｒ／パ）を５０〜１０
０屑／穴加え、さらに４℃で１晩あるいは室温で２〜４
時間放置する。第二抗体として、ビオチン化抗体を使用
した場合には、プレートをＰＢＳでよく洗浄後、アビジ
ンービオチンーベルオキンダーゼ（１０ｇ／ｍｌ）を５
０〜１００．ｄ／穴加え、室温で３０分間放置後ＰＢＳ
でよく洗浄する。次に基質液として、ΔＢＴＳ基質液を
５０〜１００薦／穴加え、室温で１０〜３０分間放置し
、５％ＳＤＳ溶液５０〜１００ｍ／穴を加え反応を停止
する。各穴の０Ｄ４１．値を測定し、その発色度より、
血清検体中の抗原量を算出する。このようにして得られ
た健常人血清中の抗原量と胃癌患者血清中の抗原量を比
較することにより、正常値を決定し、その正常値を超え
るものを胃癌陽性とした。

放射免疫測定法（ＲＩＡ） ９６穴デイスポーザブルＵ底プレートに第一抗体（ＡＭ
Ｃ−３８２）　１０〜１００Ｒ／ｍｌを５０〜２００ｇ
／穴ずつ分注し、４℃で１〜２晩あるいは室温で２〜４
時間放置する。ＰＢＳで洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳ　　２
００威／穴を加え、さらに４℃で１晩あるいは室温で２
時間放置する。このプレートをＰＢＳでよく洗浄後、各
穴に血清検体を１〜１００倍希釈で５０〜１００ｍ加え
る。４℃で１晩あるいは室温で２時間放置後、ＰＢＳで
よく洗浄する。

次に、＋′Ｉで標識した第２抗体（１２Ｊ−ＡＭＣ−３
８２）を５０〜１００ｍ／穴加え、さらに４℃で１晩あ
るいは室温で２〜４時間放置する。プレートをよく洗浄
後、風乾させ、各ウェルを熱ニクロム線で切り取り、ジ
オツギチューブに入れ、ｒ−カウンター（アロ力）で各
穴の放射能を測定し、そのｃｐｍ値より、血清検体中の
抗原量を算出する。

以上のようにして胃癌の血清診断を行うことができるが
、単クローン性抗体ＡＭＣ−３８２を使う胃癌の血清診
断は、これらの方法に限定されるものではない。

（６）抗原解析 前述の酵素免疫抗体法、免疫組織化学的染色法あるいは
血清診断法の実施に際して、抗原（胃癌膜成分、胃癌培
養細胞株、胃癌組織）をノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａ
ｍｉｎｉｄａｓｅ）、　　プロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａ
ｓｅ）などの酵素や過ヨウ素酸などの試薬で前処理した
後、単クローン性抗体と反応させ、それらの処理をして
いない元の抗原と単クローン性抗体の反応性との差より
、抗原の化学的性状（単クローン性抗体の認識する抗原
部位の化学的性状）を明らかにした。すなわち、ノイラ
ミニダーゼ処理により抗原性が消失１ればシアル酸が、
プロテアーゼ処理により抗原性が消失すれば蛋白質が、
また過ヨウ素酸処理により抗原性が消失すれば糖鎖が、
抗原決定基に関与していると推定される。

以下本発明の実施例を示す。

実施例１゜ 〔１）抗体産生細胞の調製 ヒト正常両組織膜成分（１００■蛋白質／匹）を、生後
２４時間以内の新生仔Ｃ５７ＢＬ／６マウスに静脈内投
与した。８週間経過後のマウスにヒト胃癌組織膜成分１
００μｇ（蛋白質ＩｔＡ算）７匹を水酸化アルミニウム
ゲル２ｍｇ／匹、百日咳菌死菌ワクチン１×１０９／匹
とともに腹腔的投与した。以後１〜２週おきに、同一抗
原１００μｇ（蛋白質換算）７匹で３〜５回免疫した。

これら免疫処理したマウスのうち、その抗血清が、ヒト
胃癌細胞または組織あるいはそれらの膜断片と強く反応
したマウスを免疫マウスとして、そのマウスより、肺細
胞を調製して、細胞融合に供した。

（２）マウス骨髄腫細胞の調製 ８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｕｌを
正常培地で培養し、細胞融合時に２×１０１以上の細胞
を得、細胞融合に親株として供した。

（３）ハイブリドーマの作製 （１）と（２）で得られた肺細胞と骨髄腫細胞とを５：
１の割合で用い、前述した方式で融合させ、ＨΔＴ培地
で３７℃、１４日間Ｃ○２５％下で培養して、融合細胞
を選択し、ＨＴ培地に変えてさらに培養し、抗ヒト胃癌
に対する抗体価の測定をして、活性な穴を選び、さらに
正常培地に変え、２回クローニングを繰り返して、種々
の測定法により、ヒト正常細胞や組織あるいは他の癌に
全く反応せず、ヒト胃癌に特異的に反応する単クローン
性抗体を産生ずるハイプリドーマ株へ＼ＡＣ−３８２を
選択した。本ハイブリドーマ株は、英国、ヨーロピアン
・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャーズ
（εｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａ
ｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ）に１９８６
年２月２７日イ寸でＥＣＡＣＣ８６０２２７０１として
寄託しである。

（４）単クローン性抗体の精製 プリスタン処理した８退会Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスに（
３）で得られたハイプリドーマ株ＡＭＣ−３８２を４　
Ｘ　１０’細胞／匹腹腔内注射した。

１０〜２１日後に、ハイブリドーマは腹水癌化する。腹
水のたまったマウスから、腹水を採取（５〜ｌｏｍｌ／
匹）し、遠心分離（３，００Ｏｒｐｍ。

５分）して固形分を除去した。５０％硫酸アンモニウム
にて塩析し、ＰＢＳにＮａＣｊ！　　０．５Ｍを加えた
液で透析し、セファクリル３００（ファルマシア・ファ
イン・ケミカル社製）（ベット・ボリューム７５０ｍ１
）のカラムに流速１５ｍ１／ｈｒで通塔しＩｇＭ画分を
集め精製抗体として用いた。

（５）　　ＡＭＣ−３８２の特異性 このようにして得られた抗胃癌特異的単クローン性抗体
ＡＭＣ−３８２の反応特異性を第１表に示した。

第　　　１　　　表 実施例２゜ 実施例１で得られた単クローン性抗体ＡＭＣ−３８２を
用いて、胃癌組織の免疫組織化学的染色を行った。７例
の胃癌患者摘出胃癌パラフィン包埋ブロック切片につい
て検討した結果、金側で癌細胞が強く染まった。以上の
結果より、ＡＭＣ−３８２を用いる免疫組織化学染色に
より、胃癌の病理診断が可能であった。

実施例３゜ ９６穴ＥＩＡ用プレート〔フロー・ラボラトリーズ（Ｆ
ｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製〕に、ＡＭＣ
−３８２（１０ｘ／ｍｌ）を５０薦／穴加え、４℃で１
晩放置後、ＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ２００
ｓ／穴加え１晩放置し、ＰＢＳでよく洗浄したプレート
に、健常人血清（７７検体）および胃癌患者血清（５２
検体）をダ倍希釈して５０４／穴加え、４℃で１晩放置
後、ＰＢＳでよく洗浄した。次に、第二抗体として、ビ
オチン化抗胃癌モノクローナル抗体ＡＭＣ−３８２（１
０ｑ／ｍｌ）を１００ＩＩｉ／穴加え、４℃で１晩放置
し、ＰＢＳでよく洗浄した後、アビジン−ビオチン−ペ
ルオキ’ｙｆ−４Ｃヘク）−ル（ＶＥＣＴＯＲ）社製〕
（１０ｇ／ｍｌ）　１００ρ／穴加え、室温で１時間放
置した後、ＰＢＳで洗浄した。次にΔＢＴＳ基質液を１
００ＡＩ２／穴加え、室温で３０分間反応させ、５％Ｓ
ＤＳ溶液１００ｍ／穴を加え反応を停止した。

各穴の発色を吸光度計（ＯＤ４１Ｓ）で測定した。

その結果、第１図に示した様に、健常人血清では、ＯＤ
、、Ｓが０．３３をこえる陽性例は７７例中１例しかな
かったが、胃癌患者血清では、ＯＤｓ＋ｓが０．３３を
こえる陽性例が５２例中３２例あった。

このことより、本抗体を用いる血清診断法により、６１
．５％の確率で胃癌患者を見出すことが可能であること
がわかる。胃潰瘍患者血清では１６６例中０（０％）と
全く陽性例はなかった。

また、胃癌患者血清を病期毎にプロットすると、第２図
に示すごとく、ステージ■では４２．８％（７例中３例
）、■では５５．６％（９例中５例）、■では６３．６
％（１１１例中７）、■では６８％（２５５例中１例）
で陽性となった。この結果は、１、ＩＩ期の早期胃癌で
５０％（１６６例中８）が陽性となり、現在の早期胃癌
発見率の３５％という数値を考えれば、本血清診断が早
期胃癌の発見に有用であることが示唆される。また、第
２図より明らかなように、血中抗原量と病期の間には強
い相関性が認められることより、本血清診断系は、胃癌
のモニタリングにも有用であると判断される。

実施例４゜ 単クローン性抗体ＡＭＣ−３８２が認識する抗原を解析
するために、胃癌組織の膜成分を下記各種酵素および試
薬で処理した後ＡＭＣ−３８２との反応性を調べた。

酵素および試薬 トリプシン（ＧＩＢＣＯ社製　２．５％溶液）ＰＢＳ中
　０．２５％ ノイラミニダーゼ（ベーリンガー・マンハイム社製） ０．１Ｍ酢酸バッファ　　（１））（４，５）　−３ｍ
Ｍ（ａ　Ｃｎ　２中０．ＩＬｌ／ｍｌ α−Ｌ−フコシダーゼ（ベーリンガー・マンハイム社製
） ０．１Ｍリン酸バッファー（ｐ　Ｈ６，３）中０、ＩＵ
／ｍｌ プロテアーゼ（シグマ社製） ０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７，２）中１０Ｕ／ｍ
１ ＮａＩＯ４（和光紬薬社製） ＰＢＳ中５０＋ｙ＋Ｍ 胃癌組織の膜成分（蛋白量１００■／ｍｌ　）を５０４
／穴ずつ、ＥＩＡ用プレート〔リンプロ（Ｌｉｎｂｒｏ
）社製〕に分注し、４℃で１晩放置後、Ｐ　’Ｂ　Ｓで
３回洗浄し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを２００薦／穴分注し
、３０分間〜２時間室温で放置し、ＰＢＳで３回洗浄後
、上記酵素液または試薬液を５０ＩＩｉ／穴分注し、３
７℃で１時間反応させた。

ついでＰＢＳで５回洗浄し、単クローン性抗体ＡＭＣ３
８２（１０ｘ／ｍｌ）を５０４７大分注し、４℃で１晩
放置した。

Ｔｗｅｅｎ　２０−ＰＢＳ　　（Ｔｗｅｅｎ　２０は和
光紬薬工業社製）で５回洗浄後、パーオキシダーゼ標識
抗−マウス■ｇＧ（４００倍希釈液）を５０ρ／穴加え
、室温で２時間反応後、Ｔｗｅｅｎ　２Ｑ−ＰＢＳで５
回洗浄し、へＢＴＳ基質１００ｇを加え、３０分間反応
後、４１５ｒ＋＋＋＋における吸光度を測定した。

抗原性は、第３図に示したとおり、過ヨウ素酸（ＮａＩ
Ｏｌ）により部分的に、ノイラミニダーゼ、プロテアー
ゼ処理により完全に消失した。この結果より、単りＰ−
ン性抗体ＡＭＣ−３８２はシアル酸化された糖鎖を認識
しているものと推定された。

発明の効果 本発明によれば、胃癌の血清診断に好適な抗ヒト胃癌単
クローン性抗体が提供される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、単クローン性抗体ＡＭＣ−３８２による胃癌
の血清診断の結果を示す。 第２図は、単クローン性抗体ＡＭＣ−３８２による胃癌
の血清診断におけるステージの影響を示す。 第３図は、胃癌組織の膜成分の各種酵素、試薬処理によ
る単クローン性抗体ＡＭＣ−３８２との反応性の消長を
示す。 ・はノイラミニダーゼ０．ＩＵ／ｍｌ、△はα−Ｌ−フ
コシダーゼ０．ＩＵ／ｍｌ、口はトリプシン０．２５５
０ｍＭの処理を示す。Ｘは無処理を示す。 第１図 Ａｐ（、−３ｇλ１ｔカ冒晶。算湧鍮絣第２図 Ａ門Ｃ−３２λ１てハ胃ｐ：′ＸＬ清珍呵１．ｈ・グラ
スデー〉・・ｎ影Ｖ ＯＤＱｌｒｎｍｓ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ヒト胃癌細胞と反応し、ヒト正常胃組織（または細胞）
   とは反応せず、シアル酸化された糖蛋白質または糖脂質
   の糖鎖を抗原として認識し、かつＩｇ−Ｍクラスに属す
   る抗ヒト胃癌単クローン性抗体ＡＭＣ−３８２。