CN111471100B - 一种新型红细胞膜单抗生产方法及其加工装置 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学技术领域，公开了一种新型红细胞膜单抗生产方法，进行腹水溶解、过滤、加硫酸葡聚糖和氯化钙离心，淋洗，平衡，稀释，清洗，解离，透析，孵育，制备抗体纳米粒子并用红细胞膜包裹、过滤并保存等步骤。本发明的生产方法操作简单且过程易控制，产出率高；本发明生产的新型红细胞膜单抗灵敏度高，特异性高，结果容易判定；还具有高稳定性、高癌细胞摄取率、低网状内皮系统清除率，及明显延长体内循环作用时间的特点；本发明的加工装置能够基于预设流程进行生产方法的精准控制，提高了生产效率，减少了生产操作的复杂性，提高经济效益，并且能够实现智能化控制，减少了人工投入。

Description

一种新型红细胞膜单抗生产方法及其加工装置

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种新型红细胞膜单抗生产方法及其加工装置。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：与传统小分子抗癌药相比，由于具有高特异性和强亲和力，抗体正日益成为最重要的抗癌药物之一。与其相比，尽管小分子抗癌药有一定的药效，并目前在化疗中仍然使用广泛，但其仍存在非特异性毒性(因针对所有分化细胞)和治疗窗小等缺点。另外，小分子抗癌药的耐药性也是其临床使用中常出现的问题，这些缺点给化疗病人带来了很多痛苦。而抗体因其对非特异性细胞毒性低、人体免疫原性低、生物可降解和生物相容性好等优点，已经越来越受到重视。

随着对不同类型癌细胞异常信号通路的研究进一步发展，肿瘤标志物中许多关键的调节因子也逐渐成为了分子靶向治疗的靶点。但由于抗体难以穿透细胞膜进入细胞内部，导致目前发现的许多细胞内的有效靶点如TERT、磷酸酶/激酶转录因子等不能用抗体阻断，很大程度上阻碍了针对细胞内部抗原的抗体的成药性。游离抗体的体积过大影响了其穿透肿瘤的能力，高间隙压阻止了大分子在肿瘤中的扩散，这些因素进一步影响了肿瘤细胞对抗体药物的摄取，成为阻碍治疗进展的关键问题之一。抗体作用的靶点分为细胞内和细胞外，人们通常将注意放到细胞外靶点上以获得更高的抗体-抗原接触机会，而对细胞内靶点的药物研究少之又少。实际上，胞内靶点是一个巨大的资源，因为他们既有更高的特异性，在与抗体接触后又有很高的杀伤率。但目前极少人尝试以细胞内抗原为靶点探讨抗体纳米粒子的摄取和作用。

另一方面，抗体是一种不稳定的蛋白，其暴露在外部的结构很容易受外界环境影响而失活，因此许多抗体在静脉注射后体内滞留时间短，这也阻碍了抗体药物的发展和应用。为了增加抗体半衰期，人们做了很多努力。如PEG化已经成为增加循环时间的金标准，但同时也存在一些问题，如产物纯度不够、对修饰分子的选择性高、可能增加药物毒性、大分子PEG排出体外困难等等。对于如何增加抗体循环时间仍需要有更深入的研究。

再则，一定粒径的外源性粒子在体内易被网状内皮系统识别并清除，这在一定程度上大大减少了大分子药物在体内的作用时间。粒子的粒径、表面电荷等对于这一问题都有着很大的影响。而红细胞膜身为体内内源性物质，由于其表面携带一些特定蛋白如CD47，可以帮助其逃脱网状内皮系统的吞噬。我们可以利用红细胞膜这一特点，给大分子药物穿上“外衣”，以降低巨噬细胞吞噬，延长体内作用时间。

现有专利CN201811323290.8红细胞膜单抗及其制备方法，包括步骤1：准备试剂：平衡缓冲液、解离缓冲液、再生缓冲液、透析缓冲液、pH中和液；准备设备：Protein A柱、低温高速离心机、天平、蠕动泵；步骤2：冷冻的腹水在前一日10-15℃融化，用浸湿三蒸水的脱脂棉过滤去除油脂，过滤后的腹水4℃10000rPm离心30min收集上清；填装适量Protein A填料，用纯化水洗涤5-10倍柱体积，淋洗去除乙醇；步骤3：进行平衡、上样、再平衡、解离、再生、再平衡、透析、回收，保存Protein A柱，清洗蠕动泵进样管；步骤4：配制试剂：10mMTris-NaCl、0.1M柠檬酸、0.1M甘氨酸缓冲液、20mM Tris-NaCl、2M Tris、透析缓冲液。此过程操作复杂，制备条件难以控制，产出率低。

现有专利CN201110258744.X莱克多巴胺单抗的制备方法及其应用公开的单抗制备方法假阳性、假阴性偏多。通过对盐酸莱克多巴胺结构改造，合成莱克多巴胺人工抗原，制备特异性莱克多巴胺单克隆抗体，并通过制备的莱克多巴胺单克隆抗体为核心试剂制备检测莱克多巴胺的胶体金免疫试纸条。此方法设流程生产方法的控制精确度差，整体的温度、搅拌、离心、蠕动的速度及时间难以控制，生产的效率低。

综上所述，现有技术存在的问题是：(1)现有红细胞膜单抗灵敏度不高，特异性不强，不容易被判定，且无法大批量生产。(2)PEG化已经成为增加循环时间的金标准，但同时也存在一些问题，如产物纯度不够、对修饰分子的选择性高、可能增加药物毒性、大分子PEG排出体外困难等。

解决上述技术问题的难度：解决上述问题的难度在于红细胞膜单抗无法进行大规模生产，导致生产成本的增加，限制了其进一步的应用。

解决上述技术问题的意义：解决上述问题之后，能够成功制备出生产红细胞膜单抗的装置，进行红细胞膜单抗生产的操作简单，能够有效提高生产效率；并且，制备的红细胞膜单抗的凝集效价、相对亲和力及特异性均较良好，提高了抗体疗效和生物利用度，将为某些疾病的临床诊断和治疗提供新的制剂。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种新型红细胞膜单抗生产方法及其加工装置。

本发明是这样实现的，一种新型红细胞膜单抗生产方法，所述新型红细胞膜单抗的生产方法包括以下步骤：

步骤一，将冷冻的腹水在无菌环境下37℃温浴溶解，用脱脂纱布过滤，得到的液体中每毫升添加0.04ml 10％硫酸葡聚糖和1ml 1M氯化钙，搅拌15分钟，10000rPm离心10分钟后收集上清，得到样品。

步骤二，将筛板置于层析柱底部，排出柱底和管子内的气体后，填装适量ProteinA填料，保持放柱和填装的速度一致；用纯化水洗涤5-10倍柱体积，利用淋洗装置进行淋洗以去除乙醇，进行柱准备。

步骤三，用平衡缓冲液10mM pH8.3的Tris-NaCl淋洗5-10倍柱体积，平衡至无蛋白流出，即蛋白紫外检测仪显示值为0；步骤二中，所述Protein A长期不使用则柱内填充20％乙醇，4-8℃保存。

步骤四，用两倍体积的平衡缓冲液10mM pH8.3的Tris-NaCl利用稀释装置进行稀释作为样品上样，调节蠕动泵转速为4滴/秒，使用蠕动泵在20-25℃条件下缓慢上样；将填料上方的平衡液排出，直至液面和上筛板相切时停止。

步骤五，加入10-15倍柱体积的洗杂缓冲液，开启蠕动泵进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。

步骤六，平衡完成后使用高浓度的氯化钠进行解离，当蛋白紫外检测仪显示值大于0.3时开始收集蛋白，当蛋白紫外检测仪显示值小于0.3时停止收集蛋白。

步骤七，解离完成后用0.1M pH2.7的甘氨酸缓冲液进行再生约2倍柱体积；再生完成后用平衡缓冲液10mM pH8.0的Tris-HCl平衡柱约5-10倍柱体积。

步骤八，将得到的含蛋白组分的溶液置于1-3倍去离子水中，搅拌均匀后使用2-5KDa的透析膜、pH7-8的10-30mM磷酸盐缓冲溶液在4℃条件下进行透析处理48-72h；所述磷酸盐缓冲溶液的用量为溶液的10-20倍，换液3次，每次透析时间不低于4小时。

步骤九，透析完成后回收抗体并置于抗体孵育盒中进行孵育；孵育完成后用等电点沉淀制备抗体纳米粒子并用红细胞膜包裹抗体纳米粒子，用0.2μm滤膜过滤后添加0.09％NaN₃，置于4℃进行蛋白保存。

进一步，步骤四中，所述蠕动泵处理其它样品时应使用该样品上样缓冲液冲洗5-10遍硅胶管再进行其它操作。

进一步，步骤六中，所述解离方法为：首先往样品中添加高浓度的氯化钠，置于50～70℃作用5～20min，再添加解离剂对抗原抗体复合物进行解离；所述解离剂中含有5～6M的尿素、3.0～7.0％的Tween 80、0.5～3.0％的Triton X100；所述解离剂中尿素的含量为5.5M，所述Tween 80的含量为5％，所述Triton X100的含量为1.0％；所述高浓度的氯化钠是指终浓度在1.5～3M范围内的氯化钠。

进一步，步骤九中，所述抗体纳米粒子的制备方法包括以下步骤：

1)制备红细胞膜：完全麻醉SD大鼠后心脏取血，将血转移至含肝素钠的EP管中；全血离心，弃去上层清液，留下暗红色沉淀，PBS洗涤，离心机离心，再洗涤数次；弃去上层清液，留下沉淀，取PBS吹散，取0.2mMEDTA放入离心管混匀，充分溶血后，加入20*PBS，离心，再溶血离心数次；弃去上层清液，沉淀即为红细胞膜。

2)等电点沉淀制备抗体纳米粒子：将抗体装入透析袋，在超纯水中透析，收集透析袋中的抗体，冻干，-20℃保存；取冻干抗体，溶于含Tween80的HCl溶液中，在磁子搅拌下逐滴加入NaOH溶液，直至出现的烟雾样沉淀至最大量；离心，小心移除上清，得到抗体纳米粒子；其中，所述Tween80浓度范围为0.01％-5％，HCl浓度范围为0.005M-0.5M，NaOH浓度范围为0.005M-0.5M。

3)制备红细胞膜包裹的抗体纳米粒子：将红细胞膜与抗体纳米粒子混合，加入1*PBS重悬，超声下加入20*PBS使PBS终浓度至1*PBS，既得红细胞膜包裹的抗体纳米粒子；所述红细胞膜包裹的抗体纳米粒子粒径范围为50nm-500nm。

本发明的另一目的在于提供一种应用所述新型红细胞膜单抗生产方法的新型红细胞膜单抗加工装置，所述新型红细胞膜单抗加工装置包括：生产控制系统、淋洗装置、稀释装置和抗体孵育盒。所述淋洗装置、稀释装置和抗体孵育盒均通过导线与生产控制系统连接。

进一步，所述新型红细胞膜单抗生产控制系统具体包括：

信息采集模块：与主控模块连接，用于采集温度、湿度、速度、是否有蛋白流出及其他相关信息；

参数设定模块：与主控模块连接，用于预先设定生产流程及步骤，并设定每一步骤的环境温度、离心速度、离心时间、搅拌速度、搅拌时间、所需试剂及其他相关信息；

主控模块：与信息采集模块、参数设定模块、温度控制模块、离心控制模块、搅拌控制模块、试剂控制模块、淋洗控制模块、蠕动泵控制模块、孵育控制模块、显示模块，用于基于参数设定模块设置的相关信息，调控各个模块的工作，并发出各种控制命令；

温度控制模块：与主控模块连接，用于控制生产过程中的温度；

离心控制模块：与主控模块连接，用于控制离心速度及离心时间；

搅拌控制模块：与主控模块连接，用于控制搅拌速度及搅拌时间；

试剂控制模块：与主控模块连接，用于进行试剂的稀释，同时根据预设参数，在某一特定步骤或某一特定时间投放所需特定浓度的溶剂；所述试剂包括但不限于纯化水、去离子水、硫酸葡聚糖、氯化钙、平衡缓冲液及其他所需试剂；

淋洗控制模块：与主控模块连接，用于根据预设参数，在某一特定流程投放相应试剂至淋洗装置进行淋洗操作，并控制淋洗时间；

蠕动泵控制模块：与主控模块连接，用于控制蠕动泵的转速、转动时间；

孵育控制模块：与主控模块连接，用于接收主控模块传送的相关控制命令，进行孵育盒的温度及其他相关调节；

显示模块：用于显示检测到的各个结果及预设设定的参数信息。

进一步，所述淋洗装置包括设置在所述辊轮每一端的至少一个子淋洗装置，所述子淋洗装置至少包括：引流环、至少一根引流管和至少一个锁水扇；所述引流环环固于所述辊轮的待淋洗端，所述引流环的内环壁上设置有孔体。

所述引流管的一端与所述锁水扇活动相连、另一端穿过所述引流环的外环壁且位于所述引流环中，并且所述另一端固定于所述辊轮上；通过所述辊轮的转动，带动所述引流环、引流管以及锁水扇运动，当所述锁水扇随着所述辊轮往下运动经过所述萃取槽时舀取萃取液，当所述锁水扇随着所述辊轮往上运动时，舀取的所述萃取液依次通过所述引流管、所述引流环以及所述孔体淋洗在所述辊轮的待淋洗端；所述引流环和辊轮之间设置有环形卡扣，所述环形卡扣内壁设置有凹槽，所述凹槽中设置缓冲垫，所述环形卡扣通过所述缓冲垫与所述辊轮接触固定。

进一步，所述稀释装置本体包括：固定基座和至少一个比例分配器；所述固定基座上形成有至少一个进液管路以及一个出液管路，所述进液管路相互连通，然后与出液管路连通；所述比例分配器的数量与进液管路的数量相同，所述比例分配器的进口通过管路连接进液容器，所述比例分配器的出口与所述固定基座的进液管路连通；所述出液管路与流动注射分析仪连接；所述控制系统与所述比例分配器信号连接，用于控制比例分配器的分配比例。

所述进液容器为样品容器和稀释液容器；所述进液管路的数量为3个，分别通过比例分配器连接至样品容器、第一稀释液容器和第二稀释液容器；所述比例分配器为比例电磁阀、蠕动泵或注射泵；所述比例分配器与所述固定基座的进液管路之间通过连接管路连接，所述连接管路为毛细管、泵管或玻璃管。

进一步，所述抗体孵育盒设置有遮光的盒体，位于盒体内壁两侧设有凸台，凸台适于架空多孔板，且位于多孔板的下方设有一抽屉层，该抽屉层内放置有海绵；所述多孔板的上端面铺设有塑胶膜，该塑胶膜的上边沿设置有纵向标记位，一侧边沿设置有横向标记位，且沿相应标记位的延长线将塑胶膜划分为相应网格区。

进一步，所述抗体孵育盒盒体的至少一侧设有致冷片，该致冷片与冷热换向电路相连，且该冷热换向电路由处理器模块控制，所述处理器模块还与按键模块、显示模块和用于检测盒内温度的温度传感器相连；所述处理器模块还与时钟模块和蜂鸣器相连。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明在生产过程中将筛板置于层析柱底部，能够为之后上样的开启与停止提供参考标准；排出柱底和管子内的气体后进行填料，防止气泡产生；设定蠕动泵转速为4滴/秒，与放柱的速度相适应，能够避免气泡产生，上样效果更佳；液面和上筛板相切时关闭蠕动泵，完成上样；加入10-15倍柱体积的洗杂缓冲液进行清洗，能够去除非特异性吸附的杂蛋白，纯化效果更好；使用pH7～8的磷酸盐缓冲溶液进行透析处理，能够为保持细胞结构和完整性提供良好生理环境；0.2μm滤膜能够将细菌进行过滤，减少蛋白中的细菌，更有利于保存的进行，同时可以实现其纯度的提高；4℃进行蛋白保存能够保证其活性，保证其结构的稳定。

本发明将抗体置于避光保湿抗体孵育盒中，能够保证在盒体内具有避光、保湿的孵育环境，通过放置在抽屉层中的海绵可以及时补充水分，提高保湿效果；通过塑胶膜可以标定孵育抗体的具体位置，便于后期有针对性的定位相应孵育抗体进行检测化验；位于盒体侧壁的致冷片能够有效的控制孵育温度，提高孵育效果。

本发明的抗体纳米粒子具有符合增强渗透滞留效应(即EPR效应)的粒径范围，具有高稳定性、高癌细胞摄取率、低网状内皮系统清除率，及明显延长体内循环作用时间的特点，提高了抗体疗效和生物利用度。

本发明控制系统能够基于预设流程进行生产方法的控制，精准的控制整体的温度、搅拌、离心、蠕动的速度及时间，提高了生产的效率，减少了生产操作的复杂性，提高经济效益，能够实现智能化控制，减少了人工投入。本发明的生产方法工艺简单，不繁琐，且过程易控制，产出率高；本发明生产的新型红细胞膜单抗灵敏度高，特异性高，结果容易判定。本发明制备的抗体免疫后效价高，且融合后细胞长，细胞生长快。

附图说明

图1是本发明实施例提供的新型红细胞膜单抗生产方法流程图。

图2是本发明实施例提供的新型红细胞膜单抗生产控制系统结构示意图；

图中：1、信息采集模块；2、参数设定模块；3、主控模块；4、温度控制模块；5、离心控制模块；6、搅拌控制模块；7、试剂控制模块；8、淋洗控制模块；9、蠕动泵控制模块；10、孵育控制模块；11、显示模块。

图3是本发明实施例提供的淋洗装置结构示意图；

图中：12、引流环；13、引流管；14、锁水扇；15、辊轮；16、萃取槽；17、萃取液；18、环形卡扣。

图4是本发明实施例提供的稀释装置结构示意图；

图中：19、固定基座；20、比例分配器；21、样品容器。

图5是本发明实施例提供的抗体孵育盒结构示意图；

图中：22、盒体；23、凸台；24、多孔板；25、抽屉层；26、海绵；27、塑胶膜。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

现有红细胞膜单抗灵敏度不高，特异性不强，不容易被判定，且无法大批量生产。PEG化已经成为增加循环时间的金标准，但同时也存在一些问题，如产物纯度不够、对修饰分子的选择性高、可能增加药物毒性、大分子PEG排出体外困难等。

为解决上述问题，下面结合附图对本发明作详细说明。

如图1所示，本发明实施例提供的新型红细胞膜单抗的生产方法包括以下步骤：

S101：将冷冻的腹水在无菌环境下37℃温浴溶解，用脱脂纱布过滤，得到的液体中每毫升添加0.04ml 10％硫酸葡聚糖和1ml 1M氯化钙，搅拌15分钟，10000rPm离心10分钟后收集上清，得到样品。

S102：将筛板置于层析柱底部，排出柱底和管子内的气体后，填装适量ProteinA填料，保持放柱和填装的速度一致；用纯化水洗涤5-10倍柱体积，利用淋洗装置进行淋洗以去除乙醇，进行柱准备。

S103：用平衡缓冲液10mM pH8.3的Tris-NaCl淋洗5-10倍柱体积，平衡至无蛋白流出，即蛋白紫外检测仪显示值为0；步骤S102中所述Protein A长期不使用则柱内填充20％乙醇，4-8℃保存。

S104：用两倍体积的平衡缓冲液10mM pH8.3的Tris-NaCl利用稀释装置进行稀释作为样品上样，调节蠕动泵转速为4滴/秒，使用蠕动泵在20-25℃条件下缓慢上样；将填料上方的平衡液排出，直至液面和上筛板相切时停止。

S105：加入10-15倍柱体积的洗杂缓冲液，开启蠕动泵进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。

S106：平衡完成后使用高浓度的氯化钠进行解离，当蛋白紫外检测仪显示值大于0.3时开始收集蛋白，当蛋白紫外检测仪显示值小于0.3时停止收集蛋白。

S107：解离完成后用0.1M pH2.7的甘氨酸缓冲液进行再生约2倍柱体积；再生完成后用平衡缓冲液10mM pH8.0的Tris-HCl平衡柱约5-10倍柱体积。

S108：将得到的含蛋白组分的溶液置于1-3倍去离子水中，搅拌均匀后使用2-5KDa的透析膜、pH7-8的10-30mM磷酸盐缓冲溶液在4℃条件下进行透析处理48-72h；所述磷酸盐缓冲溶液的用量为溶液的10-20倍，换液3次，每次透析时间不低于4小时。

S109：透析完成后回收抗体并置于抗体孵育盒中进行孵育；孵育完成后用等电点沉淀制备抗体纳米粒子并用红细胞膜包裹抗体纳米粒子，用0.2um滤膜过滤后添加0.09％NaN₃，置于4℃进行蛋白保存。

本发明提供的S104中，所述蠕动泵处理其它样品时应使用该样品上样缓冲液冲洗5-10遍硅胶管再进行其它操作。

本发明提供的S106中，所述解离方法为：首先往样品中添加高浓度的氯化钠，置于50～70℃作用5～20min，再添加解离剂对抗原抗体复合物进行解离；所述解离剂中含有5～6M的尿素、3.0～7.0％的Tween 80、0.5～3.0％的Triton X100；所述解离剂中尿素的含量为5.5M，所述Tween 80的含量为5％，所述Triton X100的含量为1.0％；所述高浓度的氯化钠是指终浓度在1.5～3M范围内的氯化钠。

本发明提供的S109中，所述抗体纳米粒子的制备方法包括以下步骤：

1)制备红细胞膜：完全麻醉SD大鼠后心脏取血，将血转移至含肝素钠的EP管中；全血离心，弃去上层清液，留下暗红色沉淀，PBS洗涤，离心机离心，再洗涤数次；弃去上层清液，留下沉淀，取PBS吹散，取0.2mMEDTA放入离心管混匀，充分溶血后，加入20*PBS，离心，再溶血离心数次；弃去上层清液，沉淀即为红细胞膜。

2)等电点沉淀制备抗体纳米粒子：将抗体装入透析袋，在超纯水中透析，收集透析袋中的抗体，冻干，-20℃保存；取冻干抗体，溶于含Tween80的HCl溶液中，在磁子搅拌下逐滴加入NaOH溶液，直至出现的烟雾样沉淀至最大量；离心，小心移除上清，得到抗体纳米粒子；其中，所述Tween80浓度范围为0.01％-5％，HCl浓度范围为0.005M-0.5M，NaOH浓度范围为0.005M-0.5M。

3)制备红细胞膜包裹的抗体纳米粒子：将红细胞膜与抗体纳米粒子混合，加入1*PBS重悬，超声下加入20*PBS使PBS终浓度至1*PBS，既得红细胞膜包裹的抗体纳米粒子；所述红细胞膜包裹的抗体纳米粒子粒径范围为50nm-500nm。

本发明实施例提供的一种应用所述新型红细胞膜单抗生产方法的新型红细胞膜单抗加工装置，所述新型红细胞膜单抗加工装置包括：生产控制系统、淋洗装置、稀释装置和抗体孵育盒。

如图2所示，本发明提供的新型红细胞膜单抗生产控制系统具体包括：

信息采集模块1：与主控模块3连接，用于采集温度、湿度、速度、是否有蛋白流出及其他相关信息。

参数设定模块2：与主控模块3连接，用于预先设定生产流程及步骤，并设定每一步骤的环境温度、离心速度、离心时间、搅拌速度、搅拌时间、所需试剂及其他相关信息。

主控模块3：与信息采集模块1、参数设定模块2、温度控制模块4、离心控制模块5、搅拌控制模块6、试剂控制模块7、淋洗控制模块8、蠕动泵控制模块9、孵育控制模块10、显示模块11，用于基于参数设定模块设置的相关信息，调控各个模块的工作，并发出各种控制命令。

温度控制模块4：与主控模块3连接，用于控制生产过程中的温度。

离心控制模块5：与主控模块3连接，用于控制离心速度及离心时间。

搅拌控制模块6：与主控模块3连接，用于控制搅拌速度及搅拌时间。

试剂控制模块7：与主控模块3连接，用于进行试剂的稀释，同时根据预设参数，在某一特定步骤或某一特定时间投放所需特定浓度的溶剂；所述试剂包括但不限于纯化水、去离子水、硫酸葡聚糖、氯化钙、平衡缓冲液及其他所需试剂。

淋洗控制模块8：与主控模块3连接，用于根据预设参数，在某一特定流程投放相应试剂至淋洗装置进行淋洗操作，并控制淋洗时间。

蠕动泵控制模块9：与主控模块3连接，用于控制蠕动泵的转速、转动时间。

孵育控制模块10：与主控模块3连接，用于接收主控模块传送的相关控制命令，进行孵育盒的温度及其他相关调节。

显示模块11：与主控模块3连接，用于显示检测到的各个结果及预设设定的参数信息。

如图3所示，本发明提供的淋洗装置包括设置在所述辊轮每一端的至少一个子淋洗装置，所述子淋洗装置至少包括：引流环12、至少一根引流管13和至少一个锁水扇14；所述引流环环固于所述辊轮15的待淋洗端，所述引流环12的内环壁上设置有孔体。

本发明提供的引流管13的一端与所述锁水扇14活动相连、另一端穿过所述引流环12的外环壁且位于所述引流环12中，并且所述另一端固定于所述辊轮15上；通过所述辊轮15的转动，带动所述引流环12、引流管13以及锁水扇14运动，当所述锁水扇14随着所述辊轮15往下运动经过所述萃取槽16时舀取萃取液17，当所述锁水扇14随着所述辊轮15往上运动时，舀取的所述萃取液17依次通过所述引流管13、所述引流环12以及所述孔体淋洗在所述辊轮15的待淋洗端；所述引流环12和辊轮15之间设置有环形卡扣18，所述环形卡扣18内壁设置有凹槽，所述凹槽中设置缓冲垫，所述环形卡扣18通过所述缓冲垫与所述辊轮15接触固定。

如图4所示，本发明提供的稀释装置本体包括：固定基座19和至少一个比例分配器20；所述固定基座19上形成有至少一个进液管路以及一个出液管路，所述进液管路相互连通，然后与出液管路连通；所述比例分配器20的数量与进液管路的数量相同，所述比例分配器20的进口通过管路连接进液容器，所述比例分配器的出口与所述固定基座的进液管路连通；所述出液管路与流动注射分析仪连接；所述控制系统与所述比例分配器信号连接，用于控制比例分配器的分配比例。

本发明提供的进液容器为样品容器21和稀释液容器；所述进液管路的数量为3个，分别通过比例分配器连接至样品容器、第一稀释液容器和第二稀释液容器；所述比例分配器为比例电磁阀、蠕动泵或注射泵；所述比例分配器与所述固定基座的进液管路之间通过连接管路连接，所述连接管路为毛细管、泵管或玻璃管。

如图5所示，本发明提供的抗体孵育盒设置有遮光的盒体22，位于盒体22内壁两侧设有凸台23，凸台23适于架空多孔板24，且位于多孔板24的下方设有一抽屉层25，该抽屉层25内放置有海绵26；所述多孔板24的上端面铺设有塑胶膜27，该塑胶膜27的上边沿设置有纵向标记位，一侧边沿设置有横向标记位，且沿相应标记位的延长线将塑胶膜27划分为相应网格区。

本发明提供的盒体22的至少一侧设有致冷片，该致冷片与冷热换向电路相连，且该冷热换向电路由处理器模块控制，所述处理器模块还与按键模块、显示模块和用于检测盒内温度的温度传感器相连；所述处理器模块还与时钟模块和蜂鸣器相连。

下面结合具体实验及数据对本发明作进一步描述。

1)、新型红细胞膜单抗的生产：

本发明具体实验提供的是一种应用所述新型红细胞膜单抗生产方法及其加工装置生产的新型红细胞膜单抗，所述新型红细胞膜单抗具体包括：SEQ ID NO：1：重链可变区氨基酸序列；SEQ ID NO：2：重链可变区核苷酸序列；SEQ ID NO：3：轻链可变区氨基酸序列；SEQ ID NO：4：轻链可变区核苷酸序列。

SEQ ID NO：1：重链可变区氨基酸序列：

TTKTSSNTAYMVQSSITSEDSAVYYCARRGRVSAERNSYSVTNNGKTELNYKNTEPVLDSDNVEVHTAQDDGSLSSGVHTLPAVLQSGLNTLSSSLTPRGPTIKPGKEFKCKDNNKDLAAPIRRTISKAKGSVCPRCKCPAPNLLGGPSVFIGPPKIKNVLMISKYAYTLYHSTLRAVSALPIQAQDWMPRAPQVYVTPPREEERTKKQVTRTCMVRDFMPEDIYVSPIVTYVVVDKSEDDPDVSFSREVWIEWVKQRPGHGLEWSANILPGSGSPNYGFPYWEWTGQGTLVTQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSSYNEKFKGKDTFTADQISWFVGKIECSVVHEGLHNHHGSYFVYKLLRVEKKNWVTSPSQSITRNVANPASSPKVDKSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLRCLVKGYSPEPVTLPWNS；

SEQ ID NO：2：重链可变区核苷酸序列：

ACCACCAAGACCAGCAGCAACACCGCCTACATGGTGCAGAGCAGCATCACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAAGAGGCAGAGTGAGCGCCGAGAGAAACAGCTACAGCGTGACCAACAACGGCAAGACCGAGCTGAACTACAAGAACACCGAGCCCGTGCTGGACAGCGACAACGTGGAGGTGCACACCGCCCAGGACGACGGCAGCCTGAGCAGCGGCGTGCACACCCTGCCCGCCGTGCTGCAGAGCGGCCTGAACACCCTGAGCAGCAGCCTGACCCCCAGAGGCCCCACCATCAAGCCCGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAGGACAACAACAAGGACCTGGCCGCCCCCATCAGAAGAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCAGCGTGTGCCCCAGATGCAAGTGCCCCGCCCCCAACCTGCTGGGCGGCCCCAGCGTGTTCATCGGCCCCCCCAAGATCAAGAACGTGCTGATGATCAGCAAGTACGCCTACACCCTGTACCACAGCACCCTGAGAGCCGTGAGCGCCCTGCCCATCCAGGCCCAGGACTGGATGCCCAGAGCCCCCCAGGTGTACGTGACCCCCCCCAGAGAGGAGGAGAGAACCAAGAAGCAGGTGACCAGAACCTGCATGGTGAGAGACTTCATGCCCGAGGACATCTACGTGAGCCCCATCGTGACCTACGTGGTGGTGGACAAGAGCGAGGACGACCCCGACGTGAGCTTCAGCAGAGAGGTGTGGATCGAGTGGGTGAAGCAGAGACCCGGCCACGGCCTGGAGTGGAGCGCCAACATCCTGCCCGGCAGCGGCAGCCCCAACTACGGCTTCCCCTACTGGGAGTGGACCGGCCAGGGCACCCTGGTGACCCAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGATGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCACCGGCTACACCTTCAGCAGCTACAACGAGAAGTTCAAGGGCAAGGACACCTTCACCGCCGACCAGATCAGCTGGTTCGTGGGCAAGATCGAGTGCAGCGTGGTGCACGAGGGCCTGCACAACCACCACGGCAGCTACTTCGTGTACAAGCTGCTGAGAGTGGAGAAGAAGAACTGGGTGACCAGCCCCAGCCAGAGCATCACCAGAAACGTGGCCAACCCCGCCAGCAGCCCCAAGGTGGACAAGAGCAGCGCCAAGACCACCGCCCCCAGCGTGTACCCCCTGGCCCCCGTGTGCGGCGACACCACCGGCAGCAGCGTGACCCTGAGATGCCTGGTGAAGGGCTACAGCCCCGAGCCCGTGACCCTGCCCTGGAACAGCTGA；

SEQ ID NO：3：轻链可变区氨基酸序列：

GGGTFNDRFKDSTYSQSYPFTFFLNKNPWTDQDIVTGVSSRFSGSGSGTAFTLTTSSTLTLTKDEYERHNSYTTEATHIISNVKCEIDGSERLHKLEIKRADVAPTASIFPPSSEQLTSGGASVVCYCQQGMTQTPSSLSASLGDVLSKSCDSKSTSPIVRSISSLQGEDIATYRNEGIQNGVLHASQNIKVWLSWYQQKPGNIPKLLIYKTSNRDRADLIGH；

SEQ ID NO：4：轻链可变区核苷酸序列：

GGCGGCGGCACCTTCAACGACAGATTCAAGGACAGCACCTACAGCCAGAGCTACCCCTTCACCTTCTTCCTGAACAAGAACCCCTGGACCGACCAGGACATCGTGACCGGCGTGAGCAGCAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGCCTTCACCCTGACCACCAGCAGCACCCTGACCCTGACCAAGGACGAGTACGAGAGACACAACAGCTACACCACCGAGGCCACCCACATCATCAGCAACGTGAAGTGCGAGATCGACGGCAGCGAGAGACTGCACAAGCTGGAGATCAAGAGAGCCGACGTGGCCCCCACCGCCAGCATCTTCCCCCCCAGCAGCGAGCAGCTGACCAGCGGCGGCGCCAGCGTGGTGTGCTACTGCCAGCAGGGCATGACCCAGACCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCGACGTGCTGAGCAAGAGCTGCGACAGCAAGAGCACCAGCCCCATCGTGAGAAGCATCAGCAGCCTGCAGGGCGAGGACATCGCCACCTACAGAAACGAGGGCATCCAGAACGGCGTGCTGCACGCCAGCCAGAACATCAAGGTGTGGCTGAGCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAACATCCCCAAGCTGCTGATCTACAAGACCAGCAACAGAGACAGAGCCGACCTGATCGGCCACTGA。

2)、新型红细胞膜单抗的急性毒性试验：

2.1)试验过程：根据临床推荐的治疗方案(5mg/次，一次经血管注射)，设定新型红细胞膜单抗的小鼠单次剂量为20mg单抗/kg，相当于临床人用剂量的200倍(50kg/人，剂量按公斤体重计算)。设试验组和对照组，每组小鼠24只，雌雄各半。试验鼠一次尾静脉注入0.4mg单抗/20g，容量为0.4ml；对照鼠给予等量生理盐水。给药后即刻，此后每隔1h观察记录小鼠的一般状态(包括对外来刺激的反应、活动行为、呼吸、痉挛、皮毛、排泄物等)、有无死亡及死亡过程。给药后24h各组处死雌雄小鼠各2个，剖检观察有无肉眼可见病变，如有病变应作病理切片检查。其余小鼠连续观察14d，每日观察1次，隔日称重1次。

2.2)试验结果：小鼠一次尾静脉注射相当于临床推荐剂量200倍的新型红细胞膜单抗后，一般状态良好，与对照组小鼠无明显差异。静脉注射24h后剖检，肉眼未观察到病变。无论摄食、体重，试验组小鼠同对照组无任何明显差异，试验组鼠全部存活，一般状态正常，体重增长，未见明显毒副反应。新型红细胞膜单抗对小鼠急性毒性试验期间体重的影响如表1所示。

表1 新型红细胞膜单抗对小鼠急性毒性试验期间体重的影响

3)、新型红细胞膜单抗的效价测定试验：

3.1)试验步骤：本发明采用聚凝胺试验、间接抗球蛋自试验((IAT)和白蛋白铺层试验和ELISA，检测新型红细胞膜单抗的细胞培养上清中mAb的效价。检测中使用O型红细胞制成的2％～4％的盐水悬液。检测前首先要对新型红细胞膜单抗的细胞培养上清进行倍比稀释。

3.1.1)试验中倍比稀释步骤：(1)根据血清稀释度标记10个检测试管，一个1:1的稀释液表示1体积没有稀释的血清。1:2表示在最终为2体积的溶液中有1体积的血清或在稀释液中有50％的血清溶液。

(2)除第1管(1:1)外其余的试管都加1体积盐水。

(3)在前2管中(1:1和1:2)加相同体积的血清。

(4)使用洁净的移液管混匀1:2管中的内容物，并转移1体积到下一试管中(此管的浓度则为1:4)。

(5)继续按相同方法稀释，直到最后一管，从最后一管中移出1体积的稀释血清。

(6)对倍比稀释后的抗体可通过聚凝胺试验、间接抗球蛋白试验((IAT)，白蛋白铺层试验等检测相应的抗体浓度。

(7)肉眼观察凝集强度并评分。试验结果如表2所示。

表2 ELISA法检测细胞培养上清的抗体效价

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：新型红细胞膜单抗生产方法

1.工作流程：

1.1准备：

1.1.1试剂准备：

平衡缓冲液：10mM Tris-NaCl(pH8.3)。

解离缓冲液：0.1M柠檬酸(pH4.0)。

再生缓冲液：0.1M甘氨酸(pH2.7)。

透析缓冲液：20mM Tris-NaCl(pH7.5)或10mM PBS(pH7.4)。

pH中和液：2M Tris(pH8.0)。

1.1.2设备准备：Protein A柱、低温高速离心机、天平、蠕动泵。

1.2操作步骤：

1.2.1样品准备：冷冻的腹水在前一日10-15℃融化，用浸湿三蒸水的脱脂棉过滤去除油脂，过滤后的腹水4℃10000rPm离心30min收集上清。

柱准备：填装适量Protein A填料，用纯化水洗涤5-10倍柱体积，淋洗去除乙醇。

1.2.2平衡：Protein A柱用平衡缓冲液平衡5倍柱体积。

1.2.3上样：腹水用两倍体积的平衡缓冲液10mM Tris-NaCl(pH8.3)稀释作为样品上样，使用蠕动泵在20-25℃条件下缓慢上样。

1.2.4平衡：上样完成后再用平衡缓冲液10mM Tris-NaCl(pH8.3)淋洗5-10倍柱体积，平衡至无蛋白流出，即蛋白紫外检测仪显示值为0。

1.2.5解离：平衡完成后使用0.1M柠檬酸(pH4.0)进行解离，当蛋白紫外检测仪显示值大于0.3时开始收集蛋白，当蛋白紫外检测仪显示值小于0.3时停止收集蛋白。

1.2.6再生：解离完成后用0.1M甘氨酸(pH2.7)缓冲液进行再生约2倍柱体积。

1.2.7平衡：再生完成后用平衡缓冲液10mM Tris-NaCl(pH8.3)平衡柱约5-10倍柱体积；

1.2.8透析：合并含蛋白组分使用透析缓冲液20mM Tris-NaCl(pH7.5)或10mM PBS(pH7.4)进行透析，透析比例为1:50，换液3次，每次透析时间不低于4小时。

1.2.9抗体处理：透析完成后回收抗体并用0.22μm滤膜过滤后添加0.09％NaN3保存蛋白。

1.3 Protein A柱保存：Protein A柱长期不使用则柱内填充20％乙醇，4-8℃保存。

1.4蠕动泵进样管的清洗：同一蠕动泵处理其它样品时应使用该样品上样缓冲液冲洗5-10遍硅胶管再进行其它操作。

1.5试剂配制：

1.5.1 10mM Tris-NaCl(pH 8.3)

品名	原料来源	1L标准量
			Tris	北京益利	1.21g
NaCl	北京益利	11.688g
			纯化水	自制，质检合格	1L

用电子天平称取上述试剂，倒入1L烧杯中，再加入适量纯化水，搅拌溶解，用浓盐酸调pH至8.3，定容至1L。

1.5.2 0.1M柠檬酸(pH4.0)

用电子天平称取上述试剂，倒入1L烧杯中，再加入适量纯化水，搅拌溶解，用2.5MNaOH调节pH至4.0，定容至1L。

1.5.3 0.1M甘氨酸缓冲液(pH2.7)

品名	原料来源	1L标准量
			甘氨酸	北京益利	7.51g
纯化水	自制，质检合格	1L

用电子天平称取上述试剂，倒入1L烧杯中，再加入适量纯化水，搅拌溶解，用浓盐酸调pH至2.7，定容至1L。

1.5.4 20mM Tris-NaCl(pH7.5)

品名	原料来源	1L标准量
			Tris	北京益利	2.4218g
NaCl	北京益利	11.688g
			纯化水	自制，质检合格	1L

用电子天平称取上述试剂，倒入1L烧杯中，再加入适量纯化水，搅拌溶解，用浓盐酸调pH至7.5，定容至1L。

1.5.5 2M Tris(pH8.0)

品名	原料来源	1L标准量
			Tris	北京益利	242.18g
纯化水	自制，质检合格	1L

用电子天平称取上述试剂，倒入1L烧杯中，再加入适量纯化水，搅拌溶解，用浓盐酸调pH至8.0，定容至1L。

1.5.6透析缓冲液：10mM PBS(pH7.4)

品名	原料要求	1L标准量
			Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·12H<sub>2</sub>O	国药	2.87g
NaH<sub>2</sub>PO4·2H<sub>2</sub>O	国药	0.31g
			NaCl	国药	9g
纯化水	自制，质检合格	1L

用电子天平称取上述试剂，倒入1L烧杯中，再加入适量纯化水，搅拌溶解，用2.5MNaOH调pH至7.4，定容至1L。

实施例2：检验报告，如下：

实施例3

(1)抗-hTERT单抗纳米粒子的制备：将抗-hTERT单抗原材料装入10kD透析袋，在超纯水中透析，并在2h，4h后换水，并透析过夜。收集透析袋中的抗体，冻干，-20℃保存。取3mg冻干抗体，溶于0.5mL的含0.2％Tween80的0.01NHCl中，在磁子搅拌下逐滴加入0.01NNaOH，直至出现的烟雾样沉淀至最大量。6500rpm离心5分钟，小心移除上清，得到抗-hTERT单抗纳米粒子。

(2)红细胞膜包裹的抗-hTERT单抗纳米粒子的制备：用2％戊巴比妥钠溶液完全麻醉SD大鼠后，剖开剑突及以上部位，暴露心脏后，从左心室进针，取用0.5％肝素钠荡洗过的注射器取血1mL，取血后转移至2m含肝素钠的EP管中。将全血放入4℃离心机中900g离心20min，弃去上层清液，留下暗红色沉淀，取沉淀3倍体积的1*PBS放入，并均匀吹散，放入4℃离心机离心2500g，15min，此为第一次洗涤。放入离心机离心2500g，15min，此为第二次洗涤。再次重复以上步骤，此为第三次洗涤。弃去上层清液，留下沉淀，取沉淀等量的1*PBS放入离心管中吹散，取950ul的0.2mMEDTA放入离心管混匀，待充分溶血后，加入50ul20*PBS，4℃离心机离心21000g，7min，此为第一次溶血洗涤。再次取950ul的0.2mMEDTA放入离心管混匀，待充分溶血后，加入50ul20*PBS，4℃离心机离心21000g，7min，此为第二次溶血洗涤。重复以上步骤，此为第三次溶血洗涤。弃去上层清液，留下沉淀于离心管中，加入950ul0.2mM的EDTA，充分混匀，4℃离心机离心21000g，7min。弃去上层清液，得到红细胞膜。

将红细胞膜与上述制备的抗-hTERT单抗纳米粒子混合，用1mL1*PBS重悬，超声下加入20*PBS使PBS终浓度至1*PBS，超声处理5min，既得红细胞膜包裹的抗-hTERT单克隆抗体纳米粒子。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110>江苏帆博生物制品有限公司

<120>一种新型红细胞膜单抗生产方法及其加工装置

<160> 4

<210> 1

<211> 442

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

Thr Thr Lys Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Val Gln Ser Ser Ile

Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Arg Val

Ser Ala Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Val Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu

Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Asn Val Glu

Val His Thr Ala Gln Asp Asp Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr

Leu Pro Ala Val Leu Gln Ser Gly Leu Asn Thr Leu Ser Ser Ser Leu

Thr Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys

Asp Asn Asn Lys Asp Leu Ala Ala Pro Ile Arg Arg Thr Ile Ser Lys

Ala Lys Gly Ser Val Cys Pro Arg Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Gly Pro Pro Lys Ile Lys Asn Val

Leu Met Ile Ser Lys Tyr Ala Tyr Thr Leu Tyr His Ser Thr Leu Arg

Ala Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln Ala Gln Asp Trp Met Pro Arg Ala

Pro Gln Val Tyr Val Thr Pro Pro Arg Glu Glu Glu Arg Thr Lys Lys

Gln Val Thr Arg Thr Cys Met Val Arg Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile

Tyr Val Ser Pro Ile Val Thr Tyr Val Val Val Asp Lys Ser Glu Asp

Asp Pro Asp Val Ser Phe Ser Arg Glu Val Trp Ile Glu Trp Val Lys

Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ser Ala Asn Ile Leu Pro Gly

Ser Gly Ser Pro Asn Tyr Gly Phe Pro Tyr Trp Glu Trp Thr Gly Gln

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Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe

Ser Ser Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Asp Thr Phe Thr Ala Asp

Gln Ile Ser Trp Phe Val Gly Lys Ile Glu Cys Ser Val Val His Glu

Gly Leu His Asn His His Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Lys Leu Leu Arg

Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Thr Ser Pro Ser Gln Ser Ile Thr Arg

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Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp

Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Arg Cys Leu Val Lys Gly Tyr Ser

Pro Glu Pro Val Thr Leu Pro Trp Asn Ser

<210> 2

<211> 1329

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

accaccaagaccagcagcaacaccgcctacatggtgcagagcagcatcaccagcgaggacagcgccgtgtactactgcgccagaagaggcagagtgagcgccgagagaaacagctacagcgtgaccaacaacggcaagaccgagctgaactacaagaacaccgagcccgtgctggacagcgacaacgtggaggtgcacaccgcccaggacgacggcagcctgagcagcggcgtgcacaccctgcccgccgtgctgcagagcggcctgaacaccctgagcagcagcctgacccccagaggccccaccatcaagcccggcaaggagttcaagtgcaaggacaacaacaaggacctggccgcccccatcagaagaaccatcagcaaggccaagggcagcgtgtgccccagatgcaagtgccccgcccccaacctgctgggcggccccagcgtgttcatcggcccccccaagatcaagaacgtgctgatgatcagcaagtacgcctacaccctgtaccacagcaccctgagagccgtgagcgccctgcccatccaggcccaggactggatgcccagagccccccaggtgtacgtgaccccccccagagaggaggagagaaccaagaagcaggtgaccagaacctgcatggtgagagacttcatgcccgaggacatctacgtgagccccatcgtgacctacgtggtggtggacaagagcgaggacgaccccgacgtgagcttcagcagagaggtgtggatcgagtgggtgaagcagagacccggccacggcctggagtggagcgccaacatcctgcccggcagcggcagccccaactacggcttcccctactgggagtggaccggccagggcaccctggtgacccagctgcagcagagcggcgccgagctgatgaagcccggcgccagcgtgaagatcagctgcaaggccaccggctacaccttcagcagctacaacgagaagttcaagggcaaggacaccttcaccgccgaccagatcagctggttcgtgggcaagatcgagtgcagcgtggtgcacgagggcctgcacaaccaccacggcagctacttcgtgtacaagctgctgagagtggagaagaagaactgggtgaccagccccagccagagcatcaccagaaacgtggccaaccccgccagcagccccaaggtggacaagagcagcgccaagaccaccgcccccagcgtgtaccccctggcccccgtgtgcggcgacaccaccggcagcagcgtgaccctgagatgcctggtgaagggctacagccccgagcccgtgaccctgccctggaacagctga

<210> 3

<211> 223

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400>3

Gly Gly Gly Thr Phe Asn Asp Arg Phe Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Gln

Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Phe Leu Asn Lys Asn Pro Trp Thr Asp Gln

Asp Ile Val Thr Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

Thr Ala Phe Thr Leu Thr Thr Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp

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Ser Asn Val Lys Cys Glu Ile Asp Gly Ser Glu Arg Leu His Lys Leu

Glu Ile Lys Arg Ala Asp Val Ala Pro Thr Ala Ser Ile Phe Pro Pro

Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Tyr Cys

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Glu Gly Ile Gln Asn Gly Val Leu His Ala Ser Gln Asn Ile Lys Val

Trp Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu

Ile Tyr Lys Thr Ser Asn Arg Asp Arg Ala Asp Leu Ile Gly His

<210> 4

<211> 672

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400>4

ggcggcggcaccttcaacgacagattcaaggacagcacctacagccagagctaccccttcaccttcttcctgaacaagaacccctggaccgaccaggacatcgtgaccggcgtgagcagcagattcagcggcagcggcagcggcaccgccttcaccctgaccaccagcagcaccctgaccctgaccaaggacgagtacgagagacacaacagctacaccaccgaggccacccacatcatcagcaacgtgaagtgcgagatcgacggcagcgagagactgcacaagctggagatcaagagagccgacgtggcccccaccgccagcatcttcccccccagcagcgagcagctgaccagcggcggcgccagcgtggtgtgctactgccagcagggcatgacccagacccccagcagcctgagcgccagcctgggcgacgtgctgagcaagagctgcgacagcaagagcaccagccccatcgtgagaagcatcagcagcctgcagggcgaggacatcgccacctacagaaacgagggcatccagaacggcgtgctgcacgccagccagaacatcaaggtgtggctgagctggtaccagcagaagcccggcaacatccccaagctgctgatctacaagaccagcaacagagacagagccgacctgatcggccactga

Claims (3)

1.一种新型红细胞膜单抗的生产方法，其特征在于，所述新型红细胞膜单抗的生产方法包括以下步骤：

步骤一，将冷冻的腹水在无菌环境下37℃温浴溶解，用脱脂纱布过滤，得到的液体中每毫升添加0.04ml 10％硫酸葡聚糖和1ml 1M氯化钙，搅拌15分钟，10000rPm离心10分钟后收集上清，得到样品；

步骤二，将筛板置于层析柱底部，排出柱底和管子内的气体后，填装ProteinA填料，使放柱和填装的速度一致；用纯化水洗涤5-10倍柱体积，利用淋洗装置进行淋洗以去除乙醇，进行柱准备；

步骤三，用平衡缓冲液10mM pH8.3的Tris-NaCl淋洗5-10倍柱体积，平衡至无蛋白流出，蛋白紫外检测仪显示值为0；步骤二中的Protein A长期不使用则柱内填充20％乙醇，4-8℃保存；

步骤四，在稀释装置内利用两倍体积pH8.3的平衡缓冲液Tris-NaCl进行稀释后，作为样品上样，调节生产控制系统的蠕动泵控制模块中的蠕动泵转速4滴/秒，使用蠕动泵在20-25℃条件下上样；将填料上方的平衡液排出，直至液面和上筛板相切时停止；

所述步骤四后，还需进行：

(1)加入10-15倍柱体积的洗杂缓冲液，开启蠕动泵进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液；

(2)平衡完成后使用高浓度的氯化钠进行解离，当蛋白紫外检测仪显示值大于0.3时开始收集蛋白，当蛋白紫外检测仪显示值小于0.3时停止收集蛋白；

(3)解离完成后用0.1M pH2.7的甘氨酸缓冲液进行再生2倍柱体积；再生完成后用平衡缓冲液10mM pH8.0的Tris-HCl平衡柱5-10倍柱体积；

(4)将得到的含蛋白组分的溶液置于1-3倍去离子水中，搅拌均匀后使用2-5KDa的透析膜、pH7-8的10-30mM磷酸盐缓冲溶液在4℃条件下进行透析处理48-72h；所述磷酸盐缓冲溶液的用量为 含蛋白溶液的10-20倍，换液3次，每次透析时间不低于4小时；

(5)透析完成后回收抗体并置于抗体孵育盒中进行孵育；孵育完成后用等电点沉淀制备抗体纳米粒子并用红细胞膜包裹抗体纳米粒子，用0.2μm滤膜过滤后添加0.09％NaN₃，置于4℃进行蛋白保存。

2.如权利要求1所述新型红细胞膜单抗的生产方法，其特征在于，步骤四中，(3)所述的解离方法为：首先往样品中添加高浓度的氯化钠，置于50～70℃作用5～20min，再添加解离剂对抗原抗体复合物进行解离；所述解离剂中含有5～6M的尿素、3.0～7.0％的Tween 80、0.5～3.0％的Triton X100；所述解离剂中尿素的含量为5.5M，所述Tween 80的含量为5％，所述Triton X100的含量为1.0％；所述高浓度的氯化钠浓度为1.5～3M。

3.如权利要求1所述新型红细胞膜单抗的生产方法，其特征在于，步骤四中，(5)所述抗体纳米粒子的制备方法包括以下步骤：

1)制备红细胞膜：将大鼠血转移至含肝素钠的EP管中；全血离心，弃去上层清液，留下暗红色沉淀，PBS洗涤，离心机离心，再洗涤数次；弃去上层清液，留下沉淀，取PBS吹散，取0.2mMEDTA放入离心管混匀，充分溶血后，加入20*PBS，离心，再溶血离心数次；弃去上层清液，沉淀物为红细胞膜；

2)等电点沉淀制备抗体纳米粒子：将抗体装入透析袋，在超纯水中透析，收集透析袋中的抗体，冻干，-20℃保存；取冻干抗体，溶于含Tween80的HCl溶液中，在磁子搅拌下逐滴加入NaOH溶液，直至烟雾样沉淀至最大量；离心，小心移除上清，得到抗体纳米粒子；所述Tween80浓度为0.01％-5％，HCl浓度为0.005M-0.5M，NaOH浓度为0.005M-0.5M；

3)制备红细胞膜包裹的抗体纳米粒子：将红细胞膜与抗体纳米粒子混合，加入1*PBS重悬，超声下加入20*PBS使PBS终浓度至1*PBS，既得红细胞膜包裹的抗体纳米粒子；所述红细胞膜包裹的抗体纳米粒子粒径为50nm-500nm。

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