KR20220069043A

KR20220069043A - 감소된 숙주 세포 단백질 및 증가된 폴리소르베이트-80 안정성을 갖는 항-ctla4 모노클로날 항체를 포함하는 방법 및 조성물

Info

Publication number: KR20220069043A
Application number: KR1020227013167A
Authority: KR
Inventors: 레베카 에이. 크미엘로스키; 프란시스 인사이두; 저스틴 비. 밀러; 다시니 샤; 데이비드 제이. 로시; 존 피. 웰시
Original assignee: 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션
Priority date: 2019-09-23
Filing date: 2020-09-18
Publication date: 2022-05-26
Also published as: JP2023500775A; EP4034546A1; CA3154726A1; EP4034546A4; WO2021061504A1; BR112022005410A2; CN114650999A; US20240115701A1; AU2020356303A1; MX2022003432A

Abstract

크로마토그래피 프로세스에서 생산 단백질로부터 숙주 세포 리파제를 분리하는 방법, 및 크로마토그래피 프로세스를 사용하여 생산 단백질로부터 숙주 세포 리파제를 분리함으로써 생산 단백질 제형에서 폴리소르베이트-80 안정성을 개선하는 방법이 본원에 제공된다. 또한, 세포독성 T 림프구 연관 항원 4 (CTLA4)에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 또 다른 측면에서, 이러한 조성물은 감소된 수준의 숙주 세포 단백질 및/또는 증가된 수준의 폴리소르베이트-80 (PS-80) 안정성을 추가로 포함한다.

Description

감소된 숙주 세포 단백질 및 증가된 폴리소르베이트-80 안정성을 갖는 항-CTLA4 모노클로날 항체를 포함하는 방법 및 조성물

I. 분야

크로마토그래피 프로세스에서 생산 단백질 (예를 들어, 모노클로날 항체)로부터 숙주 세포 단백질 (HCP) (예를 들어, 리파제)을 분리하는 방법이 본원에 제공된다. 또한, 크로마토그래피 프로세스를 사용하여 생산 단백질 (예를 들어, 모노클로날 항체)로부터 HCP (예를 들어, 리파제)를 분리함으로써 생산 단백질 제형 (예를 들어, 원료의약품 제형 또는 약물 완제품 제형)에서 폴리소르베이트-80 (PS-80) 안정성을 개선하는 방법이 본원에 제공된다. 또한, 세포독성 T 림프구 연관 항원 4 (CTLA4)에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 또 다른 측면에서, 이러한 조성물은 증가된 수준의 PS-80 안정성과 감소된 수준의 숙주 세포 단백질을 추가로 포함한다.

II. 발명의 배경

생산 단백질 (예를 들어, 모노클로날 항체)의 바이오프로세싱 및 제조에서, HCP (예를 들어, 리파제)는 종종 생산 단백질로부터 제거하기 어려운 불순물의 일부를 구성한다. 이러한 불순물은 생물의약의 안전성 및 효능에 다양한 문제를 일으킬 수 있다. 전 세계의 규제 기관은 생물의약 제품이 불순물 수준 및 불순물의 검출 및 정량화를 위한 테스트를 포함하여 특정 허용 기준을 충족하도록 요구한다. 그러므로, 생산 단백질 (예를 들어, 모노클로날 항체)로부터 HCP (예를 들어, 리파제)를 제거하는 효율적이고 효과적인 프로세스를 개발하는 것이 바람직하다.

CTLA4 mAb 또는 CTLA4 리간드는 CTLA4가 그의 천연 리간드에 결합하는 것을 방지할 수 있으며, 이에 의해 CTLA4에 의한 T 세포 음성 조절 신호의 전달을 차단하고, 다양한 항원에 대한 T 세포의 반응성을 향상시킨다. 이 측면에서, 생체내 및 시험관내 연구의 결과는 실질적으로 일치한다. CTLA-4는 인간 사용에 대한 이필리무맙의 FDA 승인 후 면역치료제 표적으로서, 흑색종에 대한 단일요법으로서, 또는 미세부수체 불안정성을 갖는 흑색종, 신장암, 결장직장암에서 항-PD-1 항체인 니볼루맙과의 조합 요법의 일부로서 입증되었다. (Zhang, P., et al. Mechanism and Immune Landscape Based ranking of Therapeutic Responsiveness of 22 Major Human Cancers to Next Generation Anti-CTLA-4 Antibodies, Cancers, 12(2), 284). 전립선암, 방광암, 결장직장암, 위장관암, 간암, 악성 흑색종 등을 치료하기 위해 임상 시험에서 일부 CTLA4 mAb가 테스트되고 있다 (Grosso et al., CTLA-4 blockade in tumor models: an overview of preclinical and translational research. Cancer Immun. 13:5(2013)).

III. 요약

본 개시내용은 크로마토그래피 프로세스에서 생산 단백질 (예를 들어, 모노클로날 항체)로부터 HCP (예를 들어, 리파제)를 분리하는 방법, 뿐만 아니라 크로마토그래피 프로세스를 사용하여 생산 단백질 (예를 들어, 모노클로날 항체)로부터 HCP (예를 들어, 리파제)를 분리함으로써 생산 단백질 제형 (예를 들어, 원료의약품 제형 또는 약물 완제품 제형)에서 PS-80 안정성을 개선하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 HCP (예를 들어, 리파제) 및 생산 단백질 (예를 들어, 모노클로날 항체)이 두 단백질 사이의 분리 인자 (α) 및/또는 HCP (예를 들어, 리파제)에 대한 분배 계수 (K_P)가 특정 범위의 수치 값에 도달하는 작동 조건 하에서 충분히 분리될 수 있다는 발견에 적어도 부분적으로 기초한다.

한 측면에서, 생산 단백질은 항-CTLA4 항체이다.

한 측면에서, 하기를 포함하는, 크로마토그래피 프로세스를 통해 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로부터 숙주 세포 리파제를 분리하는 방법이 본원에 제공된다:

(a) 리파제 및 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 로드 유체를 로딩 작동 조건 하에 크로마토그래피 수지를 통해 통과시키는 단계; 및

(b) 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 플로우스루(flowthrough)에 수집하는 단계;

여기서 분리 인자 (α)는 리파제에 대한 분배 계수 (K_P) 대 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 대한 K_P의 비율이고, 여기서 로딩 작동 조건 하에 log α는 0.5보다 크다.

특정 실시양태에서, 로딩 작동 조건 하에 log α는 1.0보다 크다.

일부 실시양태에서, 로딩 작동 조건 하에 리파제에 대한 log K_P는 1.0보다 크다. 다른 실시양태에서, 로딩 작동 조건 하에 리파제에 대한 log K_P는 1.5보다 크다.

특정 실시양태에서, 로딩 작동 조건 하에 log α는 0.5보다 크고 리파제에 대한 log K_P는 1.0보다 크다. 일부 실시양태에서, 로딩 작동 조건 하에 log α는 0.5보다 크고 리파제에 대한 log K_P는 1.5보다 크다. 다른 실시양태에서, 로딩 작동 조건 하에 log α는 1.0보다 크고 리파제에 대한 log K_P는 1.0보다 크다. 또 다른 실시양태에서, 로딩 작동 조건 하에 log α는 1.0보다 크고 리파제에 대한 log K_P는 1.5보다 크다.

또 다른 측면에서, 하기를 포함하는, 크로마토그래피 프로세스를 통해 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로부터 숙주 세포 리파제를 분리하는 방법이 본원에 제공된다:

(a) 리파제 및 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 로드 유체를 크로마토그래피 수지를 통해 통과시키는 단계; 및

(b) 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 용리 작동 조건 하에 용리 용액으로 크로마토그래피 수지로부터 용리하는 단계;

여기서 α는 리파제에 대한 K_P 대 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 대한 K_P의 비율이고, 여기서 용리 작동 조건 하에 log α는 0.5보다 크다.

특정 실시양태에서, 용리 작동 조건 하에 log α는 1.0보다 크다.

일부 실시양태에서, 용리 작동 조건 하에 리파제에 대한 log K_P는 1.0보다 크다. 다른 실시양태에서, 용리 작동 조건 하에 리파제에 대한 log K_P는 1.5보다 크다.

특정 실시양태에서, 용리 작동 조건 하에 log α는 0.5보다 크고 리파제에 대한 log K_P는 1.0보다 크다. 일부 실시양태에서, 용리 작동 조건 하에 log α는 0.5보다 크고 리파제에 대한 log K_P는 1.5보다 크다. 다른 실시양태에서, 용리 작동 조건 하에 log α는 1.0보다 크고 리파제에 대한 log K_P는 1.0보다 크다. 또 다른 실시양태에서, 용리 작동 조건 하에 log α는 1.0보다 크고 리파제에 대한 log K_P는 1.5보다 크다.

본원에 제공된 다양한 방법의 일부 실시양태에서, 리파제는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 리파제이다.

특정 실시양태에서, 리파제는 포스포리파제 B-유사 2 (PLBL2), 지단백질 리파제 (LPL), 리소좀 포스포리파제 A2 (LPLA2), 포스포리파제 A2 VII (LP-PLA2), 및 리소좀산 리파제 A (LAL)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 리파제는 PLBL2이다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 LPL이다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 LPLA2이다. 한 실시양태에서, 리파제는 LP-PLA2이다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 LAL이다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 상이한 리파제를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 PLBL2, LPL, LPLA2, LP-PLA2 및 LAL로 이루어진 군으로부터 선택된 2, 3, 4 또는 5개의 상이한 리파제를 포함한다. 한 실시양태에서, 리파제는 PLBL2 및 LPL을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 PLBL2 및 LPLA2를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 PLBL2 및 LP-PLA2를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 PLBL2 및 LAL을 포함한다. 한 실시양태에서, 리파제는 LPL 및 LPLA2를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 LPL 및 LP-PLA2를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 LPL 및 LAL을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 LPLA2 및 LP-PLA2를 포함한다. 한 실시양태에서, 리파제는 LPLA2 및 LAL을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 LP-PLA2 및 LAL을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 PLBL2, LPL 및 LPLA2를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 PLBL2, LPL 및 LP-PLA2를 포함한다. 한 실시양태에서, 리파제는 PLBL2, LPL 및 LAL을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 PLBL2, LPLA2 및 LP-PLA2를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 PLBL2, LPLA2 및 LAL을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 PLBL2, LP-PLA2 및 LAL을 포함한다. 한 실시양태에서, 리파제는 LPL, LPLA2 및 LP-PLA2를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 LPL, LPLA2 및 LAL을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 LPL, LP-PLA2 및 LAL을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 LPLA2, LP-PLA2 및 LAL을 포함한다. 한 실시양태에서, 리파제는 PLBL2, LPL, LPLA2 및 LP-PLA2를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 PLBL2, LPL, LPLA2 및 LAL을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 PLBL2, LPL, LP-PLA2 및 LAL을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 PLBL2, LPLA2, LP-PLA2 및 LAL을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 PLBL2, LPL, LPLA2, LP-PLA2 및 LAL을 포함한다.

특정 실시양태에서, CHO 세포 리파제는 PLBL2, LPL, LPLA2, LP-PLA2 및 LAL로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, CHO 세포 리파제는 PLBL2이다. 또 다른 실시양태에서, CHO 세포 리파제는 LPL이다. 또 다른 실시양태에서, CHO 세포 리파제는 LPLA2이다. 한 실시양태에서, CHO 세포 리파제는 LP-PLA2이다. 또 다른 실시양태에서, CHO 세포 리파제는 LAL이다. 또 다른 실시양태에서, CHO 세포 리파제는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 상이한 CHO 세포 리파제를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, CHO 세포 리파제는 PLBL2, LPL, LPLA2, LP-PLA2 및 LAL로 이루어진 군으로부터 선택된 2, 3, 4 또는 5개의 상이한 CHO 세포 리파제를 포함한다. 한 실시양태에서, CHO 세포 리파제는 PLBL2 및 LPL을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, CHO 세포 리파제는 PLBL2 및 LPLA2를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, CHO 세포 리파제는 PLBL2 및 LP-PLA2를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, CHO 세포 리파제는 PLBL2 및 LAL을 포함한다. 한 실시양태에서, CHO 세포 리파제는 LPL 및 LPLA2를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, CHO 세포 리파제는 LPL 및 LP-PLA2를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, CHO 세포 리파제는 LPL 및 LAL을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, CHO 세포 리파제는 LPLA2 및 LP-PLA2를 포함한다. 한 실시양태에서, CHO 세포 리파제는 LPLA2 및 LAL을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, CHO 세포 리파제는 LP-PLA2 및 LAL을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, CHO 세포 리파제는 PLBL2, LPL 및 LPLA2를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, CHO 세포 리파제는 PLBL2, LPL 및 LP-PLA2를 포함한다. 한 실시양태에서, CHO 세포 리파제는 PLBL2, LPL 및 LAL을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, CHO 세포 리파제는 PLBL2, LPLA2 및 LP-PLA2를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, CHO 세포 리파제는 PLBL2, LPLA2 및 LAL을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, CHO 세포 리파제는 PLBL2, LP-PLA2 및 LAL을 포함한다. 한 실시양태에서, CHO 세포 리파제는 LPL, LPLA2 및 LP-PLA2를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, CHO 세포 리파제는 LPL, LPLA2 및 LAL을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, CHO 세포 리파제는 LPL, LP-PLA2 및 LAL을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, CHO 세포 리파제는 LPLA2, LP-PLA2 및 LAL을 포함한다. 한 실시양태에서, CHO 세포 리파제는 PLBL2, LPL, LPLA2 및 LP-PLA2를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, CHO 세포 리파제는 PLBL2, LPL, LPLA2 및 LAL을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, CHO 세포 리파제는 PLBL2, LPL, LP-PLA2 및 LAL을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, CHO 세포 리파제는 PLBL2, LPLA2, LP-PLA2 및 LAL을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, CHO 세포 리파제는 PLBL2, LPL, LPLA2, LP-PLA2 및 LAL을 포함한다.

본원에 제공된 다양한 방법의 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 수지는 이온 교환 (IEX) 수지이다. 다른 실시양태에서, 크로마토그래피 수지는 소수성 상호작용 (HIC) 수지이다. 한 실시양태에서, IEX 수지는 양이온 교환 (CEX) 수지이다. 또 다른 실시양태에서, CEX 수지는 혼합 모드 CEX 수지이다. 또 다른 실시양태에서, IEX 수지는 음이온 교환 (AEX) 수지이다. 또 다른 실시양태에서, AEX 수지는 혼합 모드 AEX 수지이다.

CEX 수지 또는 혼합 모드 CEX 수지를 사용하는 다양한 방법의 특정 실시양태에서, 작동 조건의 pH는 약 6.0 미만이다. CEX 수지 또는 혼합 모드 CEX 수지를 사용하는 다양한 방법의 일부 실시양태에서, 작동 조건의 pH는 약 5.5 미만이다. CEX 수지 또는 혼합 모드 CEX 수지를 사용하는 다양한 방법의 다른 실시양태에서, 작동 조건의 pH는 약 5.0 미만이다. CEX 수지 또는 혼합 모드 CEX 수지를 사용하는 다양한 방법의 또 다른 실시양태에서, 작동 조건의 pH는 약 4.5 내지 약 5.5이다. CEX 수지 또는 혼합 모드 CEX 수지를 사용하는 다양한 방법의 또 다른 실시양태에서, 작동 조건의 pH는 약 4.5 내지 약 5.0이다. CEX 수지 또는 혼합 모드 CEX 수지를 사용하는 다양한 방법의 특정 실시양태에서, 작동 조건의 pH는 약 5.0 내지 약 5.5이다. CEX 수지 또는 혼합 모드 CEX 수지를 사용하는 다양한 방법의 일부 실시양태에서, 작동 조건의 pH는 약 4.9 내지 약 5.3이다.

AEX 수지 또는 혼합 모드 AEX 수지를 사용하는 다양한 방법의 특정 실시양태에서, 작동 조건의 pH는 약 6.5 초과이다. AEX 수지 또는 혼합 모드 AEX 수지를 사용하는 다양한 방법의 일부 실시양태에서, 작동 조건의 pH는 약 6.9 초과이다. AEX 수지 또는 혼합 모드 AEX 수지를 사용하는 다양한 방법의 다른 실시양태에서, 작동 조건의 pH는 약 7.2 초과이다. AEX 수지 또는 혼합 모드 AEX 수지를 사용하는 다양한 방법의 또 다른 실시양태에서, 작동 조건의 pH는 약 6.9 내지 약 7.9이다. AEX 수지 또는 혼합 모드 AEX 수지를 사용하는 다양한 방법의 또 다른 실시양태에서, 작동 조건의 pH는 약 7.2 내지 약 7.5이다. AEX 수지 또는 혼합 모드 AEX 수지를 사용하는 다양한 방법의 특정 실시양태에서, 작동 조건의 pH는 약 7.5 내지 약 7.8이다.

본원에 제공된 다양한 방법의 특정 실시양태에서, 작동 조건은 염을 첨가함으로써 작동 용액의 이온 강도 및/또는 전도도를 조정하는 것을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 작동 조건은 염을 첨가함으로써 작동 용액의 이온 강도를 조정하는 것을 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 작동 조건은 염을 첨가함으로써 작동 용액의 전도도를 조정하는 것을 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 작동 조건은 염을 첨가함으로써 작동 용액의 이온 강도 및 전도도를 조정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 염을 첨가하는 효과는 원하는 log α를 달성하는 것이다. 다른 실시양태에서, 염을 첨가하는 효과는 리파제에 대한 원하는 log K_P를 달성하는 것이다. 또 다른 실시양태에서, 염을 첨가하는 효과는 원하는 log α 및 리파제에 대한 원하는 log K_P를 달성하는 것이다.

일부 실시양태에서, 작동 용액 내의 염은 염화나트륨, 아세트산나트륨, 인산나트륨, 황산암모늄, 황산나트륨 및 트리스-HCl로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 염은 염화나트륨이다. 또 다른 실시양태에서, 염은 아세트산나트륨이다. 또 다른 실시양태에서, 염은 인산나트륨이다. 또 다른 실시양태에서, 염은 황산암모늄이다. 한 실시양태에서, 염은 황산나트륨이다. 또 다른 실시양태에서, 염은 트리스-HCl이다.

구체적인 실시양태에서, 작동 용액 중 염화나트륨의 농도는 약 100 mM 내지 약 225 mM이고, 크로마토그래피 수지는 CEX이고, 작동 조건의 pH는 약 5.0 내지 약 6.0이다.

또 다른 구체적인 실시양태에서, 작동 용액 중 염화나트륨의 농도는 약 150 mM 내지 약 180 mM이고, 크로마토그래피 수지는 CEX이고, 작동 조건의 pH는 약 5.0 내지 약 6.0이다.

또 다른 구체적인 실시양태에서, 작동 용액 중 아세트산나트륨의 농도는 약 100 mM 내지 약 200 mM이고, 크로마토그래피 수지는 AEX이고; 작동 조건의 pH는 약 6.9 내지 약 7.8이다.

또 다른 구체적인 실시양태에서, 작동 용액 중 황산나트륨의 농도는 약 500 mM 내지 약 620 mM이고, 크로마토그래피 수지는 HIC이고, 작동 조건의 pH는 약 7이다.

또 다른 구체적인 실시양태에서, 작동 용액 중 황산나트륨의 농도는 약 510 mM 내지 약 560 mM이고, 크로마토그래피 수지는 HIC이고, 작동 조건의 pH는 약 7이다.

또 다른 측면에서, 하기를 포함하는, 혼합 모드 AEX 크로마토그래피 프로세스를 통해 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로부터 PLBL2를 분리하고 PS-80 안정성을 개선하는 방법이 본원에 제공된다:

(a) PLBL2 및 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 로드 유체를 혼합 모드 AEX 수지를 통해 통과시키는 단계; 및

(b) 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 플로우스루에 수집하는 단계;

여기서 로드 유체의 pH는 약 pH 7.2 내지 약 pH 7.6이고, 여기서 로드 유체는 염을 포함하지 않는다.

또 다른 측면에서, 하기를 포함하는, CEX 크로마토그래피 프로세스를 통해 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로부터 PLBL2를 분리하고 PS-80 안정성을 개선하는 방법이 본원에 제공된다:

(a) PLBL2 및 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 로드 유체를 CEX 수지를 통해 통과시키는 단계; 및

(b) 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 용리 용액으로 CEX 수지로부터 용리하는 단계;

여기서 용리 용액의 pH는 약 pH 4.9 내지 약 pH 5.3이고, 여기서 용리 용액은 약 120 mM 내지 약 175 mM 염화나트륨을 추가로 포함한다.

한 실시양태에서, CEX 크로마토그래피 프로세스를 통해 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로부터 PLBL2를 분리하고 PS-80 안정성을 개선하는 방법은 하기를 포함한다:

여기서 용리 용액의 pH는 약 pH 5.1이고, 여기서 용리 용액은 약 150 mM 염화나트륨을 추가로 포함한다.

또 다른 실시양태에서, CEX 크로마토그래피 프로세스를 통해 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로부터 PLBL2를 분리하고 PS-80 안정성을 개선하는 방법은 하기를 포함한다:

여기서 용리 용액의 pH는 약 pH 5.1이고, 여기서 용리 용액은 약 165 mM 염화나트륨을 추가로 포함한다.

또 다른 측면에서, 하기를 포함하는, CEX 크로마토그래피 프로세스를 통해 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로부터 LPLA2를 분리하고 PS-80 안정성을 개선하는 방법이 본원에 제공된다:

(a) LPLA2 및 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 로드 유체를 CEX 수지를 통해 통과시키는 단계; 및

여기서 용리 용액의 pH는 약 pH 5.0 내지 약 pH 5.4이고, 여기서 용리 용액은 약 150 mM 내지 약 275 mM 염화나트륨을 추가로 포함한다.

한 실시양태에서, CEX 크로마토그래피 프로세스를 통해 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로부터 LPLA2를 분리하고 PS-80 안정성을 개선하는 방법은 하기를 포함한다:

또 다른 실시양태에서, CEX 크로마토그래피 프로세스를 통해 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로부터 LPLA2를 분리하고 PS-80 안정성을 개선하는 방법은 하기를 포함한다:

여기서 용리 용액의 pH는 약 pH 5.1이고, 여기서 용리 용액은 약 200 mM 염화나트륨을 추가로 포함한다.

여기서 용리 용액의 pH는 약 pH 5.1이고, 여기서 용리 용액은 약 250 mM 염화나트륨을 추가로 포함한다.

본원에 제공된 다양한 방법의 추가 실시양태에서, 로드 유체는 선행 크로마토그래피 프로세스로부터의 용리액이다. 한 실시양태에서, 선행 크로마토그래피 프로세스는 친화성 크로마토그래피를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 선행 크로마토그래피 프로세스는 친화성 크로마토그래피에 이은 비친화성 크로마토그래피를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 친화성 크로마토그래피는 단백질 A 크로마토그래피이다. 또 다른 실시양태에서, 비친화성 크로마토그래피는 AEX 크로마토그래피이다. 또 다른 실시양태에서, 선행 크로마토그래피 프로세스는 단백질 A 크로마토그래피에 이은 AEX 크로마토그래피를 포함한다.

또 다른 측면에서, 하기를 포함하는, 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편 제형에서 PS-80 안정성을 개선하는 방법이 본원에 제공된다:

(a) 숙주 세포 리파제 및 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 로드 유체를 로딩 작동 조건 하에 크로마토그래피 수지를 통해 통과시키는 단계;

(c) 추가로, 숙주 세포 리파제를 포함하는 플로우스루 생성물을 추가 크로마토그래피 수지를 통해 통과시키는 단계;

(d) 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 수집하는 단계, 및

(e) 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편 제형이 PS-80을 포함하도록 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제형화하는 단계;

(f) PLBL2 및 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 로드 유체를 로딩 작동 조건 하에 크로마토그래피 수지를 통해 통과시키는 단계;

(g) 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 플로우스루에 수집하는 단계;

(h) 추가로, PLBL2를 포함하는 플로우스루 생성물을 추가 크로마토그래피 수지를 통해 통과시키는 단계;

(i) 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 수집하는 단계, 및

(j) 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편 제형이 PS-80을 포함하도록 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제형화하는 단계;

또 다른 측면에서, 하기를 포함하는, 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편 조성물에서 PS-80 분해를 감소시키는 방법이 본원에 제공된다:

(c) 숙주 세포 리파제를 포함하는 플로우스루 생성물을 추가 크로마토그래피 수지를 통해 통과시키는 단계;

(a) 숙주 세포 리파제 및 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 로드 유체를 크로마토그래피 수지를 통해 통과시키는 단계;

(b) 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 용리 작동 조건 하에 용리 용액으로 크로마토그래피 수지로부터 용리하는 단계; 및

(c) 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편 제형이 PS-80-함유 용액이 되도록 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제형화하는 단계;

특정 실시양태에서, 리파제는 PLBL2, LPL, LPLA2, LP-PLA2 및 LAL로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 리파제는 PLBL2이다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 LPL이다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 LPLA2이다. 한 실시양태에서, 리파제는 LP-PLA2이다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 LAL이다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 상이한 리파제를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 PLBL2, LPL, LPLA2, LP-PLA2 및 LAL로 이루어진 군으로부터 선택된 2, 3, 4 또는 5개의 상이한 리파제를 포함한다. 한 실시양태에서, 리파제는 PLBL2 및 LPL을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 PLBL2 및 LPLA2를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 PLBL2 및 LP-PLA2를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 PLBL2 및 LAL을 포함한다. 한 실시양태에서, 리파제는 LPL 및 LPLA2를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 LPL 및 LP-PLA2를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 LPL 및 LAL을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 LPLA2 및 LP-PLA2를 포함한다. 한 실시양태에서, 리파제는 LPLA2 및 LAL을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 LP-PLA2 및 LAL을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 PLBL2, LPL 및 LPLA2를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 PLBL2, LPL 및 LP-PLA2를 포함한다. 한 실시양태에서, 리파제는 PLBL2, LPL 및 LAL을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 PLBL2, LPLA2 및 LP-PLA2를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 PLBL2, LPLA2 및 LAL을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 PLBL2, LP-PLA2 및 LAL을 포함한다. 한 실시양태에서, 리파제는 LPL, LPLA2 및 LP-PLA2를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 LPL, LPLA2 및 LAL을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 LPL, LP-PLA2 및 LAL을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 LPLA2, LP-PLA2 및 LAL을 포함한다. 한 실시양태에서, 리파제는 PLBL2, LPL, LPLA2 및 LP-PLA2를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 PLBL2, LPL, LPLA2 및 LAL을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 PLBL2, LPL, LP-PLA2 및 LAL을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 PLBL2, LPLA2, LP-PLA2 및 LAL을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 PLBL2, LPL, LPLA2, LP-PLA2 및 LAL을 포함한다.

본원에 제공된 다양한 방법의 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 수지는 IEX 수지이다. 다른 실시양태에서, 크로마토그래피 수지는 HIC 수지이다. 한 실시양태에서, IEX 수지는 CEX 수지이다. 또 다른 실시양태에서, CEX 수지는 혼합 모드 CEX 수지이다. 또 다른 실시양태에서, IEX 수지는 AEX 수지이다. 또 다른 실시양태에서, AEX 수지는 혼합 모드 AEX 수지이다.

(a) 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 로드 유체를 혼합 모드 AEX 수지를 통해 통과시키는 단계;

(b) 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 플로우스루에 수집하는 단계; 및

(a) 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 로드 유체를 CEX 수지를 통해 통과시키는 단계;

(b) 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 용리 용액으로 CEX 수지로부터 용리하는 단계; 및

한 실시양태에서, 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편 제형에서 PS-80 안정성을 개선하는 방법은 하기를 포함한다:

또 다른 실시양태에서, 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편 제형에서 PS-80 안정성을 개선하는 방법은 하기를 포함한다:

(c) 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편 제형이 PS-80-함유 용액이 되도록 항-CTLA4 항체를 제형화하는 단계;

또 다른 측면에서, 하기를 포함하는, CEX 크로마토그래피 프로세스를 통해 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로부터 숙주 세포 리파제를 분리하는 방법이 본원에 제공된다:

(a) 숙주 세포 리파제 및 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 로드 유체를 CEX 수지를 통해 통과시키는 단계; 및

여기서 용리 용액의 pH는 약 pH 4.9 내지 약 pH 5.4이고, 여기서 용리 용액의 전도도는 약 15 mS/cm 내지 약 21 mS/cm이다.

(c) 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편 제형이 PS-80을 포함하도록 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제형화하는 단계;

여기서 용리 용액의 pH는 약 pH 4.9 내지 약 pH 5.4이고, 여기서 용리 용액은 약 135 mM 내지 약 195 mM 염화나트륨을 추가로 포함한다.

본원에 기재된 다양한 방법의 특정 실시양태에서, 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 치료 단백질이다.

본원에 기재된 다양한 방법의 일부 실시양태에서, 항-CTLA4 항체는 모노클로날 항체이다.

또 다른 측면에서, 치료 단백질 및 1 ppm 미만의 숙주 세포 리파제를 포함하는 제약 조성물이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 치료 단백질 및 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8 또는 0.9 ppm 미만의 숙주 세포 리파제를 포함한다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 치료 단백질 및 0.1 ppm 미만의 숙주 세포 리파제를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 치료 단백질 및 0.2 ppm 미만의 숙주 세포 리파제를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 치료 단백질 및 0.3 ppm 미만의 숙주 세포 리파제를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 치료 단백질 및 0.4 ppm 미만의 숙주 세포 리파제를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 치료 단백질 및 0.5 ppm 미만의 숙주 세포 리파제를 포함한다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 치료 단백질 및 0.6 ppm 미만의 숙주 세포 리파제를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 치료 단백질 및 0.7 ppm 미만의 숙주 세포 리파제를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 치료 단백질 및 0.8 ppm 미만의 숙주 세포 리파제를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 치료 단백질 및 0.9 ppm 미만의 숙주 세포 리파제를 포함한다.

본원에 기재된 제약 조성물의 다양한 실시양태에서, 숙주 세포 리파제의 수준은 액체 크로마토그래피-질량 분석법 (LC-MS)에 의해 측정된다.

또 다른 측면에서, 증가된 PS-80 안정성을 갖는 치료 단백질을 포함하는 제약 조성물이 본원에 제공되며, 여기서 제약 조성물은 PS-80 분해의 감소를 갖는다.

특정 실시양태에서, 제약 조성물은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 용리 용액을 사용한 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 CEX 크로마토그래피로부터의 용리액이다:

(a) 약 120 mM 내지 약 175 mM 염화나트륨을 포함하는 약 4.9 내지 약 5.3의 pH를 갖는 용리 용액;

(b) 약 150 mM 염화나트륨을 포함하는 약 5.1의 pH를 갖는 용리 용액;

(c) 약 165 mM 염화나트륨을 포함하는 약 5.1의 pH를 갖는 용리 용액;

(d) 약 4.9 내지 약 5.4의 pH 및 약 15 mS/cm 내지 약 21 mS/cm의 전도도를 갖는 용리 용액;

(e) 약 135 mM 내지 약 195 mM 염화나트륨을 포함하는 약 4.9 내지 약 5.4의 pH를 갖는 용리 용액;

(f) 약 150 mM 내지 약 275 mM 염화나트륨을 포함하는 약 pH 5.0 내지 약 pH 5.4의 pH를 갖는 용리 용액;

(g) 약 200 mM 염화나트륨을 포함하는 약 5.1의 pH를 갖는 용리 용액; 및

(h) 약 250 mM 염화나트륨을 포함하는 약 5.1의 pH를 갖는 용리 용액.

한 실시양태에서, 제약 조성물은 약 120 mM 내지 약 175 mM 염화나트륨 및 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 약 4.9 내지 약 5.3의 pH를 갖는 용리 용액을 사용한 CEX 크로마토그래피로부터의 용리액이다.

또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 약 150 mM 염화나트륨 및 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 약 5.1의 pH를 갖는 용리 용액을 사용한 CEX 크로마토그래피로부터의 용리액이다.

또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 약 165 mM 염화나트륨 및 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 약 5.1의 pH를 갖는 용리 용액을 사용한 CEX 크로마토그래피로부터의 용리액이다.

또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 약 4.9 내지 약 5.4의 pH 및 약 15 mS/cm 내지 약 21 mS/cm의 전도도를 갖고 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 용리 용액을 사용한 CEX 크로마토그래피로부터의 용리액이다.

한 실시양태에서, 제약 조성물은 약 135 mM 내지 약 195 mM 염화나트륨 및 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 약 4.9 내지 약 5.4의 pH를 갖는 용리 용액을 사용한 CEX 크로마토그래피로부터의 용리액이다.

또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 약 150 mM 내지 약 275 mM 염화나트륨 및 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 약 pH 5.0 내지 약 pH 5.4의 pH를 갖는 용리 용액을 사용한 CEX 크로마토그래피로부터의 용리액이다.

또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 약 200 mM 염화나트륨 및 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 약 5.1의 pH를 갖는 용리 용액을 사용한 CEX 크로마토그래피로부터의 용리액이다.

또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 약 250 mM 염화나트륨 및 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 약 5.1의 pH를 갖는 용리 용액을 사용한 CEX 크로마토그래피로부터의 용리액이다.

제약 조성물의 일부 실시양태에서, 플로우스루 모드로 작동되는 AEX 크로마토그래피가 CEX 크로마토그래피에 앞선다.

제약 조성물의 특정 실시양태에서, 리파제는 PLBL2, LPL, LPLA2, LP-PLA2 및 LAL로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 리파제는 PLBL2이다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 LPL이다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 LPLA2이다. 한 실시양태에서, 리파제는 LP-PLA2이다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 LAL이다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 상이한 리파제를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 PLBL2, LPL, LPLA2, LP-PLA2 및 LAL로 이루어진 군으로부터 선택된 2, 3, 4 또는 5개의 상이한 리파제를 포함한다. 한 실시양태에서, 리파제는 PLBL2 및 LPL을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 PLBL2 및 LPLA2를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 PLBL2 및 LP-PLA2를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 PLBL2 및 LAL을 포함한다. 한 실시양태에서, 리파제는 LPL 및 LPLA2를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 LPL 및 LP-PLA2를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 LPL 및 LAL을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 LPLA2 및 LP-PLA2를 포함한다. 한 실시양태에서, 리파제는 LPLA2 및 LAL을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 LP-PLA2 및 LAL을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 PLBL2, LPL 및 LPLA2를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 PLBL2, LPL 및 LP-PLA2를 포함한다. 한 실시양태에서, 리파제는 PLBL2, LPL 및 LAL을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 PLBL2, LPLA2 및 LP-PLA2를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 PLBL2, LPLA2 및 LAL을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 PLBL2, LP-PLA2 및 LAL을 포함한다. 한 실시양태에서, 리파제는 LPL, LPLA2 및 LP-PLA2를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 LPL, LPLA2 및 LAL을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 LPL, LP-PLA2 및 LAL을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 LPLA2, LP-PLA2 및 LAL을 포함한다. 한 실시양태에서, 리파제는 PLBL2, LPL, LPLA2 및 LP-PLA2를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 PLBL2, LPL, LPLA2 및 LAL을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 PLBL2, LPL, LP-PLA2 및 LAL을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 PLBL2, LPLA2, LP-PLA2 및 LAL을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리파제는 PLBL2, LPL, LPLA2, LP-PLA2 및 LAL을 포함한다.

제약 조성물의 다른 실시양태에서, 치료 단백질은 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다.

본 발명에 유용한 항-CTLA4 항체 및 항원 결합 단편

또한 10-200 mg의 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다.

또한 10-100 mg의 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다.

또한 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다: (1) 10 mg의 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편; (2) 25 mg의 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편; (3) 50 mg의 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편; (4) 75 mg의 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 또는 (5) 100 mg의 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편.

또한 25 mg의 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다.

본 발명의 정제 방법, 치료 방법, 조성물, 키트 및 용도의 한 실시양태에서, 항-CTLA-4 항체는 인간 모노클로날 항체 10D1이며, 이는 현재 이필리무맙으로 공지되어 있고 여보이™로 판매되고 있으며, 이는 미국 특허 번호 6,984,720 및 문헌 [WHO Drug Information 19(4): 61 (2005)]에 개시되어 있다. 또 다른 실시양태에서, 항-CTLA-4 항체는 CP-675,206으로도 공지된 트레멜리무맙이며, 이는 IgG2 모노클로날 항체이고, 이는 미국 특허 출원 공개 번호 2012/263677, 또는 PCT 국제 출원 공개 번호 WO 2012/122444 또는 WO 2007/113648 A2에 기재되어 있다.

본 발명의 정제 방법, 치료 방법, 조성물, 키트 및 용도의 추가 실시양태에서, 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하기를 포함한다: 서열식별번호(SEQ ID NO): 1, 2 및 3에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열식별번호: 4, 5 및 6에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR.

본 발명의 정제 방법, 치료 방법, 조성물, 키트 및 용도의 다른 실시양태에서, 항-CTLA4 항체는 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편이며, 이는 인간 CTLA4에 결합하고, (a) 서열식별번호: 7에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 (b) 서열식별번호: 8에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

본 발명의 정제 방법, 치료 방법, 조성물, 키트 및 용도의 한 실시양태에서, 항-CTLA-4 항체는 서열식별번호: 9에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열식별번호: 10에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-CTLA4 항체는 서열식별번호: 9 및/또는 서열식별번호: 10의 항원 결합 단편이고, 여기서 항원 결합 단편은 CTLA4에 특이적으로 결합한다.

본 발명의 정제 방법, 치료 방법, 조성물, 키트 및 용도의 한 실시양태에서, 항-CTLA-4 항체는 국제 출원 공개 번호 WO 2016/015675 A1에 개시된 항-CTLA-4 항체 또는 그의 항원 결합 단편 중 임의의 것이다. 한 실시양태에서, 항-CTLA4 항체는 하기 CDR을 포함하는 모노클로날 항체이다:

아미노산 서열 GFTFSDNW (서열식별번호: 11)를 포함하는 CDRH1;

아미노산 서열 IRNKPYNYET (서열식별번호: 12)를 포함하는 CDRH2;

아미노산 서열 TAQFAY (서열식별번호: 13)를 포함하는 CDRH3;

및/또는

아미노산 서열 ENIYGG (서열식별번호: 14)를 포함하는 CDRL1;

아미노산 서열 GAT (서열식별번호: 15)를 포함하는 CDRL2; 및

하기로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3: QNVLRSPFT (서열식별번호: 16); QNVLSRHPG (서열식별번호: 17); 또는 QNVLSSRPG (서열식별번호: 18).

본 발명의 정제 방법, 치료 방법, 조성물, 키트 및 용도의 한 실시양태에서, 항-CTLA4 항체는 8D2/8D2 (RE) 또는 그의 변이체, 8D2H1L1 또는 그의 변이체, 8D2H2L2 또는 그의 변이체, 8D3H3L3 또는 그의 변이체, 8D2H2L15 또는 그의 변이체, 또는 8D2H2l17 또는 그의 변이체이다.

본 발명의 정제 방법, 치료 방법, 조성물, 키트 및 용도의 또 다른 실시양태에서, 항-CTLA4 항체는 8D2/8D2 (RE)의 변이체, 8D2H1L1의 변이체, 8D2H2L2의 변이체, 8D2H2L15의 변이체, 또는 8D2H2L17의 변이체이고, 여기서 VH 쇄 아미노산 서열에서 위치 18의 메티오닌 (Met)은 독립적으로 류신 (Leu), 발린 (Val), 이소류신 (Ile) 또는 알라닌 (Ala)으로부터 선택된 아미노산으로 치환된다. 본 발명의 실시양태에서, 항-CTLA4 항체는 상기 표에 기재된 바와 같은 8D2H2L2 변이체 1의 서열을 포함한다.

본 발명의 정제 방법, 치료 방법, 조성물, 키트 및 용도의 또 다른 실시양태에서, 항-CTLA4 항체는 서열식별번호: 32에 기재된 전체 중쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호: 33에 기재된 전체 경쇄 서열을 갖는 8D2H2L2 변이체 1이다.

본 발명의 정제 방법, 치료 방법, 조성물, 키트 및 용도의 한 실시양태에서, 항-CTLA4 항체는 2018년 3월 1일에 공개된 국제 출원 공개 번호 WO 2018/035710 A1에 개시된 바와 같이 기재된 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편 중 임의의 것이다.

본 발명의 정제 방법, 치료 방법, 조성물, 키트 및 용도의 또 다른 실시양태에서, 항-CTLA-4 항체는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이며, 이는 8D2/8D2 (RE) 또는 그의 변이체, 8D2H1L1 또는 그의 변이체, 8D2H2L2 또는 그의 변이체, 8D3H3L3 또는 그의 변이체, 8D2H2L15 또는 그의 변이체, 8D2H2L17을 포함하여, 인간 CTLA-4에 대한 결합을 위해 교차-경쟁하거나 인간 CTLA-4의 동일한 에피토프 영역에 결합하거나 상기 기재된 항체 중 임의의 것이다.

일 실시양태에서, 조성물은 (i) 약 10 mg/ml 내지 약 200 mg/ml의 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 약 5 mM 내지 약 20 mM 완충제; 약 6% 내지 8% 중량/부피 (w/v) 비환원당; 약 0.01% 내지 약 0.10% 비이온성 계면활성제; 및 약 1 mM 내지 약 20 mM 항산화제를 포함하고, 여기서 PLBL2, LPLA2 및 LPL의 수준은 ≤ 1 ng/ml CTLA4 항체이다.

또 다른 실시양태에서, 조성물은 하기를 포함한다: (i) 약 10 mg/ml 내지 약 200 mg/ml의 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 약 5 mM 내지 약 20 mM 완충제; 약 6% 내지 8% 중량/부피 (w/v) 비환원당; 약 0.01% 내지 약 0.10% 비이온성 계면활성제; 및 약 1 mM 내지 약 20 mM 항산화제; 잔류량의 숙주 세포 리파제, 여기서 잔류량의 숙주 세포 리파제는 2 ppm 미만이다.

일 실시양태에서, 조성물은 하기를 포함한다: (i) 약 10 mg/ml 내지 약 200 mg/ml의 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편; (ii) 약 5 mM 내지 약 20 mM 완충제; (iii) 약 6% 내지 8% 중량/부피 (w/v) 비환원당; (iv) 약 0.01% 내지 약 0.10% 비이온성 계면활성제; 및 (v) 약 1 mM 내지 약 20 mM 항산화제, 여기서 PLBL2, LPLA2 및 LPL의 수준은 ≤ 1 ng/mg이다.

추가 실시양태에서, 비이온성 계면활성제는 PS-80이다.

또 다른 실시양태에서, 조성물은 하기를 포함한다: (i) 약 10 mg/ml 내지 약 200 mg/ml의 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편; (ii) 약 5 mM 내지 약 20 mM 완충제; (iii) 약 6% 내지 8% 중량/부피 (w/v) 비환원당; (iv) 약 0.01% 내지 약 0.10% 폴리소르베이트 80 (PS80); 및 (v) 약 1 mM 내지 약 20 mM 항산화제, 여기서 PLBL2, LPLA2 및 LPL의 수준은 ≤ 1 ng/mg이고, 평균 PS80 분해는 6개월 후 10% 이하이다. 또 다른 실시양태에서, PS-80 분해는 일반적인 저장 조건 하에 물리적으로, 화학적으로 및/또는 생물학적으로 안정한 상태로 남아있는 PS-80의 상태를 지칭한다.

또 다른 실시양태에서, PS-80 분해는 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 갖는 HPLC 시스템에서 질량 분석법 (MS), 액체 크로마토그래피-질량 분석법 (LCMS), 또는 고체상 추출 (SPE)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 방법을 사용하여 무손상 PS-80 분자의 양 및/또는 분해된 생성물의 양에 의해 측정될 수 있다.

일 실시양태에서, 조성물은 하기를 포함한다: (i) 약 10 mg/ml 내지 약 200 mg/ml의 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편; (ii) 약 5 mM 내지 약 20 mM 완충제; (iii) 약 6% 내지 8% 중량/부피 (w/v) 비환원당; (iv) 약 0.01% 내지 약 0.10% 비이온성 계면활성제; 및 (v) 약 1 mM 내지 약 20 mM 항산화제, 여기서 PLBL2의 수준은 ≤ 1 ng/mg이다.

일 실시양태에서, 조성물은 하기를 포함한다: (i) 약 10 mg/ml 내지 약 200 mg/ml의 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편; (ii) 약 5 mM 내지 약 20 mM 완충제; (iii) 약 6% 내지 8% 중량/부피 (w/v) 비환원당; (iv) 약 0.01% 내지 약 0.10% PS80; 및 (v) 약 1 mM 내지 약 20 mM 항산화제, 여기서 PLBL2의 수준은 ≤ 1 ng/mg이고, 평균 PS80 분해는 6개월 후 10% 이하이다. 일 실시양태에서, 조성물은 하기를 포함한다: (i) 약 10 mg/ml 내지 약 200 mg/ml의 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편; (ii) 약 5 mM 내지 약 20 mM 완충제; (iii) 약 6% 내지 8% 중량/부피 (w/v) 비환원당; (iv) 약 0.01% 내지 약 0.10% PS80; 및 (v) 약 1 mM 내지 약 20 mM 항산화제, 여기서 PLBL2의 수준은 ≤ 1 ng/mg이고, 평균 PS80 분해는 6개월 후 10% 이하이고, 여기서 PS80 분해는 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 갖는 HPLC 시스템에서 질량 분석법 (MS), 액체 크로마토그래피-질량 분석법 (LCMS), 또는 고체상 추출 (SPE)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 방법을 사용하여 무손상 PS-80 분자의 양 및/또는 분해된 생성물의 양에 의해 측정된다.

일 실시양태에서, 조성물은 하기를 포함한다: (i) 약 50 mg/ml의 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편; (ii) 약 10 mM 완충제; (iii) 약 7% 중량/부피 (w/v) 비환원당; (iv) 약 0.02% 비이온성 계면활성제; 및 (v) 약 1 mM 내지 약 20 mM 항산화제, 여기서 PLBL2의 수준은 ≤ 1 ng/mg이다.

일 실시양태에서, 조성물은 하기를 포함한다: (i) 약 50 mg/ml의 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편; (ii) 약 10 mM 완충제; (iii) 약 7% 중량/부피 (w/v) 비환원당; (iv) 약 0.02% PS80; 및 (v) 약 1 mM 내지 약 20 mM 항산화제, 여기서 PLBL2의 수준은 ≤ 1 ng/mg이고, 평균 PS80 분해는 6개월 후 10% 이하이다.

한 실시양태에서, 제형은 4.5 내지 6.5의 pH를 갖는다. 특정 실시양태에서, 제형의 pH는 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.0이다. 추가 실시양태에서, 제형의 pH는 약 pH 5.3 내지 약 pH 5.8이다. 또 다른 실시양태에서, pH는 5.3이다. 또 다른 실시양태에서, pH는 5.4이다. 한 실시양태에서, pH는 5.5이다. 한 실시양태에서, pH는 5.6이다. 추가 실시양태에서, pH는 5.7이다. 일 실시양태에서, pH는 5.8이다.

제형의 한 실시양태에서, 완충제는 L-히스티딘 완충제 또는 아세트산나트륨 완충제이고, 비환원당은 수크로스이고, 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 80이고, 항산화제는 메티오닌 또는 그의 제약상 허용되는 염이다. 한 실시양태에서, 항산화제는 L-메티오닌이다. 또 다른 실시양태에서, 항산화제는 L-메티오닌의 제약상 허용되는 염, 예컨대, 예를 들어, 메티오닌 HCl이다.

한 실시양태에서, 조성물 중 PS-80 농도는 영점시간 결과와 비교하여 ± 0.02 mg/mL로 유지된다.

또 다른 실시양태에서, 상기 기재된 방법 중 임의의 것에 따른 조성물, 여기서 조성물은 환자에게 투여된다.

IV. 도면의 간단한 설명
도 1a-1f는 전형적인 AEX 조건의 범위에 대한 PLBL2 (도 1a-1c) 또는 LPLA2 (도 1d-1f) log K_P 값을 보여준다. 도 1a 및 도 1d는 트리스 및 아세테이트 완충제에 로딩하기 위한 전형적인 조건을 보여준다. 도 1b 및 도 1e는 트리스 완충제로 평형화 또는 세척하기 위한 전형적인 조건을 보여준다. 도 1c 및 도 1f는 포스페이트 완충제로 평형화 또는 세척하기 위한 조건을 보여준다.
도 2a-2c는 전형적인 CEX 조건의 범위에 대한 PLBL2 (도 2a 및 2b) 또는 LPLA2 (도 2c) log K_P 값을 보여준다. 도 2a 및 도 2c는 주로 염을 변경함으로써 결합을 조정하기 위한 조건을 보여준다. 도 2b는 주로 pH를 변경함으로써 결합을 조정하기 위한 조건을 보여준다.
도 3은 염 농도에 의한 결합의 조정을 위한 전형적인 HIC 조건의 범위에 대한 PLBL2 또는 LPLA2 log K_P 값을 보여준다.
도 4a 및 4b는 다중모드 크로마토그래피 수지에 대해 전형적인 pH 및 염 조건의 범위에 대한 PLBL2 log K_P 값을 보여준다. 도 4a는 다중모드 음이온 교환기, 캅토 어드히어(Capto adhere)에 대한 조건을 보여준다. 도 4b는 다중모드 양이온 교환기, 캅토 MMC(Capto MMC)에 대한 조건을 보여준다.
도 5는 AEX 수지에 결합된 mAb3가 거의 없음을 나타내는 특정된 조건 하에 플로우스루 모드로 작동되는 AEX 프로세스의 크로마토그램을 보여준다.
도 6a-6c는 CEX 크로마토그래피를 위한 전형적인 pH 및 염 조건의 범위에서 mAb3 및 PLBL2 (도 6a 및 6b) 또는 mAb3 및 LPLA2 (도 6c)에 대한 log α 분리 인자 값을 보여준다. 도 6a 및 6c는 주로 염 농도를 변경함으로써 결합이 조정되는 최적화 분리 조건을 나타낸다. 도 6b는 주로 pH를 변경함으로써 결합이 조정되는 최적화 조건을 나타낸다. 흑색 박스는 분리가 최대화된 영역을 나타낸다.
도 7은 PLBL2, LPLA2, 및 2개의 상이한 mAb, mAb2 및 mAb3에 대한 HIC 수지에 대한 log K_P 값의 비교를 보여준다. mAb3은 PLBL2 및 LPLA2에 대한 매우 유사한 결합을 갖지만, mAb2는 mAb3, PLBL2 및 LPLA2보다 약하게 결합되어, mAb3보다 mAb2로부터 PLBL2 및 LPLA2의 더 큰 분리 잠재성을 제공한다.
도 8a 및 8b는 다중모드 크로마토그래피 수지에 대한 전형적인 작동 조건에서 mAb3 및 PLBL2에 대한 log α 값을 보여준다. 도 8a는 다중모드 음이온 교환기, 캅토 어드히어에 대한 최적화 분리 조건을 나타낸다. 도 8b는 다중모드 양이온 교환기, 캅토 MMC에 대한 최적화 분리 조건을 나타낸다. 흑색 박스는 분리가 최대화된 영역을 나타낸다.
도 9는 잔류 HCP (ng/mg)에 대한 모델 파라미터 (인자)의 랭킹된 통계적 유의성을 요약하는 파레토(Pareto) 차트를 보여준다.
도 10a-10c는 26주에 걸쳐 5℃ (도 10a), 25℃ (도 10b), 및 40℃ (도 10c)에서 플라시보, mAb4 음이온 교환 크로마토그래피 (AEX) 풀 원료의약품 (AEXP DS), 및 mAb4 양이온 교환 크로마토그래피 (CEX) 풀 원료의약품 (CEXP DS)의 PS-80 농도를 보여준다.
도 11a 및 11b는 2-칼럼 크로마토그래피 (단백질 A 및 AEX, 도 11a) 또는 3-칼럼 크로마토그래피 (단백질 A, AEX 및 CEX, 도 11b)에 의해 정제된 mAb4를 함유하는 제형에서 PS80 분해의 백분율을 보여준다.
도 12는 mAb4에 대한 잔류 리파제를 완전히 제거하기 위해 3-칼럼 크로마토그래피가 필요함을 나타낸다.
도 13은 24주 및 16주 동안 5 ± 3℃ 및 25 ± 3℃에서 조합된 CEXP 실행에 대해 수행된 PS-80 안정성 연구를 보여준다.
도 14는 AEX에 대한 PLBL2 스파이크 결과를 보여준다.
도 15는 CEX에 대한 PLBL2 스파이크 결과를 보여준다.
도 16은 AEX에 대한 LPL 스파이크 결과를 보여준다.
도 17은 CEX에 대한 LPL 스파이크 결과를 보여준다.
도 18은 CEX에 대한 염기성 변이체 스파이크 결과를 보여준다.
도 19는 CEX에 대한 총 고분자량 종 스파이크 결과를 보여준다. CEX에 대한 총 HMW 수용력은 대략 10.8%였다.

V. 발명의 상세한 설명

1. 정의

특정 기술 및 과학 용어는 아래에 구체적으로 정의되어 있다. 이 문서의 다른 곳에서 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 다른 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 관련된 기술분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 의미를 갖는다. 충돌하는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선할 것이다.

본원에서 교환가능하고 사용된 바와 같은 용어 "작동(operating) 조건", "작동(operation) 조건", "프로세싱 조건" 또는 "프로세스 조건"은 크로마토그래피 프로세스를 작동하기 위한 조건을 지칭한다. 작동 조건은 평형화 조건, 로딩 조건, 세척 조건 및/또는 용리 조건 등일 수 있다. 작동 조건은 크로마토그래피 수지의 유형, 수지 백본, 수지 리간드, 작동 용액의 pH, 작동 용액의 조성, 작동 용액의 각 성분의 농도, 작동 용액의 전도도, 작동 용액의 이온 강도, 작동 용액의 양이온 강도, 작동 용액의 음이온 강도, 또는 2개 이상의 상기 인자의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

용어 "작동 용액"은 크로마토그래피 프로세스를 작동하는데 사용되는 용액을 지칭한다. 작동 용액은 평형화 용액, 로딩 또는 공급 용액, 세척 용액 및/또는 용리 용액 등일 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "분배 계수" 또는 "K_P"는 크로마토그래피 수지에 결합된 단백질의 농도 (Q) 대 특정 작동 조건 하에 평형에서 용액에 남아있는 단백질의 농도 (C)의 비율을 지칭한다. 특정 단백질에 대한 분배 계수는 하기와 같이 계산될 수 있다: K_P = Q/C.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "분리 인자" 또는 "α"는 제1 단백질에 대한 분배 계수 (K_{P, 단백질 1}) 및 제2 단백질에 대한 분배 계수 (K_{P, 단백질 2})의 비율을 지칭한다. 분리 인자는 특정 작동 조건 하에 2개의 단백질 간의 크로마토그래피 수지의 선택성을 정량화한다. 작동 조건 하에 크로마토그래피 수지를 통해 2개의 단백질의 분리 정도를 예측하는데 사용될 수 있다. 2개의 단백질 간의 분리 인자는 하기와 같이 계산될 수 있다: α = K_{P, 단백질 1}/ K_{P, 단백질 2}; 또는 log α = log K_{P, 단백질 1} - log K_{P, 단백질 2}.

본원에서 사용된 바와 같은 "생산 단백질"은 바이오프로세스의 의도된 생성물인 임의의 단백질을 지칭한다. 생산 단백질의 비제한적인 예는 치료 단백질, 항체 (예를 들어, 모노클로날 항체, 이중특이적 항체, 또는 그의 항원-결합 단편 등), 호르몬, 시토카인, 효소, 성장 인자, 응고 인자, 또는 그의 면역접합체, 그의 융합 단백질, 또는 그의 단편을 포함한다. 생산 단백질의 한 예는 항-CTLA4 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

본원에서 사용된 바와 같은 "치료 단백질"은 동물 (예를 들어, 인간, 소, 말, 개 등)에서 치료 효과를 갖는 임의의 단백질을 지칭한다. 치료 단백질의 비제한적인 예는 항체 (예를 들어, 모노클로날 항체, 이중특이적 항체, 또는 그의 항원-결합 단편 등), 호르몬, 시토카인, 효소, 성장 인자, 응고 인자, 또는 그의 면역접합체, 그의 융합 단백질, 또는 그의 단편을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같은 "리파제"는 일반적으로 숙주 세포 리파제 및 관련 단백질/효소 (차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 발현 시스템의 경우: PLBL2, LPL, LPLA2, LP-PLA2 및 LAL 포함)를 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같은 "용리액"은 크로마토그래피를 통해 통과하는 액체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 용리액은 로딩 용액의 플로우스루이다. 다른 실시양태에서, 용리액은 크로마토그래피를 통해 통과하는 용리 용액 및 크로마토그래피로부터 용리된 임의의 추가 구성성분을 포함한다.

크로마토그래피 수지와 함께 사용될 때 "혼합 모드" 또는 "다중모드"는 수지가 하나 초과의 모드, 기능 또는 메커니즘, 예를 들어 이온 교환 및 소수성 상호작용에 의해 분자를 분리할 수 있음을 의미한다. 일부 실시양태에서, 혼합 모드 또는 다중모드 크로마토그래피 수지는 양이온 교환 및 소수성 상호작용 둘 모두에 의해 분자를 분리할 수 있다. 다른 실시양태에서, 혼합 모드 또는 다중모드 크로마토그래피 수지는 음이온 교환 및 소수성 상호작용 둘 모두에 의해 분자를 분리할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같은 "폴리소르베이트-80 안정성" 또는 "PS-80 안정성"은 일정 기간에 걸쳐 (예를 들어, 1주, 1개월, 6개월, 1년, 2년 등) 일반적인 저장 조건 하에 (예를 들어, 5℃ ± 3℃, 25℃ ± 3℃, 60% ± 5% 상대 습도 (RH), 40℃ ± 2℃, 75% ± 5% 상대 습도 (RH)) 물리적으로, 화학적으로 및/또는 생물학적으로 안정한 상태로 남아있는 PS-80의 상태를 지칭한다. PS-80 안정성은 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 갖는 HPLC 시스템에서 질량 분석법 (MS), 액체 크로마토그래피-질량 분석법 (LCMS), 또는 고체상 추출 (SPE)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 방법을 사용하여 무손상 PS-80 분자의 양 및/또는 분해된 생성물의 양에 의해 측정될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같은 "모노클로날 항체" 또는 "mAb" 또는 "Mab"는 실질적으로 균질한 항체의 집단을 지칭하며, 즉, 집단을 구성하는 항체 분자는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 아미노산 서열이 동일하다. 수식어 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 수득되는 항체의 특징을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 개시내용에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al. (1975) Nature 256: 495]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조). "모노클로날 항체"는 또한 예를 들어 문헌 [Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628] 및 [Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597]에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 또한, 문헌 [Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731]을 참조한다.

일반적으로, 기본 항체 구조 단위는 사량체를 포함한다. 각 사량체는 폴리펩티드 쇄의 2개의 동일한 쌍을 포함하며, 각 쌍은 하나의 "경쇄" (약 25 kDa) 및 하나의 "중쇄" (약 50-70 kDa)를 갖는다. 각 쇄의 아미노-말단 부분은 항원 인식을 주로 담당하는 약 100 내지 110개 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 중쇄의 카르복시-말단 부분은 이펙터 기능을 주로 담당하는 불변 영역을 정의할 수 있다. 전형적으로, 인간 경쇄는 카파 및 람다 경쇄로 분류된다. 더욱이, 인간 중쇄는 전형적으로 뮤, 델타, 감마, 알파 또는 엡실론으로 분류되며, 항체의 이소타입을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 정의한다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결되고, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. 일반적으로, 문헌 [Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)]을 참조한다.

각 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 항체 결합 부위를 형성한다. 그러므로, 일반적으로, 무손상 항체는 2개의 결합 부위를 갖는다. 이중기능적 또는 이중특이적 항체를 제외하고, 2개의 결합 부위는 일반적으로 동일하다. 전형적으로, 중쇄 및 경쇄 둘 모두의 가변 도메인은 상보성 결정 영역 (CDR)이라고도 하는 3개의 초가변 영역을 포함하며, 이는 상대적으로 보존된 프레임워크 영역 (FR) 내에 위치된다. CDR은 일반적으로 프레임워크 영역에 의해 정렬되어, 특이적 에피토프에 대한 결합을 가능하게 한다. 일반적으로, N-말단에서 C 말단까지, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인은 모두 FR1, CDR1, FR2 , CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각 도메인에 대한 아미노산의 할당은 일반적으로 문헌 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, et al.; National Institutes of Health, Bethesda, Md. ; 5th ed.; NIH Publ. No. 91-3242 (1991)]; [Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32:1-75]; [Kabat, et al., (1977) J. Biol. Chem. 252:6609-6616]; [Chothia, et al., (1987) J Mol. Biol. 196:901-917] 또는 [Chothia, et al., (1989) Nature 342:878-883]의 정의에 따른다.

"항-CTLA-4 항체"는 인간 B7 수용체와 CTLA-4의 상호작용을 방해하도록 인간 CTLA-4에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 의미한다. B7에 결합 후, CTLA4는 마우스 및 인간 T 세포의 활성화를 억제하여 T 세포의 활성화에서 음성 조절 역할을 할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 구체적으로 언급되지 않는 한, 상기 B7은 B7-1 및/또는 B7-2를 지칭하고; 이들의 특이적 단백질 서열은 관련 기술분야에 공지된 서열을 지칭한다. 문헌 또는 진뱅크(GenBank)에 개시된 서열, 예를 들어, B7-1 (CD80, NCBI 유전자 ID: 941), B7-2 (CD86, NCBI 유전자 ID: 942)을 참조할 수 있다. 항-CTLA4 항체는 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있으며, 인간 불변 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 불변 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직한 실시양태에서, 인간 불변 영역은 IgG1 또는 IgG4 불변 영역이다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 단편은 Fab, Fab'-SH, F(ab')2, scFv 및 Fv 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

"CDR" 또는 "CDR들"은 달리 표시되지 않는 한 카바트 넘버링 시스템을 사용하여 정의된 면역글로불린 가변 영역의 상보성 결정 영역(들)을 의미한다.

"포함하는(comprising)" 또는 변형, 예컨대 "포함하다(comprise)", "포함하다(comprises)" 또는 "로 구성된(comprised of)"은 포괄적인 의미로 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐 사용되며, 즉, 언급된 특징의 존재를 특정하지만, 문맥이 명시적 언어 또는 필요한 함축으로 인해 달리 요구하지 않는 한, 본 발명의 실시양태 중 임의의 것의 작동 또는 유용성을 실질적으로 향상시킬 수 있는 추가 특징의 존재 또는 첨가를 배제하지 않는다.

수치로 정의된 파라미터 (예를 들어, pH, 농도 등)를 변형시키기 위해 사용될 때 "약"은 파라미터가 해당 파라미터에 대한 언급된 수치 값 또는 범위의 20% 이내, 15% 이내, 10% 이내, 9% 이내, 8% 이내, 7% 이내, 6% 이내, 5% 이내, 4% 이내, 3% 이내, 2% 이내, 1% 이내, 또는 그 미만임을 의미하며; 적절한 경우, 언급된 파라미터는 가장 가까운 정수로 반올림될 수 있다.

첨부된 청구범위를 포함하여 본원에서 사용된 바와 같이, "하나"와 같은 단어의 단수 형태는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 이들의 상응하는 복수 지시대상을 포함한다. 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함할 수 있고, 복수 용어는 단수를 포함할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "적어도 하나"의 항목 또는 "하나 이상"의 항목 각각은 목록으로부터 선택된 단일 항목 뿐만 아니라 목록으로부터 선택된 2개 이상의 항목의 혼합물을 포함한다.

용어 "예를 들어(e.g.)" 또는 "예를 들어(for example)" 뒤에 오는 임의의 예(들)는 완전하거나 제한적인 것을 의미하지 않는다.

명시적으로 반대로 언급되지 않는 한, 본원에 인용된 모든 범위는 포괄적이며; 즉, 범위는 범위의 상한 및 하한에 대한 값 뿐만 아니라 그 사이의 모든 값을 포함한다. 예로서, 본원에 기재된 온도 범위, 백분율, 등가물의 범위 등은 범위의 상한 및 하한 및 그 사이의 연속체 내의 임의의 값을 포함한다. 모든 범위는 또한 반드시 명시적으로 설명되지는 않지만 포함된 모든 하위 범위를 포함하도록 의도된다. 예를 들어, pH 4.0-5.0의 범위는 pH 4.0, 4.1, 4.13, 4.2, 4.1-4.6, 4.3-4.4, 및 5.0을 포함하도록 의도된다. 또한, 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "또는"은 적절한 경우 조합될 수 있는 대안을 나타내며; 즉, 용어 "또는"은 별도로 나열된 각 대안 뿐만 아니라 이들의 조합을 포함한다.

용어 "환자" (대안적으로 본원에서 "대상체" 또는 "개체"로 지칭됨)는 본 발명의 조성물로 치료될 수 있는 포유동물 (예를 들어, 래트, 마우스, 개, 고양이, 토끼), 가장 바람직하게는 인간을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 환자는 성인 환자이다. 다른 실시양태에서, 환자는 소아 환자이다.

본 개시내용의 측면 또는 실시양태가 마쿠쉬 그룹 또는 대안의 다른 그룹화의 관점에서 설명되는 경우, 본 개시내용은 전체로서 나열된 전체 그룹 뿐만 아니라 그룹의 각 구성원을 개별적으로 포함하고 주요 그룹의 모든 가능한 서브그룹을 포함하지만, 또한 주요 그룹에는 그룹 구성원 중 하나 이상이 없다. 본 개시내용은 또한 청구범위에서 임의의 그룹 구성원 중 하나 이상을 명시적으로 배제하는 것을 예상한다.

예시적인 방법 및 재료가 본원에 설명되어 있지만, 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 또한 본 개시내용의 실시 또는 테스트에서 사용될 수 있다. 재료, 방법 및 예는 예시일 뿐이며 제한하려는 의도가 아니다.

2. 크로마토그래피 프로세스

본원에 제공된 다양한 방법은 불순물로부터 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 분리를 위해 본원에 개시되거나 관련 기술분야의 통상의 기술자가 이해하는 임의의 크로마토그래피 프로세스와 함께 사용될 수 있다. 크로마토그래피 프로세스의 비제한적인 예는 IEX, AEX, CEX, HIC, 혼합 모드 AEX, 혼합 모드 CEX, 친화성, 및 수산화인회석 크로마토그래피 (HAC) 프로세스 등을 포함한다. 한 실시양태에서, 크로마토그래피 프로세스는 IEX 크로마토그래피 프로세스이다. 또 다른 실시양태에서, 크로마토그래피 프로세스는 AEX 크로마토그래피 프로세스이다. 또 다른 실시양태에서, 크로마토그래피 프로세스는 CEX 크로마토그래피 프로세스이다. 또 다른 실시양태에서, 크로마토그래피 프로세스는 HIC 크로마토그래피 프로세스이다. 한 실시양태에서, 크로마토그래피 프로세스는 혼합 모드 IEX 크로마토그래피 프로세스이다. 또 다른 실시양태에서, 크로마토그래피 프로세스는 혼합 모드 AEX 크로마토그래피 프로세스이다. 또 다른 실시양태에서, 크로마토그래피 프로세스는 혼합 모드 CEX 크로마토그래피 프로세스이다. 또 다른 실시양태에서, 크로마토그래피 프로세스는 친화성 크로마토그래피 프로세스이다. 한 실시양태에서, 크로마토그래피 프로세스는 단백질 A 크로마토그래피 프로세스이다. 또 다른 실시양태에서, 크로마토그래피 프로세스는 단백질 G 친화성 크로마토그래피 프로세스이다. 또 다른 실시양태에서, 크로마토그래피 프로세스는 고정화 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC) 프로세스이다. 또 다른 실시양태에서, 크로마토그래피 프로세스는 HAC 프로세스이다.

IEX 크로마토그래피는 분자의 순 전하에 기초하여 분자를 분리한다. IEX 크로마토그래피 수지에서 반대로 하전된 리간드 그룹에 대해 반대 이온 및 하전된 관심 분자 간의 경쟁 결과로 분리가 발생한다. IEX 수지에 대한 분자의 결합 강도는 작동 조건, 예컨대 pH 및 이온 강도에 의해 영향을 받는 분자의 순 전하에 의존한다. IEX 수지는 AEX 수지 및 CEX 수지를 포함한다. AEX 수지는 치환체, 예컨대 디에틸아미노에틸 (DEAE), 트리메틸아미노에틸 (TMAE), 4차 아미노에틸 (QAE) 및 4차 아민 (QA) 기를 함유할 수 있다. CEX 수지는 치환체, 예컨대 카르복시메틸 (CM), 술포에틸 (SE), 술포프로필 (SP), 포스페이트 (P) 및 술포네이트 (S)를 함유할 수 있다. 셀룰로스 IEX 수지, 예컨대 DE23, DE32, DE52, CM-23, CM-32 및 CM-52는 영국 켄트주 메이드스톤 소재의 와트만 리미티드(Whatman Ltd.)로부터 입수가능하다. 세파덱스-기반 및 가교된 IEX 수지가 또한 공지되어 있다. 예를 들어, DEAE-, QAE-, CM-, 및 SP-세파덱스, 및 DEAE-, Q-, CM- 및 S-세파로스, 및 세파로스는 모두 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재의 지이 헬스케어(GE Healthcare)로부터 입수가능하다. 또한, DEAE 및 CM 유래 에틸렌 글리콜-메타크릴레이트 공중합체, 예컨대 토요펄(TOYOPEARL)™ DEAE-650S 또는 M 및 토요펄™ CM-650S 또는 M은 둘 모두 미국 펜실베이니아주 필라델피아 소재의 토소 하스 캄파니(Toso Haas Co.)로부터 입수가능하다. 포로스(POROS)™ HS, 포로스™ HQ, 포로스™ XS는 미국 매사추세츠주 월섬 소재의 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)으로부터 입수가능하다.

HIC 크로마토그래피는 분자의 소수성에 기초하여 분자를 분리한다. 관심 분자의 소수성 영역은 소수성 상호작용을 통해 HIC 수지에 결합한다. 상호작용의 강도는 작동 조건, 예컨대 pH, 이온 강도 및 염 농도에 의존한다. 일반적으로, HIC 수지는 소수성 리간드 (예를 들어, 알킬 또는 아릴 기)가 커플링된 기본 매트릭스 (예를 들어, 가교된 아가로스 또는 합성 공중합체 재료)를 함유한다. HIC 수지의 비제한적인 예는 페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우(FAST FLOW)™ (파마시아 LKB 바이오테크놀로지, AB(Pharmacia LKB Biotechnology, AB), 스웨덴); 페닐 세파로스™ 하이 퍼포먼스(High Performance) (파마시아 LKB 바이오테크놀로지, AB, 스웨덴); 옥틸 세파로스™ 하이 퍼포먼스 (파마시아 LKB 바이오테크놀로지, AB, 스웨덴); 프락토겔(Fractogel)™ EMD 프로필 또는 프락토겔™ EMD 페닐 (이. 메르크(E. Merck), 독일); 마크로-프렙(MACRO-PREP)™ 메틸 또는 마크로-프렙™ t-부틸 지지체 (바이오-라드(Bio-Rad), 미국 캘리포니아주 소재); WP HI-프로필 (C3)™ (제이. 티. 베이커(J. T. Baker), 미국 뉴저지주 소재); 토요펄™ 에테르, 페닐 또는 부틸 (토소 하스, 미국 펜실베이니아주 소재); 및 토소-부틸-650M (토소 코포레이션(Tosoh Corp.), 일본 도쿄 소재)을 포함한다.

HAC 크로마토그래피는 매트릭스 및 리간드 모두로 화학식 [Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂]의 불용성 히드록실화된 인산칼슘을 사용한다. HAC 수지의 관능기는 양으로 하전된 칼슘 이온 (C-부위) 및 음으로 하전된 포스페이트 기 (P-부위)의 쌍을 포함한다. C-부위는 단백질 표면 상의 카르복실레이트 잔기와 상호작용할 수 있는 반면, P-부위는 염기성 단백질 잔기와 상호작용할 수 있다. 단백질 및 HAC 수지 간의 결합 강도는 pH, 이온 강도, 용액의 조성, 조성물의 각 구성성분의 농도, pH의 구배, 구성성분 농도의 구배 등을 포함하는 작동 조건에 의존한다. 다양한 HAC 수지, 예컨대 CHT™ 세라믹 수산화인회석 및 CFT™ 세라믹 플루오린화인회석은 상업적으로 입수가능하다.

친화성 크로마토그래피는 관심 분자 및 수지의 관능기 간의 고도로 특이적인 상호작용, 예컨대 항원 및 항체, 효소 및 기질, 수용체 및 리간드, 또는 단백질 및 핵산 간의 상호작용 등에 기초하여 분자를 분리한다. 일부 일반적으로 사용되는 친화성 크로마토그래피 수지는 항체를 정제하기 위한 단백질 A 또는 단백질 G 수지, 비오틴/아비딘 및 이들의 유도체를 정제하기 위한 아비딘 비오틴 수지, GST-태그부착된 재조합 단백질을 정제하기 위한 글루타티온 수지, 혈장 응고 단백질을 분리하기 위한 헤파린 수지, 금속 이온과 특이적으로 상호작용하는 단백질을 정제하기 위한 IMAC 수지 등을 포함한다. 각 친화성 크로마토그래피의 작동 조건은 상호작용 메커니즘 및 상호작용에 영향을 미치는 인자에 의존한다. 상업용 친화성 크로마토그래피 수지는 맙셀렉트 슈어(MabSelect Sure), 우노스피어(UNOsphere) SUPrA™, 아피-겔(Affi-Gel)®, 및 아피-프렙(Affi-Prep)®을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

특정 실시양태에서, 본원에서 사용된 크로마토그래피 수지는 하나 초과의 기능 또는 메커니즘에 기초하여, 즉, 혼합 모드로 분자를 분리할 수 있다. 혼합 모드는 상기 기재되거나 관련 기술분야의 통상의 기술자가 이해하는 임의의 2개 이상의 기능 또는 메커니즘의 조합, 예컨대 IEX 및 HIC의 조합 (예를 들어, AEX/HIC 또는 CEX/HIC), AEX 및 CEX의 조합 (AEX/CEX), 또는 HIC, AEX 및 CEX의 조합 (HIC/AEX/CEX) 등일 수 있다. 예시적인 혼합 모드 크로마토그래피 수지는 오민팩(OminPac) PCX-500, 프라임셉(Primesep), 오벨리스크(Obelisc) R, 오블리스크(Oblisc) N, 어클레임 트리니티(Acclaim Trinity) P1, 어클레임 트리니티 P2, 캅토 어드히어(Capto Adhere), 캅토 어드히어 임프레스(Impres), 캅토 MMC, 캅토 MMC 임프레스, 캅토 코어 700, PPA 하이퍼셀(Hypercel), HEA 하이퍼셀, MEP 하이퍼셀, 에쉬무노(Eshmuno) HCX, 토요펄 MX-Trp-650M, 누비아(Nuvia) C 프라임, CHT 유형 I, 및 CHT 유형 II를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

3. 분배 계수 (K_P) 및 분리 인자 (α)

분배 계수 (K_P) 및 분리 인자 (α)는 크로마토그래피 프로세스의 작동 조건에 특이적인 두 가지 열역학적 파라미터이며, 이는 작동 조건 하에 프로세스를 통해 달성될 수 있는 분리를 정량화하는데 사용될 수 있다.

분배 계수 (K_P)는 공지된 액체 농도의 단백질 (또는 다른 관심 분자)을 공지된 부피의 크로마토그래피 수지와 혼합하고, 수지에 결합된 단백질 및 평형에서 액체에 남아있는 단백질의 비율을 계산함으로써 결정된다: K_P = q/c = [결합된]/[유리].

분배는 일반적으로 log K_P의 관점에서 보고되며, 이는 본원에 기재된 UV 방법을 사용하여 대략 0에서 2까지 정확하게 정량화될 수 있다. log K_P 스크리닝에 대한 일반적인 규칙은 하기와 같다:

log K_P ≥ 1.5, 수지에 대한 강한 결합;

log K_P < 1, 결합-및-용리 양식에 대해 용리가 예상되는 조건;

0.5 < log K_P < 1, 일부 결합을 나타낼 약한 상호작용 조건;

log K_P < 0.5, 결합이 거의 또는 전혀 없음.

상이한 종 간의 log K_P 값의 차이는 하기와 같이 분리 인자 (α)의 계산을 통해 종의 분리를 예측하는데 사용될 수 있다: α = K_{P, 단백질 1}/K_{P, 단백질 2}; log α = log K_{P, 단백질 1} - log K_{P, 단백질 2}, 여기서 log α는 0에서 멀어질수록 더 나은 분리를 나타낸다. 특정 실시양태에서, 0.2보다 큰 log α의 절대값은 두 종 간의 양호한 분리를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 0.3보다 큰 log α의 절대값은 두 종 간의 양호한 분리를 나타낸다. 다른 실시양태에서, 0.5보다 큰 log α의 절대값은 두 종 간의 양호한 분리를 나타낸다. 다른 실시양태에서, 1.0보다 큰 log α의 절대값은 두 종 간의 양호한 분리를 나타낸다.

4. HCP 및 생산 단백질

본원에 제공된 다양한 방법은 광범위하게 다양한 HCP 뿐만 아니라 광범위하게 다양한 생산 단백질에 적용된다.

HCP는 숙주 세포에서 발현되는 생산 단백질의 바이오프로세싱 동안 숙주 세포 (예를 들어, CHO 세포)로부터 유래된 임의의 내인성 단백질일 수 있다. HCP의 비제한적인 예는 구조적 단백질, 기능적 단백질, 분비된 단백질, 효소, 예컨대 리파제, 프로테이나제, 및 키나제 등을 포함한다. 일부 실시양태에서, HCP는 구조적 단백질이다. 특정 실시양태에서, HCP는 기능적 단백질이다. 다른 실시양태에서, HCP는 분비된 단백질이다. 또 다른 실시양태에서, HCP는 효소이다. 한 실시양태에서, HCP는 리파제이다. 또 다른 실시양태에서, HCP는 프로테이나제이다. 또 다른 실시양태에서, HCP는 키나제이다.

숙주 세포는 외인성 단백질을 발현하는데 사용되는 임의의 세포일 수 있다. 생물의약의 제조에 사용되는 일반적인 숙주 세포는 CHO 세포, 베이비 햄스터 신장 (BHK21) 세포, 뮤린 골수종 NS0 세포, 뮤린 골수종 Sp2/0 세포, 인간 배아 신장 293 (HEK293) 세포, 섬유육종 HT-1080 세포, PER.C6 세포, HKB-11 세포, CAP 세포, HuH-7 세포, 뮤린 C127 세포, 및 그의 자연적으로 생성되거나 유전적으로 변형된 변이체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 CHO 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 베이비 햄스터 신장 (BHK21) 세포이다. 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 뮤린 골수종 NS0 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 뮤린 골수종 Sp2/0 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 인간 배아 신장 293 (HEK293) 세포이다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 섬유육종 HT-1080 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 PER.C6 세포이다. 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 HKB-11 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 CAP 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 HuH-7 세포이다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 뮤린 C127 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 상기 숙주 세포의 자연적으로 생성된 변이체이다. 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 상기 숙주 세포의 유전적으로 변형된 변이체이다.

생산 단백질은 생물의약 제품을 생성할 목적으로 숙주 세포에서 발현되는 임의의 관심 단백질일 수 있다. 생산 단백질의 비제한적인 예는 치료 단백질, 모노클로날 항체, 호르몬, 시토카인, 성장 인자, 응고 인자, 효소, 그의 융합 단백질, 그의 면역접합체, 및 그의 단편을 포함한다. 특정 실시양태에서, 생산 단백질은 치료 단백질이다. 일부 실시양태에서, 생산 단백질은 모노클로날 항체이다. 다른 실시양태에서, 생산 단백질은 호르몬이다. 또 다른 실시양태에서, 생산 단백질은 시토카인이다. 또 다른 실시양태에서, 생산 단백질은 성장 인자이다. 특정 실시양태에서, 생산 단백질은 응고 인자이다. 일부 실시양태에서, 생산 단백질은 효소이다. 다른 실시양태에서, 생산 단백질은 상기 생산 단백질의 융합 단백질이다. 또 다른 실시양태에서, 생산 단백질은 상기 생산 단백질의 면역접합체이다. 또 다른 실시양태에서, 생산 단백질은 상기 생산 단백질의 단편이다.

일부 실시양태에서, 생산 단백질은 PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG3, TIM3, TIGIT, GITR, TNF-α, HER2, GPIIb/IIIa, CD52, PCSK9, IL-2Rα, BLyS, VEGF, 클로스트리디움 디피실레 독소 B, CD19, CD30, IL-1β, IL17Rα, PSMA, EGFR, IL-2R, IL-2Rβγ, CD38, RANKL, GD2, IL-4Rα, 보체 구성성분 5, CD20, SLAMF7, 다비가트란, IL-5, α-4 인테그린, PDGFRα, VEGFR1, VEGFR2, RSV의 F 단백질, IL-6, IL-6R, IL-12, IL-23, 및 CD33을 포함하나 이에 제한되지는 않는 항원에 특이적인 모노클로날 항체이다. 한 실시양태에서, 생산 단백질은 항-PD-1 모노클로날 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 생산 단백질은 항-CTLA-4 모노클로날 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 생산 단백질은 항-CTLA-4 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 생산 단백질은 항-LAG3 모노클로날 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 생산 단백질은 항-TIGIT 모노클로날 항체이다. 한 실시양태에서, 생산 단백질은 항-GITR 모노클로날 항체이다.

구체적인 실시양태에서, 항-PD-1 모노클로날 항체는 펨브롤리주맙이다. 또 다른 실시양태에서, 항-PD-1 모노클로날 항체는 니볼루맙이다. 또 다른 실시양태에서, 항-PD-1 모노클로날 항체는 피딜리주맙 (미국 특허 번호 7,332,582)이다. 또 다른 실시양태에서, 항-PD-1 모노클로날 항체는 AMP-514 (메디뮨 엘엘씨(MedImmune LLC), 미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재)이다. 또 다른 실시양태에서, 항-PD-1 모노클로날 항체는 PDR001 (미국 특허 번호 9,683,048)이다. 또 다른 실시양태에서, 항-PD-1 모노클로날 항체는 BGB-A317 (미국 특허 번호 8,735,553)이다. 또 다른 실시양태에서, 항-PD-1 모노클로날 항체는 MGA012 (매크로제닉스(MacroGenics), 미국 메릴랜드주 록빌 소재)이다.

한 실시양태에서, 항-LAG3 모노클로날 항체는 BMS-986016 (브리스톨-마이어스 스퀴브, 미국 뉴욕주 뉴욕 소재)이다. 또 다른 실시양태에서, 항-LAG3 모노클로날 항체는 REGN3767 (리제네론(Regeneron), 미국 뉴욕주 태리타운 소재)이다. 또 다른 실시양태에서, 항-LAG3 모노클로날 항체는 LAG525 (노바티스, 스위스 바젤 소재)이다. 또 다른 실시양태에서, 항-LAG3 모노클로날 항체는 GSK2813781 (글락소스미스클라인, 영국 브렌트포드 소재)이다.

한 실시양태에서, 항-TIGIT 모노클로날 항체는 BMS-986207 (브리스톨-마이어스 스퀴브, 미국 뉴욕주 뉴욕 소재)이다. 또 다른 실시양태에서, 항-TIGIT 모노클로날 항체는 OMP-313M32 (온코메드 파마슈티칼스(OncoMed Pharmaceuticals), 미국 캘리포니아주 레드우드 시티 소재)이다. 또 다른 실시양태에서, 항-TIGIT 모노클로날 항체는 MTIG7192A (RG6058로도 공지됨, 미국 공개 번호 2017/0088613)이다. 또 다른 실시양태에서, 항-TIGIT 모노클로날 항체는 PTZ-201 (포텐자 테라퓨틱스(Potenza Therapeutics), 미국 매사추세츠주 케임브리지 소재; ASP8374로도 공지됨, 아스텔라스 파마(Astellas Pharma), 일본 도쿄 소재)이다.

5. 생산 단백질로부터 숙주 세포 리파제의 분리를 위한 작동 조건을 스크리닝하는 방법

본 개시내용은 크로마토그래피 프로세스를 통해 생산 단백질 (예를 들어, 모노클로날 항체)로부터 HCP (예를 들어, 리파제)를 분리하기 위한 작동 조건을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

스크리닝은 배치 결합 연구, 미니-칼럼 결합 연구, 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 이해할 수 있는 임의의 다른 방법에 의해 수행될 수 있다. pH, 염의 유무, 염 유형, 염 농도, 용액 내 다른 구성성분 (예를 들어, 반대 이온), 각 구성성분의 농도, 또는 로드 단백질 농도 등을 포함하는 크로마토그래피 수지 및 작동 조건의 과다한 조합이 HCP (예를 들어, 리파제) 또는 생산 단백질 (예를 들어, 모노클로날 항체)에 대해 설계 및 검사될 수 있다. HCP (예를 들어, 리파제) 및 생산 단백질 (예를 들어, 모노클로날 항체)의 K_P 값은 본원에 개시되거나 관련 기술분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 방법에 의해 결정된다. HCP (예를 들어, 리파제) 및 생산 단백질 (예를 들어, 모노클로날 항체) 간의 log α 값은 본원에 기재된 방법을 사용하여 계산된다. 일반적으로, HCP (예를 들어, 리파제) 및 생산 단백질 (예를 들어, 모노클로날 항체) 간의 양호한 분리를 위해 0.5보다 큰 log α의 절대값이 바람직하다.

스크리닝되는 크로마토그래피 수지는 HCP (예를 들어, 리파제) 및 생산 단백질 (예를 들어, 모노클로날 항체)의 특징에 기초하여 생산 단백질 (예를 들어, 모노클로날 항체)로부터 HCP (예를 들어, 리파제)를 분리할 수 있는 임의의 크로마토그래피 수지일 수 있다. 스크리닝되는 작동 조건은 선택된 각 수지에 대해 일반적으로 사용되는 프로세스 조건, 예를 들어, 평형화 조건, 로딩 조건, 세척 조건, 용리 조건, 또는 스트립핑 조건 등일 수 있다.

한 실시양태에서, 스크리닝은 문헌 [Welsh et al., Biotechnol Prog. 30 (3):626-635 (2014)]에 개시된 바와 같이 수지 슬러리 플레이트 방법을 사용하여 수행된다. 예를 들어, pH, 염 및 공급물의 상이한 조합의 혼합물이 96-웰 필터 플레이트 (예를 들어, P/N MSBVN1250, 밀리포어 시그마(Millipore Sigma), 미국 매사추세츠주 버링턴 소재)에 첨가된다. 크로마토그래피 수지 부피는 2-50 μL이고, 액체 공급 부피는 200 μL이다. 일부 실시양태에서, 16-32 조건이 각 수지에 대해 테스트된다. 다른 실시양태에서, 24-96 조건이 각 수지에 대해 테스트된다. 수지 및 액체의 분리는 진공 여과에 의해 성취된다. 먼저, 수지를 평형화 완충제와 함께 10분 동안 인큐베이션하고, 평형화 단계를 3회 반복한다. 다음으로, 수지를 공급물과 함께 60분 동안 인큐베이션한다. 그 후, 수지를 스트립 조건에서 10분 동안 인큐베이션하고 2회 반복한다. 평형화 단계는 초기 수지 슬러리 완충제로부터 완충제 교환을 허용한다. 공급물 혼합을 위한 60분 시간은 주어진 조건 세트에서 수지 리간드 및 단백질 간의 유사 평형화를 허용한다. 공급 단계로부터의 여과액을 280 - 320 nm에서 UV 흡광도에 의해 측정하여 단백질의 최종 액체 농도 (c)를 결정하였다. 단백질의 결합된 농도 (q)는 c의 질량 균형 및 공지된 공급물 농도 (c₀)에 의해 결정된다.

또 다른 실시양태에서, 스크리닝은 문헌 [Welsh et al., Biotechnol Prog. 30 (3):626-635 (2014)] 또는 [Petroff et al., Biotech Bioeng. 113 (6):1273-1283 (2015)]에 개시된 바와 같이 미니-칼럼 방법을 사용하여 수행된다. 예를 들어, pH, 염 및 공급물의 상이한 조합의 혼합물은 3 cm 베드 높이를 갖는 0.6 mL 칼럼 포맷에서 스크리닝된다. 최대 8개의 칼럼이 병렬로 스크리닝된다. 선형 유속을 전형적인 칼럼의 경우 약 300 cm/h에서 미니어처 칼럼 포맷에서 약 45 cm/h로 감소시킴으로써 미니어처 칼럼에서 약 4분의 전형적인 체류 시간이 보존된다. 크로마토그래피 스크리닝을 위한 다른 모든 전형적인 파라미터가 보존된다. 용리액 분획은 풀로서 수집되거나, 96-웰 플레이트에서 수집하여 실험실 규모 연구와 유사한 크로마토그램을 생성함으로써 분획으로서 수집될 수 있다.

생산 단백질 (예를 들어, 모노클로날 항체)로부터 HCP (예를 들어, 리파제)를 분리하기 위한 작동 조건이 결정되면, 로드 유체 및/또는 수지의 조건이 이에 따라 조절될 수 있다. 예를 들어, 수지를 필요한 작동 조건으로 만드는 용액으로 세척함으로써 수지를 평형화할 수 있다.

6. 생산 단백질로부터 숙주 세포 리파제를 분리하는 방법

본 개시내용은 크로마토그래피 프로세스를 통해 생산 단백질 (예를 들어, 모노클로날 항체)로부터 HCP (예를 들어, 리파제)를 분리하는 방법을 추가로 제공한다.

본원에 제공된 다양한 방법의 일부 실시양태에서, 리파제는 CHO 세포 리파제이다.

CEX 수지를 사용하는 다양한 방법의 특정 실시양태에서, 작동 조건의 pH는 약 6.0 미만이다. 일부 실시양태에서, 작동 조건의 pH는 약 5.5 미만이다. 다른 실시양태에서, 작동 조건의 pH는 약 5.0 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 작동 조건의 pH는 약 4.5 내지 약 5.5이다. 또 다른 실시양태에서, 작동 조건의 pH는 약 4.5 내지 약 5.0이다. 특정 실시양태에서, 작동 조건의 pH는 약 5.0 내지 약 5.5이다. 일부 실시양태에서, 작동 조건의 pH는 약 4.9 내지 약 5.3이다.

혼합 모드 CEX 수지를 사용하는 다양한 방법의 특정 실시양태에서, 작동 조건의 pH는 약 6.0 미만이다. 일부 실시양태에서, 작동 조건의 pH는 약 5.5 미만이다. 다른 실시양태에서, 작동 조건의 pH는 약 5.0 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 작동 조건의 pH는 약 4.5 내지 약 5.5이다. 또 다른 실시양태에서, 작동 조건의 pH는 약 4.5 내지 약 5.0이다. 특정 실시양태에서, 작동 조건의 pH는 약 5.0 내지 약 5.5이다. 일부 실시양태에서, 작동 조건의 pH는 약 4.9 내지 약 5.3이다.

AEX 수지를 사용하는 다양한 방법의 특정 실시양태에서, 작동 조건의 pH는 약 6.5 초과이다. 일부 실시양태에서, 작동 조건의 pH는 약 6.9 초과이다. 다른 실시양태에서, 작동 조건의 pH는 약 7.2 초과이다. 또 다른 실시양태에서, 작동 조건의 pH는 약 6.9 내지 약 7.9이다. 또 다른 실시양태에서, 작동 조건의 pH는 약 7.2 내지 약 7.5이다. 특정 실시양태에서, 작동 조건의 pH는 약 7.5 내지 약 7.8이다.

혼합 모드 AEX 수지를 사용하는 다양한 방법의 특정 실시양태에서, 작동 조건의 pH는 약 6.5 초과이다. 일부 실시양태에서, 작동 조건의 pH는 약 6.9 초과이다. 다른 실시양태에서, 작동 조건의 pH는 약 7.2 초과이다. 또 다른 실시양태에서, 작동 조건의 pH는 약 6.9 내지 약 7.9이다. 또 다른 실시양태에서, 작동 조건의 pH는 약 7.2 내지 약 7.5이다. 특정 실시양태에서, 작동 조건의 pH는 약 7.5 내지 약 7.8이다.

본원에 제공된 다양한 방법의 특정 실시양태에서, 작동 조건은 염을 첨가함으로써 이온 강도 및/또는 전도도를 조정하는 것을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 작동 조건은 염을 첨가함으로써 이온 강도를 조정하는 것을 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 작동 조건은 염을 첨가함으로써 전도도를 조정하는 것을 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 작동 조건은 염을 첨가함으로써 이온 강도 및 전도도를 조정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 염을 첨가하는 효과는 원하는 log α를 달성하는 것이다. 다른 실시양태에서, 염을 첨가하는 효과는 리파제에 대한 원하는 log K_P를 달성하는 것이다. 또 다른 실시양태에서, 염을 첨가하는 효과는 원하는 log α 및 리파제에 대한 원하는 log K_P를 달성하는 것이다. 그러므로, 한 실시양태에서, 작동 조건은 염을 첨가함으로써 원하는 log α를 달성하는 것을 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 작동 조건은 염을 첨가함으로써 리파제에 대한 원하는 log K_P를 달성하는 것을 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 작동 조건은 염을 첨가함으로써 원하는 log α 및 리파제에 대한 원하는 log K_P를 달성하는 것을 추가로 포함한다.

또 다른 구체적인 실시양태에서, 작동 용액 중 아세트산나트륨의 농도는 약 100 mM 내지 약 200 mM이고, 크로마토그래피 수지는 AEX이고, 작동 조건의 pH는 약 6.9 내지 약 7.8이다.

또 다른 측면에서, 하기를 포함하는, 혼합 모드 AEX 크로마토그래피 프로세스를 통해 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로부터 PLBL2를 분리하는 방법이 본원에 제공된다:

이러한 방법의 특정 실시양태에서, 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 치료 단백질이다.

이러한 방법의 일부 실시양태에서, 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 모노클로날 항체이다.

또 다른 측면에서, 하기를 포함하는, CEX 크로마토그래피 프로세스를 통해 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로부터 PLBL2를 분리하는 방법이 본원에 제공된다:

한 실시양태에서, CEX 크로마토그래피 프로세스를 통해 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로부터 PLBL2를 분리하는 방법은 하기를 포함한다:

또 다른 실시양태에서, CEX 크로마토그래피 프로세스를 통해 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로부터 PLBL2를 분리하는 방법은 하기를 포함한다:

또 다른 측면에서, 하기를 포함하는, CEX 크로마토그래피 프로세스를 통해 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로부터 LPLA2를 분리하는 방법이 본원에 제공된다:

한 실시양태에서, CEX 크로마토그래피 프로세스를 통해 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로부터 LPLA2를 분리하는 방법은 하기를 포함한다:

또 다른 실시양태에서, CEX 크로마토그래피 프로세스를 통해 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로부터 LPLA2를 분리하는 방법은 하기를 포함한다:

본원에 제공된 분리 방법은 본원에 기재되거나 관련 기술분야에서 일반적으로 사용되는 하나 이상의 분리 단계와 조합하여 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 분리 단계가 본원에 기재된 방법에 선행한다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 분리 단계가 본원에 기재된 방법을 뒤따른다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 분리 단계가 본원에 기재된 2개의 방법 사이에 수행된다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 분리 단계가 본원에 기재된 방법 이전, 이후 및/또는 사이에 수행된다. 조합될 수 있는 분리 단계 또는 방법의 수 또는 조합되는 분리 단계 또는 방법의 순서에는 제한이 없다.

이러한 방법의 다른 실시양태에서, 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 모노클로날 항체이다.

7. 생산 단백질 제형에서 PS-80 안정성을 개선하는 방법

본 개시내용은 크로마토그래피 프로세스를 사용하여 생산 단백질 (예를 들어, 모노클로날 항체)로부터 HCP (예를 들어, 리파제)를 분리함으로써 생산 단백질 제형 (예를 들어, 원료의약품 제형 또는 약물 완제품 제형)에서 PS-80 안정성을 개선하는 방법을 추가로 제공한다.

(c) 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 PS-80을 함유하는 용액에 존재하도록 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제형화하는 단계;

(c) 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편 제형이 PS-80을 포함하는 용액이 되도록 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제형화하는 단계;

또 다른 측면에서, 하기를 포함하는, 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편 제형을 제조하는 방법이 본원에 제공된다:

(c) PS-80을 포함하는 용액에서 단계 (b)로부터 수득된 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제형화하는 단계, 여기서 평균 PS80 분해는 6개월 후 10% 이하이다.

또 다른 실시양태에서, PS80 분해는 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 갖는 HPLC 시스템에서 질량 분석법 (MS), 액체 크로마토그래피-질량 분석법 (LCMS), 또는 고체상 추출 (SPE)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 방법을 사용하여 무손상 PS-80 분자의 양 및/또는 분해된 생성물의 양에 의해 측정된다.

8. 제약 조성물

본 개시내용은 또한 치료 단백질 (예를 들어, 모노클로날 항체) 및 소량의 HCP (예를 들어, 리파제)를 포함하는 제약 조성물 (예를 들어, 원료의약품 또는 약물 완제품)을 제공한다.

특정 실시양태에서, 제약 조성물은 치료 단백질 및 1 ppm 미만의 숙주 세포 리파제를 포함한다. 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 치료 단백질 및 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8 또는 0.9 ppm 미만의 숙주 세포 리파제를 포함한다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 치료 단백질 및 0.1 ppm 미만의 숙주 세포 리파제를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 치료 단백질 및 0.2 ppm 미만의 숙주 세포 리파제를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 치료 단백질 및 0.3 ppm 미만의 숙주 세포 리파제를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 치료 단백질 및 0.4 ppm 미만의 숙주 세포 리파제를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 치료 단백질 및 0.5 ppm 미만의 숙주 세포 리파제를 포함한다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 치료 단백질 및 0.6 ppm 미만의 숙주 세포 리파제를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 치료 단백질 및 0.7 ppm 미만의 숙주 세포 리파제를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 치료 단백질 및 0.8 ppm 미만의 숙주 세포 리파제를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 치료 단백질 및 0.9 ppm 미만의 숙주 세포 리파제를 포함한다.

특정 실시양태에서, 제약 조성물은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 용리 용액을 사용한 CEX 크로마토그래피로부터의 용리액이다:

한 실시양태에서, 제약 조성물은 약 120 mM 내지 약 175 mM 염화나트륨을 포함하는 약 4.9 내지 약 5.3의 pH를 갖는 용리 용액을 사용한 CEX 크로마토그래피로부터의 용리액이다.

또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 약 150 mM 염화나트륨을 포함하는 약 5.1의 pH를 갖는 용리 용액을 사용한 CEX 크로마토그래피로부터의 용리액이다.

또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 약 165 mM 염화나트륨을 포함하는 약 5.1의 pH를 갖는 용리 용액을 사용한 CEX 크로마토그래피로부터의 용리액이다.

또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 약 4.9 내지 약 5.4의 pH 및 약 15 mS/cm 내지 약 21 mS/cm의 전도도를 갖는 용리 용액을 사용한 CEX 크로마토그래피로부터의 용리액이다.

한 실시양태에서, 제약 조성물은 약 135 mM 내지 약 195 mM 염화나트륨을 포함하는 약 4.9 내지 약 5.4의 pH를 갖는 용리 용액을 사용한 CEX 크로마토그래피로부터의 용리액이다.

또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 약 150 mM 내지 약 275 mM 염화나트륨을 포함하는 약 pH 5.0 내지 약 pH 5.4의 pH를 갖는 용리 용액을 사용한 CEX 크로마토그래피로부터의 용리액이다.

또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 약 200 mM 염화나트륨을 포함하는 약 5.1의 pH를 갖는 용리 용액을 사용한 CEX 크로마토그래피로부터의 용리액이다.

또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 약 250 mM 염화나트륨을 포함하는 약 5.1의 pH를 갖는 용리 용액을 사용한 CEX 크로마토그래피로부터의 용리액이다.

제약 조성물의 다른 실시양태에서, 치료 단백질은 모노클로날 항체이다.

VI. 실시예

이 섹션 (섹션 VI)의 실시예는 제한이 아니라 예시를 위해 제공된다.

실시예 1: 상이한 종의 K_P를 결정하는 방법

분배 계수 (K_P)는 공지된 액체 농도의 단백질 (또는 다른 관심 분자)을 공지된 부피의 크로마토그래피 수지와 혼합하고, 수지에 결합된 단백질 및 액체에 남아있는 단백질의 비율을 계산함으로써 결정된다: K_P = q/c = [결합된]/[유리].

모든 후속 실시예의 경우, 크로마토그래피 부피는 20 μL이고, 액체 부피는 0.5 mg/mL의 단백질 농도를 갖는 200 μL였다. 이들 부피는 5 mg/mL의 효과적인 수지 로딩에 대해 10:1의 위상 비율을 제공한다.

96-웰 필터 플레이트 (P/N MSBVN1250, 밀리포어 시그마, 미국 매사추세츠주 버링턴 소재)에서 수지 및 액체를 격렬하게 혼합함으로써 스크리닝을 수행하였으며, 진공 여과에 의해 수지 및 액체를 분리하였다. 단계의 순서는 하기와 같았다:

(a) 3 x 평형화 (완충제를 함유하지 않는 공급물), 각 단계에서 10분 인큐베이션;

(b) 1 x 공급물 혼합, 60분 인큐베이션; 및

(c) 2 x 스트립 조건, 각 단계에서 10분 인큐베이션

평형화 단계는 초기 수지 슬러리 완충제로부터 완충제 교환을 허용한다. 공급물 혼합을 위한 60분 시간은 주어진 조건 세트에서 수지 리간드 및 단백질 간의 유사 평형화를 허용한다. 공급 단계로부터의 여과액을 280 - 320 nm에서 UV 흡광도에 의해 측정하여 단백질의 최종 액체 농도 (c)를 결정하였다. 단백질의 결합된 농도 (q)는 약 c의 질량 균형 및 공지된 공급물 농도 (c₀) (0.5 mg/mL)에 의해 결정하였다.

log K_P ≥ 1.5, 수지에 대한 강한 결합;

log K_P < 1, 결합-및-용리 양식에 대해 용리가 예상되는 조건;

0.5 < log K_P < 1, 일부 결합을 나타낼 약한 상호작용 조건;

log K_P < 0.5, 결합이 거의 또는 전혀 없음.

상이한 종의 log K_P는 또한 하기와 같이 분리 인자 (α)의 계산을 통해 상이한 종의 분리를 예측하는데 사용된다: α = K_{P, 단백질 1}/K_{P, 단백질 2}; log α = log K_{P, 단백질 1} - log K_{P, 단백질 2}, 여기서 log α는 0에서 멀어질수록 더 나은 분리를 나타낸다. 하기 예에서, α = K_{P, 리파제}/K_{P, mAb}; log α = log K_{P, 리파제} - log K_{P, mAb}. 0.5보다 큰 log α는 리파제 및 모노클로날 항체 간의 양호한 분리를 나타낸다.

실시예 2: 전형적인 프로세싱 조건에서 PLBL2 및 mAb K_P 값의 비교

K_P 및 α를 결정하는 방법은 다양한 크로마토그래피 프로세스를 통해 2개의 모노클로날 항체인 mAb1 및 mAb2에 대한 작동 조건에서 공지된 리파제 불순물인 PLBL2를 분리하는 능력을 평가하는데 사용되었다. 표 1은 mAb1에 대한 여러 프로세스 조건에서 mAb1 및 PLBL2에 대한 log K_P 및 log α 값을 요약한다.

<표 1>

mAb1에 대한 프로세싱 조건에서 mAb1 및 PLBL2에 대한 log K_P 및 log α 값

표 1은 크로마토그래피 프로세스를 통해 mAB1로부터 PLBL2를 분리하기 위한 잠재적 작동 조건을 보여준다.

단백질 A 프로세스의 경우, PLBL2는 친화성을 갖지 않으므로, 대부분의 PLBL2는 로딩 또는 세척 단계 동안 단백질 A 수지를 통해 유동할 것으로 예상되었다. 풀에 존재하는 PLBL2만이 불충분한 세척 또는 mAb1과 연관된 것일 수 있다.

mAb1에 대해 플로우스루 모드로 작동되는 AEX 프로세스의 경우, PLBL2는 로딩 및 세척 조건에서 mAb1과 비교하여 더 강한 결합 (더 높은 log K_P)을 보여준다. 이는 이들 조건에서 1.0보다 큰 log α를 초래하며, 이는 PLBL2가 이들 조건에서 수지에 결합된 상태로 유지되는 반면, mAb1은 이를 통해 유동할 것임을 나타낸다.

CEX 프로세스의 경우, PLBL2는 mAb1과 비교하여 염 조정에 대한 더 적은 민감도를 나타내고 염 범위의 더 높은 말단에서 더 높은 log K_P를 갖는다. 중심점 및 높은 염 한계에서 1.0보다 큰 log α는 PLBL2가 mAb1 용리 동안 결합된 상태로 유지됨을 나타낸다. 낮은 염 한계는 mAb1로부터 PLBL2의 분리에 훨씬 덜 유리한 log α를 제공하며, 이는 이들 조건에서 일부 결합을 유지할 것으로 예상된다 (1.5의 log K_{P, mAb1}).

표 2는 mAb2에 대한 여러 프로세스 조건에서 mAb2 및 PLBL2에 대한 log K_P 및 log α 값을 요약한다.

<표 2>

mAb2에 대한 프로세싱 조건에서 mAb2 및 PLBL2에 대한 log K_P 및 log α 값

표 2는 크로마토그래피 프로세스를 통해 mAb2로부터 PLBL2를 분리하기 위한 잠재적 작동 조건을 보여준다.

단백질 A 및 CEX 프로세스에 대한 mAb2의 경향은 mAb1과 매우 유사하며, mAb2는 단백질 A 용리 동안 약간 더 강한 결합 및 CEX 용리 동안 더 약한 결합을 나타낸다. CEX 프로세스의 경우, mAb2는 더 낮은 염에서 더 낮은 결합을 가지므로, 염 범위 전체에 걸쳐 더 강력한 log α를 갖는다.

실시예 3: 상이한 수지에 대한 조건 범위에서 PLBL2 및 LPLA2 K_P 값의 매핑

다운스트림 프로세싱에서 잠재적으로 사용될 수 있는 상이한 완충제 및 조건으로 광범위하게 다양한 수지에 대한 PLBL2 및 LPLA2의 분배 계수를 결정하기 위해 광범위한 매핑을 수행하였다 (표 3). 염 및 pH 조건을 조합하여 테스트하였다. PLBL2 및 LPLA2 K_P의 포괄적인 매핑은 공지된 mAb 정제 조건으로 또는 탐색될 조건에 대해 PLBL2 또는 LPLA2의 분리를 예측하는 것에 대한 기초를 제공할 수 있다.

<표 3>

PLBL2 또는 LPLA2 log K_P 매핑을 위해 스크리닝된 조건

3.1 AEX 크로마토그래피

AEX 크로마토그래피에 대한 조건 세트는 표 3에 나열되어 있고, PLBL2의 경우 도 1a-1c에 및 포로스 50 HQ 수지로 LPLA2의 경우 도 1d-1f에 도시되어 있다. 제1 완충제 조합은 단백질 A 및 낮은 pH 유지 단계 (도 1a 및 1d) 후에 플로우스루 모드로 AEX 로딩 단계에서 일반적으로 볼 수 있는 범위의 완충제의 혼합물을 나타낸다. 이들 조건 하에, 아세테이트는 결합을 위해 경쟁하는 반대 이온으로 작용하였고, 트리스 염기는 pH 제어를 위해 적절한 양으로 첨가되었다. PLBL2는 > 100 mM 아세테이트 첨가에서도 강한 상호작용을 나타내었고, 약 140 mM 아세테이트에서 대략 1의 log K_P가 관찰되었으며, log K_P는 아마도 더 높은 아세테이트 농도에서 계속 강하하는 것으로 추정된다 (도 1a). pH 7.0-7.5 범위에 걸쳐 차이가 거의 관찰되지 않았다 (도 1a). LPLA2는 아세테이트와 유사한 경향을 나타내었지만, 또한 pH에 대한 더 강한 의존성을 나타내었으며, 더 높은 pH에서 더 강한 결합이 보였다 (도 1d).

2개의 다른 AEX 조건은 AEX 평형화 및 세척 단계에 사용될 수 있는 완충제 (트리스 및 포스페이트)를 나타낸다. NaCl 염 조정의 사용은 사전 염 용리 (예를 들어, CEX로부터) 후에 AEX 프로세스를 위한 가능한 조건을 제공한다. 트리스 완충제 (도 1b 및 1e)에서, PLBL2는 최대 약 50 mM NaCl 첨가까지 강하게 결합된 상태로 유지되고 (log KP > 1.5), log K_P는 대략 100 mM NaCl 초과에서 1 미만으로 강하된다. LPLA2는 유사하게 거동하지만, 최대 약 30 mM NaCl까지 log KP > 1.5 및 약 75 mM NaCl 초과에서 log K_P < 1로 덜 강하게 유지된다. 포스페이트 완충제 (도 1c 및 1f)는 트리스보다 더 강하게 PLBL2 및 LPLA2 상호작용을 방지하고; 리파제로 스크리닝된 조건은 log K_P > 1.5를 제공하지 않았고, log K_P는 각 경우에 약 40 mM NaCl에서 1 미만으로 강하되었다. pH는 테스트된 범위에 걸쳐 두 완충제 모두에 거의 영향을 미치지 않았다.

3.2 CEX 크로마토그래피

CEX 크로마토그래피에 대한 조건 세트는 표 3에 나열되어 있고, 포로스 50 HS 수지의 경우 도 2a-2c에 도시되어 있다.

제1 조합은 전형적으로 용리를 위한 NaCl 조정을 사용하여 mAb의 결합 및 용리에 사용될 수 있는 pH 및 염 범위를 나타낸다 (도 2a 및 2c). 이 경우에, NaCl은 강한 효과를 가졌으며, 250 mM NaCl 초과에서 결합이 관찰되지 않았고 PLBL2에 대해 대략 150 mM NaCl에서 1의 log K_P 값이 관찰되지 않았다 (도 2a). pH는 또한 더 낮은 pH에서, 특히 pH 5.0에 가까울수록 log K_P가 증가함에 따라 유의한 영향을 미쳤다. LPLA2는 pH 및 염 조정에 대해 유사한 경향을 나타내었지만, 200 내지 250 mM NaCl에서 1의 log K_P 값으로 유의하게 더 강한 체류를 가졌다 (도 2c).

제2 조합은 전형적으로 훨씬 더 낮은 염 조건에서 pH가 결합을 조정하는데 사용되는 조건을 나타낸다 (도 2b). 이 경우에, 1.5 초과의 log K_P의 강한 PLBL2 결합은 pH 5.5 미만에서만 관찰되었고, log K_P 값은 약 pH 5.8 초과에서 1 미만으로 강하된다. 여기에서 테스트된 염 조건은 이들 pH 값에서 분배에 거의 영향을 미치지 않았다. 최대 pH 6.0까지 아세테이트 완충제를 사용하였고, 더 높은 pH 조건을 완충하는데 포스페이트 완충제를 사용하였다.

3.3 HIC

PLBL2 및 LPLA2의 HIC 수지인 토소 부틸-650M으로의 분배에 대한 테스트는 20 mM 인산나트륨 (pH 7.0)의 완충 조건에서 황산나트륨 농도를 조정함으로써 수행하였다 (표 3, 도 3). 두 리파제는 모두 높은 염에서 강한 결합 (PLBL2의 경우 250 mM 황산나트륨 및 LPLA2의 경우 400 mM 황산나트륨 초과에서 log K_P > 1.5) 및 더 낮은 염에서 감소된 분배 (PLBL2의 경우 150 mM 황산나트륨 및 LPLA2의 경우 200 mM 황산나트륨 미만에서 log K_P < 1)로 전형적인 HIC 거동을 나타내었다.

3.4 다중모드 크로마토그래피

PLBL2의 분배를 또한 2개의 다중모드 크로마토그래피 수지: 다중모드 AEX 수지인 캅토 어드히어 및 다중모드 CEX 수지인 캅토 MMC에서 테스트하였다 (표 3, 도 4a 및 4b). 캅토 어드히어의 경우, log K_P 값은 테스트된 모든 조건에서 1.9보다 컸으며, 이는 광범위한 작동 조건에 걸쳐 강한 결합을 나타낸다 (도 4a). 캅토 MMC의 경우, 훨씬 더 넓은 염 범위에 걸쳐 pH 변화에 의해 결합이 우세하게 조정되었다 (도 4b). 1.5 초과의 log K_P를 갖는 강한 결합 범위는 약 pH 5.8 미만에서 관찰되었다. 1 미만의 log K_P를 갖는 더 약한 결합 범위는 높은 염 첨가로 대략 5.9 초과의 pH에서만 관찰되었다.

실시예 4: IgG1 mAb, mAb3로부터 PLBL2를 분리하기 위한 조건의 최적화

실시예 3에서 PLBL2에 대해 제공된 분배 맵을 사용하여 IgG1 mAb, mAb3로부터 PLBL2의 분리를 최적화하였다. mAb3의 성능은 단백질 A 프로세스에 대한 mAb1의 성능과 유사하였다. mAb3의 강한 결합이 단백질 A 로딩 조건 하에 관찰되었다 (데이터는 나타내지 않음).

4.1 AEX 크로마토그래피

사용된 칼럼은 포로스 HQ 수지에 대해 20 cm 베드 높이에서 대략 7 mL 부피였다. mAb3 공급물은 대략 110 mM의 아세테이트 반대 이온과 함께 pH 7.5의 트리스 및 아세테이트 혼합물에서 13.5 mg/mL 농도였다. 이 조건에서 mAb3 log K_P는 0에 가까운 반면, PLBL2 log K_P는 약 1.4이며 (도 1a), 이는 mAb3은 결합하지 않지만 PLBL2는 특정 정도로 수지에 결합할 것임을 나타낸다. 프로세스를 플로우스루 모드로 실행하였으며, 크로마토그램은 칼럼에 결합된 mAb3가 거의 없음을 나타낸다 (도 5). 농도를 교정하는데 사용되는 공지된 PLBL2 펩티드를 사용하여 QE HF-X 시스템에서 질량 분석법을 사용하여 상이한 분획의 PLBL2를 정량화하였다. 공급물 중 PLBL2의 농도는 77 ppm이었다. 플로우스루 중 PLBL2의 농도는 9 ppm이었다. 스트립 중 PLBL2의 농도는 3841 ppm이었다. 검출된 양은 PLBL2의 85% 초과가 플로우스루 풀의 mAb3로부터 제거되었음을 나타낸다. 스트립 풀 중 많은 양의 PLBL2는 1.4의 log K_P 값에 의해 예측된 바와 같이 플로우스루 조건 하에 수지에 결합된 리파제가 1 M NaCl 높은 염 스트립 조건 하에 용리되었음을 나타내며, 이는 또한 0의 log K_P 값에 의해 예측되었다.

그러므로, 단백질 A 및 AEX는 단백질 A 로딩 동안 -2의 log α 값 및 플로우스루 모드로 AEX 로딩 동안 대략 1.5의 log α 값을 갖는 일반적인 작동 조건에서 PLBL2를 제거하는 유망한 단계를 나타낸다. ProA의 경우 LPLA2를 사용하여 유사한 α 값을 달성할 수 있으며, 플로우스루 모드로 AEX 로딩의 경우 최대 대략 1.7까지 훨씬 더 나은 분리를 달성할 수 있다.

mAb3의 경우, 단백질 A 및 AEX 프로세스를 넘어서는 추가 청소가 또한 필요하였으므로, 실시예 3에서 PLBL2 및 LPLA2에 사용된 것과 유사한 조건에서 log K_P 맵을 생성하였다. 그 후, 이들 log KP 값을 사용하여 가장 큰 분리의 조건을 식별하기 위해 스크리닝된 범위에 걸쳐 log α를 계산하였다.

4.2 CEX 크로마토그래피

포로스 50 HS 수지를 사용한 CEX 크로마토그래피를 사용한 분리를 위한 조건은 표 3에 나열된 조건에서 PLBL2의 경우 도 6a 및 6b에 및 LPLA2의 경우 도 6c에 log α 값으로 도시되어 있다. 염을 사용한 결합 조정의 경우, PLBL2에 대한 최상의 분리 조건은 pH 5-5.2 및 200-225 mM NaCl 사이였으며, 여기서 log α 값은 대략 0.4이다 (도 6a, 흑색 박스). log α가 양수이기 때문에, mAb3는 PLBL2보다 덜 강하게 결합되며, 이는 이들 조건 하에 mAb3는 수지로부터 용리되는 반면, PLBL2는 결합된 상태로 유지될 수 있음을 나타낸다. 최적화된 구역은 다소 좁은 pH 및 염 범위를 나타내며, 특히 높은 log α를 갖지 않는다. 전통적인 칼럼 크로마토그래피를 사용한 확인은 이 프로세스를 위해 여전히 수행되어야 할 가능성이 있다.

이들 CEX 조건에 대한 LPLA2 및 mAb3에 대한 분리는 도 6c에 나타낸 바와 같이 훨씬 더 크다. 최적화된 범위는 PLBL2와 유사하지만, LPLA2 및 mAb3에 대한 α 값은 200-250 mM NaCl 및 pH 5.0-5.3의 조건에서 1보다 크다.

염 조정과 대조적으로, pH에 의한 결합의 변화는 대략 -0.6의 음의 log α 값을 생성하였다 (도 6b, 흑색 박스). 대략 pH 6.0-6.6 및 20 mM 미만의 NaCl을 포함하는 영역은 mAb3가 PLBL2보다 수지에 더 강하게 결합된 조건을 나타낸다. 그러므로, 이들 조건은 더 높은 pH (및/또는 더 높은 염)에서 mAb3를 용리하기 전에 PLBL2를 제거할 수 있는 중간 세척으로 사용될 수 있었다.

추가 CEX 프로세스가 실시예 4.1에 특정된 로딩 작동 조건 하에 플로우스루 모드로 작동된 AEX 프로세스 후 mAb3로부터 PLBL2 및 LPLA2를 추가로 분리할 수 있는지 여부를 평가하기 위해, AEX 플로우스루 풀은 pH 5.1 및 165 mM NaCl에서 용리 조건으로 결합-및-용리 모드로 작동되는 포로스 HS 수지를 함유하는 CEX 칼럼에 로딩되었다. 이 용리 작동 조건 하에 log α는 PLBL2의 경우 0.2 (도 6a) 및 LPLA2의 경우 0.9 (도 6c)이다. 이들 log α 값은 200 mM NaCl 주변의 최적 범위의 값보다 작지만, 양수 값은 여전히 리파제가 특히 LPLA2의 경우 이 용리 조건 하에 수지에 더 강하게 결합할 것임을 나타낸다. 질량 분석법 분석은 CEX 공급물 내 PLBL2가 5 ppm이었지만, CEX 용리 풀 내 PLBL2가 0.3 ppm으로 강하하였음을 보여주었다. 용리 풀 내 LPLA2는 검출 한계 미만이었다 (데이터는 나타내지 않음). 이들 결과는 특정된 용리 작동 조건 하에, AEX 프로세스가 플로우스루 모드로 실행된 후 추가 CEX 프로세스가 mAb3로부터 PLBL2를 추가로 분리할 수 있음을 입증한다.

4.3 HIC

mAb3 및 리파제의 분배는 또한 표 3에 나열된 조건에서 HIC 수지, 토소 부틸-650M (도 7)에서 비교되었다. 황산나트륨 농도의 변경은 이 조건에서 대략 0.3의 log α로 임의의 분리를 제공하는 300 mM 황산나트륨만으로 mAb3 및 PLBL2 사이에 거의 분리를 제공하지 않는다. LPLA2는 300-400 mM 황산나트륨 사이에서 약 0.5의 log α로 다소 더 나은 분리를 제공한다. 대조적으로, mAb2는 mAb3, PLBL2, 또는 LPLA2보다 훨씬 덜 소수성이므로, 600 mM 황산나트륨보다 클 때까지 1.5 초과의 log K_P에서 HIC 수지에 대한 강한 결합으로 전이되지 않는다. mAb2 및 PLBL2의 경우, 1.5-2.0의 log α 값은 300-500 mM 황산나트륨 사이에서 달성될 수 있으며, 매우 넓은 염 범위는 내부에서 작동하기 위한 유망한 분리 능력을 갖는다. LPLA2의 경우와 유사하게, 1보다 큰 log α 값이 이 동일한 염 범위에서 관찰된다.

4.4 다중모드 크로마토그래피

mAb3 및 PLBL2의 분배는 표 3에 나열된 조건에서 상이한 다중모드 수지, 다중모드 AEX 수지인 캅토 어드히어 (도 8a) 및 다중모드 CEX 수지인 캅토 MMC (도 8b)에 대해 최종적으로 비교되었다.

캅토 어드히어의 경우, PLBL2는 모든 조건에서 강하게 결합된 반면 (도 4a), mAb3는 더 높은 염에서 더 강한 분배와 함께 소수성 상호작용을 나타내었다. 생성된 log α 플롯은 mAb3 결합이 가장 낮은 저염에서 pH 7.3-7.6의 조건 하에 가장 높은 분리 인자 (log α > 0.8)를 보여준다 (도 8a). 이들 조건은 캅토 어드히어 수지에 대한 PLBL2 결합을 유지하면서 mAb3 용리 또는 플로우스루에 활용될 수 있었다.

캅토 MMC는 스크리닝된 조건에 대해 캅토 어드히어와 동일한 수준의 mAb3 및 PLBL2의 분리를 제공하지 않는다. 최상의 조건은 pH 5.9-6.0 및 300 mM NaCl 초과에서 관찰되었으며, 여기서 최대 0.3의 log α 값이 관찰되었다. log α가 0보다 크기 때문에, 이들 조건은 PLBL2 결합을 유지하면서 mAb3 용리에 사용될 수 있었다 (도 8b). 이 스크린에서 두 인자의 상한에서 최적 범위가 관찰되었기 때문에, 더 높은 pH 및/또는 더 높은 염에서 더 광범위하거나 더 유리한 분리 조건 세트가 가능할 수 있었다.

실시예 5: 모노클로날 항체 mAb4 (MK-1308, 항-CTLA4 항체)에 대한 CEX 작동 조건의 최적화

표 4에 표시된 바와 같이 CEX 실험 설계 (DoE)에서 5개의 인자를 연구하였다. 가변 양의 아세트산나트륨 삼수화물, 4 M 아세트산, 및 염화나트륨을 사용하여 용리 완충제 pH 및 전도도를 조절하였다. 1 M 트리스, 1 M 아세트산, 및 1 M 염화나트륨을 사용하여 로드 pH 및 전도도를 조절하였다.

<표 4>

연구될 CEX DoE 인자

DoE 설계는 표 5에 표시된 바와 같이 총 40회 실행되었다. 3회 제조된 중심점 용리 완충제로 각 용리 완충제를 2회 제조하였다.

<표 5>

CEX DoE 실행

각 실행은 7 mL 크로마토그래피 칼럼에서 표 6의 단계에 따라 작동되었다. 수율 및 품질 분석을 위해 각 실행의 용리 풀 및 스트립을 수집하였다.

<표 6>

CEX 작동 단계

각 실행의 용리 풀 및 스트립은 잔류 HCP ELISA 분석을 위해 제출되었다. 용리 완충제 pH 및 전도도는 잔류 HCP ELISA 결과에 가장 큰 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다 (도 9).

따라서, 용리 완충제 조건에 기초한 특정 실행을 액체 크로마토그래피-질량 분석법 (LC-MS)에 의해 추가로 분석하였다 (표 7 참조). 재료 제한으로 인해, 동일한 용리 완충제 조건을 사용하는 일부 실행의 풀 및 스트립을 조합하였다 (예를 들어, 아래 10&13).

<표 7>

LCMS 분석을 위해 제출된 CEX DoE 풀 및 스트립

*평균 값:

실행 11은 하기 로드 조건을 가졌다: pH 5.3, cond 4 mS/cm @ 50 g/L 로딩

실행 24는 하기 로드 조건을 가졌다: pH 4.9, cond 4 mS/cm @ 30 g/L 로딩

LC-MS 결과는 공지된 펩티드 서열의 데이터베이스 검색에 기초하여 테스트된 모든 샘플의 CEX 풀에 리파제가 존재하지 않음을 나타내었다. 1 mg DS에서 LC-MS의 검출 한계를 500 amole에서 50 pmole까지 범위의 48개의 상이한 인간 단백질 (6 내지 83 kDa)에서 스파이크에 의해 평가하였다. 적어도 2개의 고유한 펩티드가 0.6 ppm만큼 낮은 스파이크-인 단백질에 대해 식별되었다 (데이터는 나타내지 않음).

포스포리파제 B-유사 2 (PLBL2), 지단백질 리파제 (LPL), 포스포리파제 A2 XV (LPLA2), 포스포리파제 A2 VII (LP-PLA2), 및 리소좀산 리파제 A (LAL/LIPA)를 포함한 5개의 리파제가 각 CEX 스트립 샘플에서 식별되고 상대적으로 정량화되었다 (표 8 참조). 이들 결과는 테스트된 용리 완충제 범위에서 CEX 수지에 대한 리파제의 강한 결합을 시사한다 (pH 4.9 - 5.4, 전도도 15 - 21 mS/cm, 이는 135 - 195 mM의 염화나트륨 농도에 해당함).

<표 8>

mAb4 CEX 스트립에서 내인성 리파제의 상대적 정량화

용리 완충제 설계 공간에서 PS-80 안정성의 개선을 확인하기 위해, PS-80 안정성 연구를 수행하였다. 안정성 연구를 위한 충분한 mAb 질량을 갖기 위해, 표 5의 상이한 실행 (그러나 동일한 용리 완충제 조건)으로부터의 CEXP를 동일한 mAb 질량 비율 (1:1)로 조합하고 제형화하였다. PS-80 안정성 연구를 5 ± 3℃ 및 25 ± 3℃에서 각각 24주 및 16주 동안 조합된 CEXP 실행에 대해 수행하였다 (도 13). 이 연구는 테스트된 모든 CEXP 샘플에 대해 연구 지속기간 동안 안정한 PS-80을 입증한 반면 (< 20% PS-80 분해), 양성 대조군인 AEXP는 25 ± 3℃에서 16주 후에 ~30% 분해되었다. CEX 용리 완충제 pH 5.1 ± 0.2 및 전도도 18 ± 2 mS/cm에 대한 작동 공간은 CEXP 및 이에 따라 DS에서 PS-80 안정성을 개선하기 위해 명백히 강력하다.

실시예 6: 숙주 세포 리파제가 제거됨에 따라 증가된 PS-80 안정성

특정된 시간에 걸쳐 특정된 온도에서 PS80을 함유하는 용액의 PS-80 농도를 측정함으로써 PS-80 안정성을 평가하였다. PS-80 농도의 유의한 변화는 영점시간 결과와 비교하여 ± 0.02 mg/mL PS-80 농도 범위 (즉, 검정 변동성)를 벗어난 2개의 연속 결과로 정의된다.

mAb4 원료의약품 (DS)은 10 mM 히스티딘 완충제 (pH 5.5), 10 mM 메티오닌, 7% (w/v) 수크로스 및 0.02% (w/v) PS-80 중 50 mg/mL mAb4의 최종 DS 농도를 달성하기 위해 49% (w/w) 수크로스 및 85mM 메티오닌 스톡 용액, 및 10% (w/w) PS-80 스톡 용액의 별도의 첨가를 수반하는 제형화 단계를 통해 제조된 PS-80-함유 용액이다.

2-칼럼 및 3-칼럼 정제 계획으로부터 생성된 2개의 mAb4 DS 샘플 간에 PS-80 안정성을 비교하였다. 2-칼럼 정제 계획은 단백질 A 및 AEX를 포함하였다. 생성된 AEX 풀 (AEXP)은 DS로 제형화되었으며, "AEXP DS"로 지칭된다. 3-칼럼 정제 계획은 단백질 A, AEX 및 CEX를 포함하였다. 생성된 CEX 풀 (CEXP)은 DS로 제형화되었으며, "CEXP DS"로 지칭된다. 더욱이, 단백질이 없는 동일한 DS 제형을 함유하는 플라시보를 연구 전반에 걸쳐 음성 대조군으로 사용하였다.

플라시보, AEXP DS 및 CEXP DS를 별도의 유리 바이알에 2.2 ml 충전 부피로 충전하고, 고무 마개로 캡핑하여 약물 완제품의 저장을 시뮬레이션하였다. 바이알은 하기 안정성 챔버에 배치하였다:

· 5℃ ± 3℃

· 25℃ ± 3℃, 60% ± 5% 상대 습도 (RH)

· 40℃ ± 2℃, 75% ± 5% 상대 습도 (RH)

샘플을 취하고, 최대 12주 및 6개월 (26주)까지 2주 간격으로 PS-80 농도에 대해 테스트하였다.

도 10a에 나타낸 바와 같이, AEXP DS의 PS-80 농도는 5℃에서 0.21 (0주)에서 0.18 mg/mL (12주)로 감소되었다. PS-80의 분해는 저장 온도가 증가함에 따라 증가하였다. 예를 들어, 25℃에서, AEXP DS의 PS-80 농도는 0.21 (0주)에서 0.18 mg/mL (4주) 및 0.15 mg/mL (26주)로 감소되었고 (도 10b); 40℃에서, AEXP DS의 PS-80 농도는 0.21 (0주)에서 0.17 mg/mL (2주) 및 0.09 mg/mL (26주)로 감소되었다 (도 10c). 반면에, CEXP DS의 PS-80 농도는 3개의 상이한 온도 모두에서 시간이 지남에 따라 유의하게 변화하지 않았으며, 이는 플라시보에 필적한다.

이 PS-80 안정성 연구와 병행하여, 상응하는 크로마토그래피 스트립 샘플과 함께 동일한 배치의 인-프로세스 중간체를 액체 크로마토그래피-질량 분석법 (LC-MS)에 의해 리파제 식별에 대해 테스트하였다 (표 9). PLBL2 및 LPL은 AEXP에서 발견되었지만, CEXP에서는 부재하였다. AEX 스트립 및 CEX 스트립에 PLBL2 및 LPL이 모두 존재하였으며, 이는 수지에 대한 리파제의 강한 결합을 시사한다. 따라서, AEXP에서 PLBL2 및 LPL의 존재가 AEXP DS에서 5-40℃에서 PS-80 농도 감소의 잠재적인 원인 중 하나가 될 수 있다고 가정한다. 제3 CEX 칼럼의 첨가는 이들 리파제를 효과적으로 제거하고 CEXP DS에서 PS-80 안정성을 개선할 수 있다.

<표 9>

mAb4 프로세스 중간체에서 내인성 PLBL2 및 LPL의 상대적 정량화

2개의 크로마토그래피 단계 (단백질 A 및 AEX)만을 사용하는 4개의 mAb4 정제 배치로부터의 DS를 -40℃, 5℃ 및 25℃에서 최대 6개월 동안 안정성 연구에 배치하였다 (도 11a). 25℃에서 평균 PS80 분해는 1개월 직후 대략 20% 및 6개월 후 대략 45%였다. 3개의 크로마토그래피 단계 (단백질 A, AEX 및 CEX)를 사용하는 3개의 mAb4 정제 배치로부터의 DS를 -40℃, 5℃ 및 25℃에서 최대 6개월 동안 안정성 연구에 배치하였다 (도 11b). 25℃에서 평균 PS80 분해는 6개월 후에도 10%를 넘지 않았다. 이들 결과는 CEX가 불순물 (예컨대 리파제)을 제거하고 PS-80 안정성을 개선한다는 주장을 추가로 뒷받침한다.

전체 프로세스에서 AEX 단계를 스킵할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 단백질 A 단계 이후의 물질, 구체적으로, 여과된 중화된 바이러스 불활성화된 풀 (FNVIP)을 CEX 칼럼에 로딩하였다. 생성된 CEX 풀은 DS로 제형화되었고, "FNVIP-CEXP DS"로 명명되었다. 더욱이, CEX 스트립에서 식별된 리파제 중 하나인 LPLA2를 양성 리파제 대조군으로 2개의 농도, 5 ppm 및 50 ppm에서 DS에 스파이크하였다. 이들 DS 샘플을 단백질 A 풀 (PAP), FNVIP, AEXP, 플라시보 (DS가 없는 동일한 제형), 및 3-칼럼 정제 프로세스 (단백질 A, AEX 및 CEX)로부터의 DS와 함께 5℃ 및 40℃에서 안정성 연구에 배치하였다 (도 12). 40℃에서 12주 후, PAP DS, FNVIP DS, 및 LPLA2-스파이크된 DS 샘플 둘 모두는 50% 초과의 PS80 분해를 경험한 반면, 플라시보 DS 및 표준 3-칼럼 프로세스 DS는 10% PS80 분해 이하로 유지되었다. 이들 결과는 리파제, 예컨대 LPLA2가 PS80 분해를 유발하고 정제 프로세스의 PAP 및 FNVIP에 더 농축되어 있음을 나타낸다. AEXP DS 및 FNVIP-CEXP DS PS80은 40℃에서 12주 후에 대략 30 - 40 % 분해되었으며, 이는 mAb4 DS로부터 잔류 리파제를 완전히 제거하기 위해 3-칼럼 정제 프로세스 (단백질 A, AEX 및 CEX)가 필요함을 시사한다.

CEX에 의해 리파제가 제거된다는 추가 확인을 위해, 500 L HCCF 배치 (19K-1308-19002) 및 2000 L HCCF 배치 (W18-MK1308-010)로부터의 프로세스 중간체 샘플을 액체 크로마토그래피 - 다중 반응 모니터링 (LC-MRM)을 위해 제출하였다. 세 가지 리파제: 포스포리파제 B-유사 2 (PLBL2), 포스포리파제 A2 XV (LPLA2), 및 지단백질 리파제 (LPL)를 정량화하기 위해 LC-MRM을 수행하였다. 하기 표 7의 분석 결과를 참조한다.

<표 10>

mAb4 프로세스 중간체에서 내인성 PLBL2, LPLA2 및 LPL의 상대적 정량화

BLQ = 정량화 한계 미만. BLQ ≤ 1 ng/mg

실시예 7: 리파제 스파이크 연구 - 항-CTLA4 항체인 MK-1308을 사용한 PLBL2, LPL 및 염기성 변이체의 청소

본 실시예의 목적은 프로세스 및 생성물 관련 불순물을 제거하기 위한 개별 단위 작동의 능력을 이해하는 것이었다. PLBL2 및 LPL의 청소는 각 단계에 대해 AEX 농축된 스트립 및 CEX 농축된 스트립으로 공급물을 스파이크함으로써 평가하였다. 다중 반응 모니터링-질량 분석법 (MRM-MS) 리파제 검정을 사용하여 리파제 수준을 결정하였다.

음이온 교환 크로마토그래피 (AEX)는 포로스 HQ50 수지를 사용한다. 항-CTLA4 항체는 200 g 생성물/L 수지의 표적에 로딩된다. 항체는 칼럼을 통해 유동하는 반면, 불순물, 예컨대 숙주 세포 단백질, HMW 및 DNA는 칼럼에 결합한다. AEX 스트립의 일부를 1:1 부피비의 20 mM 아세트산나트륨 pH 5.1을 사용하여 희석하고, 30 kDa 재생된 셀룰로스 한외여과막을 사용하여 농축하고, 정용여과하고, 1M 트리스 염기를 사용하여 7.5의 표적 pH로 pH를 조절하였다. AEX 단계에 걸쳐 rHCP, 리파제 및 HMW 청소를 평가하기 위해 AEXL에 농축되고 투석된 AEX 스트립을 스파이크하였다. AEX 단계에 걸쳐 rDNA 청소를 평가하기 위해 AEXL에 CHO DNA 농축물을 스파이크하였다.

양이온 교환 크로마토그래피 (CEX)는 포로스 HS50 수지를 사용한다. 항-CTLA4 항체는 40 g 생성물/L 수지의 표적에 로딩된다. 불순물, 예컨대 HCP, HMW, 및 rProA 리간드를 용리 완충제 중 염화나트륨 농도에 의해 분리한다. CEX 스트립의 일부를 1:1 부피비의 20 mM 아세트산나트륨 pH 5.1을 사용하여 희석하고, 30 kDa 재생된 셀룰로스 한외여과막을 사용하여 농축하고 정용여과하였다. CEX 단계에 걸쳐 rHCP, 리파제, 염기성 변이체 및 HMW 청소를 평가하기 위해 CEXL에 농축되고 투석된 CEX 스트립을 스파이크하였다.

맙셀렉트 슈어 단백질 A 리간드를 지이 헬스케어로부터 구입하고, 탈이온수에서 0.2 g/L로 희석하고, CEX 단계에 걸쳐 rProA 리간드 청소를 평가하기 위해 CEXL에 스파이크하였다. 테스트된 모든 rProA 리간드 수준 (최대 79 ppm)은 CEXP에서 LOQ (0.3 mg/ml) 미만을 초래하였다.

AEX는 더 낮은 공급물 pH 및 더 높은 공급물 전도도에서 실행된 반면, CEX는 중심점 조건에서 실행되었다. AEX에 대한 중심점 조건은 하기와 같다: 로드: pH 7.5, ≤ 5 mS/cm, 200 g/L, 세척: 25 mM 트리스-HCl, pH 7.5. CEX에 대한 중심점 조건은 하기와 같다: 로드: pH 5.1, ≤ 6 mS/cm, 40 g/L, 세척: 20 mM 아세트산나트륨, pH 5.1, 및 용리액: 20 mM 아세트산나트륨, pH 5.1, 165 mM NaCl을 첨가함으로써 18 mS/cm 달성됨.

각 스파이크 수준에 대한 공급물 및 생성물 PLBL2 결과는 도 14-도 15에 나타낸다. CEX에 걸친 거의 모든 스파이크 수준에 대해, PLBL2는 1.0 ppm의 정량화 한계 (LOQ) 미만으로 청소되었다 (도 15). CEX에 대한 최대 PLBL2 수용력은 약 62 ppm이었다 (도 15). AEX의 경우, AEXL의 PLBL2 스파이크 수준이 증가함에 따라 AEXP의 PLBL2 수준이 기하급수적으로 증가하였다 (도 14). AEX에 대한 최대 PLBL2 수용력은 약 350-400 ppm이었다 (도 14).

각 스파이크 수준에 대한 공급물 및 생성물 LPL 결과는 도 16-도 17에 나타낸다. CEX에 걸친 모든 스파이크 수준에 대해, LPL 둘 모두는 1.0 ppm의 LOQ 미만으로 청소되었다 (도 17). CEX에 대한 최대 LPL 수용력은 약 94.6 ppm이었다 (도 17). AEX의 경우, AEXL의 LPL 스파이크 수준이 증가함에 따라 AEXP의 LPL 수준이 기하급수적으로 증가하였다 (도 16). AEX에 대한 최대 LPL 수용력은 약 300-350 ppm이었다 (도 16).

다양한 수준에서 CEX 농축된 스트립으로 공급물을 스파이크하고 HP-IEX를 사용하여 생성된 염기성 변이체 수준을 측정함으로써 중심점 조건에서 CEX에 걸쳐 염기성 변이체의 청소를 연구하였다. 각 스파이크 수준에 대한 공급물 및 생성물 염기성 변이체 결과는 도 18에 나타낸다. 염기성 변이체 수준은 처음 2개의 불순물 스파이크 수준에 대해 CEXP에서 일정하게 유지되었으며 (도 18), 이는 약 6.4%의 최대 HMW 수준에 해당하였다 (도 19). 염기성 변이체는 제3 및 제4 스파이크 수준에서 CEXP에서 선형으로 증가하였다 (도 18). CEX에 대한 염기성 변이체에 대한 최대 수용력은 30.9%였지만 (도 18), CEXP의 HMW 수준은 5.0%였으며 (도 13), 이는 약 2%의 예상되는 상업적 DS 사양을 충족하지 않았다. 따라서, CEX에 대한 염기성 변이체에 대한 최대 수용력은 21.5%였다 (도 18).

본원에 인용된 모든 참고문헌은 각 개별 간행물, 데이터베이스 엔트리 (예를 들어 진뱅크 서열 또는 유전자 ID 엔트리), 특허 출원 또는 특허가 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것처럼 동일한 정도로 참조로 포함된다. 이러한 참조에 의한 포함 진술은 출원인에 의해 37 C.F.R. §1.57(b)(1)에 따라, 각 및 모든 개별 간행물, 데이터베이스 엔트리 (예를 들어 진뱅크 서열 또는 유전자 ID 엔트리), 특허 출원 또는 특허와 관련된 것으로 의도되며, 이들 각각은 이러한 인용이 참조에 의한 포함 전용 진술에 바로 인접하지 않더라도 37 C.F.R. §1.57(b)(2)에 따라 명백하게 식별된다. 명세서 내에서 참조에 의한 포함에 대한 전용 진술 (있는 경우)의 포함은 참조에 의한 포함에 대한 이러한 일반적인 진술을 어떤 식으로든 약화시키지 않는다. 본원의 참고문헌 인용은 참고문헌이 적절한 선행 기술임을 인정하기 위한 것이 아니며, 이들 간행물 또는 문서의 내용 또는 날짜에 대한 어떠한 인정을 구성하지도 않는다.

표 11은 서열 목록에서 CTLA4-관련 서열의 간략한 설명을 제공한다.

<표 11>

SEQUENCE LISTING <110> MERCK SHARP & DOHME CORP. Chmielowski, Rebecca Insaidoo, Francis Miller, Justin Roush, David Shah, Darshini Welsh, John <120> METHODS AND COMPOSITIONS COMPRISING AN ANTI-CTLA4 MONOCLONAL ANTIBODY WITH REDUCED HOST CELL PROTEINS AND INCREASED POLYSORBATE-80 STABILITY <130> 24815 <150> 62/904,331 <151> 2019-09-23 <160> 35 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light and heavy chain Ipilimumab - CDRL1 <400> 1 Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light and heavy chain Ipilimumab - CDRL2 <400> 2 Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light and heavy chain Ipilimumab - CDRL3 <400> 3 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light and heavy chain Ipilimumab - CDRH1 <400> 4 Ser Tyr Thr Met His 1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light and heavy chain Ipilimumab - CDRH2 <400> 5 Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light and heavy chain Ipilimumab - CDRH3 <400> 6 Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr 1 5 <210> 7 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain VR - Ipilimumab <400> 7 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain VR - Ipilimumab <400> 8 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 9 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mature heavy chain and the mature light chain of Ipilimumab <400> 9 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 10 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mature heavy chain and the mature light chain of Ipilimumab <400> 10 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody CDRH1 <400> 11 Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asn Trp 1 5 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody CDRH2 <400> 12 Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr 1 5 10 <210> 13 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody CDRH3 <400> 13 Thr Ala Gln Phe Ala Tyr 1 5 <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody CDRL1 <400> 14 Glu Asn Ile Tyr Gly Gly 1 5 <210> 15 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody CDRL2 <400> 15 Gly Ala Thr 1 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody CDRL3 <400> 16 Gln Asn Val Leu Arg Ser Pro Phe Thr 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody CDRL3 <400> 17 Gln Asn Val Leu Ser Arg His Pro Gly 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody CDRL3 <400> 18 Gln Asn Val Leu Ser Ser Arg Pro Gly 1 5 <210> 19 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 8D2/8D2 (RE) VH <400> 19 Glu Val Lys Leu Asp Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Pro Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asn 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Gly Glu Asp Met Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Ala Gln Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ala 115 <210> 20 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 8D2/8D2 (RE) VL <400> 20 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Gly Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Gly 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Arg Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 Phe Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Met Ser Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Arg Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Ser Leu His Pro 65 70 75 80 Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Arg Ser Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 <210> 21 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 8D2H1L1 VH <400> 21 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asn 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Ala Gln Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 22 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 8D2H1L1 VL <400> 22 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Gly 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Arg Lys Gln Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Ser Gly Met Ser Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Lys Ile Ser Ser Leu His Pro 65 70 75 80 Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Arg Ser Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 23 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 8D2H2L2 VH <400> 23 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asn 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Ala Gln Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 24 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 8D2H2L2 VL <400> 24 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Gly 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Arg Ser Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 25 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 8D2H2L2 VH - VARIANT 1 <400> 25 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asn 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Ala Gln Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 26 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 8D3H3L3 VL <400> 26 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asn 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Glu Tyr Ala Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Ala Gln Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 27 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 8D3H3L3 VL <400> 27 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Gly 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Thr Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Arg Ser Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 28 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 8D2H2L15 VH <400> 28 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asn 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Ala Gln Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 29 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 8D2H2L15 VL <400> 29 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Gly 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Ser Arg His Pro 85 90 95 Gly Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 30 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 8D2H2L17 VH <400> 30 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asn 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Ala Gln Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 31 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 8D2H2L17 VL <400> 31 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Gly 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Ser Ser Arg Pro 85 90 95 Gly Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 32 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 8D2H2L2 Full Heavy Chain - VARIANT 1 <400> 32 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asn 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Ala Gln Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 33 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 8D2H2L2 Full Light Chain - VARIANT 1 <400> 33 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Gly 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Arg Ser Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 34 <211> 7 <212> PRT <213> artifical sequence <400> 34 Leu Thr Phe Pro Thr Gly Arg 1 5 <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> artifical sequence <400> 35 Leu Val Ala Ala Leu Tyr Lys 1 5

Claims

하기를 포함하며:
(i) 약 10 mg/ml 내지 약 200 mg/ml의 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
(ii) 약 5 mM 내지 약 20 mM 완충제;
(iii) 약 6% 내지 8% 중량/부피 (w/v) 비환원당;
(iv) 약 0.01% 내지 약 0.10% 비이온성 계면활성제; 및
(v) 약 1 mM 내지 약 20 mM 항산화제, 및
(vi) 여기서 PLBL2, LPLA2 및 LPL의 수준은 ≤ 1 ng/ml CTLA4 항체인
조성물.
하기를 포함하며:
(i) 약 10 mg/ml 내지 약 200 mg/ml의 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
(vii) 약 5 mM 내지 약 20 mM 완충제;
(viii) 약 6% 내지 8% 중량/부피 (w/v) 비환원당;
(ix) 약 0.01% 내지 약 0.10% 비이온성 계면활성제; 및
(x) 약 1 mM 내지 약 20 mM 항산화제;
(xi) 잔류량의 숙주 세포 리파제, 여기서 잔류량의 숙주 세포 리파제는 2 ppm 미만인
조성물.
항-CTLA4 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 잔류량의 숙주 세포 리파제, 및 폴리소르베이트-80을 포함하는 조성물이며, 여기서 조성물은 안정한 폴리소르베이트-80 농도를 포함하고, 여기서 안정한 PS80 농도는 10% PS-80 분해 이하로 유지되는 것인 조성물.
제3항에 있어서, 리파제가 포스포리파제 B-유사 2 (PLBL2), 지단백질 리파제 (LPL), 리소좀 포스포리파제 A2 (LPLA2), 포스포리파제 A2 VII (LP-PLA2), 및 리소좀산 리파제 A (LAL)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
제4항에 있어서, PLBL2, LPLA2 및 LPL의 수준이 ≤ 1 ng/mg인 조성물.
제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, mg CTLA4 항체 당 1 ng 미만의 PLBL2를 포함하는 조성물.
제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, mg CTLA4 항체 당 1 ng 미만의 LPLA2를 포함하는 조성물.
제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, mg CTLA4 항체 당 1 ng 미만의 LPL을 포함하는 조성물.
제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, mg CTLA4 항체 당 1 ng 미만의 LP-PLA2를 포함하는 조성물.
제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, mg CTLA4 항체 당 1 ng 미만의 LAL을 포함하는 조성물.
제3항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, PS-80 분해가 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 갖는 HPLC 시스템에서 질량 분석법 (MS), 액체 크로마토그래피-질량 분석법 (LCMS), 또는 고체상 추출 (SPE)을 포함하는 다양한 방법을 사용하여 무손상 PS-80 분자의 양에 의해 측정되는 것인 조성물.
제3항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, PS-80 분해가 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 갖는 HPLC 시스템에서 질량 분석법 (MS), 액체 크로마토그래피-질량 분석법 (LCMS), 또는 고체상 추출 (SPE)을 포함하는 다양한 방법을 사용하여 분해된 생성물의 양에 의해 측정되는 것인 조성물.
제3항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 약 10 mg/ml 내지 약 200 mg/ml의 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물.
제3항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 25 mg/ml의 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물.
제3항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 50 mg/ml의 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물.
제3항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 약 10 mg/ml 내지 약 200 mg/ml의 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편; (ii) 약 5 mM 내지 약 20 mM 완충제; (iii) 약 6% 내지 8% 중량/부피 (w/v) 비환원당; (iv) 약 0.01% 내지 약 0.10% PS-80; 및 (v) 약 1 mM 내지 약 20 mM 항산화제를 포함하는 조성물.
제3항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, PS-80 농도가 영점시간 결과와 비교하여 ± 0.02 mg/mL로 유지되는 것인 조성물.
제3항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, PS-80 분해가 25℃에서 적어도 6개월 동안 10% 이하로 유지되는 것인 조성물.
제16항에 있어서, 완충제가 L-히스티딘 완충제 또는 아세트산나트륨 완충제인 조성물.
제16항에 있어서, 비환원당이 수크로스인 조성물.
제16항에 있어서, 항산화제가 메티오닌 또는 그의 제약상 허용되는 염인 조성물.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CTLA4 항체가 하기를 포함하는 것인 조성물:
i. 서열식별번호(SEQ ID NO): 14, 15 및 16에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열식별번호: 11, 12 및 13에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR;
ii. 서열식별번호: 14, 15 및 17에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열식별번호: 11, 12 및 13에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR; 또는
iii. 서열식별번호: 14, 15 및 18에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열식별번호: 11, 12 및 13에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR.
제22항에 있어서, 항-CTLA4 항체가 하기를 포함하는 것인 조성물:
a. 서열식별번호: 19에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 20에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
b. 서열식별번호: 21에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 22에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
c. 서열식별번호: 23에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 24에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
d. 서열식별번호: 25에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 24에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
e. 서열식별번호: 26에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 27에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
f. 서열식별번호: 28에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 29에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
g. 서열식별번호: 30에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 31에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 제1 단백질 A 크로마토그래피 단계, 제2 음이온 교환 크로마토그래피 단계, 및 제3 양이온 교환 단계를 포함하는 프로세스에 의해 정제되어 이에 의해 정제된 조성물을 생산하는 것인 조성물.
항-CTLA4 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 잔류량의 포스포리파제 B-유사 2 (PLBL2), 및 폴리소르베이트-80을 포함하는 조성물이며, 여기서 조성물은 안정한 폴리소르베이트-80 농도를 포함하고, 여기서 안정한 PS80 농도는 10% PS-80 분해 이하로 유지되는 것인 조성물.
제25항에 있어서, 1 ng/mg 미만의 PLBL2를 포함하는 조성물.
제25항에 있어서, PS-80 분해가 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 갖는 HPLC 시스템에서 질량 분석법 (MS), 액체 크로마토그래피-질량 분석법 (LCMS), 또는 고체상 추출 (SPE)을 포함하는 다양한 방법을 사용하여 무손상 PS-80 분자의 양에 의해 측정되는 것인 조성물.
제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, PS-80 분해가 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 갖는 HPLC 시스템에서 질량 분석법 (MS), 액체 크로마토그래피-질량 분석법 (LCMS), 또는 고체상 추출 (SPE)을 포함하는 다양한 방법을 사용하여 분해된 생성물의 양에 의해 측정되는 것인 조성물.
제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 약 10 mg/ml 내지 약 200 mg/ml의 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물.
제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 25 mg/ml의 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물.
제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 50 mg/ml의 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물.
제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 (i) 약 10 mg/ml 내지 약 200 mg/ml의 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편; (ii) 약 5 mM 내지 약 20 mM 완충제; (iii) 약 6% 내지 8% 중량/부피 (w/v) 비환원당; (iv) 약 0.01% 내지 약 0.10% 폴리소르베이트-80; 및 (v) 약 1 mM 내지 약 20 mM 항산화제를 포함하고, 여기서 PLBL2의 수준이 ≤ 1 ng/mg이고, 평균 폴리소르베이트-80 분해가 6개월 후 10% 이하인 조성물.
제25항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리소르베이트-80 농도가 영점시간 결과와 비교하여 ± 0.02 mg/mL로 유지되는 것인 조성물.
제25항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, PS-80 분해가 25℃에서 적어도 6개월 동안 10% 이하로 유지되는 것인 조성물.
제32항에 있어서, 완충제가 L-히스티딘 완충제 또는 아세트산나트륨 완충제인 조성물.
제32항에 있어서, 비환원당이 수크로스인 조성물.
제32항에 있어서, 항산화제가 메티오닌 또는 그의 제약상 허용되는 염인 조성물.
제32항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CTLA4 항체가 하기를 포함하는 것인 조성물:
iv. 서열식별번호: 14, 15 및 16에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열식별번호: 11, 12 및 13에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR;
v. 서열식별번호: 14, 15 및 17에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열식별번호: 11, 12 및 13에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR; 또는
vi. 서열식별번호: 14, 15 및 18에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR 및 서열식별번호: 11, 12 및 13에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR.
제38항에 있어서, 항-CTLA4 항체가 하기를 포함하는 것인 조성물:
a. 서열식별번호: 19에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 20에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
b. 서열식별번호: 21에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 22에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
c. 서열식별번호: 23에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 24에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
d. 서열식별번호: 25에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 24에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
e. 서열식별번호: 26에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 27에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
f. 서열식별번호: 28에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 29에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
g. 서열식별번호: 30에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 31에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
제32항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 제1 단백질 A 크로마토그래피 단계, 제2 음이온 교환 크로마토그래피 단계, 및 제3 양이온 교환 단계를 포함하는 프로세스에 의해 정제되어 이에 의해 정제된 조성물을 생산하는 것인 조성물.
정제된 항-CTLA4 모노클로날 항체 조성물이며, 여기서 조성물은 제1 단백질 A 크로마토그래피 단계, 제2 음이온 교환 크로마토그래피 단계, 및 제3 양이온 교환 단계를 포함하는 프로세스에 의해 정제되어 이에 의해 정제된 조성물을 생산하고, 여기서 햄스터 PLBL2의 양은 1 ng/mg 미만이고, 조성물은 안정한 폴리소르베이트-80 농도를 포함하고, 여기서 안정한 PS80 농도는 10% PS-80 분해 이하로 유지되는 것인 조성물.
조성물 내 PS-80 안정성을 개선하는 방법이며, 여기서 조성물은 단백질 A, 음이온 교환 및 양이온 교환으로 이루어진 3개의 크로마토그래피 단계를 포함하는 정제 프로세스에 의해 정제되고, 여기서 조성물은 (i) 약 10 mg/ml 내지 약 200 mg/ml의 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편; (ii) 약 5 mM 내지 약 20 mM 완충제; (iii) 약 6% 내지 8% 중량/부피 (w/v) 비환원당; (iv) 약 0.01% 내지 약 0.10% 비이온성 계면활성제; 및 (v) 약 1 mM 내지 약 20 mM 항산화제를 포함하고, 여기서 PLBL2의 수준은 mg 항-CTLA4 항체 당 ≤ 1 ng인 방법.