CN109575135A - 红细胞膜单抗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出红细胞膜单抗,包括其可变区的氨基酸序列和核苷酸序列,其中,重链的3个互补决定区CDR序列分别为,CDR1:Gln‑Asp‑Asp‑Gly‑Ser‑Leu‑Ser‑Ser‑Gly,CDR2:Tyr‑Thr‑Phe‑Ser‑Ser‑Tyr,CDR3:Pro‑Leu‑Ala‑Pro‑Val‑Cys;轻链的3个互补决定区CDR序列分别为,CDR1:Tyr‑Ser‑Gln‑Ser‑Tyr,CDR2:Pro‑Ser‑Ser‑Leu‑Ser‑Ala,CDR3:Asn‑Ile‑Pro‑Lys‑Leu‑Leu‑Ile‑Tyr。灵敏度高,特异性高,结果容易判定。同时本发明还提出了红细胞膜单抗的制备方法。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域,尤其是一种红细胞膜单抗及其制备方法。
背景技术
抗体单体分子是由两条相同的重链(H链)和两条相同的轻链(L链),通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。H链和L链包括氨基(N)端和羧基(C)端,靠近N端的可变区(V区)由高变区/互补决定区(HVR/CDR)和骨架区(FR)组成;靠近C端为恒定区(C区)。重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)形成的蛋白质折叠是抗原结合部位,其中的CDR/HVR是抗体与抗原决定基互补结合的部位,C区引发抗原抗体识别后的反应。
单克隆抗体是通过将抗原注入到宿主动物体内启动机体免疫应答而产生的。继而大多数操作都是在体外将来自这些宿主的脾细胞与培养的恶性骨髓瘤细胞进行融合。将独特的细胞克隆分离出来,融合步骤中存活下来的细胞称为杂交瘤。杂交瘤因骨髓瘤特性而可以永生,且容易在培养物中繁殖。
发明内容
本发明所解决的技术问题在于提供一种红细胞膜单抗及其制备方法,包括其可变区的氨基酸序列和核苷酸序列,灵敏度高,特异性高,结果容易判定。
实现本发明目的的技术解决方案为:
红细胞膜单抗,包括重链和轻链,其中,重链的3个互补决定区CDR序列分别为,CDR1:Gln-Asp-Asp-Gly-Ser-Leu-Ser-Ser-Gly,CDR2:Tyr-Thr-Phe-Ser-Ser-Tyr,CDR3:Pro-Leu-Ala-Pro-Val-Cys;轻链的3个互补决定区CDR序列分别为,CDR1: Tyr-Ser-Gln-Ser-Tyr,CDR2:Pro-Ser-Ser-Leu-Ser-Ala,CDR3: Asn-Ile-Pro-Lys-Leu-Leu-Ile-Tyr。
进一步的,本发明的红细胞膜单抗,所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步的,本发明的红细胞膜单抗,所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步的,本发明的红细胞膜单抗,所述重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步的,本发明的红细胞膜单抗,所述轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提出红细胞膜单抗的制备方法,包括以下步骤:
步骤1:准备试剂:平衡缓冲液、解离缓冲液、再生缓冲液、透析缓冲液、pH中和液;准备设备:Protein A柱、低温高速离心机、天平、蠕动泵;
步骤2:冷冻的腹水在前一日10-15℃融化,用浸湿三蒸水的脱脂棉过滤去除油脂,过滤后的腹水4℃10000rPm离心30min收集上清;填装适量Protein A填料,用纯化水洗涤5-10倍柱体积,淋洗去除乙醇;
步骤3:进行平衡、上样、再平衡、解离、再生、再平衡、透析、回收,保存Protein A柱,清洗蠕动泵进样管;
步骤4:配置试剂:10mM Tris-NaCl、0.1M柠檬酸、0.1M甘氨酸缓冲液、20mM Tris-NaCl、2M Tris、透析缓冲液。
本发明采用以上技术方案与现有技术相比,具有以下技术效果:
本发明筛选出红细胞膜单抗,并获得其重链和轻链可变区,测序后得到其独特的核苷酸序列,灵敏度高,特异性高,结果容易判定。
附图说明
图1是本发明的亲和力数据结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施方式,所述实施方式的示例在附图中示出,其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施方式是示例性的,仅用于解释本发明,而不能解释为对本发明的限制。
实施例1
红细胞膜单抗,包括重链和轻链,其中,重链的3个互补决定区CDR序列分别为,CDR1:Gln-Asp-Asp-Gly-Ser-Leu-Ser-Ser-Gly,CDR2:Tyr-Thr-Phe-Ser-Ser-Tyr,CDR3:Pro-Leu-Ala-Pro-Val-Cys;轻链的3个互补决定区CDR序列分别为,CDR1: Tyr-Ser-Gln-Ser-Tyr,CDR2:Pro-Ser-Ser-Leu-Ser-Ala,CDR3: Asn-Ile-Pro-Lys-Leu-Leu-Ile-Tyr。
重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,轻链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO.2 所示。重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,轻链可变区核苷酸序列如SEQ IDNO.4 所示。
如图1所示,该单抗具备良好的亲和力,数据如下表所示:
Loading Sample ID | Response | KD(M) | kon(1/Ms) | kdis(1/s) |
本发明单抗 | 0.7359 | 1.08E-10 | 4.51E+05 | 4.87E-05 |
红细胞膜单抗的制备方法包括以下步骤:
步骤1:准备试剂:平衡缓冲液、解离缓冲液、再生缓冲液、透析缓冲液、pH中和液;准备设备:Protein A柱、低温高速离心机、天平、蠕动泵;
步骤2:冷冻的腹水在前一日10-15℃融化,用浸湿三蒸水的脱脂棉过滤去除油脂,过滤后的腹水4℃10000rPm离心30min收集上清;填装适量Protein A填料,用纯化水洗涤5-10倍柱体积,淋洗去除乙醇;
步骤3:进行平衡、上样、再平衡、解离、再生、再平衡、透析、回收,保存Protein A柱,清洗蠕动泵进样管;
步骤4:配置试剂:10mM Tris-NaCl、0.1M柠檬酸、0.1M甘氨酸缓冲液、20mM Tris-NaCl、2M Tris、透析缓冲液。
实施例2
红细胞膜单抗的制备方法如下:
1、准备:
1)试剂准备:
平衡缓冲液:10mM Tris-NaCl(pH8.3)
解离缓冲液:0.1M柠檬酸(pH4.0)
再生缓冲液:0.1M甘氨酸(pH2.7)
透析缓冲液:20mM Tris-NaCl(pH7.5)或10mM PBS(pH7.4)
pH中和液:2M Tris(pH8.0)
2)设备准备:Protein A柱、低温高速离心机、天平、蠕动泵。
2、操作步骤
1)样品准备:冷冻的腹水在前一日10-15℃融化,用浸湿三蒸水的脱脂棉过滤去除油脂,过滤后的腹水4℃10000rPm离心30min收集上清;
柱准备:填装适量Protein A填料,用纯化水洗涤5-10倍柱体积,淋洗去除乙醇。
2)平衡:Protein A柱用平衡缓冲液平衡5倍柱体积;
3)上样:腹水用两倍体积的平衡缓冲液10mM Tris-NaCl(pH8.3)稀释作为样品上样,使用蠕动泵在20-25℃条件下缓慢上样;
4)平衡:上样完成后再用平衡缓冲液10mM Tris-NaCl(pH8.3)淋洗5-10倍柱体积,平衡至无蛋白流出,即蛋白紫外检测仪显示值为0;
5)解离:平衡完成后使用0.1M柠檬酸(pH4.0)进行解离,当蛋白紫外检测仪显示值大于0.3时开始收集蛋白,当蛋白紫外检测仪显示值小于0.3时停止收集蛋白;
6)再生:解离完成后用0.1M甘氨酸(pH2.7)缓冲液进行再生约2倍柱体积;
7)平衡:再生完成后用平衡缓冲液10mM Tris-NaCl(pH8.3)平衡柱约5-10倍柱体积;
8)透析:合并含蛋白组分使用透析缓冲液20mM Tris-NaCl(pH7.5)或10mM PBS(pH7.4)进行透析,透析比例为1:50,换液3次,每次透析时间不低于4小时;
9)抗体处理:透析完成后回收抗体并用0.22μm滤膜过滤后添加0.09%NaN3保存蛋白。
3、Protein A柱保存:Protein A柱长期不使用则柱内填充20%乙醇,4-8℃保存。
4、蠕动泵进样管的清洗:同一蠕动泵处理其它样品时应使用该样品上样缓冲液冲洗5-10遍硅胶管再进行其它操作。
5、试剂配制
1)10mM Tris-NaCl(pH 8.3)
品名 | 原料来源 | 1L标准量 |
Tris | 北京益利 | 1.21g |
NaCl | 北京益利 | 11.688g |
纯化水 | 自制,质检合格 | 1L |
用电子天平称取上述试剂,倒入1L烧杯中,再加入适量纯化水,搅拌溶解,用浓盐酸调pH至8.3,定容至1L。
2)0.1M柠檬酸(pH4.0)
品名 | 原料来源 | 1L标准量 |
一水合柠檬酸 | 北京益利 | 13.76g |
二水合柠檬酸三钠 | 北京益利 | 10.15g |
纯化水 | 自制,质检合格 | 1L |
用电子天平称取上述试剂,倒入1L烧杯中,再加入适量纯化水,搅拌溶解,用2.5MNaOH调节PH至4.0,定容至1L。
3)0.1M甘氨酸缓冲液(pH2.7)
品名 | 原料来源 | 1L标准量 |
甘氨酸 | 北京益利 | 7.51g |
纯化水 | 自制,质检合格 | 1L |
用电子天平称取上述试剂,倒入1L烧杯中,再加入适量纯化水,搅拌溶解,用浓盐酸调pH至2.7,定容至1L。
4)20mM Tris-NaCl(pH7.5)
品名 | 原料来源 | 1L标准量 |
Tris | 北京益利 | 2.4218g |
NaCl | 北京益利 | 11.688g |
纯化水 | 自制,质检合格 | 1L |
用电子天平称取上述试剂,倒入1L烧杯中,再加入适量纯化水,搅拌溶解,用浓盐酸调pH至7.5,定容至1L。
5)2M Tris(pH8.0)
品名 | 原料来源 | 1L标准量 |
Tris | 北京益利 | 242.18g |
纯化水 | 自制,质检合格 | 1L |
用电子天平称取上述试剂,倒入1L烧杯中,再加入适量纯化水,搅拌溶解,用浓盐酸调pH至8.0,定容至1L。
6)透析缓冲液:10mM PBS(pH7.4)
用电子天平称取上述试剂,倒入1L烧杯中,再加入适量纯化水,搅拌溶解,用2.5MNaOH调pH至7.4,定容至1L。
保存条件:-20℃(避免反复冻融)
缓冲液:0.01M PBS(pH=7.4)
防腐剂:0.09%NaN3
检验依据:JDPJ-STP041-01
物理性状:澄清淡黄色液体、无絮状沉淀
蛋白纯度SDS-PAGE≥90.0%。
序列表
<110> 南京京达生物技术有限公司
<120> 红细胞膜单抗及其制备方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Thr Thr Lys Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Val Gln Ser Ser Ile
1 5 10 15
Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Arg Val
20 25 30
Ser Ala Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Val Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu
35 40 45
Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Asn Val Glu
50 55 60
Val His Thr Ala Gln Asp Asp Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr
65 70 75 80
Leu Pro Ala Val Leu Gln Ser Gly Leu Asn Thr Leu Ser Ser Ser Leu
85 90 95
Thr Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys
100 105 110
Asp Asn Asn Lys Asp Leu Ala Ala Pro Ile Arg Arg Thr Ile Ser Lys
115 120 125
Ala Lys Gly Ser Val Cys Pro Arg Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu
130 135 140
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Gly Pro Pro Lys Ile Lys Asn Val
145 150 155 160
Leu Met Ile Ser Lys Tyr Ala Tyr Thr Leu Tyr His Ser Thr Leu Arg
165 170 175
Ala Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln Ala Gln Asp Trp Met Pro Arg Ala
180 185 190
Pro Gln Val Tyr Val Thr Pro Pro Arg Glu Glu Glu Arg Thr Lys Lys
195 200 205
Gln Val Thr Arg Thr Cys Met Val Arg Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile
210 215 220
Tyr Val Ser Pro Ile Val Thr Tyr Val Val Val Asp Lys Ser Glu Asp
225 230 235 240
Asp Pro Asp Val Ser Phe Ser Arg Glu Val Trp Ile Glu Trp Val Lys
245 250 255
Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ser Ala Asn Ile Leu Pro Gly
260 265 270
Ser Gly Ser Pro Asn Tyr Gly Phe Pro Tyr Trp Glu Trp Thr Gly Gln
275 280 285
Gly Thr Leu Val Thr Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys
290 295 300
Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe
305 310 315 320
Ser Ser Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Asp Thr Phe Thr Ala Asp
325 330 335
Gln Ile Ser Trp Phe Val Gly Lys Ile Glu Cys Ser Val Val His Glu
340 345 350
Gly Leu His Asn His His Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Lys Leu Leu Arg
355 360 365
Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Thr Ser Pro Ser Gln Ser Ile Thr Arg
370 375 380
Asn Val Ala Asn Pro Ala Ser Ser Pro Lys Val Asp Lys Ser Ser Ala
385 390 395 400
Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp
405 410 415
Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Arg Cys Leu Val Lys Gly Tyr Ser
420 425 430
Pro Glu Pro Val Thr Leu Pro Trp Asn Ser
435 440
<210> 2
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gly Gly Gly Thr Phe Asn Asp Arg Phe Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Gln
1 5 10 15
Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Phe Leu Asn Lys Asn Pro Trp Thr Asp Gln
20 25 30
Asp Ile Val Thr Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
35 40 45
Thr Ala Phe Thr Leu Thr Thr Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp
50 55 60
Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Thr Glu Ala Thr His Ile Ile
65 70 75 80
Ser Asn Val Lys Cys Glu Ile Asp Gly Ser Glu Arg Leu His Lys Leu
85 90 95
Glu Ile Lys Arg Ala Asp Val Ala Pro Thr Ala Ser Ile Phe Pro Pro
100 105 110
Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Tyr Cys
115 120 125
Gln Gln Gly Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
130 135 140
Asp Val Leu Ser Lys Ser Cys Asp Ser Lys Ser Thr Ser Pro Ile Val
145 150 155 160
Arg Ser Ile Ser Ser Leu Gln Gly Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Arg Asn
165 170 175
Glu Gly Ile Gln Asn Gly Val Leu His Ala Ser Gln Asn Ile Lys Val
180 185 190
Trp Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu
195 200 205
Ile Tyr Lys Thr Ser Asn Arg Asp Arg Ala Asp Leu Ile Gly His
210 215 220
<210> 3
<211> 1329
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
accaccaaga ccagcagcaa caccgcctac atggtgcaga gcagcatcac cagcgaggac 60
agcgccgtgt actactgcgc cagaagaggc agagtgagcg ccgagagaaa cagctacagc 120
gtgaccaaca acggcaagac cgagctgaac tacaagaaca ccgagcccgt gctggacagc 180
gacaacgtgg aggtgcacac cgcccaggac gacggcagcc tgagcagcgg cgtgcacacc 240
ctgcccgccg tgctgcagag cggcctgaac accctgagca gcagcctgac ccccagaggc 300
cccaccatca agcccggcaa ggagttcaag tgcaaggaca acaacaagga cctggccgcc 360
cccatcagaa gaaccatcag caaggccaag ggcagcgtgt gccccagatg caagtgcccc 420
gcccccaacc tgctgggcgg ccccagcgtg ttcatcggcc cccccaagat caagaacgtg 480
ctgatgatca gcaagtacgc ctacaccctg taccacagca ccctgagagc cgtgagcgcc 540
ctgcccatcc aggcccagga ctggatgccc agagcccccc aggtgtacgt gacccccccc 600
agagaggagg agagaaccaa gaagcaggtg accagaacct gcatggtgag agacttcatg 660
cccgaggaca tctacgtgag ccccatcgtg acctacgtgg tggtggacaa gagcgaggac 720
gaccccgacg tgagcttcag cagagaggtg tggatcgagt gggtgaagca gagacccggc 780
cacggcctgg agtggagcgc caacatcctg cccggcagcg gcagccccaa ctacggcttc 840
ccctactggg agtggaccgg ccagggcacc ctggtgaccc agctgcagca gagcggcgcc 900
gagctgatga agcccggcgc cagcgtgaag atcagctgca aggccaccgg ctacaccttc 960
agcagctaca acgagaagtt caagggcaag gacaccttca ccgccgacca gatcagctgg 1020
ttcgtgggca agatcgagtg cagcgtggtg cacgagggcc tgcacaacca ccacggcagc 1080
tacttcgtgt acaagctgct gagagtggag aagaagaact gggtgaccag ccccagccag 1140
agcatcacca gaaacgtggc caaccccgcc agcagcccca aggtggacaa gagcagcgcc 1200
aagaccaccg cccccagcgt gtaccccctg gcccccgtgt gcggcgacac caccggcagc 1260
agcgtgaccc tgagatgcct ggtgaagggc tacagccccg agcccgtgac cctgccctgg 1320
aacagctga 1329
<210> 4
<211> 672
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggcggcggca ccttcaacga cagattcaag gacagcacct acagccagag ctaccccttc 60
accttcttcc tgaacaagaa cccctggacc gaccaggaca tcgtgaccgg cgtgagcagc 120
agattcagcg gcagcggcag cggcaccgcc ttcaccctga ccaccagcag caccctgacc 180
ctgaccaagg acgagtacga gagacacaac agctacacca ccgaggccac ccacatcatc 240
agcaacgtga agtgcgagat cgacggcagc gagagactgc acaagctgga gatcaagaga 300
gccgacgtgg cccccaccgc cagcatcttc ccccccagca gcgagcagct gaccagcggc 360
ggcgccagcg tggtgtgcta ctgccagcag ggcatgaccc agacccccag cagcctgagc 420
gccagcctgg gcgacgtgct gagcaagagc tgcgacagca agagcaccag ccccatcgtg 480
agaagcatca gcagcctgca gggcgaggac atcgccacct acagaaacga gggcatccag 540
aacggcgtgc tgcacgccag ccagaacatc aaggtgtggc tgagctggta ccagcagaag 600
cccggcaaca tccccaagct gctgatctac aagaccagca acagagacag agccgacctg 660
atcggccact ga 672
Claims (6)
1.红细胞膜单抗,其特征在于,包括重链和轻链,其中,重链的3个互补决定区CDR序列分别为,CDR1:Gln-Asp-Asp-Gly-Ser-Leu-Ser-Ser-Gly,CDR2:Tyr-Thr-Phe-Ser-Ser-Tyr,CDR3:Pro-Leu-Ala-Pro-Val-Cys;轻链的3个互补决定区CDR序列分别为,CDR1:Tyr-Ser-Gln-Ser-Tyr,CDR2:Pro-Ser-Ser-Leu-Ser-Ala,CDR3:Asn-Ile-Pro-Lys-Leu-Leu-Ile-Tyr。
2.根据权利要求1所述的红细胞膜单抗,其特征在于,所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的红细胞膜单抗,其特征在于,所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1所述的红细胞膜单抗,其特征在于,所述重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
5.根据权利要求1所述的红细胞膜单抗,其特征在于,所述轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
6.红细胞膜单抗的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1:准备试剂:平衡缓冲液、解离缓冲液、再生缓冲液、透析缓冲液、pH中和液;准备设备:Protein A柱、低温高速离心机、天平、蠕动泵;
步骤2:冷冻的腹水在前一日10-15℃融化,用浸湿三蒸水的脱脂棉过滤去除油脂,过滤后的腹水4℃10000rPm离心30min收集上清;填装适量Protein A填料,用纯化水洗涤5-10倍柱体积,淋洗去除乙醇;
步骤3:进行平衡、上样、再平衡、解离、再生、再平衡、透析、回收,保存Protein A柱,清洗蠕动泵进样管;
步骤4:配制试剂:10mM Tris-NaCl、0.1M柠檬酸、0.1M甘氨酸缓冲液、20mM Tris-NaCl、2M Tris、透析缓冲液。
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2018
- 2018-11-08 CN CN201811323290.8A patent/CN109575135A/zh not_active Withdrawn
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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