KR20210126699A - 2개 이상의 항체를 포함하는 조성물의 제조 - Google Patents

Abstract

본 발명은 적어도 2개의 항체를 생성하는 수단 및 방법에 관한 것이다. 본 방법은 항체를 인코딩하는 핵산을 세포에 제공하는 단계; 상기 세포를 배양하는 단계; 배양물로부터 항체를 수집하는 단계; 및
이온 교환 크로마토그래피(IEX)에 의해 절반 항체로부터, 생성된 항체를 분리하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 사용된 IEX 조건 하에서 개별 항체의 체류 시간의 평균으로부터 10% 이하만큼 벗어나는 IEX 체류 시간을 나타낸다. 본 발명은 또한, 그에 따라 생성된 항체의 조성물에 관한 것이다. 일부 태양에서, 본 발명은 2 내지 10개의 재조합 항체를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 상기 항체들 중 적어도 2개의 IEX 체류 시간이 IEX 조건 하에서 개별 항체의 체류 시간의 평균으로부터 10% 이하만큼 벗어나는 것을 특징으로 한다. 이는 또한, 2 내지 10개의 재조합 항체를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 상기 항체들 중 적어도 2개의 pI가 상기 적어도 2개의 항체의 평균 pI로부터 0.4 단위 이하만큼 상이한 것을 특징으로 한다.

Description

2개 이상의 항체를 포함하는 조성물의 제조

본 발명은 항체 분야, 특히 치료적 항체 분야에 관한 것이다. 항체는 인간의 치료에 사용될 수 있다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 다수의 항체들의 생성 및/또는 정제에 관한 것이다. 단일 숙주 세포는 다수의 항체들을 생성할 수 있다. 항체들은 또한, 항체들 중 하나를 각각 생성하는 숙주 세포들의 혼합물에 의해 생성될 수 있다. 본 발명은 또한 이러한 항체들을 포함하는 조성물을 생성하고 이러한 항체들을 정제하는 방법에 관한 것이다.

다중클론 항체는 전형적으로 대상체의 혈액으로부터 수집된다. 다중클론 항체의 이점은 병원체가 다수의 표적 및 에피토프를 통해 공격을 받는다는 것이다. 단일클론 또는 재조합 항체의 이점은 이러한 항체가 잘 정의된 작용 및 독성 스펙트럼을 갖는 정밀 약제로서 이용되게 하는 잘 특성화된 특이성 및 기능이다.

단일클론 항체의 특이성은 또한, 특히 다수의 표적이 다루어져야 할 필요가 있는 경우, 단점일 수 있다. 약제에 더 많은 항체를 부가함으로써 이러한 단점을 줄이는 것이 가능하지만, 단일 치료적 항체조차도 고가일 수 있다는 점을 고려하면, 이러한 다중클론 칵테일의 비용이 빠르게 고가로 될 수 있다고 생각된다.

이중-, 삼중- 및 기타 다중특이성 항체의 개발은 다중클론 항체의 일부 양태를 항체 치료제에 도입하는 데 성공했다. 표적의 수의 증가 외에도, 이는 또한, 전통적인 단일특이성 단일- 또는 다중클론 항체로는 이전에 달성할 수 없었던 추가 기능을 성공적으로 도입하였다. 동일한 치료에서 다수의 이중-, 삼중- 및 기타 다중특이성 항체를 사용하면 더 추가의 이점을 제공할 수 있다.

본 발명은 단일 숙주 세포 또는 대안적으로 숙주 세포들의 혼합물로부터 생성된 다수의 항체 치료제의 정제를 위한 강건하고 경제적인 방법을 설명함으로써 당업계의 진보를 제공한다. 본 발명은 2개 이상의 항체, 바람직하게는 다중특이성 항체들의 수집물의 경제적 생성에 특히 유용하다.

본 발명은 적어도 2개의 다중특이성 항체를 생성하는 방법을 제공하는데, 본 방법은

- 다중특이성 항체를 인코딩하는 핵산을 세포에 제공하는 단계;

- 상기 세포를 배양하는 단계;

- 배양물로부터 다중특이성 항체를 수집하는 단계; 및

- 이온 교환 크로마토그래피(IEX)에 의해 절반 항체(half-antibody), 및 선택적으로 단일특이성 항체 및/또는 다른 원치 않는 항체 생성물 관련 불순물로부터, 생성된 다중특이성 항체를 분리하는 단계를 포함하고,

본 방법은 다중특이성 항체가 사용된 IEX 조건 하에서 개별 다중특이성 항체의 체류 시간의 평균으로부터 10% 이하만큼 벗어나는 IEX 체류 시간을 나타내는 것을 특징으로 한다. 각각의 절반 항체 및 선택적으로 단일특이성 항체 및/또는 다른 원치 않는 항체 생성물 관련 불순물의 체류 시간은 바람직하게는 다중특이성 항체의 체류 시간이 걸쳐있는 범위 밖에 있다.

본 발명은 또한 적어도 2개의 다중특이성 항체를 생성하는 방법을 제공하는데, 본 방법은

- 다중특이성 항체를 인코딩하는 핵산을 세포에 제공하는 단계;

- 상기 세포를 배양하는 단계;

- 배양물로부터 다중특이성 항체를 수집하는 단계; 및

- 이온 교환 크로마토그래피(IEX)에 의해 절반 항체, 및 선택적으로 단일특이성 항체 및/또는 다른 원치 않는 항체 생성물 관련 불순물로부터, 생성된 다중특이성 항체를 분리하는 단계를 포함하고,

본 방법은 다중특이성 항체가 사용된 IEX 조건 하에서 본질적으로 동일한 IEX 체류 시간을 나타내는 것을 특징으로 한다. 각각의 절반 항체 및 선택적으로 단일특이성 항체 및/또는 다른 원치 않는 항체 생성물 관련 불순물의 체류 시간은 바람직하게는 항체의 체류 시간이 걸쳐있는 범위 밖에 있다.

본 발명은 적어도 2개의 항체를 생성하는 방법을 추가로 제공하는데, 여기서 항체는 단일특이성 및/또는 다중특이성 항체를 포함하며, 본 방법은

- 항체를 인코딩하는 핵산을 세포에 제공하는 단계;

- 상기 세포를 배양하는 단계;

- 배양물로부터 항체를 수집하는 단계; 및

- 이온 교환 크로마토그래피(IEX)에 의해 절반 항체로부터, 생성된 항체를 분리하는 단계를 포함하고,

본 방법은 항체가 사용된 IEX 조건 하에서 본질적으로 동일한 IEX 체류 시간을 나타내는 것을 특징으로 한다. 각각의 절반 항체 및 선택적으로 단일특이성 항체의 체류 시간은 바람직하게는 항체의 체류 시간이 걸쳐있는 범위 밖에 있다.

본 발명은 또한, 본 명세서에 기재된 방법에 의해 얻을 수 있는 2 내지10개의 재조합 항체를 포함하는 조성물을 제공한다.

다중특이성 항체와 같은 2 내지 10개의 재조합 항체를 포함하는 조성물이 또한 제공되는데, 상기 항체들 중 적어도 2개의 IEX 체류 시간이 사용된 IEX 조건 하에서 개별 항체의 체류 시간의 평균으로부터 10% 이하만큼 벗어나는 것을 특징으로 한다.

2 내지 10개의 재조합 항체를 포함하는 조성물이 추가로 제공되는데, 상기 항체들 붕 적어도 2개의 IEX 체류 시간이 본질적으로 동일한 것을 특징으로 한다.

2 내지 10개의 재조합 항체를 포함하는 조성물이 또한 제공되는데, 상기 항체들 중 적어도 2개의 등전점(pI)이 바람직하게는 상기 적어도 2개의 항체의 평균 pI로부터 0.4 단위, 0.3, 0.2 및 바람직하게는 0.1 단위 이하만큼 상이한 것을 특징으로 한다. 상기 적어도 2개의 항체 각각의 pI는 바람직하게는 0.25 단위 이하만큼 서로 상이하다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 항원 상의 에피토프와 결합하는 하나 이상의 도메인을 함유하는, 단백질의 면역글로불린 부류에 속하는 단백질성 분자를 의미하는데, 여기서 그러한 도메인은 항체의 가변 영역이거나 그로부터 유래되거나 그와 서열 상동성을 공유한다. 항체는 전형적으로 기본 구조 단위들로 구성되며, 이들 각각은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 갖는다. 치료적 용도를 위한 항체는 바람직하게는 가능한 한 치료하고자 하는 대상체의 천연 항체와 근접한다(예를 들어, 인간 대상체의 경우 인간 항체). 연장된 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체가 또한 본 명세서에 포함된다. 본 발명에 따른 항체는 임의의 특정 포맷 또는 그의 생성 방법으로 제한되지 않는다.

절반 항체는, 다른 중쇄 및 경쇄 조합과 회합되지 않고 또 다른 가변 영역 또는 가변 영역-유사 폴리펩티드와 계면을 형성하지 않는 중쇄 및 경쇄 조합이다. 다른 원하지 않는 항체 생성물 관련 불순물은 중쇄와 회합되지 않은 유리 경쇄, 경쇄 또는 다른 중쇄와 회합되지 않은 유리 중쇄, 또는 경쇄가 결여된 불완전하게 조립된 항체일 수 있다.

항체 생성에 적합한 세포는 당업계에 공지되어 있으며, 하이브리도마 세포, 중국 햄스터 난소(CHO)세포, NS0 세포 또는 PER-C6 세포, 또는 당업자에게 공지된 다양한 다른 세포주들을 포함한다. 다양한 기관 및 회사는 항체의 대규모 생성을 위하여, 예를 들어 임상 사용을 위하여 세포주를 개발해 왔다. 이러한 세포주의 비제한적인 예는 특히 CHO 세포, NS0 세포 또는 PER.C6 세포 또는 HEK293 세포이다. 특정 바람직한 실시 형태에서, 상기 세포는 인간 세포이다. 바람직하게는, 아데노바이러스 E1 영역 또는 그의 기능적 등가물에 의해 형질전환된 세포이다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 세포는 CHO 세포 또는 그의 변이체이다. 바람직하게는, 항체의 발현을 위하여 글루타민 신테타제 (GS) 벡터 시스템을 사용하는 변이체이다. 바람직한 일 실시 형태에서, 세포는 CHO 세포이다.

세포에는 항체를 인코딩하는 핵산이 제공될 수 있다. 세포는 형성된 항체를 발현하고, 조립하고, 세포 배양물의 상청액 내로 배설할 것이다. 단일 중쇄 및 경쇄(또는 오히려 이에 대해 코딩하는 핵산)의 도입은, 경쇄와 각각 회합된 2개의 중쇄를 갖는 단일클론 항체의 생성으로 이어진다.

본 발명의 방법은 상이한 항체를 각각 생성하는 2종 이상의 세포들을 포함하는 세포들의 혼합물로 수행될 수 있다. 이러한 혼합물을 사용하는 이점은 수집된 항체의 하류 처리가 더욱 효율적으로 간소화될 수 있다는 것이다. 방법의 추가의 이점은 항체 생성물이 하나씩 수집 및 정제된다는 것이다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 생성된 2개 이상의 항체의 혼합물은, 각각의 항체에 대해 개별적으로 요구되는 시험의 수와 비교할 때, 규제 승인을 얻기 위해 요구되는 시험의 수를 감소시킬 수 있다.

추가 실시 형태에서, 세포는 각각의 항체를 인코딩하는 핵산이 제공된 단일 세포의 복제물로 본질적으로 구성된 세포의 균질한 집합체이다. 세포에서 몇몇 중쇄의 동시발현은 중쇄의 다양한 조합을 가능하게 한다. 추가 경쇄와의 조합은 조합의 수를 증가시킨다. 다른 방법에 비해 특정 조합의 형성을 유리하게 하기 위한 다양한 방법이 개발되어 왔다. 동종이량체에 대한 중쇄 이종이량체의 형성 또는 그 반대로 이종이량체에 대한 중쇄 동종이량체의 형성을 특이적으로 촉진하는 중쇄 변이체가 생성되었다. 특정 동종- 또는 이종이량체화 도메인을 갖는 중쇄는 이러한 세포에 의해 생성되는 항체의 수를 감소시키고/시키거나 대안적인 조합에 비해 바람직한 항체의 수준을 증가시킨다(예를 들어, 동종이량체에 비해 이종이량체의 더 높은 생성).

본 발명의 방법은, 이중특이성 항체를 포함하는, 2개 이상의 다중특이성 항체의 생성에 특히 적합하다. 이중특이성 항체의 생성을 위한 다양한 방법이 당업계에 존재한다. 하나의 접근법은 상이한 중쇄를 갖는 기능적 가변 도메인을 형성할 수 있는 공통 경쇄를 사용한다. 이중특이성 항체를 생성하기 위한 하나의 바람직한 방법은 게놈에 공통 사슬을 보유하는 형질전환 동물의 사용을 포함하여, 항원으로 이러한 동물을 면역화하면 비-공통 사슬을 기반으로 하는 상기 항원에 특이적인 항체의 레퍼토리가 생성되는데, 여기서 레퍼토리는 상기 공통 사슬 및 재배열된 동족 사슬을 포함하는 다양한 항체로 구성된다. 하나의 동물은 상이한 항원으로 면역화될 수 있거나, 상이한 동물들은 각자의 항원 각각으로 개별적으로 면역화될 수 있다. 비-공통 사슬 또는 이의 가변 영역을 인코딩하는 핵산은 동물(들), 예를 들어 B-세포, 비장 또는 림프조직으로부터 얻어질 수 있다. 이들은 생성 세포 내로 도입될 수 있는 각각의 비-공통 사슬을 발현할 수 있는 핵산을 생성하는 데 사용될 수 있다. 공통 사슬은 동일하거나 상이한 시간에 도입될 수 있다. 핵산은 핵 내로, 그리고 바람직하게는 숙주 세포의 게놈 내로 혼입되어, 숙주 세포가 형질전환 동물(들)이 면역화된 다수의 항원을 표적으로 하는 다중특이성 항체 또는 다량체를 생성하도록 할 수 있다(예를 들어, 상이한 표적 및/또는 상이한 에피토프에 대해 특이적인 기능적 가변 도메인을 생성하기 위해 공통 사슬과 조합될 수 있는 가변 영역의 생성을 목적으로 본 명세서에 참조로 포함된 WO2009/157771호 참조).

공통 경쇄 및 공통 경쇄와 함께 기능적 가변 도메인을 각각 형성할 수 있는 2개의 상이한 중쇄를 생성하는 세포는 특히 2개의 상이한 중쇄 및 경쇄 조합들을 갖는 이중특이성 항체를 생성한다. 유사하게, 공통 경쇄 및 3개 이상의 상이한 중쇄를 생성하는 세포는 3개 이상의 항원을 표적화할 수 있는 다중특이성 항체, 또는 3개 이상의 항원을 표적화할 수 있는 2개 이상의 다중특이성 항체들의 조합을 형성할 수 있다. 현재, 항체의 표준 포맷(즉, 1개의 불변 부분 및 2개의 가변 도메인)을 구축하고 추가의 결합 도메인을 부가할 수 있다. 이와 같이, 항체의 불변 또는 하나 이상의 가변 도메인에 부착된 추가의 결합 특이성을 갖는 하나 이상의 단일 사슬 Fv를 갖는 다중특이성 항체가 제조될 수 있다. 2개 이상의 가변 영역을 갖는 중쇄를 생성하는 것이 또한 가능하다. 추가의 중쇄 영역은 유리하게는, 상이한 또는 공통 경쇄 가변 영역과 회합될 수 있다. 본 명세서에 참고로 포함되는 US 62/650467호를 참조한다.

세포가 2개 이상의 다중특이성 항체를 생성할 때, 이는 또한, 경우에 따라, 일정량의 절반 항체 및 동일한 중쇄 또는 동종이량체를 갖는 항체를 생성할 수 있다. 후자의 양은 중쇄에서의 이종이량체 형성 촉진 변형을 포함함으로써 감소될 수 있다. 상기에 나타낸 바와 같이, 중쇄의 이종이량체화를 유도하는 다양한 방법이 존재한다. 변형을 갖는 각각의 도메인은 집합적으로 이종이량체화 도메인으로 지칭된다. 상호작용에 유리한 이종이량체화 도메인을 갖는 중쇄는 양립가능한 이종이량체화 도메인을 갖는 것으로 언급된다. 양립가능한 이종이량체화 도메인들은 바람직하게는 양립가능한 면역글로불린 중쇄 CH3 이종이량체화 도메인들이다. 당업계에서는 중쇄의 이러한 CH3 이종이량체화가 달성될 수 있는 다양한 방법이 설명되어 있다.

이중특이성 항체를 생성하는 하나의 바람직한 방법이 US 9,248,181호 및 US 9,358,286호에 개시되어 있다. 구체적으로는, 이중특이성 전장 IgG 분자만을 본질적으로 생성하기에 바람직한 변경은 제1 CH3 도메인 내의 아미노산 치환 L351K 및 T366K(EU 넘버링) ('KK-변이체' 중쇄) 및 제2 도메인 내의 아미노산 치환 L351D 및 L368E('DE-변이체' 중쇄)이거나, 또는 역으로도 성립된다. 앞서 기재된 바와 같이, DE-변이체와 KK-변이체는 우선적으로 이종이량체(이른바 'DEKK' 이중특이성 분자)를 형성하도록 쌍을 형성한다. DE-변이 중쇄의 동종이량체화(DEDE 동종이량체) 또는 KK-변이 중쇄의 동종이량체화(KKKK 동종이량체)는, 동일한 중쇄들 사이의 CH3-CH3 계면에서의 하전된 잔기들 사이의 강한 반발력을 포함한 이유로 인해 거의 발생되지 않는다.

본 발명에서, 세포에는 공통 경쇄를 인코딩하는 핵산이 제공되는 것이 바람직하다. 상이한 중쇄 가변 영역 및 동일한 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 생성하기 위한 다양한 방법이 당업자에게 이용가능하다. WO2004/106375호는 공통 경쇄 가변 영역을 사용하는 파지 라이브러리를 설명한다. 파지 선택은 동일한 경쇄 가변 영역 및 상이한 중쇄 가변 영역을 갖는 가변 도메인을 산출한다. 추가로, 공통 사슬 및 상이한 동족 사슬을 갖는 비인간 동물은 WO2009/157771호에 기재되어 있다. 이러한 동물에서 항체 선택은 동일하거나 유사한 공통 사슬 가변 영역 및 상이한 동족 사슬 가변 영역을 갖는 가변 도메인을 산출한다. WO2004/106375호 및 WO2009/157771호는 본 명세서에 참고로 포함된다. 간행물에서는 동일하거나 유사한 공통 사슬 가변 영역 및 상이한 동족 사슬 가변 영역, 바람직하게는 공통 경쇄 가변 영역 및 상이한 중쇄 가변 영역을 갖는 항체 및 이러한 항체를 인코딩하는 핵산의 생성에 대해 구체적으로 언급되어 있다.

바람직한 일 실시 형태에서, 세포는 2개 이상의 중쇄 및 하나의 공통 경쇄를 생성한다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 각각의 사슬과 연결된 하나 이상의 가변 영역을 가질 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 세포는 3개 이상의 중쇄를 생성한다. 3개의 중쇄 중 하나는 바람직하게는 양립가능한 이종이량체화 도메인의 한 부분을 함유한다. 2개 이상의 다른 중쇄는 바람직하게는 양립가능한 이종이량체화 도메인의 다른 부분을 포함한다. 제1 중쇄가 문자 "A"에 의해 그리고 2개의 다른 중쇄가 문자 "B" 및 "C" 심벌로 표시되는 경우, 이종이량체화 도메인들의 특정 조합은 주로 조합 AB 및 AC의 형성으로 이어진다. 조합 AA, BB, CC, 및 BC는 이종이량체화 도메인의 포함에 의해 불리하다. 이러한 세포는 2개의 이중특이성 항체 AB 및 AC만을 생성하는 데 효과적이다(도 1 참조). 본 발명에서, 세포는 적어도 3개의 중쇄를 생성함으로써 2개의 항체를 생성하는 것이 바람직하다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 중쇄들 중 하나는 양립가능한 이종이량체화 도메인의 한 부분을 포함하고, 상기 2개 이상의 다른 중쇄는 바람직하게는 양립가능한 이종이량체화 도메인의 다른 부분을 포함한다. 조성물 내의 2개 이상의 이중- 또는 다중특이성 항체 또는 다량체에 의해 공유되는 중쇄는 바람직하게는 이종이량체화 도메인의 CH3 DE 부분을 갖는다. 이중- 또는 다중특이성 항체 내의 다른 중쇄는 바람직하게는 CH3 KK 부분을 갖는다.

적어도 2개의 항체는 바람직하게는 다중특이성 항체, 바람직하게는 이중특이성 항체이다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 항체들 중 적어도 2개는 동일한 중쇄를 공유한다. 세포는 중쇄에 상이한 이종이량체화 도메인을 포함함으로써 이중특이성 항체들의 몇몇 시리즈를 생성할 수 있다. 이러한 구현은 중쇄 조합 AB 및 CD를 갖는 이중특이성 항체의 우세한 생성으로 이어질 수 있다. 조합 AB는 본 명세서에서 상기에 언급된 바와 같은 DE/KK 이종이량체화 도메인에 의해 선호될 수 있으며, CD는, 예를 들어 전하 조작(charge engineering)을 통해, "노브 인 홀(knob in hole)" 이종이량체화 도메인, 또는 당업계에 공지된 다른 이종이량체화 특징부의 통합에 의해 선호될 수 있다. 공유 중쇄와의 상이한 이중- 또는 다중특이성 다량체 또는 항체 조합들 사이의 공유 중쇄는 이종이량체화 도메인의 한 부분을 공유 중쇄에 그리고 이종이량체화 도메인의 상보적 부분을 다양한 조합 사슬에 제공함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 공유 중쇄에서의 CH3 DE 부분 및 조합 사슬에서의 CH3 KK 부분. 하나의 공유 중쇄 및 2개의 조합 중쇄는, 이러한 환경에서, 이중- 또는 다중특이성 다량체 또는 세포에 의한 중쇄 조합 AB 및 AC(또는 다중특이성 다량체의 경우 AxBC 및 AxDE)를 갖는 항체의 생성을 야기할 것이다. 다른 가능한 조합은 AB, AE, CD 및 CF; 또는 AB, AE, AG 및 CD 등이다.

항체는 대체적으로 다른 숙주 세포 단백질과 비교하여 구별되는 등전점(전형적으로 pH 6 내지 10의 범위)을 갖는다. 항체, 예컨대, 다중특이성 항체, 및 다중특이성 다량체는 본 명세서에 개시된 방법을 통해 상대적으로 고순도로 정제될 수 있다. 방법은 숙주 세포를 배양하는 단계, 수확 청징을 거치는 단계, 이어서 단백질을 포획하는 단계와 같은 여러 단계를 포함할 수 있다. 음이온 교환 크로마토그래피와 같은 IEX 크로마토그래피는 숙주 세포 DNA를 제거하는 데 사용될 수 있고, 양이온 교환 크로마토그래피(CIEX)는 예를 들어 숙주 세포 단백질, 침출된 단백질 A 및 잠재적인 응집체를 제거하는 데 사용될 수 있다. 바이러스 여과 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피와 같은 추가의 단계가 포함될 수 있다.

항체는 전형적으로 생성 세포에 의해 배설된다. 이러한 항체의 수확은 전형적으로 세포 상청액의 수집에 이어, 존재를 원하지 않는 세포 잔사 또는 응집체를 제거하기 위한 몇몇 정제를 수반한다. 수확 청징은 항체 생성 세포의 배양 상청액의 여과, 원심분리 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 항체 단백질 포획은 전형적으로 친화성 정제에 의해 수행된다. 이는 몇몇 방식으로 수행될 수 있다. 이는 종종, 항체에 대해 기지의 높은 특이적 결합 능력을 갖는 박테리아 단백질인 재조합 단백질 A, 단백질 G 또는 단백질 L을 갖는 컬럼을 사용한 정제를 수반한다. 현재, 항체에 더욱 특이적으로 결합하는 다양한 최적화된 돌연변이가 이용가능하다. 예를 들어, 비필수 도메인이 제거된 재조합 단백질 A가 이용가능하고, 알부민 결합 부위가 결실된 재조합 단백질 G가 이용가능하며, 변형된 단백질 L이 또한 이용가능하다. 결합된 항체는 이러한 컬럼들 중 하나 이상에 대한 용리에 의해 수집될 수 있다. 음이온- 및 양이온-교환 크로마토그래피가 사용되어 제제를 추가로 정제할 수 있는데, 예를 들어, 절반 항체 및/또는 동종이량체 항체 및/또는 다른 원치 않는 항체 생성물 관련 불순물(있는 경우)로부터 이중특이성 또는 다중특이성 항체를 정제할 수 있다. 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)는 항체 정제 공정에서 대안적인 폴리싱 단계로서 통상 사용된다. HIC는 이온 교환 크로마토그래피에 대한 직교 선택성(orthogonal selectivity)을 제공하고, 응집체 제거 및 숙주 세포 단백질 감소를 위한 효과적인 단계일 수 있다. 본 발명에서, HIC는, 2개 이상의 이중- 또는 다중특이성 항체 또는 다량체의 정제가 완료된 후, IEX에서 유사한, 바람직하게는 본질적으로 동일한 체류 시간 및/또는 유사한, 바람직하게는 본질적으로 동일한 pI를 갖는 2개 이상의 종을 정량화하기 위한 분석 목적으로 사용될 수 있다. 따라서, HIC는 정제된 분자의 상대적인 양을 정량화하는 데 사용된다.

소수성 상호작용 수지는 고정상으로서 선택되고, 이동상의 pH 및/또는 전도도는 요구되는 선택성을 달성하도록 조절된다. 항체는 전형적으로, 극성과 전체 표면 소수성에 영향을 미치는 더 낮은 pH에서 양전하를 끌어당긴다. 제제에서 2개 이상의 항체의 분리를 허용하는 pH 조건이 선택될 수 있다.

일부 실시형태에서, 수집된 항체는 먼저, 친화성 정제에 의해, 바람직하게는 단백질 A 추출에 의해 다른 단백질로부터 분리된다. 후속적으로, 친화성 정제된 항체는 유통물 분획에서 항체를 수집하는 조건 하에서 음이온 교환 컬럼 상에서 실행된다. 후속적으로, 항체는 하나 이상의 CIEX 컬럼 상에서 실행될 수 있다.

적어도 2개의 항체를 생성하기 위한 바람직한 방법은 2개 이상의 항체를 포함하는 단일 조성물로서 세포에 의해 그들을 생성함으로써 수행된다.

적어도 2개의 항체를 생성하는 방법은 바람직하게는 2개 이상의 항체를 생성하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 세포의 상청액을 수집하는 단계, 바람직하게는 세포 또는 세포 잔사와 같은 응집체를 포획하고 항체 생성물의 통과를 허용하는 기공 크기 컷-오프(cut-off)를 사용한 여과를 포함하는 수확 청징 공정에서 상청액 수확물을 처리하는 단계를 포함한다. 항체는 단백질 A를 사용하는 친화성 크로마토그래피에 의해 세포 배양액으로부터 수집된다. 단백질 수지에 결합된 항체는 낮은 pH에 노출된 후 크로마토그래피 컬럼으로부터 용리되고, 용출액은 후속적으로 적합한 완충액을 사용하여 중화된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "등전점(pI)"은 단백질 표면의 평균 순 전하, 즉 단백질의 전기 이중층의 전위가 0 인 pH를 의미한다. 다시 말하면, 이 용어는 단백질 그룹이 해리되어 양이온과 음이온의 수가 동일하여 단백질의 순 전하가 0이 되는 지점을 의미한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "pI"는 본 출원의 가장 이른 출원일(우선일)의 디폴트 파라미터를 사용하여 ExPASy, ProtParam 도구에 따라 1차 아미노산을 기반으로 계산된다. ProtParam은 Swiss-Prot 또는 TrEMBL에 저장된 주어진 단백질 또는 사용자가 입력한 단백질 서열에 대한 다양한 물리적 및 화학적 파라미터의 계산을 가능하게 하는 도구이다. 계산된 파라미터는 이론적 pI를 포함한다. 문헌[Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A.; Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server; (In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005) pp. 571-607].

단백질의 순 표면 전하는 단백질의 pI에 의해 지시되는 방식으로 pH에 따라 변한다. 단백질의 pI와 동일한 pH에서, 단백질은 순 전하를 띠지 않을 것이다. pI 미만의 pH에서, 단백질은 순 양전하를 띨 것이다. 완충액 pH가 단백질의 pI 위로 상승되면, 순 음전하를 띨 것이다.

단백질의 pI는 그의 1차 아미노산 서열에 의해 결정될 수 있고 그에 따라서 계산될 수 있으며, 이어서 관심 단백질에 대한 기지의 순 전하를 보장하는 완충액이 선택될 수 있다. 따라서, 관심 단백질이 작동 pH에서 순 양전하를 띨 때, 음으로 하전된 양이온 교환 수지가 선택된다.

상이한 pI 값을 갖는 단백질은 주어진 pH에서 다양한 정도의 전하를 가질 것이고 그에 의해 음이온 교환 매질의 입자 상의 양으로 하전된 표면 그룹에 대해 상이한 친화성을 가질 것이며; 따라서, 상이한 단백질이 상이한 강도로 수지에 결합하여 그의 분리를 촉진할 것이다. 따라서, 동종이량체 및 절반 항체 오염물 및/또는 다른 항체 생성물 관련 불순물에 대해 구별되는 pI를 갖는 이종이량체 폴리펩티드를 생성함으로써, 이종이량체 폴리펩티드는 표준 용리 기술을 사용하여, 예를 들어 pH 구배를 적용함으로써, 또는 고정된 pH에서 염 또는 전도도 구배 또는 pH와 전도도 구배의 조합을 적용함으로써 용이하게 정제될 수 있다. 본 발명의 실시 형태에서, 항체 내의 불변 부분 및 경쇄는 본질적으로, 상이한 항체에서 동일한 서열을 갖는다. 이러한 항체는 전형적으로 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열에서만 본질적으로 상이하다. 이러한 항체의 경우, 이는 전형적으로 본 명세서에 나타난 바와 같이 중쇄 가변 영역의 pI를 계산하기에 충분하다. 이어서, (반)-항체의 pI 대신에 중쇄 가변 영역의 pI를 사용함으로써 계산 및 기준이 설정된다. 항체의 중쇄 가변 영역의 평균 pI는 CIEX-컬럼에서의 항체의 체류 시간을 나타낸다. 항체는, 존재하는 경우, 동일하거나 상이한 이종이량체화 도메인을 가질 수 있다. 이는 바람직하게는 동일한 이종이량체화 도메인을 갖는다. 항체는 추가로, 불변 부분에서의 정확한 아미노산 서열에서 다소 상이할 수 있다.

이온-교환 크로마토그래피(IEX) 단계(들)의 경우, 이는 이온 교환기에 대한 친화도에 기초하여 이온과 극성 분자를 분리하는 공정이다. 이는 큰 단백질, 작은 뉴클레오티드, 및 아미노산을 포함하는 다양한 하전된 분자에 대해 작용한다. IEX는 종종 단백질 정제에 사용된다. 수용성 및 하전된 단백질은 불용성 고정상과 이온 결합을 형성한다. 이어서, 결합된 분자는 더 높은 이온 농도 및/또는 상이한 pH를 갖는 용리액을 사용하여 용리 및 수집될 수 있다. 염의 농도 또는 pH는 단계적 방식으로; 크로마토그래피 실행의 이동상을 점진적으로 변경함으로써, 또는 이들의 조합으로 변경될 수 있다. 두 가지 유형의 이온 크로마토그래피는 음이온-교환 및 양이온-교환이다. 양이온-교환 크로마토그래피(CIEX)가 본 발명에서 바람직하다. 항체 CIEX는 바람직하게는 생리학적 pH에서 수행된다. pH는 전형적으로 5 내지 9, 바람직하게는 6 내지 8의 범위를 갖는다.

CIEX는 전형적으로, 관심 분자가 크로마토그래피에 사용되는 pH 하에서 양으로 하전될 때 사용된다. 크로마토그래피를 위한 pH가 분자의 pI보다 낮기 때문에 분자는 양으로 하전된다. 이러한 유형의 크로마토그래피에서, 고정상은 음으로 하전되고, 양으로 하전된 분자가 그것에 끌어당겨지도록 로딩된다. 음이온-교환 크로마토그래피에서, 고정상은 양으로 하전되고, 음으로 하전된 분자(크로마토그래피에 대한 pH가 pI보다 높은 것을 의미함)가 그것에 끌어당겨지도록 로딩된다.

다중특이성 항체와 같은 항체는 전형적으로 다중특이성 항체와 같은 항체의 기재에 대한 결합을 촉진하는 조건 하에 결합 단계에서 IEX 컬럼에 결합된다. IEX 컬럼은 전형적으로 후속적으로 세척되어 결합되지 않은 물질을 제거한다. 컬럼으로부터의 용리는 용리 단계에서 수행된다. 다중특이성 항체와 같은 항체의 체류 시간은 전형적으로 용리 단계의 시작으로부터 계산된다. 그것은 용리상이 시작될 때 항체가 컬럼 상에 보내는 시간이다. 샘플이 몇몇 화합물을 함유하는 경우, 샘플 내의 각각의 화합물은 전형적으로 그의 화학적 조성에 따라 컬럼 상에서 상이한 시간을 보낼 것인데, 즉 각각은 상이한 체류 시간을 가질 것이다. 체류 시간은 통상 초 또는 분의 단위로 표시된다.

다중특이성 항체와 같은 항체의 체류 시간은 본 발명의 방법에서 바람직하게는 본질적으로 동일하다. 상이한 항체는 동일한 컬럼 및 조건에서 상이한 체류 시간을 가질 수 있다. 본 발명에서, 단일 IEX 크로마토그래피 실행에서 2개 이상의 다중특이성 항체와 같은 2개 이상의 항체의 동시정제를 허용하기에 충분히 가까운 IEX 체류 시간을 갖도록 다중특이성 항체와 같은 항체가 선택되거나 설계될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 개별 항체의 체류 시간의 평균으로부터 10% 이하만큼 벗어나는 체류 시간은 전형적으로 단일 IEX 크로마토그래피 실행에서 2개 이상의 다중특이성 항체와 같은 2개 이상의 항체의 동시정제를 허용하기에 충분히 가깝다.

본 발명에 따른 항체 정제 및/또는 분석에 적합한 CIEX HPLC 방법은 TSKgel SP-STAT(7 μm 입자 크기, 4.6 mM I.D. × 10 cm L, Tosoh 21964) 시리즈의 이온 교환 컬럼을 사용한다. 컬럼은 생체분자의 단리뿐만 아니라 빠른 고해상도 분석을 위해 비다공성 수지 입자로 패킹된다. TSKgel STAT 컬럼 내의 입자가 로딩 용량을 위한 다층 이온-교환 그룹의 개방형 액세스 네트워크를 포함하는 한편, 입자 크기는 이러한 컬럼을 HPLC 및 FPLC 시스템에 적합하게 한다.

적합한 방법은 완충액 A(소듐 포스페이트 완충액, 25 mM, pH 6.0)를 사용한 TSKgel SP-STAT(7 μm 입자 크기, 4.6 mM I.D × 10 cm L, Tosoh 21964)의 평형화 - 그 후에는, 염 농도를 증가시키고 완충액 B(25 mM 소듐 포스페이트, 1 mM NaCl, pH 6.0)의 구배를 실행시킴으로써 항체가 컬럼으로부터 제거됨 - 를 수반한다. 유속은 0.5 mL/min으로 설정된다. 시험 샘플 및 대조군에 대한 주입 샘플 질량은 10 ㎍이고, 주입 부피는 10 내지 100 μl이다. 크로마토그램은 220 nm 결과에 기초하여 관찰된 주 피크에 대한 피크 패턴, 체류 시간 및 피크 면적에 대해 분석된다. 본 방법은 더 많은 양의 항체를 위해 스케일링될 수 있다.

항체 제제의 CIEX 크로마토그래피 실행의 전형적인 그래프는 도 2에 도시되어 있다. 이러한 실행을 위한 항체는, 실시예에서 나타난 바와 같이 형질감염된 세포로부터 수집하였고, 단백질 A 컬럼에 의해 배지 내의 많은 다른 단백질로부터 정제하였다. 항체는 산 용리에 이은 중화 및 실시예에서 나타난 바와 같이 PBS pH 7.4로 완충액 교환에 의해 용리되었다. 후속하여, 항체 제제의 샘플을 CIEX 컬럼 상에 로딩하였다. 세척 후, 염 구배를 적용하여 관련 단백질을 용리시켰다. CIEX 조건은 도 2a 및 도 2b의 샘플에 대해 동일하였다. 체류 시간은 이중특이성 항체의 피크의 상단에 대해 계산된다. 다중특이성 항체와 같은 2개 이상의 항체의 체류 시간은 바람직하게는 2개 이상의 항체의 체류 시간의 평균으로부터 10% 이하만큼 벗어난다. 10% 초과의 편차는 전형적으로 절반 항체로부터 그리고 선택적으로 다중특이성 항체의 경우에는 동종이량체 및/또는 다른 항체 생성물 관련 불순물로부터 항체의 비효율적인 분리를 야기한다. 바람직한 실시 형태에서, 2개 이상의 항체의 체류 시간은 2개의 항체의 체류 시간의 평균으로부터 9% 이하만큼 벗어난다. 바람직하게는, 2개 이상의 항체의 체류 시간의 평균으로부터 8%, 7%, 6%, 또는 5% 이하만큼 벗어난다. 바람직한 실시 형태에서, 2개 이상의 항체의 체류 시간은 2개 이상의 항체의 체류 시간의 평균으로부터 4% 이하만큼 벗어난다. 바람직하게는 3% 이하, 바람직하게는 2% 이하. 점점 더 유사한 체류 시간은 전형적으로 절반 항체 및 선택적으로 동종이량체 및/또는 다른 항체 생성물 관련 불순물로부터 다중특이성 항체의 점점 더 효율적인 분리를 가능하게 하며, 따라서 IEX 컬럼의 분획에서 2개의 항체의 더욱 깨끗한 수집을 가능하게 한다.

본 발명의 수단 및 방법에서, 2개 이상의 다중특이성 항체와 같은 2개 이상의 항체의 평균 체류 시간은 동시정제되거나 수집될 항체에 대해 계산된다. 따라서, 정제될 항체가 다중특이성 항체인 실시 형태에서, 2개 이상의 항체의 평균 체류 시간은 다중특이성 항체에 기초하여 계산된다. 동종이량체 항체와 같은 수집되지 않는 항체의 체류 시간은 평균의 계산을 위해 사용되지 않는다.

IEX에 사용되는 조건 하에서 본질적으로 동일한 IEX 체류 시간을 갖는 다중특이성 항체와 같은 항체를 선택함으로써 본 발명의 방법에서 동시정제를 위해 다중특이성 항체와 같은 항체가 선택될 수 있다. 다중특이성 항체와 같은 항체는 또한, IEX에 대해 사용된 동일하거나 유사한 조건 하에서 본질적으로 동일한 IEX 체류 시간을 갖도록 하나 이상의 가변 영역의 적절한 변형을 통해 맞추어질 수 있다.

일 실시 형태에서, 이중- 및/또는 다중특이성 항체와 같이 동시정제하고자 하는 생성된 항체는 유사한 pI를 갖는다. 상기 항체들 중 적어도 2개의 등전점(pI)이 바람직하게는 상기 적어도 2개의 항체의 평균 pI로부터 0.4 단위, 0.3, 0.2 및 바람직하게는 0.1 단위 이하만큼 상이하다. 상기 적어도 2개의 항체 각각의 pI는 바람직하게는 0.25 단위 이하만큼 서로 상이하다.

항체의 pI의 차이가 작거나 전혀 없으면 전형적으로 양호한 동시정제를 가능하게 한다. 유리하게는, 항체 내의 각각의 절반 항체의 pI는 평균과 더 상이하다. 이러한 차이는 CIEX 크로마토그래피 단계에서 "동시"-이동 완전 항체로부터 절반 항체의 양호한 분리를 촉진한다.

동시정제하고자 하는 항체가 이중- 또는 다중특이성 항체인 실시 형태에서, 동시정제하고자 하는 항체 각각 내의 가변 도메인의 pI는 공동-정제될 다른 항체(들)의 가변 도메인의 pI의 평균으로부터 0.2 초과, 바람직하게는 0.3, 바람직하게는 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 1.0, 1.2, 1.4 바람직하게는 1.8 또는 2.0 단위 초과만큼 상이한 것이 바람직하다. 이러한 실시 형태에서, 항체 내의 가변 도메인의 pI의 차이는 바람직하게는, "x"가 상기 항체들 중 제1 항체의 2개의 가변 도메인의 pI의 평균이고 "y"가 상기 항체들 중 제2 항체의 2개의 가변 도메인 pI의 평균인 경우, "x"와 "y" 사이의 차이보다 적어도 0.2 단위 더 크며, 바람직하게는 이는 "x"와 "y" 사이의 차이보다 적어도 0.3, 0.4, 0.5, 바람직하게는 적어도 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.2, 1.5, 2.0 또는 2,5 더 크다. 항체 내의 가변 도메인의 pI의 언급된 바와 같은 차이는 전형적으로, 항체 생성물 관련 불순물의 동시정제하고자 하는 항체로부터의 양호한 분리 및/또는 단일-특이성 항체로부터의 양호한 분리를 나타낸다.

2개 이상의 이중- 또는 다중특이성 항체를 포함하는 일부 조성물은 아미노산 서열이 유사하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 불변 영역 및 경쇄를 갖는다. 이러한 2개 이상의 이중- 및/또는 다중특이성 항체는 전형적으로, 본질적으로 가변 도메인의 아미노산 서열에서만, 또는 본질적으로 중쇄 가변 영역에서만 서로 상이하다. 이러한 경우, 전체 항체의 pI를 결정하는 것이 종종 필요하지는 않다. 대신 가변 도메인의 pI 및/또는 중쇄 가변 영역의 pI가 결정될 수 있다. 이는 항체가 CIEX 크로마토그래피 단계에서 서로 가깝게 이동할 수 있는지 여부, 즉 항체가 동시정제를 허용하기에 충분히 동일한 체류 시간을 갖는지 여부를 평가하는 수단을 제공한다.

본 명세서에 개시된 바와 같은 방법 또는 조성물의 일 실시 형태에서, 2개 이상의 이중- 또는 다중특이성 항체는, 동일한 아미노산 서열을 갖거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 불변 영역 및 경쇄를 갖는다. 2개 이상의 이중- 또는 다중특이성 항체는, 각각의 항체 내의 가변 도메인의 평균 pI가 동시정제하고자 하는 각각의 항체의 가변 도메인의 평균 pI로부터 0.7 단위 이하만큼 상이할 때 CIEX 크로마토그래피 단계에서 동시정제될 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 항체들 중 제1 항체의 2개의 가변 도메인의 pI의 평균 "x" 및 상기 항체들 중 제2 항체의 2개의 가변 도메인의 pI의 평균 "y"는 동시정제하고자 하는 제1 및 제2 항체의 "x" 및 "y"의 평균으로부터 0.6 단위 이하, 바람직하게는 0.5 단위 이하만큼 상이하다. "x" 및 "y"는 동시정제하고자 하는 제1 및 제2 항체의 "x" 및 "y"의 평균으로부터 바람직하게는 0.4; 바람직하게는 0.3; 바람직하게는 0.2; 그리고 바람직하게는 0.1 단위 이하만큼 상이하다. 이러한 이중- 및/또는 다중특이성 항체는 전형적으로, 본질적으로는 동일한 체류 시간을 갖는다. 본 실시 형태에서, 항체의 불변 영역은 본질적으로 동일하다. 이러한 항체의 pI, 및 특히 평균 "x" 및 "y"는, 전체로서 각각의 항체의 pI를 나타낸다. 이러한 실시 형태에서, 동시정제하고자 하는 항체 각각 내의 가변 도메인의 pI는 항체의 가변 도메인의 pI의 평균으로부터 0.2 초과, 바람직하게는 0.3, 바람직하게는 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 1.0, 1.2, 1.4 바람직하게는 1.8 또는 2.0 단위 초과만큼 상이한 것이 바람직하다. 이러한 실시 형태에서, 항체 내의 가변 도메인의 pI의 차이는 바람직하게는, "x"와 "y" 사이의 차이보다 적어도 0.2 단위 더 크며, 바람직하게는 이는 "x"와 "y" 사이의 차이보다 적어도 0.3, 0.4, 0.5, 바람직하게는 적어도 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.2, 1.5, 2.0 또는 2,5 더 크다. 항체 내의 가변 도메인의 pI의 언급된 바와 같은 차이는 전형적으로, 절반 항체의 동시정제하고자 하는 항체로부터의 양호한 분리 및/또는 단일-특이성 항체로부터의 양호한 분리를 나타낸다.

본 명세서에 개시된 바와 같은 방법 또는 조성물의 일 실시 형태에서, 2개 이상의 이중- 또는 다중특이성 항체는, 동일한 아미노산 서열을 갖거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 불변 영역 및 경쇄를 갖는다. 2개 이상의 이중- 또는 다중특이성 항체는, 각각의 항체 내의 중쇄 가변 영역의 평균 pI가 동시정제하고자 하는 각각의 항체의 중쇄 가변 영역의 평균 pI로부터 0.7 단위 이하만큼 상이할 때 CIEX 크로마토그래피 단계에서 동시정제될 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 항체들 중 제1 항체의 2개의 중쇄 가변 영역의 pI의 평균 "m" 및 상기 항체들 중 제2 항체의 2개의 중쇄 가변 영역의 pI의 평균 "n"은 동시정제하고자 하는 제1 및 제2 항체의 "m" 및 "n"의 평균으로부터 0.6 단위 이하, 바람직하게는 0.5 단위 이하만큼 상이하다. "m" 및 "n"은 동시정제하고자 하는 제1 및 제2 항체의 "m" 및 "n"의 평균으로부터 바람직하게는 0.4; 바람직하게는 0.3; 바람직하게는 0.2; 그리고 바람직하게는 0.1 단위 이하만큼 상이하다. 이러한 이중- 및/또는 다중특이성 항체는 전형적으로, 본질적으로는 동일한 체류 시간을 갖는다. 본 실시 형태에서, 항체의 불변 영역은 본질적으로 동일하다. 이러한 항체의 pI, 및 특히 평균 "m" 및 "n"은, 전체로서 각각의 항체의 pI를 나타낸다. 이러한 실시 형태에서, 동시정제하고자 하는 항체 각각 내의 중쇄 가변 영역의 pI는 항체의 중쇄 가변 영역의 pI의 평균으로부터 0.2 초과, 바람직하게는 0.3, 바람직하게는 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 1.0, 1.2, 1.4 바람직하게는 1.8 또는 2.0 단위 초과만큼 상이한 것이 바람직하다. 이러한 실시 형태에서, 항체 내의 중쇄 가변 영역의 pI의 차이는 바람직하게는, "m"과 "n" 사이의 차이보다 적어도 0.2 단위 더 크며, 바람직하게는 이는 "m"과 "n" 사이의 차이보다 적어도 0.3, 0.4, 0.5, 바람직하게는 적어도 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.2, 1.5, 2.0 또는 2,5 더 크다. 항체 내의 중쇄 가변 영역의 pI의 언급된 바와 같은 차이는 전형적으로, 절반 항체의 동시정제하고자 하는 항체로부터의 양호한 분리 및/또는 단일-특이성 항체로부터의 양호한 분리를 나타낸다.

다중특이성 항체와 같은 항체는, 사용되는 IEX 조건 하에서, 전체 항체 또는 원하는 항체, 예컨대, 다중특이성 항체의 체류 시간과 유의하게 상이한 체류 시간을 갖는 중쇄 및 경쇄 조합(절반 항체) 또는 동종이량체(예를 들어, 단일특이성 항체) 또는 다른 항체 생성물 관련 불순물을 가질 수 있거나, 또는 갖도록 선택될 수 있다. 세포가 공통 경쇄를 발현하는 실시 형태에서, 선택은 전형적으로 중쇄에 있다. 중쇄는 절반 항체 또는 동종이량체가 매우 상이한 체류 시간을 갖도록 변형될 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 절반 항체 및/또는 동종이량체의 체류 시간은 각각의 항체 또는 다중특이성 항체의 체류 시간의 평균의 10% 초과만큼 상이하다. 바람직한 실시 형태에서, 동시정제되고자 하지 않는 항체의 개별 중쇄 및 경쇄 조합의 평균 pI는 동시정제될 적어도 2개의 항체의 상기 중쇄 및 경쇄의 평균 pI로부터 0.5 단위 초과만큼 상이하다.

본 발명은 또한, 본 명세서에 기재된 방법에 의해 얻을 수 있는 2 내지10개의 재조합 항체를 포함하는 조성물을 추가로 제공한다. 2 내지 10개의 재조합 항체를 포함하는 조성물이 또한 제공되는데, 상기 항체들 붕 적어도 2개의 IEX 체류 시간이 본질적으로 동일한 것을 특징으로 한다.

본 발명은 2 내지 10개의 재조합 항체를 포함하는 조성물을 추가로 제공하는데, 상기 항체들 중 적어도 2개의 pI가 상기 적어도 2개의 항체의 평균 pI로부터 0.4 단위, 0.3, 0.2 및 바람직하게는 0.1 단위 이하만큼 상이한 것을 특징으로 한다. 상기 적어도 2개의 항체 각각의 pI는 바람직하게는 0.25 단위 이하만큼 서로 상이하다.

본 발명은 2 내지 10개의 재조합 항체를 포함하는 조성물을 추가로 제공하는데, 제1 항체의 2개의 가변 도메인의 pI의 평균 "x" 및 제2 항체의 2개의 가변 도메인의 pI의 평균 "y"는 동시정제하고자 하는 제1 및 제2 항체의 "x" 및 "y"의 평균으로부터 0.7, 0.6 및 바람직하게는 0.5 단위 이하만큼 상이한 것을 특징으로 한다. "x" 및 "y"는 동시정제하고자 하는 제1 및 제2 항체의 "x" 및 "y"의 평균으로부터 바람직하게는 0.4; 바람직하게는 0.3; 바람직하게는 0.2; 그리고 바람직하게는 0.1 단위 이하만큼 상이하다. 다중특이성 항체와 같은 이러한 항체는 전형적으로, 본질적으로는 동일한 체류 시간을 갖는다. 본 실시 형태에서, 항체의 불변 영역은 본질적으로 동일하다. pI, 및 특히 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 각각 포함하는 항체의 상이한 가변 도메인의 pI의 평균은 전체로서 항체의 pI를 나타낸다.

본 발명은 2 내지 10개의 재조합 항체를 포함하는 조성물을 추가로 제공하는데, 제1 항체의 2개의 가변 도메인의 2개의 중쇄 가변 영역의 pI의 평균 "m" 및 제2 항체의 2개의 가변 도메인의 2개의 중쇄 가변 영역의 pI의 평균 "n"은 동시정제하고자 하는 제1 및 제2 항체의 "m" 및 "n"의 평균으로부터 0.7, 0.6 및 바람직하게는 0.5 단위 이하만큼 상이한 것을 특징으로 한다. "m" 및 "n"은 동시정제하고자 하는 제1 및 제2 항체의 "m" 및 "n"의 평균으로부터 바람직하게는 0.4; 바람직하게는 0.3; 바람직하게는 0.2; 그리고 바람직하게는 0.1 단위 이하만큼 상이하다. 다중특이성 항체와 같은 이러한 항체는 전형적으로, 본질적으로는 동일한 체류 시간을 갖는다. 본 실시 형태에서, 항체의 불변 영역 및 경쇄 가변 영역은 본질적으로 동일하다. pI, 및 특히 항체의 상이한 중쇄 가변 영역의 pI의 평균은 전체로서 항체의 pI를 나타낸다.

바람직한 실시 형태에서, IEX 체류 시간 및/또는 pI는 바람직하게는, 조성물 내에 수집될 모든 항체에 대해 본질적으로 동일하다. 바람직한 실시 형태에서, 항체들 중 적어도 2개는 이중특이성 항체이다. 바람직하게는, 상기 항체들 중 적어도 2개는 동일한 중쇄를 공유한다.

일부 실시 형태에서, VH/VL 결합 영역들 중 하나 또는 둘 모두의 공통 경쇄 가변 영역은 생식세포계열(germline) IgVκ1-39*01 가변 영역 V-세그먼트를 포함한다. 소정 실시 형태에서, VH/VL 결합 영역들 중 하나 또는 둘 모두의 경쇄 가변 영역은 카파 경쇄 V-세그먼트 IgVκ1-39*01을 포함한다. IgVκ1-39는 면역글로불린 가변 카파 1-39 유전자에 대한 축약어이다. 이 유전자는 면역글로불린 카파 가변 1-39; IGKV139; IGKV1-39로도 알려져 있다. 유전자의 외부 Id는 HGNC: 5740; Entrez Gene: 28930; Ensembl: ENSG00000242371이다. V-영역에 대한 아미노산 서열은 서열 번호 25에 제공되어 있다. V-영역은 5개의 J-영역들 중 하나와 조합될 수 있다. 바람직한 J-영역은 jk1 및 jk5이고, 합쳐진 서열들은 IGKV1-39/jk1 및 IGKV1-39/jk5로 나타내며; 대체명은 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 또는 IgVκ1-39*01/IGJκ5*01(imgt.org에 있는 IMGT 데이터베이스 월드와이드 웹에 따른 명명법)이다. 소정 실시 형태에서, VH/VL 결합 영역들 중 하나 또는 둘 모두의 경쇄 가변 영역은 카파 경쇄 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 또는 IgVκ1-39*01/IGJκ1*05(각각 서열 번호 26 및 서열 번호 27)를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체의 VH/VL 결합 영역들 중 하나 또는 둘 모두의 경쇄 가변 영역은 아미노산 서열 QSISSY(서열 번호 22)를 포함하는 LCDR1, 아미노산 서열 AAS를 포함하는 LCDR2, 및 아미노산 서열 QQSYSTP(서열 번호 24)를 포함하는 LCDR3(즉, IMGT에 따른 IGKV1-39의 CDR)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체의 VH/VL 결합 영역들 중 하나 또는 둘 모두의 경쇄 가변 영역은 아미노산 서열 QSISSY(서열 번호 22)를 포함하는 LCDR1, 아미노산 서열 AASLQS(서열 번호 23)를 포함하는 LCDR2, 및 아미노산 서열 QQSYSTP(서열 번호 24)를 포함하는 LCDR3을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체의 VH/VL 결합 영역들 중 하나 또는 둘 모두는 서열 번호 26에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 더 바람직하게는 적어도 97%, 더 바람직하게는 적어도 98%, 더 바람직하게는 적어도 99% 동일하거나 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체의 VH/VL 결합 영역들 중 하나 또는 둘 모두는 서열 번호 27에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 더 바람직하게는 적어도 97%, 더 바람직하게는 적어도 98%, 더 바람직하게는 적어도 99% 동일하거나 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

예를 들어, 일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체의 VH/VL 결합 영역들 중 하나 또는 둘 모두의 가변 경쇄는 서열 번호 26 또는 서열 번호 27에 대하여 0 내지 10개, 바람직하게는 0 내지 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 이중특이성 항체의 VH/VL 결합 영역들 중 하나 또는 둘 모두의 경쇄 가변 영역은 지시된 아미노산 서열에 대하여 0 내지 9개, 0 내지 8개, 0 내지 7개, 0 내지 6개, 0 내지 5개, 0 내지 4개, 바람직하게는 0 내지 3개, 바람직하게는 0 내지 2개, 바람직하게는 0개 또는 1개, 그리고 바람직하게는 0개의 아미노산 삽입, 결실, 치환, 부가, 또는 이들의 조합을 포함한다.

다른 실시 형태에서, 이중특이성 항체의 VH/VL 결합 영역들 중 하나 또는 둘 모두의 경쇄 가변 영역은 서열 번호 26 또는 서열 번호 27의 아미노산 서열을 포함한다. 소정 실시 형태에서, 이중특이성 항체의 VH/VL 결합 영역 둘 모두는 동일한 VL 영역을 포함한다. 일 실시 형태에서, 이중특이성 항체의 VH/VL 결합 영역 둘 모두의 VL은 서열 번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 이중특이성 항체의 VH/VL 결합 영역 둘 모두의 VL은 서열 번호 27에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.

본 명세서의 방법에 개시된 것과 같은 이중특이성 항체는 다수의 포맷으로 제공될 수 있다. 다수의 상이한 포맷의 이중특이성 항체는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 2개의 VH/VL 조합을 갖는 고전적인 항체가 아닌 이중특이성 항체 포맷은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 가변 도메인을 적어도 갖는다. 이러한 가변 도메인은 제2 결합 활성을 제공하는 단일쇄 Fv-단편, 모노바디(monobody), VH 및 Fab-단편에 연결될 수 있다.

본 명세서에 제공된 방법에 개시된 것과 같은 이중특이성 항체는 대체적으로 인간 IgG 하위클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)의 것이다. 소정 실시 형태에서, 항체는 인간 IgG1 하위클래스의 것이다. 유리한 반감기 때문에 그리고 낮은 면역원성의 이유로 전장 IgG 항체가 바람직하다. 따라서, 소정 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 전장 IgG 분자이다. 일 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 전장 IgG1 분자이다.

소정 실시 형태에서, 항체는 결정화가능한 단편(Fc)을 포함한다. 이중특이성 항체의 Fc는 바람직하게는 인간 불변 영역으로 구성된다. 이중특이성 항체의 불변 영역 또는 Fc는 천연 발생 인간 항체의 불변 영역과의 1개 이상, 바람직하게는 10개 이하, 바람직하게는 5개 이하의 아미노산 차이를 함유할 수 있다. 예를 들어, 소정 실시 형태에서, 이중특이성 항체의 각각의 Fab-아암(arm)은 이중특이성 항체의 형성을 촉진하는 변형, Fc-매개 이펙터 기능에 영향을 미치는 변형, 및/또는 본 명세서에 기재된 다른 특징을 포함하는 Fc-영역을 추가로 포함할 수 있다.

일 태양에서, 본 명세서에 정의된 바와 같은 2개 이상의 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용되는"이란, 동물, 특히 인간에서의 사용에 대해 정부 규제 기관에 의해 승인되거나, 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인식된 약전에 열거된 것을 의미하며, 생리학적으로 적합한 임의의 그리고 모든 용매, 염, 분산 매질, 코팅, 항세균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 용어 "담체"는 화합물과 함께 투여되는 희석제, 애쥬번트(adjuvant), 부형제, 또는 비히클을 지칭한다. 그러한 약제학적 담체는 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것들, 예컨대 땅콩유, 대두유, 광유, 참깨유, 글리세롤 폴리에티렌 글리콜 리시놀레에이트 등을 포함하는, 물 및 오일과 같은 멸균 액체일 수 있다. 물 또는 식염수 용액, 및 덱스트로스 및 글리세롤 수용액이, 특히 주사용 용액을 위한 담체로서 사용될 수 있다. 비경구 투여를 위한 액체 조성물은 주사 또는 연속 주입에 의한 투여를 위해 제형화될 수 있다. 주사 또는 주입에 의한 투여 경로는 방광내, 종양내, 정맥내, 복막내, 근육내, 수강내 및 피하를 포함한다. 투여 경로(예를 들어, 정맥내, 피하, 관절내 등)에 따라, 활성 화합물은, 화합물을 불활성화시킬 수 있는 산 및 다른 천연 조건의 작용으로부터 화합물을 보호하기 위해 소정의 물질로 코팅될 수 있다.

인간 환자에게 투여하기에 적합한 약제학적 조성물은 전형적으로 비경구 투여를 위해, 예를 들어 액체 담체 중에 제형화되거나, 또는 정맥내 투여를 위해 액체 용액 또는 현탁액으로 재구성하기에 적합하다. 조성물은 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위하여 투여 단위 형태로 제형화될 수 있다.

또한, 사용 직전에 경구 또는 비경구 투여를 위한 액체 제제로의 전환을 위해 의도된 고체 제제가 포함된다. 그러한 액체 형태는 용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다.

"이중특이성 항체"는 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체로서, 여기서 항체의 하나의 도메인은 제1 항원에 결합하고, 한편 항체의 제2 도메인은 제2 항원에 결합하며, 상기 제1 항원과 제2 항원은 동일하지 않다. 용어 "이중특이성 항체"는 또한 하나의 중쇄 가변 영역/경쇄 가변 영역(VH/VL) 조합이 항원 상의 제1 에피토프에 결합하고, 제2 VH/VL 조합이 제2 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다. 용어는 VH가 제1 항원을 특이적으로 인식할 수 있고, 면역글로불린 가변 영역 내에서 VH와 쌍을 이룬 VL이 제2 항원을 특이적으로 인식할 수 있는 항체를 추가로 포함한다. 생성된 VH/VL 쌍은 항원 1 또는 항원 2와 결합할 것이다. 그러한 이른바 "투-인-원(two-in-one) 항체"는, 예를 들어 WO 2008/027236호, WO 2010/108127호 및 문헌[Schaefer et al (Cancer Cell 20, 472-486, October 2011)]에 기재되어 있다. 본 발명에 따른 이중특이성 항체는 임의의 특정 이중특이성 포맷 또는 그의 생성 방법으로 제한되지 않는다.

본 명세서에서 핵산 또는 아미노산 서열에 대해 언급될 때 "퍼센트(%) 동일성"은 최적의 비교 목적을 위하여 선택된 서열과 후보 서열을 정렬시킨 후, 선택된 서열 내의 잔기와 동일한 후보 서열 내의 잔기의 백분율로서 정의된다. 핵산 서열을 비교하는 서열 동일성 백분율은 디폴트 설정을 사용하는 벡터 NTI 프로그램 어드밴스 10.5.2(Vector NTI Program Advance 10.5.2) 소프트웨어의 얼라인X(AlignX) 응용 프로그램을 사용하여 결정되고, 디폴트 설정은 변형된 클러스탈W(ClustalW) 알고리즘(문헌[Thompson, J.D., Higgins, D.G., and Gibson T.J. (1994) Nuc. Acid Res. 22: 4673-4680]), swgapdnarnt 스코어 매트릭스, 15의 갭 개방 패널티 및 6.66의 갭 연장 패널티를 사용한다. 아미노산 서열은 디폴트 설정을 사용하는 벡터 NTI 프로그램 어드밴스 11.5.2 소프트웨어의 얼라인X 응용 프로그램을 사용하여 정렬되고, 디폴트 설정은 변형된 클러스탈W 알고리즘(문헌[Thompson, J.D., Higgins, D.G., and Gibson T.J., 1994]), blosum62mt2 스코어 매트릭스, 10의 갭 개방 패널티 및 0.1의 갭 연장 패널티를 사용한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 '공통 경쇄'는 이중특이성 항체 내의 2개의 경쇄(또는 이의 VL 부분)를 지칭한다. 2개의 경쇄(또는 이의 VL 부분)는, 동일할 수 있거나, 또는 전장(full length) 항체의 결합 특이성에 영향을 주지 않으면서 일부 아미노산 서열 차이를 가질 수 있다. 용어 '재배열된'이 추가되거나 추가되지 않은 용어 '공통 경쇄', '공통 VL', '단일 경쇄', '단일 VL'은 모두 본 명세서에서 상호교환 가능하게 사용된다. "공통"은 또한 동일하지 않은 아미노산 서열을 갖는 경쇄의 기능적 등가물을 지칭한다. 상기 경쇄의 많은 변이체가 존재하는데, 이러한 변이체에는 기능성 결합 영역의 형성에 영향을 주지 않는 돌연변이(결실, 치환, 삽입 및/또는 부가)가 존재한다. 본 발명의 경쇄는 또한, 0 내지 10개, 바람직하게는 0 내지 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 갖는, 본 명세서에서 상기에 지정된 바와 같은 경쇄일 수 있다. 예를 들어 본 명세서에 사용되는 바와 같은 공통 경쇄의 정의의 범위 내에 있는 것으로서, 예를 들어 보존적 아미노산 변화, 중쇄와 쌍을 이룰 때 결합 특이성에 기여하지 않거나 단지 부분적으로 기여하는 영역 내에서의 아미노산의 변화 등을 도입 및 시험함으로써, 동일하지 않지만 여전히 기능적으로 등가인 경쇄를 제조하거나 찾아내는 것을 들 수 있다. 본 발명에 따른 용어 '전장 IgG' 또는 '전장 항체'는 본질적으로 완전한 IgG를 포함하는 것으로 정의되지만, 이것은 반드시 온전한 IgG의 모든 기능을 갖는 것은 아니다. 오해를 피하기 위하여, 전장 IgG는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 함유한다. 각각의 사슬은 불변(C) 및 가변(V) 영역을 함유하며, 이들은 CH1, CH2, CH3, VH, 및 CL, VL로 지정된 도메인들로 분해될 수 있다. IgG 항체는 Fab 부분 내에 함유된 가변 영역 도메인을 통해 항원에 결합하고, 결합 후에는 불변 도메인을 통해, 대개 Fc 부분을 통해 면역 시스템의 분자 및 세포와 상호작용할 수 있다. 본 발명에 따른 전장 항체는 원하는 특성을 제공하는 돌연변이가 존재할 수 있는 IgG 분자를 포함한다. 전장 IgG는 임의의 이들 영역의 실질적인 부분의 결실을 가져서는 안 된다. 그러나, 생성되는 IgG 분자의 결합 특성을 본질적으로 변경시키지 않고서, 한 개 또는 수 개의 아미노산 잔기가 결실된 IgG 분자는 용어 "전장 IgG" 내에 포함된다. 예를 들어, 그러한 IgG 분자는, 바람직하게는 비-CDR 영역 내에 1 내지 10개의 아미노산 잔기의 결실을 가질 수 있으며, 이때 결실된 아미노산은 IgG의 결합 특이성에 필수적이지 않다.

항체는 전형적으로 항원의 에피토프를 인식하기 때문에, 그리고 그러한 에피토프는 다른 화합물에도 마찬가지로 존재할 수 있기 때문에, 항원을 "특이적으로 인식하는" 본 발명에 따른 항체는, 다른 화합물이 동일한 종류의 에피토프를 함유한다면, 그러한 다른 화합물도 마찬가지로 인식할 수 있다. 따라서, 항원 및 항체 상호작용에 관하여 용어 "특이적으로 인식한다"는 동일한 종류의 에피토프를 함유하는 다른 화합물에 대한 항체의 결합을 배제하지 않는다.

용어 "에피토프" 또는 "항원 결정기"는 면역글로불린 또는 항체가 특이적으로 결합하는 항원 상의 부위를 지칭한다. 에피토프는 연속 아미노산 또는 단백질의 3차 접힘에 의해 병치된 불연속 아미노산 둘 모두로부터 형성될 수 있다(이른바 선형 및 입체구조 에피토프). 연속 선형 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 대한 노출 시에 보유되는 반면, 3차 접힘 입체구조에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 의한 처리 시에 상실된다. 에피토프는 전형적으로 특유의 공간 입체구조 내에 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산을 포함할 수 있다. 에피토프의 공간 입체형태를 결정하는 방법은 당업자에게 알려져 있으며, 본 기술 분야의 기법, 예를 들어 에피토프의 성질에 따라 X-선 결정구조해석, HDX-MS 및 2차원 핵자기 공명, 펩스캔(Pepscan), 및 알라닌 스캔을 포함한다(예를 들어, 문헌[Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)] 참조).

명료성 및 간결한 설명을 위해, 특징들은 본 명세서에 동일하거나 개별적인 실시 형태의 일부로서 기재되지만, 본 발명의 범주는 개시된 특징들 중 전부 또는 일부의 조합을 갖는 실시 형태를 포함할 수 있음이 이해될 것이다.

본 설명이 더 용이하게 이해될 수 있도록 하기 위하여, 소정의 용어가 먼저 정의된다. 추가의 정의가 상세한 설명 전체에 걸쳐 기재되어 있다. 달리 언급되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지며, 면역학, 단백질 화학, 생화학, 재조합 DNA 기법 및 약리학의 통상적인 방법이 사용된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 단수형("a", "an" 및 "the")은 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면, 복수의 지시 대상을 포함한다. 용어 "포함하는"뿐만 아니라 "포함하다", "포함한다", 및 "포함된"과 같은 다른 형태의 사용은 제한적이지 않다.

도면의 간단한 설명

도 1

조성물이 공통 아암을 공유하는 2개의 이중특이성 항체를 포함하는 실시 형태의 개략도. 이 도면은 중쇄(1) 및 경쇄(4)를 갖는 항체를 도시한다. 4개의 중쇄는 3개의 상이한 가변 영역(5, 6, 7)을 갖는다. 공유 가변 영역(5)을 갖는 중쇄는 이종이량체화 도메인의 하나의 부분(3)을 갖는다. 가변 영역(6) 및 가변 영역(7)을 갖는 중쇄는 이종이량체화 도메인(2)의 양립가능한 부분을 갖는다. 이종이량체화 영역(2) 및 이종이량체화 영역(3)의 바람직한 쌍은 이중특이성 항체의 형성을 지시할 수 있다.

도 2

패널 A: 이중특이성 항체 PB4516 생성 번호 8(p08)의 220 nm에서의 CIEX-프로파일. 패널 B: 이중특이성 항체 PB6892 생성 번호 4(p04)의 220 nm에서의 CIEX-프로파일.

도 3

도 3a: 이중특이성 항체 PB4516 생성 번호 10(p10)의 220 nm에서의 CIEX-프로파일.

도 3b: 이중특이성 항체 PB11244 생성 번호 1(p01)의 220 nm에서의 CIEX-프로파일.

도 3c: 박스 당 2개의 이중특이성 항체가 PB(PBXXXX(X)) 컬럼에서 확인된다. PB11244 및 PB4516에 대한 중쇄 가변 영역은 표적 1 및 표적 2의 컬럼들에 나타나 있다. 경쇄의 서열은 모든 항체에 대해 동일하며, 서열 번호 26의 공통 경쇄 IgKV1*39/jk1의 아미노산 서열을 갖는다. ExPASy, ProtParam 도구로 계산된 pI는 pI 컬럼에서 각각의 중쇄 가변 영역에 대해 표시된다. 2개의 중쇄 가변 영역들 사이의 pI 차이는 마지막 컬럼에 표시되어있으며, 이는 PB11244와 PB4516 사이의 평균 VH pI 차이가 0.08임을 입증한다.

도 4

풀(pool) FST2의 개별 콜로니 cp12의 항체 제제의 220 nm에서의 CIEX-프로파일. CIEX-프로파일은 동시용리 항체 PB4516 및 PB11244의 날카로운 피크를 보여준다. 프로파일은 샘플이 제한된 양의 생성물 관련 불순물을 함유하는 것을 보여준다. 이는 또한 개별적으로 이동하는 생성물-관련 불순물과 동시용리 이중특이성 항체 사이의 양호한 분리를 보여준다.

도 5

콜로니 CP07의 항체 제제의 220 nm에서의 CIEX-프로파일. 단일 콜로니 FST2cp09의 개별 콜로니들의 집합으로부터 콜로니를 골라내었다. FST2cp09-cp07 세포주가 클론 세포주인 것을 확인하기 위하여 제2 서브클로닝을 수행하였다. 이중특이성 항체 특이적 ELISA는 743 ㎍/ml의 EGFR/HER2 이중특이성 항체 PB11244 및 1134 ㎍/ml의 EGFR/HER3 이중특이성 항체 PB4516의 존재를 나타내었다.

도 6

2개의 동일한 가변 도메인을 갖는 항체 동종이량체(PGXXXX)의 체류 시간. 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호 26의 공통 경쇄 IgKV1*39/jk1 및 도 8의 MF에 대해 나타낸 서열을 갖는다.

도 7. 박스 당 2개의 이중특이성 항체가 PB(PBXXXX(X)) 컬럼에서 확인된다. 이중특이성 항체 각각의 중쇄 가변 영역(MFXXXX)은 표적 1 및 표적 2의 컬럼들에 나타나 있다. 경쇄의 서열은 모든 항체에 대해 동일하며, 서열 번호 26의 공통 경쇄 IgKV1*39/jk1의 아미노산 서열을 갖는다. ExPASy, ProtParam 도구로 계산된 pI는 pI 컬럼에서 각각의 중쇄 가변 영역에 대해 표시된다. 2개의 중쇄 가변 영역 사이의 pI 차이와 측정된 체류 시간은 마지막 2개의 컬럼에 나타나 있다. 측정된 체류 시간 및 계산된 pI 및 평균 pI는 이중특이성 항체의 커플이 CIEX 크로마토그래피에서 효율적으로 동시용리될 수 있다는 것을 나타낸다. 항체는 IgG1 불변 영역 및 공통 경쇄를 갖는다. 공유 중쇄 가변 영역(동일한 MF)이 CH3 DE 중쇄 또는 KK 중쇄를 갖는 중쇄가 나타나 있다. 체류 시간은 각각의 이중특이성에 대해 수행된 CIEX 크로마토그래피에 대해 표시되며, CIEX 크로마토그래피에 대한 예시적인 조건은 재료 및 방법 섹션에 설명되어 있다. 많은 다른 CIEX 크로마토그래피 조건은 제공된 pI 값을 갖는 나열된 이중특이성 항체 쌍들 사이의 적합한 체류 시간을 야기할 것이다.

도 8

각각의 항체의 중쇄 가변 영역(MFXXXX) 및 경쇄 가변 영역의 CDR의 아미노산 서열 및 공통 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열.

실시예

실시예 1

재료 및 방법

세포주

HEK293 및 CHO-K1을 성장 배지에서 유지시켰다.

이중특이성 항체의 생성

이중특이성 항체의 효율적인 이종이량체화 및 형성을 보장하기 위해 독점적인 CH3 기술을 사용하여 이중특이성 항체를 생성하였다. CH3 기술은 CH3 영역에서 전하-기반 점 돌연변이를 사용하여, 앞서 기재된 바와 같은 2개의 상이한 중쇄 분자의 효율적인 쌍형성을 가능하게 한다(PCT/NL2013/050294호; WO 2013/157954 A1호로 공개됨).

VH 유전자를 2개의 상이한 골격 IgG1 벡터들 중 하나에서 클로닝하였다. 결합 파트너에 따라, VH는 이종이량체화 변이체 "DE"를 갖는 CH3 변이체를 포함하는 IgG1 골격에서 또는 상보적 CH3 이종이량체화 변이체 "KK"를 포함하는 IgG1 골격에서 클로닝되었다. 2개 이상의 항체가 중쇄를 공유하는 이중- 또는 다중특이성 항체의 경우. 공유 사슬은 바람직하게는 CH3 이종이량체화 변이체 "DE"(DE-중쇄로도 지칭됨)를 갖고, 2개 이상의 특유의 중쇄는 CH3 이종이량체화 변이체 "KK"(KK-중쇄로도 지칭됨)를 갖는다.

HEK293 세포를 DNA-FUGENE 혼합물로 일시적으로 형질감염시키고 추가로 배양하였다. 형질감염 7일 후, 상청액을 수확하였고 배지를 재생하였다. 형질감염 14일 후, 상청액들을 배합하고 0.22 μM을 통해 여과하였다. 멸균 상청액을 4℃에서 보관하였다. 현탁 적응화된 293F 세포를 밀도가 3.0 × 10e6 세포/ml가 될 때까지 진탕기 받침대에 있는 T125 플라스크 내에서 배양하였다. 세포를 24-딥 웰 플레이트(deep well plate)의 각각의 웰 내에서 0.3 내지 0.5 × 10e6개 생존가능 세포/ml의 밀도로 시딩하였다. 세포를 개별 멸균 DNA: PEl-MIX로 일시적으로 형질감염시키고, 추가로 배양하였다. 형질감염 7일 후, 상청액을 수확하였고, 0.22 μM을 통해 여과하였다. 멸균 상청액을 4℃에서 보관하였다.

2개의 이중특이성 항체를 동시발현하는 안정한 세포주 풀의 생성

CHO 세포를 공통 경쇄 작제물(cLC):EGFR 중쇄:HER2 중쇄:HER3 중쇄 = 2.5:2:1:1의 몰비로 3개의 중쇄 작제물 및 공통 경쇄 작제물로 형질감염시켰다. 안정하게 형질감염된 세포의 10개의 풀을 얻었다(A-J). 항-EGFR, 항-HER2 및 항-HER3 항체의 ELISA 분석을 10개 풀의 일수 3 및 일수 6 상청액에 대해 수행하였다. 3종 모두가 모든 풀에서 검출될 수 있었다.

2개의 이중특이성 항체를 동시발현하는 안정한 세포주 클론의 생성.

풀을 반고체 배지에 플레이팅하고 7 내지 10일 동안 성장시키게 하였다. 단일 콜로니를 골라내어 24 웰 배양 플레이트 내로 시딩하였다. 배양물의 상청액으로부터의 항체의 수집 전에 콜로니를 재시딩하였다.

항체 역가의 결정

단일 이중특이성 항체를 함유하는 샘플의 항-HER2 항체 역가를 Erbb-2 Fc 단백질(R&D 시스템)에 대한 ELISA에 의해 결정하였다. 단일 이중특이성 항체를 함유하는 샘플의 항-HER3 역가를 인간 Erbb-3 Fc 단백질(R&D 시스템)에 대한 ELISA에 의해 결정하였다. 단일 이중특이성 항체를 함유하는 샘플의 항-EGFR 항체 역가를 인간 EGFR ECD-Fc 단백질(R&D 시스템)에 대한 ELISA에 의해 결정하였다. 5 ㎍/ml에서 시작하여, 항원의 연속 2배 희석액을 사용하여 ELISA 플레이트의 웰을 코팅하였다.

2개의 이중특이성 항체의 혼합물을 포함하는 조성물에서 EFGR × HER2 및 EGFR × HER3 이중특이성 항체를 정량화하기 위한 ELISA 검정을, ELISA 플레이트를 EGFR-Fc(R&D 시스템)로 코팅함으로써 수행하였다. 세척 후 플레이트를 샘플과 함께 인큐베이션하였다. 세척 후, 하나의 EFGR 아암 및 하나의 HER2 아암을 갖는 결합된 이중특이성 항체의 존재를, 표지된 HER2-Fc와 함께 인큐베이션함으로써 검출하였다. 하나의 EFGR 아암 및 하나의 HER3 아암을 갖는 결합된 이중특이성 항체의 존재를, 표지된 HER3-Fc와 함께 인큐베이션함으로써 검출하였다.

IgG 정제

친화성 크로마토그래피를 사용하여 IgG의 정제를 수행하였다. 진공 여과를 사용하여 멸균 조건 하에서 정제를 수행하였다. 먼저, 배지의 pH를 pH 8.0으로 조정하고, 후속으로, 생성물을 600 rpm으로 진탕 플랫폼 상에서 25℃에서 2시간 동안 단백질 A 세파로스(Sepharose) CL-4B 비드 (50% v/v) (Pierce)와 함께 인큐베이션하였다. 다음으로, 비드를 진공 여과에 의해 수집하였다. 비드를 PBS (pH 7.4)로 2회 세척하였다. 이어서, IgG를 0.1 M 시트르산 완충액을 사용하여 pH 3.0에서 용리시키고, IgG 분획을 Tris pH 8.0을 사용하여 즉시 중화시켰다. Ultracel(Millipore)를 사용한 원심분리에 의해 완충액 교환을 수행하였다. 샘플을 PBS pH 7.4의 최종 완충액으로 마무리하였다.

양이온-교환 크로마토그래피 (CIEX)

CIEX-HPLC 크로마토그래피를 TSKgel SP-STAT(7 μm 입자 크기, 4.6 mM I.D. × 10 cm L, Tosoh 21964) 시리즈의 이온 교환 컬럼을 사용하여 수행하였다. 컬럼은 생체분자의 단리뿐만 아니라 빠른 고해상도 분석을 위해 비다공성 수지 입자로 패킹된다. TSKgel STAT 컬럼 내의 입자가 로딩 용량을 위한 다층 이온-교환 그룹의 개방형 액세스 네트워크를 포함하는 한편, 입자 크기는 이러한 컬럼을 HPLC 및 FPLC 시스템에 적합하게 한다.

완충액 A(소듐 포스페이트 완충액, 25 mM, pH 6.0)를 사용하여 TSKgel SP-STAT(7 μm 입자 크기, 4.6 mM I.D × 10 cm L, Tosoh 21964)를 평형화하고, 그 후에는, 염 농도를 증가시키고 완충액 B(25 mM 소듐 포스페이트, 1 mM NaCl, pH 6.0)의 구배를 실행시킴으로써 항체를 컬럼으로부터 제거하였다. 유속은 0.5 mL/min으로 설정하였다. 모든 시험 샘플 및 대조군(PBS 중)에 대한 주입 샘플 질량은 10 ㎍이었고, 주입 부피는 10 내지 100 μl였다. 크로마토그램은 220 nm 결과에 기초하여 관찰된 주 피크에 대한 피크 패턴, 체류 시간 및 피크 면적에 대해 분석된다.

결과

이중특이성 항체 PB4516p08 및 PB6892p04의 CIEX 프로파일을 비교하였다(도 2 참조). PB6892의 생성에는 유의한 양의 불순물이 포함되어 있다는 것이 관찰되었다. 또한 PB6892의 이중특이성 항체 분획의 체류 시간은 PB4516의 이중특이성 항체 분획의 체류 시간보다 유의하게 낮았다. 동일한 세포에 의한 동시생성 및 CIEX를 사용한 후속 동시정제의 경우, 2개의 이중특이성 항체의 체류 시간은 바람직하게는 서로 더 가깝다. 이러한 이유로, PB6892에 대한 HER2 아암의 가변 영역은 상이한 가변 영역으로 대체되었다. 가변 영역 MF2032를 갖는 중쇄를 선택 및 사용하여 EGFR × HER2 이중특이성 항체 PB11244를 생성하였다. PB4516p10 및 PB11244p01의 CIEX 프로파일이 도 3에 도시되어 있다. 이중특이성 항체 분획들의 체류 시간은 각각 16.310 및 16.950이다. 이들 체류 시간은 표시된 조건 하에서 CIEX를 사용한 동시정제를 가능하게 하기에 충분히 동일하다. 추가로, 이 도면은 불순물의 체류 시간이 분석 및 분취 컬럼에서의 효율적인 분리를 허용하기에 충분히 상이하다는 것을 보여준다. 상기 이중특이성 항체 제제를 HEK293 세포에서 생성하였다.

공동 생성을 위하여 CHO-K1 세포를 사용하였다. CHO 세포를 MF3755(EGFR), M2032(HER2) 및 MF3178(HER3)의 각각의 가변 영역을 갖는 3개의 중쇄를 함유하는 작제물로 형질감염시켰고, 서열 번호 26의 경쇄 가변 영역을 발현하는 작제물과 함께 CHO-K1 세포 내로 형질감염시켰다. 벡터 양성 세포를 선택 및 풀링하였다. 형질감염된 CHO-K1 세포의 10개의 개별 풀(A-J로 식별됨)을 생성하였다.

표 1은 각각의 풀에 의해 생성된 이중특이성 항체 PB4516 (EGFR × HER3) 및 PB11244 (EGFR × HER2)의 양을 나타낸다. 또한, 생성된 IgG의 총량뿐만 아니라 양들의 비가 나타나 있다. 풀 F 및 J를 서브클로닝을 위해 선택하였다.

표 2는 각각의 클론에 의해 생성된 이중특이성 항체 PB4516 (EGFR × HER3) 및 PB11244 (EGFR × HER2)의 양을 나타낸다.

클론 FST2cp12에 의해 생성된 항체를 사용하여 CIEX 프로파일을 분석하였다(도 4 참조). 2개의 이중특이성 항체가 동일한 CIEX 용리 분획에서 효율적으로 동시용리되는 것은 명백하다.

클론 FST2cp09를 추가로 서브클로닝하여, 세포주가 클론임을 확인하였고, 생성된 항체의 추가의 CIEX 프로파일을 결정하였다. 도 5는 CIEX 프로파일을 나타낸다. 2개의 이중특이성 항체가 동일한 CIEX 용리 분획에서 효율적으로 동시용리되는 것은 명백하다. 동시용리에서 2개의 이중특이성 항체의 상대적인 기여는 ELISA에 의해 그리고/또는 소수성 상호작용 컬럼에 의해 분석된다. 이중특이성 항체 특이적 ELISA는 743 ㎍/ml의 EGFR/HER2 이중특이성 항체 PB11244 및 1134 ㎍/ml의 EGFR/HER3 이중특이성 항체 PB4516의 존재를 나타내었다.

실시예 2

2개의 이중특이성 항체를 동시발현하는 안정한 세포주 풀의 생성

도 7에 나열된 2 × 2개의 이중특이성 항체를 발현하는 세포주는 하기와 같이 생성된다. CHO 세포는 3개의 중쇄 작제물 및 공통 경쇄 작제물로 형질감염된다. 3개의 중쇄는 박스에 표시된 중쇄 가변 영역(MFXXXX)에 의해 확인된다. 경쇄는 서열번호 26의 IgVk1*39/jk1의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 2개의 이중특이성 항체는 하나의 중쇄를 공통적으로 그리고 하나의 상이한 중쇄를 각각 갖는다. 예를 들어, 도 7에 명시된 제1 커플은 중쇄 가변 영역(MF3178) 및 상이한 제2 결합 아암을 포함하는 동일한 HER3 결합 아암을 포함하는 공통 중쇄를 공유한다. PB4528은 중쇄 가변 영역(MF4003)을 갖는 EGFR 결합 아암을 갖고, PB4188은 중쇄 가변 영역(MF3958)을 갖는 HER2 결합 아암을 갖는다. 공유 중쇄는 양립가능한 DE/KK 이종이량체화 도메인의 KK CH3 영역을 갖는다. 공유 중쇄 아암은 또한 DE CH3 영역을 가질 수 있다. 예를 들어, 도 3 내지 도 5에서, 2개의 이중특이성 항체는 동시정제된 PB11244 및 PB4516이다. 도 3c에 도시된 바와 같이, PB11244 및 PB4516은 중쇄 가변 영역(MF3755)을 갖는 동일한 EGFR 결합 아암을 공유하고 PB11244는 중쇄 가변 영역(MF2032)을 갖는 HER2 결합 아암을 갖고 PB4516은 중쇄 가변 영역(MF3178)을 갖는 HER3 결합 아암을 갖는다. 이중특이성 항체들의 이러한 쌍 내의 공유 중쇄 아암이 DE CH3 영역을 갖는 한편, 상이한 HER2 및 HER3 결합 아암들은 KK CH3 영역을 갖는다.

공통 경쇄 작제물(cLC):공유 중쇄 작제물:상이한 중쇄 작제물 1:상이한 중쇄 작제물 2의 몰비는 2.5:2:1:1이다. 안정하게 형질감염된 세포의 풀이 얻어진다. 항원의 ELISA 분석이 풀로부터 수집된 상층액에 대해 수행된다. 3개의 항원 결합 종 모두가 풀에서 검출된다. 도 7의 각각의 커플에서의 이중특이성 항체의 CIEX 체류 시간은 유사한 CIEX 조건 하에서 결정되고, 8번째 컬럼에 나타나 있다. 평균 체류 시간으로부터의 편차는 식 100x((A-B)/(A+B))로 계산되는데, 여기서 A는 최장 체류 시간을 갖는 이중특이성 항체의 체류 시간이다. 예를 들어, 제1 커플에 대한 편차는 100x((16.46-16.24)/(16.46+16.24))= 0.67 또는 0.7%이다.

수집된 상청액 중의 항체는 먼저 단백질 A 추출에 이은 산 용리 및 빠른 중화에 의해 상청액 중의 다른 단백질로부터 분리된다. 후속하여, 수집된 항체의 완충액은 PBS로 교환된다. 후속하여, 샘플은 CIEX 컬럼 상에 로딩되고, 세척되고, 증가하는 염 구배를 부여함으로써 용리된다. 용출액의 흡수는 220 nm으로 측정되고, 체류 시간은 염 구배의 시작 및 이중특이성 항체에 대한 피크(들)의 관찰로부터 계산된다. 이중특이성 항체가 수집되고, 수집된 용출액 중의 각각의 이중특이성 항체는 ELISA에 의해 검증된다. 각각의 이중특이성 항체에 대한 체류 시간은 마지막 컬럼에 나타나 있다. 다수의 커플이 CIEX 컬럼에서 효율적으로 동시용리되는 체류 시간을 갖는 것이 명백하다. CIEX 크로마토그래피는 동시용리 이중특이성 항체와 각각의 동종이량체(존재하는 경우)의 양호한 분리를 제공하는 것이 또한 명백하다. 도 6은 동시용리 이중특이성 항체에 존재하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄의 동종이량체를 갖는 다양한 항체의 체류 시간을 나열한다. 동종이량체의 체류 시간은 각각의 이중특이성 항체의 체류 시간과 충분히 상이한 것은 명백하다. 예를 들어, 도 7의 첫 번째 박스에서, 동종이량체 PG3178, PG3958 및 PG4003은 생성물에 존재할 수 있다. 각각의 동종이량체의 체류 시간은 약 22, 12 및 13인 반면(도 6의 행 1 내지 3), 중쇄 가변 영역을 포함하는 이중특이성 항체의 체류 시간은 약 19 및 19.5이다(도 7, 행 1 및 2).

[표 1]

표 1: 세포의 풀에서의 EGFRxHER2 및 EGFRxHER3 이중특이성 항체 생성의 정량화. 10개의 풀(A-J)의 배양 상청액을 평가하였다. ELISA 검정은 EGFR-Fc 코팅, 생성된 항체의 결합 및 표지된 HER2-Fc 또는 표지된 HER3-Fc를 사용한 검출을 기초로 하였다. 풀 A 내지 J를 2가지 ELISA 검정을 사용하여 분석하였다. 이중특이성 항체 PB4516 및 PB11244는 양립가능한 DE/KK 이종이량체화 도메인을 갖는 IgG1 중쇄 항체이다. 중쇄는 공통 경쇄와 조합된다. 이중특이성 항체는 하나의 중쇄 상에서 MF3755 중쇄 가변 영역을 공유하고, 각각은 다른 IgG1 중쇄 상의 상이한 중쇄 가변 영역, 즉 PB4516에 대해 MF3178을 그리고 PB11244에 대해 MF2032를 갖는다.

[표 2]

표 2: 선택된 풀을 단일 세포 클로닝에 사용하였다. 18개의 콜로니를 3개의 풀로부터 골라내었다. 2개의 독립적인 풀 F(FST1 및 FST2) 및 하나의 풀 J(JST1)를 단일 세포 클로닝에 사용하였다. 숫자가 뒤에 붙은 표시 "cp"는 풀의 개별 콜로니를 식별한다. 골라낸 콜로니를 성장시키고 항체의 수집을 위해 사용하였다. 동일한 풀로부터의 개별 콜로니는 각각의 이중특이성 항체의 상이한 양 및 상이한 비율을 생성하였다.

SEQUENCE LISTING <110> Merus N.V. <120> Producing compositions comprising two or more antibodies <130> P121090PC00 <140> PCT/NL2020/050080 <141> 2020-02-14 <150> EP 19178542.7 <151> 2019-06-05 <150> EP 19157286.6 <151> 2019-02-14 <160> 31 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HER3-MF3178 <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp His Gly Ser Arg His Phe Trp Ser Tyr Trp Gly Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HER3-MF3163 <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Ser Tyr Ser Arg His Phe Tyr Ser Trp Trp Ala Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HER3-MF6061 <400> 3 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Gln Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp His Gly Ser Arg His Phe Trp Ser Tyr Trp Gly Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 4 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD1-MF6930 <400> 4 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Met Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Val Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Met Ile Ile Pro Val Phe Glu Thr Ala Thr Tyr Glu Lys Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Ile Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Thr Val Glu Ala Thr Leu Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 5 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD1-MF6256 <400> 5 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Met Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Val Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Met Ile Ile Pro Val Phe Asp Thr Ser Ser Tyr Glu Lys Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ile Thr Ile Ile Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Thr Val Glu Ala Thr Leu Leu Phe Asp Phe Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 6 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HER2-MF1849 <400> 6 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Asp Tyr Gly Ser Tyr Ser Ser Tyr Ala Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 7 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LGR5-MF7423 <400> 7 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ser Ile Ile Pro Ile Leu Gly Thr Thr Asp His Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Gly Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Asp Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Ile Ala Ala Arg Leu Asp Tyr Phe Asp Ser Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR-MF3755 <400> 8 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Ala Asn Thr Gly Asp Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Glu Arg Phe Leu Glu Trp Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 9 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LGR5-MF7428 <400> 9 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ser Ile Ile Pro Ile Leu Gly Thr Thr Asp His Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Ser Lys Thr Thr Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Leu Ile Ala Ala Arg Leu Asp Tyr Phe Asp Ser Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 10 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LGR5-MF7533 <400> 10 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ser Ile Ile Pro Ile Leu Gly Thr Thr Asp His Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Gly Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Asp Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Ile Ala Ala Arg Leu Asp Tyr Phe Asp Ser Trp Gly 100 105 110 Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 11 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LGR5-MF7532 <400> 11 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Lys Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asp Thr Gly Asp Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asp Cys Asp Ser Thr Ser Cys Tyr Arg Tyr Ser Tyr Gly 100 105 110 Tyr Glu Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 12 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR-MF4280 <400> 12 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu 20 25 30 Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Phe Asp Pro Glu Tyr Gly Lys Thr Phe Phe Ala Gln Asn Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Ala Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Glu Gly Tyr Tyr Glu Thr Thr Thr Tyr Tyr Tyr Asn Leu Phe 100 105 110 Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 13 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HER2-MF3958 <400> 13 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr 20 25 30 Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Pro Val Tyr Tyr Asp Ser Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 14 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR-MF4003 <400> 14 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Pro Ser Phe 20 25 30 Ala Met Asn Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Thr Thr Asn Thr Gly Asp Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Ser Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Tyr Asn Trp Ile Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> n.a. <400> 15 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 1 5 10 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> n.a. <400> 16 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 1 5 10 <210> 17 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HER2-MF3025 <400> 17 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Glu Glu Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Pro His Tyr Gly Tyr Asp Asp Trp Tyr Phe Ala Val Trp Gly 100 105 110 Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 18 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR-MF4010 <400> 18 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Asn 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Ile Thr Gly Asp Pro Ser Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Glu Phe Leu Glu Trp Leu Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 19 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TIM3-MF6501 <400> 19 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ser Asn Ala Trp Asp Ser Met Ala Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 20 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HER2-MF1898 <400> 20 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Gly Phe Arg Arg Thr Thr Leu Ser Gly Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 21 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HER2-MF2032 <400> 21 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Tyr Tyr Arg Arg Thr Ala Arg Ala Gly Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 22 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR1 <400> 22 Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 1 5 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR2 <400> 23 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR3 <400> 24 Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro 1 5 <210> 25 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgVk1-39*01 <400> 25 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro 85 90 95 <210> 26 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Common Light Chain IgKV1*39/jk1 <400> 26 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 27 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Common Light Chain IgKV1*39/jk5 <400> 27 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 28 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG1 CH1 <400> 28 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys 100 105 <210> 29 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG1 CH2 <400> 29 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 35 40 45 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 85 90 95 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 110 <210> 30 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG1 CH3 KK <400> 30 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Lys Pro Pro Ser Arg Glu 1 5 10 15 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 31 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG1 CH3 DE <400> 31 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Asp Pro Pro Ser Arg Glu 1 5 10 15 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Glu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105

Claims (23)

1. 적어도 2개의 항체를 생성하는 방법으로서,
   - 항체를 인코딩하는 핵산을 세포에 제공하는 단계;
   - 상기 세포를 배양하는 단계;
   - 배양물로부터 항체를 수집하는 단계; 및
   - 이온 교환 크로마토그래피(IEX)에 의해 절반 항체(half antibody)로부터, 생성된 항체를 분리하는 단계를 포함하고,
   상기 방법은 항체가 사용된 IEX 조건 하에서 개별 항체의 체류 시간의 평균으로부터 10% 이하만큼 벗어나는 IEX 체류 시간을 나타내는 것을 특징으로 하는, 방법.
2. 제1항에 있어서, 배양물로부터 항체를 수집하는 단계는 항체 친화성 정제에 의해, 바람직하게는 단백질 A 추출에 의해, 다른 단백질로부터 항체를 정제하는 단계를 포함하는, 방법.
3. 제2항에 있어서, 친화성 정제된 항체를 크기-배제 크로마토그래피(겔-여과 크로마토그래피) 및/또는 음이온-교환 크로마토그래피에 적용시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, IEX에 후속하여 수집된 항체는 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)에 의해 상대적인 발현 수준에 대해 정량적으로 분석되는, 방법.
5. 제4항에 있어서, 수집된 항체의 특이성은 ELISA에 의해 검증되는, 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 절반 항체의 체류 시간은 항체의 체류 시간이 걸쳐있는 범위 밖에 있는, 방법.
7. 제6항에 있어서, 세포는 3개의 중쇄를 생성하는, 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 중쇄는 중쇄의 효율적인 이종이량체화를 위한 도메인을 포함하는, 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체들 중 적어도 2개는 이중특이성 항체인, 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체들 중 적어도 2개는 동일한 중쇄를 공유하는, 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 상기 적어도 2개의 항체의 평균 등전점(pI)으로부터 0.4 단위 이하만큼 상이한 pI를 갖는, 방법.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 사용된 IEX 조건 하에 전체 항체의 체류 시간과 유의하게 상이한 체류 시간을 갖는 중쇄 및 경쇄 조합을 갖도록 선택되는, 방법.
13. 제12항에 있어서, 중쇄 및 경쇄 조합의 pI는 상기 적어도 2개의 항체의 평균 pI로부터 0.4 단위 초과만큼 상이한, 방법.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄는 중쇄의 이종이량체화에 유리한 CH3 도메인을 포함하는, 방법.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체의 중쇄는 IgG 중쇄인, 방법.
16. 제7항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 하나의 중쇄는 CH3 영역 내에 아미노산 치환 L351K 및 T366K(EU 넘버링)를 포함하고 다른 중쇄는 CH3 영역 내에 아미노산 치환 L351D 및 L368E를 포함하는, 방법.
17. 적어도 2개의 항체를 생성하는 방법으로서,
    - 항체를 인코딩하는 핵산을 세포에 제공하는 단계;
    - 상기 세포를 배양하는 단계;
    - 배양물로부터 항체를 수집하는 단계; 및
    - 이온 교환 크로마토그래피(IEX)에 의해 절반 항체로부터, 생성된 항체를 분리하는 단계를 포함하고,
    상기 방법은 항체가 사용된 IEX 조건 하에서 개별 항체의 체류 시간의 평균으로부터 10% 이하로 벗어나는 IEX 체류 시간을 나타내고, IEX에 후속하여 수집된 항체는 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)에 의해 상대적인 발현 수준에 대해 정량적으로 분석되고, 수집된 항체의 특이성은 ELISA에 의해 검증되는 것을 특징으로 하는, 방법.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 방법에 의해 얻을 수 있는 2 내지 10개의 재조합 항체를 포함하는, 조성물.
19. 2 내지 10개의 재조합 항체를 포함하고, 상기 항체들 중 적어도 2개의 IEX 체류 시간이 IEX 조건 하에서 개별 항체의 체류 시간의 평균으로부터 10% 이하만큼 벗어나는 것을 특징으로 하는, 조성물.
20. 2 내지 10개의 재조합 항체를 포함하고, 상기 항체들 중 적어도 2개의 pI가 상기 적어도 2개의 항체의 평균 pI로부터 0.4 단위 이하만큼 상이한 것을 특징으로 하는, 조성물.
21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, IEX 체류 시간 및/또는 pI는 모든 항체에 대해 본질적으로 동일한 것을 특징으로 하는, 조성물.
22. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 항체들 중 적어도 2개는 이중특이성 항체인, 조성물.
23. 제22항에 있어서, 상기 항체들 중 적어도 2개는 동일한 중쇄를 공유하는, 조성물.

Images