JP2022548394A - クロマトグラフィーの使用および再生のためのシステムおよび方法 - Google Patents
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Abstract
本開示の態様は、負荷質量が適用されている疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムを再生する方法であって、約１０～約１４の間のｐＨ、および０．５ｍＳ／ｃｍ～約１０ｍＳ／ｃｍの間の伝導率を示すアルカリ溶液の１以上のカラム体積を、該カラム内の疎水性相互作用媒体に通過させることを含み、疎水性相互作用媒体に結合した物質が除去される、方法に関する。いくつかの場合、アルカリ溶液は、例えば約０．１ｍＭ～１０ｍＭの間の濃度の水酸化ナトリウムを含み得る。【選択図】図１２
Description
関連出願の相互参照
［００１］本出願は、２０１９年９月２４日出願の米国仮特許出願第６２／９０５，０３３号、および２０２０年１月９日出願の米国仮特許出願第６２／９５８，８９９号の利益を主張し、これらの文献はどちらも、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
［００１］本出願は、２０１９年９月２４日出願の米国仮特許出願第６２／９０５，０３３号、および２０２０年１月９日出願の米国仮特許出願第６２／９５８，８９９号の利益を主張し、これらの文献はどちらも、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
開示の分野
［００２］本開示は、クロマトグラフィー媒体（chromatography media）の使用および再生のためのシステム、方法、および溶液に関する。本開示のいくつかの態様は、一工程疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体再生溶液（a single-step hydrophobic interaction chromatography media regeneration solution）を組み込んだシステムおよび方法に関する。
［００２］本開示は、クロマトグラフィー媒体（chromatography media）の使用および再生のためのシステム、方法、および溶液に関する。本開示のいくつかの態様は、一工程疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体再生溶液（a single-step hydrophobic interaction chromatography media regeneration solution）を組み込んだシステムおよび方法に関する。
序論
［００３］クロマトグラフィーは、混合物の成分（components）を分離するために実行可能なプロセスの広く用いられるカテゴリーである。特定のタイプのクロマトグラフィーは、薬剤製品調製プロセス（例えば薬剤製品中で使用するための分子の分離、収集、単離、精製、ポリッシング等）において実行され得る。対象（interest）のいくつかの分子（例えばポリペプチド、ポリリボヌクレオチド等）は、産生された宿主細胞の物質から生成される必要がある可能性がある。クロマトグラフィーを用いた対象の分子の分離または精製は、宿主細胞タンパク質（例えばリパーゼ）、宿主細胞物質（例えば細胞破片）、およびそうでなければ対象の分子と共に精製され得る他の不純物を減少させるか、除去するか、または分離することが可能である。
［００３］クロマトグラフィーは、混合物の成分（components）を分離するために実行可能なプロセスの広く用いられるカテゴリーである。特定のタイプのクロマトグラフィーは、薬剤製品調製プロセス（例えば薬剤製品中で使用するための分子の分離、収集、単離、精製、ポリッシング等）において実行され得る。対象（interest）のいくつかの分子（例えばポリペプチド、ポリリボヌクレオチド等）は、産生された宿主細胞の物質から生成される必要がある可能性がある。クロマトグラフィーを用いた対象の分子の分離または精製は、宿主細胞タンパク質（例えばリパーゼ）、宿主細胞物質（例えば細胞破片）、およびそうでなければ対象の分子と共に精製され得る他の不純物を減少させるか、除去するか、または分離することが可能である。
［００４］クロマトグラフィーには、固定相（a stationary phase）を通過する移動相（a mobile phase）の成分の分離を補助するように構成された媒体を含む固定相の使用が含まれ得る。例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィー（hydrophobic interaction chromatography）（ＨＩＣ）は、分子と、固定相中のＨＩＣ媒体疎水性表面との間の可逆性相互作用（a reversible interaction）を用いることによって、表面疎水性の相違に従って分子（例えばポリペプチド、ポリヌクレオチド等）を分離し得る。分子とＨＩＣ媒体疎水性表面との間の相互作用は、例えば、ランニング緩衝液（a running buffer）中の塩によって影響を受ける可能性がある。高塩濃度を有する負荷質量（load mass）を、ＨＩＣ装置内に負荷（be loaded）してもよく、この装置内で、高塩濃度によって、装置内のＨＩＣ媒体と混合物中の分子との間の相互作用が促進される。続いて、イオン強度が減少した溶液（例えば緩衝液）がＨＩＣ装置を通じて流れ、ＨＩＣ媒体と分子との間の疎水性相互作用が逆転し得る。疎水性が最低である分子がまず溶出可能であり、疎水性が最大である分子は、ＨＩＣ媒体との疎水性相互作用を逆転させるために塩濃度のより大きな減少を必要とすることから、最後に溶出可能である。
［００５］いくつかの場合、ＨＩＣ媒体は、多数のクロマトグラフィーサイクルのために再使用可能である。ＨＩＣ媒体の有効性、品質、および清浄性を維持し、サイクル間の汚染を防ぎ、ＨＩＣ媒体の寿命を増加させ、不純物の蓄積を防ぎ、かつ／またはそうでなければ操作基準（operating standards）（例えば実験室もしくは組織内部の操作基準、または規制機関によって命じられる操作基準）を満たすかもしくはそれを超えるため、ＨＩＣサイクルを実行した後、ＨＩＣ媒体から残留物質（residual material）を除去するために、ＨＩＣ媒体を再生するための方法を使用してもよい。
［００６］本開示の態様は、クロマトグラフィーカラムの再生に関する。一態様において、本開示は、負荷質量が適用されている疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム（a hydrophobic interaction chromatography column to which a load mass has been applied）を再生する方法に関する。該方法は、アルカリ溶液の１以上のカラム体積（one or more column volumes）を、カラム内の疎水性相互作用媒体（hydrophobic interaction media）に通過させることを含んでよく、アルカリ溶液は約１０～約１４の間のｐＨ、および０．５ｍＳ／ｃｍ～約１０ｍＳ／ｃｍの間の伝導率（a conductivity）を示し、疎水性相互作用媒体に結合した物質は除去される。アルカリ溶液は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、またはＴｒｉｓの１つを含むことが可能であり；アルカリ溶液は約０．８ｍＳ／ｃｍ～約１．６ｍＳ／ｃｍの間の伝導率を示すことが可能であり、かつまたは、アルカリ溶液は、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭの間の総溶解塩濃度（a total dissolved salt concentration）を含むことが可能である。
［００７］疎水性相互作用媒体に結合した物質の除去後、負荷質量の１．０％未満が残留質量（a residual mass）として疎水性相互作用媒体に結合したままであり得る。媒体から除去される物質は、宿主細胞タンパク質、示唆される（suggested）タンパク質、脂質、ポリペプチド断片、生体分子、または核酸を含み得る。媒体から除去される物質は、いくつかの実施形態において、細菌または真菌を含まない可能性がある。方法は、いくつかの実施形態において、カオトロピック剤（a chaotropic agent）または有機溶媒と疎水性相互作用媒体を接触させることを含まない可能性がある。アルカリ溶液の１以上のカラム体積をカラム内の疎水性相互作用媒体に通過させる工程は、約１０分間～約１時間かかる。
［００８］別の態様において、本開示は、負荷質量が適用されているクロマトグラフィーカラムを再生する方法であって、アルカリ溶液の１以上のカラム体積をカラム内の疎水性相互作用媒体に通過させることを含み、アルカリ溶液は約０．５ｍＭ～約５０ｍＭの間の総溶解濃度（a total dissolved concentration）の水酸化ナトリウムを含み、媒体に結合した物質は除去される。媒体は、脂肪族または芳香族立体配置（configuration）の２～１０の間の炭化水素を有するリガンドを含むマトリックスを含み得る。リガンドは、媒体ｍｌあたり約２０～約３０μｍｏｌの間の密度で媒体中に存在し得る。他の例では、媒体は３０以上の炭化水素を含むリガンドを含まない可能性があり；クロマトグラフィーカラムは、混合モードのクロマトグラフィープロセスで用いられない可能性があり；かつ／または、媒体は架橋アガロースおよびフェニルリガンドを含むマトリックスを含み得る。他の例では、方法は、アルコール、エチレングリコール、または塩化ナトリウムと媒体を接触させることを含まない可能性がある。方法は、アルカリ溶液の１以上のカラム体積をカラム内に通過させた後、カオトロピック剤の１以上のカラム体積をカラムに通過させることをさらに含んでよく、カオトロピック剤は６Ｎ塩酸グアニジンまたは８Ｎ尿素の一方である。方法は、約０．０５Ｍ～約０．１５Ｍの間の総溶解濃度の水酸化ナトリウムを含む保管緩衝液と、カラムを接触させることをさらに含み得る。方法はまた、クロマトグラフィーカラムに第一の負荷質量を適用すること、およびクロマトグラフィーカラムに第二の負荷質量を適用することをさらに含むことが可能であり、クロマトグラフィーカラムをクリーニングすることを含まない。
［００９］別の態様において、本開示は、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム再生溶液のためのアルカリ溶液の濃度を特定する（identifying）方法であって、第一の溶液のある体積（a volume）を、カラム内の疎水性相互作用媒体に通過させることであって、第一の溶液は水と、約０Ｎから始まってほぼ一定の比率で最大濃度まで増加する濃度のアルカリ溶液とを含み（wherein the first solution includes water and a concentration of an alkaline solution beginning from about 0N and increasing at an approximately constant rate to a maximum concentration）；第二の溶液のある体積を、疎水性相互作用媒体に通過させることであって、第二の溶液は水と、最大濃度から始まってほぼ一定の比率で約０Ｎまで減少する濃度のアルカリ溶液とを含み（wherein the second solution includes water and a concentration of an alkaline solution beginning from the maximum concentration and decreasing at an approximately constant rate to about 0N）；および、疎水性相互作用媒体を通過する時に、疎水性相互作用媒体に結合した物質を除去する、第一または第二の溶液の部分を特定することを含む、方法に関する。アルカリ溶液は水酸化ナトリウムを含んでもよく、最大濃度が約１Ｎであり得る。他の例では、第一の溶液の体積および第二の溶液の体積は、各々、約２０カラム体積である。
［０１０］別の態様において、本開示は、多様なクロマトグラフィー樹脂の有用性および再生を予測するか、評価するか、または比較することを含む。いくつかの例では、クロマトグラフィープロトコルを評価する方法は、フィルタープレートウェル（a filter plate well）中で、標的分子（a target molecule）を含有する負荷質量を、ある体積のクロマトグラフィー媒体に添加し、フィルタープレートウェルからフロースルー（a flowthrough）を収集することであって、負荷質量がプロトコルｐＨを示し；クロマトグラフィー媒体を含む緩衝液の複数のアリコート（aliquots）を添加して、クロマトグラフィー媒体から溶離液を得ることであって、緩衝液が緩衝液ｐＨを示し、コスモトロピック塩の濃度が複数のアリコートにわたって直線的に減少し（a concentration of a kosmotropic salt decreases linearly over the plurality of aliquots）、かつ標的分子の第一の量がフロースルーおよび溶離液を合わせた中に含まれ；第二の溶液をクロマトグラフィー媒体に添加して、クロマトグラフィー媒体から標的分子の第二の量を抽出すること；および、カオトロピック剤をクロマトグラフィー媒体に添加して、クロマトグラフィー媒体から標的分子の第三の量を抽出することを含む、方法に関する。
［０１１］付随する図は、本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成し、多様な例示的な実施形態を例示し、かつ本明細書と共に、開示する実施形態の原理を説明する役割を果たす。本明細書に記載の実施形態または例のいかなる特徴（例えば組成、配合、方法等）も、任意の他の実施形態または例と組み合わせ可能であり、すべてのこうした組み合わせは本開示に含まれる。さらに、記載するシステムおよび方法は、いかなる１つの態様またはその実施形態に限定されず、こうした態様および実施形態のいかなる組み合わせまたは順列に限定されない。簡潔にするために、特定の順列および組み合わせは、本明細書に別個に論じられず、かつ／または例示されない。
［０３５］別に定義しない限り、本明細書で用いるすべての技術的および科学的用語は、本開示が属する技術分野の一般的な当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本開示の実施または試験において、任意の適切な方法および材料（例えば本明細書に記載するものと類似であるかまたは同等であるもの）を用いてもよいが、ここで、特定の方法を記載する。言及するすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
［０３６］本明細書において用いた際、用語「含む（comprises）」、「含んでいる（comprising）」またはその任意の変型は、要素のリストを含むプロセス、方法、物品または装置が、これらの要素のみを含むのではなく、明確に列挙されていないか、あるいはこうしたプロセス、方法、物品、または装置に本来備わっている他の要素を含んでもよいように、非排除的な包含を含むと意図される。用語「例示的（exemplary）」は、「理想的（ideal）」よりもむしろ「例（example）」の意味で用いられる。用語「例えば（for example）」および「など（such as）」およびその文法的な同等物に関して、明確にそうではないと言及されない限り、句「かつ限定なしに（and without limitation）」が続くと理解される。
［０３７］本明細書で用いた際、用語「約」は、実験誤差による変動を考慮することを意味する。数値に適用された際、用語「約」は、異なる変動が明記されない限り、開示する数値から＋／－５％の変動を示し得る。本明細書で用いた際、単数形「a」、「an」および「the」は、背景が明確にそうではないことを示さない限り、複数の指示対象を含む。さらに、すべての範囲は、終点を包含すると理解され、例えば１センチメートル（ｃｍ）から５ｃｍは、１ｃｍ、５ｃｍ、および１ｃｍ～５ｃｍの間のすべての距離の長さを含む。
［０３８］本明細書に開示するすべての数値（開示する値、限界、および範囲のすべてを含む）は、異なる変動が明記されない限り、開示する数値から＋／－５％の変動を有し得る。
［０３９］用語「ポリペプチド」は、本明細書で用いた際、アミド結合を通じて共有連結された、約２０より多いアミノ酸を有する任意のアミノ酸ポリマーを指す。タンパク質は、１つ以上のアミノ酸ポリマー鎖（例えばポリペプチド）を含有する。従って、ポリペプチドはタンパク質であってもよく、タンパク質は多数のポリペプチドを含有して１つの機能する生体分子を形成してもよい。
［０４０］翻訳後修飾は、ポリペプチドの構造を修飾するかまたは改変することが可能である。例えば、いくつかのタンパク質では、ジスルフィド架橋（例えばシステイン残基間のＳ－Ｓ結合）が翻訳後に形成され得る。いくつかのジスルフィド架橋は、ポリペプチド、免疫グロブリン、タンパク質、補因子、基質等の適切な構造、機能、および相互作用に必須である。ジスルフィド結合形成に加えて、タンパク質は、他の翻訳後修飾、例えば脂質化（例えばミリストイル化、パルミトイル化、ファルネソイル化（farnesoylation）、ゲラニルゲラニル化、およびグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー形成）、アルキル化（例えばメチル化）、アシル化、アミド化、グリコシル化（例えばアルギニン、アスパラギン、システイン、ヒドロキシリジン、セリン、スレオニン、チロシン、および/またはトリプトファンでのグリコシル基の付加）、およびリン酸化（すなわち、セリン、スレオニン、チロシンおよび/またはヒスチジンへのリン酸基の付加）に供され得る。翻訳後修飾は、疎水性、静電表面特性、またはポリペプチドが関与する表面間相互作用を決定する他の特性に影響を及ぼし得る。
［０４１］本明細書において用いた際、用語「タンパク質」には、生物学的療法タンパク質、研究または療法に用いられる組換えタンパク質、トラップタンパク質および他のＦｃ融合タンパク質、キメラタンパク質、抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、二重特異性抗体、抗体断片、抗体様分子、ナノボディ、組換え抗体キメラ、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモン等が含まれる。対象のタンパク質（ＰＯＩ）は、単離、精製、または別の方式で調製されることが望ましい任意のポリペプチドまたはタンパク質を含み得る。ＰＯＩは、抗体を含めて、細胞によって産生されるポリペプチドを含み得る。
［０４２］用語「抗体」は、本明細書において用いた際、４つのポリペプチド鎖、ジスルフィド結合によって内部連結された２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖で構成される免疫グロブリンを含む。典型的には、抗体は、１００ｋＤａを超える、例えば１３０ｋＤａ～２００ｋＤａの間、例えば約１４０ｋＤａ、１４５ｋＤａ、１５０ｋＤａ、１５５ｋＤａ、または１６０ｋＤａの分子量を有する。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書において、ＨＣＶＲまたはＶＨと略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書において、ＬＣＶＲまたはＶＬと略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬを含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性領域にさらに分けられ得る。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成され、これらはアミノ末端からカルボキシ末端に以下の順序で配置される、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４（重鎖ＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と略されてもよく；軽鎖ＣＤＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と略されてもよい）。
［０４３］例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）と称される免疫グロブリンクラスは、ヒト血清で一般的であり、４つのポリペプチド鎖、２つの軽鎖および２つの重鎖を含む。各軽鎖は、１つのシステインジスルフィド結合を通じて１つの重鎖に連結され、２つの重鎖は、２つのシステインジスルフィド結合を通じて互いに結合される。他のクラスのヒト免疫グロブリンには、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥが含まれる。ＩｇＧの場合、４つのサブクラス、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４が存在する。各サブクラスは定常領域が異なり、その結果、異なるエフェクター機能を有し得る。本明細書に記載するいくつかの実施形態において、ＰＯＩは、ＩｇＧを含む標的ポリペプチドを含み得る。少なくとも１つの実施形態において、標的ポリペプチドはＩｇＧ４を含む。
［０４４］用語「抗体」はまた、本明細書において用いた際、全長抗体分子の抗原結合断片を含む。用語、抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」等は、本明細書において用いた際、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、任意の天然存在の、酵素的に得られ得る、合成の、または遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合断片は、例えば任意の適切な標準的技術、例えばタンパク質分解的消化、または抗体可変ドメインおよび随意に定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現を伴う組換え遺伝子操作技術を用いて、全長抗体分子から得られ得る。こうしたＤＮＡは公知であり、かつ／または例えば商業的供給源、ＤＮＡライブラリー（例えばファージ－抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であり、あるいは合成することが可能である。ＤＮＡを配列決定し、化学的に操作してもよいし、あるいは分子生物学技術を用いて、例えば１つ以上の可変および／または定常ドメインを適切な立体配置にアレンジするか、またはコドンを導入するか、システイン残基を生成するか、アミノ酸を修飾するか、付加するかもしくは欠失させるなどによって操作してもよい。
［０４５］組換え細胞に基づく産生システム、例えば昆虫バキュロウイルスシステム、酵母システム（例えばＰｉｃｈｉａ属種）、または哺乳動物システム（例えばＣＨＯ細胞およびＣＨＯ－Ｋ１細胞のようなＣＨＯ誘導体）を用いて、標的分子（例えば標的ポリペプチド／抗体）を産生してもよい。用語「細胞」は、組換え核酸配列を発現するために適した任意の細胞を含む。細胞は、原核生物および真核生物のもの（単細胞または多細胞）、細菌細胞（例えばＥ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属種、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属種の株）、マイコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ等）、植物細胞、昆虫細胞（例えばＳＦ－９、ＳＦ－２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ等）、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、あるいは細胞融合体、例えばハイブリドーマまたはクアドローマを含む。いくつかの実施形態において、細胞は、ヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラット、またはマウス細胞であってもよい。いくつかの実施形態において、細胞は真核細胞であってもよく、以下の細胞から選択されてもよい、ＣＨＯ（例えばＣＨＯ Ｋ１、ＤＸＢ－１１ ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ－ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えばＣＯＳ－７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えばＨＥＫ２９３、２９３ ＥＢＮＡ、ＭＳＲ ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ ８０６５、ＨＬ－６０、（例えばＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（上皮）、ＣＶ－１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、ＭＭＴ ０６０５６２、セルトリ細胞、ＢＲＬ ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞、および前述の細胞に由来する細胞。いくつかの実施形態において、細胞は、１つ以上のウイルス遺伝子を含んでもよく、例えばウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えばＰＥＲ．Ｃ６ＴＭ細胞）であってもよい。
［０４６］用語「標的分子（target molecule）」は、本明細書において、標的ポリペプチド（例えば抗体、抗体断片、あるいは他のタンパク質またはタンパク質断片）、あるいは産生され、単離され、精製され、かつ／または薬剤製品に含まれるよう意図される他の分子（例えばアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）または療法使用のための他の分子）を指すよう用いられ得る。本開示に従った方法は、標的ポリペプチドを指してもよいが、これらは、他の標的分子にも適用可能であり得る。例えば、適切な方法（例えば深層ろ過、アフィニティクロマトグラフィー等）に従ってＡＡＶを調製してもよく、ＡＡＶを含む混合物を本開示に従った方法に供してもよい。本開示の１つ以上の方法の前にまたはこうした方法に従った後に、ＡＡＶを含む混合物をさらなる処置（例えば、「空のカセット」または標的配列を含有しないＡＡＶの除去）に供してもよい。
［０４７］いくつかの実施形態において、標的分子は、抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、抗原結合抗体断片、一本鎖抗体、ディアボディ、トリアボディまたはテトラボディ、Ｆａｂ断片またはＦ（ａｂ’）２断片、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、またはＩｇＧ４抗体である。一実施形態において、抗体はＩｇＧ１抗体である。一実施形態において、抗体はＩｇＧ２抗体である。一実施形態において、抗体はＩｇＧ４抗体である。一実施形態において、抗体はキメラＩｇＧ２／ＩｇＧ４抗体である。一実施形態において、抗体はキメラＩｇＧ２／ＩｇＧ１抗体である。一実施形態において、抗体はキメラＩｇＧ２／ＩｇＧ１／ＩｇＧ４抗体である。
［０４８］いくつかの実施形態において、標的分子（例えば抗体）を、抗プログラム細胞死１抗体（例えば米国特許出願公報第ＵＳ２０１５／０２０３５７９Ａ１号に記載されるような抗ＰＤ１抗体）、抗プログラム細胞死リガンド１（例えば、米国特許出願公報第ＵＳ２０１５／０２０３５８０Ａ１号に記載されるような抗ＰＤ－Ｌ１抗体）、抗Ｄｌｌ４抗体、抗アンジオポエチン－２抗体（例えば米国特許第９，４０２，８９８号に記載されるような抗ＡＮＧ２抗体）、抗アンジオポエチン様３抗体（例えば米国特許第９，０１８，３５６号に記載されるような抗ＡｎｇＰｔｌ３抗体）、抗血小板由来増殖因子受容体抗体（例えば米国特許第９，２６５，８２７号に記載されるような抗ＰＤＧＦＲ抗体）、抗プロラクチン受容体抗体（例えば米国特許第９，３０２，０１５号に記載されるような抗ＰＲＬＲ抗体）、抗補体５抗体（例えば米国特許出願公報第ＵＳ２０１５／０３１３１９４Ａ１号に記載されるような抗Ｃ５抗体）、抗ＴＮＦ抗体、抗上皮増殖因子受容体抗体（例えば、米国特許第９，１３２，１９２号に記載されるような抗ＥＧＦＲ抗体または米国特許出願公報第ＵＳ２０１５／０２５９４２３Ａ１号に記載されるような抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体）、抗プロタンパク質コンバターゼ・サブチリシン・ケキシン－９抗体（例えば米国特許第８，０６２，６４０号または米国特許出願公報第ＵＳ２０１４／００４４７３０Ａ１号に記載されるような抗ＰＣＳＫ９抗体）、抗増殖および分化因子－８抗体（例えば米国特許第８，８７１，２０９号または第９，２６０，５１５号に記載されるような、抗ミオスタチン抗体としても知られる抗ＧＤＦ８抗体）、抗グルカゴン受容体（例えば米国特許出願公報第ＵＳ２０１５／０３３７０４５Ａ１号または第ＵＳ２０１６／００７５７７８Ａ１号に記載されるような抗ＧＣＧＲ抗体）、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＩＬ１Ｒ抗体、インターロイキン４受容体抗体（例えば米国特許出願公報第ＵＳ２０１４／０２７１６８１Ａ１号あるいは米国特許第８，７３５，０９５号または第８，９４５，５５９号に記載されるような抗ＩＬ－４Ｒ抗体）、抗インターロイキン６受容体抗体（例えば米国特許第７，５８２，２９８号、第８，０４３，６１７号または第９，１７３，８８０号に記載されるような抗ＩＬ６Ｒ抗体）、抗インターロイキン３３（例えば米国特許出願公報第ＵＳ２０１４／０２７１６５８Ａ１号または第ＵＳ２０１４／０２７１６４２Ａ１号に記載されるような抗ＩＬ３３抗体）、抗呼吸器合胞体ウイルス抗体（例えば米国特許出願公報第ＵＳ２０１４／０２７１６５３Ａ１号に記載されるような抗ＲＳＶ抗体）、抗表面抗原分類３（例えば米国特許出願公報第ＵＳ２０１４／００８８２９５Ａ１号および第ＵＳ２０１５０２６６９６６Ａ１号、ならびに米国出願第６２／２２２，６０５号に記載されるような抗ＣＤ３抗体）、抗表面抗原分類２０（例えば米国特許出願公報第ＵＳ２０１４／００８８２９５Ａ１号および第ＵＳ２０１５０２６６９６６Ａ１号、ならびに米国特許第７，８７９，９８４号に記載されるような抗ＣＤ２０抗体）、抗表面抗原分類４８（例えば米国特許第９，２２８，０１４号に記載されるような抗ＣＤ４８抗体）、抗Ｆｅｌ ｄ１抗体（例えば米国特許第９，０７９，９４８号に記載されるようなもの）、抗中東呼吸器症候群ウイルス（例えば抗ＭＥＲＳ抗体）、抗エボラウイルス抗体（例えばＲｅｇｅｎｅｒｏｎのＲＥＧＮ－ＥＢ３）、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＩＬ１抗体、抗ＩＬ２抗体、抗ＩＬ３抗体、抗ＩＬ４抗体、抗ＩＬ５抗体、抗ＩＬ６ 抗体、抗ＩＬ７抗体、抗Ｅｒｂ３抗体、抗ジカウイルス抗体、抗リンパ球活性化遺伝子３（例えば抗ＬＡＧ３抗体または抗ＣＤ２２３抗体）および抗アクチビンＡ抗体からなる群より選択される。この段落中で言及した各米国特許および米国特許公報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
［０４９］いくつかの実施形態において、標的分子（例えば二重特異性抗体）は、抗ＣＤ３ｘ抗ＣＤ２０二重特異性抗体、抗ＣＤ３ｘ抗ムチン１６二重特異性抗体、および抗ＣＤ３ｘ抗前立腺特異的膜抗原二重特異性抗体からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、標的分子は、アリロクマブ、サリルマブ、ファシヌマブ、ネスバクマブ、デュピルマブ、トレボグルマブ、エビナクマブ、およびリヌクマブからなる群より選択される。
［０５０］いくつかの実施形態において、標的分子は、Ｆｃ部分および別のドメインを含有する組換えタンパク質（例えばＦｃ融合タンパク質）である。いくつかの実施形態において、Ｆｃ融合タンパク質は、受容体Ｆｃ融合タンパク質であり、Ｆｃ部分にカップリングした受容体の１つ以上の細胞外ドメインを含有する。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、ヒンジ領域に続いてＩｇＧのＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態において、受容体Ｆｃ融合タンパク質は、１つのリガンドまたは複数のリガンドのいずれかに結合する２つ以上の別個の受容体鎖を含有する。例えばＦｃ融合タンパク質はＴＲＡＰタンパク質、例えばＩＬ－１ ｔｒａｐ（例えばｈＩｇＧ１のＦｃに融合したＩｌ－１Ｒ１細胞外領域に融合したＩＬ－１ＲＡｃＰリガンド結合領域を含有するリロナセプト；その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，９２７，００４号を参照されたい）、またはＶＥＧＦ ｔｒａｐ（例えばｈＩｇＧ１のＦｃに融合したＶＥＧＦ受容体Ｆｌｋ１のＩｇドメイン３に融合したＶＥＧＦ受容体Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２を含有するアフリベルセプトまたはジブアフリベルセプト；どちらもその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７．０８７，４１１号および第７，２７９，１５９号を参照されたい）である。他の実施形態において、Ｆｃ融合タンパク質は、ＳｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質であり、Ｆｃ部分にカップリングした抗体の可変重鎖断片および可変軽鎖断片などの１つ以上の抗原結合ドメインの１つ以上を含有する。
［０５１］本開示の実施形態を、多様な薬剤製品の調製に、または多様な薬剤製品を精製する方法の開発に用いてもよい。いくつかの実施形態において、本開示は、抗原結合分子またはＡＡＶを含む薬剤製品の調製または精製に有用であり得る。いくつかの態様において、本開示の実施形態は、とりわけ、例えばアフリベルセプト、アリロクマブ、アビシパルペゴル、ベバシズマブ、ブロルシズマブ、コンベルセプト、デュプリマブ、エボロクマブ、トシリズマブ、セルトリズマブ、アバタセプト、リツキシマブ、インフリキシマブ、ラニビズマブ、サリルマブ、アダリムマブ、アナキンラ、トラスツズマブ、ペグフィルグラスチム、インターフェロンベータ１ａ、インスリングラルギン［ｒＤＮＡ起源］、エポエチンアルファ、ダルベポエチン、フィリグラスチム、ゴリムマブ、エタネルセプト、上記いずれかの抗原結合断片、あるいはこうした結合ドメインの組み合わせ、例えばＶＥＧＦまたはアンジオポエチン－２に対する二重特異性抗体などの成分を含む薬剤製品の調製に使用するために適している可能性がある。
［０５２］用語「疎水性相互作用媒体（hydrophobic interaction media）」または「ＨＩＣ媒体（HIC media）」は、支持構造（a support structure）および疎水性部分（a hydrophobic moiety）の組み合わせを意味し、疎水性部分は支持構造に固定されている。媒体は、クロマトグラフィー媒体の形、例えば、充填床カラム形式（a packed bed column format）で保持されるビーズまたは他の粒子の形式、メンブレン形式、または対象のタンパク質および混入物質（contaminants）を含む液体を収容し得る任意の形式であってもよい。従って、支持構造は、アガロースビーズ（例えばセファロース）、シリカビーズ、セルロース性メンブレン、セルロース性ビーズ、親水性ポリマービーズ、樹脂等を含む。疎水性部分は疎水性分子およびタンパク質の疎水性表面に結合する。媒体の疎水性の度合いは、疎水性部分を選択することによって調節され得る。疎水性相互作用媒体は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（hydrophobic interaction chromatography）（ＨＩＣ）として知られるプロセスで使用され、混入物質と関連する製品およびプロセス（product and process related contaminants）から、標的分子、例えば対象のタンパク質または他の分子を分離するために用いられる。標的分子を宿主細胞で製造し、かつ／または該細胞から精製する際、最終的に標的分子から分離されなければならないいくつかの生成物およびプロセス関連成分（some product and process related components）を、宿主細胞タンパク質（host cell proteins）（ＨＣＰ）および細胞破片（cellular debris）と称する。いくつかの例では、ＨＩＣ媒体の疎水性部分への標的分子中の疎水性基の結合を促進するよう設計された緩衝液中で、標的分子および他の成分を含有する混合物を、ＨＩＣ媒体に適用する。こうした混合物は「負荷質量（load mass）」と称され得る。ＨＩＣは、負荷（load）、洗浄（wash）、または再生（regeneration）期中に分離を生じる、標的分子（複数可）と不純物との間の疎水性相違を利用する。しばしば、標的分子はフロースルー（the flow through）内に分離される一方、不純物はＨＩＣ媒体に結合している。ＨＩＣはまた、標的分子がＨＩＣ媒体に結合する一方、ＨＣＰおよび細胞破片が結合できず、流出する方式で操作されてもよい。本開示はいずれの場合にも（標的分子が疎水性相互作用部分に結合してもまたしなくても）適用可能である。
［０５３］ＨＩＣ媒体は、標的分子の精製／収集で使用した後、定期的にストリップ（stripped）または再生（regenerated）され得る。本明細書において用いた際、用語「ストリッピング（stripping）」および「再生（regenerating）」は、交換可能に、かつ／または組み合わせて用いられ、精製サイクル後にＨＩＣ媒体から負荷質量の任意の残留成分（any residual components of a load mass）を除去し、続く精製サイクルのためにＨＩＣ媒体を調製するように構成されたプロセスを指す。例えば、ＨＩＣ装置を用いて、宿主細胞物質（例えば宿主細胞破片、宿主細胞タンパク質等）を含む負荷質量から対象の分子を分離するかまたは精製し、対象の分子をＨＩＣ装置から溶出した後、ＨＩＣ媒体を再生して、ＨＩＣ媒体から残留物質（例えば宿主細胞物質、宿主細胞タンパク質、脂質、残留ポリペプチド、凝集タンパク質、核酸、生体分子等）を除去し、別の負荷質量から、対象の分子を精製する際に用いられるようにＨＩＣ媒体を調製することが可能である。いくつかの実施形態において、ＨＩＣ媒体の再生は、残留宿主細胞物質および／または標的分子とＨＩＣ媒体との間の疎水性相互作用を破壊し、かつ／または残留宿主細胞物質を変性することを含み得る。再生は、ＨＩＣサイクル間で行われ、より長いクリーニングプロセスの必要なしに、ＨＩＣ媒体を「リセット（reset）」し得る。いくつかの実施形態において、ＨＩＣサイクル間で再生を行って、経時的なＨＩＣ媒体の変色（discoloration）を防止するかまたは減少させることが可能である。いくつかの実施形態において、本開示に従った再生プロセスは、例えば、約５分間～約１時間、例えば約１０分間～約１時間、約１０分間～約４５分間、または約１０分間～約３０分間、行われ得る。好ましくは、ＨＩＣ媒体の再生は、望ましくない影響を有するかまたはさらなる懸念を生じ得るよりロバスト（robust）なクリーニング溶液にＨＩＣ媒体を供することなく、完了し得る。クロマトグラフィー媒体からの、例えば細菌、真菌または他の微生物の除去に特定の重点を置かずに、再生プロセスを構成してもよい。
［０５４］「ストリッピング」および「再生」は、例えばクロマトグラフィー媒体の「クリーニング（cleaning）」とは区別され得る。クリーニングは、クロマトグラフィー媒体、クロマトグラフィー装置、および／または実験セッティングの完全な消毒および／または除染を意図するプロセスを含み得る。例えば、クリーニングプロセスは、抗生物質、抗真菌剤、または別の方式の抗微生物溶液、他の消毒溶液、滅菌法等の、クロマトグラフィー媒体またはクロマトグラフィー装置の衛生化および／または滅菌を意図する濃度および量での使用を含み得る。対照的に、再生は、いくつかの場合、抗微生物特性を有する溶液の使用を含み得るが、再生の主な意図は、精製プロセス後に、クロマトグラフィー媒体から負荷質量の残留成分を除去することであり得る。いくつかの実施形態において、クリーニングプロセス中に用いた消毒、衛生化、抗微生物、または抗生物質溶液によって、続くクロマトグラフィーサイクルが影響を受けないことを確実にするため、クリーニングプロセス中および／またはプロセス後に、さらなる保護または処置が必要であり得る。多くの場合、クリーニングプロセスは、再生プロセスより長い可能性がある（例えば約１時間を超える）。
［０５５］ＨＩＣ媒体中の分子の分離は、例えば、ＨＩＣ媒体を、高塩濃度を有する負荷質量に曝露して、ＨＩＣ媒体と負荷質量中の標的分子との間の疎水性相互作用を増加させ、続いて、減少したまたは減少しつつある塩濃度（a decreased or decreasing salt concentration）を有するある体積の溶液（a volume of a solution）（例えば緩衝液）をＨＩＣ媒体に通過させて、疎水性相互作用を逆転させることによって、達成され得る。従って、低塩または無塩条件下（in low- or no-salt conditions）では、より少ない物質がＨＩＣ媒体に結合することが慣例的に理解される。しかし、驚くべきことに、特定のタイプのＨＩＣ媒体は、無塩条件下で、残留物質（例えば宿主細胞タンパク質）に増加した結合（例えば疎水性相互作用）を示すことが発見されている。さらに、いくつかのタンパク質（例えばモノクローナル抗体）は、あるタイプのＨＩＣ媒体（例えばＣａｐｔｏＴＭフェニル（Ｈｉｇｈ Ｓｕｂ）媒体（GE Healthcare Life Sciences））上では変性し得ることが発見されている。タンパク質は、ＨＩＣ媒体からひとたび溶出すると本来の立体配置（their native configurations）に戻り得るが、変性状態にあるこうしたタンパク質は、例えば逆浸透脱イオン水（ＲＯＤＩ）、１Ｎ水酸化ナトリウム、および／または２０％エタノールを含む再生処置によってはＨＩＣ媒体から除去されない可能性がある。ある場合には、ＨＩＣ媒体からの分子の溶出は、ｐＨおよび／または伝導率に依存すると仮定される。
［０５６］本開示の態様は、再生溶液、および再生の容易さを含む有用性に関するクロマトグラフィー媒体の評価に関する。
［０５７］本開示のいくつかの実施形態において、再生溶液はアルカリ溶液であり得る。本開示のいくつかの実施形態において、高いｐＨは、再生溶液の有効性における促進因子（a driving factor）である可能性があることが意図される；しかしながら、いくつかの場合、高いｐＨの有効性は、高いイオン強度によって相殺され得るとさらに意図される。従って、いくつかの実施形態において、再生溶液の有効性は、低いがゼロではない伝導率と組み合わせた高いｐＨによって促進され（be driven）得る（例えば以下に論じる実施例１４を参照されたい）。例えば、いくつかの実施形態において、再生溶液は、約８～約１４、例えば約１０～約１４の間のｐＨを示し得る。いくつかの実施形態において、再生溶液は、一般的に低い伝導率を示し得る。例えば、いくつかの実施形態において、再生溶液は、約０．５ｍＳ／ｃｍ～約１０ｍＳ／ｃｍの間、例えば約０．５ｍＳ／ｃｍ～約５ｍＳ／ｃｍの間、約５．０ｍＳ／ｃｍ～約１０ｍＳ／ｃｍの間、約０．５ｍＳ／ｃｍ～約３ｍＳ／ｃｍの間、約０．５ｍＳ／ｃｍ～約１．６ｍＳ／ｃｍの間、約０．８ｍＳ／ｃｍ～約１．６ｍＳ／ｃｍの間、約０．５ｍＳ／ｃｍ、約１．０ｍＳ／ｃｍ、約１．５ｍＳ／ｃｍ、約２．０ｍＳ／ｃｍ、約２．５ｍＳ／ｃｍ、約３ｍＳ／ｃｍ、約３．５ｍＳ／ｃｍ、約４．０ｍＳ／ｃｍ、約４．５ｍＳ／ｃｍ、または約５．０ｍＳ／ｃｍの伝導率を示し得る。
［０５８］いくつかの実施形態において、再生溶液は、ある濃度（a concentration）の例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、Ｔｒｉｓ、他のアルカリ溶液、またはその組み合わせを含むアルカリ溶液であり得る。いくつかの実施形態において、再生溶液は、約０．１ｍＭ～約５０ｍＭの間、例えば約０．１ｍＭ～約２５ｍＭの間、約０．１ｍＭ～約２０ｍＭの間、約０．１ｍＭ～約１５ｍＭの間、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭの間、約０．１ｍＭ～約５ｍＭの間、約０．１ｍＭ～約２．５ｍＭの間、約１ｍＭ～約１０ｍＭの間、約１ｍＭ～約７ｍＭの間、約２．５ｍＭ～約５ｍＭ、または約２．５ｍＭ～約７ｍＭの間、例えば約０．５ｍＭ、約１ｍＭ、約１．５ｍＭ、約２ｍＭ、約２．５ｍＭ、約３ｍＭ、約３．５ｍＭ、約４ｍＭ、約４．５ｍＭ、約５ｍＭ、約５．５ｍＭ、約６ｍＭ、約６．５ｍＭ、約７ｍＭ、約７．５ｍＭ、約８ｍＭ、約８．５ｍＭ、約９ｍＭ、約９．５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、または約２５ｍＭの総溶解塩濃度を含み得る。
［０５９］いくつかの実施形態において、本開示に従った再生溶液は、一工程再生プロセス（single-step regeneration processes）で使用するために適している可能性がある。すなわち、いくつかの実施形態において、ＨＩＣ媒体を再生する方法は、１つの溶液（a single solution）とＨＩＣ媒体を接触させることを含んでもよく、ここで、溶液は本明細書記載の１つ以上の特性を示し、１つの溶液と接触させた後、負荷質量の約５％未満が、残留質量としてＨＩＣ媒体に結合したままである。例えば、いくつかの実施形態において、ＨＩＣ媒体を再生する方法は、約１０～約１４の間のｐＨ、および約０．５ｍＳ／ｃｍ～約１０ｍＳ／ｃｍの間の伝導率を示す溶液と、ＨＩＣ媒体を接触することを含んでもよく、その後、負荷質量の約５％未満が、残留質量としてＨＩＣ媒体に結合したままである。いくつかの実施形態において、残留質量は、負荷質量の約４％未満、約３％未満、約２％未満または約１％未満であり得る。
［０６０］本開示に従って用いる再生溶液の体積は、任意の適切な体積であり得る。例えば負荷質量をクロマトグラフィーカラム中のＨＩＣ媒体に適用する、いくつかの実施形態において、本開示に従って用いる再生溶液の体積は、カラム体積（column volumes）（ＣＶ）で測定され得る。いくつかの実施形態において、例えば、クロマトグラフィーカラム中のＨＩＣ媒体を再生する方法は、少なくとも１ ＣＶ（at least one CV）の再生溶液をカラムに通過させることを含み得る。いくつかの実施形態において、方法は、約１～約２０カラム体積の間、例えば約１カラム体積～約１５カラム体積の間、約１カラム体積～約１０カラム体積の間、約１カラム体積～約５カラム体積の間、約３カラム体積～約１７カラム体積の間、約５カラム体積～約１５カラム体積の間、または約５カラム体積～約１０カラム体積の間、例えば約１カラム体積、約２カラム体積、約３カラム体積、約４カラム体積、約５カラム体積、約６カラム体積、約７カラム体積、約８カラム体積、約９カラム体積、約１０カラム体積、約１２カラム体積、約１４カラム体積、約１６カラム体積、約１８カラム体積、または約２０カラム体積の再生溶液を、カラムに通過させることを含み得る。
［０６１］本開示に従ったシステムおよび方法は、多様な分離媒体および／またはプロセスに適用可能であり得る。本開示の１つのシステム、方法、または溶液（A single system, method, or solution）は、本明細書記載の１より多い態様と特徴を共有し得る。いくつかの例示的な実施形態において、本開示に従ったシステムおよび方法は、負荷質量の成分を完全にまたは部分的にその疎水性に基づいて分離する媒体および／またはプロセス、例えばＨＩＣに、あるいは疎水性および電荷の組み合わせを用いる媒体および／またはプロセス、例えばイオン交換／疎水性相互作用混合方式クロマトグラフィーに適用可能であり得る。いくつかの実施形態において、本明細書開示の１つ以上の再生溶液および／または方法を他の再生溶液および／または方法と組み合わせて（例えばその前またはその後に実行して）もよい。例えば、疎水性により、媒体と相互作用している残留質量を媒体からストリップするために、本開示の再生溶液を、混合方式クロマトグラフィーに用いた媒体に適用してもよい。電荷により媒体に結合している残留質量を媒体からストリップするために、別の再生溶液もまた媒体に適用してもよい。
［０６２］いくつかの実施形態において、本明細書開示の再生溶液および／または方法は、高度の疎水性を有するＨＩＣ媒体に適用可能であり得る。いくつかの実施形態において、本開示に従った溶液および方法で使用され得るクロマトグラフィー媒体は、例えば架橋アガロース、ポリスチレンジビニルベンゼン、またはポリメタクリレートを含む疎水性マトリックスを含み得る。いくつかの実施形態において、マトリックスは、脂肪族または芳香族立体配置の２～１０の間の炭化水素を有するリガンドを含み得る。いくつかの実施形態において、マトリックスは、３０以上の炭化水素を含むリガンドを含まない。いくつかの実施形態において、例えば、リガンドは、フェニルリガンド、ブチルリガンド、またはオクチルリガンドを含み得る。いくつかの実施形態において、リガンドは、媒体ｍｌあたり（per ml of media）、約２０～約３０μｍｏｌの間の密度で媒体中に存在し得る。いくつかの実施形態において、本明細書記載の方法および再生溶液を、特に適用してＨＩＣ媒体を再生し得る。いくつかの実施形態において、本明細書記載の方法および再生溶液は、例えばＣａｐｔｏＴＭフェニル（Ｈｉｇｈ Ｓｕｂ）、ＣａｐｔｏＴＭブチル、またはＣａｐｔｏＴＭオクチル媒体（GE Healthcare Life Sciences）、フェニルセファロース（Ｒ）媒体（GE Healthcare Life Sciences）、ＰＯＲＯＳＴＭベンジルおよびＰＯＲＯＳＴＭエチルＨＩＣ樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＴＭ）、またはＴＯＹＯＰＥＡＲＬＴＭ樹脂に適している可能性がある。いくつかの実施形態において、本明細書記載の方法および再生溶液は、連続（多カラム）（continuous (multi-column)）ＨＩＣシステムおよび方法における使用、例えば参照により本明細書に組み込まれる２０１９年７月１日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４０１４８号に開示されるようなものにおける使用に適している可能性がある。例えば、本開示に従った一工程再生溶液を、多カラム連続ＨＩＣセットアップで用いてもよく、ここで、一工程再生溶液の効率が、多カラムセットアップの全体の効率を増進し得る。いくつかの実施形態において、本明細書記載の方法および再生溶液は、低または無コスモトロープ条件（low- or no-kosmotrope conditions）を含めて、ＨＩＣシステムおよび方法において有用であり得る。
［０６３］いくつかの実施形態において、逆浸透脱イオン水（ＲＯＤＩ）、有機溶媒（例えばエタノールまたはエチレングリコール）、カオトロピック剤（例えばグアニジンまたは尿素）、塩化ナトリウム、および／または５０ｍＭを超える濃度の水酸化ナトリウムの使用を伴わずに、本開示に従った再生プロセスを実行してもよい。好適には、本明細書開示の溶液を用いた再生プロセスは、例えば溶媒、例えばエタノール（例えば２０％エタノール）、ならびにカオトロピック剤、例えばグアニジンおよび尿素（例えば６Ｎグアニジンまたは６Ｎ尿素）を廃棄するさらなるプロセスを必要としない可能性がある。しかし、いくつかの実施形態において、本明細書開示の再生溶液は、有機溶媒（例えば２０％エタノール）またはカオトロピック剤（例えば６Ｎグアニジンまたは６Ｎ尿素）の前、その後、またはそれと組み合わせて使用され得ると意図される。
［０６４］いくつかの実施形態において、本開示に従った方法は、保管目的のために保管緩衝剤とクロマトグラフィーカラムを接触させる前に、本明細書開示の再生溶液を、クロマトグラフィーカラムに通過させることを含み得る。保管緩衝液は、例えば約０．０５Ｍ～約０．１５Ｍの間の濃度の水酸化ナトリウムまたは別の塩を含み得る。
［０６５］いくつかの実施形態において、本開示に従った方法は、標的分子の精製中に、１つ以上のクロマトグラフィー媒体が、媒体の使用または再生に問題を提示するかどうかを特定する、多様なクロマトグラフィー媒体の評価を含み得る。本開示に従ったクロマトグラフィー媒体の評価は、例えば、かつ限定なしに、１つ以上のクロマトグラフィー媒体タイプの使用、ｐＨ条件の維持、および標的分子を含み得る。好適には、本開示に従った方法は、標的分子を精製するために一般的に行われるものよりも小さいスケールでのスクリーニングを含み、試料の量の有意な節約を可能にし得る（例えば慣用法に従って、クロマトグラフィー媒体、例えばＨＩＣを評価するために必要な試料の量のおよそ１／１０、１／１００、１／５００、１／７００またはそれ未満を用いる）。さらに、例えばハイスループットスクリーニング（a high-throughput screening）（ＨＴＳ）プロセスを用いて、異なる変数（例えば異なる組み合わせおよびタイプの媒体、ｐＨ、および／または標的分子）を有する多数の精製スキームを同時にスクリーニングしてもよい。ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）の代わりに、またはＨＴＳに加えて、溶出アッセイを用いて、潜在的なＨＩＣプロトコルのパラメーターを排除してもよい。
［０６６］好適には、これらのスクリーニング技術およびアッセイは、例えばＨＩＣ単位操作（a HIC unit operation）を最適化することによって、大規模精製プロセスにおける使用のために適した精製スキームを特定する際、有意な時間の節約を生じ得る。例えば、本開示に従って行われるＨＴＳプロセスは、ＨＩＣ、イオン交換、アフィニティ、およびその他を含む、１つ以上の単位操作のためのクロマトグラフィープロトコルにおける再生／有用性の問題を特定する慣用的な手段より、約１０倍速い、５０倍速い、６０倍速い、７０倍速い、またはさらに速い可能性がある。
［０６７］本開示に従った評価法は、ウェル、例えばフィルタープレートウェルに、潜在的な精製スキームにおける使用のために意図される、ある量のクロマトグラフィー媒体を充填することを含んでもよい。フィルタープレートウェルは、例えば５ｍＬ未満、例えば４ｍＬ未満、３ｍＬ未満、または２ｍＬ未満の容量を有し得る。いくつかの実施形態において、フィルタープレートウェルは、約１ｍＬ、約０．８ｍＬ、約０．５ｍＬの容量または任意の他の適切な容量を有し得る。フィルタープレートウェルに、適切なメッシュサイズ、例えば約０．５～約１．５ミクロンの間、例えば約０．８ミクロン、約１．０ミクロン、または約１．２ミクロンのメッシュサイズを有するフィルターを取り付けてもよい。フィルターメッシュサイズは、プロトコルで用いられるクロマトグラフィー媒体中に存在する樹脂ビーズのサイズに依存し得る。こうしたクロマトグラフィー樹脂ビーズのサイズは、例えば約４０ミクロン～約１２０ミクロンの間、例えば約５０ミクロン～約１００ミクロンの間、約６０ミクロン～約９０ミクロンの間、約８０ミクロン～約９０ミクロンの間、約７０ミクロン、約８０ミクロン、約９０ミクロン、約１００ミクロン、または約１１０ミクロンであり得る。ウェル内に充填されるクロマトグラフィー媒体の量は、多様であり得る。例えば、クロマトグラフィー媒体の量は、例えば約２．０μＬ～約５０．０μＬの範囲、例えば約１０．０μＬ、約２０．０μＬ、約３０．０μＬ、または約４０．０μＬであり得る。本開示に従ったいくつかの方法において、アレイ中で多数のプロトコルを同時に評価するため、多数のウェルを含むフィルタープレートに、複数の異なるクロマトグラフィー媒体を充填してもよい。これは、ＨＩＣ、イオン交換、アフィニティ、およびその他を含む、精製スキームにおけるクロマトグラフィー工程に使用され得る。
［０６８］負荷物質の体積を、充填フィルタープレートウェル（または複数のプロトコルを同時に評価する場合は、各々の充填フィルタープレートウェル）に負荷してもよい。負荷物質は、いくつかの最初の精製プロセス、例えばアフィニティクロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーを経た標的分子を含んでもよい。負荷物質は、単位操作、例えばＨＩＣを試験するために、本開示に従って用いられ得る。１つの単位操作（a single unit operation）に関して複数の条件を同時に評価する場合、異なるウェルで使用する負荷物質は、異なる標的分子を含み得る。負荷物質を、プロトコル特異的ｐＨ（a protocol-specific pH）に対して滴定してもよい。負荷物質内の標的分子のおよその濃度を、任意の適切な単位操作特異的濃度（unit operation-specific concentration）に調整してもよい。いくつかの実施形態において、負荷物質の体積は、フルスケールプトロコルで用いられる負荷質量の一部（a fraction）、例えばフルスケールプロトコルで用いられる負荷質量の１／２、１／５、１／８、１／１０、１／２０、１／５０、１／１００またはそれ未満の負荷質量（例えば負荷物質内の標的分子の質量）に対応してもよい。
［０６９］単位操作のためのプロトコルを評価する方法は、大規模プロセスで使用するために適した溶出および洗浄工程（elution and wash steps）を実行し（例えばＲＯＤＩ、１Ｎ水酸化ナトリウム、および／または５ｍＭ水酸化ナトリウムの使用を含む）、続いて腐食剤またはカオトロピック剤、例えば６ＮグアニジンＨＣｌまたは６Ｎ尿素、あるいは溶媒、例えば２０％エタノールを用いるストリッピング工程を行うことをさらに含み得る。溶出／洗浄工程は、例えばプロトコル特異的なｐＨに対して滴定された溶出緩衝液を用いて実行され得る。単位操作に関して多数のプロトコルを評価する場合、異なるプロトコル特異的ｐＨ値を示す溶出緩衝液を、１つのアレイ（a single array）中の異なるウェルで用いてもよい。溶出工程は、例えば、フィルタープレートウェル中に負荷されたクロマトグラフィー媒体を溶出緩衝液勾配（a gradient of elution buffer）（比較的高い濃度で始まり、０の濃度で終わる）に曝露することを含み得る。別の実施形態において、溶出工程は、負荷されたクロマトグラフィー媒体を、初期濃度のコスモトロピック塩（例えばクエン酸塩５００ｍＭ、４００ｍＭ、３００ｍＭ、２００ｍＭ等）を有し、次第に／直線的に（gradually/linearly）緩衝液濃度が０に減少する緩衝液に曝露することを含み得る。いくつかの実施形態において、疑似勾配溶出（a pseudo-gradient elution）を行ってもよく、負荷されたクロマトグラフィー媒体を、多数の工程に渡って（例えば４回、５回、６回、７回、８回、それより多いまたは少ない工程）、出発濃度（例えば３００ｍＭ）から０まで、直線的に減少する濃度を有する別個の体積の溶出緩衝液に曝露する。
［０７０］第一の工程は、単位操作プロトコルとして試験が意図される任意のプロセスを含み得る。一般的に、第一の工程は、大規模および反復操作で使用するために適していると考えられる溶液（例えば安全性または毒性の懸念を提示しない溶液）を適用することを含み得る。例えば、第一の工程は、各々、１回または多数回、連続してまたは交互の順序で適用されるＲＯＤＩおよび／または１Ｎ ＮａＯＨの単数または複数の洗浄を含み得る。第二の工程は、評価している単位操作プロトコルが完了した後に、クロマトグラフィー媒体に結合している任意の残留物質をストリップするよう意図される任意の溶液を含み得る。こうした再生プロセスは、本明細書の別の箇所に記載されるが、一般的に、カオトロピック剤、例えば６ＮグアニジンＨＣｌまたは６Ｎ尿素、あるいは溶媒、例えば２０％エタノールを含み得る。
［０７１］本開示に従った評価法は、例えば洗浄／溶出工程およびストリッピング工程中に回収される標的分子の量を測定する工程を含み得る。これらの結果を、多様なクロマトグラフィー媒体間で比較してもよい。比較的大きな割合（percentage）の標的分子が、ストリッピング工程（すなわちクロマトグラフィー媒体の過酷な（rigorous）ストリッピング）中ではなく、洗浄／溶出工程中（すなわち試験しているＨＩＣプロトコル中）に回収されることが好ましい可能性がある。
［０７２］本開示に従った評価法は、試験している単位操作プロトコル中に回収される総標的分子の割合として、ストリッピング工程中の標的分子の回収を決定する工程をさらに含み得る。ストリッピング工程中の標的分子の回収の割合が、あらかじめ決定された閾値（above a predetermined threshold）を超えるならば、単位操作プロトコルは、スケールアップした際および／または多数回反復した際、再生／再使用可能性の問題を引き起こす潜在的な可能性があると予測され得る。ストリッピング工程中の標的分子の回収の割合が、あらかじめ決定された閾値以下（at or below a predetermined threshold）であるならば、単位操作プロトコルは、スケールアップした際および／または多数回反復した際、再生／再使用可能性の問題を引き起こさないと予測され得る。あらかじめ決定される閾値は、単位操作、例えばＨＩＣプロトコル後にクロマトグラフィー媒体に結合したままである残留物（residue）の量の指標となる任意の実験的に決定された閾値であってもよい。いくつかの実施形態において、あらかじめ決定される閾値は、例えば約１％～約１０％の間、例えば約３％～約７％の間、例えば約４％、約５％、または約６％であり得る。
［０７３］多数のクロマトグラフィープロコルを同時に評価する実施形態において、標的分子の回収の割合の上記計算は、多数のクロマトグラフィーに関して一度で決定可能であり、どのプロトコルが、さらなる使用、試験、調査、または開発のために適切であり得るかまたは優先され得るかの最初の印象を生じ得る。さらなる研究のためのプロトコルは、ストリッピング工程に起因し得る回収の標準化割合（a normalized percentage recovery）が１％以下、３％以下、５％以下、７％以下、または１０％以下であり得るウェルを含み得る。
［０７４］いくつかの実施形態において、本開示に従ったクロマトグラフィープロトコル、例えばＨＩＣ単位操作に関するプロトコルを評価する方法を、精製プロセスを開発する初期段階で実行してもよい。例えば、複数のＨＩＣプロトコルを本明細書に記載するように評価してもよく（例えばハイスループットスクリーニングおよび／または溶出アッセイ）、再生／再使用可能性の問題を課すと予測されるＨＩＣプロトコルをさらなる研究から排除するかまたは優先度を下げることが可能である。再生／再使用可能性の問題を課すと予測されないクロマトグラフィープロトコルを、さらなる試験（例えばフルスケール試験）または研究に供して、例えば収量を最大にし、不純物を最小限にし、これらが内部および外部品質基準指針（internal and external quality control guidelines）を満たすことを確認し、反復可能性および寿命（例えばこれらが１０、２５、５０、７５、１００またはそれ以上のサイクル後にカラム変色または他の望ましくない影響を生じないかどうか）を評価することが可能である。
［０７５］いくつかの実施形態において、本開示に従った方法は、そうでなければ１回以上の使用後に生じる可能性がある、再生カラム、媒体、および／または装置の変色を、好適に防止するかまたは減少させ得る（例えば本明細書に論じる実施例６および９を参照されたい）。いくつかの実施形態において、本開示に従った方法は、再生／有用性の課題を提示し得るクロマトグラフィー単位操作のためのプロトコルを、好適に早期に特定することを補助することができ、従って、完全な精製スキームを開発する際にかかり得る時間および費用を節約し、そのクロマトグラフィー工程のためのプロトコルが後にそのような問題を提示することを見出すのみである。
［０７６］ここで、特定の図を参照されたい。図１は、本開示の態様に従って、クロマトグラフィーカラムを再生する方法１００を示す。工程１０２に従って、第一の負荷質量を疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに適用し得る。工程１０４に従って、対象のタンパク質を、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムから収集し得る。工程１０６に従って、単一アルカリ再生溶液をクロマトグラフィーカラムに適用して、カラム中で疎水性相互作用媒体に結合した物質を除去し得る。
［０７７］工程１０２に従って、第一の負荷質量を疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに適用し得る。負荷質量は、標的分子（例えばポリペプチド）ならびに残留成分、例えば宿主細胞タンパク質、細胞破片等を含み得る。工程１０４に従って、対象のタンパク質を疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムから収集し得る。これは、例えば洗浄工程または溶出工程で行われ得る。工程１０６に従って、単一アルカリ再生溶液をクロマトグラフィーカラムに適用して、カラム中の疎水性相互作用媒体に結合した物質を除去し得る。単一アルカリ再生溶液は、上述の１つ以上の特性を有し得る。
［０７８］実施例１
［０７９］ポリソルベート２０（「ＰＳ２０」）とインキュベーションした後、いくつかの試料溶液中の非エステル化遊離脂肪酸（non-esterified free fatty acids）（「ＮＥＦＡ」）の量を測定した。試料中のＮＥＦＡの存在および量は、例えば試料中の不純物、例えば宿主細胞タンパク質によって引き起こされるＰＳ２０分解の指標と解釈される。第一の試料をＨＩＣ負荷質量から採取した。続く１、２、３、５、および１０サイクル後のＨＩＣプールから、５つのさらなる試料を採取した。すべての試料を同じ時間インキュベーションした。以下の表１に示す通り、サイクル１～サイクル５まで、ＰＳ２０分解は、陰性対照と同等の負の割合であると計算された。負のＰＳ２０分解割合は、検出可能なＮＥＦＡがなく、結果として検出可能なリパーゼ活性がないことに相当する。ＮＥＦＡはサイクル５～１０の間で検出可能であり、リパーゼ活性の増加を示す。このデータは、リパーゼ活性がサイクリングの関数として増加し得ることを示す。
［０８０］実施例２
［０８１］図２は、以下に詳述するように、使用または再生溶液への曝露後の多様な状態のＨＩＣ媒体（ＣａｐｔｏＴＭフェニル（Ｈｉｇｈ Ｓｕｂ）（GE Healthcare Life Sciences））のブロット分析を示す。
［０８２］図２からわかるように、６ＮグアニジンＨＣｌと接触させたカラム（カラムＦ）以外は、使用済の各カラムに関して、暗い領域が見える。未処理媒体を代表するカラム（カラムＡ）もまた、暗い領域を示さない。このデータは、６ＮグアニジンＨＣｌが、他の溶液と比較した際、クロマトグラフィーカラムの再生中に残留媒体を除去可能であることを示す。６ＮグアニジンＨＣｌは、従って、ストリッピング剤として、かつ他のストリッピング／再生剤に続いて使用して、こうした他の剤の有効性を評価し得る剤として利用される。
［０８３］実施例３
［０８４］図３は、以下に詳述するように、使用または再生溶液への曝露後の多様な状態のＨＩＣ媒体（ＣａｐｔｏＴＭフェニル（Ｈｉｇｈ Ｓｕｂ））のブロット分析を示す。
［０８５］表３は、用いた媒体のタイプ、および再生剤があるとすれば媒体がどの再生剤に曝露されたかを列挙する。図３からわかるように、ＲＯＤＩ、１．０Ｎ ＮａＯＨ、ＲＯＤＩ、および２０％エタノールを含む再生パラダイム（媒体ＢおよびＣで用いられる）が、媒体から残留物を除去する能力は、６ＮグアニジンＨＣｌ（Ｄ）が媒体から残留物を除去する能力と同程度に完全ではなかった。
［０８６］実施例４
［０８７］図４は、プロセス中、モノクローナル抗体ｍＡｂ １の収集後の５回の衛生化処置（sanitization procedures）を示す重ね合わせ（overlaid）ＵＶクロマトグラムを示す。各衛生化処置は、２カラム体積の第一の０．５Ｎ水酸化ナトリウムフラッシュ（flush）（Ａ）、その後、中断、次いで、１カラム体積の第二の０．５Ｎ水酸化ナトリウムフラッシュ（Ｂ）を含んだ。衛生化は、Ｃ時点で完了すると見なされ、その後、２カラム体積の注射用水（water for injection）（「ＷＦＩ」）フラッシュが行われた（Ｄ）。図４でわかるように、第一の水酸化ナトリウムフラッシュ（Ａ）は、フラッシュの初期部分で高い吸光度（absorbance）を生じ、これは不純物の多量の除去に相関する。ＨＩＣ溶出（再生（regeneration））中に見られる最大吸光度は２．４ＡＵであり、一方、図４の衛生化サイクル中に見られる最大吸光度はおよそ１．４ＡＵであった。
［０８８］実施例５
［０８９］図５は、以下に詳述するように、使用またはストリッピング溶液への曝露後の多様な状態のＨＩＣ媒体（ＣａｐｔｏＴＭフェニル（Ｈｉｇｈ Ｓｕｂ））のブロット分析を示す。特に、用いたＨＩＣ媒体を、減少する濃度のグアニジンに曝露した。
［０９０］図５でわかるように、６ＮグアニジンＨＣｌ（Ｄ）の使用は、ＨＩＣ媒体から大部分の残留物を除去する一方、より低い濃度のグアニジンを有する溶液、および２０％エタノールの溶液は、ＨＩＣ媒体から残留物を除去する際にそれほど有効ではなかった。
［０９１］実施例６
［０９２］図６は、ＣａｐｔｏＴＭフェニル（Ｈｉｇｈ Ｓｕｂ）（GE Healthcare Life Sciences）を含有する２つのカラムを示す。左側のカラムは、モノクローナル抗体ｍＡｂ ２を精製するために４９サイクルのＨＩＣに曝露された。各サイクルは、ＲＯＤＩ、１Ｎ水酸化ナトリウム、ＲＯＤＩ、および２０％エタノールの順序でのカラムの再生を含んだ。４０回目のサイクル後、カラムの底に黄色いバンドが特定された。比較としての右側のカラムは、未処理ＣａｐｔｏＴＭフェニル（Ｈｉｇｈ Ｓｕｂ）ＨＩＣ媒体の代表である。左側のカラムの変色は、再生が不十分であることの指標であり得る。
［０９３］サイクル１および４９からプールを収集し、リパーゼ活性および宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の存在に関して分析した。サイクル１およびサイクル４９の間のリパーゼ活性またはＨＣＰ値に有意な傾向はなかった。
［０９４］実施例７
［０９５］図７Ａおよび７Ｂは、それぞれ、実施例６に関して記載した左側のカラム上で行った、サイクル２および４９のクロマトグラムを示す。図７Ａおよび７Ｂは、以下のように注釈付けされる。
［０９６］サイクル２およびサイクル４９の両方で、ＲＯＤＩは、ＣまたはＣ’後にピークが存在しない（マーカーＸおよびＸ’）ことが示すように、有効なストリッピング溶液ではなかった。１Ｎ ＮａＯＨの導入によって、ピークＰ１（サイクル２）およびＰ３（サイクル４９）が生じ、これは１Ｎ ＮａＯＨが少なくとも部分的にストリッピング溶液として有効であったことを意味する。第二のＲＯＤＩストリップの導入は、ある程度のさらなる不純物を除去し、ピークＰ２（サイクル２）およびＰ４（サイクル４９）を生じた。２０％エタノール溶液の導入はさらなるピークを生じなかった。両方のサイクルからのこのデータは、ＲＯＤＩが、水酸化ナトリウムの前に用いた際には有効なストリッピング溶液ではないことを示す。
［０９７］実施例８
［０９８］各々、標的モノクローナル抗体を含む、２つの負荷質量を、疎水性相互作用クロマトグラフィープロセスに供した。第一のプロセスでは、第一の負荷質量からの標的モノクローナル抗体ｍＡｂ ３の負荷、洗浄および溶出後、クロマトグラフィーカラムを１Ｎ水酸化ナトリウムストリッピング溶液、その後、ＲＯＤＩストリップ、および２０％エタノールストリップに供した。第二のプロセスでは、第二の負荷質量からの標的モノクローナル抗体ｍＡｂ ４の負荷、洗浄および溶出後、クロマトグラフィーカラムをＲＯＤＩストリップ、その後、１Ｎ水酸化ナトリウムストリップ、別のＲＯＤＩストリップ、および２０％エタノールストリップに供した。図８Ａは第一のプロセスに関するクロマトグラムを示し、図８Ｂは第二のプロセスに関するクロマトグラムを示す。各クロマトグラムは以下のように注釈付けされる。
［０９９］図８ＢのマーカーＤ’に示される第一のＲＯＤＩストリップ後（マーカーＸ’）、ピークが存在せず、これは図８Ａ（第一のＲＯＤＩストリップが行われない）のマーカーＸによって示される位置でピークが欠如していることに匹敵する。従って、第一のプロセスで適用される第一のＲＯＤＩストリップの伝導率の減少は、クロマトグラフィーカラムからの物質の認識可能な量の除去を引き起こさなかった。
［０１００］実施例９
［０１０１］ストリッピング溶液としての、かつ図６に示す左側のカラム上の変色を除去するための潜在的な溶液としての６ＮグアニジンＨＣｌの有効性をさらに評価した。カラムを、以下の表に記載するプロトコルに供した。プロトコル中、図９に示すクロマトグラムが生成された。
各溶液は、ダウンフロー方向（すなわちＨＩＣ精製プロセスが流れるのと同じ方向）またはアップフロー方向（すなわちダウンフローと反対、またはカラムを「逆向き」に）のいずれかで、２００ｃｍ／時間の速度でカラムを通じて移動した。６ＮグアニジンＨＣｌの第二の適用（アステリスクによって示す）は、カラム内でおよそ１６時間行われた。
［０１０２］図９のクロマトグラムに示すように、ＲＯＤＩの第一の導入は、ピークＰ１を生じ、ＲＯＤＩの第一の導入後の６ＮグアニジンＨＣｌの第一のストリップは、高いピークＰ２を生じた。フロースルー前にカラム中で一晩保持された６ＮグアニジンＨＣｌの第二のストリップと関連するピークはなかった。これはおそらく、カラムに結合した残留物を除去する際の６ＮグアニジンＨＣｌの第一のストリップの有効性を示す。しかし、全クリーニングプロトコル後、カラムは変色したままであった（図６に示す通り）。
［０１０３］実施例１０
［０１０４］再生パラダイムを詳細に分析した。図１０Ａは、ＣａｐｔｏＴＭフェニル（Ｈｉｇｈ Ｓｕｂ）媒体（GE Life Sciences）を用いてモノクローナル抗体ｍＡｂ ４を精製するＨＩＣ処置のクロマトグラムを示す。再生パラダイムを含むＨＩＣ処置は、以下の工程を含んだ。
［０１０５］図１０Ａを参照すると、ピークＰ１は１Ｎ水酸化ナトリウム導入（Ｅ）に続いており、ピークＰ２は第二のＲＯＤＩストリップ（Ｆ）と一致した。ピークＰ３は６ＮグアニジンＨＣＬ導入（Ｉ）に続いた。
［０１０６］図１０ＢはピークＰ１の拡大画像を示す。第一のＲＯＤＩストリップ（Ｄ）は、検出される吸光度を生じなかった。１Ｎ ＮａＯＨストリップ（Ｅ）は、ピークＰ１の存在によって示されるように、カラムからの残留物の即時かつ早期の除去を生じるようであり、ピークＰ１は、伝導率が増加するにつれてベースラインになるようであった。最初のＲＯＤＩストリップ（Ｄ）は、その除去を促進するのではなく、ある程度の残留物をカラムにより緊密に結合させ得ると仮定される。水酸化ナトリウムによって引き起こされるカラムからの残留物の溶出は、主に、ｐＨによって促進されるが、水酸化ナトリウム（弱いコスモトロープ）の濃度が増加するにつれて、残留タンパク質は、溶液伝導率が増加するにつれ、ＨＩＣ媒体により緊密に結合し得るとさらに仮定される。
［０１０７］実施例１１
［０１０８］使用済のＨＩＣ媒体からの残留物の溶出は、水酸化ナトリウム濃度の関数として観察された。図１１は、モノクローナル抗体ｍＡｂ ４を収集するためのＨＩＣカラムの負荷および洗浄後（セクションＡ中）、ＲＯＤＩのみで始まり、次第に水酸化ナトリウムの濃度を増加させて、１Ｎ水酸化ナトリウムの最大濃度にする（セクションＢ）混合したＲＯＤＩおよび水酸化ナトリウムの２０ ＣＶ勾配をカラム内に負荷したプロセスのクロマトグラムを示す。カラムに～５ｍＭ水酸化ナトリウムを通過させると溶出される、１つの明確なピークＰ１が観察された。ＲＯＤＩおよび１Ｎの最大濃度の水酸化ナトリウムで開始し、次第に０まで水酸化ナトリウムの濃度を減少させる（セクションＣ）、第二の２０ ＣＶ勾配を行い、カラムに負荷した。この第二の勾配中にさらなるピークは観察されなかった。最後に、６ＮグアニジンＨＣｌ溶液を、マークＤでカラムにフラッシュした。カラムに６ＮグアニジンＨＣｌを通過させる間、小さいピークＰ２が観察された。２８０ｎｍ ＵＶ吸光度を積分することによって、各ピークの曲線下面積（Area under the curve）（ＡＵＣ）を計算した。１３，３０５ｍＬ＊ｍＡＵであると計算された対照処置中の６ＮグアニジンＨＣｌストリップのＡＵＣと比較して、ピークＰ２は、１，１６０ｍＬ＊ｍＡＵを有すると計算された。従って、ピークＰ２は対照に比較した際、サイズの９１．３％の減少を示した。
［０１０９］このプロセスは、～５ｍＭの水酸化ナトリウムをカラムに通過させた際、カラムから溶出する結合物質が最大値であり、６ＮグアニジンＨＣｌで溶出する残留媒体は比較的少量しか残らないことを示した。
［０１１０］実施例１２
［０１１１］多様な濃度（１０００ｍＭ、５００ｍＭ、１００ｍＭ、５０ｍＭ、２５ｍＭ、１０ｍＭ、および５ｍＭ）を有する水酸化ナトリウム溶液を、各々、ＨＩＣカラムの負荷および洗浄後に行われる、別個の２溶液再生プロセスにおいて適用した。各再生プロセスは、第一の再生溶液としての水酸化ナトリウム溶液と、第二の再生溶液としての６ＮグアニジンＨＣｌ溶液とを含んだ。再生プロセスに関するクロマトグラムを生成し、これを図１２で重ね合わせる。各再生プロセス中の水酸化ナトリウム溶液は、Ａとラベルされるピーク群に示される、第一のピークを生じた。各再生プロセス中の６ＮグアニジンＨＣｌ溶液は、Ｂとラベルされるピーク群に示される、第二のピークを生じた。５ｍＭ ＮａＯＨを含む再生プロセスは、最大の「Ａ」ピーク（水酸化ナトリウム溶液の適用で溶出する最大残留量を示す）と最小の「Ｂ」ピーク（グアニジンＨＣｌの適用で溶出する最少残留量を示す）を生じると決定された。従って、試験した水酸化ナトリウム溶液の範囲では、５ｍＭ水酸化ナトリウム溶液は、ＨＩＣカラムを再生する際に最も有効であった（すなわちカラムから最も多くの結合物質を除去した）。水酸化ナトリウム濃度が高ければ高いほど、６ＮグアニジンＨＣｌ溶液による除去のため、より多くの残留質量がカラム上に残る。ｐＨの増加は、ＨＩＣカラムからの残留物溶出を促進する一方、伝導率の増加は、残留物とＨＩＣ媒体の間の結合を強化することによって、残留物の溶出を減少させると仮定された。
［０１１２］実施例１３
［０１１３］ＣａｐｔｏＴＭフェニル（Ｈｉｇｈ Ｓｕｂ）媒体（GE Healthcare Life Sciences）で調製したＨＩＣカラムからのｍＡｂ ４の収集後の再生処置によって生じたクロマトグラムピークの曲線下面積（ＡＵＣ）に対して、一元配置分散統計分析（A one-way statistical analysis of variance）を行った。図１３Ａおよび１３Ｂに示すように、対照（Ａ）、ＲＯＤＩ（Ｂ）、および多様な濃度の水酸化ナトリウム溶液（Ｃ～Ｌ）を用いて、再生処置を行った。各再生処置は、ストリッピング溶液（図１３Ａで分析したＡＵＣ）、その後、６ＮグアニジンＨＣｌ溶液（図１３Ｂで分析したＡＵＣ）を含んだ。また、各分析に対して全対Ｔｕｒｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ検定を行って、統計的有意性を示した。
［０１１４］図１３Ａおよび１３Ｂに示すように、０．５ｍＭ ＮａＯＨおよび１ｍＭ ＮａＯＨ再生溶液と関連する処置は、これらの再生溶液のフロースルー中に生じるピークに関して最高のＡＵＣ値（領域１３００中で囲む）を示し、これらの再生溶液が、ＨＩＣカラムからの物質のより有効な除去を引き起こすことを示した。０．５ｍＭ ＮａＯＨ、１ｍＭ ＮａＯＨ、および５ｍＭ ＮａＯＨ再生溶液と関連する処置は、再生溶液に続く６ＮグアニジンＨＣｌ溶液のフロースルー中に生じるピークに関して最低のＡＵＣ値（図１３Ｂの領域１３５０で囲む）を示し、このこともまた、これらの再生溶液が、ＨＩＣカラムからの物質のより効率的な除去を引き起こし、６ＮグアニジンＨＣｌによって除去されるべきものがより少なくしか残っていないことを裏付けた。従って、０．５ｍＭ～５ｍＭ ＮａＯＨの範囲の水酸化ナトリウム濃度を有する溶液は、ＨＩＣカラムの再生に効果的であることが示された。
［０１１５］実施例１４
［０１１６］水酸化ナトリウム溶液を用いた再生プロセスを、塩化ナトリウム溶液を用いた再生プロセスと比較した。ＨＩＣカラムからのモノクローナル抗体ｍＡｂ ５の収集後、３ｍＭ、５ｍＭ、または７ｍＭの濃度を有する水酸化ナトリウムを用いて、あるいは５ｍＭ、８ｍＭ、または１１ｍＭの濃度を有する塩化ナトリウムを用いて、カラムを再生した。各再生溶液のｐＨおよび伝導率にもまた注目した。水酸化ナトリウム溶液は、すべて、１１より大きいｐＨを示す一方、塩化ナトリウム溶液は、すべて、５．５～６．５の間のｐＨを示した。溶液伝導率は同等であった。各プロセスに関して、６ＮグアニジンＨＣｌ溶液を再生溶液の後に各カラムに適用した。クロマトグラムを各プロセスに関して生成し、そのすべてを図１４で重ね合わせた。再生溶液のフロースルーおよび６ＮグアニジンＨＣｌのフロースルーと関連するピークに関して、ＡＵＣを計算した。溶液およびＡＵＣを以下の表に列挙する。
［０１１７］このデータに示されるように、水酸化ナトリウム溶液のフロースルーは、塩化ナトリウム溶液よりも、実質的により高いＡＵＣ値を示した。同様に、水酸化ナトリウム溶液後の６ＮグアニジンＨＣｌのフロースルーは、塩化ナトリウム溶液後の６ＮグアニジンＨＣｌのフロースルーよりも実質的により低いＡＵＣ値を示した。図１４において、水酸化ナトリウムのフロースルーによって生じるピークをマーカーＡによって示し、塩化ナトリウムのフロースルーによって生じるピーク（またはピークの欠如）をマーカーＢによって示す。同様に、水酸化ナトリウム後の６ＮグアニジンＨＣｌのフロースルーによって生じるピーク、および塩化ナトリウム後の６ＮグアニジンＨＣｌのフロースルーによって生じるピークを、それぞれ、マーカーＡ’およびＢ’によって示す。図１４に示すように、水酸化ナトリウム溶液は、塩化ナトリウム溶液よりもより効果的なストリッピング剤であった。
［０１１８］実施例１５
［０１１９］モノクローナル抗体ｍＡｂ ６を精製するために５０サイクルのＨＩＣに供したカラム上で、潜在的なクリーニング／再生溶液を試験した。カラムは、図１５に示すように、カラム床の最上部近くに変色を示した（カラムＡ、Ｂ、およびＣ）。カラムＡを０．５Ｍ ＥＤＴＡの２ ＣＶでフラッシュし、カラムＢを０．５Ｍ酢酸の２ ＣＶでフラッシュし、カラムＣを対照として用いた。どちらの溶液も褐色化／変色を減少させるには無効であった。
［０１２０］実施例１６
［０１２１］３つの水酸化ナトリウム溶液（２ｍＭ、５ｍＭ、および１０ｍＭ）を、モノクローナル抗体ｍＡｂ ６のＨＩＣ精製後の再生溶液として用いた。精製プロセス中で用いるＨＩＣ媒体の再生における各水酸化ナトリウム溶液の有効性は、各水酸化ナトリウム溶液の適用後の６ＮグアニジンＨＣｌストリップと関連するクロマトグラムピークのサイズによって特徴づけられた。グアニジンストリップピークに関連するＡＵＣがより大きければ、ストリップに先行する水酸化ナトリウム溶液によって残る残留量がより多かったことを示し、逆に、グアニジンストリップピークに関連するＡＵＣがより小さければ、ストリップに先行する水酸化ナトリウム溶液によって残る残留量がより少なく、その結果、水酸化ナトリウム再生溶液はより有効であることを示した。図１６は、水酸化ナトリウム濃度の関数としてグアニジンストリップピークＡＵＣを示すグラフを示す。試験した３つの水酸化ナトリウム溶液はすべて、ＲＯＤＩ、１Ｎ水酸化ナトリウム、ＲＯＤＩ、２０％エタノール、およびＲＯＤＩの順序を含むデフォルトクリーニングパラダイムよりも、より有効な再生（すなわちより小さいグアニジンストリップピーク）を示した。５ｍＭ水酸化ナトリウム溶液は、最低のグアニジンストリップピーク面積を有した。データ点から外挿された曲線に基づき、７ｍＭ水酸化ナトリウム再生溶液が、さらにより低いグアニジンストリップピーク面積を生じ得る可能性がある。
［０１２２］実施例１７
［０１２３］対照と示される第一の再生プロセスを、カラムからのモノクローナル抗体ｍＡｂ ５の収集後のＨＩＣカラムに対して用いた。該プロセスを用いてクロマトグラムを精製した。１Ｎ水酸化ナトリウムで始まり、ＲＯＤＩ、２０％エタノール、ＲＯＤＩ、および６ＮグアニジンＨＣｌが続く順序で、多数の溶液を用いた。６ＮグアニジンＨＣｌのフロースルーに対応するクロマトグラムピークを再生プロセスの有効性の測定値として用いた。クロマトグラムを図１７に示す。クロマトグラム上のマーカーは以下の事象を示す。
６ＮグアニジンＨＣｌ溶液のフロースルーに対応するピークのＡＵＣは、７，３９０ｍＬ＊ｍＡＵと計算された。
［０１２４］ＨＩＣカラムからのｍＡｂ ５の収集後、５ｍＭ水酸化ナトリウムを含む第二の再生プロセスを用い、クロマトグラムを生成し、図１８に示した。５ｍＭ水酸化ナトリウムで始まり、ＲＯＤＩ、２０％エタノール、ＲＯＤＩ、５ｍＭ水酸化ナトリウム、ＲＯＤＩ、６ＮグアニジンＨＣｌ、および０．１Ｎ水酸化ナトリウムが続く順序で、多数の溶液を用いた。各溶液のフロースルーに対応するＡＵＣをクロマトグラムから計算し、その結果を以下の表に列挙する。
［０１２５］図１８に示し、上記表中のＡＵＣ値に反映されるように、最初の５ｍＭ ＮａＯＨフロースルーは最大の差で最高のＡＵＣを示した（ピークＡ）。最初の５ｍＭ ＮａＯＨ溶液後にカラムに適用された溶液は、対応するＡＵＣ値が比較的小さいことによって示されるように、ＨＩＣカラムからさらに除去される物質を最小限で提供した。二番目に大きいＡＵＣ値は、６ＮグアニジンＨＣｌのフロースルーに関連したが、８８９ｍＬ＊ｍＡＵで、最初の５ｍＭ ＮａＯＨフロースルーに関連するＡＵＣの値の３０分の１未満であった。さらに、図１７に示す対照プロセス中の６ＮグアニジンＨＣｌピークのＡＵＣ値（７，３９０ｍＬ＊ｍＡＵ）に比較した際、この再生プロセス中の６ＮグアニジンＨＣｌピークのＡＵＣ値がより小さいことから、最初の５ｍＭ ＮａＯＨ溶液は、対照実行に比較した際、ＨＩＣカラムの実質的に改善された再生を提供したことが示された。ＲＯＤＩ、２０％エタノール、６ＮグアニジンＨＣｌ、および０．１Ｎ ＮａＯＨを、５ｍＭ ＮａＯＨ溶液後に用いた際にＨＩＣ再生に対して提供されるさらなる利点は最小限であった。
［０１２６］実施例１８
［０１２７］各々、異なる標的分子（例えば標的モノクローナル抗体）を含み、負荷緩衝液中に異なる濃度のクエン酸塩を含む６つの混合物を、ＣａｐｔｏＴＭフェニル（Ｈｉｇｈ Ｓｕｂ）媒体（GE Life Sciences）を含有するカラム中のＨＩＣに供した。各モノクローナル抗体の溶出後、用いたＨＩＣカラムを、水酸化ナトリウムを全く含まない溶液（純粋なＲＯＤＩ）から始まり１Ｎ水酸化ナトリウムまでの勾配、その後、逆の方向の勾配（１Ｎ水酸化ナトリウムから純粋なＲＯＤＩに戻る）で、ある体積のＲＯＤＩおよび水酸化ナトリウムに供した。最後に、各プロセスは、６ＮグアニジンＨＣｌの負荷およびフロースルーの収集で終了した。以下の表は、各負荷混合物中のｐＨおよびクエン酸塩濃度を示す。
［０１２８］各プロセスに関して、クロマトグラムを生じた；一連のクロマトグラムを図１９に示す。示すように、各クロマトグラムＡ～Ｆは、約５ｍＭ ＮａＯＨのフロースルーでのＨＩＣ媒体に結合した物質の溶出に対応するピーク（Ａ’、Ｂ’、Ｃ’、Ｄ’、Ｅ’、Ｆ’）を含んだ。続くグアニジンＨＣｌフロースルーピークは、極端に小さいかまたは存在しなかった。従って、再生溶液の有効性は、１つのモノクローナル抗体の使用に制限されないことが示された。
［０１２９］実施例１９
［０１３０］異なる条件を有する多数のＨＩＣプロトコルを評価して、こうしたプロトコルが、再生／有用性の問題を課す可能性があるかどうかを評価した。９６ウェルフィルタープレート（ＡｃｒｏＰｒｅｐＴＭＡｄｖａｎｃｅ １ｍＬフィルタープレート、１．２μｍ Ｓｕｐｏｒメンブレン、部品番号８１３０、Pall Corporation）のウェルに、０．０２μＬの以下のような多様なＨＩＣ媒体を充填した。
［０１３１］３つの標的抗体（ｍＡｂ １、ｍＡｂ ２、ｍＡｂ ３）の１つを含有する負荷物質のアリコートを調製し、ＨＩＣ媒体と混合した際、５ｇ／Ｌの濃度を目標として、０．３３ｇ／Ｌの濃度に調整した。３つの標的抗体各々に関して、２Ｍ酢酸または２Ｍ Ｔｒｉｓ塩基を用いて、負荷物質のアリコートを異なるｐＨ（４．５、６．２５、または８．０）に対して滴定して、各々、３つの標的抗体の１つを含み、３つの異なるｐＨ値の１つを示す、総数９つのアリコートを調製した。
［０１３２］１つの媒体タイプを充填したウェルの３つのカラムの各々を、異なるｐＨ（４．５、６．２５、または８．０）で精製プロトコルに供して、媒体およびｐＨの多様な組み合わせを用いた、一連のプロトコルを生じた。各カラム中のウェルの列をグループ分けし、列の各グループを異なる標的抗体（ｍＡｂ １、ｍＡｂ ２、またはｍＡｂ ３）に関するプロトコルに供するようにした。各プロトコルをそれぞれのｐＨで実行するため、それぞれの標的抗体に関して、対応するｐＨの標的抗体を含む負荷物質のアリコート、ならびに対応するｐＨの４０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３００ｍＭクエン酸塩の平衡化緩衝液を用いた。
［０１３３］アレイに対して、以下の工程が同時に行われる。
１． それぞれのｐＨの平衡化緩衝液を用いて、多様なＨＩＣ樹脂を充填したウェルを３回平衡化する。
２． それぞれのｐＨで所望の標的抗体を含む負荷物質を各ウェルに添加し、１時間インキュベーションする。
３． プレートを１１００ｒｐｍで回転させる。
４． フロースルー（例えばインキュベーション中に媒体に結合していない成分）を収集する。
５． 試験している各プロトコルに関して、それぞれのｐＨの平衡化緩衝液を用いて、ウェルを２回洗浄する。
６． それぞれのｐＨの平衡化緩衝液を用いて、疑似勾配溶出を行う。各ウェルを７回反復して平衡化緩衝液に曝露し、クエン酸塩濃度は、７回の反復すべてに渡って、３００ｍＭから０ｍＭに直線的に減少する（反復あたり、４２．９ｍＭの増分）。
７． ウェルを、ＲＯＤＩで２回、１Ｎ水酸化ナトリウムで２回洗浄する。
８． プレートを１１００ｒｐｍで回転させる。
９． ６ＮグアニジンＨＣｌ溶液で２回、ウェルをストリップする。
１０． プレートを１１００ｒｐｍで回転させる。
１． それぞれのｐＨの平衡化緩衝液を用いて、多様なＨＩＣ樹脂を充填したウェルを３回平衡化する。
２． それぞれのｐＨで所望の標的抗体を含む負荷物質を各ウェルに添加し、１時間インキュベーションする。
３． プレートを１１００ｒｐｍで回転させる。
４． フロースルー（例えばインキュベーション中に媒体に結合していない成分）を収集する。
５． 試験している各プロトコルに関して、それぞれのｐＨの平衡化緩衝液を用いて、ウェルを２回洗浄する。
６． それぞれのｐＨの平衡化緩衝液を用いて、疑似勾配溶出を行う。各ウェルを７回反復して平衡化緩衝液に曝露し、クエン酸塩濃度は、７回の反復すべてに渡って、３００ｍＭから０ｍＭに直線的に減少する（反復あたり、４２．９ｍＭの増分）。
７． ウェルを、ＲＯＤＩで２回、１Ｎ水酸化ナトリウムで２回洗浄する。
８． プレートを１１００ｒｐｍで回転させる。
９． ６ＮグアニジンＨＣｌ溶液で２回、ウェルをストリップする。
１０． プレートを１１００ｒｐｍで回転させる。
［０１３４］各ウェルに関して、ウェルから除去した物質（フロースルー、溶離液、洗浄液等）中の標的ポリペプチドのクロマトグラムを生成した。結果を分析するため、各クロマトグラムを３つのゾーンに分け、第一のゾーンは、工程２、３、および４（フロースルー、洗浄、および溶出）中に除去された物質中で観察される標的ポリペプチドの質量を含み、第二のゾーンは、工程５、６、７、８（ＲＯＤＩおよび１Ｎ水酸化ナトリウムを用いる）中に除去された物質中で観察される標的ポリペプチドの質量を含み、第三のゾーンは、工程９、１０（６ＮグアニジンＨＣｌを用いる）中に除去された物質中で観察される標的ポリペプチドの質量を含んだ。６．２５のｐＨと、３つの異なるＨＩＣ媒体（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＴＭヘキシル－６５０Ｃ、フェニルセファロース６ 高速フロー（Ｈｉｇｈ Ｓｕｂ）、およびＰＯＲＯＳＴＭエチル）各々で、標的抗体ｍＡｂ １を精製するプロトコルから生成され、３つのゾーンに分割された、３つのクロマトグラムの例を、図２０Ａ～２０Ｃに示す。
［０１３５］比較は、試験ウェルに対して行ったプロトコルおよび分析と、大規模カラムに対して行ったプロトコルおよび分析と、９８％の統計的に有意な精度で整合することを示す。
［０１３６］実施例２０
［０１３７］本明細書記載のハイスループットスクリーニング技術を用いたデータの収集総計によって、改善された効率および収量のＨＩＣプロトコルの開発に情報を与え得る、予測機能（predictive functions）の開発が可能になる。例えば、多数のパラメーター（例えばｐＨ、溶出緩衝液クエン酸塩濃度、負荷質量、ＨＩＣ媒体選択）と、プロトコルの効率または収量のいずれかの間の関係を記載する、境界関数をプロットしてもよい。
［０１３８］図２１Ａは、媒体リットルあたり１００ｇの負荷での、所定の抗体およびフェニルセファロースＴＭ媒体に関するハイスループットスクリーニングデータの収集総計に基づく、ＨＩＣプロトコルの予測される収量に対する、溶出緩衝液クエン酸濃度およびｐＨに関する境界関数のプロットである。斜線領域（The shaded area）は、理論的収量の９０％未満の予測収量を生じるＨＩＣプロトコルパラメーターの組み合わせに相当する。この境界関数は、所定の抗体およびフェニルセファロースＴＭ媒体を含むＨＩＣプロトコルに関して、どのクエン酸塩およびｐＨパラメーターを考慮すべきかの情報を与える。斜線領域の外のｐＨおよびクエン酸塩濃度の組み合わせは、所定の抗体およびフェニルセファロースＴＭ媒体に関する利用可能なＨＩＣプロトコルパラメーターである一方、斜線領域内のｐＨおよびクエン酸塩濃度の組み合わせは排除されるパラメーターである。
［０１３９］図２１Ｂは、媒体リットルあたり１００ｇの負荷での、所定の抗体およびＣａｐｔｏＴＭフェニル（Ｈｉｇｈ Ｓｕｂ）クロマトグラフィー媒体に関するハイスループットスクリーニングデータの収集総計に基づく、ＨＩＣプロトコルの予測される収量に対する、溶出緩衝液クエン酸塩濃度およびｐＨに関する境界関数のプロットである。斜線領域は、理論的収量の９０％未満の予測収量を生じるＨＩＣプロトコルパラメーターの組み合わせに相当する。この境界関数は、所定の抗体およびＣａｐｔｏＴＭフェニル（Ｈｉｇｈ Ｓｕｂ）媒体を含むＨＩＣプロトコルに関して、どのクエン酸塩およびｐＨパラメーターを考慮すべきかの情報を与える。斜線領域の外のｐＨおよびクエン酸塩濃度の組み合わせは、所定の抗体およびＣａｐｔｏＴＭフェニル（Ｈｉｇｈ Ｓｕｂ）媒体に関する利用可能なＨＩＣプロトコルパラメーターである一方、斜線領域内のｐＨおよびクエン酸塩濃度の組み合わせは排除されるパラメーターである。
［０１４０］上述の境界関数に加えて、ハイスループットスクリーニングから収集されるデータは、ＨＩＣプロトコルの設計を補助し得る、伝達関数（a transfer function）または他の数学的モデルの発展を可能にし得る。例えば、伝達関数は、溶出アッセイ、ハイスループットスクリーン、または実験室規模のＨＩＣプロトコル由来のデータを、フルスケールＨＩＣプロトコルに関連させるように回帰され得る。例えば、予測される収量（例えば小規模アッセイまたはハイスループットスクリーニングによって予測される収量）を含むＨＩＣプロトコルセットに関して、フルスケールクロマトグラフィーを通じて、各ＨＩＣプロトコルに関して実際の収量を決定してもよい。予測される収量および実際の収量の間の関係を回帰して、予測モデルを改善することが可能である。溶出アッセイ、ハイスループットスクリーン、または実験室規模ＨＩＣプロトコル由来のデータに適用した際の回帰関係（例えば伝達関数）に基づいて、将来予測される収量を少なくとも部分的に計算することが可能である。
［０１４１］１つ以上の伝達関数、境界関数、および／または予測モデルを組み合わせて、動的予測モデルを開発してもよい。図２２を参照すると、動的予測モデルが示される。動的予測モデルは、１つ以上のＨＩＣプロトコルパラメーター（例えばｐＨ、クエン酸塩濃度、負荷質量、クロマトグラフィー樹脂）への変化が、どのようにＨＩＣプロトコルの定量化される特性に影響を及ぼすかを計算する。例えば、図２２に示す例において、その結果、選択されるプロトコルパラメーターは、６のｐＨ、３０ｍＭのクエン酸塩濃度、ＨＩＣ媒体リットルあたりの１００ｇの負荷質量、および樹脂Ｃ（例えばフェニルセファロースＴＭ媒体）を含む。次いで、モデルは、これらのパラメーターの各々が、予測される収量、高分子量画分（a high molecular weight fraction）、および選択されるパラメーターでＨＩＣプロトコルを用いて収集される溶出液のプール宿主細胞タンパク質濃度にどのように影響を及ぼすかを示す。図２２に示すように、選択されるパラメーターは、およそ９５％の予測収量、およそ１．３の高分子量画分、およびおよそ２２．５ｐｐｍのプール宿主細胞タンパク質濃度を生じる。これらの定量化された特性を、ＨＩＣプロトコルの評価に用いてもよく、プロトコルパラメーターがＨＩＣプロトコルの産物にどのように影響を及ぼすかの情報を与え得る。動的モデルによって計算された定量化された特性に関する値を、プロトコルパラメーターを改変するにつれてリアルタイムで更新し得る。
［０１４２］いくつかの実施形態において、プロトコルの定量化された特性の複合（例えば予測される収量、高分子量画分、およびプール宿主細胞タンパク質濃度の複合）として、全体の望ましさ（desirability）もまた計算し得る。望ましさの計算は、ＨＩＣプロトコルの定量的特性の加重に基づいてもよい。例えばプロトコルの収量に影響を及ぼすＨＩＣプロトコルに対する変化は、効率に影響を及ぼす変化よりより重要であり得る。動的予測モデルは、定量的な測定の相対的な重要性を考慮に入れ、これらが全体の望ましさに不均等に影響を及ぼすように、異なる測定に加重を割り当ててもよい。いくつかの実施形態において、さらなるクロマトグラフィーデータ（例えば小規模アッセイ、ハイスループットスクリーニング、およびフルスケールクロマトグラフィー実行からのデータ）が収集され、統合されるにつれて、動的予測モデルを更新してもよい。
［０１４３］実施例２１
［０１４４］異なる標的分子および多様なｐＨでのＨＩＣ媒体の組み合わせを含む、多数のＨＩＣプロトコルを、勾配溶出アッセイで試験して、こうした組み合わせが、再生／有用性の問題を課す可能性があるかどうか、標的分子およびＨＩＣ媒体組み合わせのいずれかが、さらなるＨＩＣプロトコルの開発から除外されるべきであるかどうかを決定した。
［０１４５］９６ウェルフィルタープレート（ＡｃｒｏＰｒｅｐＴＭＡｄｖａｎｃｅ １ｍＬフィルタープレート、１．２μｍ Ｓｕｐｏｒメンブレン、部品番号８１３０、Pall Corporation）のウェルに、０．０２μＬの多様なＨＩＣ媒体を充填した。標的分子を含有する負荷物質のアリコートを調製し、ＨＩＣ媒体と混合した際、５ｇ／Ｌの濃度を目標として、０．３３ｇ／Ｌの濃度に調整した。３つの標的抗体各々に関して、２Ｍ酢酸または２Ｍ Ｔｒｉｓ塩基を用いて、負荷物質のアリコートをいくつかの異なるｐＨ（例えば４．５、６．２５、または８．０）に対して滴定して、各々、標的抗体を含み、異なるｐＨ値を示す、いくつかのアリコートを調製した。
［０１４６］１つの媒体タイプを充填した９６ウェルプレートの各ウェルを、異なるｐＨ（４．５、６．２５、または８．０）でＨＩＣプロトコルに供して、媒体およびｐＨの多様な組み合わせを用いて行う、一連のプロトコルを生じた。
［０１４７］アレイに対して、以下の工程が同時に行われる。
１． それぞれのｐＨの平衡化緩衝液を用いて、多様なＨＩＣ樹脂を充填したウェルを３回平衡化する。
２． それぞれのｐＨで所望の標的分子を含む負荷物質を各ウェルに添加し、１時間インキュベーションする。
３． プレートを１１００ｒｐｍで回転させる。
４． フロースルー（例えばインキュベーション中に媒体に結合していない成分を含む）を収集する。
５． 試験している各プロトコルに関して、それぞれのｐＨの平衡化緩衝液を用いて、ウェルを３回洗浄する。
６． 疑似溶出を行う。各ウェルを７回反復して溶出緩衝液に曝露し、プレートを１１００ｒｐｍで回転させ、各反復後に溶出液を収集する。
７． ウェルを、ＮａＯＨで２回洗浄する。アレイの異なるウェルは異なる濃度のＮａＯＨを使用してもよい。例えば、２つのウェルは、同じクロマトグラフィー媒体を含んでもよく、同じｐＨで負荷されるが、一方のウェルでは５ｍＭ ＮａＯＨ洗浄を用い、他方のウェルでは１Ｎ ＮａＯＨ洗浄を用いる。各洗浄後、プレートを１１００ｒｐｍで回転させ、洗浄液を収集する。
８． ６ＮグアニジンＨＣｌ溶液で２回、ウェルをストリップし、ストリップ物質（the stripped material）を収集する。
１． それぞれのｐＨの平衡化緩衝液を用いて、多様なＨＩＣ樹脂を充填したウェルを３回平衡化する。
２． それぞれのｐＨで所望の標的分子を含む負荷物質を各ウェルに添加し、１時間インキュベーションする。
３． プレートを１１００ｒｐｍで回転させる。
４． フロースルー（例えばインキュベーション中に媒体に結合していない成分を含む）を収集する。
５． 試験している各プロトコルに関して、それぞれのｐＨの平衡化緩衝液を用いて、ウェルを３回洗浄する。
６． 疑似溶出を行う。各ウェルを７回反復して溶出緩衝液に曝露し、プレートを１１００ｒｐｍで回転させ、各反復後に溶出液を収集する。
７． ウェルを、ＮａＯＨで２回洗浄する。アレイの異なるウェルは異なる濃度のＮａＯＨを使用してもよい。例えば、２つのウェルは、同じクロマトグラフィー媒体を含んでもよく、同じｐＨで負荷されるが、一方のウェルでは５ｍＭ ＮａＯＨ洗浄を用い、他方のウェルでは１Ｎ ＮａＯＨ洗浄を用いる。各洗浄後、プレートを１１００ｒｐｍで回転させ、洗浄液を収集する。
８． ６ＮグアニジンＨＣｌ溶液で２回、ウェルをストリップし、ストリップ物質（the stripped material）を収集する。
［０１４８］各ウェルに関して、ウェルから除去した物質（フロースルー、溶離液、洗浄液等）中の標的分子のクロマトグラムを生成した。結果を分析するため、各クロマトグラムを３つのゾーンに分け、第一のゾーンは、工程２、３、および４（フロースルー、洗浄、および溶出）中に除去された物質中で観察される標的分子の質量を含み、第二のゾーンは、工程５、６、７（ＲＯＤＩおよびＮａＯＨを用いる）中に除去された物質中で観察される標的分子の質量を含み、第三のゾーンは、工程８（６ＮグアニジンＨＣｌを用いる）中に除去された物質中で観察される標的分子の質量を含んだ。
［０１４９］第一の標的分子に関する溶出アッセイから生成されたクロマトグラムの例を、図２３Ａ～２６Ｃに示す。図２３Ａ～２３Ｃは、ＣａｐｔｏＴＭフェニル（Ｈｉｇｈ Ｓｕｂ）媒体上での第一の標的分子を含む溶出アッセイのクロマトグラムを示し、図２４Ａ～２４Ｃは、ＣａｐｔｏＴＭブチル媒体上での第一の標的分子を含む溶出アッセイのクロマトグラムを示し、図２５Ａ～Ｃは、ＰＯＲＯＳＴＭベンジル媒体上での第一の標的分子を含む溶出アッセイのクロマトグラムを示し、図２６Ａ～Ｃは、フェニルセファロース（Ｒ）媒体上での第一の標的分子を含む溶出アッセイのクロマトグラムを示す。図２３Ａ、２４Ａ、２５Ａ、および２６Ａは、４．５のｐＨでの溶出アッセイ実行のクロマトグラムを示し、図２３Ｂ、２４Ｂ、２５Ｂ、および２６Ｂは、６．２５のｐＨでの溶出アッセイ実行のクロマトグラムを示し、図２３Ｃ、２４Ｃ、２５Ｃ、および２６Ｃは、８のｐＨでの溶出アッセイ実行のクロマトグラムを示す。図２３Ａ～２６Ｃにおいて、点線は、５ｍＭ ＮａＯＨ洗浄を含む溶出アッセイからのクロマトグラムを示し、実線は、１Ｎ ＮａＯＨ洗浄を含む溶出アッセイからのクロマトグラムを示す。
［０１５０］第二の標的分子に関する溶出アッセイから生成されたクロマトグラムの例を、図２７Ａ～２８Ｄに示す。図２７Ａ～２８の各図は、３つのクロマトグラムを示し、各々、異なるｐＨの溶出アッセイ実行に由来する。図２７Ａは、ＣａｐｔｏＴＭフェニル（Ｈｉｇｈ Ｓｕｂ）媒体上での溶出アッセイ実行からのクロマトグラムを示し、図２７Ｂは、ＣａｐｔｏＴＭブチル媒体上での溶出アッセイ実行からのクロマトグラムを示し、図２７Ｃは、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＴＭフェニル－６５０Ｃ媒体上での溶出アッセイ実行からのクロマトグラムを示し、図２７Ｄは、ＰＯＲＯＳＴＭエチル媒体上での溶出アッセイ実行からのクロマトグラムを示し、図２８Ａは、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＴＭヘキシル－６５０Ｃ媒体上での溶出アッセイ実行からのクロマトグラムを示し、図２８Ｂは、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＴＭブチル－６５０Ｃ媒体上での溶出アッセイ実行からのクロマトグラムを示し、図２８Ｃは、ＰＯＲＯＳＴＭベンジル媒体上での溶出アッセイ実行からのクロマトグラムを示し、図２８Ｄは、フェニルセファロース（Ｒ）媒体上での溶出アッセイ実行からのクロマトグラムを示す。図２７Ａ～２８Ｄにおいて、点線は、５ｍＭ ＮａＯＨ洗浄を含む溶出アッセイからのクロマトグラムを示し、実線は、１Ｎ ＮａＯＨ洗浄を含む溶出アッセイからのクロマトグラムを示す。
［０１５１］クロマトグラムからわかるように、１Ｎ ＮａＯＨストリップを含むすべての試験したプロトコルは、５ｍＭ ＮａＯＨストリップを含む匹敵するプロトコルよりも、大きな割合の標的分子質量を含んだ。すなわち、５ｍＭ ＮａＯＨストリップに比較して、１Ｎ ＮａＯＨストリップ後にカラムに結合したままである標的分子はより多かった。
［０１５２］所定の標的分子に関して、異なるＨＩＣプロトコルのクロマトグラムを比較することによって、特定のＨＩＣ媒体および／またはｐＨは考慮から除外され得る。一連の溶出アッセイを用いて、望ましくない標的分子、ＨＩＣ媒体、およびｐＨの組み合わせを考慮から除外すると、ＨＩＣプロトコルを開発し試験するスピードが改善され得る。例えば、標的分子の５％より多く（例えば１０％より多く）がゾーン３中で溶出することを示すクロマトグラムは、所定のＨＩＣ媒体、ｐＨ、および標的分子の組み合わせが、ＨＩＣプロトコルへの統合に適していないことを示し得る。
［０１５３］溶出アッセイを用いて、ＨＩＣ媒体、ｐＨ、および標的分子を考慮から除外することに加えて、クロマトグラムから計算されるゾーン３質量を、伝達関数を通じて変換して、フルスケールクロマトグラフィー実行中に、ゾーン３中で溶出する標的分子の質量を予測することが可能である。この予測質量を用いて、ＨＩＣ媒体、ｐＨ、および標的分子の組み合わせを考慮から除外することもまた可能である。多様な組み合わせのＨＩＣ媒体およびｐＨを用いた一連のＨＩＣプロトコル中の所定の標的分子に関する、計算されるゾーン３標的分子回収の例示的なリストを、表１４に示す。
［０１５４］表１４でわかるように、４．５のｐＨのＣａｐｔｏＴＭフェニル（Ｈｉｇｈ Ｓｕｂ）媒体上の所定の標的分子を含む溶出アッセイは、３８．２％の回収の標準化割合を生じた。この結果は、伝達関数を通じて変換すると、１０．６％のフルスケールゾーン３の回収を生じる。あらかじめ決定された閾値が１０％である実施形態において、これは閾値よりも高く、従って、標的分子、ＣａｐｔｏＴＭフェニル（Ｈｉｇｈ Ｓｕｂ）媒体、および４．５のｐＨの組み合わせは、さらなるＨＩＣプロトコルの開発から除外される。いくつかの実施形態において、所定の標的分子に関する媒体およびｐＨの組み合わせの除外が保証されると、その媒体およびｐＨの組み合わせはまた、他の標的分子を含むさらなるプロトコルの開発からも除外され得る。
［０１５５］当業者は、本開示が基づく概念は、本開示のいくつかの目的を実行するため、他の方法およびシステムを設計するための基礎として容易に用いられ得ることを認識するであろう。従って、請求項は、前述の説明によって限定されるとは見なされないものとする。
Claims (26)
- 負荷質量が適用されている疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムを再生する方法であって、
アルカリ溶液の１以上のカラム体積を、該カラム内の疎水性相互作用媒体に通過させることを含み、前記アルカリ溶液が約１０～約１４の間のｐＨ、および約０．５ｍＳ／ｃｍ～約１０ｍＳ／ｃｍの間の伝導率を示し、
疎水性相互作用媒体に結合した物質が除去される、方法。 - アルカリ溶液が水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、またはＴｒｉｓの１つを含む、請求項１に記載の方法。
- アルカリ溶液が約０．８ｍＳ／ｃｍ～約１．６ｍＳ／ｃｍの間の伝導率を示す、請求項１に記載の方法。
- アルカリ溶液が、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭの間の総溶解塩濃度を含む、請求項１に記載の方法。
- 疎水性相互作用媒体に結合した物質の除去後、負荷質量の約１．０％未満が残留質量として疎水性相互作用媒体に結合したままである、請求項１に記載の方法。
- 媒体から除去される物質が、宿主細胞タンパク質、凝集タンパク質、脂質、ポリペプチド断片、生体分子、または核酸を含む、請求項１に記載の方法。
- 媒体から除去される物質が、細菌または真菌を含まない、請求項１に記載の方法。
- 方法が、カオトロピック剤または有機溶媒と疎水性相互作用媒体を接触させることを含まない、請求項１に記載の方法。
- アルカリ溶液の１以上のカラム体積を該カラム内の疎水性相互作用媒体に通過させる工程が、約１０分間～約１時間かかる、請求項１に記載の方法。
- 負荷質量が適用されているクロマトグラフィーカラムを再生する方法であって、
アルカリ溶液の１以上のカラム体積を、該カラム内の媒体に通過させることを含み、前記アルカリ溶液が約０．５ｍＭ～約５０ｍＭの間の総溶解濃度の水酸化ナトリウムを含み、
媒体に結合した物質が除去される、方法。 - 媒体が、脂肪族または芳香族立体配置の２～１０の間の炭化水素を有するリガンドを含むマトリックスを含む、請求項１０に記載の方法。
- リガンドが、媒体ｍｌあたり約２０～約３０μｍｏｌの間の密度で媒体中に存在する、請求項１１に記載の方法。
- 媒体が３０以上の炭化水素を含むリガンドを含まない、請求項１０に記載の方法。
- クロマトグラフィーカラムが混合モードのクロマトグラフィープロセスで使用されない、請求項１０に記載の方法。
- 媒体が架橋アガロースおよびフェニルリガンドを含むマトリックスを含む、請求項１０に記載の方法。
- 方法が、アルコール、エチレングリコール、または塩化ナトリウムと媒体を接触させることを含まない、請求項１０に記載の方法。
- アルカリ溶液の１以上のカラム体積をカラム内に通過させた後、カオトロピック剤の１以上のカラム体積を該カラム内に通過させることをさらに含み、前記カオトロピック剤が６Ｎ塩酸グアニジンまたは８Ｎ尿素の一方である、請求項１０に記載の方法。
- 保管用のクロマトグラフィーカラムを調製する方法であって、
請求項１０の方法を実行すること；および
約０．０５Ｍ～約０．１５Ｍの間の総溶解濃度の水酸化ナトリウムを含む保管緩衝液と、カラムを接触させること
を含む、方法。 - クロマトグラフィーカラムを再使用するための方法であって、
クロマトグラフィーカラムに第一の負荷質量を適用すること；
請求項１０に記載の方法を該クロマトグラフィーカラムに対して実行すること；および
該クロマトグラフィーカラムに第二の負荷質量を適用すること
を含み、
前記方法が該クロマトグラフィーカラムをクリーニングすることを含まない、方法。 - 疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム再生溶液のためのアルカリ溶液の濃度を特定する方法であって、
第一の溶液のある体積を、該カラム内の疎水性相互作用媒体に通過させることであって、前記第一の溶液が水と、約０Ｎから始まってほぼ一定の比率で最大濃度まで増加する濃度のアルカリ溶液とを含み；
第二の溶液のある体積を、疎水性相互作用媒体に通過させることであって、前記第二の溶液が水と、最大濃度から始まってほぼ一定の比率で約０Ｎまで減少する濃度のアルカリ溶液とを含み；および
疎水性相互作用媒体を通過する時に、疎水性相互作用媒体に結合した物質を除去する、第一または第二の溶液の部分を特定すること
を含む、方法。 - アルカリ溶液が水酸化ナトリウムを含み、最大濃度が約１Ｎである、請求項２０に記載の方法。
- 第一の溶液の体積および第二の溶液の体積が、各々、約２０カラム体積である、請求項１８に記載の方法。
- 複数のクロマトグラフィープロトコルを評価する方法であって、各々のクロマトグラフィープロトコルがクロマトグラフィー媒体、プロトコルｐＨ、および標的分子を含み、
各クロマトグラフィープロトコルについて：
フィルタープレートウェル中で、標的分子を含有する負荷質量を、ある体積のクロマトグラフィー媒体に添加し、フィルタープレートウェルからフロースルーを収集することであって、前記負荷質量がプロトコルｐＨを示し；
クロマトグラフィー媒体を含む緩衝液の複数のアリコートを添加して、クロマトグラフィー媒体から溶離液を得ることであって、前記緩衝液が緩衝液ｐＨを示し、コスモトロピック塩の濃度が複数のアリコートにわたって直線的に減少し、かつ標的分子の第一の量がフロースルーおよび溶離液を合わせた中に含まれ；
第二の溶液をクロマトグラフィー媒体に添加して、クロマトグラフィー媒体から標的分子の第二の量を抽出すること；および
カオトロピック剤をクロマトグラフィー媒体に添加して、クロマトグラフィー媒体から標的分子の第三の量を抽出すること
を含む、方法。 - 前記プロトコルの１つを用いて、疎水性相互作用クロマトグラフィーを含むクロマトグラフィー単位操作を用意することをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
- フィルタープレートを用いて、複数のクロマトグラフィープロトコルに対して方法を同時に実行することを含む、請求項２３に記載の方法。
- 負荷質量が約２０ｍｇ未満の標的分子を含む、請求項２３に記載の方法。
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