JP2023500775A - 宿主細胞タンパク質が減少し、ポリソルベート－８０安定性が増加した、抗ｃｔｌａ４モノクローナル抗体を含む方法および組成物 - Google Patents

宿主細胞タンパク質が減少し、ポリソルベート－８０安定性が増加した、抗ｃｔｌａ４モノクローナル抗体を含む方法および組成物 Download PDF

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Abstract

本明細書では、クロマトグラフィープロセスにおいて生成タンパク質から宿主細胞リパーゼを分離する方法、およびクロマトグラフィープロセスを使用して生成タンパク質から宿主細胞リパーゼを分離することによって、生成タンパク質製剤内のポリソルベート－８０安定性を改善する方法が提供される。本明細書ではまた、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む組成物も提供される。別の態様では、そのような組成物は、低下したレベルの宿主細胞タンパク質および／または増加したレベルのポリソルベート－８０（ＰＳ－８０）安定性をさらに含む。

Description

本明細書では、クロマトグラフィープロセスにおいて生成タンパク質（例えばモノクローナル抗体）から宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）（例えばリパーゼ）を分離する方法が提供される。本明細書ではまた、クロマトグラフィープロセスを使用して生成タンパク質（例えばモノクローナル抗体）からＨＣＰ（例えばリパーゼ）を分離することによって、生成タンパク質製剤（例えば、医薬物質製剤または医薬品製剤）内のポリソルベート－８０（ＰＳ－８０）安定性を改善する方法も提供される。本明細書ではまた、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む組成物も提供される。別の態様では、ＰＳ－８０安定性のレベルが増加したそのような組成物は、低下したレベルの宿主細胞タンパク質をさらに含む。
生成タンパク質（例えばモノクローナル抗体）のバイオプロセスおよび製造では、ＨＣＰ（例えばリパーゼ）は、生成タンパク質から除去することが多くの場合困難な不純物の一部を構成する。そのような不純物は、バイオ医薬品の安全性および有効性に対して様々な問題を引き起こす可能性がある。世界中の規制当局は、バイオ医薬品が、不純物のレベル、ならびに不純物の検出および定量のための試験を含む特定の許容基準を満たすことを要求している。したがって、生成タンパク質（例えばモノクローナル抗体）からＨＣＰ（例えばリパーゼ）を除去するための効率的かつ効果的なプロセスを開発することが望ましい。
ＣＴＬＡ４ ｍＡｂまたはＣＴＬＡ４リガンドは、ＣＴＬＡ４がその天然のリガンドに結合するのを防ぎ、それによって、ＣＴＬＡ４によるＴ細胞負調節シグナルの伝達を遮断し、様々な抗原に対するＴ細胞の応答性を高めることができる。この局面では、インビボ試験およびインビトロ試験からの結果は実質的に一致している。ＣＴＬＡ－４は、黒色腫の単剤療法として、または黒色腫、腎癌、マイクロサテライト不安定性を伴う結腸直腸癌に対する抗ＰＤ－１抗体ニボルマブとの併用療法の一部として、ヒトに使用するためのイピリムマブのＦＤＡ承認後の免疫療法標的として検証された。（Ｚｈａｎｇ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｌａｎｄｓｃａｐｅ Ｂａｓｅｄ ｒａｎｋｉｎｇ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ ２２ Ｍａｊｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒｓ ｔｏ Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ａｎｔｉ－ＣＴＬＡ－４ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃａｎｃｅｒｓ，１２（２），２８４）。前立腺癌、膀胱癌、結腸直腸癌、消化管の癌、肝癌、悪性黒色腫などを治療するための臨床試験では、いくつかのＣＴＬＡ４ ｍＡｂが試験されている（Ｇｒｏｓｓｏ ｅｔ ａｌ．，ＣＴＬＡ－４ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｍｏｄｅｌｓ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎ．１３：５（２０１３））。
Ｚｈａｎｇ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｌａｎｄｓｃａｐｅ Ｂａｓｅｄ ｒａｎｋｉｎｇ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ ２２ Ｍａｊｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒｓ ｔｏ Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ａｎｔｉ－ＣＴＬＡ－４ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃａｎｃｅｒｓ，１２（２），２８４ Ｇｒｏｓｓｏ ｅｔ ａｌ．，ＣＴＬＡ－４ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｍｏｄｅｌｓ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎ．１３：５（２０１３）
本開示は、クロマトグラフィープロセスにおいて生成タンパク質（例えばモノクローナル抗体）からＨＣＰ（例えばリパーゼ）を分離する方法、並びに、クロマトグラフィープロセスを使用して生成タンパク質（例えばモノクローナル抗体）からＨＣＰ（例えばリパーゼ）を分離することによって、生成タンパク質製剤（例えば、医薬物質製剤または医薬品製剤）内のＰＳ－８０安定性を改善する方法を提供する。本開示は、ＨＣＰ（例えばリパーゼ）と生成タンパク質（例えばモノクローナル抗体）とが、２つのタンパク質間の分離係数（α）および／またはＨＣＰ（例えばリパーゼ）の分配係数（ＫＰ）が特定の数値範囲に達する操作条件下で十分に分離され得るという発見に少なくとも部分的に基づく。
一態様では、生成タンパク質は抗ＣＴＬＡ４抗体である。
一態様では、クロマトグラフィープロセスによって、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片から宿主細胞リパーゼを分離する方法が本明細書で提供され、該方法は、
（ａ）ローディング操作条件下で、リパーゼと抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片とを含むロード流体（ｌｏａｄ ｆｌｕｉｄ）をクロマトグラフィー樹脂に通過させること、および
（ｂ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片をフロースルー中で回収することを含み、
ここで、分離係数（α）は、リパーゼの分配係数（ＫＰ）と抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片のＫＰとの比であり、そしてここで、ｌｏｇ αが、ローディング操作条件下で０．５よりも大きい。
特定の実施形態では、ｌｏｇ αは、ローディング操作条件下で１．０よりも大きい。
いくつかの実施形態では、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは、ローディング操作条件下で１．０よりも大きい。他の実施形態では、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは、ローディング操作条件下で１．５よりも大きい。
特定の実施形態では、ローディング操作条件下で、ｌｏｇ αは０．５よりも大きく、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは１．０よりも大きい。いくつかの実施形態では、ローディング操作条件下で、ｌｏｇ αは０．５よりも大きく、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは１．５よりも大きい。他の実施形態では、ローディング操作条件下で、ｌｏｇ αは１．０よりも大きく、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは１．０よりも大きい。さらに他の実施形態では、ローディング操作条件下で、ｌｏｇ αは１．０よりも大きく、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは１．５よりも大きい。
別の態様では、クロマトグラフィープロセスによって、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片から宿主細胞リパーゼを分離する方法が本明細書で提供され、該方法は、
（ａ）リパーゼと、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片とを含むロード流体をクロマトグラフィー樹脂に通過させること、および
（ｂ）溶出操作条件下で溶出溶液を用いて、クロマトグラフィー樹脂から抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を溶出することを含み、
ここで、αが、リパーゼのＫＰと抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片のＫＰとの比であり、そしてここで、ｌｏｇ αは、溶出操作条件下で０．５よりも大きい。
特定の実施形態では、ｌｏｇ αは、溶出操作条件下で１．０よりも大きい。
いくつかの実施形態では、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは、溶出操作条件下で１．０よりも大きい。他の実施形態では、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは、溶出操作条件下で１．５よりも大きい。
特定の実施形態では、溶出操作条件下で、ｌｏｇ αは０．５よりも大きく、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは１．０よりも大きい。いくつかの実施形態では、溶出操作条件下で、ｌｏｇ αは０．５よりも大きく、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは１．５よりも大きい。他の実施形態では、溶出操作条件下で、ｌｏｇ αは１．０よりも大きく、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは１．０よりも大きい。さらに他の実施形態では、溶出操作条件下で、ｌｏｇ αは１．０よりも大きく、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは１．５よりも大きい。
本明細書で提供される様々な方法のいくつかの実施形態では、リパーゼは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞リパーゼである。
特定の実施形態では、リパーゼは、ホスホリパーゼＢ様２（ＰＬＢＬ２）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、リソソームホスホリパーゼＡ２（ＬＰＬＡ２）、ホスホリパーゼＡ２ ＶＩＩ（ＬＰ－ＰＬＡ２）およびリソソーム酸リパーゼＡ（ＬＡＬ）からなる群から選択される。一実施形態では、リパーゼはＰＬＢＬ２である。別の実施形態では、リパーゼはＬＰＬである。さらに別の実施形態では、リパーゼはＬＰＬＡ２である。一実施形態では、リパーゼはＬＰ－ＰＬＡ２である。別の実施形態では、リパーゼはＬＡＬである。また別の実施形態では、リパーゼは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異なるリパーゼを含む。またさらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬからなる群から選択される２つ、３つ、４つまたは５つの異なるリパーゼを含む。一実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰＬを含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。一実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＰＬＡ２を含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。一実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＡＬを含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。またさらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。
特定の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬからなる群から選択される。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼはＰＬＢＬ２である。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼはＬＰＬである。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼはＬＰＬＡ２である。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼはＬＰ－ＰＬＡ２である。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼはＬＡＬである。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異なるＣＨＯ細胞リパーゼを含む。またさらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬからなる群から選択される２つ、３つ、４つまたは５つの異なるＣＨＯ細胞リパーゼを含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰＬを含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＰＬＡ２を含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＡＬを含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。またさらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。
本明細書で提供される様々な方法のいくつかの実施形態では、クロマトグラフィー樹脂はイオン交換（ＩＥＸ）樹脂である。他の実施形態では、クロマトグラフィー樹脂は疎水性相互作用（ＨＩＣ）樹脂である。一実施形態では、ＩＥＸ樹脂はカチオン交換（ＣＥＸ）樹脂である。別の実施形態では、ＣＥＸ樹脂は混合モードＣＥＸ樹脂である。さらに別の実施形態では、ＩＥＸ樹脂はアニオン交換（ＡＥＸ）樹脂である。また別の実施形態では、ＡＥＸ樹脂は混合モードＡＥＸ樹脂である。
ＣＥＸ樹脂または混合モードＣＥＸ樹脂を使用する様々な方法の特定の実施形態では、操作条件のｐＨは約６．０未満である。ＣＥＸ樹脂または混合モードＣＥＸ樹脂を使用する様々な方法のいくつかの実施形態では、操作条件のｐＨは約５．５未満である。ＣＥＸ樹脂または混合モードＣＥＸ樹脂を使用する様々な方法の他の実施形態では、操作条件のｐＨは約５．０未満である。ＣＥＸ樹脂または混合モードＣＥＸ樹脂を使用する様々な方法のさらに他の実施形態では、操作条件のｐＨは約４．５～約５．５である。ＣＥＸ樹脂または混合モードＣＥＸ樹脂を使用する様々な方法のまた他の実施形態では、操作条件のｐＨは約４．５～約５．０である。ＣＥＸ樹脂または混合モードＣＥＸ樹脂を使用する様々な方法の特定の実施形態では、操作条件のｐＨは約５．０～約５．５である。ＣＥＸ樹脂または混合モードＣＥＸ樹脂を使用する様々な方法のいくつかの実施形態では、操作条件のｐＨは約４．９～約５．３である。
ＡＥＸ樹脂または混合モードＡＥＸ樹脂を使用する様々な方法の特定の実施形態では、操作条件のｐＨは約６．５を超える。ＡＥＸ樹脂または混合モードＡＥＸ樹脂を使用する様々な方法のいくつかの実施形態では、操作条件のｐＨは約６．９を超える。ＡＥＸ樹脂または混合モードＡＥＸ樹脂を使用する様々な方法の他の実施形態では、操作条件のｐＨは約７．２を超える。ＡＥＸ樹脂または混合モードＡＥＸ樹脂を使用する様々な方法のさらに他の実施形態では、操作条件のｐＨは約６．９～約７．９である。ＡＥＸ樹脂または混合モードＡＥＸ樹脂を使用する様々な方法のまた他の実施形態では、操作条件のｐＨは約７．２～約７．５である。ＡＥＸ樹脂または混合モードＡＥＸ樹脂を使用する様々な方法の特定の実施形態では、操作条件のｐＨは約７．５～約７．８である。
本明細書で提供される様々な方法の特定の実施形態では、操作条件は、塩を加えることによって操作溶液のイオン強度および／または導電率を調節することをさらに含む。一実施形態では、操作条件は、塩を加えることによって操作溶液のイオン強度を調節することをさらに含む。別の実施形態では、操作条件は、塩を加えることによって操作溶液の導電率を調節することをさらに含む。さらに別の実施形態では、操作条件は、塩を加えることによって操作溶液のイオン強度および導電率を調節することをさらに含む。いくつかの実施形態では、塩を加える効果は、所望のｌｏｇ αを達成することである。他の実施形態では、塩を加える効果は、リパーゼの所望のｌｏｇ ＫＰを達成することである。さらに他の実施形態では、塩を加える効果は、所望のｌｏｇ αと、リパーゼの所望のｌｏｇ ＫＰとを達成することである。
いくつかの実施形態では、操作溶液中の塩は、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムおよびＴｒｉｓ－ＨＣｌからなる群から選択される。一実施形態では、塩は塩化ナトリウムである。別の実施形態では、塩は酢酸ナトリウムである。さらに別の実施形態では、塩はリン酸ナトリウムである。また別の実施形態では、塩は硫酸アンモニウムである。一実施形態では、塩は硫酸ナトリウムである。別の実施形態では、塩はＴｒｉｓ－ＨＣｌである。
具体的な実施形態では、操作溶液中の塩化ナトリウムの濃度は約１００ｍＭ～約２２５ｍＭであり、クロマトグラフィー樹脂はＣＥＸであり、そして、操作条件のｐＨは約５．０～約６．０である。
別の具体的な実施形態では、操作溶液中の塩化ナトリウムの濃度は約１５０ｍＭ～約１８０ｍＭであり、クロマトグラフィー樹脂はＣＥＸであり、そして、操作条件のｐＨは約５．０～約６．０である。
さらに別の具体的な実施形態では、操作溶液中の酢酸ナトリウムの濃度は約１００ｍＭ～約２００ｍＭであり、クロマトグラフィー樹脂はＡＥＸであり、そして、操作条件のｐＨは約６．９～約７．８である。
また別の具体的な実施形態では、操作溶液中の硫酸ナトリウムの濃度は約５００ｍＭ～約６２０ｍＭであり、クロマトグラフィー樹脂はＨＩＣであり、そして、操作条件のｐＨは約７である。
またさらに別の具体的な実施形態では、操作溶液中の硫酸ナトリウムの濃度は約５１０ｍＭ～約５６０ｍＭであり、クロマトグラフィー樹脂はＨＩＣであり、そして、操作条件のｐＨは約７である。
さらに別の態様では、混合モードＡＥＸクロマトグラフィープロセスによって、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片からＰＬＢＬ２を分離し、ＰＳ－８０安定性を改善する方法が本明細書で提供され、該方法は、
（ａ）ＰＬＢＬ２と、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片とを含むロード流体を混合モードＡＥＸ樹脂に通過させること、および
（ｂ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片をフロースルー中で回収することを含み、
ここで、ロード流体のｐＨが約ｐＨ７．２～約ｐＨ７．６であり、そしてここで、ロード流体が塩を含まない。
また別の態様では、ＣＥＸクロマトグラフィープロセスによって、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片からＰＬＢＬ２を分離し、ＰＳ－８０安定性を改善する方法が本明細書で提供され、該方法は、
（ａ）ＰＬＢＬ２と、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片とを含むロード流体をＣＥＸ樹脂に通過させること、および
（ｂ）溶出溶液を用いて、ＣＥＸ樹脂から抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を溶出することを含み、
ここで、溶出溶液のｐＨが約ｐＨ４．９～約ｐＨ５．３であり、そしてここで、溶出溶液が、約１２０ｍＭ～約１７５ｍＭの塩化ナトリウムをさらに含む。
一実施形態では、ＣＥＸクロマトグラフィープロセスによって、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片からＰＬＢＬ２を分離し、ＰＳ－８０安定性を改善する方法は、
（ａ）ＰＬＢＬ２と、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片とを含むロード流体をＣＥＸ樹脂に通過させること、および
（ｂ）溶出溶液を用いて、ＣＥＸ樹脂から抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を溶出することを含み、
ここで、溶出溶液のｐＨは約ｐＨ５．１であり、そしてここで、溶出溶液は、約１５０ｍＭの塩化ナトリウムをさらに含む。
さらに別の実施形態では、ＣＥＸクロマトグラフィープロセスによって、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片からＰＬＢＬ２を分離し、ＰＳ－８０安定性を改善する方法は、
（ａ）ＰＬＢＬ２と、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片とを含むロード流体をＣＥＸ樹脂に通過させること、および
（ｂ）溶出溶液を用いて、ＣＥＸ樹脂から抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を溶出することを含み、
ここで、溶出溶液のｐＨは約ｐＨ５．１であり、そしてここで、溶出溶液は、約１６５ｍＭの塩化ナトリウムをさらに含む。
また別の態様では、ＣＥＸクロマトグラフィープロセスによって、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片からＬＰＬＡ２を分離し、ＰＳ－８０安定性を改善する方法が本明細書で提供され、該方法は、
（ａ）ＬＰＬＡ２と、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片とを含むロード流体をＣＥＸ樹脂に通過させること、および
（ｂ）溶出溶液を用いて、ＣＥＸ樹脂から抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を溶出することを含み、
ここで、溶出溶液のｐＨが約ｐＨ５．０～約ｐＨ５．４であり、そしてここで、溶出溶液が、約１５０ｍＭ～約２７５ｍＭの塩化ナトリウムをさらに含む。
一実施形態では、ＣＥＸクロマトグラフィープロセスによって、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片からＬＰＬＡ２を分離し、ＰＳ－８０安定性を改善する方法は、
（ａ）ＬＰＬＡ２と、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片とを含むロード流体をＣＥＸ樹脂に通過させること、および
（ｂ）溶出溶液を用いて、ＣＥＸ樹脂から抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を溶出することを含み、
ここで、溶出溶液のｐＨは約ｐＨ５．１であり、そしてここで、溶出溶液は、約１５０ｍＭの塩化ナトリウムをさらに含む。
別の実施形態では、ＣＥＸクロマトグラフィープロセスによって、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片からＬＰＬＡ２を分離し、ＰＳ－８０安定性を改善する方法は、
（ａ）ＬＰＬＡ２と、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片とを含むロード流体をＣＥＸ樹脂に通過させること、および
（ｂ）溶出溶液を用いて、ＣＥＸ樹脂から抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を溶出することを含み、
ここで、溶出溶液のｐＨは約ｐＨ５．１であり、そしてここで、溶出溶液は、約２００ｍＭの塩化ナトリウムをさらに含む。
さらに別の実施形態では、ＣＥＸクロマトグラフィープロセスによって、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片からＬＰＬＡ２を分離し、ＰＳ－８０安定性を改善する方法は、
（ａ）ＬＰＬＡ２と、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片とを含むロード流体をＣＥＸ樹脂に通過させること、および
（ｂ）溶出溶液を用いて、ＣＥＸ樹脂から抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を溶出することを含み、
ここで、溶出溶液のｐＨは約ｐＨ５．１であり、そしてここで、溶出溶液は、約２５０ｍＭの塩化ナトリウムをさらに含む。
本明細書で提供される様々な方法のさらなる実施形態では、ロード流体は、事前のクロマトグラフィープロセスから得られる溶出液である。一実施形態では、事前のクロマトグラフィープロセスは、アフィニティークロマトグラフィーを含む。別の実施形態では、事前のクロマトグラフィープロセスは、アフィニティークロマトグラフィー、それに続く非アフィニティークロマトグラフィーを含む。さらに別の実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーはプロテインＡクロマトグラフィーである。また別の実施形態では、非アフィニティークロマトグラフィーはＡＥＸクロマトグラフィーである。またさらに別の実施形態では、事前のクロマトグラフィープロセスは、プロテインＡクロマトグラフィー、それに続くＡＥＸクロマトグラフィーを含む。
またさらに別の態様では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤内のＰＳ－８０安定性を改善する方法が本明細書で提供され、該方法は、
（ａ）ローディング操作条件下で、宿主細胞リパーゼと、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片とを含むロード流体をクロマトグラフィー樹脂に通過させること、
（ｂ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片をフロースルー中で回収すること、
（ｃ）追加的に、宿主細胞リパーゼを含むフロースルー生成物を追加のクロマトグラフィー樹脂に通過させること、
（ｄ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を回収すること、および
（ｅ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤がＰＳ－８０を含むように、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を製剤化することを含み、
ここで、分離係数（α）が、リパーゼの分配係数（ＫＰ）と抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片のＫＰとの比であり、そしてここで、ｌｏｇ αは、ローディング操作条件下で０．５よりも大きい。
またさらに別の態様では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤内のＰＳ－８０安定性を改善する方法が本明細書で提供され、該方法は、
（ｆ）ローディング操作条件下で、ＰＬＢＬ２と、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片とを含むロード流体をクロマトグラフィー樹脂に通過させること、
（ｇ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片をフロースルー中で回収すること、
（ｈ）追加的に、ＰＬＢＬ２を含むフロースルー生成物を追加のクロマトグラフィー樹脂に通過させること、
（ｉ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を回収すること、および
（ｊ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤がＰＳ－８０を含むように、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を製剤化することを含み、
ここで、分離係数（α）が、リパーゼの分配係数（ＫＰ）と抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片のＫＰとの比であり、そしてここで、ｌｏｇ αは、ローディング操作条件下で０．５よりも大きい。
また別の態様では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片組成物内のＰＳ－８０分解を減少させる方法が本明細書で提供され、該方法は、
（ａ）ローディング操作条件下で、宿主細胞リパーゼと、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片とを含むロード流体をクロマトグラフィー樹脂に通過させること、
（ｂ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片をフロースルー中で回収すること、
（ｃ）宿主細胞リパーゼを含むフロースルー生成物を追加のクロマトグラフィー樹脂に通過させること、
（ｄ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を回収すること、および
（ｅ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤がＰＳ－８０を含むように、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を製剤化することを含む。
特定の実施形態では、ｌｏｇ αは、ローディング操作条件下で１．０よりも大きい。
いくつかの実施形態では、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは、ローディング操作条件下で１．０よりも大きい。他の実施形態では、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは、ローディング操作条件下で１．５よりも大きい。
特定の実施形態では、ローディング操作条件下で、ｌｏｇ αは０．５よりも大きく、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは１．０よりも大きい。いくつかの実施形態では、ローディング操作条件下で、ｌｏｇ αは０．５よりも大きく、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは１．５よりも大きい。他の実施形態では、ローディング操作条件下で、ｌｏｇ αは１．０よりも大きく、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは１．０よりも大きい。さらに他の実施形態では、ローディング操作条件下で、ｌｏｇ αは１．０よりも大きく、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは１．５よりも大きい。
別の態様では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤内のＰＳ－８０安定性を改善する方法が本明細書で提供され、該方法は、
（ａ）宿主細胞リパーゼと、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片とを含むロード流体をクロマトグラフィー樹脂に通過させること、
（ｂ）溶出操作条件下で溶出溶液を用いて、クロマトグラフィー樹脂から抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を溶出すること、および
（ｃ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤がＰＳ－８０含有溶液であるように、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を製剤化することを含み、
ここで、αが、リパーゼのＫＰと抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片のＫＰとの比であり、そしてここで、ｌｏｇ αは、溶出操作条件下で０．５よりも大きい。
特定の実施形態では、ｌｏｇ αは、溶出操作条件下で１．０よりも大きい。
いくつかの実施形態では、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは、溶出操作条件下で１．０よりも大きい。他の実施形態では、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは、溶出操作条件下で１．５よりも大きい。
特定の実施形態では、溶出操作条件下で、ｌｏｇ αは０．５よりも大きく、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは１．０よりも大きい。いくつかの実施形態では、溶出操作条件下で、ｌｏｇ αは０．５よりも大きく、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは１．５よりも大きい。他の実施形態では、溶出操作条件下で、ｌｏｇ αは１．０よりも大きく、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは１．０よりも大きい。さらに他の実施形態では、溶出操作条件下で、ｌｏｇ αは１．０よりも大きく、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは１．５よりも大きい。
本明細書で提供される様々な方法のいくつかの実施形態では、リパーゼは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞リパーゼである。
特定の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬからなる群から選択される。一実施形態では、リパーゼはＰＬＢＬ２である。別の実施形態では、リパーゼはＬＰＬである。さらに別の実施形態では、リパーゼはＬＰＬＡ２である。一実施形態では、リパーゼはＬＰ－ＰＬＡ２である。別の実施形態では、リパーゼはＬＡＬである。また別の実施形態では、リパーゼは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異なるリパーゼを含む。またさらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬからなる群から選択される２つ、３つ、４つまたは５つの異なるリパーゼを含む。一実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰＬを含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。一実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＰＬＡ２を含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。一実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＡＬを含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。またさらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。
特定の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬからなる群から選択される。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼはＰＬＢＬ２である。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼはＬＰＬである。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼはＬＰＬＡ２である。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼはＬＰ－ＰＬＡ２である。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼはＬＡＬである。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異なるＣＨＯ細胞リパーゼを含む。またさらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬからなる群から選択される２つ、３つ、４つまたは５つの異なるＣＨＯ細胞リパーゼを含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰＬを含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＰＬＡ２を含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＡＬを含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。またさらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。
本明細書で提供される様々な方法のいくつかの実施形態では、クロマトグラフィー樹脂はＩＥＸ樹脂である。他の実施形態では、クロマトグラフィー樹脂はＨＩＣ樹脂である。一実施形態では、ＩＥＸ樹脂はＣＥＸ樹脂である。別の実施形態では、ＣＥＸ樹脂は混合モードＣＥＸ樹脂である。さらに別の実施形態では、ＩＥＸ樹脂はＡＥＸ樹脂である。また別の実施形態では、ＡＥＸ樹脂は混合モードＡＥＸ樹脂である。
ＣＥＸ樹脂または混合モードＣＥＸ樹脂を使用する様々な方法の特定の実施形態では、操作条件のｐＨは約６．０未満である。ＣＥＸ樹脂または混合モードＣＥＸ樹脂を使用する様々な方法のいくつかの実施形態では、操作条件のｐＨは約５．５未満である。ＣＥＸ樹脂または混合モードＣＥＸ樹脂を使用する様々な方法の他の実施形態では、操作条件のｐＨは約５．０未満である。ＣＥＸ樹脂または混合モードＣＥＸ樹脂を使用する様々な方法のさらに他の実施形態では、操作条件のｐＨは約４．５～約５．５である。ＣＥＸ樹脂または混合モードＣＥＸ樹脂を使用する様々な方法のまた他の実施形態では、操作条件のｐＨは約４．５～約５．０である。ＣＥＸ樹脂または混合モードＣＥＸ樹脂を使用する様々な方法の特定の実施形態では、操作条件のｐＨは約５．０～約５．５である。ＣＥＸ樹脂または混合モードＣＥＸ樹脂を使用する様々な方法のいくつかの実施形態では、操作条件のｐＨは約４．９～約５．３である。
ＡＥＸ樹脂または混合モードＡＥＸ樹脂を使用する様々な方法の特定の実施形態では、操作条件のｐＨは約６．５を超える。ＡＥＸ樹脂または混合モードＡＥＸ樹脂を使用する様々な方法のいくつかの実施形態では、操作条件のｐＨは約６．９を超える。ＡＥＸ樹脂または混合モードＡＥＸ樹脂を使用する様々な方法の他の実施形態では、操作条件のｐＨは約７．２を超える。ＡＥＸ樹脂または混合モードＡＥＸ樹脂を使用する様々な方法のさらに他の実施形態では、操作条件のｐＨは約６．９～約７．９である。ＡＥＸ樹脂または混合モードＡＥＸ樹脂を使用する様々な方法のまた他の実施形態では、操作条件のｐＨは約７．２～約７．５である。ＡＥＸ樹脂または混合モードＡＥＸ樹脂を使用する様々な方法の特定の実施形態では、操作条件のｐＨは約７．５～約７．８である。
本明細書で提供される様々な方法の特定の実施形態では、操作条件は、塩を加えることによって操作溶液のイオン強度および／または導電率を調節することをさらに含む。一実施形態では、操作条件は、塩を加えることによって操作溶液のイオン強度を調節することをさらに含む。別の実施形態では、操作条件は、塩を加えることによって操作溶液の導電率を調節することをさらに含む。さらに別の実施形態では、操作条件は、塩を加えることによって操作溶液のイオン強度および導電率を調節することをさらに含む。いくつかの実施形態では、塩を加える効果は、所望のｌｏｇ αを達成することである。他の実施形態では、塩を加える効果は、リパーゼの所望のｌｏｇ ＫＰを達成することである。さらに他の実施形態では、塩を加える効果は、所望のｌｏｇ αと、リパーゼの所望のｌｏｇ ＫＰとを達成することである。
いくつかの実施形態では、操作溶液中の塩は、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムおよびＴｒｉｓ－ＨＣｌからなる群から選択される。一実施形態では、塩は塩化ナトリウムである。別の実施形態では、塩は酢酸ナトリウムである。さらに別の実施形態では、塩はリン酸ナトリウムである。また別の実施形態では、塩は硫酸アンモニウムである。一実施形態では、塩は硫酸ナトリウムである。別の実施形態では、塩はＴｒｉｓ－ＨＣｌである。
具体的な実施形態では、操作溶液中の塩化ナトリウムの濃度は約１００ｍＭ～約２２５ｍＭであり、クロマトグラフィー樹脂はＣＥＸであり、そして、操作条件のｐＨは約５．０～約６．０である。
別の具体的な実施形態では、操作溶液中の塩化ナトリウムの濃度は約１５０ｍＭ～約１８０ｍＭであり、クロマトグラフィー樹脂はＣＥＸであり、そして、操作条件のｐＨは約５．０～約６．０である。
さらに別の具体的な実施形態では、操作溶液中の酢酸ナトリウムの濃度は約１００ｍＭ～約２００ｍＭであり、クロマトグラフィー樹脂はＡＥＸであり、そして、操作条件のｐＨは約６．９～約７．８である。
また別の具体的な実施形態では、操作溶液中の硫酸ナトリウムの濃度は約５００ｍＭ～約６２０ｍＭであり、クロマトグラフィー樹脂はＨＩＣであり、そして、操作条件のｐＨは約７である。
またさらに別の具体的な実施形態では、操作溶液中の硫酸ナトリウムの濃度は約５１０ｍＭ～約５６０ｍＭであり、クロマトグラフィー樹脂はＨＩＣであり、操作条件のｐＨは約７である。
さらに別の態様では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤内のＰＳ－８０安定性を改善する方法が本明細書で提供され、該方法は、
（ａ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を含むロード流体を混合モードＡＥＸ樹脂に通過させること、
（ｂ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片をフロースルー中で回収すること、および
（ｃ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤がＰＳ－８０含有溶液であるように、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を製剤化することを含み、
ここで、ロード流体のｐＨは、約ｐＨ７．２～約ｐＨ７．６であり、そしてここで、ロード流体は、塩を含まない。
また別の態様では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤内のＰＳ－８０安定性を改善する方法が本明細書で提供され、該方法は、
（ａ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を含むロード流体をＣＥＸ樹脂に通過させること、
（ｂ）溶出溶液を用いて、ＣＥＸ樹脂から抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を溶出すること、および
（ｃ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤がＰＳ－８０含有溶液であるように、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を製剤化することを含み、
ここで、溶出溶液のｐＨは、約ｐＨ４．９～約ｐＨ５．３であり、そしてここで、溶出溶液は、約１２０ｍＭ～約１７５ｍＭの塩化ナトリウムをさらに含む。
一実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤内のＰＳ－８０安定性を改善する方法は、
（ａ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を含むロード流体をＣＥＸ樹脂に通過させること、
（ｂ）溶出溶液を用いて、ＣＥＸ樹脂から抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を溶出すること、および
（ｃ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤がＰＳ－８０含有溶液であるように、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を製剤化することを含み、
ここで、溶出溶液のｐＨは約ｐＨ５．１であり、そしてここで、溶出溶液は、約１５０ｍＭの塩化ナトリウムをさらに含む。
さらに別の実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤内のＰＳ－８０安定性を改善する方法は、
（ａ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を含むロード流体をＣＥＸ樹脂に通過させること、
（ｂ）溶出溶液を用いて、ＣＥＸ樹脂から抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を溶出すること、および
（ｃ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤がＰＳ－８０含有溶液であるように、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を製剤化することを含み、
ここで、溶出溶液のｐＨは約ｐＨ５．１であり、そしてここで、溶出溶液は、約１６５ｍＭの塩化ナトリウムをさらに含む。
また別の態様では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤内のＰＳ－８０安定性を改善する方法が本明細書で提供され、該方法は、
（ａ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を含むロード流体をＣＥＸ樹脂に通過させること、
（ｂ）溶出溶液を用いて、ＣＥＸ樹脂から抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を溶出すること、および
（ｃ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤がＰＳ－８０含有溶液であるように、抗ＣＴＬＡ４抗体を製剤化することを含み、
ここで、溶出溶液のｐＨは、約ｐＨ５．０～約ｐＨ５．４であり、そしてここで、溶出溶液は、約１５０ｍＭ～約２７５ｍＭの塩化ナトリウムをさらに含む。
一実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤内のＰＳ－８０安定性を改善する方法は、
（ａ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を含むロード流体をＣＥＸ樹脂に通過させること、
（ｂ）溶出溶液を用いて、ＣＥＸ樹脂から抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を溶出すること、および
（ｃ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤がＰＳ－８０含有溶液であるように、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を製剤化することを含み、
ここで、溶出溶液のｐＨは約ｐＨ５．１であり、そしてここで、溶出溶液は約２００ｍＭの塩化ナトリウムをさらに含む。
別の実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤内のＰＳ－８０安定性を改善する方法は、
（ａ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を含むロード流体をＣＥＸ樹脂に通過させること、
（ｂ）溶出溶液を用いて、ＣＥＸ樹脂から抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を溶出すること、および
（ｃ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤がＰＳ－８０含有溶液であるように、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を製剤化することを含み、
ここで、溶出溶液のｐＨは約ｐＨ５．１であり、そしてここで、溶出溶液は、約２５０ｍＭの塩化ナトリウムをさらに含む。
本明細書で提供される様々な方法のさらなる実施形態では、ロード流体は、事前のクロマトグラフィープロセスから得られる溶出液である。一実施形態では、事前のクロマトグラフィープロセスは、アフィニティークロマトグラフィーを含む。別の実施形態では、事前のクロマトグラフィープロセスは、アフィニティークロマトグラフィー、それに続く非アフィニティークロマトグラフィーを含む。さらに別の実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーはプロテインＡクロマトグラフィーである。また別の実施形態では、非アフィニティークロマトグラフィーはＡＥＸクロマトグラフィーである。またさらに別の実施形態では、事前のクロマトグラフィープロセスは、プロテインＡクロマトグラフィー、それに続くＡＥＸクロマトグラフィーを含む。
またさらに別の態様では、ＣＥＸクロマトグラフィープロセスによって、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片から宿主細胞リパーゼを分離する方法が本明細書で提供され、該方法は、
（ａ）宿主細胞リパーゼと、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片とを含むロード流体をＣＥＸ樹脂に通過させること、および
（ｂ）溶出溶液を用いて、ＣＥＸ樹脂から抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を溶出することを含み、
ここで、溶出溶液のｐＨは、約ｐＨ４．９～約ｐＨ５．４であり、そしてここで、溶出溶液の導電率は、約１５ｍＳ／ｃｍ～約２１ｍＳ／ｃｍである。
別の態様では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤内のＰＳ－８０安定性を改善する方法が本明細書で提供され、該方法は、
（ａ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を含むロード流体をＣＥＸ樹脂に通過させること、
（ｂ）溶出溶液を用いて、ＣＥＸ樹脂から抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を溶出すること、および
（ｃ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤がＰＳ－８０を含むように、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を製剤化することを含み、
ここで、溶出溶液のｐＨは、約ｐＨ４．９～約ｐＨ５．４であり、そしてここで、溶出溶液の導電率は、約１５ｍＳ／ｃｍ～約２１ｍＳ／ｃｍである。
またさらに別の態様では、ＣＥＸクロマトグラフィープロセスによって、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片から宿主細胞リパーゼを分離する方法が本明細書で提供され、該方法は、
（ａ）宿主細胞リパーゼと、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片とを含むロード流体をＣＥＸ樹脂に通過させること、および
（ｂ）溶出溶液を用いて、ＣＥＸ樹脂から抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を溶出することを含み、
ここで、溶出溶液のｐＨは、約ｐＨ４．９～約ｐＨ５．４であり、そしてここで、溶出溶液は、約１３５ｍＭ～約１９５ｍＭの塩化ナトリウムをさらに含む。
別の態様では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤内のＰＳ－８０安定性を改善する方法が本明細書で提供され、該方法は、
（ａ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を含むロード流体をＣＥＸ樹脂に通過させること、
（ｂ）溶出溶液を用いて、ＣＥＸ樹脂から抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を溶出すること、および
（ｃ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤がＰＳ－８０を含むように、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を製剤化することを含み、
ここで、溶出溶液のｐＨは、約ｐＨ４．９～約ｐＨ５．４であり、そしてここで、溶出溶液は、約１３５ｍＭ～約１９５ｍＭの塩化ナトリウムをさらに含む。
本明細書に記載される様々な方法の特定の実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片は、治療用タンパク質である。
本明細書に記載される様々な方法のいくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体はモノクローナル抗体である。
別の態様では、治療用タンパク質と、１ｐｐｍ未満の宿主細胞リパーゼとを含む医薬組成物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、治療用タンパク質と、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８または０．９ｐｐｍ未満の宿主細胞リパーゼとを含む。一実施形態では、医薬組成物は、治療用タンパク質と、０．１ｐｐｍ未満の宿主細胞リパーゼとを含む。別の実施形態では、医薬組成物は、治療用タンパク質と、０．２ｐｐｍ未満の宿主細胞リパーゼとを含む。さらに別の実施形態では、医薬組成物は、治療用タンパク質と、０．３ｐｐｍ未満の宿主細胞リパーゼとを含む。また別の実施形態では、医薬組成物は、治療用タンパク質と、０．４ｐｐｍ未満の宿主細胞リパーゼとを含む。またさらに別の実施形態では、医薬組成物は、治療用タンパク質と、０．５ｐｐｍ未満の宿主細胞リパーゼとを含む。一実施形態では、医薬組成物は、治療用タンパク質と、０．６ｐｐｍ未満の宿主細胞リパーゼとを含む。別の実施形態では、医薬組成物は、治療用タンパク質と、０．７ｐｐｍ未満の宿主細胞リパーゼとを含む。さらに別の実施形態では、医薬組成物は、治療用タンパク質と、０．８ｐｐｍ未満の宿主細胞リパーゼとを含む。また別の実施形態では、医薬組成物は、治療用タンパク質と、０．９ｐｐｍ未満の宿主細胞リパーゼとを含む。
本明細書に記載される医薬組成物の様々な実施形態では、宿主細胞リパーゼのレベルは、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）によって測定される。
別の態様では、ＰＳ－８０安定性が増加した治療用タンパク質を含む医薬組成物が本明細書で提供され、ここで、ＰＳ－８０分解は、減少している。
特定の実施形態では、医薬組成物は、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を含む、ＣＥＸクロマトグラフィーから得られる溶出液であり、
（ａ）約４．９～約５．３のｐＨを有し、約１２０ｍＭ～約１７５ｍＭの塩化ナトリウムを含む溶出溶液、
（ｂ）約５．１のｐＨを有し、約１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む溶出溶液、
（ｃ）約５．１のｐＨを有し、約１６５ｍＭの塩化ナトリウムを含む溶出溶液、
（ｄ）約４．９～約５．４のｐＨと、約１５ｍＳ／ｃｍ～約２１ｍＳ／ｃｍの導電率とを有する溶出溶液、
（ｅ）約４．９～約５．４のｐＨを有し、約１３５ｍＭ～約１９５ｍＭの塩化ナトリウムを含む溶出溶液、
（ｆ）約ｐＨ５．０～約ｐＨ５．４のｐＨを有し、約１５０ｍＭ～約２７５ｍＭの塩化ナトリウムを含む溶出溶液、
（ｇ）約５．１のｐＨを有し、約２００ｍＭの塩化ナトリウムを含む溶出溶液、および
（ｈ）約５．１のｐＨを有し、約２５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む溶出溶液、からなる群から選択される溶出溶液を使用する。
一実施形態では、医薬組成物は、約４．９～約５．３のｐＨを有する溶出溶液を使用するＣＥＸクロマトグラフィーから得られる溶出液であり、約１２０ｍＭ～約１７５ｍＭの塩化ナトリウムと、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片とを含む。
別の実施形態では、医薬組成物は、約５．１のｐＨを有する溶出溶液を使用するＣＥＸクロマトグラフィーから得られる溶出液であり、約１５０ｍＭの塩化ナトリウムと、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片とを含む。
さらに別の実施形態では、医薬組成物は、約５．１のｐＨを有する溶出溶液を使用するＣＥＸクロマトグラフィーから得られる溶出液であり、約１６５ｍＭの塩化ナトリウムと、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片とを含む。
また別の実施形態では、医薬組成物は、約４．９～約５．４のｐＨと、約１５ｍＳ／ｃｍ～約２１ｍＳ／ｃｍの導電率とを有する溶出溶液を使用するＣＥＸクロマトグラフィーから得られる溶出液であり、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を含む。
一実施形態では、医薬組成物は、約４．９～約５．４のｐＨを有する溶出溶液を使用するＣＥＸクロマトグラフィーから得られる溶出液であり、約１３５ｍＭ～約１９５ｍＭの塩化ナトリウムと、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片とを含む。
別の実施形態では、医薬組成物は、約ｐＨ５．０～約ｐＨ５．４のｐＨを有する溶出溶液を使用するＣＥＸクロマトグラフィーから得られる溶出液であり、約１５０ｍＭ～約２７５ｍＭの塩化ナトリウムと、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片とを含む。
また別の実施形態では、医薬組成物は、約５．１のｐＨを有する溶出溶液を使用するＣＥＸクロマトグラフィーから得られる溶出液であり、約２００ｍＭの塩化ナトリウムと、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片とを含む。
またさらに別の実施形態では、医薬組成物は、約５．１のｐＨを有する溶出溶液を使用するＣＥＸクロマトグラフィーから得られる溶出液であり、約２５０ｍＭの塩化ナトリウムと、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片とを含む。
医薬組成物のいくつかの実施形態では、ＣＥＸクロマトグラフィーの前に、フロースルーモードで操作されるＡＥＸクロマトグラフィーが先行する。
医薬組成物の特定の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬからなる群から選択される。一実施形態では、リパーゼはＰＬＢＬ２である。別の実施形態では、リパーゼはＬＰＬである。さらに別の実施形態では、リパーゼはＬＰＬＡ２である。一実施形態では、リパーゼはＬＰ－ＰＬＡ２である。別の実施形態では、リパーゼはＬＡＬである。また別の実施形態では、リパーゼは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異なるリパーゼを含む。またさらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬからなる群から選択される２つ、３つ、４つまたは５つの異なるリパーゼを含む。一実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰＬを含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。一実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＰＬＡ２を含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。一実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＡＬを含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。またさらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。
医薬組成物の他の実施形態では、治療用タンパク質は、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片である。
本発明において有用な抗ＣＴＬＡ４抗体および抗原結合断片
本明細書ではまた、１０～２００ｍｇの抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を含む組成物も提供される。
本明細書ではまた、１０～１００ｍｇの抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を含む組成物も提供される。
本明細書ではまた、（１）１０ｍｇの抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合断片、（２）２５ｍｇの抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合断片、（３）５０ｍｇの抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合断片、（４）７５ｍｇの抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合断片、または（５）１００ｍｇの抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合断片からなる群から選択される抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を含む組成物も提供される。
本明細書ではまた、２５ｍｇの抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を含む組成物も提供される。
本発明の精製方法、治療方法、組成物、キットおよび使用の一実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、イピリムマブとして現在知られており、Ｙｅｒｖｏｙ（商標）として市販されているヒトモノクローナル抗体１０Ｄ１であり、ヒトモノクローナル抗体１０Ｄ１は、米国特許第６，９８４，７２０号およびＷＨＯ Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ １９（４）：６１（２００５）に開示されている。別の実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、ＣＰ－６７５，２０６としても知られているトレメリムマブであり、トレメリムマブは、米国特許出願公開第２０１２／２６３６７７号またはＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ２０１２／１２２４４４号もしくはＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ２００７／１１３６４８号に記載されているＩｇＧ２モノクローナル抗体である。
本発明の精製方法、治療方法、組成物、キットおよび使用のさらなる実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１、２および３に記載のアミノ酸の配列を含む軽鎖ＣＤＲと、配列番号４、５および６に記載のアミノ酸の配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む。
本発明の精製方法、治療方法、組成物、キットおよび使用の他の実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体は、ヒトＣＴＬＡ４に結合し、（ａ）配列番号７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、（ｂ）配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むモノクローナル抗体またはその抗原結合断片である。
Figure 2023500775000002
本発明の精製方法、治療方法、組成物、キットおよび使用の一実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含むモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体は、配列番号９および／または配列番号１０の抗原結合断片であり、抗原結合断片は、ＣＴＬＡ４に特異的に結合する。
本発明の精製方法、治療方法、組成物、キットおよび使用の一実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、国際出願公開第ＷＯ２０１６／０１５６７５号に開示されている抗ＣＴＬＡ－４抗体またはその抗原結合断片のいずれかである。一実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体は、以下のＣＤＲを含むモノクローナル抗体である：
アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＤＮＷ（配列番号１１）を含むＣＤＲＨ１；
アミノ酸配列ＩＲＮＫＰＹＮＹＥＴ（配列番号１２）を含むＣＤＲＨ２；
アミノ酸配列ＴＡＱＦＡＹ（配列番号１３；）を含むＣＤＲＨ３
および／または
アミノ酸配列ＥＮＩＹＧＧ（配列番号１４）を含むＣＤＲＬ１；
アミノ酸配列ＧＡＴ（配列番号１５）を含むＣＤＲＬ２；および
ＱＮＶＬＲＳＰＦＴ（配列番号１６）；ＱＮＶＬＳＲＨＰＧ（配列番号１７）；またはＱＮＶＬＳＳＲＰＧ（配列番号１８）から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３。
本発明の精製方法、治療方法、組成物、キットおよび使用の一実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体は、８Ｄ２／８Ｄ２（ＲＥ）もしくはその変異体、８Ｄ２Ｈ１Ｌ１もしくはその変異体、８Ｄ２Ｈ２Ｌ２もしくはその変異体、８Ｄ３Ｈ３Ｌ３もしくはその変異体、８Ｄ２Ｈ２Ｌ１５もしくはその変異体、または８Ｄ２Ｈ２ｌ１７もしくはその変異体である。
Figure 2023500775000003
Figure 2023500775000004
本発明の精製方法、治療方法、組成物、キットおよび使用の別の実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体は、８Ｄ２／８Ｄ２（ＲＥ）の変異体、８Ｄ２Ｈ１Ｌ１の変異体、８Ｄ２Ｈ２Ｌ２の変異体、８Ｄ２Ｈ２Ｌ１５の変異体または８Ｄ２Ｈ２Ｌ１７の変異体であり、ここで、ＶＨ鎖アミノ酸配列内の１８位のメチオニン（Ｍｅｔ）は、ロイシン（Ｌｅｕ）、バリン（Ｖａｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）またはアラニン（Ａｌａ）から選択されるアミノ酸によって独立して置換されている。本発明の実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体は、上記の表に記載の８Ｄ２Ｈ２Ｌ２変異体１の配列を含む。
本発明の精製方法、治療方法、組成物、キットおよび使用の別の実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体は、配列番号３２に記載の完全重鎖アミノ酸配列と、配列番号３３に記載の完全軽鎖配列とを有する８Ｄ２Ｈ２Ｌ２変異体１である。
Figure 2023500775000005
本発明の精製方法、治療方法、組成物、キットおよび使用の一実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体は、２０１８年３月１日に公開された国際出願公開第ＷＯ２０１８／０３５７１０号に開示されている抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片のいずれかである。
本発明の精製方法、治療方法、組成物、キットおよび使用の別の実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、ヒトＣＴＬＡ－４への結合について、８Ｄ２／８Ｄ２（ＲＥ）もしくはその変異体、８Ｄ２Ｈ１Ｌ１もしくはその変異体、８Ｄ２Ｈ２Ｌ２もしくはその変異体、８Ｄ３Ｈ３Ｌ３もしくはその変異体、８Ｄ２Ｈ２Ｌ１５もしくはその変異体、８Ｄ２Ｈ２Ｌ１７を含む上記の抗体のいずれかと交差競合するか、または、８Ｄ２／８Ｄ２（ＲＥ）もしくはその変異体、８Ｄ２Ｈ１Ｌ１もしくはその変異体、８Ｄ２Ｈ２Ｌ２もしくはその変異体、８Ｄ３Ｈ３Ｌ３もしくはその変異体、８Ｄ２Ｈ２Ｌ１５もしくはその変異体、８Ｄ２Ｈ２Ｌ１７を含む上記の抗体のいずれかと同じヒトＣＴＬＡ－４のエピトープ領域に結合する抗体またはその抗原結合断片である。
一実施形態では、組成物は、（ｉ）約１０ｍｇ／ｍｌ～約２００ｍｇ／ｍｌの抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片、約５ｍＭ～約２０ｍＭの緩衝液、約６％～８％重量／体積（ｗ／ｖ）の非還元糖、約０．０１％～約０．１０％の非イオン性界面活性剤、および、約１ｍＭ～約２０ｍＭの抗酸化剤を含み、ここで、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２およびＬＰＬのレベルは、ＣＴＬＡ４抗体１ｍｌ当たり≦１ｎｇである。
別の実施形態では、組成物は、（ｉ）約１０ｍｇ／ｍｌ～約２００ｍｇ／ｍｌの抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片、約５ｍＭ～約２０ｍＭの緩衝液、約６％～８％重量／体積（ｗ／ｖ）の非還元糖、約０．０１％～約０．１０％の非イオン性界面活性剤、および約１ｍＭ～約２０ｍＭの抗酸化剤、宿主細胞リパーゼの残存量を含み、ここで、宿主細胞リパーゼの残存量は、２ｐｐｍ未満である。
一実施形態では、組成物は、（ｉ）約１０ｍｇ／ｍｌ～約２００ｍｇ／ｍｌの抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片、（ｉｉ）約５ｍＭ～約２０ｍＭの緩衝液、（ｉｉｉ）約６％～８％重量／体積（ｗ／ｖ）の非還元糖、（ｉｖ）約０．０１％～約０．１０％の非イオン性界面活性剤、および、（ｖ）約１ｍＭ～約２０ｍＭの抗酸化剤を含み、ここで、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２およびＬＰＬのレベルは≦１ｎｇ／ｍｇである。
さらなる実施形態では、非イオン性界面活性剤はＰＳ－８０である。
別の実施形態では、組成物は、（ｉ）約１０ｍｇ／ｍｌ～約２００ｍｇ／ｍｌの抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片、（ｉｉ）約５ｍＭ～約２０ｍＭの緩衝液、（ｉｉｉ）約６％～８％重量／体積（ｗ／ｖ）の非還元糖、（ｉｖ）約０．０１％～約０．１０％のポリソルベート８０（ＰＳ８０）、および、（ｖ）約１ｍＭ～約２０ｍＭの抗酸化剤を含み、ここで、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２およびＬＰＬのレベルは≦１ｎｇ／ｍｇであり、そして、６ヶ月後の平均ＰＳ８０分解は１０％以下である。別の実施形態では、ＰＳ－８０分解とは、一般的な貯蔵条件下で物理的、化学的および／または生物学的に安定なままであるＰＳ－８０の状態を指す。
別の実施形態では、ＰＳ－８０分解は、限定するものではないが、質量分析（ＭＳ）、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）、または帯電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を有するＨＰＬＣシステムを用いた固相抽出（ＳＰＥ）を含む様々な方法を使用して、インタクトなＰＳ－８０分子の量および／または分解生成物の量によって測定され得る。
一実施形態では、組成物は、（ｉ）約１０ｍｇ／ｍｌ～約２００ｍｇ／ｍｌの抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片、（ｉｉ）約５ｍＭ～約２０ｍＭの緩衝液、（ｉｉｉ）約６％～８％重量／体積（ｗ／ｖ）の非還元糖、（ｉｖ）約０．０１％～約０．１０％の非イオン性界面活性剤、および、（ｖ）約１ｍＭ～約２０ｍＭの抗酸化剤を含み、ここで、ＰＬＢＬ２のレベルは≦１ｎｇ／ｍｇである。
一実施形態では、組成物は、（ｉ）約１０ｍｇ／ｍｌ～約２００ｍｇ／ｍｌの抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片、（ｉｉ）約５ｍＭ～約２０ｍＭの緩衝液、（ｉｉｉ）約６％～８％重量／体積（ｗ／ｖ）の非還元糖、（ｉｖ）約０．０１％～約０．１０％のＰＳ８０、および、（ｖ）約１ｍＭ～約２０ｍＭの抗酸化剤を含み、ここで、ＰＬＢＬ２のレベルは≦１ｎｇ／ｍｇであり、そして、６ヶ月後の平均ＰＳ８０分解は１０％以下である。一実施形態では、組成物は、（ｉ）約１０ｍｇ／ｍｌ～約２００ｍｇ／ｍｌの抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片、（ｉｉ）約５ｍＭ～約２０ｍＭの緩衝液、（ｉｉｉ）約６％～８％重量／体積（ｗ／ｖ）の非還元糖、（ｉｖ）約０．０１％～約０．１０％のＰＳ８０、および、（ｖ）約１ｍＭ～約２０ｍＭの抗酸化剤を含み、ここで、ＰＬＢＬ２のレベルは≦１ｎｇ／ｍｇであり、そして、６ヶ月後の平均ＰＳ８０分解は１０％以下であり、そしてここで、ＰＳ８０分解は、限定するものではないが、質量分析（ＭＳ）、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）、または帯電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を有するＨＰＬＣシステムを用いた固相抽出（ＳＰＥ）を含む様々な方法を使用して、インタクトなＰＳ－８０分子の量および／または分解生成物の量によって測定される。
一実施形態では、組成物は、（ｉ）約５０ｍｇ／ｍｌの抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片、（ｉｉ）約１０ｍＭの緩衝液、（ｉｉｉ）約７％重量／体積（ｗ／ｖ）の非還元糖、（ｉｖ）約０．０２％の非イオン性界面活性剤、および、（ｖ）約１ｍＭ～約２０ｍＭの抗酸化剤を含み、ここで、ＰＬＢＬ２のレベルは≦１ｎｇ／ｍｇである。
一実施形態では、組成物は、（ｉ）約５０ｍｇ／ｍｌの抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片、（ｉｉ）約１０ｍＭの緩衝液、（ｉｉｉ）約７％重量／体積（ｗ／ｖ）の非還元糖、（ｉｖ）約０．０２％のＰＳ８０、および、（ｖ）約１ｍＭ～約２０ｍＭの抗酸化剤を含み、ここで、ＰＬＢＬ２のレベルは≦１ｎｇ／ｍｇであり、そして、６ヶ月後の平均ＰＳ８０分解は１０％以下である。
一実施形態では、製剤は、４．５～６．５のｐＨを有する。特有の実施形態では、製剤のｐＨは、約ｐＨ５．０～約ｐＨ６．０である。さらなる実施形態では、製剤のｐＨは、約ｐＨ５．３～約ｐＨ５．８である。別の実施形態では、ｐＨは５．３である。別の実施形態では、ｐＨは５．４である。一実施形態では、ｐＨは５．５である。一実施形態では、ｐＨは５．６である。さらなる実施形態では、ｐＨは５．７である。一実施形態では、ｐＨは５．８である。
製剤の一実施形態では、緩衝液は、Ｌ－ヒスチジン緩衝液または酢酸ナトリウム緩衝液であり、非還元糖はスクロースであり、非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０であり、そして、抗酸化剤は、メチオニンまたはその薬学的に許容される塩である。一実施形態では、抗酸化剤はＬ－メチオニンである。別の実施形態では、抗酸化剤は、Ｌ－メチオニンの薬学的に許容される塩、例えば、メチオニンＨＣｌである。
一実施形態では、組成物内のＰＳ－８０濃度は、時間０の結果と比較して±０．０２ｍｇ／ｍＬのままである。
別の実施形態では、上記の方法のいずれかによる組成物、組成物は、患者に投与される。
ある範囲の典型的なＡＥＸ条件に対するＰＬＢＬ２（図１Ａ～図１Ｃ）またはＬＰＬＡ２（図１Ｄ～図１Ｆ）ｌｏｇ ＫＰ値を示す。図１Ａおよび図１Ｄは、Ｔｒｉｓおよびアセテート緩衝液中でのローディングに典型的な条件を示す。 ある範囲の典型的なＡＥＸ条件に対するＰＬＢＬ２（図１Ａ～図１Ｃ）またはＬＰＬＡ２（図１Ｄ～図１Ｆ）ｌｏｇ ＫＰ値を示す。図１Ｂおよび図１Ｅは、Ｔｒｉｓ緩衝液による平衡化または洗浄に典型的な条件を示す。 ある範囲の典型的なＡＥＸ条件に対するＰＬＢＬ２（図１Ａ～図１Ｃ）またはＬＰＬＡ２（図１Ｄ～図１Ｆ）ｌｏｇ ＫＰ値を示す。図１Ｃおよび図１Ｆは、ホスフェート緩衝液による平衡化または洗浄の条件を示す。 ある範囲の典型的なＡＥＸ条件に対するＰＬＢＬ２（図１Ａ～図１Ｃ）またはＬＰＬＡ２（図１Ｄ～図１Ｆ）ｌｏｇ ＫＰ値を示す。図１Ａおよび図１Ｄは、Ｔｒｉｓおよびアセテート緩衝液中でのローディングに典型的な条件を示す。 ある範囲の典型的なＡＥＸ条件に対するＰＬＢＬ２（図１Ａ～図１Ｃ）またはＬＰＬＡ２（図１Ｄ～図１Ｆ）ｌｏｇ ＫＰ値を示す。図１Ｂおよび図１Ｅは、Ｔｒｉｓ緩衝液による平衡化または洗浄に典型的な条件を示す。 ある範囲の典型的なＡＥＸ条件に対するＰＬＢＬ２（図１Ａ～図１Ｃ）またはＬＰＬＡ２（図１Ｄ～図１Ｆ）ｌｏｇ ＫＰ値を示す。図１Ｃおよび図１Ｆは、ホスフェート緩衝液による平衡化または洗浄の条件を示す。 ある範囲の典型的なＣＥＸ条件に対するＰＬＢＬ２（図２Ａおよび図２Ｂ）またはＬＰＬＡ２（図２Ｃ）ｌｏｇ ＫＰ値を示す。図２Ａおよび図２Ｃは、塩を主に変化させることによる結合の調節の条件を示す。 ある範囲の典型的なＣＥＸ条件に対するＰＬＢＬ２（図２Ａおよび図２Ｂ）またはＬＰＬＡ２（図２Ｃ）ｌｏｇ ＫＰ値を示す。図２Ｂは、ｐＨを主に変化させることによる結合の調節の条件を示す。 ある範囲の典型的なＣＥＸ条件に対するＰＬＢＬ２（図２Ａおよび図２Ｂ）またはＬＰＬＡ２（図２Ｃ）ｌｏｇ ＫＰ値を示す。図２Ａおよび図２Ｃは、塩を主に変化させることによる結合の調節の条件を示す。 塩濃度による結合の調節に典型的なＨＩＣ条件の範囲に対するＰＬＢＬ２またはＬＰＬＡ２ ｌｏｇ ＫＰ値を示す。 マルチモーダルクロマトグラフィー樹脂に典型的なｐＨおよび塩条件の範囲に対するＰＬＢＬ２ ｌｏｇ ＫＰ値を示す。図４Ａは、マルチモーダルアニオン交換体Ｃａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅの条件を示す。 マルチモーダルクロマトグラフィー樹脂に典型的なｐＨおよび塩条件の範囲に対するＰＬＢＬ２ ｌｏｇ ＫＰ値を示す。図４Ｂは、マルチモーダルカチオン交換体Ｃａｐｔｏ ＭＭＣの条件を示す。 非常に少ないｍＡｂ３がＡＥＸ樹脂に結合したことを示している、指定された条件下でフロースルーモードで操作されたＡＥＸプロセスのクロマトグラムを示す。 ＣＥＸクロマトグラフィーに典型的なｐＨおよび塩条件の範囲でのｍＡｂ３およびＰＬＢＬ２（図６Ａおよび図６Ｂ）またはｍＡｂ３およびＬＰＬＡ２（図６Ｃ）のｌｏｇ α分離係数値を示す。図６Ａおよび図６Ｃは、塩濃度を主に変化させることによって結合が調節される分離条件の最適化を示す。 ＣＥＸクロマトグラフィーに典型的なｐＨおよび塩条件の範囲でのｍＡｂ３およびＰＬＢＬ２（図６Ａおよび図６Ｂ）またはｍＡｂ３およびＬＰＬＡ２（図６Ｃ）のｌｏｇ α分離係数値を示す。図６Ｂは、ｐＨを主に変化させることによって結合が調節される条件の最適化を示す。黒色の枠は、分離が最大になる領域を表す。 ＣＥＸクロマトグラフィーに典型的なｐＨおよび塩条件の範囲でのｍＡｂ３およびＰＬＢＬ２（図６Ａおよび図６Ｂ）またはｍＡｂ３およびＬＰＬＡ２（図６Ｃ）のｌｏｇ α分離係数値を示す。図６Ａおよび図６Ｃは、塩濃度を主に変化させることによって結合が調節される分離条件の最適化を示す。 ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２ならびに２つの異なるｍＡｂ、ｍＡｂ２およびｍＡｂ３に関するＨＩＣ樹脂上のｌｏｇ ＫＰ値の比較を示す。ｍＡｂ３はＰＬＢＬ２およびＬＰＬＡ２に対して非常に類似した結合を有するが、ｍＡｂ２はｍＡｂ３、ＰＬＢＬ２およびＬＰＬＡ２よりも弱く結合し、ｍＡｂ３よりもｍＡｂ２からの方がＰＬＢＬ２およびＬＰＬＡ２の分離ポテンシャルが高い。 マルチモーダルクロマトグラフィー樹脂のための典型的な操作条件でのｍＡｂ３およびＰＬＢＬ２のｌｏｇ α値を示す。図８Ａは、マルチモーダルアニオン交換体Ｃａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅの分離条件の最適化を示す。 マルチモーダルクロマトグラフィー樹脂のための典型的な操作条件でのｍＡｂ３およびＰＬＢＬ２のｌｏｇ α値を示す。図８Ｂは、マルチモーダルカチオン交換体Ｃａｐｔｏ ＭＭＣの分離条件の最適化を示す。黒色の枠は、分離が最大になる領域を表す。 残存ＨＣＰ（ｎｇ／ｍｇ）に関するモデルパラメータ（因子）のランク付けされた統計的有意性を要約するパレート図を示す。 ２６週間にわたる５℃（図１０Ａ）、２５℃（図１０Ｂ）および４０℃（図１０Ｃ）でのプラセボ、ｍＡｂ４アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）プール医薬物質（ＡＥＸＰ ＤＳ）およびｍＡｂ４カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）プール医薬物質（ＣＥＸＰ ＤＳ）のＰＳ－８０濃度を示す。 ２６週間にわたる５℃（図１０Ａ）、２５℃（図１０Ｂ）および４０℃（図１０Ｃ）でのプラセボ、ｍＡｂ４アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）プール医薬物質（ＡＥＸＰ ＤＳ）およびｍＡｂ４カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）プール医薬物質（ＣＥＸＰ ＤＳ）のＰＳ－８０濃度を示す。 ２６週間にわたる５℃（図１０Ａ）、２５℃（図１０Ｂ）および４０℃（図１０Ｃ）でのプラセボ、ｍＡｂ４アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）プール医薬物質（ＡＥＸＰ ＤＳ）およびｍＡｂ４カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）プール医薬物質（ＣＥＸＰ ＤＳ）のＰＳ－８０濃度を示す。 ２カラムクロマトグラフィー（プロテインＡおよびＡＥＸ、図１１Ａ）または３カラムクロマトグラフィー（プロテインＡ、ＡＥＸおよびＣＥＸ、図１１Ｂ）によって精製されたｍＡｂ４を含有する製剤内のＰＳ８０分解の割合を示す。 ２カラムクロマトグラフィー（プロテインＡおよびＡＥＸ、図１１Ａ）または３カラムクロマトグラフィー（プロテインＡ、ＡＥＸおよびＣＥＸ、図１１Ｂ）によって精製されたｍＡｂ４を含有する製剤内のＰＳ８０分解の割合を示す。 ｍＡｂ４の残存リパーゼを完全に除去するために３カラムクロマトグラフィーが必要であることを示す。 ５±３℃および２５±３℃で２４週間および１６週間にわたって組合せＣＥＸＰ実行で行われたＰＳ－８０安定性試験を示す。 ＡＥＸに関するＰＬＢＬ２スパイクの結果を示す。 ＣＥＸに関するＰＬＢＬ２スパイクの結果を示す。 ＡＥＸに関するＬＰＬスパイクの結果を示す。 ＣＥＸに関するＬＰＬスパイクの結果を示す。 ＣＥＸに関する塩基性変異体スパイクの結果を示す。 ＣＥＸに関する総高分子量種スパイクの結果を示す。ＣＥＸの総ＨＭＷ容量は約１０．８％であった。
１．定義
特定の技術用語および科学用語を以下に具体的に定義する。本明細書の他の箇所で具体的に定義されていない限り、本明細書で使用される他のすべての技術用語および科学用語は、本開示が関連する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先する。
用語「操作条件（ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」、「操作条件（ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」、「処理条件（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」または「処理条件（ｐｒｏｃｅｓｓ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」は交換可能であり、本明細書で使用される場合、クロマトグラフィープロセスを操作するための条件を指す。操作条件は、平衡化条件、ローディング条件、洗浄条件および／または溶出条件などであり得る。操作条件には、限定するものではないが、クロマトグラフィー樹脂の種類、樹脂骨格、樹脂リガンド、操作溶液のｐＨ、操作溶液の組成、操作溶液の各成分の濃度、操作溶液の導電率、操作溶液のイオン強度、操作溶液のカチオン強度、操作溶液のアニオン強度、または２つ以上の上記因子の組合せが含まれる。
用語「操作溶液」は、クロマトグラフィープロセスを操作する際に使用される溶液を指す。操作溶液は、平衡化溶液、ローディング溶液または供給溶液、洗浄溶液、および／または溶出溶液などであり得る。
本明細書で使用される用語「分配係数」または「ＫＰ」は、クロマトグラフィー樹脂に結合したタンパク質の濃度（Ｑ）と、特定の操作条件下で平衡状態にある溶液中に残っているタンパク質の濃度（Ｃ）との比を指す。特定のタンパク質の分配係数は、以下のように計算することができる：ＫＰ＝Ｑ／Ｃ。
本明細書で使用される用語「分離係数」または「α」は、第１のタンパク質の分配係数（ＫＰ、タンパク質１）と、第２のタンパク質の分配係数（ＫＰ、タンパク質２）との比を指す。分離係数は、特定の操作条件下で、２つのタンパク質間のクロマトグラフィー樹脂の選択性を定量する。これを使用して、その操作条件下でのクロマトグラフィー樹脂による２つのタンパク質の分離の程度を予測することができる。２つのタンパク質間の分離係数は、以下のように計算することができる：α＝ＫＰ、タンパク質１／ＫＰ、タンパク質２；またはｌｏｇ α＝ｌｏｇ ＫＰ、タンパク質１－ｌｏｇ ＫＰ、タンパク質２。
本明細書で使用される「生成タンパク質」は、バイオプロセスの意図された生成物である任意のタンパク質を指す。生成タンパク質の非限定的な例には、治療用タンパク質、抗体（例えば、モノクローナル抗体二重特異性抗体またはその抗原結合断片など）、ホルモン、サイトカイン、酵素、増殖因子、凝固因子、またはそのイムノコンジュゲート、その融合タンパク質もしくはその断片を含む。生成タンパク質の一例には、限定するものではないが、抗ＣＴＬＡ４抗体を含む。
本明細書で使用される「治療用タンパク質」は、動物（例えば、ヒト、ウシ、ウマ、イヌなど）に対する治療効果を有する任意のタンパク質を指す。治療用タンパク質の非限定的な例には、抗体（例えば、モノクローナル抗体、二重特異性抗体またはその抗原結合断片など）、ホルモン、サイトカイン、酵素、増殖因子、凝固因子、またはそのイムノコンジュゲート、その融合タンパク質もしくはその断片を含む。
本明細書で使用される「リパーゼ」は、一般に、（チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）発現系については、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含め、宿主細胞リパーゼおよび関連するタンパク質／酵素を指す。
本明細書で使用される「溶出液」は、クロマトグラフィーを通過する液体を指す。いくつかの実施形態では、溶出液は、ローディング溶液のフロースルーである。他の実施形態では、溶出液は、クロマトグラフィーを通過する溶出溶液と、クロマトグラフィーから溶出される任意の追加の成分とを含む。
「混合モード」または「マルチモーダル」は、クロマトグラフィー樹脂とともに使用される場合、樹脂が複数のモード、機能または機構、例えば、イオン交換および疎水性相互作用によって分子を分離することができることを意味する。いくつかの実施形態では、混合モードクロマトグラフィー樹脂またはマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂は、カチオン交換および疎水性相互作用の両方によって分子を分離することができる。他の実施形態では、混合モードクロマトグラフィー樹脂またはマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂は、アニオン交換および疎水性相互作用の両方によって分子を分離することができる。
本明細書で使用される「ポリソルベート－８０安定性」または「ＰＳ－８０安定性」は、一定期間（例えば、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年など）にわたって一般的な貯蔵条件下（例えば、５℃±３℃、２５℃±３℃、６０％±５％相対湿度（ＲＨ）、４０℃±２℃、７５％±５％相対湿度（ＲＨ））で、物理的、化学的および／または生物学的に安定なままであるＰＳ－８０の状態を指す。ＰＳ－８０安定性は、限定するものではないが、質量分析（ＭＳ）、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）、または帯電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を有するＨＰＬＣシステムを用いた固相抽出（ＳＰＥ）を含む様々な方法を使用して、インタクトなＰＳ－８０分子の量および／または分解生成物の量によって測定され得る。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」もしくは「Ｍａｂ」は、実質的に均一な抗体の集団を指し、すなわち、その集団を含む抗体分子は、少量存在し得る天然に存在する可能性のある変異を除いてアミノ酸配列が同一である。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体の特徴を示し、何らかの特定の方法による抗体の生成を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本開示に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得るか、または組換えＤＮＡ法（例えば米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製され得る。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－５９７に記載されている技術を使用してファージ抗体ライブラリーから単離され得る。Ｐｒｅｓｔａ（２００５）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１６：７３１も参照されたい。
一般に、基本的な抗体構造単位は四量体を含む。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対を含み、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）と、１つの「重」鎖（約５０～７０ｋＤａ）とを有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識を主に担う約１００～１１０個以上のアミノ酸の可変領域を含む。重鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を主に担う定常領域を規定し得る。典型的には、ヒト軽鎖は、カッパ軽鎖およびラムダ軽鎖として分類される。さらに、ヒト重鎖は、典型的には、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファまたはイプシロンとして分類され、抗体のアイソタイプを、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥと規定する。軽鎖および重鎖内で、可変領域および定常領域は、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結されており、重鎖はまた、約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。一般に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ ｅｄ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照されたい。
各軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。したがって、一般に、インタクトな抗体は２つの結合部位を有する。二機能性抗体または二重特異性抗体を除いて、２つの結合部位は一般に同じである。典型的には、重鎖および軽鎖の両方の可変ドメインは、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）内に位置する相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる３つの超可変領域を含む。ＣＤＲは、通常、フレームワーク領域によって整列され、特定のエピトープへの結合を可能にする。一般に、Ｎ末端からＣ末端に向かって、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインの両方が、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割当ては、一般に、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．；５ｔｈ ｅｄ．；ＮＩＨ Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１－３２４２（１９９１）；Ｋａｂａｔ（１９７８）Ａｄｖ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．３２：１－７５；Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，（１９７７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６６０９－６６１６；Ｃｈｏｔｈｉａ，ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７またはＣｈｏｔｈｉａ，ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８－８８３の定義に従う。
「抗ＣＴＬＡ－４抗体」は、ヒトＣＴＬＡ－４に結合して、ＣＴＬＡ－４とヒトＢ７受容体との相互作用を妨害する抗体またはその抗原結合断片を意味する。ＣＴＬＡ４は、Ｂ７に結合した後、マウスＴ細胞およびヒトＴ細胞の活性化を阻害し、Ｔ細胞の活性化に対して負の調節役割を果たすことができる。本明細書で使用される場合、特に明記しない限り、上記Ｂ７は、Ｂ７－１および／またはＢ７－２を指し、それらの特定のタンパク質配列は、当技術分野で公知の配列を指す。文献またはＧｅｎＢａｎｋに開示されている配列、例えば、Ｂ７－１（ＣＤ８０、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４１）、Ｂ７－２（ＣＤ８６、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４２）を参照することができる。抗ＣＴＬＡ４抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得、ヒト定常領域を含み得る。いくつかの実施形態では、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１定常領域、ＩｇＧ２定常領域、ＩｇＧ３定常領域およびＩｇＧ４定常領域からなる群から選択され、好ましい実施形態では、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１定常領域またはＩｇＧ４定常領域である。いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖおよびＦｖ断片からなる群から選択される。
「ＣＤＲ」または「ＣＤＲｓ」は、特に明記しない限り、Ｋａｂａｔナンバリングシステムを使用して定義される、免疫グロブリン可変領域内（類）の相補性決定領域を意味する。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または変形例、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「から構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｏｆ）」は、本明細書および特許請求の範囲を通して包括的な意味で、すなわち、記載された特徴の存在を特定するが、本発明の実施形態のいずれかの動作または有用性を実質的に高めることができるさらなる特徴の存在または追加を排除しないように使用されるが、文脈上、明示的な文言または必要な含意のためにそうでないことが必要な場合は除く。
数値的に定義されたパラメータ（例えば、ｐＨ、濃度など）を修正するために使用される場合の「約」は、パラメータが、そのパラメータについて記載された数値または範囲の２０％以内、１５％以内、１０％以内、９％以内、８％以内、７％以内、６％以内、５％以内、４％以内、３％以内、２％以内、１％以内またはそれ以下であることを意味し；適切な場合、記載されたパラメータは、最も近い整数に丸められてもよい。
添付の特許請求の範囲を含む本明細書で使用される場合、単語の単数形、例えば、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別段の指示をしない限り、それらの対応する複数の言及を含む。文脈上他に要求されない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。
本明細書で使用される場合、用語「少なくとも１つの」項目または「１つ以上の」項目はそれぞれ、一覧から選択された単一の項目、および一覧から選択された２つ以上の項目の混合を含む。
用語「例えば（ｅ．ｇ．）」または「例えば（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）」に続く任意の例（１または複数）は、網羅的または限定的であることを意味しない。
そうではないと明示的に述べられていない限り、本明細書に引用されるすべての範囲は包括的であり；すなわち、範囲は、範囲の上限および下限の値、ならびにその間のすべての値を含む。一例として、本明細書に記載の温度範囲、割合、等価物の範囲などは、範囲の上限および下限、ならびにそれらの間の連続体における任意の値を含む。すべての範囲はまた、含まれるすべての部分範囲を含むことが意図されているが、必ずしも明示的に記載されているわけではない。例えば、ｐＨ４．０～５．０の範囲は、ｐＨ４．０、４．１、４．１３、４．２、４．１～４．６、４．３～４．４、および５．０を含むことが意図される。さらに、本明細書で使用される用語「または」は、適切な場合には組み合わせることができる代替物を示し；すなわち、用語「または」は、別個に列挙された各代替物、およびそれらの組合せを含む。
用語「患者」（本明細書では「対象」または「個体」とも呼ばれる）は、本発明の組成物を用いて治療することができる哺乳動物（例えば、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウサギ）、最も好ましくはヒトを指す。いくつかの実施形態では、患者は成人患者である。他の実施形態では、患者は小児患者である。
本開示の態様または実施形態がマーカッシュグループ、または代替物の他のグループ分けに関して記載される場合、本開示は、全体として列挙されたグループ全体だけでなく、グループの各メンバーを個別に、およびメイングループのすべての可能なサブグループを包含するだけでなく、グループメンバーのうちの１つ以上が存在しないメイングループも包含する。本開示はまた、特許請求の範囲におけるグループメンバーのいずれかのうちの１つ以上の明示的な除外を想定する。
例示的な方法および材料が本明細書に記載されているが、本明細書に記載の方法および材料と類似または同等の方法および材料も、本開示の実施または試験に使用することができる。材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定することを意図するものではない。
２．クロマトグラフィープロセス
本明細書で提供される様々な方法は、不純物からの抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片の分離のために、本明細書に開示されるまたは当業者によって理解される任意のクロマトグラフィープロセスとともに使用することができる。クロマトグラフィープロセスの非限定的な例には、ＩＥＸ、ＡＥＸ、ＣＥＸ、ＨＩＣ、混合モードＡＥＸ、混合モードＣＥＸ、アフィニティーおよびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（ＨＡＣ）プロセスなどを含む。一実施形態では、クロマトグラフィープロセスはＩＥＸクロマトグラフィープロセスである。別の実施形態では、クロマトグラフィープロセスはＡＥＸクロマトグラフィープロセスである。さらに別の実施形態では、クロマトグラフィープロセスはＣＥＸクロマトグラフィープロセスである。また別の実施形態では、クロマトグラフィープロセスはＨＩＣクロマトグラフィープロセスである。一実施形態では、クロマトグラフィープロセスは、混合モードＩＥＸクロマトグラフィープロセスである。別の実施形態では、クロマトグラフィープロセスは混合モードＡＥＸクロマトグラフィープロセスである。さらに別の実施形態では、クロマトグラフィープロセスは混合モードＣＥＸクロマトグラフィープロセスである。また別の実施形態では、クロマトグラフィープロセスはアフィニティークロマトグラフィープロセスである。一実施形態では、クロマトグラフィープロセスはプロテインＡクロマトグラフィープロセスである。別の実施形態では、クロマトグラフィープロセスはプロテインＧアフィニティークロマトグラフィープロセスである。さらに別の実施形態では、クロマトグラフィープロセスは固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）プロセスである。また別の実施形態では、クロマトグラフィープロセスはＨＡＣプロセスである。
ＩＥＸクロマトグラフィーは、分子の正味電荷に基づいて分子を分離する。分離は、目的の荷電分子と、ＩＥＸクロマトグラフィー樹脂上の反対に荷電したリガンド基の対イオンとの間の競合の結果として起こる。ＩＥＸ樹脂への分子の結合の強度は、ｐＨおよびイオン強度などの操作条件によって影響を受ける、分子の正味電荷に依存する。ＩＥＸ樹脂には、ＡＥＸ樹脂およびＣＥＸ樹脂が含まれる。ＡＥＸ樹脂は、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基、トリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）基、第四級アミノエチル（ＱＡＥ）基および第四級アミン（ＱＡ）基のような置換基を含み得る。ＣＥＸ樹脂は、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホエチル（ＳＥ）、スルホプロピル（ＳＰ）、ホスフェート（Ｐ）およびスルホネート（Ｓ）のような置換基を含み得る。ＤＥ２３、ＤＥ３２、ＤＥ５２、ＣＭ－２３、ＣＭ－３２およびＣＭ－５２のようなセルロース系ＩＥＸ樹脂は、Ｗｈａｔｍａｎ Ｌｔｄ．Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ，Ｋｅｎｔ，Ｕ．Ｋ．から入手可能である。Ｓｅｐｈａｄｅｘ系ＩＥＸ樹脂および架橋ＩＥＸ樹脂も知られている。例えば、ＤＥＡＥ－、ＱＡＥ－、ＣＭ－およびＳＰ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ、およびＤＥＡＥ－、Ｑ－、ＣＭ－およびＳ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ならびにＳｅｐｈａｒｏｓｅはいずれも、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪから入手可能である。さらに、ＤＥＡＥおよびＣＭの両方から誘導されるエチレングリコール－メタクリレートコポリマー、例えば、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）ＤＥＡＥ－６５０ＳまたはＭ、およびＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）ＣＭ－６５０ＳまたはＭは、Ｔｏｓｏ Ｈａａｓ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡから入手可能である。ＰＯＲＯＳ（商標）ＨＳ、ＰＯＲＯＳ（商標）ＨＱ、ＰＯＲＯＳ（商標）ＸＳは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡから入手可能である。
ＨＩＣクロマトグラフィーは、分子の疎水性に基づいて分子を分離する。目的の分子内の疎水性領域は、疎水性相互作用を介してＨＩＣ樹脂に結合する。相互作用の強度は、ｐＨ、イオン強度および塩濃度のような操作条件に依存する。一般に、ＨＩＣ樹脂は、疎水性リガンド（例えば、アルキル基またはアリール基）が結合したベースマトリックス（例えば、架橋アガロースまたは合成コポリマー材料）を含有する。ＨＩＣ樹脂の非限定的な例には、Ｐｈｅｎｙｌ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）６ ＦＡＳＴ ＦＬＯＷ（商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）；Ｐｈｅｎｙｌ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）；Ｏｃｔｙｌ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）；Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ ＰｒｏｐｙｌまたはＦＲＡＣＴＯＧＥＬ（商標）ＥＭＤ Ｐｈｅｎｙｌ（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）；ＭＡＣＲＯ－ＰＲＥＰ（商標）ＭｅｔｈｙｌまたはＭＡＣＲＯ－ＰＲＥＰ（商標）ｔ－Ｂｕｔｙｌ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，ＣＡ）；ＷＰ ＨＩ－Ｐｒｏｐｙｌ（Ｃ３）（商標）（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，ＮＪ）；ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）エーテル、フェニルまたはブチル（ＴｏｓｏＨａａｓ，ＰＡ）；およびＴｏｓｏｈ－Ｂｕｔｙｌ－６５０Ｍ（Ｔｏｓｏｈ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を含む。
ＨＡＣクロマトグラフィーは、式［Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２］の不溶性ヒドロキシル化リン酸カルシウムをマトリックスおよびリガンドの両方として使用する。ＨＡＣ樹脂の官能基は、正に帯電したカルシウムイオン（Ｃ部位）と負に帯電したホスフェート基（Ｐ部位）との対を含む。Ｃ部位は、タンパク質表面上のカルボキシレート残基と相互作用することができるのに対して、Ｐ部位は、塩基性タンパク質残基と相互作用することができる。タンパク質とＨＡＣ樹脂との間の結合の強度は、ｐＨ、イオン強度、溶液の組成、組成物の各成分の濃度、ｐＨの勾配、成分濃度の勾配などを含む操作条件に依存する。ＣＨＴ（商標）Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅおよびＣＦＴ（商標）Ｃｅｒａｍｉｃ Ｆｌｕｏｒｏａｐａｔｉｔｅなどの様々なＨＡＣ樹脂が市販されている。
アフィニティークロマトグラフィーは、目的の分子と樹脂の官能基との間の高度に特異的な相互作用、例えば、抗原と抗体、酵素と基質、受容体とリガンド、またはタンパク質と核酸などとの間の相互作用に基づいて分子を分離する。いくつかの一般的に使用されるアフィニティークロマトグラフィー樹脂には、抗体を精製するためのプロテインＡ樹脂またはプロテインＧ樹脂、ビオチン／アビジンおよびそれらの誘導体を精製するためのアビジンビオチン樹脂、ＧＳＴタグ付き組換えタンパク質を精製するためのグルタチオン樹脂、血漿凝固タンパク質を分離するためのヘパリン樹脂、金属イオンと特異的に相互作用するタンパク質を精製するためのＩＭＡＣ樹脂などが含まれる。各アフィニティークロマトグラフィーの操作条件は、相互作用の機構、および相互作用に影響を及ぼす因子に依存する。市販のアフィニティークロマトグラフィー樹脂には、限定するものではないが、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ ＳＵＰｒＡ（商標）、Ａｆｆｉ－Ｇｅｌ（登録商標）およびＡｆｆｉ－Ｐｒｅｐ（登録商標）が含まれる。
特定の実施形態では、本明細書で使用されるクロマトグラフィー樹脂は、複数の機能または機構に基づいて、すなわち、混合モードで分子を分離することができる。混合モードは、上記のまたは当業者によって理解される任意の２つ以上の機能または機構の組合せ、例えば、ＩＥＸとＨＩＣとの組合せ（例えば、ＡＥＸ／ＨＩＣまたはＣＥＸ／ＨＩＣ）、ＡＥＸとＣＥＸとの組合せ（ＡＥＸ／ＣＥＸ）、またはＨＩＣ、ＡＥＸおよびＣＥＸの組合せ（ＨＩＣ／ＡＥＸ／ＣＥＸ）などであり得る。例示的な混合モードクロマトグラフィー樹脂には、限定するものではないが、ＯｍｉｎＰａｃ ＰＣＸ－５００、Ｐｒｉｍｅｓｅｐ、Ｏｂｅｌｉｓｃ Ｒ、Ｏｂｌｉｓｃ Ｎ、Ａｃｃｌａｉｍ Ｔｒｉｎｉｔｙ Ｐ１、Ａｃｃｌａｉｍ Ｔｒｉｎｉｔｙ Ｐ２、Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ、Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ Ｉｍｐｒｅｓ、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ Ｉｍｐｒｅｓ、Ｃａｐｔｏ Ｃｏｒｅ ７００、ＰＰＡ Ｈｙｐｅｒｃｅｌ、ＨＥＡ Ｈｙｐｅｒｃｅｌ、ＭＥＰ Ｈｙｐｅｒｃｅｌ、Ｅｓｈｍｕｎｏ ＨＣＸ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＭＸ－Ｔｒｐ－６５０Ｍ、Ｎｕｖｉａ Ｃ Ｐｒｉｍｅ、ＣＨＴ Ｔｙｐｅ ＩおよびＣＨＴ Ｔｙｐｅ ＩＩが含まれる。
３．分配係数（ＫＰ）および分離係数（α）
分配係数（ＫＰ）および分離係数（α）は、クロマトグラフィープロセスの操作条件に特有の２つの熱力学的パラメータであり、操作条件下でのプロセスを通して達成することができる分離を定量するために使用することができる。
分配係数ＫＰは、既知の液体濃度のタンパク質（または目的の他の分子）を既知の体積のクロマトグラフィー樹脂と混合し、樹脂に結合したタンパク質と平衡状態にある液体中に残っているタンパク質との比を計算することによって決定される：ＫＰ＝ｑ／ｃ＝［結合］／［遊離］。
分配は、一般に、ｌｏｇ ＫＰについて報告されており、ｌｏｇ ＫＰは、本明細書に記載のＵＶ法を使用して約０～２まで正確に定量することができる。ｌｏｇ ＫＰスクリーニングの通則は、以下の通りである：
ｌｏｇ ＫＰ≧１．５、樹脂への強い結合；
ｌｏｇ ＫＰ＜１、結合溶出様式について溶出が予測される条件；
０．５＜ｌｏｇ ＫＰ＜１、いくらかの結合を示す弱い相互作用条件；
ｌｏｇ ＫＰ＜０．５、結合がほとんどまたは全くない。
異なる種間のｌｏｇ ＫＰ値の差を使用して、分離係数αを以下のように計算することによって、種の分離を予測することができる：α＝ＫＰ、タンパク質１／ＫＰ、タンパク質２；ｌｏｇ α＝ｌｏｇ ＫＰ、タンパク質１－ｌｏｇ ＫＰ、タンパク質２、ここで、ｌｏｇ αが０から遠いほど、さらに良好な分離を示す。特定の実施形態では、０．２よりも大きいｌｏｇ αの絶対値は、２つの種の間の良好な分離を示す。いくつかの実施形態では、０．３よりも大きいｌｏｇ αの絶対値は、２つの種の間の良好な分離を示す。他の実施形態では、０．５よりも大きいｌｏｇ αの絶対値は、２つの種の間の良好な分離を示す。他の実施形態では、１．０よりも大きいｌｏｇ αの絶対値は、２つの種の間の良好な分離を示す。
４．ＨＣＰおよび生成タンパク質
本明細書で提供される様々な方法は、多種多様なＨＣＰ、並びに多種多様な生成タンパク質に適用される。
ＨＣＰは、宿主細胞内で発現される生成タンパク質のバイオプロセス中の宿主細胞（例えばＣＨＯ細胞）に由来する任意の内因性タンパク質であり得る。ＨＣＰの非限定的な例には、構造タンパク質、機能性タンパク質、分泌タンパク質、酵素、例えば、リパーゼ、プロテイナーゼおよびキナーゼを含む。いくつかの実施形態では、ＨＣＰは構造タンパク質である。特定の実施形態では、ＨＣＰは機能性タンパク質である。他の実施形態では、ＨＣＰは分泌タンパク質である。さらに他の実施形態では、ＨＣＰは酵素である。一実施形態では、ＨＣＰはリパーゼである。別の実施形態では、ＨＣＰはプロテイナーゼである。さらに別の実施形態では、ＨＣＰはキナーゼである。
特定の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬからなる群から選択される。一実施形態では、リパーゼはＰＬＢＬ２である。別の実施形態では、リパーゼはＬＰＬである。さらに別の実施形態では、リパーゼはＬＰＬＡ２である。一実施形態では、リパーゼはＬＰ－ＰＬＡ２である。別の実施形態では、リパーゼはＬＡＬである。また別の実施形態では、リパーゼは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異なるリパーゼを含む。またさらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬからなる群から選択される２つ、３つ、４つまたは５つの異なるリパーゼを含む。一実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰＬを含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。一実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＰＬＡ２を含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。一実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＡＬを含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。またさらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。
宿主細胞は、外因性タンパク質を発現させるために使用される任意の細胞であり得る。バイオ医薬品の製造に使用される一般的な宿主細胞には、限定するものではないが、ＣＨＯ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ２１）細胞、マウス骨髄腫ＮＳ０細胞、マウス骨髄腫Ｓｐ２／０細胞、ヒト胚腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、線維肉腫ＨＴ－１０８０細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＨＫＢ－１１細胞、ＣＡＰ細胞、ＨｕＨ－７細胞、マウスＣ１２７細胞およびその天然に生成された変異体または遺伝子改変変異体が含まれる。特定の実施形態では、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞はベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ２１）細胞である。他の実施形態では、宿主細胞はマウス骨髄腫ＮＳ０細胞である。さらに他の実施形態では、宿主細胞はマウス骨髄腫Ｓｐ２／０細胞である。また他の実施形態では、宿主細胞は、ヒト胚腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞である。特定の実施形態では、宿主細胞は線維肉腫ＨＴ－１０８０細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞はＰＥＲ．Ｃ６細胞である。他の実施形態では、宿主細胞はＨＫＢ－１１細胞である。さらに他の実施形態では、宿主細胞はＣＡＰ細胞である。また他の実施形態では、宿主細胞はＨｕＨ－７細胞である。特定の実施形態では、宿主細胞はマウスＣ１２７細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、上記宿主細胞の天然に生成された変異体である。他の実施形態では、宿主細胞は、上記宿主細胞の遺伝子改変変異体である。
特定の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬからなる群から選択される。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼはＰＬＢＬ２である。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼはＬＰＬである。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼはＬＰＬＡ２である。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼはＬＰ－ＰＬＡ２である。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼはＬＡＬである。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異なるＣＨＯ細胞リパーゼを含む。またさらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬからなる群から選択される２つ、３つ、４つまたは５つの異なるＣＨＯ細胞リパーゼを含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰＬを含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＰＬＡ２を含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＡＬを含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。またさらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。
生成タンパク質は、バイオ医薬品を生成するという目的では、宿主細胞内で発現される目的の任意のタンパク質であり得る。生成タンパク質の非限定的な例には、治療用タンパク質、モノクローナル抗体、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、凝固因子、酵素、その融合タンパク質、そのイムノコンジュゲートおよびその断片を含む。特定の実施形態では、生成タンパク質は治療用タンパク質である。いくつかの実施形態では、生成タンパク質はモノクローナル抗体である。他の実施形態では、生成タンパク質はホルモンである。さらに他の実施形態では、生成タンパク質はサイトカインである。また他の実施形態では、生成タンパク質は増殖因子である。特定の実施形態では、生成タンパク質は凝固因子である。いくつかの実施形態では、生成タンパク質は酵素である。他の実施形態では、生成タンパク質は、上記生成タンパク質の融合タンパク質である。さらに他の実施形態では、生成タンパク質は、上記生成タンパク質のイムノコンジュゲートである。また他の実施形態では、生成タンパク質は、上記生成タンパク質の断片である。
いくつかの実施形態では、生成タンパク質は、限定するものではないが、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＧＩＴＲ、ＴＮＦ－α、ＨＥＲ２、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＣＤ５２、ＰＣＳＫ９、ＩＬ－２Ｒα、ＢＬｙＳ、ＶＥＧＦ、クロストリジウム・ディフィシーレ毒素Ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＩＬ－１β、ＩＬ１７Ｒα、ＰＳＭＡ、ＥＧＦＲ、ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－２Ｒβγ、ＣＤ３８、ＲＡＮＫＬ、ＧＤ２、ＩＬ－４Ｒα、補体成分５、ＣＤ２０、ＳＬＡＭＦ７、ダビガトラン、ＩＬ－５、α－４インテグリン、ＰＤＧＦＲα、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＲＳＶのＦタンパク質、ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－１２、ＩＬ－２３およびＣＤ３３を含む、抗原に特異的なモノクローナル抗体である。一実施形態では、生成タンパク質は抗ＰＤ－１モノクローナル抗体である。別の実施形態では、生成タンパク質は抗ＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体である。別の実施形態では、生成タンパク質は、抗ＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体またはその抗原結合断片である。さらに別の実施形態では、生成タンパク質は抗ＬＡＧ３モノクローナル抗体である。また別の実施形態では、生成タンパク質は抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体である。一実施形態では、生成タンパク質は抗ＧＩＴＲモノクローナル抗体である。
具体的な実施形態では、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体は、ペンブロリズマブである。別の実施形態では、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体は、ニボルマブである。さらに別の実施形態では、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体は、ピディリズマブ（米国特許第７，３３２，５８２号）である。また別の実施形態では、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体は、ＡＭＰ－５１４（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ ＬＬＣ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）である。別の実施形態では、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体は、ＰＤＲ００１（米国特許第９，６８３，０４８号）である。さらに別の実施形態では、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体は、ＢＧＢ－Ａ３１７（米国特許第８，７３５，５５３号）である。また別の実施形態では、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体は、ＭＧＡ０１２（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）である。
一実施形態では、抗ＬＡＧ３モノクローナル抗体は、ＢＭＳ－９８６０１６（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）である。別の実施形態では、抗ＬＡＧ３モノクローナル抗体は、ＲＥＧＮ３７６７（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）である。さらに別の実施形態では、抗ＬＡＧ３モノクローナル抗体は、ＬＡＧ５２５（Ｎｏｖａｒｔｉｓ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）である。また別の実施形態では、抗ＬＡＧ３モノクローナル抗体は、ＧＳＫ２８１３７８１（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ，Ｂｒｅｎｔｆｏｒｄ，ＵＫ）である。
一実施形態では、抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体は、ＢＭＳ－９８６２０７（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）である。別の実施形態では、抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体は、ＯＭＰ－３１３Ｍ３２（ＯｎｃｏＭｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｒｅｄｗｏｏｄ ｃｉｔｙ，ＣＡ）である。さらに別の実施形態では、抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体は、ＭＴＩＧ７１９２Ａ（ＲＧ６０５８としても知られる、米国特許公開第２０１７／００８８６１３号）である。また別の実施形態では、抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体は、ＰＴＺ－２０１（Ｐｏｔｅｎｚａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ；ＡＳＰ８３７４としても知られる、Ａｓｔｅｌｌａｓ Ｐｈａｒｍａ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）である。
５．生成タンパク質から宿主細胞リパーゼを分離するための操作条件をスクリーニングする方法
本開示は、クロマトグラフィープロセスによって生成タンパク質（例えばモノクローナル抗体）からＨＣＰ（例えばリパーゼ）を分離するための操作条件をスクリーニングする方法を提供する。
スクリーニングは、バッチ結合試験、ミニカラム結合試験、または当業者が理解するであろう任意の他の方法によって行うことができる。クロマトグラフィー樹脂と、溶液中の塩の有無でのｐＨ、塩の種類、塩濃度、他の成分（例えば対イオン）、各成分の濃度、またはロードタンパク質濃度を含む操作条件との多数の組合せを、ＨＣＰ（例えばリパーゼ）または生成タンパク質（例えばモノクローナル抗体）について、設計し検討することができる。ＨＣＰ（例えばリパーゼ）および生成タンパク質（例えばモノクローナル抗体）のＫＰ値は、本明細書に開示される方法、または当業者によって一般的に理解される方法によって決定される。ＨＣＰ（例えばリパーゼ）と生成タンパク質（例えばモノクローナル抗体）との間のｌｏｇ α値は、本明細書に記載の方法を使用して計算される。一般に、ＨＣＰ（例えばリパーゼ）と生成タンパク質（例えばモノクローナル抗体）との間の良好な分離のために、０．５よりも大きいｌｏｇ αの絶対値が望ましい。
スクリーニングされるクロマトグラフィー樹脂は、ＨＣＰ（例えばリパーゼ）および生成タンパク質（例えばモノクローナル抗体）の特性に基づいて生成タンパク質（例えばモノクローナル抗体）からＨＣＰ（例えばリパーゼ）を分離し得る任意のクロマトグラフィー樹脂であり得る。スクリーニングされる操作条件は、選択された各樹脂について一般的に使用される処理条件、例えば、平衡化条件、ローディング条件、洗浄条件、溶出条件またはストリッピング条件などであり得る。
一実施形態では、スクリーニングは、Ｗｅｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ．３０（３）：６２６－６３５（２０１４）に開示されているように、樹脂スラリープレート法を使用して行われる。例えば、ｐＨ、塩および供給物の異なる組合せの混合物を、９６ウェルフィルタープレート（例えば、Ｐ／Ｎ ＭＳＢＶＮ１２５０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）に加える。クロマトグラフィー樹脂体積は２～５０μＬであり、液体供給体積は２００μＬである。いくつかの実施形態では、各樹脂について１６～３２の条件が試験される。他の実施形態では、各樹脂について２４～９６の条件が試験される。樹脂と液体との分離は、真空濾過によって達成される。まず、樹脂を平衡化緩衝液と１０分間インキュベートし、平衡化工程を３回繰り返す。次に、樹脂を供給物とともに６０分間インキュベートする。次いで、樹脂をストリップ状態で１０分間インキュベートし、２回繰り返す。平衡化工程は、初期樹脂スラリー緩衝液からの緩衝液交換を可能にする。供給物混合のための６０分の時間は、所与の条件セットで樹脂リガンドとタンパク質との間の擬似平衡化を可能にする。供給工程からの濾液を２８０～３２０ｎｍでのＵＶ吸光度によって測定して、タンパク質の最終液体濃度ｃを決定した。タンパク質の結合濃度ｑは、ｃと既知の供給物濃度ｃ０との物質収支によって決定される。
別の実施形態では、スクリーニングは、Ｗｅｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ．３０（３）：６２６－６３５（２０１４）またはＰｅｔｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｅｎｇ．１１３（６）：１２７３－１２８３（２０１５）に開示されているように、ミニカラム法を使用して行われる。例えば、ｐＨ、塩および供給物の異なる組合せの混合物を、３ｃｍのベッド高さを有する０．６ｍＬカラムフォーマットでスクリーニングする。最大８本のカラムを並行してスクリーニングする。ミニチュアカラムでは、典型的なカラムの約３００ｃｍ／ｈからミニチュアカラムフォーマットの約４５ｃｍ／ｈまで線形流速を減少させることによって、約４分の典型的な滞留時間が維持される。クロマトグラフィースクリーニングのための他のあらゆる典型的なパラメータが保存される。溶出液画分を９６ウェルプレートに収集することによって、プールとしてまたは画分として収集して、実験室規模の試験と同様のクロマトグラムを生成することができる。
生成タンパク質（例えばモノクローナル抗体）からＨＣＰ（例えばリパーゼ）を分離するための操作条件が決定されると、それに応じてロード流体および／または樹脂の条件を調整することができる。例えば、必要な操作条件にする溶液を用いて樹脂を洗浄することによって、樹脂を平衡化することができる。
６．生成タンパク質から宿主細胞リパーゼを分離する方法
本開示はさらに、クロマトグラフィープロセスによって生成タンパク質（例えばモノクローナル抗体）からＨＣＰ（例えばリパーゼ）を分離する方法を提供する。
一態様では、クロマトグラフィープロセスによって、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片から宿主細胞リパーゼを分離する方法が本明細書で提供され、該方法は、
（ａ）ローディング操作条件下で、リパーゼと、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片とを含むロード流体をクロマトグラフィー樹脂に通過させること、および
（ｂ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片をフロースルー中で回収することを含み、
ここで、分離係数（α）が、リパーゼの分配係数（ＫＰ）と抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片のＫＰとの比であり、そしてここで、ｌｏｇ αはローディング操作条件下で０．５よりも大きい。
特定の実施形態では、ｌｏｇ αは、ローディング操作条件下で１．０よりも大きい。
いくつかの実施形態では、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは、ローディング操作条件下で１．０よりも大きい。他の実施形態では、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは、ローディング操作条件下で１．５よりも大きい。
特定の実施形態では、ローディング操作条件下で、ｌｏｇ αは０．５よりも大きく、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは１．０よりも大きい。いくつかの実施形態では、ローディング操作条件下で、ｌｏｇ αは０．５よりも大きく、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは１．５よりも大きい。他の実施形態では、ローディング操作条件下で、ｌｏｇ αは１．０よりも大きく、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは１．０よりも大きい。さらに他の実施形態では、ローディング操作条件下で、ｌｏｇ αは１．０よりも大きく、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは１．５よりも大きい。
別の態様では、クロマトグラフィープロセスによって、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片から宿主細胞リパーゼを分離する方法が本明細書で提供され、該方法は、
（ａ）リパーゼと、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片とを含むロード流体をクロマトグラフィー樹脂に通過させること、および
（ｂ）溶出操作条件下で溶出溶液を用いて、クロマトグラフィー樹脂から抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を溶出することを含み、
αが、リパーゼのＫＰと抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片のＫＰとの比であり、ｌｏｇ αが、溶出操作条件下で０．５よりも大きい。
特定の実施形態では、ｌｏｇ αは、溶出操作条件下で１．０よりも大きい。
いくつかの実施形態では、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは、溶出操作条件下で１．０よりも大きい。他の実施形態では、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは、溶出操作条件下で１．５よりも大きい。
特定の実施形態では、溶出操作条件下でｌｏｇ αは０．５よりも大きく、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは１．０よりも大きい。いくつかの実施形態では、溶出操作条件下で、ｌｏｇ αは０．５よりも大きく、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは１．５よりも大きい。他の実施形態では、溶出操作条件下で、ｌｏｇ αは１．０よりも大きく、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは１．０よりも大きい。さらに他の実施形態では、溶出操作条件下で、ｌｏｇ αは１．０よりも大きく、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは１．５よりも大きい。
本明細書で提供される様々な方法のいくつかの実施形態では、リパーゼはＣＨＯ細胞リパーゼである。
特定の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬからなる群から選択される。一実施形態では、リパーゼはＰＬＢＬ２である。別の実施形態では、リパーゼはＬＰＬである。さらに別の実施形態では、リパーゼはＬＰＬＡ２である。一実施形態では、リパーゼはＬＰ－ＰＬＡ２である。別の実施形態では、リパーゼはＬＡＬである。また別の実施形態では、リパーゼは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異なるリパーゼを含む。またさらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬからなる群から選択される２つ、３つ、４つまたは５つの異なるリパーゼを含む。一実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰＬを含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。一実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＰＬＡ２を含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。一実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＡＬを含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。またさらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。
特定の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬからなる群から選択される。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼはＰＬＢＬ２である。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼはＬＰＬである。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼはＬＰＬＡ２である。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼはＬＰ－ＰＬＡ２である。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼはＬＡＬである。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異なるＣＨＯ細胞リパーゼを含む。またさらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬからなる群から選択される２つ、３つ、４つまたは５つの異なるＣＨＯ細胞リパーゼを含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰＬを含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＰＬＡ２を含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＡＬを含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。またさらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。
本明細書で提供される様々な方法のいくつかの実施形態では、クロマトグラフィー樹脂はＩＥＸ樹脂である。他の実施形態では、クロマトグラフィー樹脂はＨＩＣ樹脂である。一実施形態では、ＩＥＸ樹脂はＣＥＸ樹脂である。別の実施形態では、ＣＥＸ樹脂は混合モードＣＥＸ樹脂である。さらに別の実施形態では、ＩＥＸ樹脂はＡＥＸ樹脂である。また別の実施形態では、ＡＥＸ樹脂は混合モードＡＥＸ樹脂である。
ＣＥＸ樹脂を使用する様々な方法の特定の実施形態では、操作条件のｐＨは約６．０未満である。いくつかの実施形態では、操作条件のｐＨは約５．５未満である。他の実施形態では、操作条件のｐＨは約５．０未満である。さらに他の実施形態では、操作条件のｐＨは約４．５～約５．５である。また他の実施形態では、操作条件のｐＨは約４．５～約５．０である。特定の実施形態では、操作条件のｐＨは約５．０～約５．５である。いくつかの実施形態では、操作条件のｐＨは約４．９～約５．３である。
混合モードＣＥＸ樹脂を使用する様々な方法の特定の実施形態では、操作条件のｐＨは約６．０未満である。いくつかの実施形態では、操作条件のｐＨは約５．５未満である。他の実施形態では、操作条件のｐＨは約５．０未満である。さらに他の実施形態では、操作条件のｐＨは約４．５～約５．５である。また他の実施形態では、操作条件のｐＨは約４．５～約５．０である。特定の実施形態では、操作条件のｐＨは約５．０～約５．５である。いくつかの実施形態では、操作条件のｐＨは約４．９～約５．３である。
ＡＥＸ樹脂を使用する様々な方法の特定の実施形態では、操作条件のｐＨは約６．５を超える。いくつかの実施形態では、操作条件のｐＨは約６．９を超える。他の実施形態では、操作条件のｐＨは約７．２を超える。さらに他の実施形態では、操作条件のｐＨは約６．９～約７．９である。また他の実施形態では、操作条件のｐＨは約７．２～約７．５である。特定の実施形態では、操作条件のｐＨは約７．５～約７．８である。
混合モードＡＥＸ樹脂を使用する様々な方法の特定の実施形態では、操作条件のｐＨは約６．５を超える。いくつかの実施形態では、操作条件のｐＨは約６．９を超える。他の実施形態では、操作条件のｐＨは約７．２を超える。さらに他の実施形態では、操作条件のｐＨは約６．９～約７．９である。また他の実施形態では、操作条件のｐＨは約７．２～約７．５である。特定の実施形態では、操作条件のｐＨは約７．５～約７．８である。
本明細書で提供される様々な方法の特定の実施形態では、操作条件は、塩を加えることによってイオン強度および／または導電率を調節することをさらに含む。一実施形態では、操作条件は、塩を加えることによってイオン強度を調節することをさらに含む。別の実施形態では、操作条件は、塩を加えることによって導電率を調節することをさらに含む。さらに別の実施形態では、操作条件は、塩を加えることによってイオン強度および導電率を調節することをさらに含む。いくつかの実施形態では、塩を加える効果は、所望のｌｏｇ αを達成することである。他の実施形態では、塩を加える効果は、リパーゼの所望のｌｏｇ ＫＰを達成することである。さらに他の実施形態では、塩を加える効果は、所望のｌｏｇ αとリパーゼの所望のｌｏｇ ＫＰとを達成することである。したがって、一実施形態では、操作条件は、塩を加えることによって所望のｌｏｇ αを達成することをさらに含む。別の実施形態では、操作条件は、塩を加えることによってリパーゼの所望のｌｏｇ ＫＰを達成することをさらに含む。さらに別の実施形態では、操作条件は、塩を加えることによって、所望のｌｏｇ αとリパーゼの所望のｌｏｇ ＫＰとを達成することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、操作溶液中の塩は、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムおよびＴｒｉｓ－ＨＣｌからなる群から選択される。一実施形態では、塩は塩化ナトリウムである。別の実施形態では、塩は酢酸ナトリウムである。さらに別の実施形態では、塩はリン酸ナトリウムである。また別の実施形態では、塩は硫酸アンモニウムである。一実施形態では、塩は硫酸ナトリウムである。別の実施形態では、塩はＴｒｉｓ－ＨＣｌである。
具体的な実施形態では、操作溶液中の塩化ナトリウムの濃度は約１００ｍＭ～約２２５ｍＭであり、クロマトグラフィー樹脂はＣＥＸであり、そして、操作条件のｐＨは約５．０～約６．０である。
別の具体的な実施形態では、操作溶液中の塩化ナトリウムの濃度は約１５０ｍＭ～約１８０ｍＭであり、クロマトグラフィー樹脂はＣＥＸであり、そして、操作条件のｐＨは約５．０～約６．０である。
さらに別の具体的な実施形態では、操作溶液中の酢酸ナトリウムの濃度は約１００ｍＭ～約２００ｍＭであり、クロマトグラフィー樹脂はＡＥＸであり、そして、操作条件のｐＨは約６．９～約７．８である。
また別の具体的な実施形態では、操作溶液中の硫酸ナトリウムの濃度は約５００ｍＭ～約６２０ｍＭであり、クロマトグラフィー樹脂はＨＩＣであり、そして、操作条件のｐＨは約７である。
またさらに別の具体的な実施形態では、操作溶液中の硫酸ナトリウムの濃度は約５１０ｍＭ～約５６０ｍＭであり、クロマトグラフィー樹脂はＨＩＣであり、そして、操作条件のｐＨは約７である。
さらに別の態様では、混合モードＡＥＸクロマトグラフィープロセスによって抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片からＰＬＢＬ２を分離する方法が本明細書で提供され、該方法は、
（ａ）ＰＬＢＬ２と、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片とを含むロード流体を混合モードＡＥＸ樹脂に通過させること、および
（ｂ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片をフロースルー中で回収することを含み、
ここで、ロード流体のｐＨは約ｐＨ７．２～約ｐＨ７．６であり、そしてここで、ロード流体は塩を含まない。
そのような方法の特定の実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片は、治療用タンパク質である。
そのような方法のいくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片は、モノクローナル抗体である。
また別の態様では、ＣＥＸクロマトグラフィープロセスによって抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片からＰＬＢＬ２を分離する方法が本明細書で提供され、該方法は、
（ａ）ＰＬＢＬ２と、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片とを含むロード流体をＣＥＸ樹脂に通過させること、および
（ｂ）溶出溶液を用いて、ＣＥＸ樹脂から抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を溶出することを含み、
ここで、溶出溶液のｐＨは約ｐＨ４．９～約ｐＨ５．３であり、そしてここで、溶出溶液は、約１２０ｍＭ～約１７５ｍＭの塩化ナトリウムをさらに含む。
一実施形態では、ＣＥＸクロマトグラフィープロセスによって抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片からＰＬＢＬ２を分離する方法は、
（ａ）ＰＬＢＬ２と、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片とを含むロード流体をＣＥＸ樹脂に通過させること、および
（ｂ）溶出溶液を用いて、ＣＥＸ樹脂から抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を溶出することを含み、
ここで、溶出溶液のｐＨは約ｐＨ５．１であり、そしてここで、溶出溶液は、約１５０ｍＭの塩化ナトリウムをさらに含む。
さらに別の実施形態では、ＣＥＸクロマトグラフィープロセスによって抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片からＰＬＢＬ２を分離する方法は、
（ａ）ＰＬＢＬ２と、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片とを含むロード流体をＣＥＸ樹脂に通過させること、および
（ｂ）溶出溶液を用いて、ＣＥＸ樹脂から抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を溶出することを含み、
ここで、溶出溶液のｐＨは約ｐＨ５．１であり、そしてここで、溶出溶液は、約１６５ｍＭの塩化ナトリウムをさらに含む。
また別の態様では、ＣＥＸクロマトグラフィープロセスによって抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片からＬＰＬＡ２を分離する方法が本明細書で提供され、該方法は、
（ａ）ＬＰＬＡ２と、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片とを含むロード流体をＣＥＸ樹脂に通過させること、および
（ｂ）溶出溶液を用いて、ＣＥＸ樹脂から抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を溶出することを含み、
ここで、溶出溶液のｐＨは約ｐＨ５．０～約ｐＨ５．４であり、そしてここで、溶出溶液は約１５０ｍＭ～約２７５ｍＭの塩化ナトリウムをさらに含む。
一実施形態では、ＣＥＸクロマトグラフィープロセスによって抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片からＬＰＬＡ２を分離する方法は、
（ａ）ＬＰＬＡ２と、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片とを含むロード流体をＣＥＸ樹脂に通過させること、および
（ｂ）溶出溶液を用いて、ＣＥＸ樹脂から抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を溶出することを含み、
ここで、溶出溶液のｐＨは約ｐＨ５．１であり、そしてここで、溶出溶液は、約１５０ｍＭの塩化ナトリウムをさらに含む。
別の実施形態では、ＣＥＸクロマトグラフィープロセスによって抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片からＬＰＬＡ２を分離する方法は、
（ａ）ＬＰＬＡ２と、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片とを含むロード流体をＣＥＸ樹脂に通過させること、および
（ｂ）溶出溶液を用いて、ＣＥＸ樹脂から抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を溶出することを含み、
ここで、溶出溶液のｐＨは約ｐＨ５．１であり、そしてここで、溶出溶液は、約２００ｍＭの塩化ナトリウムをさらに含む。
さらに別の実施形態では、ＣＥＸクロマトグラフィープロセスによって抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片からＬＰＬＡ２を分離する方法は、
（ａ）ＬＰＬＡ２と、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片とを含むロード流体をＣＥＸ樹脂に通過させること、および
（ｂ）溶出溶液を用いて、ＣＥＸ樹脂から抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を溶出することを含み、
ここで、溶出溶液のｐＨは約ｐＨ５．１であり、そしてここで、溶出溶液は、約２５０ｍＭの塩化ナトリウムをさらに含む。
本明細書で提供される分離方法は、本明細書に記載されるまたは当技術分野で一般的に使用される１つ以上の分離工程と組み合わせて使用され得る。一実施形態では、１つ以上の分離工程は、本明細書に記載の方法に先行する。別の実施形態では、１つ以上の分離工程は、本明細書に記載の方法に続く。さらに別の実施形態では、１つ以上の分離工程は、本明細書に記載の２つの方法の合間に行われる。また他の実施形態では、１つ以上の分離工程は、本明細書に記載の方法の前、後および／または合間に行われる。いくつの分離工程もしくは方法を組み合わせることができるか、または組み合わせる分離工程もしくは方法の順序に制限はない。
本明細書で提供される様々な方法のさらなる実施形態では、ロード流体は、事前のクロマトグラフィープロセスから得られる溶出液である。一実施形態では、事前のクロマトグラフィープロセスは、アフィニティークロマトグラフィーを含む。別の実施形態では、事前のクロマトグラフィープロセスは、アフィニティークロマトグラフィー、それに続く非アフィニティークロマトグラフィーを含む。さらに別の実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーはプロテインＡクロマトグラフィーである。また別の実施形態では、非アフィニティークロマトグラフィーはＡＥＸクロマトグラフィーである。またさらに別の実施形態では、事前のクロマトグラフィープロセスは、プロテインＡクロマトグラフィー、それに続くＡＥＸクロマトグラフィーを含む。
またさらに別の態様では、ＣＥＸクロマトグラフィープロセスによって抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片から宿主細胞リパーゼを分離する方法が本明細書で提供され、該方法は、
（ａ）宿主細胞リパーゼと、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片とを含むロード流体をＣＥＸ樹脂に通過させること、および
（ｂ）溶出溶液を用いて、ＣＥＸ樹脂から抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を溶出することを含み、
ここで、溶出溶液のｐＨは約ｐＨ４．９～約ｐＨ５．４であり、そしてここで、溶出溶液の導電率は、約１５ｍＳ／ｃｍ～約２１ｍＳ／ｃｍである。
そのような方法の特定の実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片は、治療用タンパク質である。
そのような方法の他の実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片は、モノクローナル抗体である。
また別の態様では、ＣＥＸクロマトグラフィープロセスによって、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片から宿主細胞リパーゼを分離する方法が本明細書で提供され、該方法は、
（ａ）宿主細胞リパーゼと、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片とを含むロード流体をＣＥＸ樹脂に通過させること、および
（ｂ）溶出溶液を用いて、ＣＥＸ樹脂から抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を溶出することを含み、
溶出溶液のｐＨが、約ｐＨ４．９～約ｐＨ５．４であり、溶出溶液が、約１３５ｍＭ～約１９５ｍＭの塩化ナトリウムをさらに含む。
７．生成タンパク質製剤内のＰＳ－８０安定性を改善する方法
本開示はさらに、生成タンパク質（例えばモノクローナル抗体）からクロマトグラフィープロセスを使用してＨＣＰ（例えばリパーゼ）を分離することによって、生成タンパク質製剤（例えば、医薬物質製剤または医薬品製剤）内のＰＳ－８０安定性を改善する方法を提供する。
またさらに別の態様では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤内のＰＳ－８０安定性を改善する方法が本明細書で提供され、該方法は、
（ａ）ローディング操作条件下で、宿主細胞リパーゼと、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片とを含むロード流体をクロマトグラフィー樹脂に通過させること、
（ｂ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片をフロースルー中で回収すること、および
（ｃ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤がＰＳ－８０を含むように、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を製剤化することを含み、
ここで、分離係数（α）は、リパーゼの分配係数（ＫＰ）と抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片のＫＰとの比であり、そしてここで、ｌｏｇ αは、ローディング操作条件下で０．５よりも大きい。
特定の実施形態では、ｌｏｇ αは、ローディング操作条件下で１．０よりも大きい。
いくつかの実施形態では、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは、ローディング操作条件下で１．０よりも大きい。他の実施形態では、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは、ローディング操作条件下で１．５よりも大きい。
特定の実施形態では、ローディング操作条件下で、ｌｏｇ αは０．５よりも大きく、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは１．０よりも大きい。いくつかの実施形態では、ローディング操作条件下で、ｌｏｇ αは０．５よりも大きく、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは１．５よりも大きい。他の実施形態では、ローディング操作条件下で、ｌｏｇ αは１．０よりも大きく、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは１．０よりも大きい。さらに他の実施形態では、ローディング操作条件下で、ｌｏｇ αは１．０よりも大きく、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは１．５よりも大きい。
別の態様では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤内のＰＳ－８０安定性を改善する方法が本明細書で提供され、該方法は、
（ａ）宿主細胞リパーゼと、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片とを含むロード流体をクロマトグラフィー樹脂に通過させること、
（ｂ）溶出操作条件下で溶出溶液を用いて、クロマトグラフィー樹脂から抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を溶出すること、および
（ｃ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片がＰＳ－８０を含有する溶液中にあるように、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を製剤化することを含み、
ここで、αは、リパーゼのＫＰと抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片のＫＰとの比であり、そしてここで、ｌｏｇ αは、溶出操作条件下で０．５よりも大きい。
特定の実施形態では、ｌｏｇ αは、溶出操作条件下で１．０よりも大きい。
いくつかの実施形態では、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは、溶出操作条件下で１．０よりも大きい。他の実施形態では、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは、溶出操作条件下で１．５よりも大きい。
特定の実施形態では、溶出操作条件下で、ｌｏｇ αは０．５よりも大きく、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは１．０よりも大きい。いくつかの実施形態では、溶出操作条件下で、ｌｏｇ αは０．５よりも大きく、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは１．５よりも大きい。他の実施形態では、溶出操作条件下で、ｌｏｇ αは１．０よりも大きく、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは１．０よりも大きい。さらに他の実施形態では、溶出操作条件下で、ｌｏｇ αは１．０よりも大きく、リパーゼのｌｏｇ ＫＰは１．５よりも大きい。
本明細書で提供される様々な方法のいくつかの実施形態では、リパーゼは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞リパーゼである。
特定の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬからなる群から選択される。一実施形態では、リパーゼはＰＬＢＬ２である。別の実施形態では、リパーゼはＬＰＬである。さらに別の実施形態では、リパーゼはＬＰＬＡ２である。一実施形態では、リパーゼはＬＰ－ＰＬＡ２である。別の実施形態では、リパーゼはＬＡＬである。また別の実施形態では、リパーゼは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異なるリパーゼを含む。またさらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬからなる群から選択される２つ、３つ、４つまたは５つの異なるリパーゼを含む。一実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰＬを含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。一実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＰＬＡ２を含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。一実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＡＬを含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。またさらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。
特定の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬからなる群から選択される。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼはＰＬＢＬ２である。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼはＬＰＬである。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼはＬＰＬＡ２である。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼはＬＰ－ＰＬＡ２である。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼはＬＡＬである。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異なるＣＨＯ細胞リパーゼを含む。またさらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬからなる群から選択される２つ、３つ、４つまたは５つの異なるＣＨＯ細胞リパーゼを含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰＬを含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＰＬＡ２を含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＡＬを含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。またさらに別の実施形態では、ＣＨＯ細胞リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。
本明細書で提供される様々な方法のいくつかの実施形態では、クロマトグラフィー樹脂はイオン交換（ＩＥＸ）樹脂である。他の実施形態では、クロマトグラフィー樹脂は疎水性相互作用（ＨＩＣ）樹脂である。一実施形態では、ＩＥＸ樹脂はカチオン交換（ＣＥＸ）樹脂である。別の実施形態では、ＣＥＸ樹脂は混合モードＣＥＸ樹脂である。さらに別の実施形態では、ＩＥＸ樹脂はアニオン交換（ＡＥＸ）樹脂である。また別の実施形態では、ＡＥＸ樹脂は混合モードＡＥＸ樹脂である。
ＣＥＸ樹脂または混合モードＣＥＸ樹脂を使用する様々な方法の特定の実施形態では、操作条件のｐＨは約６．０未満である。ＣＥＸ樹脂または混合モードＣＥＸ樹脂を使用する様々な方法のいくつかの実施形態では、操作条件のｐＨは約５．５未満である。ＣＥＸ樹脂または混合モードＣＥＸ樹脂を使用する様々な方法の他の実施形態では、操作条件のｐＨは約５．０未満である。ＣＥＸ樹脂または混合モードＣＥＸ樹脂を使用する様々な方法のさらに他の実施形態では、操作条件のｐＨは約４．５～約５．５である。ＣＥＸ樹脂または混合モードＣＥＸ樹脂を使用する様々な方法のまた他の実施形態では、操作条件のｐＨは約４．５～約５．０である。ＣＥＸ樹脂または混合モードＣＥＸ樹脂を使用する様々な方法の特定の実施形態では、操作条件のｐＨは約５．０～約５．５である。ＣＥＸ樹脂または混合モードＣＥＸ樹脂を使用する様々な方法のいくつかの実施形態では、操作条件のｐＨは約４．９～約５．３である。
ＡＥＸ樹脂または混合モードＡＥＸ樹脂を使用する様々な方法の特定の実施形態では、操作条件のｐＨは約６．５を超える。ＡＥＸ樹脂または混合モードＡＥＸ樹脂を使用する様々な方法のいくつかの実施形態では、操作条件のｐＨは約６．９を超える。ＡＥＸ樹脂または混合モードＡＥＸ樹脂を使用する様々な方法の他の実施形態では、操作条件のｐＨは約７．２を超える。ＡＥＸ樹脂または混合モードＡＥＸ樹脂を使用する様々な方法のさらに他の実施形態では、操作条件のｐＨは約６．９～約７．９である。ＡＥＸ樹脂または混合モードＡＥＸ樹脂を使用する様々な方法のまた他の実施形態では、操作条件のｐＨは約７．２～約７．５である。ＡＥＸ樹脂または混合モードＡＥＸ樹脂を使用する様々な方法の特定の実施形態では、操作条件のｐＨは約７．５～約７．８である。
本明細書で提供される様々な方法の特定の実施形態では、操作条件は、塩を加えることによって操作溶液のイオン強度および／または導電率を調節することをさらに含む。一実施形態では、操作条件は、塩を加えることによって操作溶液のイオン強度を調節することをさらに含む。別の実施形態では、操作条件は、塩を加えることによって操作溶液の導電率を調節することをさらに含む。さらに別の実施形態では、操作条件は、塩を加えることによって操作溶液のイオン強度および導電率を調節することをさらに含む。いくつかの実施形態では、塩を加える効果は、所望のｌｏｇ αを達成することである。他の実施形態では、塩を加える効果は、リパーゼの所望のｌｏｇ ＫＰを達成することである。さらに他の実施形態では、塩を加える効果は、所望のｌｏｇ αと、リパーゼの所望のｌｏｇ ＫＰとを達成することである。
いくつかの実施形態では、操作溶液中の塩は、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムおよびＴｒｉｓ－ＨＣｌからなる群から選択される。一実施形態では、塩は塩化ナトリウムである。別の実施形態では、塩は酢酸ナトリウムである。さらに別の実施形態では、塩はリン酸ナトリウムである。また別の実施形態では、塩は硫酸アンモニウムである。一実施形態では、塩は硫酸ナトリウムである。別の実施形態では、塩はＴｒｉｓ－ＨＣｌである。
具体的な実施形態では、操作溶液中の塩化ナトリウムの濃度は約１００ｍＭ～約２２５ｍＭであり、クロマトグラフィー樹脂はＣＥＸであり、そして、操作条件のｐＨは約５．０～約６．０である。
別の具体的な実施形態では、操作溶液中の塩化ナトリウムの濃度は約１５０ｍＭ～約１８０ｍＭであり、クロマトグラフィー樹脂はＣＥＸであり、そして、操作条件のｐＨは約５．０～約６．０である。
さらに別の具体的な実施形態では、操作溶液中の酢酸ナトリウムの濃度は約１００ｍＭ～約２００ｍＭであり、クロマトグラフィー樹脂はＡＥＸであり、そして、操作条件のｐＨは約６．９～約７．８である。
また別の具体的な実施形態では、操作溶液中の硫酸ナトリウムの濃度は約５００ｍＭ～約６２０ｍＭであり、クロマトグラフィー樹脂はＨＩＣであり、そして、操作条件のｐＨは約７である。
またさらに別の具体的な実施形態では、操作溶液中の硫酸ナトリウムの濃度は約５１０ｍＭ～約５６０ｍＭであり、クロマトグラフィー樹脂はＨＩＣであり、そして、操作条件のｐＨは約７である。
さらに別の態様では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤内のＰＳ－８０安定性を改善する方法が本明細書で提供され、該方法は、
（ａ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を含むロード流体を混合モードＡＥＸ樹脂に通過させること、
（ｂ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片をフロースルー中で回収すること、および
（ｃ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤がＰＳ－８０を含む溶液であるように、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を製剤化することを含み、
ここで、ロード流体のｐＨは、約ｐＨ７．２～約ｐＨ７．６であり、そしてここで、ロード流体は塩を含まない。
別の態様では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤を作製するためのプロセスが本明細書で提供され、該プロセスは、
（ａ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を含むロード流体を混合モードＡＥＸ樹脂に通過させること、
（ｂ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片をフロースルー中で回収すること、および
（ｃ）ＰＳ－８０を含む溶液中で、工程（ｂ）から得られる抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を製剤化することを含み、ここで、６ヶ月後の平均ＰＳ８０分解は１０％以下である。
さらに別の実施形態では、ＰＳ８０分解は、限定するものではないが、質量分析（ＭＳ）、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）、または帯電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を有するＨＰＬＣシステムを用いた固相抽出（ＳＰＥ）を含む様々な方法を使用して、インタクトなＰＳ－８０分子の量および／または分解生成物の量によって測定される。
また別の態様では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤内のＰＳ－８０安定性を改善する方法が本明細書で提供され、該方法は、
（ａ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を含むロード流体をＣＥＸ樹脂に通過させること、
（ｂ）溶出溶液を用いて、ＣＥＸ樹脂から抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を溶出すること、および
（ｃ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤がＰＳ－８０を含む溶液であるように、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を製剤化することを含み、
ここで、溶出溶液のｐＨは、約ｐＨ４．９～約ｐＨ５．３であり、そしてここで、溶出溶液は、約１２０ｍＭ～約１７５ｍＭの塩化ナトリウムをさらに含む。
一実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤内のＰＳ－８０安定性を改善する方法は、
（ａ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を含むロード流体をＣＥＸ樹脂に通過させること、
（ｂ）溶出溶液を用いて、ＣＥＸ樹脂から抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を溶出すること、および
（ｃ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤がＰＳ－８０を含む溶液であるように、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を製剤化することを含み、
ここで、溶出溶液のｐＨは約ｐＨ５．１であり、そしてここで、溶出溶液は、約１５０ｍＭの塩化ナトリウムをさらに含む。
さらに別の実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤内のＰＳ－８０安定性を改善する方法は、
（ａ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を含むロード流体をＣＥＸ樹脂に通過させること、
（ｂ）溶出溶液を用いて、ＣＥＸ樹脂から抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を溶出すること、および
（ｃ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤がＰＳ－８０を含む溶液であるように、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を製剤化することを含み、
ここで、溶出溶液のｐＨは約ｐＨ５．１であり、そしてここで、溶出溶液は、約１６５ｍＭの塩化ナトリウムをさらに含む。
また別の態様では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤内のＰＳ－８０安定性を改善する方法が本明細書で提供され、該方法は、
（ａ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を含むロード流体をＣＥＸ樹脂に通過させること、
（ｂ）溶出溶液を用いて、ＣＥＸ樹脂から抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を溶出すること、および
（ｃ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤がＰＳ－８０を含む溶液であるように、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を製剤化することを含み、
ここで、溶出溶液のｐＨは、約ｐＨ５．０～約ｐＨ５．４であり、そしてここで、溶出溶液は、約１５０ｍＭ～約２７５ｍＭの塩化ナトリウムをさらに含む。
一実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤内のＰＳ－８０安定性を改善する方法は、
（ａ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を含むロード流体をＣＥＸ樹脂に通過させること、
（ｂ）溶出溶液を用いて、ＣＥＸ樹脂から抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を溶出すること、および
（ｃ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤がＰＳ－８０を含む溶液であるように、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を製剤化することを含み、
ここで、溶出溶液のｐＨは約ｐＨ５．１であり、そしてここで、溶出溶液は、約２００ｍＭの塩化ナトリウムをさらに含む。
さらに別の実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤内のＰＳ－８０安定性を改善する方法は、
（ａ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を含むロード流体をＣＥＸ樹脂に通過させること、
（ｂ）溶出溶液を用いて、ＣＥＸ樹脂から抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を溶出すること、および
（ｃ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤がＰＳ－８０を含む溶液であるように、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を製剤化することを含み、
ここで、溶出溶液のｐＨは約ｐＨ５．１であり、そしてここで、溶出溶液は、約２５０ｍＭの塩化ナトリウムをさらに含む。
本明細書で提供される様々な方法のさらなる実施形態では、ロード流体は、事前のクロマトグラフィープロセスから得られる溶出液である。一実施形態では、事前のクロマトグラフィープロセスは、アフィニティークロマトグラフィーを含む。別の実施形態では、事前のクロマトグラフィープロセスは、アフィニティークロマトグラフィー、それに続く非アフィニティークロマトグラフィーを含む。さらに別の実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーはプロテインＡクロマトグラフィーである。また別の実施形態では、非アフィニティークロマトグラフィーはＡＥＸクロマトグラフィーである。またさらに別の実施形態では、事前のクロマトグラフィープロセスは、プロテインＡクロマトグラフィー、それに続くＡＥＸクロマトグラフィーを含む。
別の態様では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤内のＰＳ－８０安定性を改善する方法が本明細書で提供され、該方法は、
（ａ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を含むロード流体をＣＥＸ樹脂に通過させること、
（ｂ）溶出溶液を用いて、ＣＥＸ樹脂から抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を溶出すること、および
（ｃ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤がＰＳ－８０を含む溶液であるように、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を製剤化することを含み、
ここで、溶出溶液のｐＨは、約ｐＨ４．９～約ｐＨ５．４であり、そしてここで、溶出溶液の導電率は、約１５ｍＳ／ｃｍ～約２１ｍＳ／ｃｍである。
別の態様では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤内のＰＳ－８０安定性を改善する方法が本明細書で提供され、該方法は、
（ａ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を含むロード流体をＣＥＸ樹脂に通過させること、
（ｂ）溶出溶液を用いて、ＣＥＸ樹脂から抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を溶出すること、および
（ｃ）抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片製剤がＰＳ－８０を含む溶液であるように、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を製剤化することを含み、
ここで、溶出溶液のｐＨは、約ｐＨ４．９～約ｐＨ５．４であり、そしてここで、溶出溶液は、約１３５ｍＭ～約１９５ｍＭの塩化ナトリウムをさらに含む。
８．医薬組成物
本開示はまた、治療用タンパク質（例えばモノクローナル抗体）と、少量のＨＣＰ（例えばリパーゼ）とを含む医薬組成物（例えば、医薬物質または医薬品）を提供する。
特定の実施形態では、医薬組成物は、治療用タンパク質と、１ｐｐｍ未満の宿主細胞リパーゼとを含む。他の実施形態では、医薬組成物は、治療用タンパク質と、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８または０．９ｐｐｍ未満の宿主細胞リパーゼとを含む。一実施形態では、医薬組成物は、治療用タンパク質と、０．１ｐｐｍ未満の宿主細胞リパーゼとを含む。別の実施形態では、医薬組成物は、治療用タンパク質と、０．２ｐｐｍ未満の宿主細胞リパーゼとを含む。さらに別の実施形態では、医薬組成物は、治療用タンパク質と、０．３ｐｐｍ未満の宿主細胞リパーゼとを含む。また別の実施形態では、医薬組成物は、治療用タンパク質と、０．４ｐｐｍ未満の宿主細胞リパーゼとを含む。またさらに別の実施形態では、医薬組成物は、治療用タンパク質と、０．５ｐｐｍ未満の宿主細胞リパーゼとを含む。一実施形態では、医薬組成物は、治療用タンパク質と、０．６ｐｐｍ未満の宿主細胞リパーゼとを含む。別の実施形態では、医薬組成物は、治療用タンパク質と、０．７ｐｐｍ未満の宿主細胞リパーゼとを含む。さらに別の実施形態では、医薬組成物は、治療用タンパク質と、０．８ｐｐｍ未満の宿主細胞リパーゼとを含む。また別の実施形態では、医薬組成物は、治療用タンパク質と、０．９ｐｐｍ未満の宿主細胞リパーゼとを含む。
本明細書に記載される医薬組成物の様々な実施形態では、宿主細胞リパーゼのレベルは、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）によって測定される。
特定の実施形態では、医薬組成物は、
（ａ）約４．９～約５．３のｐＨを有し、約１２０ｍＭ～約１７５ｍＭの塩化ナトリウムを含む溶出溶液、
（ｂ）約５．１のｐＨを有し、約１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む溶出溶液、
（ｃ）約５．１のｐＨを有し、約１６５ｍＭの塩化ナトリウムを含む溶出溶液、
（ｄ）約４．９～約５．４のｐＨと、約１５ｍＳ／ｃｍ～約２１ｍＳ／ｃｍの導電率とを有する溶出溶液、
（ｅ）約４．９～約５．４のｐＨを有し、約１３５ｍＭ～約１９５ｍＭの塩化ナトリウムを含む溶出溶液、
（ｆ）約ｐＨ５．０～約ｐＨ５．４のｐＨを有し、約１５０ｍＭ～約２７５ｍＭの塩化ナトリウムを含む溶出溶液、
（ｇ）約５．１のｐＨを有し、約２００ｍＭの塩化ナトリウムを含む溶出溶液、および
（ｈ）約５．１のｐＨを有し、約２５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む溶出溶液、からなる群から選択される溶出溶液を使用するＣＥＸクロマトグラフィーから得られる溶出液である。
一実施形態では、医薬組成物は、約４．９～約５．３のｐＨを有し、約１２０ｍＭ～約１７５ｍＭの塩化ナトリウムを含む溶出溶液を使用するＣＥＸクロマトグラフィーから得られる溶出液である。
別の実施形態では、医薬組成物は、約５．１のｐＨを有し、約１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む溶出溶液を使用するＣＥＸクロマトグラフィーから得られる溶出液である。
さらに別の実施形態では、医薬組成物は、約５．１のｐＨを有し、約１６５ｍＭの塩化ナトリウムを含む溶出溶液を使用するＣＥＸクロマトグラフィーから得られる溶出液である。
また別の実施形態では、医薬組成物は、約４．９～約５．４のｐＨと、約１５ｍＳ／ｃｍ～約２１ｍＳ／ｃｍの導電率とを有する溶出溶液を使用するＣＥＸクロマトグラフィーから得られる溶出液である。
一実施形態では、医薬組成物は、約４．９～約５．４のｐＨを有し、約１３５ｍＭ～約１９５ｍＭの塩化ナトリウムを含む溶出溶液を使用するＣＥＸクロマトグラフィーから得られる溶出液である。
別の実施形態では、医薬組成物は、約ｐＨ５．０～約ｐＨ５．４のｐＨを有し、約１５０ｍＭ～約２７５ｍＭの塩化ナトリウムを含む溶出溶液を使用するＣＥＸクロマトグラフィーから得られる溶出液である。
また別の実施形態では、医薬組成物は、約５．１のｐＨを有し、約２００ｍＭの塩化ナトリウムを含む溶出溶液を使用するＣＥＸクロマトグラフィーから得られる溶出液である。
またさらに別の実施形態では、医薬組成物は、約５．１のｐＨを有し、約２５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む溶出溶液を使用するＣＥＸクロマトグラフィーから得られる溶出液である。
医薬組成物のいくつかの実施形態では、ＣＥＸクロマトグラフィーの前に、フロースルーモードで操作されるＡＥＸクロマトグラフィーが先行する。
医薬組成物の特定の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬからなる群から選択される。一実施形態では、リパーゼはＰＬＢＬ２である。別の実施形態では、リパーゼはＬＰＬである。さらに別の実施形態では、リパーゼはＬＰＬＡ２である。一実施形態では、リパーゼはＬＰ－ＰＬＡ２である。別の実施形態では、リパーゼはＬＡＬである。また別の実施形態では、リパーゼは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異なるリパーゼを含む。またさらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬからなる群から選択される２つ、３つ、４つまたは５つの異なるリパーゼを含む。一実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰＬを含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬおよびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。一実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＰＬＡ２を含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。一実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよびＬＡＬを含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬ、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。一実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＰ－ＰＬＡ２を含む。別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。さらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。また別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。またさらに別の実施形態では、リパーゼは、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬ、ＬＰＬＡ２、ＬＰ－ＰＬＡ２およびＬＡＬを含む。
医薬組成物の他の実施形態では、治療用タンパク質はモノクローナル抗体である。
［実施例］
このセクション（セクションＶＩ）の実施例は、限定ではなく例示として提供されている。
［実施例１］：異なる種のＫＰを決定する方法
分配係数ＫＰは、既知の液体濃度のタンパク質（または目的の他の分子）を既知の体積のクロマトグラフィー樹脂と混合し、樹脂に結合したタンパク質と液体中に残っているタンパク質との比を計算することによって決定される：
ＫＰ＝ｑ／ｃ＝［結合］／［遊離］。
その後の全実施例について、クロマトグラフィー体積は２０μＬであり、液体体積は２００μＬであり、タンパク質濃度は０．５ｍｇ／ｍＬであった。これらの体積は、５ｍｇ／ｍＬの有効樹脂ローディングに対して１０：１の相比を提供する。
スクリーニングは、９６ウェルフィルタープレート（Ｐ／Ｎ ＭＳＢＶＮ１２５０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）内で樹脂と液体とを激しく混合し、真空濾過によって樹脂と液体とを分離することによって行った。工程の順序は以下の通りであった：
（ａ）３回の平衡化（供給物を含有しない緩衝液）、各工程１０分間のインキュベーション；
（ｂ）１回の供給物混合、６０分間のインキュベーション；および
（ｃ）２回のストリップ条件、各工程１０分間のインキュベーション
平衡化工程は、初期樹脂スラリー緩衝液からの緩衝液交換を可能にする。供給物混合のための６０分の時間は、所与の条件セットで樹脂リガンドとタンパク質との間の擬似平衡化を可能にする。供給工程からの濾液を２８０～３２０ｎｍでのＵＶ吸光度によって測定して、タンパク質の最終液体濃度ｃを決定した。タンパク質の結合濃度ｑは、ｃ付近と、既知の供給物濃度ｃ０（０．５ｍｇ／ｍＬ）との物質収支によって決定した。
分配は、一般に、ｌｏｇ ＫＰに関して報告されており、ｌｏｇ ＫＰは、本明細書に記載のＵＶ法を使用して約０～２まで正確に定量することができる。ｌｏｇ ＫＰスクリーニングの通則は、以下の通りである：
ｌｏｇ ＫＰ≧１．５、樹脂への強い結合；
ｌｏｇ ＫＰ＜１、結合溶出様式について溶出が予測される条件；
０．５＜ｌｏｇ ＫＰ＜１、いくらかの結合を示す弱い相互作用条件；
ｌｏｇ ＫＰ＜０．５、結合がほとんどまたは全くない。
異なる種のｌｏｇ ＫＰはまた、分離係数αを以下のように計算することによって、異なる種の分離を予測するために使用される：α＝ＫＰ、タンパク質１／ＫＰ、タンパク質２；ｌｏｇ α＝ｌｏｇ ＫＰ、タンパク質１－ｌｏｇ ＫＰ、タンパク質２、ここで、ｌｏｇ αが０から遠いほど、さらに良好な分離を示す。以下の実施例では、α＝ＫＰ、リパーゼ／ＫＰ、ｍＡｂ；ｌｏｇ α＝ｌｏｇ ＫＰ、リパーゼ－ｌｏｇ ＫＰ、ｍＡｂである。ｌｏｇ αが０．５よりも大きいことは、リパーゼとモノクローナル抗体との分離が良好であることを示す。
［実施例２］：典型的な処理条件でのＰＬＢＬ２およびｍＡｂのＫＰ値の比較
ＫＰおよびαを決定するための方法を使用して、２つのモノクローナル抗体ｍＡｂ１およびｍＡｂ２のための操作条件で、様々なクロマトグラフィープロセスを通して、既知のリパーゼ不純物ＰＬＢＬ２を分離する能力を評価した。表１は、ｍＡｂ１のためのいくつかの処理条件でのｍＡｂ１およびＰＬＢＬ２のｌｏｇ ＫＰ値およびｌｏｇ α値を要約している。
Figure 2023500775000006
表１は、クロマトグラフィープロセスによってｍＡＢ１からＰＬＢＬ２を分離するための潜在的な操作条件を示す。
プロテインＡプロセスの場合、ＰＬＢＬ２は親和性を有しないため、ＰＬＢＬ２の大部分は、ローディング工程または洗浄工程中にプロテインＡ樹脂を通って流れると予測される。プールに存在する唯一のＰＬＢＬ２は、不十分な洗浄によるものであるか、またはｍＡｂ１と関連している可能性が高い。
ｍＡｂ１のためのフロースルーモードで操作されるＡＥＸプロセスでは、ＰＬＢＬ２は、ローディング条件および洗浄条件でｍＡｂ１よりも強い結合（高いｌｏｇ ＫＰ）を示す。これにより、これらの条件で１．０よりも大きいｌｏｇ αがもたらされ、ＰＬＢＬ２がこれらの条件で樹脂に結合したままであるのに対して、ｍＡｂ１が流れ抜けることが示される。
ＣＥＸプロセスの場合、ＰＬＢＬ２は、ｍＡｂ１と比較して、塩調節に対する感受性が低く、塩範囲の比較的高い末端で比較的高いｌｏｇ ＫＰを有する。中央点および高塩限度で１．０よりも大きいｌｏｇ αは、ＰＬＢＬ２が、ｍＡｂ１溶出中に結合したままであることを示す。低塩限度は、ｍＡｂ１からＰＬＢＬ２を分離するためのはるかに好ましくないｌｏｇ αをもたらし、これは、これらの条件でいくらかの結合を保持すると予測される（１．５のｌｏｇ ＫＰ、ｍＡｂ１）。
表２は、ｍＡｂ２のためのいくつかの処理条件でのｍＡｂ２およびＰＬＢＬ２のｌｏｇ ＫＰ値およびｌｏｇ α値を要約している。
Figure 2023500775000007
表２は、クロマトグラフィープロセスによってｍＡｂ２からＰＬＢＬ２を分離するための潜在的な操作条件を示す。
プロテインＡプロセスおよびＣＥＸプロセスに対するｍＡｂ２の傾向は、ｍＡｂ１の傾向と非常に類似しており、ｍＡｂ２の方が、プロテインＡ溶出中にわずかに強い結合を示し、ＣＥＸ溶出中に弱い結合を示す。ＣＥＸプロセスでは、ｍＡｂ２の方が、低い塩で低い結合を有するため、塩範囲全体にわたって堅牢なｌｏｇ αを有する。
［実施例３］：異なる樹脂のためのある範囲の条件でのＰＬＢＬ２およびＬＰＬＡ２のＫＰ値のマッピング
下流処理で使用される可能性がある緩衝液および条件が異なる多種多様な樹脂について、ＰＬＢＬ２およびＬＰＬＡ２の分配係数を決定するために広範囲なマッピングを行った（表３）。塩条件およびｐＨ条件を組み合わせて試験した。ＰＬＢＬ２およびＬＰＬＡ２のＫＰの包括的マッピングは、既知のｍＡｂ精製条件または調査される条件でのＰＬＢＬ２またはＬＰＬＡ２の分離を予測するための基礎を提供することができる。
Figure 2023500775000008
３．１ ＡＥＸクロマトグラフィー
ＡＥＸクロマトグラフィーのための一連の条件を表３に列挙し、ＰＬＢＬ２については図１Ａ～図１Ｃに、ＰＯＲＯＳ ５０ ＨＱ樹脂を用いたＬＰＬＡ２については図１Ｄ～図１Ｆに示す。第１の緩衝液の組合せは、プロテインＡ工程および低ｐＨ保持工程に続くフロースルーモードのＡＥＸローディング工程では一般的に見られ得る範囲の緩衝液の混合物を表す（図１Ａおよび図１Ｄ）。これらの条件下で、アセテートは対イオンとして作用して結合について競合し、Ｔｒｉｓ塩基を適切な量で加えてｐＨを制御した。ＰＬＢＬ２は、＞１００ｍＭのアセテートを加えても強い相互作用を示し、約１４０ｍＭのアセテートでは約１のｌｏｇ ＫＰが観察され、ｌｏｇ ＫＰは、さらに高いアセテート濃度では低下し続けると推定される（図１Ａ）。ｐＨ７．０～７．５の範囲にわたって差はほとんど観察されなかった（図１Ａ）。ＬＰＬＡ２は、アセテートと同様の傾向を示したが、さらに高いｐＨでは、さらに強い結合が見られ、ｐＨに対するさらに強い依存性も示した（図１Ｄ）。
他の２つのＡＥＸ条件は、ＡＥＸ平衡化工程および洗浄工程に使用され得る緩衝液（Ｔｒｉｓおよびホスフェート）を表す。ＮａＣｌ塩調節の使用は、事前の塩溶出（例えば、ＣＥＸから）後のＡＥＸプロセスのための可能な条件を提供する。Ｔｒｉｓ緩衝液（図１Ｂおよび図１Ｅ）では、ＰＬＢＬ２は約５０ｍＭのＮａＣｌを加えるまで強く結合したままであり（ｌｏｇ ＫＰ＞１．５）、ｌｏｇ ＫＰは、約１００ｍＭのＮａＣｌを超えて１未満に低下する。ＬＰＬＡ２は同様に挙動するが、最大約３０ｍＭのＮａＣｌまでｌｏｇ ＫＰ＞１．５、および、約７５ｍＭ超のＮａＣｌではｌｏｇ ＫＰ＜１であり、あまり強く保持されない。ホスフェート緩衝液（図１Ｃおよび図１Ｆ）は、Ｔｒｉｓよりも強力にＰＬＢＬ２およびＬＰＬＡ２の相互作用を妨げ；いずれのリパーゼを用いてスクリーニングした条件もｌｏｇ ＫＰ＞１．５をもたらさず、ｌｏｇ ＫＰは、いずれの場合も約４０ｍＭのＮａＣｌで１未満に低下した。ｐＨは、試験した範囲にわたっていずれの緩衝液にもほとんど影響を及ぼさなかった。
３．２ ＣＥＸクロマトグラフィー
ＣＥＸクロマトグラフィーのための一連の条件を表３に列挙し、ＰＯＲＯＳ ５０ ＨＳ樹脂については図２Ａ～図２Ｃに示す。
第１の組合せは、溶出のためにＮａＣｌ調節を使用する、ｍＡｂの結合および溶出に典型的に使用され得るｐＨおよび塩範囲を表す（図２Ａおよび図２Ｃ）。この場合、ＮａＣｌは強い効果を有し、２５０ｍＭを超えるＮａＣｌでは結合は見られず、ＰＬＢＬ２では約１５０ｍＭのＮａＣｌでｌｏｇ ＫＰ値は１であった（図２Ａ）。ｐＨはまた、比較的低いｐＨ、特にｐＨ５．０に近いｐＨでｌｏｇ ＫＰの増加に顕著な影響を及ぼした。ＬＰＬＡ２は、ｐＨおよび塩調節について同様の傾向を示したが、顕著に比較的強い保持を有し、２００～２５０ｍＭのＮａＣｌではｌｏｇ ＫＰ値は１であった（図２Ｃ）。
第２の組合せは、典型的にははるかに低い塩条件で、ｐＨを使用して結合を調節する条件を表す（図２Ｂ）。この場合、１．５のｌｏｇ ＫＰを超える強いＰＬＢＬ２結合は、ｐＨ５．５未満でのみ見られ、ｌｏｇ ＫＰ値は、約ｐＨ５．８を超えると１未満に低下した。ここで試験した塩条件は、これらのｐＨ値では分配にほとんど影響を及ぼさなかった。アセテート緩衝液をｐＨ６．０まで使用し、ホスフェート緩衝液を使用してさらに高いｐＨ条件を緩衝した。
３．３ ＨＩＣ
２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）の緩衝条件で硫酸ナトリウム濃度を調節することによって、ＨＩＣ樹脂、Ｔｏｓｏｈ Ｂｕｔｙｌ－６５０ＭへのＰＬＢＬ２およびＬＰＬＡ２の分配試験を行った（表３、図３）。両リパーゼは、高塩では強い結合を有する典型的なＨＩＣ挙動を示し（ｌｏｇ ＫＰ＞１．５、ＰＬＢＬ２については２５０ｍＭを超える硫酸ナトリウム、およびＬＰＬＡ２については４００ｍＭ硫酸ナトリウム）、低塩では分配を減少させた（ｌｏｇ ＫＰ＜１、ＰＬＢＬ２については１５０ｍＭ未満の硫酸ナトリウム、およびＬＰＬＡ２については２００ｍＭ硫酸ナトリウム）。
３．４ マルチモーダルクロマトグラフィー
また、２つのマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂、すなわち、マルチモーダルＡＥＸ樹脂、Ｃａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅ、およびマルチモーダルＣＥＸ樹脂、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣを用いて、ＰＬＢＬ２の分配を試験した（表３、図４Ａおよび図４Ｂ）。Ｃａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅでは、ｌｏｇ ＫＰ値は、試験したいずれの条件でも１．９よりも大きく、広範囲の操作条件にわたって強い結合を示した（図４Ａ）。Ｃａｐｔｏ ＭＭＣでは、結合は、はるかに広い塩範囲にわたるｐＨ変化によって主に調節された（図４Ｂ）。１．５を超えるｌｏｇ ＫＰを有する強い結合範囲が、約ｐＨ５．８未満で観察された。１未満のｌｏｇ ＫＰを有するそれよりも弱い結合範囲が、高塩添加によって約５．９のｐＨを超えた場合にのみ観察された。
［実施例４］：ＩｇＧ１ ｍＡｂ、ｍＡｂ３からＰＬＢＬ２を分離するための条件の最適化
実施例３のＰＬＢＬ２について提供された分配マップを使用して、ＩｇＧ１ ｍＡｂ、ｍＡｂ３からのＰＬＢＬ２の分離を最適化した。ｍＡｂ３の性能は、プロテインＡプロセスに対するｍＡｂ１の性能と同様であった。プロテインＡローディング条件下では、ｍＡｂ３の強い結合が観察された（データは示さず）。
４．１ ＡＥＸクロマトグラフィー
使用したカラムは、ＰＯＲＯＳ ＨＱ樹脂では、ベッド高さ２０ｃｍで約７ｍＬの体積であった。ｍＡｂ３供給物は、約１１０ｍＭのアセテート対イオンを有する、ｐＨ７．５のＴｒｉｓおよびアセテート混合物中で１３．５ｍｇ／ｍＬの濃度であった。この条件でのｍＡｂ３ ｌｏｇ ＫＰは０に近いのに対して、ＰＬＢＬ２ ｌｏｇ ＫＰは約１．４であり（図１Ａ）、ｍＡｂ３は樹脂に結合しないが、ＰＬＢＬ２はある程度樹脂に結合することを示している。プロセスをフロースルーモードで実行し、クロマトグラムは、カラムに結合したｍＡｂ３がほとんどないことを示す（図５）。濃度を較正するために使用される既知のＰＬＢＬ２ペプチドを用いて、ＱＥ ＨＦ－Ｘシステムを用いて質量分析法を使用して、異なる画分中のＰＬＢＬ２を定量した。供給物中のＰＬＢＬ２の濃度は７７ｐｐｍであった。フロースルー中のＰＬＢＬ２の濃度は９ｐｐｍであった。ストリップ中のＰＬＢＬ２の濃度は３８４１ｐｐｍであった。検出された量は、８５％を超えるＰＬＢＬ２が、フロースループール中のｍＡｂ３から除去されたことを示している。ストリッププール中のＰＬＢＬ２の量が多いことは、ｌｏｇ ＫＰ値１．４によって予測されるように、リパーゼが、フロースルー条件下で樹脂に結合し、ｌｏｇ ＫＰ値０によっても予測される１Ｍ ＮａＣｌ高塩ストリップ条件下で溶出したことを示す。
したがって、プロテインＡおよびＡＥＸは、一般的な操作条件でＰＬＢＬ２を除去する有望な工程であり、ｌｏｇ α値は、プロテインＡローディング中に－２であり、フロースルーモードでＡＥＸローディング中に約１．５である。同様のα値が、ＰｒｏＡについてはＬＰＬＡ２によって達成することができ、フロースルーモードでのＡＥＸローディングについては約１．７までのさらに良好な分離を達成することができる。
ｍＡｂ３については、プロテインＡプロセスおよびＡＥＸプロセスを超える追加のクリアランスも所望されたため、実施例３のＰＬＢＬ２およびＬＰＬＡ２に使用したものと同様の条件でｌｏｇ ＫＰマップを作成した。次いで、これらのｌｏｇ ＫＰ値を使用して、スクリーニングした範囲にわたってｌｏｇ αを計算して、最大分離条件を同定した。
４．２ ＣＥＸクロマトグラフィー
ＰＯＲＯＳ ５０ ＨＳ樹脂を用いたＣＥＸクロマトグラフィーを使用した分離条件を、表３に列挙した条件でＰＬＢＬ２については図６Ａおよび図６Ｂに、ＬＰＬＡ２については図６Ｃにｌｏｇ α値として示す。塩との結合を調節するためには、ＰＬＢＬ２の最良の分離条件は、ｐＨ５～５．２、および２００～２２５ｍＭのＮａＣｌであり、ここで、ｌｏｇ α値は約０．４であった（図６Ａ、黒色の枠）。ｌｏｇ αが正であるため、ｍＡｂ３はＰＬＢＬ２よりも弱く結合し、このことは、これらの条件下では、ｍＡｂ３が樹脂から溶出するのに対して、ＰＬＢＬ２は結合したままであり得ることを示している。最適化された面積は、幾分狭いｐＨおよび塩範囲を表し、特に高いｌｏｇ αを有しない。このプロセスでは、従来のカラムクロマトグラフィーを使用した確認を依然として行う必要がある可能性が高い。
これらのＣＥＸ条件に対するＬＰＬＡ２およびｍＡｂ３の分離は、図６Ｃに示すようにはるかに大きい。最適化された範囲はＰＬＢＬ２と同様であるが、ＬＰＬＡ２およびｍＡｂ３のα値は、２００～２５０ｍＭのＮａＣｌおよび５．０～５．３のｐＨの条件では１よりも大きい。
塩調節とは対照的に、ｐＨによる結合の変化は、約－０．６の負のｌｏｇ α値をもたらした（図６Ｂ、黒色の枠）。約ｐＨ６．０～６．６および２０ｍＭ未満のＮａＣｌを包含する領域は、ｍＡｂ３がＰＬＢＬ２よりも強く樹脂に結合する条件を表す。したがって、これらの条件は、比較的高いｐＨ（および／または比較的高い塩）でｍＡｂ３を溶出する前にＰＬＢＬ２を除去することができる中間洗浄として使用され得る。
追加のＣＥＸプロセスが、実施例４．１で指定されたローディング操作条件下でフロースルーモードで操作されたＡＥＸプロセス後にｍＡｂ３からＰＬＢＬ２およびＬＰＬＡ２をさらに分離することができるかどうかを評価するために、ｐＨ５．１および１６５ｍＭ ＮａＣｌでの溶出条件で結合溶出モードで操作される、ＰＯＲＯＳ ＨＳ樹脂を含むＣＥＸカラムに、ＡＥＸフロースループールをロードした。この溶出操作条件下でのｌｏｇ αは、ＰＬＢＬ２（図６Ａ）については０．２であり、ＬＰＬＡ２（図６Ｃ）については０．９である。これらのｌｏｇ α値は、約２００ｍＭ ＮａＣｌの最適範囲の値よりも小さいが、正の値は、特にＬＰＬＡ２について、この溶出条件下でリパーゼが樹脂に比較的強く結合することを依然として示している。質量分析により、ＣＥＸ供給物中のＰＬＢＬ２は５ｐｐｍであったが、ＣＥＸ溶出プール中のＰＬＢＬ２は０．３ｐｐｍに低下したことが示された。溶出プール中のＬＰＬＡ２は、検出限界未満であった（データは示さず）。これらの結果は、ＡＥＸプロセスがフロースルーモードで実行された後、指定された溶出操作条件下で追加のＣＥＸプロセスがｍＡｂ３からＰＬＢＬ２をさらに分離することができることを実証している。
４．３ ＨＩＣ
表３に列挙した条件で、ＨＩＣ樹脂、Ｔｏｓｏｈ Ｂｕｔｙｌ－６５０Ｍ（図７）を用いて、ｍＡｂ３およびリパーゼの分配も比較した。硫酸ナトリウム濃度を変化させても、ｍＡｂ３とＰＬＢＬ２との間の分離はほとんどもたらされず、この条件では、３００ｍＭの硫酸ナトリウムのみが約０．３のｌｏｇ αで何らかの分離をもたらす。ＬＰＬＡ２は、３００～４００ｍＭの硫酸ナトリウムで約０．５のｌｏｇ αで幾分良好な分離をもたらす。対照的に、ｍＡｂ２は、ｍＡｂ３、ＰＬＢＬ２またはＬＰＬＡ２よりもはるかに疎水性が低く、したがって、硫酸ナトリウムが６００ｍＭを超えるまで、１．５のｌｏｇ ＫＰを超えるＨＩＣ樹脂への強い結合に移行しない。ｍＡｂ２およびＰＬＢＬ２の場合、１．５～２．０のｌｏｇ α値が３００～５００ｍＭの硫酸ナトリウムで達成され得、これは、その中で操作するための有望な分離能力を有する非常に広い塩範囲である。ＬＰＬＡ２についても同様に、この同じ塩範囲では、１よりも大きいｌｏｇ α値が見られる。
４．４ マルチモーダルクロマトグラフィー
表３に列挙した条件で、異なるマルチモーダル樹脂、マルチモーダルＡＥＸ樹脂、Ｃａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅ（図８Ａ）およびマルチモーダルＣＥＸ樹脂、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ（図８Ｂ）について、ｍＡｂ３およびＰＬＢＬ２の分配を最終的に比較した。
Ｃａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅでは、ＰＬＢＬ２はいずれの条件でも強く結合したのに対して（図４Ａ）、ｍＡｂ３は、さらに高い塩でさらに強い分配を伴う疎水性相互作用を示した。得られたｌｏｇ αプロットは、ｍＡｂ３結合が最も低かった低塩でのｐＨ７．３～７．６の条件下で最も高い分離係数（ｌｏｇ α＞０．８）を示す（図８Ａ）。これらの条件は、Ｃａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅ樹脂へのＰＬＢＬ２の結合を維持しながら、ｍＡｂ３溶出またはフロースルーに利用することができる。
Ｃａｐｔｏ ＭＭＣは、スクリーニングされた条件では、Ｃａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅと同じレベルのｍＡｂ３およびＰＬＢＬ２の分離をもたらさない。最良の条件は、ｐＨ５．９～６．０および３００ｍＭ超のＮａＣｌで見られ、０．３までのｌｏｇ α値が観察された。ｌｏｇ αが０よりも大きいため、これらの条件は、ＰＬＢＬ２結合を維持しながらｍＡｂ３溶出に使用され得る（図８Ｂ）。このスクリーニングでは両因子の上限で最適範囲が見られたため、さらに高いｐＨおよび／またはさらに高い塩で、さらに広いまたはさらに好ましい一連の分離条件が可能であり得る。
［実施例５］：モノクローナル抗体ｍＡｂ４（ＭＫ－１３０８、抗ＣＴＬＡ４抗体）のためのＣＥＸ操作条件の最適化
表４に示すように、実験のＣＥＸ設計（ＤｏＥ）では５つの因子を試験した。可変量の酢酸ナトリウム三水和物、４Ｍ酢酸および塩化ナトリウムを使用して、溶出緩衝液のｐＨおよび導電率を調整した。１Ｍ Ｔｒｉｓ、１Ｍ酢酸および１Ｍ塩化ナトリウムを使用して、ロードｐＨおよび導電率を調整した。
Figure 2023500775000009
表５に示すように、ＤｏＥ設計は合計４０回の実行に達した。各溶出緩衝液を２回調製し、中央点溶出緩衝液を３回調製した。
Figure 2023500775000010
７ｍＬクロマトグラフィーカラムを用いて、表６の工程に従って、各実行を操作した。収率および品質分析のために、各実行の溶出プールおよびストリップを収集した。
Figure 2023500775000011
各実行の溶出プールおよびストリップを、残存ＨＣＰ ＥＬＩＳＡ分析に供した。溶出緩衝液のｐＨおよび導電率は、残存ＨＣＰ ＥＬＩＳＡの結果に対して最大の効果を有することが分かった（図９）。
そのため、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）によって、溶出緩衝液条件に基づく特定の実行をさらに分析した（表７を参照）。材料の制限により、同じ溶出緩衝液条件でのいくつかの実行のプールおよびストリップを組み合わせた（例えば、以下の１０および１３）。
Figure 2023500775000012
ＬＣ－ＭＳの結果は、既知のペプチド配列のデータベース検索に基づいて試験した全試料のＣＥＸプールにリパーゼが存在しないことを示した。５００ａｍｏｌｅ～５０ｐｍｏｌｅの範囲の４８の異なるヒトタンパク質（６ｋＤａ～８３ｋＤａ）をスパイクインすることによって、１ｍｇ ＤＳ中のＬＣ－ＭＳの検出限界を評価した。少なくとも２つの固有のペプチドが、０．６ｐｐｍ程度の低いスパイクインタンパク質として同定された（データは示さず）。
各ＣＥＸストリップ試料では、ホスホリパーゼＢ様２（ＰＬＢＬ２）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、ホスホリパーゼＡ２ ＸＶ（ＬＰＬＡ２）、ホスホリパーゼＡ２ ＶＩＩ（ＬＰ－ＰＬＡ２）およびリソソーム酸リパーゼＡ（ＬＡＬ／ＬＩＰＡ）を含む５つのリパーゼを同定し、相対定量した（表８を参照）。これらの結果は、試験した溶出緩衝液範囲では、リパーゼがＣＥＸ樹脂に強く結合することを示唆している（ｐＨ４．９～５．４、導電率１５～２１ｍＳ／ｃｍ、これは１３５～１９５ｍＭの塩化ナトリウム濃度に相当する）。
Figure 2023500775000013
溶出緩衝液設計空間におけるＰＳ－８０安定性の改善を確認するために、ＰＳ－８０安定性試験を行った。安定性試験に十分なｍＡｂ質量を有するために、表５の異なる実行から得られたＣＥＸＰ（ただし、同じ溶出緩衝液条件）を等しいｍＡｂ質量比（１：１）によって組み合わせ、製剤化した。それぞれ２４週間および１６週間にわたる５±３℃および２５±３℃での組合せＣＥＸＰ実行で、ＰＳ－８０安定性試験を行った（図１３）。この試験では、試験した全ＣＥＸＰ試料について試験期間中に安定なＰＳ－８０が示されたが（＜２０％のＰＳ－８０分解）、陽性対照であるＡＥＸＰは、２５±３℃で１６週間後に約３０％分解した。ＣＥＸ溶出緩衝液ｐＨ５．１±０．２および導電率１８±２ｍＳ／ｃｍの操作空間は、ＣＥＸＰ、ひいてはＤＳ中のＰＳ－８０安定性を改善するために明らかに堅牢である。
［実施例６］：宿主細胞リパーゼが除去されるにつれてＰＳ－８０安定性が増加した
ＰＳ８０を含有する溶液のＰＳ－８０濃度を特定の温度で特定の時間にわたって測定することによって、ＰＳ－８０安定性を評価した。ＰＳ－８０濃度の顕著な変化は、時間０の結果と比較して、±０．０２ｍｇ／ｍＬのＰＳ－８０濃度範囲外（すなわち、アッセイ変動性）の２つの連続した結果として定義される。
ｍＡｂ４医薬物質（ＤＳ）は、製剤化工程によって作製されたＰＳ－８０含有溶液であり、ＰＳ－８０含有溶液は、１０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ５．５）、１０ｍＭメチオニン、７％（ｗ／ｖ）スクロースおよび０．０２％（ｗ／ｖ）ＰＳ－８０中５０ｍｇ／ｍＬ ｍＡｂ４の最終ＤＳ濃度を達成するために、４９％（ｗ／ｗ）スクロースおよび８５ｍＭメチオニン原液ならびに１０％（ｗ／ｗ）ＰＳ－８０原液を別個に加えることを必要とする。
ＰＳ－８０安定性を、２カラムおよび３カラム精製スキームから生成した２つのｍＡｂ４ ＤＳ試料の間で比較した。２カラム精製スキームには、プロテインＡおよびＡＥＸを含めた。得られたＡＥＸプール（ＡＥＸＰ）をＤＳに製剤化し、「ＡＥＸＰ ＤＳ」と呼ぶ。３カラム精製スキームには、プロテインＡ、ＡＥＸおよびＣＥＸを含めた。得られたＣＥＸプール（ＣＥＸＰ）をＤＳに製剤化し、「ＣＥＸＰ ＤＳ」と呼ぶ。さらに、タンパク質を含まない同じＤＳ製剤を含有するプラセボを、試験全体を通して陰性対照として使用した。
プラセボ、ＡＥＸＰ ＤＳおよびＣＥＸＰ ＤＳを別個のガラスバイアルに２．２ｍｌ充填容量で充填し、ゴム栓を用いて蓋をして、医薬品の貯蔵を模倣した。バイアルを以下の安定チャンバに入れた：
・５℃±３℃
・２５℃±３℃、６０％±５％相対湿度（ＲＨ）
・４０℃±２℃、７５％±５％相対湿度（ＲＨ）
試料を取り出し、１２週間および６ヶ月（２６週間）まで２週間間隔でＰＳ－８０濃度について試験した。
図１０Ａに示すように、ＡＥＸＰ ＤＳ中のＰＳ－８０濃度は、５℃で０．２１（０週）から０．１８ｍｇ／ｍＬ（１２週）まで低下した。ＰＳ－８０の分解は、貯蔵温度が高くなるにつれて増加した。例えば、２５℃では、ＡＥＸＰ ＤＳ中のＰＳ－８０濃度は、０．２１（０週間）から０．１８ｍｇ／ｍＬ（４週間）および０．１５ｍｇ／ｍＬ（２６週間）まで低下した（図１０Ｂ）；４０℃では、ＡＥＸＰ ＤＳ中のＰＳ－８０濃度は、０．２１（０週間）から０．１７ｍｇ／ｍＬ（２週間）および０．０９ｍｇ／ｍＬ（２６週間）まで低下した（図１０Ｃ）。一方、ＣＥＸＰ ＤＳ中のＰＳ－８０濃度は、３つの異なる温度いずれの下でも経時的に顕著に変化せず、これはプラセボとほぼ同等である。
このＰＳ－８０安定性試験と並行して、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）によるリパーゼ同定について、対応するクロマトグラフィーストリップ試料とともに、同じバッチのインプロセス中間体を試験した（表９）。ＰＬＢＬ２およびＬＰＬは、ＡＥＸＰ中に見出されたが、ＣＥＸＰには存在しなかった。ＰＬＢＬ２およびＬＰＬの両方がＡＥＸストリップおよびＣＥＸストリップに存在し、樹脂へのリパーゼの強い結合が示唆された。したがって、ＡＥＸＰ中のＰＬＢＬ２およびＬＰＬの存在は、ＡＥＸＰ ＤＳ中の５～４０℃でのＰＳ－８０濃度低下の１つの潜在的原因であり得ると仮定される。第３のＣＥＸカラムを加えることにより、これらのリパーゼを効果的に除去し、ＣＥＸＰ ＤＳ中のＰＳ－８０安定性を改善することができる。
Figure 2023500775000014
２つのクロマトグラフィー工程（プロテインＡおよびＡＥＸ）のみを利用する４つのｍＡｂ４精製バッチから得られたＤＳを、－４０℃、５℃および２５℃で最大６ヶ月間にわたる安定性試験に供した（図１１Ａ）。２５℃での平均ＰＳ８０分解は、わずか１ヶ月後に約２０％であり、６ヶ月後に約４５％であった。３つのクロマトグラフィー工程（プロテインＡ、ＡＥＸおよびＣＥＸ）を利用する３つのｍＡｂ４精製バッチから得られたＤＳを、－４０℃、５℃および２５℃で最大６ヶ月間にわたる安定性試験に供した（図１１Ｂ）。２５℃での平均ＰＳ８０分解は、６ヶ月後に１０％を超えなかった。これらの結果は、ＣＥＸが、不純物（リパーゼなど）を除去し、ＰＳ－８０安定性を改善するという主張をさらに裏付ける。
ＡＥＸ工程がプロセス全体で省略され得るかどうかを決定するために、プロテインＡ工程後の材料、具体的には、濾過中和ウイルス不活化プール（ＦＮＶＩＰ）をＣＥＸカラムにロードした。得られたＣＥＸプールをＤＳに製剤化し、「ＦＮＶＩＰ－ＣＥＸＰ ＤＳ」と命名した。さらに、ＣＥＸストリップ中で同定されたリパーゼの１つであるＬＰＬＡ２を、陽性リパーゼ対照として５ｐｐｍおよび５０ｐｐｍの２つの濃度でＤＳにスパイクした。これらのＤＳ試料を、プロテインＡプール（ＰＡＰ）、ＦＮＶＩＰ、ＡＥＸＰ、プラセボ（ＤＳを含まない同じ製剤）および３カラム精製プロセス（プロテインＡ、ＡＥＸおよびＣＥＸ）から得られたＤＳとともに、５℃および４０℃での安定性試験に供した（図１２）。４０℃で１２週間後、ＰＡＰ ＤＳ、ＦＮＶＩＰ ＤＳおよび両ＬＰＬＡ２スパイクＤＳ試料には５０％を超えるＰＳ８０分解が認められたが、プラセボＤＳおよび標準的な３カラムプロセスＤＳは１０％以下のＰＳ８０分解のままであった。これらの結果は、ＬＰＬＡ２などのリパーゼが、ＰＳ８０分解を引き起こし、精製プロセスのＰＡＰおよびＦＮＶＩＰではさらに濃縮されることを示している。ＡＥＸＰ ＤＳおよびＦＮＶＩＰ－ＣＥＸＰ ＤＳ ＰＳ８０は４０℃で１２週間後に約３０～４０％分解し、ｍＡｂ４ ＤＳから残存リパーゼを完全に除去するには、３カラム精製プロセス（プロテインＡ、ＡＥＸおよびＣＥＸ）が必要であることが示唆された。
リパーゼがＣＥＸによって除去されることをさらに検証するために、５００Ｌ ＨＣＣＦバッチ（１９Ｋ－１３０８－１９００２）および２０００Ｌ ＨＣＣＦバッチ（Ｗ１８－ＭＫ１３０８－０１０）から得られたプロセス中間体試料を液体クロマトグラフィー多重反応モニタリング（ＬＣ－ＭＲＭ）に供した。ＬＣ－ＭＲＭを行って、３つのリパーゼ、すなわち、ホスホリパーゼＢ様２（ＰＬＢＬ２）、ホスホリパーゼＡ２ ＸＶ（ＬＰＬＡ２）およびリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）を定量した。以下の表７の分析の結果を参照されたい。
Figure 2023500775000015
［実施例７］：リパーゼスパイク試験－ＭＫ－１３０８、抗ＣＴＬＡ４抗体を使用したＰＬＢＬ２、ＬＰＬおよび塩基性変異体のクリアランス
この例示的な目的は、プロセス関連不純物および生成物関連不純物を除去する個々のユニット操作の能力を理解することであった。それぞれの工程についてＡＥＸ濃縮ストリップおよびＣＥＸ濃縮ストリップを用いて供給物をスパイクすることによって、ＰＬＢＬ２およびＬＰＬのクリアランスを評価した。多重反応モニタリング質量分析（ＭＲＭ－ＭＳ）リパーゼアッセイを使用して、リパーゼレベルを決定した。
アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）では、ＰＯＲＯＳ ＨＱ５０樹脂を利用する。樹脂１Ｌ当たり２００ｇの生成物の標的に、抗ＣＴＬＡ４抗体をロードする。抗体はカラムを通って流れるが、宿主細胞タンパク質、ＨＭＷおよびＤＮＡなどの不純物はカラムに結合する。ＡＥＸストリップの一部を、体積比１：１の２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．１を使用して希釈し、３０ｋＤａの再生セルロース限外濾過膜を使用して濃縮し、透析濾過し、１Ｍ ｔｒｉｓ塩基を使用してｐＨを７．５の標的ｐＨに調整した。濃縮および透析したＡＥＸストリップをＡＥＸＬにスパイクして、ＡＥＸ工程にわたるｒＨＣＰ、リパーゼおよびＨＭＷのクリアランスを評価した。ＡＥＸ工程にわたるｒＤＮＡクリアランスを評価するために、ＣＨＯ ＤＮＡ濃縮物をＡＥＸＬにスパイクした。
カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）では、ＰＯＲＯＳ ＨＳ５０樹脂を利用する。樹脂１Ｌ当たり４０ｇの生成物の標的に、抗ＣＴＬＡ４抗体をロードする。ＨＣＰ、ＨＭＷおよびｒＰｒｏＡリガンドなどの不純物は、溶出緩衝液中の塩化ナトリウム濃度によって分離される。ＣＥＸストリップの一部を、体積比１：１の２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．１を使用して希釈し、３０ｋＤａの再生セルロース限外濾過膜を使用して濃縮し、透析濾過した。ＣＥＸ工程にわたるｒＨＣＰ、リパーゼ、塩基性変異体およびＨＭＷのクリアランスを評価するために、濃縮および透析したＣＥＸストリップをＣＥＸＬにスパイクした。
ＣＥＸ工程にわたるｒＰｒｏＡリガンドクリアランスを評価するために、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ ＳｕｒｅプロテインＡリガンドをＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入し、ＤＩ水中で０．２ｇ／Ｌに希釈し、ＣＥＸＬにスパイクした。試験したｒＰｒｏＡリガンドレベル（最大７９ｐｐｍ）はいずれも、ＣＥＸＰではＬＯＱ未満（０．３ｍｇ／ｍｌ）をもたらした。
ＡＥＸをさらに低い供給物ｐＨおよびさらに高い供給物導電率で実行し、一方、ＣＥＸを中央点条件で実行した。ＡＥＸの中央点条件は、ロード：ｐＨ７．５、≦５ｍＳ／ｃｍ、２００ｇ／Ｌ、洗浄：２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５である。ＣＥＸの中央点条件は、ロード：ｐＨ５．１、≦６ｍＳ／ｃｍ、４０ｇ／Ｌ、洗浄：２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．１、および溶出：２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．１、１６５ｍＭ ＮａＣｌを加えることによって達成される１８ｍＳ／ｃｍである。
各スパイクレベルに対する供給物および生成物のＰＬＢＬ２の結果を図１４～図１５に示す。ＣＥＸにわたるほぼあらゆるスパイクレベルについて、ＰＬＢＬ２は、１．０ｐｐｍの定量限界（ＬＯＱ）未満でクリアされた（図１５）。ＣＥＸの最大ＰＬＢＬ２容量は約６２ｐｐｍであった（図１５）。ＡＥＸでは、ＡＥＸＰ中のＰＬＢＬ２レベルは、ＡＥＸＬ中のＰＬＢＬ２スパイクレベルが増加するにつれて指数関数的に増加した（図１４）。ＡＥＸの最大ＰＬＢＬ２容量は約３５０～４００ｐｐｍであった（図１４）。
各スパイクレベルに対する供給物および生成物のＬＰＬの結果を図１６～図１７に示す。ＣＥＸにわたるあらゆるスパイクレベルについて、両ＬＰＬは、１．０ｐｐｍのＬＯＱ未満でクリアされた（図１７）。ＣＥＸの最大ＬＰＬ容量は約９４．６ｐｐｍであった（図１７）。ＡＥＸでは、ＡＥＸＰ中のＬＰＬレベルは、ＡＥＸＬ中のＬＰＬスパイクレベルが増加するにつれて指数関数的に増加した（図１６）。ＡＥＸの最大ＬＰＬ容量は約３００～３５０ｐｐｍであった（図１６）。
様々なレベルのＣＥＸ濃縮ストリップによって供給物をスパイクし、ＨＰ－ＩＥＸを使用して、得られた塩基性変異体レベルを測定することによって、中央点条件でＣＥＸにわたって塩基性変異体のクリアランスを試験した。各スパイクレベルに対する供給物および生成物の塩基性変異体の結果を図１８に示す。塩基性変異体レベルは、最初の２つの不純物スパイクレベルについてＣＥＸＰでは一定のままであり（図１８）、これは、約６．４％の最大ＨＭＷレベルに相当した（図１９）。塩基性変異体は、ＣＥＸＰでは、第３および第４のスパイクレベルで線形に増加した（図１８）。ＣＥＸでは塩基性変異体の最大容量は３０．９％であるが（図１８）、ＣＥＸＰ中のＨＭＷレベルは５．０％であり（図１３）、これは、約２％という予測される市販のＤＳ仕様を満たさない。したがって、ＣＥＸの塩基性変異体の最大容量は２１．５％であった（図１８）。
本明細書に引用されるすべての参考文献は、あたかも各個々の刊行物、データベースエントリ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ配列またはＧｅｎｅＩＤエントリ）、特許出願または特許が具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示されているのと同程度に、参照により組み込まれる。参照による組込みのこの陳述は、個々のあらゆる刊行物、データベースエントリ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ配列またはＧｅｎｅＩＤエントリ）、特許出願、または特許に関する３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５７（ｂ）（１）に従うことが出願人によって意図されており、これらはそれぞれ、そのような引用が、参照による組込みに関する特別の陳述にすぐに隣接していないとしても、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５７（ｂ）（２）に従って明らかに認識される。参照による組込みに関する特別の陳述の包含は、あったとしても、参照による組込みのこの大まかな陳述をいかなる形であれ弱めない。本明細書における参考文献の引用は、その参考文献が適切な先行技術であることの承認として意図されておらず、これらの刊行物または文献の内容または日付に関するいかなる承認も構成しない。
Figure 2023500775000016

Claims (42)

  1. （ｉ）約１０ｍｇ／ｍｌ～約２００ｍｇ／ｍｌの抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片、
    （ｉｉ）約５ｍＭ～約２０ｍＭの緩衝液、
    （ｉｉｉ）約６％～８％重量／体積（ｗ／ｖ）の非還元糖、
    （ｉｖ）約０．０１％～約０．１０％の非イオン性界面活性剤、および
    （ｖ）約１ｍＭ～約２０ｍＭの抗酸化剤
    （ｖｉ）ここで、ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２およびＬＰＬのレベルが、ＣＴＬＡ４抗体１ｍｌ当たり≦１ｎｇである、を含む組成物。
  2. （ｉ）約１０ｍｇ／ｍｌ～約２００ｍｇ／ｍｌの抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片、
    （ｖｉｉ）約５ｍＭ～約２０ｍＭの緩衝液、
    （ｖｉｉｉ）約６％～８％重量／体積（ｗ／ｖ）の非還元糖、
    （ｉｘ）約０．０１％～約０．１０％の非イオン性界面活性剤、および
    （ｘ）約１ｍＭ～約２０ｍＭの抗酸化剤、
    （ｘｉ）宿主細胞リパーゼの残存量であって、宿主細胞リパーゼの前記残存量が、２ｐｐｍ未満である、
    を含む、組成物。
  3. 抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体またはその抗原結合断片、宿主細胞リパーゼの残存量、および、ポリソルベート－８０を含む組成物であって、前記組成物が、安定なポリソルベート－８０濃度を含み、ここで、前記安定なＰＳ８０濃度が、１０％以下のＰＳ－８０分解のままである組成物。
  4. 前記リパーゼが、ホスホリパーゼＢ様２（ＰＬＢＬ２）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、リソソームホスホリパーゼＡ２（ＬＰＬＡ２）、ホスホリパーゼＡ２ ＶＩＩ（ＬＰ－ＰＬＡ２）およびリソソーム酸リパーゼＡ（ＬＡＬ）からなる群から選択される、請求項３に記載の組成物。
  5. ＰＬＢＬ２、ＬＰＬＡ２およびＬＰＬのレベルが≦１ｎｇ／ｍｇである、請求項４に記載の組成物。
  6. ＣＴＬＡ４抗体１ｍｇ当たり１ｎｇ未満のＰＬＢＬ２を含む、請求項３～５のいずれか一項に記載の組成物。
  7. ＣＴＬＡ４抗体１ｍｇ当たり１ｎｇ未満のＬＰＬＡ２を含む、請求項３～６のいずれか一項に記載の組成物。
  8. ＣＴＬＡ４抗体１ｍｇ当たり１ｎｇ未満のＬＰＬを含む、請求項３～７のいずれか一項に記載の組成物。
  9. ＣＴＬＡ４抗体１ｍｇ当たり１ｎｇ未満のＬＰ－ＰＬＡ２を含む、請求項３～８のいずれか一項に記載の組成物。
  10. ＣＴＬＡ４抗体１ｍｇ当たり１ｎｇ未満のＬＡＬを含む、請求項３～９のいずれか一項に記載の組成物。
  11. 前記ＰＳ－８０分解が、質量分析（ＭＳ）、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）、または帯電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を有するＨＰＬＣシステムを用いた固相抽出（ＳＰＥ）を含む様々な方法を使用して、インタクトなＰＳ－８０分子の量によって測定される、請求項３～１０のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 前記ＰＳ－８０分解が、質量分析（ＭＳ）、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）、または帯電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を有するＨＰＬＣシステムを用いた固相抽出（ＳＰＥ）を含む様々な方法を使用して、分解生成物の量によって測定される、請求項３～１１のいずれか一項に記載の組成物。
  13. 組成物が、（ｉ）約１０ｍｇ／ｍｌ～約２００ｍｇ／ｍｌの抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項３～１２のいずれか一項に記載の組成物。
  14. 組成物が、２５ｍｇ／ｍｌの抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項３～１３のいずれか一項に記載の組成物。
  15. 組成物が、５０ｍｇ／ｍｌの抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項３～１４のいずれか一項に記載の組成物。
  16. 組成物が、（ｉ）約１０ｍｇ／ｍｌ～約２００ｍｇ／ｍｌの抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片、（ｉｉ）約５ｍＭ～約２０ｍＭの緩衝液、（ｉｉｉ）約６％～８％重量／体積（ｗ／ｖ）の非還元糖、（ｉｖ）約０．０１％～約０．１０％のＰＳ－８０、および、（ｖ）約１ｍＭ～約２０ｍＭの抗酸化剤を含む、請求項３～１２のいずれか一項に記載の組成物。
  17. 前記ＰＳ－８０濃度が、時間０の結果と比較して±０．０２ｍｇ／ｍＬのままである、請求項３～１６のいずれか一項に記載の組成物。
  18. 前記ＰＳ－８０分解が、２５℃で少なくとも６ヶ月間にわたって１０％以下のままである、請求項３～１６のいずれか一項に記載の組成物。
  19. 前記緩衝液が、Ｌ－ヒスチジン緩衝液または酢酸ナトリウム緩衝液である、請求項１６に記載の組成物。
  20. 前記非還元糖がスクロースである、請求項１６に記載の組成物。
  21. 前記抗酸化剤が、メチオニンまたはその薬学的に許容される塩である、請求項１６に記載の組成物。
  22. 前記抗ＣＴＬＡ４抗体が、
    ｉ．配列番号１４、１５および１６に記載のアミノ酸の配列を含む軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１１、１２および１３に記載のアミノ酸の配列を含む重鎖ＣＤＲ、
    ｉｉ．配列番号１４、１５および１７に記載のアミノ酸の配列を含む軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１１、１２および１３に記載のアミノ酸の配列を含む重鎖ＣＤＲ、または
    ｉｉｉ．配列番号１４、１５および１８に記載のアミノ酸の配列を含む軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１１、１２および１３に記載のアミノ酸の配列を含む重鎖ＣＤＲ、を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の組成物。
  23. 前記抗ＣＴＬＡ４抗体が、重鎖可変領域
    ａ．配列番号１９に記載のアミノ酸の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号２０に記載のアミノ酸の配列を含む軽鎖可変領域、
    ｂ．配列番号２１に記載のアミノ酸の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号２２に記載のアミノ酸の配列を含む軽鎖可変領域、
    ｃ．配列番号２３に記載のアミノ酸の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号２４に記載のアミノ酸の配列を含む軽鎖可変領域、
    ｄ．配列番号２５に記載のアミノ酸の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号２４に記載のアミノ酸の配列を含む軽鎖可変領域、
    ｅ．配列番号２６に記載のアミノ酸の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号２７に記載のアミノ酸の配列を含む軽鎖可変領域、
    ｆ．配列番号２８に記載のアミノ酸の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号２９に記載のアミノ酸の配列を含む軽鎖可変領域、または
    ｇ．配列番号３０に記載のアミノ酸の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号３１に記載のアミノ酸の配列を含む軽鎖可変領域、を含む、請求項２２に記載の組成物。
  24. 組成物が、第１のプロテインＡクロマトグラフィー工程、第２のアニオン交換クロマトグラフィー工程および第３のカチオン交換工程を含むプロセスによって精製され、それによって、精製された組成物を生成する、請求項１～２３のいずれか一項に記載の組成物。
  25. 抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体またはその抗原結合断片、ホスホリパーゼＢ様２（ＰＬＢＬ２）の残存量、および、ポリソルベート－８０を含む組成物であって、ここで、前記組成物が、安定なポリソルベート－８０濃度を含み、ここで、前記安定なＰＳ８０濃度が１０％以下のＰＳ－８０分解のままである、組成物。
  26. 組成物が、１ｎｇ／ｍｇ未満のＰＬＢＬ２を含む、請求項２５に記載の組成物。
  27. 前記ＰＳ－８０分解が、質量分析（ＭＳ）、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）、または帯電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を有するＨＰＬＣシステムを用いた固相抽出（ＳＰＥ）を含む様々な方法を使用して、インタクトなＰＳ－８０分子の量によって測定される、請求項２５に記載の組成物。
  28. 前記ＰＳ－８０分解が、質量分析（ＭＳ）、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）、または帯電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を有するＨＰＬＣシステムを用いた固相抽出（ＳＰＥ）を含む様々な方法を使用して、分解生成物の量によって測定される、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の組成物。
  29. 組成物が、（ｉ）約１０ｍｇ／ｍｌ～約２００ｍｇ／ｍｌの抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項２５～２８のいずれか一項に記載の組成物。
  30. 組成物が、２５ｍｇ／ｍｌの抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項２５～２９のいずれか一項に記載の組成物。
  31. 組成物が、５０ｍｇ／ｍｌの抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項２６～２９のいずれか一項に記載の組成物。
  32. 組成物が、（ｉ）約１０ｍｇ／ｍｌ～約２００ｍｇ／ｍｌの抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片、（ｉｉ）約５ｍＭ～約２０ｍＭの緩衝液、（ｉｉｉ）約６％～８％重量／体積（ｗ／ｖ）の非還元糖、（ｉｖ）約０．０１％～約０．１０％のポリソルベート－８０、および、（ｖ）約１ｍＭ～約２０ｍＭの抗酸化剤を含み、ここで、ＰＬＢＬ２のレベルが≦１ｎｇ／ｍｇであり、そして、６ヶ月後の平均ポリソルベート－８０分解が１０％以下である、請求項２５～２９のいずれか一項に記載の組成物。
  33. 前記ポリソルベート－８０濃度が、時間０の結果と比較して±０．０２ｍｇ／ｍＬのままである、請求項２５～３２のいずれか一項に記載の組成物。
  34. ＰＳ－８０分解が、２５℃で少なくとも６ヶ月間にわたって１０％以下のままである、請求項２５～３３のいずれか一項に記載の組成物。
  35. 前記緩衝液が、Ｌ－ヒスチジン緩衝液または酢酸ナトリウム緩衝液である、請求項３２に記載の組成物。
  36. 前記非還元糖がスクロースである、請求項３２に記載の組成物。
  37. 前記抗酸化剤が、メチオニンまたはその薬学的に許容される塩である、請求項３２に記載の組成物。
  38. 前記抗ＣＴＬＡ４抗体が、
    ｉｖ．配列番号１４、１５および１６に記載のアミノ酸の配列を含む軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１１、１２および１３に記載のアミノ酸の配列を含む重鎖ＣＤＲ、
    ｖ．配列番号１４、１５および１７に記載のアミノ酸の配列を含む軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１１、１２および１３に記載のアミノ酸の配列を含む重鎖ＣＤＲ、または
    ｖｉ．配列番号１４、１５および１８に記載のアミノ酸の配列を含む軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号１１、１２および１３に記載のアミノ酸の配列を含む重鎖ＣＤＲ、を含む、請求項３２～３７のいずれか一項に記載の組成物。
  39. 前記抗ＣＴＬＡ４抗体が、
    ａ．配列番号１９に記載のアミノ酸の配列、および配列番号２０に記載のアミノ酸の配列を含む軽鎖可変領域、
    ｂ．配列番号２１に記載のアミノ酸の配列、および配列番号２２に記載のアミノ酸の配列を含む軽鎖可変領域、
    ｃ．配列番号２３に記載のアミノ酸の配列、および配列番号２４に記載のアミノ酸の配列を含む軽鎖可変領域、
    ｄ．配列番号２５に記載のアミノ酸の配列、および配列番号２４に記載のアミノ酸の配列を含む軽鎖可変領域、
    ｅ．配列番号２６に記載のアミノ酸の配列、および配列番号２７に記載のアミノ酸の配列を含む軽鎖可変領域、
    ｆ．配列番号２８に記載のアミノ酸の配列、および配列番号２９に記載のアミノ酸の配列を含む軽鎖可変領域、または
    ｇ．配列番号３０に記載のアミノ酸の配列、および配列番号３１に記載のアミノ酸の配列を含む軽鎖可変領域、を含む重鎖可変領域を含む、請求項３８に記載の組成物。
  40. 第１のプロテインＡクロマトグラフィー工程、第２のアニオン交換クロマトグラフィー工程および第３のカチオン交換工程を含むプロセスによって精製され、それによって、精製された組成物を生成する、請求項３２～３９のいずれか一項に記載の組成物。
  41. 精製された抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体組成物であって、ここで、前記組成物は、第１のプロテインＡクロマトグラフィー工程、第２のアニオン交換クロマトグラフィー工程および第３のカチオン交換工程を含むプロセスによって精製され、それによって、精製された組成物を生成し、ここで、ハムスターＰＬＢＬ２の量が１ｎｇ／ｍｇ未満であり、前記組成物が、安定なポリソルベート－８０濃度を含み、ここで、前記安定なＰＳ８０濃度が１０％以下のＰＳ－８０分解のままである、精製された抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体組成物。
  42. 組成物内のＰＳ－８０安定性を改善する方法であって、ここで、前記組成物は、プロテインＡ、アニオン交換およびカチオン交換からなる３つのクロマトグラフィー工程を含む精製プロセスによって精製され、ここで、前記組成物は、（ｉ）約１０ｍｇ／ｍｌ～約２００ｍｇ／ｍｌの抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片、（ｉｉ）約５ｍＭ～約２０ｍＭの緩衝液、（ｉｉｉ）約６％～８％重量／体積（ｗ／ｖ）の非還元糖、（ｉｖ）約０．０１％～約０．１０％の非イオン性界面活性剤、および、（ｖ）約１ｍＭ～約２０ｍＭの抗酸化剤を含み、ここで、ＰＬＢＬ２のレベルが抗ＣＴＬＡ４抗体１ｍｇ当たり≦１ｎｇである、方法。
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