CN106380507B - 一种单克隆抗体的纯化工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种单克隆抗体的纯化工艺，首先采用弱酸缓冲液对蛋白样本进行三倍体积的稀释，调节pH值至4.2~4.4后进行等电点沉淀；采用0.22~0.45μm孔径的过滤器过滤，调节pH值至中性；采用中性盐进行盐析；采用0.05~0.22μm孔径过滤器将处理后的蛋白液直接过滤，弃上清，保留沉淀并富集；将富集的沉淀采用中性磷酸盐溶液进行复溶，复溶后的蛋白浓度为15‑20mg/ml，经动态透析，测量蛋白含量后分装入库。本发明流程简单，操作便捷，安全性高，可保证目的蛋白的高纯度（90%以上）、高回收率（95%以上），且成本低廉，可用于工业化大规模生产。

Description

一种单克隆抗体的纯化工艺

技术领域

本发明涉及生物医药技术中的蛋白纯化，尤其是涉及一种蛋白纯化中的单克隆抗体的纯化工艺。

背景技术

1975年Kohler和Milstein发明了单抗技术，但直到1987年单抗技术的价值才被认识到并应用于诊断试剂当中。目前单抗主要应用于疾病的预防、诊断和治疗，生物物质的纯化及蛋白结构功能的研究中。治疗性单抗的市场在新药开发中有逐年增长的趋势，1997年单抗的销售额是50亿美金，每年都有40%到50%的增长，至2003年已达到1997年的十倍，达500亿美金，由此可见单抗技术是生物技术领域中升起的一颗新星。

随着对单克隆抗体药物研究的不断深入，新药的不断推出，单克隆抗体药一直处于较高的增长率。单克隆抗体不仅在体外诊断试剂上得以广泛应用，还可直接用于对人类疾病的诊断、预防、治疗以及免疫机制的研究，为人类恶性肿瘤的免疫诊断与免疫治疗开辟了广阔的前景。

蛋白质，尤其是免疫球蛋白在当今的医学领域中起着重要作用。为确保生物药剂对人的安全性，作为药物使用时必须要除去蛋白质中可导致对人体严重伤害的核酸、病毒和宿主细胞蛋白质。而纯度、生产量和产率在确定合适的纯化方法中起着重要作用。

目前已有多种方法广泛地用于蛋白质的纯化，例如使用微生物蛋白质的亲和层析（A蛋白或G蛋白亲和层析）、离子交换层析［包括阳离子交换（羧甲基树脂）、阴离子交换（氨乙基树脂）和混合模式的交换］、亲硫吸附（使用β- 基乙醇和其他SH配体）、疏水性相互作用或芳香族化合物吸附层析（使用苯基-琼脂糖、氮杂-arenophilic树脂或间-氨基苯基硼酸）、金属螯合亲和层析（使用Ni（Ⅱ）-和Cu（Ⅱ）-亲和材料）、大小排阻层析和电泳方法（凝胶电泳、毛细管电泳）（Vigayalakshmi,M.A.,Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102）。

目前单克隆抗体的纯化方法较多，常规使用的盐析纯化方法成本虽然较低，但易出现收率低、纯度不达标等现象；而采用其他的层析技术手段的过程中又涉及到各种填料等活性材料，造成纯化成本较高、工艺复杂，不利于工业化生产，导致临床试验及医药成本较高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种工艺简单、操作便捷的单克隆抗体的纯化工艺，不仅能保证产品的高纯度、高回收率，且成本低廉，可用于工业化大规模生产。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的单克隆抗体的纯化工艺，包括下述具体步骤：

第一步，采用弱酸缓冲液（目的是避免目的蛋白在较低pH的环境下失去活性）对蛋白样本进行三倍体积的稀释，持续搅拌过程中将pH值调节至4.2~4.4后进行等电点沉淀，去除样品中的杂蛋白；

第二步，采用0.22~0.45μm孔径的二级深层过滤器对上述沉淀出的上清液进行过滤，并调节pH值至中性；

第三步，采用中性盐对第二步过滤后的上清液进行盐析；所用的中性盐为硫酸铵、Na2SO4或NaCl；

第四步，采用0.05~0.22μm孔径三级深层过滤器将经第三步处理后的蛋白液直接过滤，弃上清，保留沉淀并富集；

第五步，将富集的沉淀采用中性磷酸盐溶液进行复溶，复溶后的蛋白浓度为15-20mg/ml，经动态透析，测量蛋白含量后分装入库。

本发明的优点在于流程简单，操作便捷，安全性高，可保证目的蛋白的高纯度（90%以上）、高回收率（95%以上），且成本低廉，可用于工业化大规模生产。第一步中缓冲液的添加使蛋白样品溶液在除杂蛋白彻底的同时又保证了目的蛋白的活性；第二步至第四步的深层过滤采用不同孔径的滤膜，不仅保证了纯度达到90%以上，且使整体回收率达到95%以上；第五步的复溶透析采用中性磷酸盐溶液，最大程度的保证了抗体的活性且提高了整体工作效率，动态透析时可采用自动型动态透析仪，使整个工艺流程在24小时内完成。

具体实施方式

下面通过具体实例对本发明单克隆抗体的纯化工艺做详细的说明。

本发明的单克隆抗体的纯化工艺包括下述五个具体步骤：

第一步，等电点沉淀

先将需要纯化的蛋白样本（小鼠腹水）恢复室温（20~25℃）（正常情况，蛋白样品要保存在-20℃或-80℃的冰柜中冷藏），用检验过的量筒测量样本体积，然后使用20mM醋酸-醋酸钠缓冲液进行三倍体积的样品稀释并开始搅拌；由于腹水中蛋白的含量较高（用A₂₈₀检测总蛋白含量在40mg/ml左右），若直接进行调节pH进行等电点沉淀，容易在除去杂蛋白的同时发生聚沉现象，造成目的蛋白（IgG）损失，而在验证最优蛋白样品浓度纯化过程中验证值为10~15mg/ml（最优蛋白样品浓度：即在该蛋白样品浓度进行等电点沉淀时，保证有效去杂蛋白及避免目的蛋白（IgG）沉淀两个因素的综合评价效果最好的蛋白样品浓度）；选择弱酸缓冲液进行三倍体积的样品稀释可避免目的蛋白在较低pH的环境下失去活性；在持续搅拌过程中，使用稀盐酸将pH值调节至4.2~4.4（最好调节至4.4），室温下持续搅拌的时间约为40min左右；此时，因为白蛋白的等电点在4.4附近，而IgG的等电点在6.8左右，所以可以将纯化的小鼠腹水内含有的大量杂蛋白（如白蛋白、转运蛋白等）沉淀出来，而目的蛋白（IgG）依然保留在上清液里；

第二步，深层过滤并调节pH值至中性

采用0.22~0.45μm孔径的二级深层过滤器将搅拌后的蛋白样品直接过滤，弃沉淀，保留上清液，并调节pH值至中性；此孔径的滤膜既保证了上清液中的目的蛋白（IgG）结构不受破坏，也可有效的将蛋白样品内沉淀出的杂蛋白彻底去除，而且可去除蛋白样品内的大量细菌等不溶物杂质；

第三步，盐析

盐析所用的中性盐可采用硫酸铵、Na₂SO₄或NaCl等（由于硫酸铵的性价比较高，优先选择硫酸铵）。首先测量第二步得到的上清液体积，按每毫升上清液添加0.3g硫酸铵的比例称量硫酸铵，边搅拌边缓慢加入粉碎后的固体硫酸铵，室温下持续搅拌40min；硫酸铵加入蛋白质溶液中，可使蛋白质表面电荷被中和，水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素去除而沉淀，同时盐析是一个可逆的过程，析出的蛋白质仍可以溶解在水中，不影响原来蛋白质的性质（可以有效的使目的蛋白（IgG）沉淀的盐的百分比浓度为33%~50%），在实验过程中优先选择47%,这样不仅保证了目的蛋白（IgG）沉淀彻底，而且避免了少量的杂蛋白发生聚沉，在浓缩目的蛋白（IgG）的过程再次达到了除杂的作用；

第四步，深层过滤

采用0.05~0.22μm孔径的三级深层过滤器将搅拌后的蛋白样品直接过滤，弃上清，保留沉淀并富集；该步骤可有效截留目的蛋白（IgG），使其回收率高达95%以上；

第五步，复溶、透析并分装

将富集的沉淀（主要是目的蛋白）采用pH7.4的20mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠溶液（缓冲液）进行复溶，复溶后的蛋白浓度为15-20mg/ml，因为蛋白样本（小鼠腹水）为中性，一定的盐浓度可以避免目的蛋白（IgG）在反复冻融时候发生聚沉现象，为保证后期目的蛋白在一个较稳定的缓冲体系里延长保存期，复溶比例为湿重沉淀每克加入10ml缓冲液，这样可以保证复溶后的目的蛋白（IgG）的浓度在15~20mg/ml，使其完全满足后期实验需求；然后将其放置在标准透析袋内进行动态透析（建议透析时样品与透析液体积比例为1:15，每3h换液一次，共换液4次即可透析彻底），透析液为pH7.4的20mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠溶液；

透析后的蛋白样品经测量（聚丙烯酰氨凝胶电泳检测），目的蛋白条带所占比例在90%以上，最高可达99%。然后进行蛋白含量测定（A₂₈₀检测）后，可根据实验要求进行稀释至标准含量（建议终蛋白含量为10mg/ml），添加一定体积的防腐剂（一般采用0.1%的P₃₀₀或0.02%的叠氮钠）然后再进行分装，贴好标示（主要包括项目名称、批号、蛋白含量、体积等）入库即可；也可根据每次使用量进行小瓶分装，这样可以有效避免使用过程中反复冻融。

Claims (1)

1.一种单克隆抗体的纯化工艺，其特征在于：包括下述具体步骤：

第一步，采用20mM的醋酸-醋酸钠缓冲液对蛋白样本进行三倍体积的稀释，持续搅拌过程中将pH值调节至4.2～4.4后进行等电点沉淀，去除样品中的杂蛋白；

第二步，采用0.22～0.45μm孔径的二级深层过滤器对上述沉淀出的上清液进行过滤，并调节pH值至中性；

第三步，采用中性盐对第二步过滤后的上清液进行盐析；所用中性盐为硫酸铵、Na₂SO₄或NaCl；

第四步，采用0.05～0.22μm孔径三级深层过滤器将经第三步处理后的蛋白液直接过滤，弃上清，保留沉淀并富集；

第五步，将富集的沉淀采用缓冲液进行复溶，复溶后的蛋白浓度为15-20mg/ml，经动态透析，测量蛋白含量后分装入库。