CN113444142A - 精氨酸在疏水性蛋白离子交换层析纯化中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种精氨酸在疏水性蛋白离子交换层析纯化中的应用。本发明提供了一种提高疏水性蛋白在离子交换层析中收率的方法，其特征在于：在上样样品液中添加精氨酸。通过试验证实：在上样样品液中添加精氨酸可显著提高强疏水性蛋白的收率和HCP的去除能力，其效果优于其它提高蛋白电导率的试剂、降低蛋白疏水性的试剂或其组合的效果。本发明进一步验证在上样样品液中添加30mM～100mM的Arg能够有效提高强疏水性蛋白的收率。本发明提供的方法可以应用于不同种类填料的阴离子交换层析柱中，且均能够有效提高强疏水性蛋白的收率。本发明提供的方法操作简单、成本低廉，并且不会对疏水性蛋白的进一步纯化产生不利影响。

Description

精氨酸在疏水性蛋白离子交换层析纯化中的应用
技术领域
本发明涉及蛋白质纯化领域。特别的，本发明涉及利用精氨酸在疏水性蛋白离子交换层析纯化中的应用。
背景技术
离子交换层析是根据蛋白质与填料之间可逆地电荷相互作用而进行分离的一种层析技术。蛋白质的带电性取决于溶液的pH。蛋白质是两性电解质，一般，当溶液pH高于蛋白质的等电点(pI)时，溶液中多数蛋白质会解离出氢离子，因此蛋白质会带负电荷，并结合到带正电荷的阴离子交换填料上或不结合到带负电荷的阳离子交换填料上。当溶液pH低于蛋白质的等电点(pI)时，蛋白质带正电，并结合到带负电的阳离子交换填料上或不结合到带正电荷的阴离子交换填料上。
在阴离子层析纯化蛋白的工艺中，阴离子交换层析溶液的pH小于蛋白质的等电点，蛋白质带正电，理论上和带正电荷的阴离子交换填料不结合。类似的，在阳离子层析纯化蛋白的工艺中，如若阳离子交换层析溶液的pH高于蛋白质的等电点，蛋白质带负电，理论上和带负电荷的阳离子交换填料不结合。但是在实际生产中本发明人发现一些疏水性蛋白会结合在阴离子/阳离子交换填料中，从而使疏水性蛋白的收率降低。通过实验本发明人进一步确定，这种与阴离子/阳离子交换填料结合的现象不仅仅是因为蛋白质本身的带电性或者蛋白质在纯化过程中发生聚集等某一方面的原因。
精氨酸(arginine，Arg)能有效抑制蛋白质的聚集，经常应用于蛋白质的纯化过程中，其能够防止非特异性蛋白同层析填料之间的结合或蛋白在纯化过程中发生的聚集。但是在使用阴离子交换填料或阳离子交换填料对疏水性蛋白进行纯化时，尚未见精氨酸的应用。
发明内容
发明要解决的问题
针对现有技术对疏水性蛋白(特别是抗体)进行离子交换层析纯化时，疏水性蛋白收率较低以及层析纯化后宿主细胞蛋白(HCP)残留量较高的缺陷。本发明提供了一种精氨酸在疏水性蛋白离子层析纯化中的应用，通过所述纯化技术，显著提高了离子层析纯化中疏水性蛋白的收率，同时降低了层析纯化后HCP的残留量。
用于解决问题的方案
本发明在第一方面提供了一种提高疏水性蛋白在离子交换层析中收率的方法，其特征在于：在上样样品液中添加精氨酸。
在该方法中，所述精氨酸在上样样品液中的终浓度为30mM～100mM；在一些实施例中，上样样品液中精氨酸的终浓度可以为35mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM。
在一个具体的实施方案中，该方法中所述离子交换层析为阴离子交换层析，且在所述阴离子交换层析中使用的缓冲溶液的pH小于所述疏水性蛋白的等电点(pI)；优选的，所述缓冲溶液的pH小于所述疏水性蛋白的pI 1至4个pH单位；更优选的，所述缓冲溶液的pH小于所述疏水性蛋白的pI 1至3个pH单位；最优选的，所述缓冲溶液的pH小于所述疏水性蛋白的pI 1至2个pH单位。
在另一个具体的实施方案中，该方法中所述离子交换层析为阳离子交换层析，且在所述阳离子交换层析中使用的缓冲溶液的pH大于所述疏水性蛋白的等电点(pI)；优选的，所述缓冲溶液的pH大于所述疏水性蛋白的pI 1至4个pH单位；更优选的，所述缓冲溶液的pH大于所述疏水性蛋白的pI 1至3个pH单位；最优选的，所述缓冲溶液的pH大于所述疏水性蛋白的pI 1至2个pH单位。
根据上面所述的方法，其中所述疏水性蛋白为抗体；优选的，所述疏水性蛋白为单特异性抗体或双特异性抗体；优选的，所述疏水性蛋白为强疏水性蛋白。
在具体的实施方案中，该方法中所述单特异性抗体为包含氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示的重链VH CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的重链VH CDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的重链VH CDR3、氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的轻链VL CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的轻链VL CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示的轻链VL CDR3的单特异性抗体；
所述双特异性抗体包含以下结构组成：VH-CH1-CH2-CH3-接头-VHH的多肽链，和VL-CL的多肽链，其中VH表示重链可变区，CH表示重链恒定区，CH1、CH2、CH3分别表示重链恒定区的结构域1、2和3，VHH表示单结构域抗原结合位点，VL表示轻链可变区，CL表示轻链恒定区；进一步的，所述双特异性抗体为包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO：20～22所示的VHHCDR1～VHH CDR3、氨基酸序列分别如SEQ ID NO：23～25所示的VH的HCDR1～VH的HCDR3、和氨基酸序列分别如SEQ ID NO：26～28所示的VL LCDR1～VL的LCDR3的双特异性抗体。
在另外的实施方案中，其中所述单特异性抗体的重链包含氨基酸序列如SEQ IDNO：9所示的序列或者包含与该序列具有至少90％同一性的序列，并且所述单特异性抗体的轻链包含氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示的序列或者包含与该序列具有至少90％同一性的序列；所述双特异性抗体中的VH-CH1-CH2-CH3-接头-VHH的氨基酸序列为SEQ ID NO：11所示的序列或者为与该序列具有至少90％同一性的序列，并且所述双特异性抗体中的VL-CL的氨基酸序列为SEQ ID NO：17所示的序列或者为与该序列具有至少90％同一性的序列。
本发明的第二方面提供了一种降低利用离子交换层析纯化疏水性蛋白的样品收集液中宿主细胞蛋白(HCP)残留量的方法，其特征在于，在上样样品液中添加精氨酸。
在该方法中，所述精氨酸在上样样品液中的终浓度为30mM～100mM；在一些实施例中，上样样品液中精氨酸的终浓度可以为35mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM。
在一个具体的实施方案中，该方法中所述离子交换层析为阴离子交换层析，且在阴离子交换层析中使用的缓冲溶液的pH小于所述疏水性蛋白的等电点(pI)；优选的，所述缓冲溶液的pH小于所述疏水性蛋白的pI 1至4个pH单位；更有优选的，所述缓冲溶液的pH小于所述疏水性蛋白的pI 1至3个pH单位；最优选的，所述缓冲溶液的pH小于所述疏水性蛋白的pI 1至2个pH单位；并且，
其中所述疏水性蛋白为抗体；优选的，所述疏水性蛋白为单特异性抗体或双特异性抗体；更优选的，所述单特异性抗体为包含氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的重链VHCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的重链VH CDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的重链VH CDR3、氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的轻链VL CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的轻链VL CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示的轻链VL CDR3的单特异性抗体；所述双特异性抗体为包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO：20～22所示的VHH CDR1～VHH CDR3、氨基酸序列分别如SEQ ID NO：23～25所示的VH的HCDR1～VH的HCDR3、和氨基酸序列分别如SEQ ID NO：26～28所示的VL LCDR1～VL的LCDR3的双特异性抗体。
在另一个具体的实施方案中，该方法中所述离子交换层析为阳离子交换层析，且在阳离子交换层析中使用的缓冲溶液的pH大于所述疏水性蛋白的等电点(pI)；优选的，所述缓冲溶液的pH大于所述疏水性蛋白的pI 1至4个pH单位；更有优选的，所述缓冲溶液的pH大于所述疏水性蛋白的pI 1至3个pH单位；最优选的，所述缓冲溶液的pH大于所述疏水性蛋白的pI 1至2个pH单位；并且，
其中所述疏水性蛋白为抗体；优选的，所述疏水性蛋白为单特异性抗体或双特异性抗体；更优选的，所述单特异性抗体为包含氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的重链VHCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的重链VH CDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的重链VH CDR3、氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的轻链VL CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的轻链VL CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示的轻链VL CDR3的单特异性抗体；所述双特异性抗体为包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO：20～22所示的VHH CDR1～VHH CDR3、氨基酸序列分别如SEQ ID NO：23～25所示的VH的HCDR1～VH的HCDR3、和氨基酸序列分别如SEQ ID NO：26～28所示的VL LCDR1～VL的LCDR3的双特异性抗体。
在本发明的第二方面中，其中所述单特异性抗体的重链包含氨基酸序列如SEQ IDNO：9所示的序列或者包含与该序列具有至少90％同一性的序列，并且所述单特异性抗体的轻链包含氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示的序列或者包含与该序列具有至少90％同一性的序列；所述双特异性抗体中的VH-CH1-CH2-CH3-接头-VHH的氨基酸序列为SEQ ID NO：11所示的序列或者为与该序列具有至少90％同一性的序列，并且所述双特异性抗体中的VL-CL的氨基酸序列为SEQ ID NO：17所示的序列或者为与该序列具有至少90％同一性的序列
发明的效果
(1)阴离子交换层析中在上样样品液中添加精氨酸可显著提高疏水性蛋白的收率和对杂质(例如HCP)的去除能力，其效果优于其它提高蛋白电导率的试剂(例如NaCl)、降低蛋白疏水性的试剂(例如Triton或Tween80等表面活性剂)或其组合的效果。
(2)在上样样品液中添加30mM～100mM的Arg能够有效提高疏水性蛋白的收率。
(3)本发明提供的方法可以应用于不同种类填料的阴离子交换层析柱中，且均能够有效提高疏水性蛋白的收率；与此同时，还可以提高阴离子交换层析柱去除HCP的能力。
(4)本发明提供的方法操作简单、成本低廉，并且不会对疏水性蛋白的进一步纯化产生不利影响。
为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂，下面特举较佳实施例，并配合说明书附图，作详细说明如下：
附图说明
附图1为双特异性抗体B的结构示意图，其中抗原A为LAG-3，抗原B为PD-L1。
附图2示出了市售药物Adalimumab、Ipilimumab、单抗A、双抗B以及其他蛋白分子在相同色谱条件下的洗脱出峰时间。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将结合附图对本发明的实施例进行详细说明，附图中给出了本发明的较佳实施例，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施，并不限于本文所描述的实施例。
若未特别指明，实施例中所有的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
定义：
本发明中所称的“疏水性蛋白”并不做特别的限制，并且包括任何可以通过使用本发明的离子交换层析方法从细胞中进行提纯的疏水性蛋白质。另外，所述“疏水性蛋白”并不涉及特定的疏水性数值或范围，而是指如下任何疏水性，即通过与细胞结构结合、或者自缔合作用而赋予靶蛋白质在水溶液中的不溶解性，并且允许通过本发明的离子交换层析方法对所述蛋白质进行纯化。
本发明中所称的强疏水性蛋白，是指在试验材料和试验方法部分第1.3节中所记载的HIC-HPLC的色谱条件下，其出峰时间不早于同条件下Ipilimumab出峰时间，优选出峰时间不早于同条件下单抗A或双抗B的出峰时间的蛋白。
“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”是抗体可变结构域中在序列上高变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。重链和轻链的CDR通常被称作CDR1、CDR2和CDR3，从N-端开始顺序编号。位于抗体重链可变结构域内的CDR被称作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位于抗体轻链可变结构域内的CDR被称作LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一个给定的轻链可变区或重链可变区氨基酸序列中，各CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多公知的抗体CDR指派系统的任一种或其组合确定，所述指派系统包括例如：基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature 342:877-883，Al-Lazikani等人,“Standard conformations for thecanonical structures of immunoglobulins”,Journal of Molecular Biology,273,927-948(1997))，基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第4版,U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)),AbM(University of Bath)，Contact(University College London)，国际ImMunoGeneTics database(IMGT)(在万维网上imgt.cines.fr/上)，以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinity propagationclustering)的North CDR定义。
例如，根据不同的CDR确定方案，每一个CDR的残基如下所述。
Figure BDA0002994543820000071
CDR也可以基于与参考CDR序列(例如本发明示例性CDR之任一)具有相同的Kabat编号位置而确定。
除非另有说明，否则在本发明中，术语“CDR”或“CDR序列”涵盖以上述任一种方式确定的CDR序列。
除非另有说明，否则在本发明中，当提及抗体可变区中的残基位置(包括重链可变区残基和轻链可变区残基)时，是指根据Kabat编号系统(Kabat等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1991))的编号位置。
在一个实施方案中，本发明抗体的CDR通过Kabat规则确定边界，通过IMGT确定规则，或通过AbM确定规则，或通过其任何组合确定规则。
在本发明的一个实施方案中，本发明单抗A分子中的VH的HCDR1是通过结合Kabat、AbM、Chothia及经验性等综合因素确定边界，在kabat编号系统中位置为H27-H35B，VH的HCDR2是通过Kabat规则确定，VH的HCDR3是通过IMGT规则确定，VL的LCDR是通过Kabat规则确定。
在本发明的一个实施方案中，本发明双抗B分子中的VH的HCDR1是通过结合Kabat、AbM、Chothia及经验性等综合因素确定边界，在kabat编号系统中位置为H27-H35B，VH的HCDR2是通过Kabat规则确定，VH的HCDR3是通过IMGT规则确定，VL的LCDR是通过Kabat规则确定。在本发明的一个实施方案中，本发明双抗B中的VHH的HCDR1是通过AbM规则确定，HCDR2和HCDR3是通过Kabat规则确定。
试验材料和试验方法：
1，试验材料
1.1单特异性抗体A(下文简称为单抗A)
单特异性抗体A为在中国申请CN201811561512.X中公开的重组全人源抗淋巴细胞活化基因3(LAG-3)单特异性抗体。为了本发明的目的，该中国申请的全部内容特此并入本文作为参考。
所述单抗A的抗体亚型为IgG4，其等电点为6.7，分子量为147kDa。
在一个实施方案中，单抗A包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的序列或与其具有至少90％同一性的序列，且轻链可变区包含氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的序列或与其具有至少90％同一性的序列。
在一个实施方案中，所述单抗A包含：氨基酸序列如GSIYSESYYWG(SEQ ID NO:1)所示的重链VH CDR1；氨基酸序列如SIVYSGYTYYNPSLKS(SEQ ID NO:2)所示的重链VH CDR2；氨基酸序列如ARVRTWDAAFDI(SEQ ID NO:3)所示的重链VH CDR3；氨基酸序列如QASQDISNYLN(SEQ ID NO:4)所示的轻链VL CDR1；氨基酸序列如DASNLET(SEQ ID NO:5)所示的轻链VLCDR2；和氨基酸序列如QQVLELPPWT(SEQ ID NO:6)所示的轻链VL CDR3。
在一个实施方案中，所述单抗A是包含重链和轻链的IgG4抗体，其中所述重链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的序列或与其具有至少90％同一性的序列，且其中所述轻链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的序列或与其具有至少90％同一性的序列。
优选地，所述单抗A是中国申请CN201811561512.X中公开的抗LAG-3抗体ADI-31853，该抗体由氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示的重链序列和氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的轻链序列组成。
在一个实施方案中，所述抗LAG-3抗体ADI-31853是在293细胞或CHO细胞中重组表达的抗LAG-3抗体。
1.2抗体B(又称为双特异性抗体B，简称为双抗B)
双抗B为PCT/CN2020/073964中公开的同时结合PD-L1和LAG-3的双特异性抗体。为了本申请的目的，该PCT申请的全部内容特此并入本文作为参考。
所述双抗B的抗体亚型为IgG1，其等电点为8.0，分子量为174kDa。
所述双抗B为如图1所示结构的抗LAG-3/PD-L1双特异性抗体，其中抗原A为LAG-3，抗原B为PD-L1。
其中，所述双抗B中的具体序列如下所示：
图1中VH-CH1-CH2-CH3-接头-VHH(即IGN-LP肽链#1)的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示；图1中抗LAG-3抗体ADI-31853的VH的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示；图1中CH1的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示；图1中Fc(即CH2-CH3)的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示；图1中接头的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示；图1中抗PD-L1单结构域抗体的VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示；图1中VL-CL(即IGN-LP肽链#2)的氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示；图1中抗LAG-3抗体ADI-31853的VL的氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示；图1中CL的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示。
进一步的，在所述双抗B中包含的抗PD-L1单结构域抗体的CDR1～CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：20～22所示；在所述双抗B中包含的抗LAG-3抗体ADI-31853的HCDR1～HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：23～25所示；在所述双抗B中包含的抗LAG-3抗体ADI-31853的LCDR1～LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：26～28所示；抗LAG-3抗体重链(即VH-CH1-CH2-CH3)的氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示。
在一个实施方案中，所述双抗B是在293细胞或CHO细胞中重组表达的抗LAG-3/PD-L1双特异性抗体。
1.3单抗A和双抗B的疏水性验证
设置如下的色谱条件：
采用HIC-HPLC法检测蛋白样品的疏水性。使用Waters e 2695或安捷伦1260高效液相色谱仪进行分析。分别选取疏水性不同的抗体与待检测样品疏水性进行保留时间对比，保留时间越久，蛋白疏水性越强。
色谱分析条件：采用MabPacTM HIC-10LC色谱柱(厂家：Thermo，货号088480)；流动相A：1.8mol/L硫酸铵，100mmol/L NaH2PO4·2H2O，pH 6.5，流动相B：90％体积分数的100mmol/L NaH2PO4·2H2O(pH 6.5)溶液与10％异丙醇的混合溶液；流速：1.0ml/min；洗脱程序：0至20min内，100％A→0％A；20至25min内，100％B；25至30min内，100％A；采集时间：30min；进样量：10～20μl；柱温：25℃；检测波长：280nm。
图2中示例性给出市售药物Adalimumab(阿达木单抗，英文商品名：Humira)、Ipilimumab(伊匹单抗，英文商品名：Yervoy)、单抗A、双抗B以及其他蛋白分子在同色谱条件下的洗脱出峰时间。其中，Ipilimumab是现有技术中已知的具有强疏水性质的蛋白，例如在文献(Tushar Jain等人,PNAS,114(5),944-949,2017)中测定了137个已上市或处于晚期临床阶段的蛋白分子，Ipilimumab在文献洗脱条件下HIC(hydrophobic interactionchromatography)保留时间为11.6min，达到了文献认为的HIC保留时间＞11.7±0.6min的疏水性阈值(Worst 10％threshold)。而单抗A和双抗B在本实验条件下出峰时间晚于Ipilimumab，也晚于其他所有示例性蛋白分子出峰时间，可见单抗A和双抗B均具有较强的疏水性。
1.4试验试剂
本发明中实施例中所用试剂的商购信息如表1中所示
表1试验试剂的商购信息
试剂名称 级别 产地及品牌 试剂名称 级别 产地及品牌
Arg-HCl 药用级 上海味之素 氢氧化钠 药用级 四川金山
醋酸 药用级 台山新宁 Tris 药用级 美国Angus chemical
醋酸钠 药用级 台山新宁 Tris-HCl 药用级 美国Angus chemical
氯化钠 药用级 江苏勤奋
2，阴离子交换层析
2.1阴离子填料与层析柱
层析柱：Millipore VL11；
填料：GE Q Sepharose Fast Flow柱体积9.75ml，柱高9.2cm；或者Gibco POROSHQ柱体积8.48ml，柱高8.0cm；
2.2样品处理
具体参见各实施例中的详细描述。
2.3工艺步骤
在使用前安装好层析柱，按照预平衡、平衡、上样、再平衡、再生、在线/原位清洁(CIP)步骤进行阴离子交换层析。本发明针对单抗A的具体工艺及参数见下表2：
表2单抗A阴离子交换层析工艺流程表
Figure BDA0002994543820000121
本发明针对双抗B的具体工艺及参数见下表3：
表3双抗B阴离子交换层析工艺流程表
Figure BDA0002994543820000131
3.宿主细胞蛋白(HCP)残留量和疏水性蛋白收率的检测
根据ELISA原理，使用商业化CHO HCP残留ELISA检测试剂盒(Cygnus，货号F550)检测样品中宿主细胞蛋白(HCP)的残留量，检测中使用的相关试剂和设备的相关信息如表4所示：
表4：试剂和设备相关信息
名称 厂家 货号
样品稀释液 Cygnus I028
酶标仪 Thermo Scientific MULTISKAN FC
微孔板振荡器 ORBITAL SHAKER MX100-4A
3.1准备工作
材料准备：取出4℃保存的CHO HCP残留ELISA检测试剂盒，根据实际需要，取出适量板条(Anti-CHO coated Microtiter strips，F550)平衡至室温。
洗液准备：根据实验需要，取适量4℃保存的浓缩液(Wash Buffer Concentrate，20×)，用纯化水20倍稀释后使用，临用新配。
3.2质控品配置和质控品回收率计算
取45μl原始浓度为100ng/ml的标准品，加入到105μl样品稀释液中，得到浓度为30ng/ml的质控品。将质控品作为对照，与各个实施例的试验样品同时进行阴离子层析纯化。
质控品回收率＝质控品检出值/标准品的理论值×100％
3.3样品处理
第一步稀释：取样品10μL，采用190μL样品稀释液稀释20倍
第二步稀释：取第一步稀释后样品20μL，采用180μL样品稀释液稀释，最终稀释倍数200倍。
3.4.上样液或收集液中HCP残留量的测定
3.4.1在准备好的96孔板条中加入100μL/孔Anti-CHO：HRP(F551)。
3.4.2上样；按一定顺序分别加入标准品、样品，50μL/孔，设置一个平行孔，封板，微孔板振荡器，500rpm，室温(25℃±3℃)震荡2h。
3.4.3洗板：弃去孔内液体，用多通道移液枪加洗液300μL/孔，静止5s立即甩尽液体，在吸水纸上拍干，重复4次。最后一次，应尽量拍净孔内残留洗液，但要保证孔湿润。
3.4.4 100μL/孔加入TMB试剂，室温静置避光30min后，立即加100μL/孔的终止液(stop solution)。
3.4.5采用MULTISKAN FC酶标仪自带软件，以620nm为参比波长测定在450nm处的吸光值，用0ng/ml标准品孔调零。
3.4.6数据处理
SkanIt Software3.1分析软件进行数据分析，以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，作四参数拟合曲线。得出线性方程与R2。此时将样品读出的OD值代入方程中，即可得到样品检出HCP含量(ng/ml)。
3.4.7系统适应性成立
判断标准：R2≥0.99，质控品回收率在70～130％之间。
3.4.8样品(上样液或收集液)中HCP残留量的计算：
上样液或收集液中HCP残留量(ng/mg)＝样品检出HCP含量均值(ng/ml)/样品检测蛋白浓度(mg/ml)。
3.5上样前后蛋白含量的检测
蛋白浓度的检测方法如下：使用微量分光光度计(Thremo Scientific NanoDrop2000)进行检测。
采用A280测试程序，2μL超纯水作为空白对照。在检测波长为280nm的条件下，单抗A标准品的消光系数：1.58(mg/ml)-1·cm-1，双抗B标准品的消光系数：1.58(mg/ml)-1·cm-1。
3.6疏水性蛋白收率测定
疏水性蛋白收率＝(收集液蛋白浓度×收集液体积)/(上样液蛋白浓度×上样液体积)×100％。
4.电导率测定
选择用美国梅特勒的S230电导率仪测定本发明实施例中溶液的电导率。
实施例1：阴离子交换层析纯化单抗A
使用Millipore VL11层析柱(柱体积9.75ml，柱高9.2cm)、GE Q Sepharose FastFlow填料，按照本发明试验材料和试验方法部分第2.3节表2中所示条件的工艺流程，在100mM HAc-NaAc缓冲液体系中，对未做任何处理的由CHO细胞重组表达的单抗A蛋白溶液，进行阴离子交换层析纯化。测定电导率为6.54。
按照本发明试验材料和试验方法部分第3节所示的步骤和方法，计算经过阴离子交换层析纯化后的单抗A的收率并检测上样液和收集液中的HCP残留量。
实施例2：添加表面活性剂Triton对于阴离子交换层析纯化单抗A的影响
配制浓度为20％的Triton溶液(100mM HAc-NaAc pH＝6.0)，将其加入到由CHO细胞重组表达的单抗A蛋白溶液中。混合均匀，使样品溶液中Triton的终浓度为2％，测定电导率为5.40。
在此基础上，按照实施例1同样的方法进行阴离子交换层析纯化，计算经过阴离子交换层析纯化后的单抗A的收率并检测上样液和收集液中的HCP残留量。
实施例3：添加表面活性剂Tween80对于阴离子交换层析纯化单抗A的影响
配制浓度为10％的Tween80溶液(100mM HAc-NaAc pH＝6.0)，将其加入到由CHO细胞重组表达的单抗A蛋白溶液中。混合均匀，使样品溶液中Tween80的终浓度为1％，测定电导率为5.85。
在此基础上，按照实施例1同样的方法进行阴离子交换层析纯化，计算经过阴离子交换层析纯化后的单抗A的收率并检测上样液和收集液中的HCP残留量。
实施例4：添加NaCl对于阴离子交换层析纯化单抗A的影响
配制浓度为500mM的NaCl溶液(100mM HAc-NaAc pH＝6.0)，将其加入到由CHO细胞重组表达的单抗A蛋白溶液中。混合均匀，使样品溶液中NaCl的终浓度为45mM，测定电导率为10.06。
在此基础上，按照实施例1同样的方法进行阴离子交换层析纯化，计算经过阴离子交换层析纯化后的单抗A的收率并检测检测上样液和收集液中的HCP残留量。
实施例5：同时添加NaCl和表面活性剂Triton对于阴离子交换层析纯化单抗A的影响
配制浓度为500mM的NaCl溶液(100mM HAc-NaAc pH＝6.0)，将其加入到由CHO细胞重组表达的单抗A蛋白溶液中。混合均匀，使样品溶液中NaCl的终浓度为45mM。然后，配制浓度为20％的Triton溶液(100mM HAc-NaAc pH＝6.0)，将其加入到上述混合溶液中，再次混合均匀，使样品溶液中Triton的终浓度为2％，测定电导率为9.27。
在此基础上，按照实施例1同样的方法进行阴离子交换层析纯化，计算经过阴离子交换层析纯化后的单抗A的收率并检测上样液和收集液中的HCP残留量。
实施例6：同时添加NaCl和表面活性剂Tween80对于阴离子交换层析纯化单抗A的影响
配制浓度为500mM的NaCl溶液(100mM HAc-NaAc pH＝6.0)，将其加入到由CHO细胞重组表达的单抗A蛋白溶液中。混合均匀，使样品溶液中NaCl的终浓度为45mM。然后，配制浓度为10％的Tween80溶液(100mM HAc-NaAc pH＝6.0)，将其加入到上述混合溶液中，再次混合均匀，使样品溶液中Tween80的终浓度为1％，测定电导率为9.41。
在此基础上，按照实施例1同样的方法进行阴离子交换层析纯化，计算经过阴离子交换层析纯化后的单抗A的收率并检测上样液和收集液中的HCP残留量。
实施例7：添加精氨酸Arg对于阴离子交换层析纯化单抗A的影响
配制1M Arg-HCl(100mM HAc-NaAc pH＝6.0)溶液，将其加入到由CHO细胞重组表达的单抗A蛋白溶液中。混合均匀，使样品溶液中Arg-HCl的终浓度为30mM。测定电导率为8.12。
在此基础上，按照实施例1同样的方法进行阴离子交换层析纯化，计算经过阴离子交换层析纯化后的单抗A的收率并检测上样液和收集液中的HCP残留量。
【数据1】实施例1-7中测定的单抗A的残留量和收率数据如表5所示：
表5不同的上样样品处理对HCP残留量和单抗A收率的影响
Figure BDA0002994543820000181
【结论1】
①根据实施例1-3的结果可以看出，同对照试验(即上样样品不做任何处理的实施例1)相比，通过在上样液中添加表面活性剂(即实施例2-3中所述的Triton和Tween 80)、降低蛋白的疏水性，单抗A的收率并未提高；
②根据实施例1、4-6的结果可以看出，同对照试验(即上样样品不做任何处理的实施例1)相比，在上样液中添加NaCl，单抗A的收率略有提高；
③根据实施例4、7的结果可以看出，同在上样液中添加NaCl(电导10.06ms/cm)相比，上样液中添加Arg在更低电导(8.12ms/cm)的情况下，得到了更高的单抗A的收率。
实施例8：精氨酸Arg的含量对于阴离子交换层析纯化单抗A的影响
在实施例7的基础上，进一步探究Arg的含量对于阴离子交换层析纯化单抗A收率的影响。具体进行以下试验：
(I)配制1M Arg-HCl(100mM HAc-NaAc pH＝6.0)溶液，将其加入到由CHO细胞重组表达的单抗A蛋白溶液中。混合均匀，使样品溶液中Arg-HCl的终浓度为61mM。测定电导率为10.03。
在此基础上，按照实施例1同样的方法进行阴离子交换层析纯化，计算纯化后单抗A的收率并检测上样液和收集液中的HCP残留量。
(II)配制1M Arg-HCl(100mM HAc-NaAc pH＝6.0)溶液，将其加入到由CHO细胞重组表达的单抗A蛋白溶液中。混合均匀，使样品溶液中Arg-HCl的终浓度为100mM。测定电导率为12.93。
在此基础上，按照实施例1同样的方法进行阴离子交换层析纯化，计算纯化后单抗A的收率并检测上样液和收集液中的HCP残留量。
【数据2】实施例7-8中测定的HCP的残留量和单抗A的收率数据如表6所示：
表6上样液中Arg的含量对HCP残留量和单抗A收率的影响
Figure BDA0002994543820000191
【结论2】根据实施例7-8的结果可以看出，Arg用量升高可显著提升单抗A收率，在样品中Arg浓度为100mM时，单抗A收率达到92.6％，同时仍保留了符合纯化工艺要求的HCP去除能力。同时，对比实施例8(I)与实施例4可以看出，在几乎同等pH和电导条件下，添加Arg的样品的单抗A收率明显优于添加NaCl的样品的单抗A收率。
实施例9添加NaCl、NaAc-HAC和Arg对于阴离子交换层析纯化单抗A时层析柱的HCP去除能力和单抗A收率的影响
选择不同于实施例1-8中所使用的层析柱和填料进行本试验，具体试验操作如下：
使用Millipore VL11层析柱(柱体积8.48ml，柱高8.0cm)、Gibco POROS HQ填料，按照本发明试验材料和试验方法部分第2.3节表2中所示条件的工艺流程，分别对经过以下试验组1-3处理的、由CHO细胞重组表达的单抗A蛋白溶液进行阴离子交换层析纯化。
试验组1：配制浓度为500mM的NaCl溶液(100mM HAc-NaAc pH＝6.0)，将其加入到由CHO细胞重组表达的单抗A蛋白溶液中。混合均匀，使样品溶液中NaCl的终浓度为40mM，测定电导率为9.35。
试验组2：配制浓度为500mM的HAc-NaAc缓冲溶液(pH＝6.0)，将其加入到由CHO细胞重组表达的单抗A蛋白溶液中。混合均匀，使样品溶液中HAc-NaAc的终浓度为174mM，测定电导率为9.62。
试验组3：配制1M Arg-HCl(100mM HAc-NaAc pH＝6.0)溶液，将其加入到由CHO细胞重组表达的单抗A蛋白溶液中。混合均匀，使样品溶液中Arg-HCl的终浓度为35mM。测定电导率为8.65。
按照本发明试验材料和试验方法部分第3节和第5节所示的步骤和方法，计算在试验组1-3中所述条件下、经过阴离子交换层析纯化后单抗A的收率和检测上样液和收集液中的HCP残留量。
【数据3】试验组1-3中测定的HCP的残留量、单抗A的收率的数据如表7所示：
表7不同的上样样品处理对单抗A收率和HCP残留量的影响
Figure BDA0002994543820000201
【结论3】根据表7的结果可以看出：
①对于HCP的去除能力而言，无论选择在上样样品液中添加Arg还是选择在上样样品液中提高NaAc-HAc的浓度，均能够有效提高阴离子层析柱在纯化目的蛋白过程中对于HCP的去除能力，而在上样样品液中添加NaCl对于提高阴离子层析柱去除HCP的能力没有实质提高作用；
②从提高目的蛋白收率的效果而言：在上样样品液中添加Arg对于提高目的蛋白收率的作用，优于在上样样品液中提高NaAc-HAc的浓度这一手段，且上述两种手段对于提高目的蛋白的收率均优于在上样样品液中添加NaCl。③上样样品液中添加Arg可以适用于不同类型的阴离子填料中，用于提高层析柱的HCP去除能力并且提高疏水性蛋白单抗A的收率。
综上所述，在上样样品中添加适宜浓度的Arg能够同时提高目的蛋白的收率及阴离子层析柱对HCP的去除能力。
实施例10Arg对其它疏水蛋白在阴离子层析中蛋白收率和HCP去除能力的影响
使用Millipore VL11层析柱(柱体积9.75ml，柱高9.2cm)、GE Q Sepharose FastFlow填料，按照本发明试验材料和试验方法部分第2.3节表3中所示条件的工艺流程，分别对经过以下试验组4-5处理的、由CHO细胞重组表达的双抗B蛋白溶液进行阴离子交换层析纯化。
试验组4：在20mM Tris-HCl(pH＝7.2)缓冲液体系中，对未做任何其他处理的由CHO细胞重组表达的双抗B蛋白溶液，进行阴离子交换层析纯化。测定电导率为5.00。
试验组5：配制浓度为1M的Arg-HCl(20mM Tris-HCl，pH＝7.2)，将其加入到由CHO细胞重组表达的双抗B蛋白溶液中。混合均匀，使样品溶液中Arg-HCl的终浓度为50mM，测定电导率为8.25。
按照本发明试验材料和试验方法部分第3节和第5节所示的步骤和方法，计算在试验组4-5中所述条件下、经过阴离子交换层析纯化后双抗B的收率并检测上样液和收集液中的HCP残留量。
【数据4】试验组4-5中测定HCP的残留量、双抗B收率的数据如表8所示：
表8上样液中添加Arg对双抗B收率和HCP残留量的影响
Figure BDA0002994543820000221
【结论4】根据表8的结果可以看出，在上样样品液中添加Arg对于其他疏水性蛋白(如双抗B)同样能够提高层析柱的HCP去除能力并且提高疏水性蛋白的收率。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该应用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110> 信达生物制药(苏州）有限公司
<120> 精氨酸在疏水性蛋白离子交换层析纯化中的应用
<150> 202010230150.7
<151> 2020-03-27
<160> 29
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Ser Ile Tyr Ser Glu Ser Tyr Tyr Trp Gly
1 5 10
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ser Ile Val Tyr Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ala Arg Val Arg Thr Trp Asp Ala Ala Phe Asp Ile
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Gln Val Leu Glu Leu Pro Pro Trp Thr
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Ser Glu
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Ile Val Tyr Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Val Arg Thr Trp Asp Ala Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Leu Glu Leu Pro Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Ser Glu
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Ile Val Tyr Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Val Arg Thr Trp Asp Ala Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 10
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Leu Glu Leu Pro Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 11
<211> 591
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Ser Glu
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Ile Val Tyr Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
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Cys Ala Arg Val Arg Thr Trp Asp Ala Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
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Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
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Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
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Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln
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Cys Ala Ala Ser Ala Tyr Thr Ile Ser Arg Asn Ser Met Gly Trp Phe
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85 90 95
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<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
100 105
<210> 14
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215 220
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 16
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ala Tyr Thr Ile Ser Arg Asn
20 25 30
Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val
35 40 45
Ala Ala Ile Glu Ser Asp Gly Ser Thr Ser Tyr Ser Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Pro Lys Val Gly Leu Gly Pro Arg Thr Ala Leu Gly His Leu Ala
100 105 110
Phe Met Thr Leu Pro Ala Leu Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
115 120 125
Thr Val Ser Ser
130
<210> 17
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Leu Glu Leu Pro Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 18
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Leu Glu Leu Pro Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 19
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Ala Tyr Thr Ile Ser Arg Asn Ser Met Gly
1 5 10
<210> 21
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Ala Ile Glu Ser Asp Gly Ser Thr Ser Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 22
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Pro Lys Val Gly Leu Gly Pro Arg Thr Ala Leu Gly His Leu Ala Phe
1 5 10 15
Met Thr Leu Pro Ala Leu Asn Tyr
20
<210> 23
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Gly Ser Ile Tyr Ser Glu Ser Tyr Tyr Trp Gly
1 5 10
<210> 24
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Ser Ile Val Tyr Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 25
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Ala Arg Val Arg Thr Trp Asp Ala Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 26
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr
1 5
<210> 28
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Gln Gln Val Leu Glu Leu Pro Pro Trp Thr
1 5 10
<210> 29
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Ser Glu
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Ile Val Tyr Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Val Arg Thr Trp Asp Ala Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly

Claims (8)

1.一种提高疏水性蛋白在离子交换层析中收率或降低利用离子交换层析纯化疏水性蛋白的样品收集液中宿主细胞蛋白(HCP)残留量的方法，其特征在于：在上样样品液中添加精氨酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述精氨酸在上样样品液中的终浓度为30mM～100mM。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述离子交换层析为阴离子交换层析，且在所述阴离子交换层析中使用的缓冲溶液的pH小于所述疏水性蛋白的等电点(pI)；优选的，所述缓冲溶液的pH小于所述疏水性蛋白的pI 1至4个pH单位；更优选的，所述缓冲溶液的pH小于所述疏水性蛋白的pI 1至3个pH单位。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述离子交换层析为阳离子交换层析，且在所述阳离子交换层析中使用的缓冲溶液的pH大于所述疏水性蛋白的等电点(pI)；优选的，所述缓冲溶液的pH大于所述疏水性蛋白的pI 1至4个pH单位；更优选的，所述缓冲溶液的pH大于所述疏水性蛋白的pI 1至3个pH单位。
5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其中所述疏水性蛋白为强疏水性蛋白。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述强疏水性蛋白为抗体；优选的，所述抗体为单特异性抗体或双特异性抗体。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述单特异性抗体为包含氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示的重链VH CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的重链VH CDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的重链VH CDR3、氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的轻链VL CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的轻链VL CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示的轻链VL CDR3的单特异性抗体；
所述双特异性抗体包含以下结构组成：VH-CH1-CH2-CH3-接头-VHH的多肽链，和VL-CL的多肽链，其中VH表示重链可变区，CH表示重链恒定区，CH1、CH2、CH3分别表示重链恒定区的结构域1、2和3，VHH表示单结构域抗原结合位点，VL表示轻链可变区，CL表示轻链恒定区；进一步的，所述双特异性抗体为包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO：20～22所示的VHH CDR1～VHH CDR3、氨基酸序列分别如SEQ ID NO：23～25所示的VH的HCDR1～VH的HCDR3、和氨基酸序列分别如SEQ ID NO：26～28所示的VL的LCDR1～VL的LCDR3的双特异性抗体。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述单特异性抗体的重链包含氨基酸序列如SEQID NO：9所示的序列或者包含与该序列具有至少90％同一性的序列，并且所述单特异性抗体的轻链包含氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示的序列或者包含与该序列具有至少90％同一性的序列；
所述双特异性抗体中的VH-CH1-CH2-CH3-接头-VHH的氨基酸序列为SEQ ID NO：11所示的序列或者为与该序列具有至少90％同一性的序列，并且所述双特异性抗体中的VL-CL的氨基酸序列为SEQ ID NO：17所示的序列或者为与该序列具有至少90％同一性的序列。
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CN103429609A (zh) * 2010-12-08 2013-12-04 安姆根有限公司 在氨基酸存在下的离子交换层析
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