KR20200045485A - 바이러스 오염물을 불활성화하는 방법 - Google Patents

바이러스 오염물을 불활성화하는 방법 Download PDF

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로르 카후자크
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Abstract

본 발명은 배양된 세포로부터 출발하여 바이러스 오염물이 없는 항체-함유 용액을 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 상기 항체 함유 용액을 용매 및 세제의 혼합물로 또는 높은 pH로 처리하는 단계를 포함한다.

Description

바이러스 오염물을 불활성화하는 방법
본 발명은 바이러스 불활성화 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 치료 항체를 함유하는 바이러스-무함유 용액(virus-free solution)의 제조에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 치료 항체의 정제 단계들 및 바이러스 불활성화 처리를 포함하는 대량 원료 약물(bulk drug substance)의 제조 방법에 관한 것이다.
단백질과 같은 생체분자는 질병의 치료를 위한 약제로서 사용되는 경우, 생산 공정은 인간 건강을 보장하도록 설계된다. 치료 단백질의 생산에 전형적으로 사용되는 세포 배양물 및 다른 생물학적 물질은 원천(source) 물질에 존재하거나 생산 공정 동안 도입된 바이러스에 의해 오염될 수 있다. 제거되지 않거나 비가역적으로 불활성화되지 않는다면, 바이러스 오염물은 그 약물을 사용하는 개인의 건강에 위험을 나타낸다. 따라서, 인간에 사용하기에 안전한 약제를 제조하기 위해, 생산된 단백질은 활성 바이러스 오염물이 없는 것이 요구된다(CPMP/ICH/295/95).
치료 단백질을 제조하기 위해, 정제 공정은 혼합된 생물학적 출발 물질의 나머지로부터 치료 단백질을 분리하기 위해 수행된다. 크로마토그래피 및 여과와 같은 정제 단계들은 바이러스 제거에 기여하며, 바이러스 청소(viral clearance)를 보장하는 특정 바이러스 불활성화 기술과 조합된다. 바이러스 불활성화 방법은 당업계에 공지되어 있다. 혈장 산물에서 바이러스 불활성화를 보장하기 위한 방법은 세계 보건 기구(WHO)의 기술 보고서, 부록 4 가이드라인에 의해 확립되어 있는 것처럼, 바이러스 지질 엔벨로프(virus lipid envelope)를 용해시켜 바이러스 활성을 손상시키는 용매/세제(S/D) 혼합물로 상기 혈장 산물을 처리하는 것으로 구성된다. 이러한 처리의 최적화는 1회용 백(bag) 시스템에서 혈장 산물의 S/D 처리를 허용하고(Hsieh, YT. et al. Transfusion. 2016 Jun; 56(6): 1384-93); WHO 기술 보고서, 부록 4 가이드라인(WO2012082931)에 표시된 것과 비교하여 더 낮은 온도 및 더 짧은 시간 조건에서 재조합 인자 VIII을 처리하도록 수행되었다. 또한, 비상업적 연구 규모에서 S/D 처리는 인간 하이브리도마 세포주 유래의 항-D 항체 함유 샘플에 대한 추가 바이러스 제거 단계로서 적용되었다(Robert PL, Biotechnol Prog. 2014 Nov-Dec; 30(6): 1341-7). 또한, 불활성화는 바이러스 단백질 변성을 유도하는 낮은 pH(Shukla AA et al, Pharm. Bioprocess., 2015, 3(2):127-138), 또는 고온(저온살균)(US4749783)으로의 처리에 의해 달성될 수도 있다. 이들 처리는 엔벨로프형 및 비엔벨로프형 바이러스에 대해 효과적이지만, 이들은 변성에 민감할 수도 있기 때문에 모든 치료 단백질에 이용될 수는 없다.
치료 단백질의 중요한 부류는 동물 신체에 의해 생성된 항체 중 하나와 같이, 천연 구조를 가질 수 있는 모노클로날 항체, 및 이들의 특성을 향상시키기 위해 다수의 방식으로 조작된 모노클로날 항체이다. 항체는 여러 유형의 암 및 면역계의 장애를 포함하는 다양한 질환의 치료 및 진단을 위한 약물로서 사용될 수 있다. 모노클로날 항체는 일반적으로 조절된 세포 배양 조건 하에서 대규모로 증식된 후 수확되는, 항체의 암호화 서열을 포함하는 형질감염된 세포주를 사용하여 상업적으로 생산된다. 수확후, 항체는 정제되고 정제 공정에서 바이러스 불활성화를 위한 표준 절차는 낮은 pH에서 샘플의 항온처리를 포함한다(WO2010048192; Liu HF et al. MAbs. 2010 Sep-Oct; 2(5): 480-99).
항체는 낮은 pH와 같은 비-생리학적 조건에 민감할 수 있고, 향상된 이펙터(effector) 기능을 갖거나 또는 동종이량체보다는 이종이량체를 우선적으로 형성하도록 조작되는 경우, 더 쉽게 분해될 수 있다. 항체-기반 치료제는 계속 팽창하며 이 생성물의 복잡성도 역시 팽창함으로, 새로운 바이러스 비활성화 전략의 개발이 요구된다.
또한, 항체와 같은 치료 단백질의 정제 공정은 바이러스 불활성화에 흔히 사용되는 낮은 pH와 상용될 수 없으므로, 이용할 수 있는 대안적 바이러스 불활성화 방법의 제조는 정제 공정의 개발 및 개선을 용이하게 할 것이다.
본 발명은 기존의 바이러스 불활성화 시도들이 유효하지 않거나 항체 산물의 분해 또는 일부 다른 원하지 않는 결과를 초래하거나 또는 항체 정제 공정과 상용되지 않는 경우, 상업적으로 생산된 항체를 바이러스 불활성화하기 위한 새로운 방법에 관한 것이다.
본 발명은 항체와 같은 치료 단백질의 정제 과정에서 채택된 새로운 바이러스 불활성화 방법에 관한 것이다. 항체 정제 과정에 사용되는 고전적인 방법은 낮은 pH에서 항체-함유 용액의 항온처리(incubation)이다. 그럼에도 불구하고, 정제 과정의 최적화는 낮은 pH와 비상용성인 단계의 개발을 유도할 수 있다. 또한, 낮은 pH-취약성 항체의 경우, 이 방법은 항체의 안정성을 손상시키므로 적합하지 않은 것으로 관찰되었다. 본 발명에 제시된 바이러스 불활성화의 새로운 방법은 이러한 문제점을 극복할 수 있게 한다.
특히, 본 발명은 항체 정제 과정 동안 바이러스 오염이 없는 항체 용액을 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 바이러스-무함유 항체 용액의 제조는 항체를 발현하는 형질감염된 세포의 배양물로부터 시작하고, (i) 형질감염된 세포에 의해 생성된 항체 물질을 수확하는 단계 및 (ii) 상기 항체 수확물질을 용매 세제 또는 높은 pH로 처리하는 단계를 포함한다.
보다 구체적으로, 본 발명은 (i) 세포 배양이 수행된, 항체의 암호화 서열을 포함하는 형질감염된 세포에 의해 생성된 항체 물질을 수확하는 단계, (ii) 상기 수확된 항체 물질에 대하여, 용매 및 세제의 혼합물로의 항온처리 또는 높은 pH에서의 항온처리로 이루어진 군으로부터 선택되는, 바이러스 불활성화 처리 단계를 포함하는, 바이러스-불활성화된 항체 용액을 제조하는 방법에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 수확된 항체 물질은 인간을 제외한 포유동물 세포에서 생산된다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 수확된 항체 물질은 모노클로날 항체를 포함한다. 더욱 구체적인 실시형태에서, 모노클로날 항체는 재조합 항체이다. 특정 양태에서, 상기 재조합 항체는 다중특이적이다.
본 발명의 일 실시형태에서, 수확된 항체 물질은 용매 및 세제의 혼합물로의 항온처리되며, 여기서 상기 용매는 TnBP이고, 상기 세제는 Triton X-100, 폴리소르베이트 80 및 폴리소르베이트 20으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
더 구체적인 실시형태에서, 상기 TnBP의 농도는 약 0.1%(w/w) 이상, 약 1%(w/w) 이하이고, 특히 상기 TnBP의 농도는 약 0.1%(w/w), 약 0.3%(w/w), 약 0.5%(w/w) 및 약 1%(w/w)를 포함하는 군으로부터 선택된다.
다른 구체적인 실시형태에서, 상기 폴리소르베이트 80 또는 상기 폴리소르베이트 20의 농도는 약 0.1%(w/w) 이상, 특히 약 2%(w/w) 이하이고, 특히 상기 폴리소르베이트 80 또는 상기 폴리소르베이트 20의 농도는 약 0.2%, 약 0.5%(w/w), 약 0.75%(w/w), 약 1%(w/w), 약 1.25%(w/w)를 포함하는 군으로부터 선택된다.
더 구체적인 실시형태에서, 상기 용매 및 세제의 혼합물은 0.3%(w/w) TnBP와 0.5%(w/w) 폴리소르베이트 80의 혼합물 및 0.3%(w/w) TnBP와 1%(w/w) 폴리소르베이트 80의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특히 더 구체적으로, 상기 수확된 항체 물질은 적어도 5분 동안 0.3%(w/w) TnBP와 1%(w/w) 폴리소르베이트 80의 혼합물로 항온처리된다.
특정 실시형태에서, 상기 수확된 항체 물질은 먼저 단백질 A 크로마토그래피로 처리되고, 생성된 단백질 A 용출액은 실온에서 10분 이상 동안 0.3%(w/w) TnBP와 1%(w/w) 폴리소르베이트 80의 혼합물로 항온처리된다.
또 다른 특정 실시형태에서, 상기 수확된 항체 물질은 정제된 수확물이고, 실온에서 교반하에 약 60분 동안 0.3%(w/w) TnBP와 1%(w/w) 폴리소르베이트 80의 혼합물로 항온처리된다.
본 발명의 일 실시형태에서, 수확된 항체 물질은 높은 pH로 항온처리되고, 여기서 높은 pH는 9 이상 및 12.5 이하이다. 더 구체적으로, 상기 높은 pH는 적어도 10.5이다. 더욱 구체적으로, 상기 높은 pH는 약 11이다.
구체적인 실시형태에서, 본 발명에 따른 수확된 항체 물질은 먼저 단백질 A 크로마토그래피로 처리되고, 생성된 A 용출액은 상기 높은 pH에서의 항온처리된다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단백질 A 용출액은 Tris, 히스티딘, L-아르기닌, 인산염 및 NaOH의 군으로부터 선택된 완충액으로 상기 목표한 높은 pH로 적정되고, 항온처리된다.
본 발명의 더 구체적인 양태에서, 상기 단백질 A 용출액은 실온에서 약 60 분 동안 NaOH 0.5M에 의해 목표 pH 11로 적정된다.
일 실시형태에서, 본 발명의 방법은 바이러스 불활성화 분석으로 바이러스-불활성화된 항체 용액의 일부를 시험하는 추가 단계 (iii)을 포함한다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 대량 원료 약물의 제조 방법에 관한 것이다:
(a) 제13항에서와 같은 용매 세제 처리에 의한 수확한 항체 물질의 바이러스 불활성화 단계;
(b) 생성된 바이러스 불활성화된 용액의 단백질 A 크로마토그래피 단계;
(c) 상기 단백질 A 용출액을 pH 6.0으로 중화한 후, 0.2 ㎛ 여과하는 단계;
(d) 상기 중화된 단백질 A 용출액을 양이온 교환 크로마토그래피한 후, 0.2 ㎛ 여과하는 단계;
(e) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 용출액을 한외여과 및 연속 정용여과(diafiltration)하여 농축한 후, 0.2 ㎛ 여과하는 단계;
(f) 막 흡착을 사용하여 관통(flow through) 방식으로 음이온 교환 크로마토그래피로 생성물을 정제한 후, 0.2 ㎛ 여과하는 단계;
(g) 바이러스 나노여과하는 단계;
(h) 상기 생성물을 한외여과 및 연속 정용여과에 의해 예비조제(preformulation) 완충액 내로 농축한 후, 0.2 ㎛ 여과하는 단계,
(i) pH 5.9에서 5mM 구연산염, 15% 수크로오스, 0.06% 폴리소르베이트 80를 혼합한 후 0.2 ㎛ 여과하여 최종 조제 완충액에 6 mg/ml의 생성물을 목표로 부형제를 첨가하는 단계,
(j) 상기 생성물을 멸균 백에 충진한 후, 동결하고 -80±20℃에서 보관하는 단계.
또한, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 대량 원료 약물을 제조하는 방법을 개시한다:
(a) 수확한 항체 물질을 단백질 A 크로마토그래피하는 단계;
(b) 상기 생성된 PA 용출액을 제18항에서와 같은 높은 pH에서의 항온처리하는 단계;
(c) 생성된 바이러스 불활성화된 용액을 pH 5.5로 중화한 후, 0.2 ㎛ 여과하는 단계;
(d) 상기 중화된 바이러스 불활성화된 단백질 A 용출액을 양이온 교환 크로마토그래피한 후, 0.2 ㎛ 여과하는 단계;
(e) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 용출액을 한외여과 및 연속 정용여과에 의해 농축한 후, 0.2 ㎛ 여과하는 단계;
(f) 상기 생성물을 막 흡착을 사용하여 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 관통 방식으로 정제한 후, 0.2 ㎛ 여과하는 단계;
(g) 바이러스 나노여과하는 단계;
(h) 상기 생성물을 예비조제(preformulation) 완충액 내로 한외여과 및 연속 정용여과에 의해 농축한 후, 0.2 ㎛ 여과하는 단계,
(i) 5mM L-히스티딘, 150mM L-아르기닌 일염산염, 15% 수크로오스, 0.06% 폴리소르베이트 80, pH 6.0을 혼합한 후, 0.2 ㎛ 여과하여 최종 조제 완충액에 6 mg/ml의 상기 생성물을 목표로 부형제를 첨가하는 단계,
(j) 상기 생성물을 멸균 백에 충진한 후, 동결시키고 -80±20℃에서 보관하는 단계.
또한, 본 발명은 모노클로날 항체, 완충액, 계면활성제 및 안정화제를 포함하는 액체 약학적 제제를 개시하며, 상기 모노클로날 항체는 상기 약학적 제제에 약 0.01 mg/mL 이상 및 약 100 mg/mL 이하의 농도, 바람직하게는 약 6 mg/mL의 농도로 존재하고, 상기 완충액은 상기 약학적 제제에 약 5 mM의 농도로 존재하는 구연산염이고, 상기 계면활성제는 상기 약학적 제제에 약 0.06%의 백분율로 존재하는 폴리소르베이트이고, 상기 안정화제는 상기 약학적 제제에 약 15%의 백분율로 존재하는 수크로스이며, 상기 약학적 제제는 약 5.9의 pH를 갖는다.
또한, 본 발명은 모노클로날 항체, 완충액, 계면활성제 및 안정화제를 포함하는 액체 약학적 제제를 개시하며, 상기 모노클로날 항체는 상기 약학적 제제에 약 0.01 mg/mL 이상 및 약 100 mg/mL 이하의 농도, 바람직하게는 약 6 mg/mL의 농도로 존재하고, 상기 완충액은 상기 약학적 제제에 약 5 mM의 농도로 존재하는 L-히스티딘이고, 상기 계면활성제는 상기 약학적 제제에 약 0.06%의 백분율로 존재하는 폴리소르베이트이고, 상기 안정화제는 상기 약학적 제제에 약 15%의 백분율로 존재하는 수크로스 및 상기 약학적 제제에 약 120 mM의 농도로 존재하는 L-아르기닌 일염산염이며, 상기 약학적 제제는 약 6.0의 pH를 갖는다.
또한, 본 발명은 세포 수확물을 높은 pH로 처리하는 단계, 이어서 여과 단계를 포함하는, 세포 수집물로부터 불순물을 제거하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서, 용어 "항체" 및 용어 "면역글로불린"은 상호교환가능하게 사용된다. 본원에서 언급되는 용어 "항체"는 전장(full-length) 항체 및 항체 단편을 포함한다. 항체는 항원 분자를 인식하고 불활성화시킴으로써 면역 반응에서 역할을 하는 혈장 세포에 의해 생성된 당단백질이다. 포유동물에서는 면역글로불린이 5가지 부류가 생성된다: IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE. 천연 형태로서 면역글로블린은 4 개의 폴리펩티드 사슬, 즉 2개의 동일한 중쇄(H) 사슬 및 2개의 동일한 경쇄(L) 사슬로 구성된 Y형 단위의 하나 이상의 카피로서 존재한다. 공유 이황화 결합 및 비공유 상호작용은 사슬간 연결을 가능하게 하며, 특히 중쇄는 서로 연결되어 있는 반면, 각 경쇄는 중쇄와 쌍을 이룬다. 중쇄 및 경쇄는 모두 N-말단 가변(V) 영역 및 C-말단 불변(C) 영역을 포함한다. 중쇄에서, 가변 영역은 하나의 가변 도메인(VH)으로 구성되고, 불변 영역은 항체 부류에 따라 3개 또는 4개의 불변 도메인(CH1, CH2, CH3 및 CH4)으로 구성되는 반면; 경쇄는 가변 도메인(VL) 및 단일 불변 도메인(CL)을 포함한다. 가변 영역은 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 3개의 초가변 영역을 함유한다. 이들은 항원 결합 부위를 형성하고 항체에 특이성을 부여한다. CDR은 CDR의 위치를 한정하는 프레임워크 영역(framework region)(FR)으로 불리는, 4개의 더욱 보존된 영역 사이에 위치한다. 항원 결합은 도메인 위치의 유연성에 의해 용이하게 된다; 예를 들어, 3개의 불변 중쇄 도메인을 함유하는 면역글로블린은 표적과 상호작용을 위해 이동을 허용하는 "힌지 영역(hinge region)"으로 불리는 CH1과 CH2 사이에 스페이서를 제공한다. 본래의 천연 형태의 항체로부터 시작하여, 효소 분해는 항체 단편의 생성을 유도할 수 있다. 예를 들어, IgG를 엔도펩티다제 파파인과 함께 항온처리하면, 힌지 영역에서 펩티드 결합의 붕괴를 초래하고, 결과적으로 3개의 단편, 즉 각각 항원 결합할 수 있는 2개의 항체 결합(Fab) 단편, 및 결정화가능한 단편(Fc)이 생성된다. 펩신에 의한 분해는 대신 이황화 결합에 의해 연결된 2개의 Fab 단위들로 구성된 하나의 큰 단편 F(ab')2, 및 Fc 영역의 분해로부터 초래되는 많은 작은 단편들을 생성한다. 이들의 성질에 따라, 항체 및 항체 단편은 단량체성 또는 다량체성, 1가 또는 다가, 단일특이성 또는 다중특이성일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "전장 항체"는 적어도 2쌍의 중쇄 및 경쇄를 포함하는 천연의 무손상 구조의 항체를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "항체 단편"은 전장 항체의 하나 이상의 부분(들)을 포함한다. 항체 단편의 비제한적인 예로는 (i) IgA, IgD 및 IgG에서는 CH2 및 CH3 도메인으로 이루어지고 IgE 및 IgM에서는 CH2, CH3 및 CH4 도메인으로 이루어지며 이황화 결합 및 비공유 상호작용에 의해 쌍을 이루는 2개의 불변 중쇄 단편으로 구성된 결정화가능한 단편(Fc); (ii) VL, CL 및 VH로 이루어지고 CH1이 이황화 결합에 의해 연결된 항원 결합 단편(Fab); (iii) VL, CL 및 VH로 이루어지고 CH1이 이황화 결합에 의해 연결되며, 힌지 영역 유래의 하나 이상의 시스테인 잔기로 이루어진 Fab'; (iv) 시스테인 잔기가 유리 설프히드릴 기를 함유하는 Fab' 단편인 Fab'-SH'; (v) 힌지 영역에서 이황화 결합에 의해 연결된 2개의 Fab 단편으로 이루어진 F(ab')2; (vi) 비공유 상호작용에 의해 쌍을 이룬 VL 및 VH 사슬로 이루어진 가변 단편(Fv); (vii) 링커에 의해 함께 쌍을 이룬 VL 및 VH 사슬로 이루어진 단일 사슬 가변 단편(scFv); (ix) 이중특이적 단일 사슬 Fv 이량체, (x) scFv-Fc 단편; (xi) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (xii) VH 도메인 또는 VL 도메인으로 이루어진 단일 도메인 항체, dAb; (xiii) 동일 사슬 내의 쌍형성을 방지하고 2개의 scFv의 비공유 이량체화를 허용하는 짧은 펩티드에 의해 VH와 VL 도메인이 연결된 2개의 scFv 단편으로 이루어진 이중항체(dibody); (xiv) VH와 VL 도메인이 짧은 펩티드에 의해 연결된 3개의 scFv가 삼량체를 형성하는 3가 10 삼중항체; (xv) 단일 중쇄 및 단일 가변 사슬을 포함하는 절반-IgG를 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "동형이량체(homo-dimeric) 항체" 또는 "동형이량체 단편" 또는 "동형이량체"는 적어도 제1 및 제2 폴리펩타이드, 예컨대 제1 및 제2 도메인을 포함하는 면역글로불린 분자 또는 이의 일부를 포함하고, 여기서 제2 폴리펩타이드는 제1 폴리펩타이드와 아미노산 서열이 동일한 것이다. 바람직하게는, 동형이량체 면역글로불린은 2개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하고, 여기서 제1 사슬은 제2 사슬과 적어도 하나의 동일한 도메인을 갖고 있으며, 두 사슬은 어셈블리되고, 즉 동일한 도메인을 통해 상호작용한다. 구체적으로, 동형이량체 면역글로불린은 적어도 2개의 동일한 도메인을 포함하고 두 도메인은 어셈블리하고, 즉 각각의 단백질-단백질 계면을 통해 상호작용한다. 바람직하게는, 동형이량체 면역글로불린 단편은 적어도 2개의 도메인을 포함하고, 여기서 제1 도메인은 제2 도메인과 동일하고, 두 도메인은 어셈블리하며, 즉 각각의 단백질-단백질 계면을 통해 상호작용한다.
본 명세서에 사용된 용어 "이형이량체(hetero-dimeric) 항체" 또는 "이형이량체 단편" 또는 "이형이량체"는 적어도 제1 및 제2 폴리펩타이드, 예컨대 제1 및 제2 도메인을 포함하는 면역글로불린 분자 또는 이의 일부를 포함하고, 여기서 제2 폴리펩타이드는 제1 폴리펩타이드와 아미노산 서열이 상이하다. 바람직하게는, 이형이량체 면역글로불린은 2개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하고, 여기서 제1 사슬은 제2 사슬과 적어도 하나의 비동일한 도메인을 가지며, 두 사슬은 어셈블리하고, 즉 비-동일한 도메인을 통해 상호작용한다. 구체적으로, 이형이량체 면역글로불린은 적어도 2개의 도메인을 포함하고, 여기서 제1 도메인은 제2 도메인과 동일하지 않고, 두 도메인은 어셈블리하고, 즉 각각의 단백질-단백질 계면을 통해 상호작용한다. 더욱 바람직하게는, 이형이량체 면역글로불린은 적어도 2개의 다른 리간드, 항원 또는 결합 부위에 대해 결합 특이성을 가지며, 즉 이중특이성이다.
본원에 사용된 용어 "원자가(valence)"는 항체 내의 결합 부위의 수를 의미한다. 1가 이상을 가진 항체는 다가(multivalent)라고 부르며; 다가 항체의 비-제한적인 예는 2개의 결합 부위를 특징으로 하는 2가 항체; 3개의 결합 부위를 특징으로 하는 3가 항체, 및 4개의 결합 부위를 특징으로 하는 4가 항체이다.
본원에 사용된 용어 "단일특이적 항체"는 동일한 에피토프에 모두 결합하는 하나 이상의 결합 부위를 갖는 임의의 항체 또는 단편을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "다중특이적 항체"는 다른 항원들 또는 동일한 항원의 다른 에피토프에 결합할 수 있는 하나 이상의 결합 부위를 갖는 임의의 항체 또는 단편을 의미한다. 다중특이적 항체의 비제한적인 예는 이중특이적 항체이다.
용어 "이중특이적 항체"는 2개의 다른 항원 또는 동일한 항원의 2개의 다른 에피토프에 결합할 수 있는 2개의 결합 부위를 가진 임의의 항체를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "항원"은 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 분자를 의미한다. 항원의 예는 폴리펩티드, 단백질, 다당류 및 지질 분자를 포함한다. 이 항원에는 하나 이상의 에피토프가 존재할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "에피토프" 또는 "항원성 결정인자"는 항체와 직접적인 화학적 상호작용을 하는 항원의 일부를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 동일한 단일 세포로부터 모두 유래한 클론 세포에 의해 생성되고 표적 항원의 동일한 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 치료 항체를 생산하는 경우에는 모노클로날 항체의 발생이 폴리클로날 항체에 비해 바람직하다. 사실상, 모노클로날 항체는 단일 클론으로부터 유래하는 세포에 의해 생산되어 모두 동일한 에피토프에 결합하지만, 폴리클로날 항체는 다른 면역 세포에 의해 생산되어 특정 항원의 복수의 에피토프를 인식한다. 모노클로날 항체는 배취(batch) 간 균질성, 저하된 교차-반응성 및 표적에 대한 높은 특이성을 보장한다. 모노클로날 항체는 예를 들어 숙주 세포에서, 재조합 DNA를 사용하여 발현될 수 있고 재조합 항체를 유발한다.
본 명세서에 사용된 용어 "재조합 항체"는 재조합 DNA의 사용을 수반하는 임의의 공정에 의해 생성된 항체를 의미한다. 재조합 항체는 면역원성, 결합 친화도, 분자 크기, 특이성, 반감기 및 포맷(format)과 같은 특성을 개선하기 위한 방식으로 조작될 수 있다. 재조합 항체의 예는 조작된 항체, 키메라 항체, CDR 접목된 항체(예를 들어, 인간화된 항체), 완전 인간 항체, 항체 단편, Fc 조작된 항체, 다중특이성 항체(예를 들어, 이중특이성, 삼중특이성, 사중특이성 항체), 단량체성 항체 및 다량체성 항체(예컨대, 동형이량체 및 이형이량체 항체)를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에 사용된 용어 "키메라 항체"는 가변 영역이 하나의 종으로부터 유래되고 다른 종으로부터 유래된 불변 영역에 융합되는 항체를 의미하며; 키메라 항체의 비제한적인 예는 뮤린 가변 영역이 인간 불변 영역에 융합된 항체이다.
본원에 사용된 용어 "CDR 접목된 항체"는 하나의 종으로부터 유래된 CDR이 다른 종의 프레임워크 영역에 접목된 항체를 의미하며; CDR 접목된 항체의 비-제한적인 예는 마우스와 같은 포유동물 종으로부터의 CDR이 인간 프레임워크 영역에 접목된 인간화된 항체이다.
용어 "세포 형질감염"은 외래 유전 물질을 진핵 세포 내로 도입하는 것을 의미한다. 인위적으로 도입된 핵산에 의해 암호화된 단백질이 세포에 의해 발현되는 경우, 이는 각각의 야생형 형태와 상이한 특성을 갖는 유전자 변형된 세포를 제공한다. 도입된 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 외인성 핵산을 숙주 세포에 도입하는데 통상적으로 사용되는 기술의 예는 화학적-기반 방법을 포함하며, 여기서 형질감염은 인산칼슘, 리포좀, 양이온성 중합체 또는 덴드리머(dendrimer)와 같은 형질감염 시약; 전기천공 및 마이크로인젝션과 같은 물리적-기반 방법; 및 바이러스 감염이 유전자 전달을 매개하는 바이러스-기반 방법에 의해 매개된다. 이 기술들을 이용하여 일시적 또는 안정한 형질감염이 달성될 수 있다. 일시적 형질감염에서, 핵산 서열은 숙주 세포의 게놈 내로 통합되지 않으며, 따라서 외인성 유전 물질에 의해 암호화된 단백질의 발현은 시간에 제약이 있고, 안정한 형질감염은 세포가 게놈 내에 외래 유전 물질을 통합시키면 안정한 형질감염된 세포주를 초래하여 달성된다.
용어 "숙주 세포"는 외래 핵산이 직접 도입된 세포 및 이의 후손을 포함하는, 형질감염된 핵산 물질에 의해 암호화된 단백질이 발현되는 모든 세포를 지칭한다. 항체의 발현에 적합한 세포주는 박테리아, 포유동물, 곤충, 식물 및 효모 세포를 포함하며, 이에 제한되지 않는다. 치료 항체의 발현 및 생산을 위해 종종 사용되는 세포주는 포유동물 세포주, 예를 들어, 중국 햄스터 난소(CHO)세포, NSO 마우스 골수종 세포, 인간 자궁경부 암종(HeLa) 세포 및 인간 배아 신장(HEK) 세포이다. 숙주 세포는 이들의 성장 및 항체의 발현을 보조하는 조건에서 배양된다. 최적 배양 조건은 세포 배양 배지의 조제, 생물반응기 작동 파라미터, 영양소 공급 방식 및 배양 시간 기간을 포함하는 여러 파라미터의 조절 및 조정에 의해 수득된다. 배양 배지의 조제는 세포 생존력 및 증식에 유리하도록 최적화되어야 한다; 세포 배양 배지의 구성성분의 예는 필수 아미노산, 염, 글루코스, 성장인자 및 항생제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 중요한 생물반응기 작동 파라미터는 온도, pH, 교반 속도, 산소첨가 및 이산화탄소 수준이다. 영양소는 상이한 방식으로 공급될 수 있다: 배치 모드 배양에서는 모든 필요한 영양소들이 초기 기본 배지에 존재하며 고갈될 때까지 사용되면서 폐기물이 축적된다; 유가 배양에서는 영양소 고갈을 방지하고 배양물을 연장하기 위해 추가 공급 배지가 공급되고; 이와 달리, 관류 방식에서는 배양물 중의 세포에, 세포 폐기물을 제거하면서 생물반응기에서 흐르는 영양소를 함유한 새 배지가 연속적으로 보충된다. 배양 기간은 세포가 일정한 양의 생성물을 생성하도록 하기에 충분히 길어야 할 필요가 있지만, 세포 생존력을 손상시킬 정도로 너무 길 수는 없기 때문에 중요하다.
용어 "수확된 항체 물질"은 세포 배양에 의해 수득된, 숙주 세포에 의해 발현된 항체를 함유하는 물질을 의미한다. 수확된 항체 물질은 먼저 숙주 세포 배양물을 수확한 후, 수확물을 원심분리 및/또는 여과 단계들을 통해 세포 파편의 제거를 가능하게 하는 청징화 과정으로 처리하여 생산할 수 있다.
용어 "바이러스 청소"는 당해의 물질을 오염시킬 수 있는 바이러스를 효과적으로 제거 및/또는 불활성화시키는 임의의 처리를 의미한다. 치료 항체의 정제 과정에 적용될 때, 바이러스 청소는 항체-함유 물질로부터 바이러스 불활성화 또는 바이러스 제거를 초래하는 임의의 방법을 의미한다.
용어 "바이러스 불활성화"는 바이러스가 생물학적 샘플을 감염시킬 수 없거나 복제할 수 없도록 하는 임의의 처리를 의미한다. 바이러스 불활성화는 생물학적 샘플을 용매 및 세제(S/D)로 항온처리하여 바이러스 인벨로프의 가용화를 통해 바이러스 불활성화를 유발하는 것; 바이러스 단백질의 변성을 유도하는 낮거나 높은 pH에서의 항온처리; 바이러스 단백질 변성이 높은 온도에 의해 달성되는 저온살균 처리와 같은 여러 기술들에 의해 달성될 수 있다.
용어 "항온처리"는 물질이 변성을 겪는 조건을 포함하는 특정 조건에서 물질을 유지하는 작업을 의미한다. 바이러스 불활성화 과정에서, 바이러스 불활성화를 유발하는 화학적 특성을 가진 용액으로(with a solution) 물질의 항온처리는 활성 바이러스 오염물이 없는 물질의 생성을 초래한다.
용어 "용매 세제 처리"는 수확된 항체 물질을 유기 용매와 같은 용매로 또는 또는 유기 용매 및 세제로 항온처리하는 것을 의미한다.
용어 "높은 pH 처리"는 pH가 7 초과인 완충 용액으로 상기 수확된 항체 물질의 항온처리를 의미한다.
용어 "바이러스 제거"는 처리된 샘플로부터 바이러스 입자를 물리적으로 분리시키는 임의의 처리를 의미한다. 치료 단백질 정제 과정에서, 바이러스 제거는 여과 단계에 의해 달성된다. 또한, 크로마토그래피 단계와 같은 정제 과정의 다른 단계들은 바이러스 입자의 제거를 돕는다.
용어 "여과"는 고체를 유체로부터 분리하는 작업을 의미한다.
용어 "크로마토그래피"는 크로마토그래피 컬럼의 정지상(stationary phase)과 상호작용하는 능력에 기초하여 이로부터 보유되거나 용출될 수 있는, 혼합물의 화합물을 분리하는 작업을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "바이러스 불활성화 분석" 및 "바이러스 제거 확인(VRV)"은 상호교환가능하며, 유효한 바이러스 감소를 시험하기 위한 절차를 의미한다. 바이러스 불활성화 분석을 수행하기 위해, 샘플 내 바이러스 존재는 공지된 양의 스톡(stock) 바이러스로 스파이킹(spiking) 하기 전 및 후에 측정하고, 각각 부하된 바이러스 역가에 대하여 산출된 바이러스 역가를 비교하여 측정한다. log10 감소 계수(RF)는 다음 식에 따라 결정할 수 있다: RF = log10{유입 바이러스 역가×유입량/산출 바이러스 역가×산출량}. 바이러스의 불활성화/제거는 RF가 4 log10 초과인 경우 "유효"; RF가 2 log10과 4 log10 사이에 포함되는 경우 "바이러스 감소에 기여"; RF가 1 log10 미만인 경우 "비효과적"으로 표현될 수 있다.
본 발명에서, 출발 항체 수확 물질은 모노클로날 항체를 포함한다. 바람직하게는 모노클로날 항체는 재조합체이다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 모노클로날 재조합 항체는 이형이량체 이중특이성 항체이다.
본 발명에서, 이형이량체 이중특이성 항체는 BEAT® 기술(WO2012131555)에 의해 생성될 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, BEAT®1로 지칭되는 이중특이성 항체는 T-세포에 의해 발현된 분화 클러스터 3(CD3) 및 종종 유방암 세포에서 과잉발현되는 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER2)에 결합한다. 다른 실시형태에서, BEAT®2(서열번호 1, 2 및 3)로 지칭되는 모노클로날 이중특이성 항체는 CD3 및 다발성 골수종 세포에서 과잉발현되는 분화 클러스터 38(CD38)에 결합한다. 또 다른 실시형태에서, 모노클로널 이중특이성 항체는 CD3 및 결장직장암을 비롯한 여러 유형의 암에서 표적인 것으로 알려진 EGFR에 결합하는 BEAT®3(서열번호 4, 5 및 6)이다. 다른 실시형태에서, Ab1(서열번호 7 및 8)로 지칭되는 모노클로날 항체는 자가면역 및 염증성 질환에 관여하는 OX40 수용체를 표적으로 하는 IgGl이다.
본 발명의 항체는 세포 형질감염 시 숙주 세포에서 발현된다. 본 발명에 채택된 세포 형질감염 방법은 형질감염 시약을 이용하는 화학적-기반 방법을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 적합한 형질감염 시약은 인산칼슘, 리포좀, 양이온성 중합체 및 덴드리머를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시형태에서, 세포 형질감염은 양이온성 중합체에 의해 수행된다. 양이온성 중합체의 비제한적인 예는 디에틸에탄올아민 및 폴리에틸렌이민이다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 양이온 중합체는 폴리에틸렌이민이다.
본 발명의 특정 양태에 따르면, 항체 생산을 위해 사용되는 숙주 세포주는 진핵 세포주를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시형태에서, 숙주 세포주는 포유동물 세포주이다. 보다 구체적인 실시형태에서, 포유동물 세포주는 인간을 제외한 세포주이다. 본 발명의 더욱 구체적인 실시형태에서, 포유동물 세포주는 CHO 세포주, 특히 CHO-S 세포주이다.
본 발명의 숙주 세포는 용존 O2가 40%의 공기 포화도로 유지되고 온도가 37℃로 유지되는 동물 유래 성분 무함유(ADCF) 배지를 함유한 250 L 작업용량의 일회용 생물반응기에서 배양될 수 있다. 이 배양은 접종 후 3일째 공급이 개시되는 유가 배양일 수 있다. 공급물은 1일 볼러스(bolus)가 생물반응기에 첨가된다. 배양물은 공급 개시 11일 후 또는 세포 생존력이 80% 또는 85%에 도달하면 수확한다.
본 발명에서 바이러스-불활성화된 항체 용액은 수확된 항체 물질로부터 시작하여 제조할 수 있다. 특히, 수확된 항체 물질은 숙주 세포 배양물의 벌크 수확물의 청징화 생성물이다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 수확된 항체 물질은 "데드 엔드(dead end)" 깊이 여과, 이어서 0.2 ㎛ 필터를 통한 무균 여과를 비롯한 여과 단계들을 통하여 벌크 수확물을 청징화시켜 제조한다.
수확된 항체 물질은 크로마토그래피 컬럼 상에 부하될 수 있다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 수확된 항체 물질은 단백질 A(PA) 크로마토그래피 내로 부하된다. 단백질 A 크로마토그래피 위에 부하된 수확된 항체 물질은 "PA 부하물"이라고도 지칭된다. 수집된 용액은 "PA 용출액"이라 한다. 본 발명에서, 단백질 A 크로마토그래피의 수지는 먼저 인산염 완충 식염수(PBS)에 의해 pH 7.4로 평형화된다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 컬럼은 이어서 세척되고(예를 들어, Tris 및/또는 아세트산염에 의해), 항체는 글리신 또는 아세트산염과 같은 용출 완충액을 사용하여 컬럼으로부터 용출시킨다. 본 발명의 일 양태에서, 단백질 A 용출액은 pH 약 5 이상, 7 이하; 더 구체적으로는 pH 5.5 이상, 6.5 이하로 중화된다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 바이러스 불활성화는 용매 세제 처리에 의해 수행된다. 본 명세서에 개시된 방법에 유용한 유기 용매는 트리-(n-부틸)포스페이트(TnBP)와 같은 디알킬포스페이트를 포함한다. 유기 용매의 농도는 약 0.1%(w/w) 이상 및 약 1%(w/w) 이하일 수 있다. 특히, 유기 용매의 농도는 약 0.1%(w/w), 약 0.2%(w/w), 약 0.3%(w/w), 약 0.4%(w/w), 약 0.5%(w/w), 약 0.6%(w/w), 약 0.7%(w/w), 약 0.8%(w/w), 약 0.9%(w/w) 또는 약 1%(w/w)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더욱 특히, 유기 용매의 농도는 적어도 약 0.1%(w/w), 적어도 약 0.3%(w/w), 적어도 약 0.5%(w/w), 또는 적어도 약 1%(w/w)이다. 특정 바람직한 실시형태에서, 유기 용매의 농도는 약 0.2%(w/w) 이상 및 약 0.4%(w/w) 이하이다. 특히, 유기 용매의 농도는 약 0.2%(w/w), 또는 약 0.3%(w/w), 또는 약 0.4%(w/w)이다. 더욱 바람직하게는, 유기 용매의 농도는 약 0.3%(w/w)이다. 본 발명은 또한 상기 언급된 농도 사이에서 0.1%(w/w), 0.2%(w/w), 0.3%(w/w), 0.4%(w/w), 0.5%(w/w), 0.6%(w/w), 0.7%(w/w), 0.8%(w/w), 0.9%(w/w) 또는 1%(w/w) 간격으로 유기용매의 농도를 포함한다.
본원에 개시된 방법에 유용한 세제는 폴리소르베이트, 예컨대 폴리소르베이트 20(예컨대, Tween 20®), 폴리소르베이트 40(예컨대, Tween 40®), 폴리소르베이트 60(예컨대, Tween 60®), 및 폴리소르베이트 80(예컨대, Tween 80®); 및 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐 에테르(예컨대, Triton® X-100)를 포함하는 폴리옥시에틸렌 글리콜 소르비탄 알킬 에스테르와 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다. 본 명세서에 사용된 용어 "폴리소르베이트" 및 "Tween"은 호환가능하다. 세제의 농도는 약 0.1%(w/w) 이상 및 약 2%(w/w) 이하이다; 특히 세제의 농도는 0.2%(w/w) 이상 및 1.5%(w/w) 이하이다; 본 발명의 더욱 구체적인 실시형태에서, 세제의 농도는 0.75%(w/w) 이상 및 1.25%(w/w) 이하이다. 더욱 구체적으로, 세제의 농도는 약 0.1%(w/w), 약 0.2%(w/w), 약 0.3%(w/w), 약 0.4%(w/w), 약 0.5%(w/w), 약 0.6%(w/w), 약 0.7%(w/w), 약 0.8%(w/w), 약 0.9%(w/w), 약 1%(w/w), 약 1.2%(w/w), 약 1.5%(w/w), 약 1.7%(w/w), 또는 약 2%(w/w)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더욱 특히, 유기 용매의 농도는 적어도 약 0.2%(w/w), 적어도 약 0.5%(w/w), 적어도 약 0.75 %(w/w), 적어도 약 1%(w/w), 또는 적어도 약 1.25%(w/w)이다. 특정 바람직한 실시형태에서, 세제의 농도는 약 0.75%(w/w), 또는 약 1%(w/w), 또는 약 1.25%(w/w)이다. 더욱 바람직한 구체예에서, 세제의 농도는 약 1%(w/w)이다. 또한, 본 발명은 상기 언급된 농도들 사이에서 0.05%(w/w), 0.1%(w/w), 0.2%(w/w), 0.3%(w/w), 0.4%(w/w), 0.5%(w/w), 0.6%(w/w), 0.7%(w/w), 0.8%(w/w), 0.9%(w/w) 또는 1%(w/w)의 간격으로 유기 용매의 농도를 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, 항체-함유 물질은 용매, 또는 세제, 또는 용매 및 세제의 혼합물로의 약 5 분 이상 및 약 120 분 이하의 항온처리 시간 동안 항온처리된다. 구체적으로, 항온처리 시간은 약 5 분, 약 10 분, 약 20 분, 약 30 분, 약 60 분, 약 90 분 및 약 120 분을 포함하는 군으로부터 선택된다. 더욱 구체적으로, 상기 항온처리 시간은 약 5 분 이상, 약 10 분 이상, 약 20 분 이상, 약 30 분 이상, 약 60 분 이상, 약 90 분 이상 및 약 120 분 이상이다. 특히 더 구체적으로, 항온처리 시간은 30 분 이상 및 90 분 이하이며, 바람직하게는 항온처리 시간은 60 분이다. 또한, 본 발명은 상기 언급된 항온처리 간격 사이에서 1, 2, 5, 10, 15, 30, 60, 75 또는 90 분의 간격으로 용매 및 세제 항온처리 시간를 포함한다
본 발명의 일 실시형태에서, 항체-함유 용액은 TnBP 및 Triton X-100으로 최종 농도가 약 0.3%(w/w) TnBP 및 약 0.2%(w/w) 내지 약 1%(w/w) Triton X-100이 되도록 처리된다. 본 실시형태의 다른 양태에서, 항체를 함유하는 용액은 TnBP 및 폴리소르베이트 80으로 최종 농도가 약 0.3%(w/w) TnBP 및 약 0.2%(w/w) 내지 약 1%(w/w) 폴리소르베이트 80이 되도록 처리된다. 본 실시형태의 다른 양태에서, 항체-함유 용액은 TnBP 및 폴리소르베이트 20으로 최종 농도가 약 0.3%(w/w) TnBP 및 약 0.2%(w/w) 내지 약 1%(w/w) 폴리소르베이트 20이 되도록 처리된다.
본 발명의 양태에서, 항체를 함유하는 용액은 PA 용출액이다. 특정 양태에서, PA 용출액은 약 0.1%(w/w) TnBP, 또는 약 0.3%(w/w) TnBP, 또는 약 0.5%(w/w) TnBP, 또는 약 1%(w/W) TnBP, 또는 약 0.3%(w/w) TnBP 및 약 0.2%(w/w) Triton X-100, 또는 약 0.3%(w/w) TnBP 및 약 0.5%(w/w) Triton X-100, 또는 약 0.3%(w/w) TnBP 및 약 1%(w/w) Triton X-100, 또는 0.3%(w/w) TnBP 및 약 0.2%(w/w) 폴리소르베이트 80, 또는 약 0.3%(w/w) TnBP 및 약 0.5%(w/w) 폴리소르베이트 80, 또는 약 0.3%(w/w) TnBP 및 약 1%(w/w) 폴리소르베이트 80, 또는 약 0.3%(w/w) TnBP 및 약 0.2%(w/w) 폴리소르베이트 20, 또는 약 0.3%(w/w) TnBP 및 약 0.5%(w/w) 폴리소르베이트 20, 약 0.3%(w/w) TnBP 및 약 1%(w/w) 폴리소르베이트 20으로 처리된다. 더욱 구체적인 양태에서, PA 용출액은 약 0.3%(w/w) TnBP로 약 0.2%(w/w) Triton X-100 또는 약 0.5%(w/w) Triton X-100 또는 약 0.5%(w/w) 폴리소르베이트 80, 또는 약 1%(w/w) 폴리소르베이트 80, 또는 약 0.2%(w/w) 폴리소르베이트 20, 또는 약 0.5%(w/w) 폴리소르베이트 20, 또는 약 1%(w/w) 폴리소르베이트 20과 조합되어 처리된다.
본 발명의 더욱 구체적인 양태에서, 항체를 함유하는 용액은 PA 용출액이고, PA 용출액은 0.3%(w/w) TnBP 및 1%(w/w) 폴리소르베이트 80 의 혼합물로 실온에서 10 분 이상, 바람직하게는 실온에서 약 60 분 동안 항온처리된다.
본 발명의 다른 양태에서, 항체를 함유하는 용액은 PA 부하물이고, PA 부하물은 약 0.3%(w/w) TnBP로 약 1%(w/w) Trito X-100, 또는 약 1%(w/w) 폴리소르베이트 80, 또는 약 1%(w/w) 폴리소르베이트 20과 조합으로 처리된다.
본 발명의 특정 양태에서, PA 부하물은 용매로, 또는 세제로, 또는 용매와 세제의 혼합물로 전술한 바와 같은 항온처리 시간 동안 항온처리된다.
또한, 상기 용매, 또는 상기 세제, 또는 상기 용매 및 세제의 혼합물로의 항온처리된 상기 PA는 PA 크로마토그래피 컬럼 위에 부하되고, 상기 부하 기간은 약 7 시간 이하이다. 특정 실시형태에서, 상기 부하 기간은 약 3 시간이다. 바람직하게는, 항온처리 시간과 부하 기간의 합은 7 시간 이하이다.
본 발명의 더욱 구체적인 양태에서, 항체를 함유하는 용액은 PA 부하물이고, PA 부하물는 PA 크로마토그래피 컬럼에 부하되기 전에 실온에서 5 분 이상, 바람직하게는 약 60 분 동안 0.3%(w/w) TnBP 및 1%(w/w) 폴리소르베이트 80의 혼합물과 함께 항온처리된다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 바이러스 불활성화 방법은 높은 pH 처리이다. 본원에 개시된 방법에 유용한 완충 용액은 아세트산염, 구연산염, Tris, 히스티딘, L-아르기닌, 인산염, NaOH를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 알칼리성 용액을 포함한다. 완충 용액의 pH는 약 7.5 이상, 약 14 이하일 수 있다. 특히, 완충 용액의 pH는 약 7.5, 약 8, 약 8.5, 약 9, 약 9.5, 약 10, 약 10.5, 약 11, 약 11.5, 약 12, 약 12.5, 또는 약 13, 또는 약 13.5 또는 약 14의 군으로부터 선택된다. 더욱 구체적인 실시형태에서, 완충 용액의 pH는 약 10 이상, 약 12 이하이며; 더욱 구체적으로 완충 용액의 pH는 약 10.5 이상, 약 11.5 이하이다. 구체적으로, 완충 용액의 pH는 10.5 이상이다; 더욱 구체적으로, 완충 용액의 pH는 약 11.5; 더욱 바람직하게는 약 11.2; 더욱 더 바람직하게는 약 11이다. 본 발명은 또한 상기 언급된 pH 값 사이에서 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1의 간격으로 pH 값을 포함한다. 본 실시형태의 특정 양태에서, 항체를 함유하는 용액은 PA 용출액이고, PA 용출액은 인산염 250 mM, NaOH 0.1M 및 NaOH 0.5M로 처리된다.
본 발명의 일 실시형태에서, 항체-함유 물질은 약 1 분 이상 및 약 4 시간 이하의 항온처리 시간 동안 높은 pH에서의 항온처리된다. 구체적으로, 항온처리 시간은 약 1 분, 약 5 분, 약 10 분, 약 30 분, 약 45 분, 약 60 분, 약 90 분, 약 2 시간, 약 3 시간 및 약 4 시간을 포함하는 군으로부터 선택된다. 더욱 구체적으로, 상기 항온처리 시간은 약 1 분 이상, 약 5 분 이상, 약 10 분 이상, 약 30 분 이상, 약 45 분 이상, 약 60 분 이상, 약 90 분 이상, 약 2 시간 이상, 약 3 시간 이상 및 약 4 시간 이상이다. 특히 더 구체적으로, 항온처리 시간은 30 분 이상, 90 분 이하이며, 바람직하게는 항온처리 시간은 60 분이다. 본 발명은 또한 상기 언급된 항온처리 간격 사이에서 1, 5, 10, 15, 30, 60, 75, 90 또는 120 분의 간격으로 높은 pH 항온처리 시간을 포함한다.
단백질 A 크로마토그래피 및 바이러스 불활성화 처리 이후, 또는 바이러스 불활성화 처리 및 단백질 A 크로마토그래피 이후, 항체를 함유하는 용액은 치료 항체를 함유하는 대량 원료 약물을 제조하기 위한 항체를 추가로 정제하고 농축하는 다른 크로마토그래피 및 여과 단계들로 추가 처리될 수 있다. 본 발명의 양태에서, 대량 원료 약물의 제조 방법이 개시된다. 대량 원료 약물의 제조 방법은 (a) 용매 세제 처리에 의한 바이러스 불활성화, (b) 단백질 A 크로마토그래피 정제, (c) 양이온 교환 크로마토그래피(CEX), (d)한외여과/정용여과(UF/DF), (e) 음이온 교환 막 흡수제, (f) 바이러스 나노여과, (g) UF/DF, (h) 부형제 첨가 및 농도 조정의 후속 단계들; 또는 (a') 단백질 A 크로마토그래피 정제, (b') 용매 세제 처리에 의한 바이러스 불활성화, (c') CEX, (d') UF/DF, (e') 음이온 교환 막 흡수체, (f') 바이러스 나노여과, (g') UF/DF, (h') 부형제 첨가 및 농도 조정의 후속 단계들; 또는 (a") 단백질 A 크로마토그래피 정제, (b") 높은 pH 처리, (c") CEX, (d") UF/DF, (e") 음이온 교환 막 흡수제, (f") 바이러스 나노여과, (g") UF/DF, (h") 부형제 첨가 및 농도 조정의 후속 단계들을 포함할 수 있다.
본 발명의 더욱 구체적인 양태에서, 대량 원료 약물의 제조 방법은 먼저 TnBP 0.3%(w/w) 및 폴리소르베이트 80 1%(w/w)로의 용매 세제 처리에 의한 수확된 항체 물질의 바이러스 불활성화를 60 분 동안 교반하에 수행하는 것으로 이루어진다. 이어서, 바이러스 불활성화된 용액의 단백질 A 크로마토그래피를 수행하고, 생성된 PA 용출액을 pH 6.0으로 중화시키고 0.2㎛ 여과한다; 다음, 중화된 중간물질 PA 용출액을 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 부하하고, 생성물을 0.2㎛ 필터를 통해 통과시킨다. 그 다음, 항체는 목표 25 mg/mL로 농축시키고, 한외여과/정용여과(UF/DF) 시스템에 의해 50 mM 히스티딘 pH 6.5로 투석하였다. 그 후, 생성물은 0.2 ㎛로 여과하고, 관통(flow-through) 방식의 음이온 교환(AEX) 크로마토그래피를 위한 양하전된 NatriFlo 일회용 막에서 정제하였다. 이어서, 용출액을 0.2 ㎛ 여과하였다. 다음으로, 생성물은 바이러스를 물리적으로 제거하기 위해 일회용 혼합 백에 무균적으로 연결된 Virosart® HF를 통해 나노여과한다. 0.2㎛ 여과된 예비조제 완충액, 5 mM 구연산염 pH 6.0으로 완충액 교환을 위해 제2 UF/DF 단계를 수행한다. 이어서, 생성된 생성물을 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과한다. 최종 조제 완충액에서 최종 농도 6 mg/mL를 달성하기 위해, 생성물을 계산된 양의 5 mM 구연산염, 15% 수크로스, 0.06% 폴리소르베이트 80 pH 5.9와 혼합하고 0.2 ㎛ 여과한다. 이어서,생성된 생성물은 폴리올레핀 단층 필름으로 구성된 멸균 백에 충전하기 전에 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과하고, 동결시키고, -80±20℃에 저장한다.
본 발명의 다른 구체적인 실시형태에서, 대량 원료 약물의 제조 방법은 먼저 청징화된 수확물을 단백질 A 크로마토그래피를 통해 통과시킨 후, PA 용출물을 실온에서 60분의 항온처리 시간 동안 높은 pH(목표 pH = ll)에서 항온처리하는 것으로 구성된다. 다음으로, 바이러스 불활성화된 용액은 pH 5.5로 중화시키고,0.2 ㎛ 여과하였다. 이어서, 중화된 중간 PA 용출액은 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼 위에 부하하고, 생성물을 0.2㎛ 필터를 통해 통과시킨다. 이어서, 항체는 25 mg/mL 의 목표로 농축시키고, 한외여과/정용여과(UF/DF) 시스템에 의해 50 mM 히스티딘 pH 6.5로 투석하였다. 그 후, 생성물은 0.2㎛로 여과하고, 음이온 교환(AEX) 크로마토그래피를 위한 양하전된 NatriFlo 일회용 막 상에서 관통(flow-through) 방식으로 정제하였다. 용출액은 이어서 0.2㎛ 여과하였다. 다음으로, 생성물은 바이러스를 물리적으로 제거하기 위해 일회용 혼합 백에 무균적으로 연결된 Virosart® HF 를 통해 나노여과한다. 제2 UF/DF 단계는 0.2 ㎛ 여과된 예비조제 완충액, 5 mM 히스티딘, 150 mM 아르기닌 일염산염, pH 6.0으로 완충액 교환을 위해 수행한다. 최종 조제 완충액에서 최종 농도 6 mg/mL를 달성하기 위해, 생성물은 계산된 양의 5 mM L-히스티딘, 150 mM L-아르기닌 일염산염, 15% 수크로스, 0.06% 폴리소르베이트 80, pH 6.0과 혼합한다. 이어서, 생성된 생성물은 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과한 뒤, 폴리올레핀 단층 필름으로 구성된 멸균 백에 충전하여, 동결시키고, -80±20℃에 저장한다.
본 발명의 특정 실시형태에서, 모노클로날 항체, 완충액, 계면활성제 및 안정화제를 포함하는 액체 약학적 제제가 개시된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "액체" 제제는 액체 형태로 제조된 것이다. 이러한 제제는 대상체에게 직접 투여하기에 적합할 수 있거나, 또는 대안적으로, 이후 액체 형태 또는 대상체에 투여하기에 적합한 다른 형태로 재구성하도록 액체 형태, 냉동 상태 또는 건조 형태(예를 들어, 동결건조)로 저장을 위해 포장될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "완충액"은 이의 산-염기 접합체 성분의 작용에 의해 pH 의 변화에 저항하는 완충된 용액을 의미한다. 본 발명의 완충액은 pH가 약 5.0 내지 약 7.0; 바람직하게는 6.0±0.5 범위이다. 이 범위로 pH를 조절할 수 있는 완충액의 예는 아세트산염(예를 들어, 아세트산나트륨), 석신산염(예컨대, 석신산 나트륨), 글루콘산염, 히스티딘(예를 들어, L-히스티딘), 구연산염, 인산염 및 다른 유기 산 완충액을 포함한다.
전형적인 계면활성제의 예로는 비-이온성 계면활성제(HLB 6 내지 18), 예컨대 소르비탄 지방산 에스테르(예를 들어, 소르비탄 모노카프릴레이트, 소르비탄 모노미리스테이트, 글리세린 모노스테아레이트), 폴리 글리세린 지방산 에스테르(예를 들어, 데카글리세릴 모노스테아레이트, 데카글리세릴 디스테아레이트, 데카글리세릴 모노리놀리에이트), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올리에이트,폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 트리올리에이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 트리스테아레이트), 폴리옥시에틸렌 소르비톨 지방산 에스테르(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 테트라스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 테트라올리에이트), 폴리옥시에틸렌 글리세린 지방산 에스테르(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 글리세릴 모노스테아레이트), 폴리에틸렌 글리콜 지방산 에스테르(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 디스테아레이트), 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르), 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 알킬 에테르(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 글리콜 에테르, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 프로필 에테르, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 세틸 에테르), 폴리옥시에틸렌 알킬페닐 에테르(예를 들어,폴리옥시에틸렌 노닐페닐 에테르), 폴리옥시에틸렌 수소화된 피마자유(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 피마자유, 폴리옥시에틸렌 수소화된 피마자유), 폴리옥시에틸렌 밀납 유도체(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 밀납), 폴리옥시에틸렌 라놀린 유도체(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 라놀린), 및 폴리옥시에틸렌 지방산 아미드(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 스테아릴 아미드); 음이온성 계면활성제,예컨대 Cio-Cis 알킬 설페이트 염(예를 들어, 소듐 세틸 설페이트, 소듐 라우릴 설페이트, 소듐 올레일 설페이트), 평균 2 내지 4 몰의 에틸렌 옥사이드를 가진 폴리옥시에틸렌 Cio-Cis 알킬 에테르 설페이트 염(예를 들어, 소듐 폴리옥시에틸렌 라우릴 설페이트) 및 Cs-Cis 알킬 설포석시네이트 에스터 염(예를 들어, 소듐 라우릴 설포석시네이트 에스터); 및 레시틴, 글리세로포스포 지질, 스핑고포스포 지질(예를 들어, 스핑고미엘린) 및 C12-C18 지방산의 수크로스 에스테르와 같은 천연 계면활성제를 포함한다. 바람직하게는, 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르로부터 선택된다. 특히 바람직하게는 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 21, 40, 60, 65, 80, 81 및 85, 가장 바람직하게는 폴리소르베이트 80이다.
안정화제는 단백질을 안정화시키기 위해 제제에 첨가될 수 있다. 상기 안정제는 아세트산나트륨, 중탄산나트륨, 탄산나트륨, 염화나트륨, 아세트산칼륨, 중탄산칼륨, 탄산칼륨, 염화칼륨, 수크로스, 폴리올, 당, 아미노산, 예컨대 히스티딘, 아르기닌, L-아르기닌 염산염, L-아르기닌 일염산염, 글리신, 메티오닌, 프롤린, 리신, 글루탐산, 아민 및 트레할로스를 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 특정 실시형태에서, 상기 개시된 액체 약학적 제제는 모노클로날 항체, 완충액, 계면활성제 및 안정화제를 포함하며, 상기 모노클로날 항체는 약 0.01 mg/mL 이상 및 약 100 mg/mL 이하의 농도, 바람직하게는 약 6 mg/mL의 농도로 상기 약학적 제제에 존재하고, 상기 완충액은 상기 약학적 제제에 약 5 mM의 농도로 존재하는 구연산염이고, 상기 계면활성제는 상기 약학적 제제에 약 0.06%의 백분율로 존재하는 폴리소르베이트이고, 상기 안정화제는 약 15%의 백분율로 상기 약학적 제제에 존재하는 수크로스이고, 상기 약학적 제제는 약 5.9의 pH를 갖는다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 개시된 액체 약학적 제제는 모노클로날 항체,완충액, 계면활성제 및 안정화제를 포함하며, 상기 모노클로날 항체는 약 0.01 mg/mL 이상 및 약 100 mg/mL 이하의 농도, 바람직하게는 약 6 mg/mL의 농도로 상기 약학적 제제에 존재하고, 상기 완충액은 상기 약학적 제제에 약 5 mM의 농도로 존재하는 L-히스티딘이고, 상기 계면활성제는 상기 약학적 제제에 약 0.06%의 백분율로 존재하는 폴리소르베이트이고, 상기 안정화제는 약 15%의 백분율로 상기 약학적 제제에 존재하는 수크로스 및 상기 약학적 제제에 약 120 mM의 농도로 존재하는 L-아르기닌 일염산염이며, 상기 약학적 제제는 약 6.0의 pH를 갖는다.
바이러스 불활성화 분석은 항체 용액의 순도를 시험하고 바이러스 안전성을 보장하기 위해 필요적이다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 항체-함유 용액은 모델 바이러스로 스파이킹되고, 샘플 중의 바이러스 존재는 스파이킹 전 및 후에 측정된다. 모델 바이러스는 뮤린 백혈병 바이러스(MLV), 뮤린 마이뉴트 바이러스(MMV), 슈도라비스(Pseudorabies) 바이러스(PRV)가 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 고전적으로 채택된 낮은 pH 처리의 대안으로서 사용될 수 있는 바이러스 불활성화 방법을 제안한다. 이러한 대안은 정제하기 위한 치료 항체가 낮은 pH-취약성이고, 및/또는 낮은 pH가 정제 공정과 상용가능하지 않을 때 특히 유리하다.
도 1: 낮은 pH에 의한 바이러스 불활성화, 실행 1, 단량체 HPLC-SE %
도 2: 낮은 pH에 의한 바이러스 불활성화, 실행 1; (A) 응집체 및 (B) HPLC-SE에서 숄더
도 3: 낮은 pH 처리 후 분해된 샘플의 HPLC-SE 프로파일
도 4: 낮은 pH 처리 후 HPLC-HIC 결과, 주 피크 %
도 5: 낮은 pH 처리 후 HPLC-HIC 결과, 응집체 + 숄더 %
도 6: 낮은 pH + NaCl 스파이크에서 바이러스 불활성화: HPLC-SE 결과
도 7: 낮은 pH + NaCl 스파이크에서 바이러스 불활성화: CGE 결과
도 8: 카프릴산 항온처리: HPLC-SE 결과
도 9: 카프릴산 항온처리: HPLC-HIC 결과
도 10: BEAT®2 높은 pH 유지 시간 충격 - SE-HPLC
도 11: BEAT®2 높은 pH 유지 시간 충격 - NR CGE
도 12: BEAT®2 높은 pH 유지 시간 충격 - 환원 CGE
도 13: BEAT®2 높은 pH 유지 시간 충격 - ICE
도 14: 용량 반응 곡선 및 EC50 값
도 15: 낮은 pH 항온처리 후 HPLC-SE에 의한 단량체 %
도 16: 낮은 pH 항온처리 후 HPLC-SE에 의한 숄더 종 및 응집체 %
도 17: 낮은 pH 항온처리 후 분해된 샘플의 HPLC-SE 프로파일
도 18: 낮은 pH 항온처리 후 샘플 tO의 캘리퍼 CGE 비-환원된 프로파일
도 19: 낮은 pH 항온처리 후 샘플 T48h의 캘리퍼 CGE 비-환원된 프로파일
도 20: 여러 높은 pH 항온처리 시간에서 CGE 비-환원된 프로파일의 비교
도 21: 여러 높은 pH 항온처리 시간에서 ICE 프로파일의 비교
도 22: 파일럿 규모의 VI 높은 pH 실행에서 CGE 비-환원된 프로파일의 비교
도 23: 파일럿 규모의 VI 높은 pH 실행에서 ICE 프로파일의 비교
도 24: 높은 pH 처리 기간에 따른 용량 반응 곡선 및 EC50
도 25: 높은 pH 처리 동력학
도 26: Abl 높은 pH 유지 시간 충격 - SE-HPLC
도 27: Abl 높은 pH 유지 시간 충격 - NR CGE
도 28: Abl 높은 pH 유지 시간 충격 - 환원된 CGE
도 29: Abl 높은 pH 유지 시간 충격 - ICE
도 30: 용량 반응 곡선 및 EC50 값
실시예 1: 치료 단백질의 정제 과정에서 바이러스 불활성화 단계로서 통상적으로 사용되는, 낮은 pH 처리는 낮은 pH-취약성 항체의 안정성을 손상시킨다.
치료 단백질 정제 과정에서 바이러스를 불활성화시키는데 통상적으로 사용되는 기술은 단백질-함유 용액을 낮은 pH에서 항온처리하는 것으로 이루어진다. 여기서, 바이러스를 불활성화시키기 위한 낮은 pH 처리의 역량 및 모노클로날 이형이량체성 항체의 안정성에 미치는 효과가 조사되었다. 이 조사의 결과는 BEAT®1 항체의 경우와 같이 바이러스 불활성화가 효과적이고 항체 안정성이 일반적으로 보존되는 낮은 pH 조건이 BEAT®2와 같은 낮은 pH-취약성 항체에 적합하지 않다는 것을 암시한다. 이러한 문제를 극복하기 위해, BEAT®2의 안정성 및 활성에 대한 대안적인 바이러스 불활성화 방법의 효과를 시험하기 위해 추가 연구가 수행되었다. 본 실시예는 (a) BEAT®l-함유 단백질 A(PA) 크로마토그래피 용출액의 낮은 pH 처리에 대한 바이러스 제거 확인(VRV) 연구; (b) BEAT®2 안정성에 효과적인 낮은 pH 수준의 영향; (c) BEAT®2 안정성 및 (d) 대안적인 바이러스 불활성화 기술이 사용될 때 수행된 활성을 예시한다.
a. BEAT ® 1 분자를 함유하는 PA 용출액의 낮은 pH 처리에 대한 VRV 연구
먼저, 낮은 pH에서 BEAT®l-함유 PA 용출액의 항온처리에 의한 바이러스 불활성화의 효능은 BEAT®1 항체의 정제 과정의 단계로서 조사하였다.
재료, 방법 및 장치
이 VRV 연구에 사용된 모델 바이러스는 내인성 바이러스의 관련 모델인 뮤린 백혈병 바이러스(MLV)였다. 이 바이러스 모델의 주요 특성은 표 1에 나타내었다.
Figure pct00001
낮은 pH 처리는 BEAT®1 분자를 함유하는 PA 용출액에 적용하였다. BEAT®1 정제 과정에 수행된 VRV 연구 동안 사용된 출발 물질은 표 2에 제시된다.
Figure pct00002
VRV 연구를 위해, 낮은 pH 처리 전에 시험 샘플을 취하여 바이러스 역가에 대해 분석하였다. 샘플은 공지된 양의 스톡 바이러스로 스파이킹되었고; 산출 바이러스 역가를 각각의 부하 바이러스 역가와 비교하여 감소 계수를 계산하였다. 이는 표 3에 나타낸 바와 같이 "최악의 경우" 조건 하에서 수행하였다.
Figure pct00003
이 단계는 표 4에 나타낸 바와 같이 3 가지 다른 pH 조건(설정점, +0.2 및 -0.2)으로 반복하여 수행하였다. 낮은 pH 불활성화 단계에 대한 온도(T) 사양은 20℃ 내지 25℃이다. 그러나, 이 실행 동안 목표로 한 온도는 최악의 경우의 시나리오 데이터를 갖기 위한 16℃였다.
Figure pct00004
log 감소 계수는 중화된 부하(L) 샘플에 대해 계산된 것이다; 샘플은 상이한 항온처리 시간(t) 점, 5분, 10분, 30분 및 60 분 후에 채취하여, 이어서 여러 낮은 pH 처리의 동역학을 갖도록 0.25 M 히스티딘 pH 12.0을 사용하여 pH 6.0 내지 8.0으로 중화시켰다. 이어서, 샘플은 적정 직전에 얼음 위에 배치하였다. 부하 유지(H) 샘플은 공정 기간 동안 16℃ ± 1℃로 유지하고, t = 60 분 샘플로 수집하였다. 표준 적정 외에도, t = 60 분 샘플에 대하여 대량 평판배양(LVP)을 수행하였다. 낮은 pH 불활성화 단계 동안 수행된 분석의 요약은 표 5에 제시한다:
Figure pct00005
결과 및 결론
바이러스 적정에서 부하 샘플과 부하 유지 샘플 간에 통계학적으로 유의한 변화가 바이러스 적정에서 관찰되지 않은 경우(주: 1 log10 미만의 차이는 유의하지 않은 것으로 간주함), 이것은 감소 계수를 계산하는데 사용된 부하 샘플 또는 추가 여과가 수행된(VRF 단계에서만) 부하 2 샘플이었다. 부하 및 부하 유지 결과 간에는 어떤 단계든지(추가 여과가 수행된 VRF는 제외하고) 바이러스 역가의 유의적인 변화가 관찰되지 않았고, 따라서 부하 결과는 log10 감소 계수로 사용되었다.
낮은 pH 바이러스 불활성화 단계 BEAT®1은 PA 용출액을 사용하여 pH 3.5, pH 3.7 및 pH 3.9에서 MLV 청소에 대한 효율에 대해 평가하였다. 표 6은 여러 낮은 pH 수준에서 수득된 log10 값 및 각 실행마다 계산된 log10 감소 계수를 나타낸다.
Figure pct00006
바이러스 불활성화 연구는 다음을 나타낸다:
- pH 3.5에서 낮은 pH 불활성화는 실행 1 및 실행 2에서 각각 5.94 및 4.71 log10의 감소 계수를 유도하며, 이는 낮은 pH 불활성화가 pH 3.5에서 MLV에 효과적이라는 것을 의미한다. 그러나, 표 6에 제시된 결과는 실행 1 및 실행 2 사이의 변화량이 1 log10이 넘는 차이로 유의적이며(각각 실행 1의 경우 0.08 log10 및 실행 2의 경우 1.66 log10), 따라서 이 결과들은 반복 실행 간에 비슷하지 않았음을 입증한다. 하지만, pH 3.5에서의 낮은 pH 불활성화는 pH 3.5에서 MLV 불활성화 거동에 대한 데이터를 제공하기 위해서만 수행하였고, 따라서 이들 결과는 전체 log 감소 계수 계산에는 사용하지 않았다.
- pH 3.7에서의 낮은 pH 불활성화는 표준 분석(t = 60 분 시점에서 수행된 LVP)에서 결정된 바와 같이, MLV 바이러스의 불활성화에 기여하였다. 낮은 pH 불활성화 실행으로부터 2.19 및 1.75 log10의 감소 계수(각각 실행 1 및 실행 2)가 수득되었다. 표 6에 제시된 결과는 실행 1과 실행 2 사이의 변화량이 실행 1에서는 4.18 log10이고 실행 2에서는 4.27 log10으로 유의적이지 않았으며, 따라서 이 결과들은 반복 실행 간에 비슷하다는 것을 입증한다.
- pH 3.9에서의 낮은 pH 불활성화는 표준 분석(t = 60 분 시점에서 수행된 LVP)에서 결정된 바와 같이, MLV 바이러스의 불활성화에 기여하였다. 낮은 pH 불활성화 실행으로부터 1.05 및 1.05 log10의 감소 계수(각각 실행 1 및 실행 2)가 수득되었다. 표 6에 제시된 결과는 실행 1 및 2 사이의 변화량이 실행 1 및 2 모두에서 5.49 log10으로 유의적이지 않았고, 따라서 그 결과는 반복된 실행 간에 비슷하다는 것을 입증한다.
수득된 결과에 기초하면, pH 3.5에서의 낮은 pH 불활성화는 최소 감소 계수가 4.71 log10으로서 MLV 바이러스의 불활성화에 효과적인 것으로 나타났다. pH 3.7 에서의 낮은 pH 불활성화는 1.75 log10의 최소 감소 계수로 MLV 바이러스의 불활성화에 기여하는 것으로 관찰되었다. pH 3.9에서의 낮은 pH 불활성화는 최소 감소 계수 1.05 log10으로 MLV 바이러스의 불활성화에 기여하는 것으로 관찰되었다.
이들 결과는 모노클로날 항체의 생산 공정에서 바이러스의 불활성화를 위해 고전적으로 사용되는 낮은 pH 처리가 pH 3.5에서 MLV 바이러스를 효과적으로 불활성화시킬 수 있음을 나타낸다.
b. 낮은 pH로 처리된 BEAT ® 2에 대한 안정성 연구
다음으로, 다른 항체의 안정성에 대한 연구를 수행하여 낮은 pH 처리의 효과를 평가하였다. 특히, BEAT®2가 낮은 pH에서 항온처리되었다.
재료, 방법 및 장치
본 연구에서 사용한 출발 물질은 가네카(Kaneka)의 KanCapA 수지를 사용하여 친화도 크로마토그래피로 수득한 PA 용출액이었다.
세포 배양물은 전형적으로 생존력이 80% 보다 낮을 때 종결하였고 세포 잔해는 데드-엔드(dead-end) 깊이 여과 및 그 다음 0.2 ㎛ 필터 여과에 의해 제거되었다. 세포 배양 상청액은 CHO 세포 유래인 것이었다.
본 연구를 위해, 비대표 벌크 수확물(소규모 생물반응기 또는 웨이브 백 배양물에서 유래하는 클론 1 및 클론 2의 2개의 클론) 및 대표 벌크 수확물(선택된 클론 1, 일회용 생물반응기 250L) 유래의 다른 출발 물질을 사용하였다.
공정내 0.2 ㎛ 여과 단계는 전형적으로 TPP 250 mL 필터-탑, Steriflip(Millipore) 또는 Sartopore 2 필터(Sartorius)를 사용하여 수행하였다. 모든 중간물질은 즉시 추가 처리되지 않는 한, 중간물질 모두 및 모든 완충액에 대하여 0.2 ㎛ 여과 단계를 수행하였다. 완충액은 실온에서 저장하였고, 공정 중간물질은 전형적으로 +5±3℃에서 보관하였다. 바이러스 불활성화 연구를 위해 자기 교반기 및 pH 측정기만을 사용하였다.
출발 물질로서 사용된 PA 용출액은 1.1 cm 직경의 Vantage L 컬럼(Millipore)을 사용하는
Figure pct00007
KTA Explorer 및
Figure pct00008
KTA Purifier 시스템(GE Healthcare) 상에서 수행된 Protein A 소규모 크로마토그래피 개발 실행으로부터 입수되었다.
수확물 역가는 PA-HPLC를 사용하여 측정하였다. PA 용출액은 HPLC-SE로 분석하여 응집체 및 단편의 백분율을 평가하였다. 그러나, SE-HPLC는 나머지 동형이량체 불순물의 백분율을 평가하기에는 충분하지 않았다. 따라서, PA 용출액 샘플을 또한 통상적으로 비-환원된 CGE로도 분석하였다. 출발 물질로서 PA 용출액을 사용한 몇몇 실행에서 바이러스 불활성화 단계의 수율은 280 nm에서 Nanodrop 장비(Nanodrop 2000 분광광도계, Thermo Scientific)로 처리하기 전 및 후의 농도를 측정하여 계산하였다. BEAT®2의 몰 흡광 계수는 1.52이다. HPLC-HIC 및 iCE3을 사용하여 몇몇 실험을 분석하여 소수성 종 및 전하 변이체에 대한 임의의 처리 효과가 있었는지를 조사하였다.
결과 및 결론
클론 1 및 클론 2 세포 배양물 유래의 소량의 PA 용출액(약 3 mL)은 HCl 3.7%를 사용하여 pH 3.6, 3.7, 3.8 및 3.9로 산성화하였다. BEAT®2는 낮은 pH에서 60 내지 120 분 동안 실온(RT)에서 교반 하에 항온처리하였다. 반응을 정지시키기 위해, 250 mM 히스티딘 pH 12.0을 사용하여 pH를 pH 6.0 또는 5.5로 증가시켰다. 이 실험은 결과를 확인하기 위해 여러번 반복하였다. 상기 염이 분자에 보호제 효과가 있는지를 관찰하기 위하여, 낮은 pH에서 항온처리 전에 먼저 PA 용출액을 NaCl로 스파이킹(spiking)하여 동일한 연구를 수행하였다. 다른 농도의 NaCl을 시험하였다: pH 3.7에서 90분 동안 산성화와 조합된 150mM, 500mM 및 1M. 생성물은 그 다음 HPLC-SE, HPLC-HIC 및 CGE(비-환원)에 의해 분석하였다. 표 7은 낮은 pH 항온처리에서 시험된 조건의 요약을 나타낸다.
Figure pct00009
NaCl 없는 PA 용출액
클론 2에 의해 수행된 실험들은 유사한 결과를 제공하였기 때문에 클론 1에 의해 수득된 결과만 제시한다. PA 용출액에 대해 4회의 반복된 낮은 pH 실험을 수행하였고, 결과는 그들 모두 유사하고 비슷하였다. 다른 시점마다 다른 pH에서 HPLC-SE에 의한 단량체의 백분율은 도 1에 도시하였다. 이 그래프에 도시된 바와 같이, pH 3.6에서의 최대 산성 조건은 항온처리 60분 후 단량체 백분율이 95%에서 80%로 떨어지는 상당한 감소를 초래한다. pH 3.7에서의 처리도 BEAT®2의 안정성에 부정적인 영향을 미쳤다. 덜 산성인 pH 3.8 및 3.9에서의 조건만이 항체에 부정적인 영향을 미치지 않았다. 도 2는 단량체, 응집체 및 "숄더" 종의 분해 동안 다른 종의 증가를 나타낸다. 숄더 종은 단량체의 주 피크 전에 나타났다. 도 3은 중요한 양(13%)의 "숄더" 종을 함유하는 HPLC-SE에 의한 프로파일의 예를 나타낸다. 2가지 다른 낮은 pH 처리 실행의 CGE(비-환원) 결과는 하기 표 8에 열거되며, 여기서 중화는 pH 6.0 또는 pH 5.5로 수행되었다.
Figure pct00010
CGE 데이터는 모든 조건에서 단편 및 다른 종의 백분율이 유사하였기 때문에 pH 및 항온처리 시간이 BEAT®2의 양에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여준다. pH 5.5에서의 중화는 BEAT®2가 1% 더 하위였기 때문에 pH 6.0에서의 중화에 비해 더 우수하였다. 분해는 HPLC-HIC로 관찰하였고, 도 4 및 도 5에 도시된 바와 같이 응집체 종의 증가와 함께 시간에 걸쳐 주요 피크 백분율이 더 산성인 pH에서 감소하였다. 이들 결과는 BEAT®2가 pH 3.9의 조건에서만 안정하다는 것을 나타낸다; 그럼에도 불구하고 BEAT®1에 대한 이전의 실험들은 이 pH가 효과적인 바이러스 불활성화 작용을 하기에 충분한 산성이 아니라는 것을 나타내었다.
NaCl과 PA 용출액
단백질의 안정성을 증가시키기 위해 염을 사용하였고, 낮은 pH에서 처리하기 전에 상이한 농도의 NaCl을 이용한 하나의 실험을 수행하여 낮은 pH 처리하에서 BEAT®2 안정성이 개선되었는지를 확인하였다. pH 3.7에서 90 분 동안 산성화하기 전에 0.15M 에서 1M NaCl까지 여러 농도를 시험하였고, HPLC-SE 및 비환원된 CGE를 각각 도 6 및 도 7에 나타내었다. 결과는 BEAT®2가 NaCl로 스파이킹되었을 때에도 낮은 pH에서 안정하지 않다는 것을 보여준다. 열거되지 않은 HPLC-HIC에 의해 분해가 관찰되었고, 주 피크는 모든 염 조건에서 항온처리 90분 후 82%에서 60%로 감소하였다. 도 7에서, CGE에 의해 관찰되는 변화량은 없었다.
이들 실험의 결과는 낮은 pH 처리가 BEAT®2 항체 정제 공정에 적당한 바이러스 불활성화 단계가 아니라는 것을 나타낸다.
c. 대안적인 바이러스 불활성화 처리를 받았을 때 BEAT ® 2의 안정성 시험
낮은 pH 처리가 BEAT®2의 안정성을 손상시킨다는 점에서, 다른 바이러스 불활성화 방법을 시험하였고, 항체의 안정성에 대한 효과를 조사하였다. 시험된 처리는 다음을 포함한다: PA 용출액의 저온살균 처리, PA 용출액의 카프릴산(CA) 처리, PA 용출액의 아르기닌 처리, PA 용출액의 용매 및 세제(S/D) 처리, 청징화된 수확물의 S/D 처리 및 PA 용출액의 높은 pH 처리.
재료, 방법 및 장치
하기 BEAT®2 안정성에 사용된 재료, 방법 및 장치는 "b. 낮은 pH로 처리된 BEAT®2에 대한 안정성 연구"에 기재된 것과 같다. 추가로, 가열 블록을 저온살균에 사용하였다.
결과 및 결론
PA 용출액의 저온살균 처리
바이러스 불활성화를 위한 상업적 공정에 통상적으로 사용되는 저온살균은 낮은 pH 처리에 대한 대안으로서 시험하였다. 클론 1 및 클론 2로부터의 PA 용출액을 사용하여 BEAT®2 항체 안정성에 대한 저온살균 효과를 시험하였다. PA 용출액은 250 mM 히스티딘 pH 12.0을 사용하여 pH 6.0으로 중화시켰다. 실온(RT)에서의 항온처리 및 수조를 이용한 60℃에서 30 분 및 60 분 동안 항온처리를 포함하는 여러 항온처리 조건을 시험하였다. 실험 후, 생성물은 HPLC-SE, HPLC-HIC 및 CGE(비-환원)로 분석하였다.
모든 조건에서 침전이 관찰되었다. 표 9에는 처리 후의 결과를 요약하여 제시하였다.
Figure pct00011
HPLC-SE 및 HPLC-HIC 결과는 BEAT®2가 두 분석에서 30 분 후(HPLC-SE에서 94.6%에서 43.4%로, HIC-HPLC에서 88.1%에서 13.3%로)에도 주요 피크 백분율이 현저히 감소하여 고온에서 안정하지 않다는 것을 보여준다.
이러한 결과에 기초하여, 추가 조사 및 개발에 저온살균은 선택하지 않았다.
PA 용출액의 카프릴산 처리
카프릴산은 바이러스 단백질을 침전시키기 위한 바이러스 불활성화에 사용될 수 있는 침전제이다. 클론 1로부터의 PA 용출액을 사용하여 BEAT®2 항체의 안정성에 대한 카프릴산의 효과를 시험하였다. 몇 가지 농도의 카프릴산을 0.2%, 0.5%, 0.7% 및 1%의 최종 양에 도달하도록 사용하였다. 용출 후(약 pH 4.3) 또는 pH 5.5 에서(250 mM 히스티딘 pH 12.0 완충액을 사용하여) 중화된 PA 용출액을 출발 물질로서 사용하였다. 적용된 항온처리 시간은 30분, 60분 및 90분이었다. 반응을 정지시키기 위해, 규조토(DE)를 2 mL의 PA 용출액 생성물에 대해 0.5g DE의 비로 사용하였다. DE를 통과한 생성물을 정제하기 위해 0.2 ㎛의 steriflip 필터를 사용하였다. 처리 후, 생성물은 HPLC-SE, HPLC-HIC 및 CGE(비-환원)로 분석하였다. 표 10에는 카프릴산 처리에 대해 시험된 조건의 요약이 제시된다.
Figure pct00012
pH 5.5에서의 결과는 카프릴산 0.2% 초과에서 관찰된 침전때문에 나타내지 않았다. pH 4.3의 결과는 도 8, 도 9 및 표 11에 기록된다. HPLC-SE 결과는 t = 0을 t = 30분, t = 60분 및 t = 90분과 비교하여 단량체는 감소(약 6%)하고 응집체는 증가하는 경시적인 분해를 나타낸다.
Figure pct00013
CGE 및 HPLC-HIC에서 현저한 분해는 전혀 인지되지 않았다. SE-HPLC 결과에 따라, BEAT®2는 더 낮은 산 카프릴산 농도(0.2%)에서도 30분 후에 안정하지 않았다. 그럼에도 불구하고, 카프릴산의 독성 및 시약을 제거하기 위한 DE 여과의 필요성을 고려하여, 이 대안은 폐기하였고 바이러스 불활성화의 대안으로 선택하지 않았다.
PA 용출액의 아르기닌 처리
아르기닌의 사용은 엔벨로프형 모델 바이러스를 효과적으로 불활성화시키는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 클론 1로부터의 PA 용출액을 출발 물질로서 사용하였다. PA 용출액의 pH는 pH 4.0, pH 4.75, pH 4.79 및 pH 5.5로 조정하였다. 최종 농도 0.38 M, 0.4 M 및 0.8 M의 아르기닌을 목표로 하여 상이한 양의 아르기닌(30 mM 아세트산염 중의)을 첨가하였다. 상이한 항온처리 시간: 항온처리 시간 없음, 60분 또는 120분으로 실험을 수행하였다(표 12 참조). 반응을 정지시키기 위해, PD10을 PBS 완충액 중에서 완충액 교환을 위해 사용하였다.
Figure pct00014
표 13에는 이 실험의 결과가 제시된다.
Figure pct00015
pH 4.0에서의 PA 용출액은 아르기닌과 함께 항온처리되었을 때 안정하지 않았고, 실제로, 0.4 M 아르기닌을 사용하여 60 분 항온처리만 한 후에도 HPLC-SE에 의해 13% 단량체 손실(92.7에서 79.3%)이 있었고, 0.8 M 아르기닌으로 120 분 동안 항온처리하였을 때에는 8%(90.9에서 82.5%)의 손실이 있었다. pH 4.75 이상인 조건들의 경우, pH 5.5에서 0.8 M 아르기닌을 사용할 때에도 최대 120분 동안 어떠한 분해도 관찰되지 않았다. pH가 4.75 이상인 아르기닌 처리는 낮은 pH 처리에 대한 가능한 대안으로 생각되었다.
PA 용출액의 용매 세제 처리
용매 및 세제는 엔벨로프형 바이러스의 엔벨로프의 지질을 용해시키는 능력 때문에 바이러스 불활성화에 사용될 수 있다.
클론 1 유래의 PA 용출액을 출발 물질로서 사용하였다. 처음(연구 1), TnBP 처리를 여러 농도에서 시험하였다: 0.1%, 0.3%, 0.5% 및 1%. 다음(연구 2), TnBP 와 Tween 80과의 조합 및 다른 세제, 예컨대 Triton X-100 및 Tween 20과의 처리를 시험하였다(S/D 혼합물을 제조하고, 생성물과 항온처리 15 분 전에 교반하였다). PD10을 사용한 완충액 교환은 S/D를 제거하는데 효율적이지 않았고, 반응을 정지시키기 위하여 PBS를 이용하여 4 g/L로부터 0.3 g/L로의 1회 희석을 사용하였다. 표 14에는 PA 용출액에 대해 S/D를 사용하여 시험한 14가지 다른 조건이 요약된다.
Figure pct00016
연구의 제 1 부분(연구 1)의 결과는 표 15에 보고된다. 이 실험에서, 각 시점마다 1회의 PD-10 완충액 교환을 수행하였다.
Figure pct00017
이 결과는 침전이 관찰되고 분석 결과가 제공되지 않은 120분 항온처리 동안 1% TnBP를 제외한 모든 TnBP 조건에서 BEAT®2가 안정하다는 것을 보여준다. 조건 0.3% TnBP + 1% Tween 80에서는 t0 이후에 HPLC-SE에 의해 분해가 인지되었으나, CGE 및 HPLC-HIC에 의해서는 확인되지 않았다. HPLC-SE 미가공 데이터의 분석 후, 처리 후 샘플에 남아 있는 Tween 80으로 인해 응집체 백분율은 증가하였고, Tween 80은 이 방법을 방해하는 바, Tween 80의 체류 시간은 응집체 체류 시간과 거의 비슷하다. 따라서, 조건 0.3% TnBP + 1% Tween 80에 의한 샘플에서는 분해가 전혀 관찰되지 않았다. 이 제1 실험은 반응기 PD-10 완충액 교환에 의해 정지되지 않았고, Tween 80이 HPLC-SE 분석 동안 여전히 샘플에 존재하였기 때문에 최적인 것은 아니었다. 다음으로, 2가지 다른 세제, Tween 20 및 Triton X-100을 시험하였고, 반응을 정지시키기 위하여 각 시점마다 PBS 완충액을 사용하여 0.3 g/L로 만드는 희석량을 각 샘플에 적용하였다(연구 2). 표 16의 결과에는 HPLC-SE 및 HPLC-HIC의 분석이 예시된다.
Figure pct00018
표 16은 Triton X-100과 조합된 0.3% TnBP로 처리된 샘플의 경우, 고농도의 Triton X-100(1%)에서 HPLC-SE에 의해 응집체의 약 15% 및 단편의 8%가 분해하는 것으로 나타났음을 보여준다. 0.2% Tween 80의 조건을 제외한, Tween 80 및 Tween 20과 조합된 0.3% TnBP로 처리된 샘플에서는 희석된 PA 용출액과 비교했을 때 분해 표시는 HPLC-SE 및 HPLC-HIC에 의해 전혀 인지되지 않았다. 모든 샘플 조건들에서는 t=0 및 t=90분 사이에 차이가 전혀 관찰되지 않았다.
종합해보면, 이들 결과는 BEAT®2가 대부분의 S/D 처리 조건에서 120 분까지는 안정하고, 따라서 S/D 처리는 BEAT®2-함유 용액의 유용한 바이러스 불활성화 방법인 것을 보여준다.
청징화된 수확물(PA 부하물)의 S/D 처리
PA 용출액의 S/D 처리에 대한 연구로부터 얻어진 결과에 기초하여, 청징화된 수확물에 대한 시험 S/D 처리는 더 나은 용매 및 세제 제거를 보장하고, 따라서 안전성을 증가시키는 것으로 결정하였다.
처음 2가지 정제 단계는 PA 크로마토그래피 후 바이러스 불활성화 대신에 바이러스 불활성화 및 PA 크로마토그래피였다.
Figure pct00019
이 단계에서, TnBP를 Tween 20, Tween 80 및 Triton X-100과 조합으로 사용하여 여러 조건을 시험하였다. 용매 및 세제의 혼합물은 PA 부하물에 첨가하였고, 약 20 분 동안 항온처리하였으며, Kaneka KanCapA 수지 컬럼에 부하하였다. 모든 결과는 표 18에 기록하였다.
Figure pct00020
모든 S/D 조건에서 유사한 성능을 얻었고, PA 용출액 처리 결과(실행 2, 3 및 4)는 수율 및 모든 분석 데이터에서 실행 1(S/D 항온처리 없음)과 비슷하지만,이들은 약간 더 높은 CV 용출(3.5에서 약 5로) 및 더 낮은 농도 값(7.0 g/L에서 약 5 g/L로)을 갖는다. Tween 80의 제거는 효율적이었고, PA 정제 후에 Tween 80은 약간의 미량만이 존재하였다.
PA 단계 전에 수행된 S/D 처리는 이 반응이 PA 정제에 의해 중지되었고 순도가 영향을 받지 않았기 때문에, 바이러스 불활성화에 사용될 가능성이 있는 것으로 입증되었다. 또한, 후속되는 CEX 크로마토그래피는 PA 크로마토그래피 후에 존재하는 나머지 미량의 S/D를 추가로 제거한다.
상이한 세제에 의해 수득된 결과들은 유사하므로, 다른 공정 단계들에 이미 사용되었던 Tween 80을 이후의 분석을 위해 선택하였다. 따라서, 0.3% TnBP + 1% Tween 80을 조합한 조건은 청징화된 수확물의 S/D 처리를 위해 선택하였고, 이 처리는 BEAT®2-함유 용액의 바이러스 불활성화를 위해 고려하였다.
PA 용출액의 높은 pH 처리
클론 1 유래의 소량(20 mL)의 PA 용출액을 사용하여 높은 pH 항온처리 하에서 BEAT®2의 안정성을 시험하였다. 우선, 표 19에 나타낸 바와 같이, 목표 pH 11.0에 도달하기 위하여 여러 완충액, 즉 0.5 M 아세트산염 pH 12.0, 0.5 M 구연산염 pH 12.0, 1M Tris pH 12.0, 0.25 M 히스티딘 pH 12.0, 0.5 M L-아르기닌 pH 12.0, 0.25 M 인산염 pH 12.0, 0.1M NaOH 및 최종적으로 0.5M NaOH을 시험하였다.
Figure pct00021
목표 pH 11.0은 모든 완충액, 예를 들어 아세트산염 및 구연산염 0.5 M, pH 12.0 및 Tris 1 M pH 12.0에 의해 도달되지 않았다. pH 조정을 위한 부피비는 완충액 선택의 하나의 기준이었고, 그 목적은 다음 단계의 큰 부피를 피하기 위하여 최소 비를 갖는 것이었다.
이러한 제1 선별 후, 0.25M 인산염 pH 12.0, 0.1M NaOH 및 0.5M NaOH를 선택하여 추가 연구를 수행하였다.
pH 11.2에서 항온처리는 선택된 완충액으로 30분, 45분 및 60분 동안 수행하였다(표 20 참조). 모든 실험에서 처리 후 생성물은 HPLC-SE, HPLC-HIC, CGE(비-환원)및 iCE3에 의해 분석하였다. 그 결과는 표 21에 나타내었다.
Figure pct00022
Figure pct00023
모든 실험 동안 침전은 pH 6.0에서 관찰되었고 pH 11.0에서 사라졌다. 수율은 약 95%였으며, 불순물에 대한 분석이 수행되지 않았지만 불순물의 침전이 있었고, 낮은 pH 항온처리 후 중화 시에도 생성물의 손실 없이 동일한 현상이 다른 계획들에서도 관찰된 것으로 추정되었다. BEAT®2는 pH 11.2에서 60분 이하의 항온처리에 안정하였다. 사실상, NaOH 0.5M 완충액에 의하여 HPLC-SE에 의한 단량체 백분율은 pH 11.2에서 60분 후 안정하였고, CGE(단지 마지막 시점에 시험되었다), iCE3 및 HPLC-HIC에 의하여 동등한 결과가 수득되었고, 출발 물질에 비해 분해가 전혀 관찰되지 않았다. 이 실험을 반복하고, 결과를 확인하였다. 이러한 결과를 기초로 할 때, 0.5 NaOH 완충액을 사용한 pH 처리는 낮은 pH 바이러스 불활성화에 대한 가능성 있는 대안으로서 간주되었다.
d. BEAT ® 2의 활성 시험
재료, 방법 및 장치
용매/세제, 아르기닌 및 높은 pH 처리의 영향을 조사하기 위해, 용매 세제(0.3% TnBP + l% Tween 80)에 의해 처리된 여러 샘플에 대해; pH 4.0 및 pH 5.5 에서 0.8M 아르기닌과 항온처리 후, 및 높은 pH 처리(NaOH 0.5M, pH 11.2) 후에 결합 친화도 분석을 수행하였다. 2개의 항원 표적, CD38 및 CD3을 시험하였다.
결과 및 결론
모든 샘플에 대해 현저한 차이가 관찰되지 않았고, 실제로 Kd 값은 비슷하였다. 따라서, 항체 활성에 대한 이들 처리는 모두 어떤 효과도 없었다. 이 분석의 결과는 표 22에 보고하였다.
Figure pct00024
실시예 2: 낮은 pH-취약성 항체를 함유하는 PA 용출액의 아르기닌 처리는, 항체의 안정성을 손상시키는 pH 레벨에서만 효과적인 바이러스 불활성화를 유도한다
실시예 1에 보고된 안정성 및 활성 연구에 기초하여, 바이러스를 불활성화시키는 능력에 대해 가장 유망한 바이러스 불활성화 방법을 추가 시험하였다. 바이러스 불활성화 효과는 Bioreliance에서 스파이킹 연구를 행함으로써 평가하였다. 각 처리 전 및 후에 시험 샘플을 취하여 바이러스 역가에 대해 분석하였다. 먼저, 아르기닌 처리에 대한 VRV 연구를 수행하였다.
재료, 방법 및 장치
모노클로날 항체와 같은 CHO 세포주로부터 유래된 생물학적 산물에 사용되는 전형적인 모델 바이러스인 하나의 바이러스 MLV만을 본 연구에 사용하였다. 총 7 회 실행을 수행하였다. 개발 실행으로부터의 PA 용출액을 출발 물질로서 사용하였다. 아르기닌의 여러 스톡 완충액을 여러 pH(pH 4.0, pH 4.75,pH 4.79 및 pH 5.5)에서 사용하여 목표 pH 및 농도에 도달하였다. 샘플은 반응을 정지시키기 위하여 250 mM 히스티딘 pH 12.0 완충액을 사용하여 약 pH 6.0으로 중화시켰다. 표 23은 VRV 연구 동안 시험된 조건을 요약한 것이다.
Figure pct00025
중화된 부하 샘플에 대해 log 감소 값을 계산하였고, t=60 min 샘플에 대해 5개 평판의 대용량 평판배양 뿐만 아니라 표준 적정을 수행하였다. 중화된 부하 유지 샘플은 16.0℃ 내지 20.0℃에서 60 분(실행 2, 4 및 6) 또는 120 분(실행 1, 3, 5 및 7)동안 유지시켰다.
결과 및 결론
아르기닌 처리에 대한 VRV 연구 결과는 표 24에 제시된다.
Figure pct00026
pH 4.0에서의 처리만이 효과적인 바이러스 청소를 제공하고 이 pH 조건에서 BEAT®2가 분해되는 것으로 나타났기 때문에(실시예 1), BEAT®2-함유 용액의 바이러스 불활성화 처리에 대한 가능성있는 방법으로부터 아르기닌 처리는 폐기하였다.
실시예 3: 낮은 pH-취약성 항체를 함유하는 PA 용출액의 S/D 처리는 효과적인 바이러스 불활성화를 유도한다
다음으로, 바이러스를 불활성화시키는 BEAT®2-함유 PA 용출액의 용매 세제 처리 능력을 시험하였다.
재료, 방법 및 장치
PA 용출액의 S/D 처리를 이용한 바이러스 불활성화의 효과는 Bioreliance에서 스파이킹 연구를 행함으로써 평가하였다. 모노클로날 항체와 같은 CHO 세포주로부터 유래된 생물학적 산물에 사용되는 전형적인 모델 바이러스인 하나의 바이러스 MLV 만을 본 연구에 사용하였다. 목표 농도는 TnBP 0.3% 및 Tween 80 l%였다. PA 용출액(약 pH 4.2)에 대해 수행하였고 PA 용출액을 중화시켰다(pH 6.0). 작동 온도 조건은 15℃ +/- 2℃였고, 이는 화학적 불활성화에 최악의 시나리오이다(더 낮은 온도는 더 느린 불활성화를 유도한다). 공정 작동 조건은 제조 설비에 따라 전형적으로 18 내지 25℃이다. 동역학은 시점 0분, 10분, 30분 및 60분에 수행하였다. BEAT®2에 대해 시험된 조건의 요약이 표 25에 제시된다.
Figure pct00027
표 26에서 VRV 연구 결과는 PA 용출액의 S/D 처리가 PA 용출액이 중화되지 않을 때 효율적인 바이러스 불활성화를 초래하고, PA 용출액이 항온처리 60 분 후에 중화될 때 적당한 불활성화를 초래한다는 것을 보여주며, PA 용출액의 S/D 처리가 BEAT®2 정제 공정에 유효한 VI 방법임을 확인시켜준다.
Figure pct00028
실시예 4: 낮은 pH-취약성 항체를 함유하는 청징화된 수확물의 S/D 처리는 효과적인 바이러스 불활성화를 유도한다
또한, BEAT®2 함유 청징화된 수확물의 용매 및 세제에 의한 처리에 대하여 VRV 연구를 수행하였다.
VRV 연구 1
재료, 방법 및 장치
모노클로날 항체와 같은 CHO 세포주 유래의 생물학적 산물에 사용되는 전형적인 모델 바이러스인 하나의 바이러스 MLV만을 본 연구에 사용하였다. TnBP와 Tween 80의 혼합물을 사용하여 총 3회의 실행을 수행하였다. 동일한 백분율의 TnBP(0.3%)와 상이한 백분율의 Tween 80(0.25%, 0.5% 및 1.0%)을 시험하였다. S/D로 스파이킹한 후, 생성물을 항온처리 종료 시까지 교반하였다. 일단 각 시점이 수집되면, 즉시 1/25로 희석하고 pH 6.00 내지 8.00으로 중화시켜 켄칭시켰다. 표 27 은 S/D 처리에 대한 VRV 연구 동안 BioReliance에서 시험된 조건을 보고한다.
Figure pct00029
켄칭된 부하 샘플에 대해 log 감소 값을 계산하였고, t = 60 분 샘플에 대해 5개 평판의 대용량 평판배양 및 표준 적정을 수행하였다. 켄칭된 부하 유지 샘플을 16.0℃ 내지 20.0℃에서 60 분 동안 유지시켰다.
결과 및 결론
표 28에서, VRV 연구 결과의 요약이 제시된다
Figure pct00030
청징화된 수확물의 S/D 처리는 특히 더 낮은 농도의 Tween 80(0.25%)이 사용될 때에도, 시험된 조건 모두에서 MLV 바이러스의 불활성화에 효과적인 것으로 나타났다.
VRV 연구 2
추가적으로, MLV 및 PRV 바이러스를 불활성화시키기 위한 청징화된 수확물의 용매 세제 처리 역량은 최악의 경우의 조건 하에서 평가하였다.
재료, 방법 및 장치
공정 부하 샘플은 바이러스 스톡으로 스파이킹하고 Bioreliance로 분석하였다.
이는 표 29에 나타낸 바와 같이 "최악의 경우" 조건 하에서 수행하였다. 가장 낮은 청소 계수(clearance factor)는 각각 반복물에서 기록하였다.
Figure pct00031
결과 및 결론
BEAT®2에 대해 개발된 화학적 바이러스 불활성화 단계는 MLV 및 PRV 불활성화에 미치는 효과에 대하여 0.2% TnBP + 0.75% Tween 80 및 0.4% TnBP + 1.25% Tween 80의 S/D 혼합물을 가지고 수확물 lot 1 및 lot 2를 사용하여 평가하였다.
두 바이러스 실험을 위해, 동일한 프로토콜을 적용하였고, 축소된(scaled-down) 공정부터 임상 규모의 공정을 표 30에 비교하였다.
Figure pct00032
표 31은 MLV에 대해 각 실행마다 계산된 log 감소 계수를 나타낸다.
Figure pct00033
이 결과는 바이러스 불활성화가 S/D 처리 동안 효과적이고, 총 log10 바이러스는 경시적으로 감소하며, 항온처리 5분, 10분, 30분 및 60분 후에 각각 1.31 log10, 2.44 log10, 2.88 log10 및 4.03 log10 미만이다.
추가로, S/D 실행 동안 분취량을 수집하고, 동결시키고, Tween 80 및 TnBP 백분율 함량에 대해 분석하였으며, 결과는 하기 표 32에 나타내었다.
Figure pct00034
이 결과들는 다음과 같은 것을 나타낸다:
낮은 농도(0.75% Tween 80/0.2% TnBP)에서의 화학적 불활성화는 각각 실행 1 및 실행 2에서 4.03 및 3.79 log10의 감소 계수를 나타내었고, 이는 낮은 S/D 농도가 MLV의 불활성화에 중간적으로 효과적임을 의미한다. 그러나, 표 31에 제시된 결과는 Tween 80 백분율에 관하여 실행 1 및 2 사이의 변화량(0.71% 및 0.52%)이 현저하다는 것을 입증한다. 실행 2에서는 Tween 80 0.52% 및 TnBP 0.15% 만이 측정되었으나, 이들이 낮은 농도이므로 이것이 최악의 경우이다. 목표인 0.75% Tween 80 및 0.2% TnBP는 도달하지 못했다고 결론지을 수 있다. 감소는 최악의 경우로 간주된 Tween 80 및 TnBP의 더 낮은 농도, 즉 0.52% Tween 80 및 0.15% TnBP에 의해 수행된 실행(실행 2)에서 더 낮았다.
고 농도(1.25% Tween 80/0.4% TnBP)에서의 화학적 불활성화는 각각 실행 3 및 실행 4에서 ≥5.37 및 ≥5.02 log10의 감소 계수를 나타내었으며, 이는 예상된 바와 같이 더 높은 S/D 농도가 MLV의 불활성화에 더 효과적이었음을 의미한다. 표 31에 제시된 결과는 실행 3 및 4 사이의 변화량(0.91 및 0.89)이 Tween 80 백분율에 관련하여 현저하게 상이하지 않았음을 입증한다. 그러나, 역시 1.25% Tween 80의 목표는 두 실행에서 도달하지 못했고, 사실상 0.91% 및 0.89%만이 실행 3 및 실행 4에서 각각 측정되었다. TnBP 데이터와 관련하여, 0.40% 대신에 0.48%로 실행을 수행하였다(실행 3, t60min). 역시, 바이러스 불활성화에 대한 결과는 매우 논리적이어서, 더 높은 Tween 80 및 TnBP %를 이용한 실행 3은 최상의 바이러스 불활성화를 수득할 수 있도록 한다. 결론적으로, MLV 바이러스 불활성화에 대한 최악의 경우 시나리오에서도(실행 2, 0.52% Tween 80 및 0.15% TnBP), 3.79 log10의 적당히 효과적인 감소가 수득되었다.
표 33은 PRV에 대해 측정된 Tween 80 및 TnBP %와 다른 화학적 바이러스 불활성화 샘플에서 수득된 log10 값, 및 각 실행마다 계산된 Log 감소 계수를 보여준다:
Figure pct00035
바이러스 불활성화는 항온처리동안 효과적이며, 총 log10 바이러스는 시간 경과에 따라 감소하며, 5개의 처리 직후에는 3.68 log10 미만이고, 항온처리 60 min 후 5.49 log10 이었다. S/D 실행 동안 분취량을 수집하고, 동결시키고, Tween 80 및 TnBP % 함량에 대해 분석하였으며, 결과는 하기 표 34에 나타내었다.
Figure pct00036
PRV 결과는 다음과 같다:
저 농도(0.75% Tween 80/0.2% TnBP)에서의 화학적 불활성화는 실행 1 및 실행 2에서 각각 ≥5.46 및 ≥5.19 log10의 감소 계수를 나타내었으며, 이는 낮은 S/D 농도가 PRV의 불활성화에 효과적이었음을 의미한다. 그러나, 표 33에 제시된 결과는 Tween 80% 결과(0.74% 및 0.57%)와 관련하여 실행 1 및 2 사이의 변화량이 현저하다는 것을 입증한다. 0.75% Tween 80의 목표은 실행 2에서 도달하지 못했고, 사실상 0.57%만이 측정되었으며, 이는 낮은 세제 농도이기 때문에 최악의 경우의 시나리오이다. TnBP의 경우, 두 실행은 모두 0.20% 대신에 0.15%인 목표보다 낮은 비슷한 값을 나타낸다. 예상한 바와 같이, 더 낮은 Tween 80 백분율을 가지고 실행 2는 ≥5.19 log10으로 실행 1에 비해 더 낮은 바이러스 감소를 나타내었다.
고 농도(1.25% Tween 80/0.4% TnBP)에서의 화학적 불활성화는 각각 실행 3 및 실행 4에서 ≥5.19 및 ≥5.46 log10의 감소 계수를 나타내었으며, 이는 예상한 바와 같이 더 높은 S/D 농도가 PRV의 불활성화에 더 효과적이었음을 의미한다. 표 33에 제시된 결과는 두 실행 모두, 특히 실행 3에서 시점 t0 및 시점 t60분 사이에 Tween 80 및 TnBP 값에 대하여 변화가 있었으며, t0에서 Tween 80 함량은 0.80%이고, t60min에서는 1.01%이고, 마찬가지로 TnBP t0에서는 0.27% 및 t60min에서는 0.33%였다. 역시 두 실행 모두에서 목표인 1.25% Tween 80에 도달하고자 하였지만, 이 모든 것에도 불구하고 바이러스 불활성화에 대한 최악의 경우는 낮은 농도의 S/D이다. TnBP 데이터와 관련하여, 실행은 0.40% 대신에 0.48%로 수행하였다(실행 3, t60 min). 역시, 바이러스 감소에 대한 결과는 매우 논리적이며, 더 높은 Tween 80 및 TnBP %를 이용한 실행 3은 더 우수한 바이러스 청소를 나타냈다.
동일한 화학적 불활성화를 이용하여 MLV에 비해 PRV 바이러스에 의해 수득된 더 높은 바이러스 불활성화는 사실상 PRV가 더 낮은 이화학적 내성을 갖는 것으로 예상된다.
모든 데이터를 결론적으로 말하면, 최악의 경우의 시나리오(실행 2)에서, 5.19 log10인 PRV 바이러스 불활성화는 효과적이다.
종합해보면, 연구 1 및 연구 2의 결과는 PA 부하물의 S/D 처리에 의해 VI가 달성된다는 것을 입증한다.
실시예 5: 낮은 pH-취약성 항체를 함유하는 PA 용출액의 높은 pH 처리는, 항체의 안정성을 보존하는 pH에서 중간 정도의 효과적인 바이러스 불활성화를 유도한다
재료, 방법 및 장치
BEAT®2를 함유하는 PA 용출액의 높은 pH 처리에 대한 VRV 연구를 수행하였다. 이 연구를 위해 하나의 바이러스 MLV만을 사용하였다. 실험은 pH 10.8(더 낮은 pH를 이용하는 최악의 경우 조건인 pH 11.0의 공정 목표를 기준으로)에서 단일 실행으로 수행하였다. 개발 실행 유래의 PA 용출액을 이 연구에 사용하였고, 선택된 완충액 0.5M NaOH를 사용하여 pH를 증가시켰다. 수집 시, 모든 샘플은 3.7% HCl로 pH 6-8로 중화시켰다.
log 감소 값은 중화된 부하 샘플에 대해 계산하였고, 5개 평판의 대용량 평판배양 뿐만 아니라 표준 적정은 t=60 min 샘플에 대해 수행하였다. 중화된 부하 유지 샘플은 16.0℃ 내지 20.0℃에서 60분 동안 유지하였다.
결과 및 결론
표 35에서, 이 연구 동안 수득된 VRV 결과가 제시된다.
Figure pct00037
높은 pH에서 BEAT®2-함유 PA 용출액의 항온처리는 감소 계수가 3.18 log10일 때 1분 항온처리 후부터 60분의 항온처리까지 MLV 바이러스의 불활성화에 적당하게 효과적이다. 따라서, 높은 pH 처리는 BEAT®2 정제 공정에서 낮은 pH 처리의 유효한 대안으로서 간주될 수 있다.
실시예 6: PA 용출액의 높은 pH 처리는 낮은 pH-취약성 항체 BEAT ® 2의 정제 공정에서 효과적인 불활성화 단계이다
BEAT®2의 제조 공정에서 바이러스 불활성화 단계로서 높은 pH 처리의 사용 가능성을 추가로 조사하기 위해, 추가 안정성 및 활성 연구를 수행하였다. 유지 시간 영향은 24h의 항온처리에서와 같이 최악의 경우의 시나리오를 포함하는 여러 시점들에서 평가하였다.
재료, 방법 및 장치
본 연구에서 사용한 출발 물질은 대표적인 PA 용출액이었다
모든 화학물질은 약전 등급(US 또는 EP)이었다. 공정내 0.2 ㎛ 여과 단계는 전형적으로 모든 완충액 및 공정 중간물질에 대해 수행하였다. 또한, 자기 교반기, pH 및 전도도 측정기를 사용하였다.
시험된 시점은 RT에서 1 시간, 2 시간 및 4 시간이었고, 이 시점 이후 생성물은 항온처리 24시간까지 5±3℃에 두었다. 약 100 mL의 PA 용출액은 자기 교반기를 사용하여 교반하에 NaOH 0.5 M을 사용하여 Nalgene 병에서 pH 11.2로 염기성화시켰다. 이 pH는 공정의 목표 pH 11.0을 확인하기 위해 제품 품질에 대한 최악의 경우의 시나리오로서 선택하였다. 높은 pH에서 생성물은 이하에 설명된 바와 같이 즉시 중화시킨 시점 t0을 제외하고는 항온처리하였다. 각 시점에서, 약 10 mL의 높은 pH 생성물은 50 mL TPP 튜브로 옮기고, 동결되기 전에 VI 반응을 정지시키기 위해 HCl 3.7%(중화 단계)를 사용하여 pH 6.0까지 pH 를 감소시킴으로써 중화시켰다.
모든 시점에서 HPLC-SE, iCE 및 CGE에 의해 생성물 품질을 분석하였다. 중화되지 않고 어떠한 VI 처리도 없는 PA 용출액도 분석하여 참조군으로서 사용하였다.
Figure pct00038
전술한 것들 중 일부 샘플은 표면 플라스몬 공명에 의해 시험하고자 선택하였다(표 37). 이는 높은 pH 처리가 BEAT®2 분자의 이의 표적 CD3ε 1-26-Fc 및 CD38에 대한 결합 친화도, 및 이에 따라 간접적으로 이의 활성에 영향을 미쳤는지를 확인하는 것이었다. 또한, 세포 기반 기능성 분석을 수행하여 BEAT®2 분자 활성에 대한 높은 pH의 영향을 직접적으로 확인하였다.
Figure pct00039
결과 및 결론
BEAT®2에 대한 높은 pH에서의 유지 시간의 영향은 SE-HPLC로 분석하여 표 38 및 도 10에 나타낸 바와 같이 여러 시점에서 항온처리 후 샘플의 순도를 확립하였다.
Figure pct00040
표 38에 나타낸 바와 같이, 단량체 백분율은 조건들마다 비슷했고, 24 시간까지 높은 pH 처리에 의한 현저한 응집은 나타나지 않았며, 사실상 관찰된 변화는 방법 가변성 내에 속한다.
이러한 결과는 BEAT®2가 보통 ≥60분 내지 ≤90분인 공정 시간을 안전성 한계로 포함하는 24 시간까지 안정하다는 것을 시사한다.
또한, 비환원 CGE를 실행하였고, 이는 표 39 및 도 11에 나타낸 바와 같이, BEAT®2의 안정성을 추가로 확인시켜준다.
Figure pct00041
BEAT%는 참조 샘플(PA 용출액)과 비슷하고, 4 시간까지 유의적인 단편화는 나타나지 않았다. BEAT®2는 보통 ≥60분 내지 ≤90분인 공정 시간을 안전성 한계로 포함하는 2 시간까지 안정하다.
또한, 환원 CGE는 BEAT®2가 보통 ≥60분 내지 ≤90분인 공정 시간을 안전성 한계로 포함하는 24 시간까지 안정하다는 것을 보여준다(표 40 및 도 12 참조).
Figure pct00042
전하 변이체의 변화량을 평가하기 위해, iCE를 수행하였다(도 13 및 표 41).
Figure pct00043
산성 종의 증가가 경시적으로 관찰된다. 그럼에도 불구하고, 방법 가변성은 ≤10%이며, 따라서 2시간까지 관찰된 차이는 방법 가변성 범위 내이며, 허용성이며 통계적으로 무의미한 것으로 간주될 수 있다. 관찰된 산성 증가 %는 예상된 경향이나, 2시간 안전성 한계는 보통 ≥60분 내지 ≤90분인 공정 시간 (및 그 이상)을 포함하는 것이다.
세포 기반 기능성 분석 결과는 도 14 및 표 42에 제시된다. 최대값의 절반 유효 농도(EC50)는 용량-반응 곡선에 기초하여 결정하였다. 수득된 EC50 값은 높은 pH 항온처리 시간이 0인 샘플을 참조군으로 채택하여 각 샘플의 상대적 효능을 결정할 수 있도록 하였다.
Figure pct00044
상대적인 효능 값은 경시적으로 어떤 경향도 관찰되지 않았다. tlh 및 t2h 에서의 높은 pH 처리는 참조군으로서 사용된 PA 용출액과 비교했을 때 매우 유사한 효능을 제공한다. 방법 가변성이 ≤25%라면, 높은 pH 처리는 보통 ≥60분 내지 ≤90분인 공정 시간을 포함하는 2 시간의 항온처리 후에도 BEAT®2 기능성을 유의적으로 변경시키지 않는다.
여러 시점에 평가된, 표적 CD3 및 CD38에 대한 BEAT®2 항체의 결합 친화도는 표 43에 열거된다.
Figure pct00045
인간 CD38에 대한 결합 활성은 단백질 A 용출액과 높은 pH에서의 항온처리된 모든 샘플들 간에 차이가 관찰되지 않는다. 또한, 인간 CD3ε에 대한 결합 활성의 기능적 유의성은 단백질 A 용출액과 높은 pH에서의 항온처리된 모든 샘플들 사이에 차이가 관찰되지 않는다. 인간 CD3ε에 대한 친화도의 작은 차이는 t0 샘플과 다른 모든 샘플들 간에 관찰되었지만, 친화도는 여전히 동일 범위 내이고(낮은 나노몰, PA 용출액보다 32% 더 높음), 이는 아마도 주입된 농도의 작은 차이로 인한 것이다.
결론적으로, 높은 pH 항온처리는 BEAT®2의 안정성 및 활성에 영향을 미치지 않으며, BEAT®2의 제조 공정에 사용될 수 있다.
실시예 7: PA 용출액의 높은 pH 처리는 낮은 pH-취약성 항체 BEAT ® 3의 정제 공정에서 효율적인 불활성화 단계이다
제3 BEAT 항체에 가장 적절한 바이러스 불활성화 방법을 평가하기 위해, BEAT®3, 안정성, 활성 및 VRV 연구를 수행하여 PA 용출액의 낮은 pH 및 높은 pH 처리 뿐만 아니라 청징화된 수확물의 용매/세제 처리 효과를 조사하였다.
재료, 방법 및 장치
본 연구에서 사용된 출발 물질은 청징화된 수확물 및 가네카(Kaneka)의 KanCapA 수지를 사용한 친화도 크로마토그래피 후의 PA 용출액이었다.
세포 배양물은 전형적으로 생존력이 80% 보다 낮을 때 종결시켰고, 세포 잔해는 데드-엔드 깊이 여과, 및 이어서 0.2 ㎛ 필터 여과에 의해 제거하였다. 세포 배양 상청액은 CHO 세포로부터 유래하였다. 초기 개발 시험은 최종 선택된 클론의 모 클론 유래의 비대표 물질을 사용하여 수행하였다. 최종 선택된 클론에서 유래되는 대표 물질을 사용하여 개발의 후기 분석을 수행하였다.
공정내 0.2 ㎛ 여과 단계는 전형적으로 모든 완충액 및 공정 중간물질에 대해 수행하였다. VI 연구를 위해, 자기 교반기, pH 및 전도도 측정기를 사용하였다.
PA 용출액 - 낮은 pH 바이러스 불활성화
약 25 mL의 PA 용출액을 50 mL TPP 튜브에서 HCl 3.7%를 사용하여 pH 3.7로 산성화하였다. 낮은 pH에서 생성물은 후술하는 바와 같이 즉시 중화시킨 시점 tO 을 제외하고는 자기 교반기를 사용하여 교반하에 항온처리하였다. 시험한 시점은 RT에서 1 시간, 2 시간, 4 시간 및 6 시간이었고, 이 시점 이후 생성물은 24 시간 및 48 시간 항온처리까지 5±3℃에 두었다. 각 시점에서, 약 3 mL의 낮은 pH 생성물은 15mL TPP 튜브로 옮기고, VI 반응을 정지시키기 위하여 250 mM 히스티딘 pH 12.0을 사용하여 pH 5.0까지 pH를 증가시켜(중화 단계) 중화시킨 후, 동결시켰다.
고 처리율의 HPLC-SE 분석을 사용하여 모든 시점을 특성화하였다. 캘리퍼 CGE(비환원) 및 iCE 분석은 tO 및 T48 시간에만 수행하였다. 상이한 시점과 시점 t0(낮은 pH에서 항온처리하고 pH 5.0에서 즉시 중화된 샘플)를 비교하여 결과를 분석하였다. 중화되지 않고 어떤 VI 처리도 없는 PA 용출액도 분석하였고, t0과 비교하기 위해 참조군으로 사용하였다.
Figure pct00046
청징화된 수확물 - 용매-세제 처리
0.3% TnBP 및 1% Tween 80의 혼합물을 제조하고, 혼합 균질성을 보장하기 위해 항온처리하기 15분 전에 교반하였다. 상기 혼합물을 항온처리하고, 이전 과제에서 관찰했을 때 충분한 바이러스 불활성화를 갖도록 하기 위하여 PA 부하 단계 전에 최소 60분 동안 자기 교반기를 사용하여 청징화된 수확물과 혼합하였다. 처리된 물질은 즉시 정제하여 Kaneka KanCap A 수지의 1.1 ㎝ 직경 컬럼을 사용하여 VI 반응을 정지시켰다. 이어서, 5±3℃로 유지된 PA 용출액을 이어서 HPLC-SE, CGE(환원 및 비환원) 및 iCE로 분석하였다.
PA 용출액 - 고 pH 바이러스 불활성화
시험한 시점은 RT에서 1 시간, 2 시간, 4 시간 및 6 시간이었고, 이 시점 이후 생성물을 24 시간 및 48 시간 항온처리까지 5±3℃에 두었다. 약 25 mL의 PA 용출액을 NaOH 0.5 M을 사용하여 50 mL TPP 튜브에서 pH 11.2로 염기성화시켰다. 이 pH는 공정의 목표 pH 11.0을 확인하기 위하여 생성물 품질에 대한 최악의 경우의 시나리오로서 선택하였다. 높은 pH에서 생성물은 후술하는 바와 같이 즉시 중화시킨 시점 tO을 제외하고는 자기 교반기를 사용하여 교반하에 항온처리하였다. 각 시점에서, 약 3 mL의 높은 pH 생성물을 15 mL TPP 튜브로 옮기고, VI 반응을 정지시키기 위해 HCl 3.7%를 사용하여 pH 6.0까지 pH를 감소시켜(중화 단계) 중화시킨 후, 동결시켰다.
모든 시점에서 HPLC-SE, iCE 및 CGE로 생성물 품질을 분석하였다. 분석 결과는 상이한 시점과 시점 t0(높은 pH에서의 항온처리되고 pH 6.0에서 즉시 중화된 샘플)를 비교함으로써 분석하였다. 중화되지 않고 어떤 VI 처리도 없는 PA 용출액도 분석하였고, t0과 비교하기 위해 참조군으로서 사용하였다.
Figure pct00047
결합 친화도 분석
높은 pH 처리 개발 실행으로부터의 몇몇 샘플(표 46 참조)은 표면 플라스몬 공명으로 시험하기 위해 선택하였000다. 목표는 높은 pH 처리가 BEAT®3 분자의 이의 표적 CD3ε 1-26-Fc 및 EGFR에 대한 결합 친화도, 및 이에 따라 간접적으로 활성에 영향을 미치는지를 확인하는 것이었다.
제1 분석은 인간 CD3ε 1-26-Fc 항원에 대한 결합 친화도를 측정하는 것을 목적으로 한다. 이는 Series S Sensor Chip CM5(GE Healthcare)로 수행하였다. 인간 CD3ε 1-26-Fc를 아세트산염 pH 4.5 완충액에 25 nM의 농도로 제조하였다. BEAT®3 샘플은 1000 nM부터 1.37 nM로 희석당 200 ㎕의 최종 부피로 제조하였다. 실행은 Biacore T200 처리 유닛(GE Healthcare)을 사용하여 수행하였다.
제2 분석은 인간 EGFR-his 항원에 대한 결합 친화도를 측정하는 것을 목적으로 한다. 이는 Serie S Sensor Chip Protein G(GE Healthcare)로 수행하였다. BEAT®3 샘플을 HBS-EP+(GE Healthcare) 완충액에 각각 25 nM로 희석하였다. EGFR은 100 nM부터 0.13 nM까지 제조하였고, 희석당 250 ㎕의 최종 부피로 달성하였다.
Figure pct00048
세포 기반 기능성 분석
세포 기반 기능성 분석의 목적은 높은 pH 처리가 BEAT®3 분자 활성에 영향을 미치는지를 확인하는 것이었다. 높은 pH 처리 개발로부터 선택된 샘플을 표 47에 기재된 바와 같이 시험하였다.
Figure pct00049
세포 기반 효능 분석에는 Promega에서 상업적으로 입수가능한 조작된 Jurkat T 세포주를 사용하였다. 이들 세포는 루시페라제 cDNA 서열이 NFAT 반응 요소(RE)의 제어 하에 있는 리포터 작제물로 안정하게 형질감염시켰다. 루시페라제의 생성은 CD3ε(및 T 세포 수용체 복합체)로부터 유래된 신호와 같은 NFAT 전사 인자를 활성화시키는 신호에 직접적으로 의존적어었다. 분석은 Jurkat-NFAT 세포(응답자 세포)(CD3ε+, EGFR-)를 SK-BR-3 표적 세포(EGFR+, CD3ε-) 및 BEAT®3 또는 대조군 항체와 공동항온처리함으로써 구성되었다. 응답자 세포의 활성화는 발광 반응에 의해 정량화되었다. Jurkat NFAT 세포주는 6주 배양(P6)하였고, SK-BR-3 세포주는 3 주 배양(P3)하였다.
분석은 96웰 ELISA 평판 U-바닥(TPP)에서 수행하였다. SK-BR-3 발현성 EGFR 세포주(ATCC)는 3 x 105 세포/ml로 재현탁시켰고, 96 웰 평판의 각 웰에 100㎕를 분배하였다. 분석 평판은 37℃ 및 5% C02에서 밤새 항온처리하였다. 그 후, SK-BR-3 발현성 EGFR 세포주 25㎕를 분석 평판에 유지시켰고, 6 ㎍/mL(최종 2 ㎍/mL)로 희석된 여러 BEAT®3 샘플 25 ㎕는 다른 웰에 전달되었다. Jurkat NFAT 세포(Promega)는 1.2 x 106 세포/ml로 재현탁시켰고, 25㎕를 분석 평판의 각 웰에 분배시켰다. 평판을 덮고, 37℃, 5% C02에서 5시간 동안 항온처리되었다. 항온처리 말에, 75 ㎕의 Bio-GloTM 루시페라제 분석 기질(Promega)을 웰에 첨가하였고, 평판은 마이크로평판 판독기에서 획득하였다. 발광은 다음 설정을 사용하여 측정하였다: 판독 테이프- 종말점; 적분 시간 - 1 분; 방출 - 홀; 광학 위치 - 상부; 게인(gain) 135; 판독 높이 - 1.00 mm. 데이타는 그 다음 플로팅하고 Prism(GraphPad) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. X = Log(X) 전환 후 비선형 회귀 피팅(fitting)을 적용하였고, 모든 데이터 세트에 S자형 용량 응답 피팅을 적용하여 EC50 값을 측정하였다. 각 샘플의 상대적 효능은 다음 식을 사용하여 계산하였다: 상대적 효능 % = EC50참조/EC50샘플 x 100.
잔류 DNA 및 HCP 분석
VI 단계의 주요 목적은 제품 품질을 보장하면서 바이러스를 효율적으로 비활성화시키는 것이다. 그럼에도 불구하고, 하류 공정에서 각 단계는 불순물 수준에 영향을 미칠 수 있다. 하기에 기술된 분석의 목적은 CHO 세포 유래의 잔류 DNA 및 HCP 수준에 미치는 높은 pH 처리의 영향을 평가하는 것이었다.
HCP 정량화를 위해, 2가지 다른 분석을 사용하였다: Cygnus technologies로부터의 3G HCP Elisa 키트 및 데이터 프로세싱을 위한 Pall ForteBio의 Octet Red 96 기구의 사용과 함께 ForteBio-Cygnus의 Antio-CHO HCP Detection Kit. 두 기술은 먼저 높은 pH 처리에 의한 HCP 제거를 평가하고, 또한 두 기술, 즉 더욱 민감한 것으로 알려진 고 처리량 옥텟 및 ELISA를 비교하는데 사용하였다.
ELISA를 위한 샘플 제조는 3G Elisa HCP 키트(Cygnus technologies)로 1/100 희석을 사용하여 수행하였다. 샘플은 항-CHO HCP 포획 항체로 코팅된 마이크로타이터(microtiter) 웰에서 친화도 정제된 양고추냉이 퍼옥시다제 표지된 항체와 반응시켰다. 세척 후, 기질 테트라메틸 벤지딘(TMB)을 반응시켰다. 가수분해된 기질의 양은 존재하는 CHO 단백질의 농도와 정비례하였다. 정량화는 샘플의 신호를 동시에 분석된 HCP 표준물질과 비교하여 달성하였다. 데이터는 PRISM 소프트웨어를 사용하여 처리하였다.
옥텟과 관련하여, 항-CHO HCP 검출 키트(ForteBio-Cygnus)를 사용하여 2개의 샘플 희석물을 시험하였다(1/200 및 1/400). 이 측정은 Cygnus Technologies의 금-표준 3G 항-CHO HCP 항체로 사전코팅된 항-CHO HCP 바이오센서에 대한 샌드위치형 분석을 수반하였다. 제조된 96 웰 평판은 Pall ForteBio의 Octet Red 96 기구로 직접 판독하였다. 데이터는 Octet 시스템 데이터 획득 소프트웨어를 통해 처리하였다.
잔류 DNA의 정량과 관련하여, 분석은 단백질을 제거하기 위해 프로테이나제 K에 의한 샘플의 처리를 수반하였다. 이어서, DNA는 자기 비드를 사용하여 추출하고, 세척하고 최종적으로 용출시킨다. 그 후, DNA는 Fast 5000 PCR 장비(Applied Biosystem)를 사용하여 실시간 PCR(폴리머라제 연쇄 반응)로 정량화한다. 샘플 제조는 resDNASEQ™ 정량적 CHO DNA 키트 V3.0(Applied Biosystems)으로 수행하였다
표 48에 열거된 높은 pH 개발 유래의 몇몇 샘플은 상기 기재된 잔류 DNA 및 HCP 분석에 의해 시험하도록 선택하였다. VI 이후 0.2㎛ 여과도 시험하였다.
Figure pct00050
VRV NRT 연구
VI 실험 유래의 데이터를 분석하였고, 수득된 생성물 품질에 관한 VRV NRT 연구를 위해 높은 pH 처리를 선택하였다. BioReliance에 의해 수행된 이러한 바이러스 청소 연구의 목적은 바이러스를 효과적으로 불활성화시키는 이러한 처리의 능력을 평가하는 것이었다. 본 연구는 모노클로날 항체와 같은 CHO 세포주로부터 유래된 생물학적 산물에 대해 사용된 전형적인 모델 바이러스인 이종 뮤린 백혈병 바이러스(MLV) 상에서 수행하였다. MLV는 또한 이화학적 처리에 민감한 것으로 알려져 있다(표 49 참조).
Figure pct00051
단일 실행은 pH ll.O의 공정 설정점의 최악의 경우인 pH 10.8 +/- 0.05에서 수행하였다(즉, 이 pH 범위의 하한 값은 바이러스를 더 적게 불활성화시키는 것으로 추정된다). 높은 pH 처리에서 온도 사양은 ≥20 내지 ≤25℃였고, 그럼에도 불구하고 MLV는 기준일탈(Out Of Specification: OOS)의 경우에 최악의 경우의 시나리오 데이터를 갖기 위하여 16℃±1℃에서 스파이킹하였다. 개발 실행 유래의 PA 용출액을 출발 물질로서 사용하였다. pH는 0.5M NaOH를 사용하여 증가시켰고, 샘플은 VI 동역학을 따르기 위해 표 50에 기재된 여러 유지 시점 동안 높은 pH에서의 항온처리하였다. 반응을 정지시키기 위해, 샘플은 3.7% HCl로 pH 6.0 내지 8.0으로 중화시켰다.
Figure pct00052
BEAT ® 3의 정제 공정의 단계로서 높은 pH를 시험하기 위한 VRV 연구
또한, 바이러스를 불활성화 또는 제거하기 위한 BEAT®3 정제 공정의 여러 단계의 능력은 독립적인 2회반복 실행으로 조사하였다. 이들 중에서 높은 pH 처리 역량은 PA 용출액에 대하여 평가하였다. 실험은 BioReliance에서 수행하였다. log 감소 계수는 중화된 부하 샘플에 대해 계산하고; 여러 항온처리 시점(t), 5, 10, 30 및 60 분 후에 샘플을 추출하고, 후속적으로 중화시켰다.
결과 및 결론
a. PA 용출액 - 낮은 pH 바이러스 불활성화
시험된 여러 시점에서 HPLC-SE 결과는 표 51에 나타내었고, 도 15 및 도 16 에 예시되었다.
Figure pct00053
HPLC-SE 결과는 시점 t0을 비롯한 낮은 pH에서 처리된 모든 샘플에서 단량체%의 유의적인 감소를 나타내었으며, 이는 낮은 pH 항온처리 및 중화 직후에 생성물의 높은 분해를 나타낸다. 이러한 분해는 응집체 및 "숄더(shoulder)" 종의 증가와 직접적으로 관련이 있다. 사실상, 낮은 pH 처리는 즉시 응집체 백분율에 영향을 미쳐, PA 용출액에 대해 2.4%로부터 시점 t0에서 13.1%로 증가시켰다. 더욱이, "숄더" 종의 증가는 t0에서 6.9%부터 T48h에서 12.0%까지의 범위가 연장시간 동안 관찰되었다. 이러한 "숄더" 종은 단량체의 주 피크 앞에서 나타났다. 도 17에서, 분석용 HPLC-SE 프로파일의 일 예는 "숄더" 종의 중요한 양(12%)을 함유한다.
또한, 여러 단편의 백분율을 식별 및 평가할 수 있게 하는 캘리퍼 비환원 결과는 표 52에 열거하였다. HPLC-SE 결과에서 관찰된 현저하고 중요한 분해에 비추어, 시점 t0 및 t24 시간만을 분석하였다.
Figure pct00054
낮은 pH 항온처리는 생성물이 단편화되어 PA 용출물에서 3.1% 및 tO에서 중화된 VI의 경우 12.4%로 BEAT' % 증가를 초래한다는 것을 보여주었다. 이들 CGE 데이터는 상기 논의된 HPLC-SE에서 관찰된 "숄더 종"이 BEAT' 종과 동등할 수 있다는 HPLC-SE 데이터와 상관성이 있는 것처럼 보인다. 그럼에도 불구하고, 48 시간에서의 시점은 t0보다 낮은 BEAT' %, 약 3.8%를 나타내었다. 이 결과는 놀라운 것이며 일관되지 않았다. 이 데이터는 사용된 분석 방법에 의해 설명될 수 있었다. 사실상, 분석 개발 그룹과 논의 후, 캘리퍼 CGE는 검출 및 정량이 충분히 정확하지 않거나 심지어 CGE와 비슷하지도 않은 선별 방법으로만 간주될 수 있었다. 정보를 위해, tO 및 t24h에 대한 분석 프로파일은 도 18 및 도 19에 제시한다. 이러한 결과에 의해 어떤 결정적인 결론이 내려질 수 있었고 캘리퍼 분석은 VI 단계 개발을 위하여 고전적 CGE로 확실하게 교체하였다.
ICE3 분석에 의한 전하 변이체 결과는 표 53에 제시된다. 캘리퍼 분석에 대해 시점 t0 및 t24 시간만 분석하였다.
Figure pct00055
낮은 pH 처리 후에는 전하 변이체 백분율에 대한 어떠한 변화량도 관찰되지 않았다. 산성 종의 백분율은 약 49 내지 50%, 염기성 종은 약 9%, 주 피크는 약 41%로 유지되었다. 낮은 pH 처리는 항온처리 48 시간까지 BEAT®3 분자의 전하 변이체에 어떤 영향도 미치지 않았다.
결론적으로, 낮은 pH VI 전략은 HPLC-SE 데이터에서 관찰되는 높은 생성물 분해의 견지에서 VI 공정에 확실하게 부적합한 대안으로 확인되었다.
b. 청징화된 수확물 - 용매/세제 처리
청징화된 수확물의 S/D 처리는 대표적인 물질을 사용하여 2 회 수행하였다. S/D 처리 다음에는 반응을 정지시키기 위한 PA 단계가 뒤따르고, 생성물 품질은 생성된 PA 용출액에서 직접 확인하였다. 이들은 PA 단계 개발에서 유래되는 S/D로 사전 처리되지 않은 2개의 참조 실행과 비교하였다. 이 2개의 참조 실행은 동일한 출발 물질과 비슷한 부하 인자로 수행하였다. 용출 완충액의 pH만이 상이하여, 참조군은 pH 4.3 및 S/D 실행군은 pH 4.25였다.
표 54는 이들 실행에서 수득된 데이터를 정리한 것이다:
Figure pct00056
S/D로 사전 처리된 실행에 상응하는 실행 1 및 2는 각각 최소 및 최대 부하 인자(즉, 10 및 34 g/L)에서 수행하였다. 이러한 차이는 각각 최소 및 최대 부하 인자에 대해 58% 및 67%를 갖는 단계 회수율에 영향을 미쳤다. 이들 결과는 S/D 없는 참조 실행과 비슷하였다.
품질과 관련하여, HPLC-SE 분석은 94.9% 내지 99.2% 사이에서 변하는 PA 용출액에서의 단량체 %를 나타내었고, 0.8% 내지 4.3% 범위의 응집체 백분율과 관련이 있었다. 단편의 백분율은 모든 실행에서 1% 미만으로 유지되었다. 단량체 및 응집체 백분율의 변화량은 PA 용출액 농도에 직접적으로 관련이 있었다. 사실상, 농도가 높을수록 응집체의 백분율이 더 높았다. 그럼에도 불구하고, 단량체 백분율은 여전히 95% 이상의 값으로 허용될 수 있었다. 또한, 환원 CGE 결과와 관련하여, 실행들 사이에 차이가 관찰되지 않았고(예를 들어, 모든 실행에서 94.4% 내지 95.7% 사이의 총 BEAT %), S/D 사용으로 인한 생성물의 단편화는 나타나지 않았다. 마지막으로, 전하 변이체 프로파일은 37.8% 내지 39.8% 사이의 주 피크 백분율을 나타내었고, 산성 또는 염기성 종의 어떠한 출현도 관찰되지 않았다. S/D 처리 후에 생성물의 분해는 일어나지 않았다.
또한, Tween 80 및 TnBP 농도는 PA 단계 전 및 후에 측정하여 S/D를 제거하는 PA 단계의 역량을 평가하였다. 수확물 중의 Tween 80 농도는 1.1%(w/w)인 반면, PA 용출액에서는 0.001%(w/w)였고, 측정된 TnBP는 수확물에서 0.3%(w/w)였고, PA 용출액에서 1mg/L(약 0.01%(w/w)에 상응함)이었다. 결과적으로, 단백질 A 단계는 S/D를 효율적으로 제거했다.
결론적으로, PA 단계 전의 S/D 처리는 BEAT®3 바이러스 불활성화에 적합한 옵션이었다.
c. PA 용출액 - 고 pH 바이러스 불활성화
소규모 개발
높은 pH 처리에 대해 소규모로 수득된 생성물 품질 데이타는 이 섹션에서 제시한다. HPLC-SE 결과는 표 55에 요약하고, 이어서 비환원 CGE 및 전하 변이체 결과는 각각 표 56 및 표 57에 요약된다.
Figure pct00057
단량체의 백분율은 조건 간에 비슷하였고(예를 들어, T0에서 95.0% 및 T48h에서 94.9%), 항온처리 48 시간까지 높은 pH 처리에 의한 어떠한 응집도 일어나지 않았음을 확인하였다. 그럼에도 불구하고, PA 용출액 샘플과 높은 pH 처리된 샘플 간에는 1% 차이가 있었다. 이는 높은 pH 항온처리의 결과일 수 있는 응집체 %의 약간의 증가로 인한 것이었다. 그러나, 1% 차이는 방법 가변성(method variability)내에 있으며 통계적으로 유의적일 가능성은 없다. 또한, 샘플들은 동일한 방식으로 저장하지 않았으며, 처리되지 않은 PA 용출액은 5±3℃에 저장하였고, 높은 pH 처리된 샘플은 동결시켰고, 이에 따라 동결된 샘플에서 보다 가역적인 응집체를 유도하였다.
비환원 CGE 결과는 표 56에 나타낸다:
Figure pct00058
비환원 CGE에 의해 제시된 BEAT 백분율은 t0과 비교하여 시험된 모든 샘플에서 동일하게 유지되었다(예를 들어, BEAT%는 t0에서 87.1%, T48h에서 87.2%였다). 더욱이, 48h까지 어떠한 단편의 증가도 관찰되지 않았다. 이들 데이터는 도 20에 예시된 비슷한 CGE 프로파일 중첩에 의해 확인되었다.
ICE3 결과에 의한 전하 변이체는 하기 표 57에 나타내었다:
Figure pct00059
ICE3 결과는 T0에서 약 42.8%, 1h에서 42.5%, 2h에서 41.8%의 주 피크 %를 나타내었다. 이들 동일 시점마다 각각 산성 %는 49.2%, 50.2% 및 50.9%였다. 전하 변이체는 2 시간까지 비슷하였다. 항온처리 2 시간 후, 산성 변이체 %는 증가하여 4 시간째에 54.0% 및 48 시간째에 59.6%였다. 그럼에도 불구하고, 방법 가변성은 ≤10%이고, 4 시간 및 6 시간 동안 주 피크 %에서 관찰된 차이는 방법 가변성 내지 값으로서 통계적으로 유의적일 수 없었다(예를 들어, t0에서 42.8% 및 T4h에서 39.1%의 주 피크). 하지만, 관찰된 산성 % 증가는 예상된 경향이지만, 보통 ≥60 내지 ≤90분인 공정 시간(및 그 이상)을 2시간 안전성 마진이 커버한다. 각각의 높은 pH 항온처리 시점마다 중첩시킨 프로파일은 도 21에 도시된다.
결론적으로, 데이터는 생성물 품질에 대한 높은 pH 처리가 2 시간까지는 영향을 나타내지 않았다. 하지만, 24 시간 후에는 산성 종의 7% 증가 및 48 시간 후에는 10% 증가가 관찰되었다. 이는 높은 pH 항온처리가 낮은 pH에 대한 적당한 대안이라는 확신을 제공했다.
상기 S/D 처리 및 높은 pH에 대하여 제시된 데이터에 비추어, 바람직한 옵션으로서 높은 pH 전략을 선택하였다. 사실상, 두 VI 전략에서는 비슷한 생성물 품질 데이터가 수득되었다. 그럼에도 불구하고, 다른 파라미터들이 확장성, 산업화 비용, 안전성 또는 바이러스 청소율로서 고려되어야 할 필요가 있다.
확대 개발
소규모에서 개발된 공정은 파일럿 규모로 확대되었다. 이들 실행은 이전에 결정된 결과를 확인시켜 주었고 더 큰 스케일의 공정 데이터를 생성할 수 있게 해주었다. 두 실행에 대한 공정 파라미터 및 결과는 표 58에 기재된다.
Figure pct00060
두 실행은 파일럿 규모로 PA 단계 후에 실행 1에서 11g/L 및 실행 2에서 22g/L의 부하 계수로 수행하였다. 목표 pH는 pH 11.2였고, 항온처리 시간은 최악의 경우의 시나리오를 모방하기 위해 90 분 이상 수행하였다. 몇몇 투입 작동 범위는 77.9 내지 83.4mL/L 사이의 염기화 비율 및 4.1 내지 5.6mL/L 사이의 중화 비율로 수득하였다. 비교해 보면, 비-대표 소규모 실행 동안, 비율은 상기 범위 내였고, 염기화를 위해 81.5 mL/L엿고, 중화를 위해 4.7 mL/L였다. 또한, 배출 작동 범위는 약 6.0에서 순환하는 pH, 4.0 내지 4.4mS/cm 범위의 전도도, 및 부하 계수와 직접적으로 관련이 있는 1.7 내지 3.3 g/L 사이의 PA 용출액 농도를 보여주었다. 최종적으로, 94%에서의 단계 수율은 낮은/높은 pH 불활성화 단계에서 일반적이다.
생성물 품질 결과와 관련하여, HPLC-SE는 단량체 94.3%로 두 실행 사이에 유사한 결과를 나타내었고, 항온처리 1시간에서 94.8%, 2시간에서 94.6%가 관찰된 소규모 데이터와 비슷하였다. 또한, 실행 1에서 89.9%이고 실행 2에서 87.6%인 BEAT%를 가진 CGE 비환원 데이터는 약 88%의 BEAT%를 나타낸 소규모 데이터와 유사하였다. BEAT%에서 관찰된 약간의 차이는 BEAT" 변화량%과 직접전인 연관이 있었다. 사실상, BEAT"%는 실행 1에서 2.8%이고 실행 2에서 4.1%였다. 이 방법 가변성 ≤10% 및 분석 피크 적분은 이 변화량을 설명해줄 수 있을 것이다. 도 22에 제시된 중첩 프로파일은 어떠한 유의적인 단편화를 나타내지 않는다.
마지막으로, 전하 변이체의 주 피크에서 4%의 차이는 실행 1에서 40%와 실행 2에서 36%에 의해 나타났다. 이 변화량은 실행 1 및 실행 2 사이에 산성 종에 대해 2% 증가 및 염기성 종에 대해서도 같은 증가와 직접적인 관련이 있고, 결국 방법 가변성 내이어서 관련없는 4% 감소를 초래한다. 비교를 위해, 중첩 프로파일은 도 23에 제시된다. 약 42%에서 주 피크를 가진 비슷한 값들이 소규모에서 관찰되었다.
결론적으로, 높은 pH 확대는 소규모 데이터와 비슷한 양호한 생성물 품질 결과를 나타내었다. 세포 기반의 기능성 분석 및 결합 친화도 분석으로서의 다른 분석도 수행하여 추가 데이터를 수집하였다.
결합 친화도 분석
CD3ε1-26-Fc 및 EGFR에 대한 상대적 친화도는 각각 표 59 및 표 60에 나열된다.
Figure pct00061
Figure pct00062
CD3ε 1-26-Fc 표적에 대한 친화도의 차이는 높은 pH에서 처리된 샘플들 간에 관찰되지 않았다. 상대적 해리 상수 평균은 참조군에서 1.0이었고, 높은 pH 항온처리 24 시간 후에 각각 1.07이었다.
EGFR 표적과 관련하여, 항온처리 2 시간 이상 후에는 약간의 증가만이 나타났다. 상대적 해리 상수의 평균은 2 시간 후 1.02였고, 4 시간 후 1.09였으며, 24 시간 후 1.15였다.
결론적으로, EGFR 및 CD3ε 1-26-Fc에 대한 BEAT®3의 친화도의 차이는 보통 ≥60 내지 ≤90 분인 공정 시간을 커버하는 항온처리 2시간까지 높은 pH에서 관찰되지 않았다.
세포 기반 기능 분석
세포 기반 기능 분석 결과는 도 24에 나타내었다. 최대값의 절반의 유효 농도(EC50)는 용량-반응 곡선에 기초하여 결정하였다. 여러 용량-반응 곡선들의 비교는 높은 pH 조건 간에 약간의 변화량을 나타내었다. 사실상, 항온처리 시간이 증가할 때 x 축에서는 오른쪽으로 작은 이동이 관찰된다. 이러한 이동은 EC50 값 증가와 직접적으로 관련이 있는 생성물 효능의 감소를 나타낸다(예를 들어, t0에서 EC50 = 0.0063 및 t24h에서 0.0094).
수득된 EC50 값은 높은 pH 항온처리 시간이 0인 샘플을 참조군으로 하여 각 샘플의 상대적 효능을 결정할 수 있게 하였다. 결과는 표 61에 제시된다.
Figure pct00063
결과는 항온처리 2 시간 후 97%, 4 시간 후 85% 및 24 시간 후 67%의 상대적인 효능을 나타내었다. 방법 가변성이 ≤25%인 경우, 상대적 효능은 항온처리 2 시간까지 안정한 것으로 밝혀졌으며, 그 후에 관찰된 감소는 BEAT®3 활성의 변경을 나타내는 것으로 보인다. 사실상, 예를 들어, 24 시간의 항온처리 후에, BEAT®3의 농도는 동일한 활성 수준을 얻기 위해 참조 샘플(즉, 항온처리 시간이 0인 경우)보다 높아야 한다. 이러한 상대적 효능 백분율의 감소는 응답자 세포의 활성화 감소 및 결과적으로 발광 반응의 감소를 수반하는 분자의 잠재적 산화와 관련이 있을 수 있다. 이러한 가설은, 산성 종의 초과시간 동안 관찰된, 전술한 ICE 결과와 상관관계가 있는 것으로 보였다. 사실상, 산화는 음으로 하전된 전자의 손실을 수반할 수 있으며, 결과적으로 양으로 하전된 산성 종의 증가를 간접적으로 수반할 수 있다.
결론적으로, BEAT®3 활성의 감소는 높은 pH 항온처리 시간이 증가할 때 발견되는 것으로 보인다. 그럼에도 불구하고, BEAT®3 활성은 보통 ≥60 내지 ≤90분인 공정 시간을 커버하는 항온처리 2 시간까지 변경되지 않았다.
잔류 DNA 및 HCP 분석
파일럿 규모로 높은 pH 샘플에 대해 수행된 잔류 DNA 분석은 표 62에 제시된다.
Figure pct00064
잔류 DNA 농도는 단백질 mg당 DNA 피코그램으로 표현되었고, 각 샘플의 단백질 농도가 무엇이든지 간에 모든 샘플을 그들 간에 비교할 수 있게 하였다. 높은 pH에서 처리 후, DNA 농도는 159 pg/mg(부하물 = PA 용출액 중의 182 pg/mg에 대하여) 및 여과 후 30 pg/mg이었다. 높은 pH 항온처리 동안, 아마도 DNA 및 숙주 세포 단백질(HCP)을 포함하는 불순물 침전으로 인해 침전이 관찰되었다. 결과적으로, 높은 pH 단계는 침전에 의해 DNA를 제거하고, 침전물은 그 다음 0.2㎛ 여과에 의해 제거된다. 전체 제거 단계 백분율은 약 84%였다.
HCP 오염물 수준에 대한 높은 pH 단계의 영향을 평가하여고, 결과를 표 63 에 나타내었다.
Figure pct00065
모든 PA 용출액은 VI 단계 전에 0.2㎛에서 여과하였다.
잔류 HCP 농도는 각 샘플의 단백질 농도가 무엇이든지 간에 모든 샘플을 그들 간에 비교하기 위해 단백질 밀리그램 당 HCP 나노그램으로 표현하였다. 제1 샘플은 Octet 기구에 따라 1425 ng/mg 및 ELISA 방법에 따라 2803 ng/mg의 잔류 HCP 농도를 갖는다. Octet 사용을 하는 분석이 고전적인 ELISA 분석에 비해 더 민감한 것으로 공급자는 설명했었기 때문에, 이러한 결과는 예상하지 못했다. 이들 2개의 비처리 샘플은 각 방법에 대한 참조군으로 독립적으로 사용하였다.
Octet 결과와 관련하여, 높은 pH 처리 후, HCP 농도는 처리되지 않은 PA 용출액에 대해 1425 ng/mg인 것에 대해 1154 ng/mg이었다. 여과 후, 농도는 185 ng/mg이었다. 잔류 DNA 분석에서 관찰된 바와 같이, 높은 pH 처리는 아마도 높은 pH 항온처리 동안 침전되는 HCP를 제거할 가능성을 나타내었고, 0.2 ㎛ 여과에 의해 제거되었다. ELISA 분석에서 더 양호한 민감성이 나타났고(즉, 더 높은 농도가 측정됨), 그럼에도 불구하고 HCP 제거 백분율은 양 VI에서 약 80% 제거로 양 방법 사이에 비슷했다.
결론적으로, 높은 pH 처리는 DNA 및 HCP 불순물을 제거하는 흥미로운 잠재성을 나타내었다. 이 단계의 마지막에 수행되는 0.2 ㎛ 여과는 높은 pH 항온처리 동안 침전된 HCP 및 DNA를 물리적으로 제거하는 목적으로 필수적이었다.
VRV NRT 연구
바이러스를 효율적으로 불활성화시키는 능력에 대해 높은 pH 처리를 시험하였다. 비조절 실행을 Bioreliance에서 수행하였고, 바이러스 청소 결과는 표 64에 요약하였다.
Figure pct00066
이종 뮤린 백혈병 바이러스(MLV)에서 수행된 바이러스 청소는 pH 10.8(+/- 0.05)의 높은 pH 처리 60 분 후에 5.65 log10의 감소 계수를 나타내었다. 따라서, 높은 pH 처리는 바이러스 청소 측면에서 매우 효과적인 것으로 나타났다.
또한, BEAT®3 정제 공정의 바이러스 불활성화 단계로서, 높은 pH에서 BEAT®3의 항온처리를 사용하여 바이러스 청소를 시험할 때, 청소는 도 25에서 높은 pH 처리 동역학으로 제시된 바와 같이 효과적인 것으로 초래된다.
바이러스 역가 및 계산된 log 감소 계수는 하기 표 65에 요약된다:
Figure pct00067
2회반복 실행은 둘 다 시간 경과에 따라 유의적이고 신속한 감소(예를 들어, 5, 10, 30 및 60 분 항온처리 후 2.15 log10, 1.81 log10, 1.62 log10 및 1.47 log10)를 가진 불활성화의 유사한 동역학을 나타내었고, 5분 항온처리 후에는 큰 저하가 체계적으로 관찰되었다. 높은 pH 처리에서 수득된 5.77 log10 및 5.65 log10(즉, 각각 실행 1 및 실행 2)의 MLV 감소 계수는 VI가 MLV 바이러스의 불활성화에 효과적이라는 결론을 내리게 하였다(즉, 모든 LRF > 4.00 log10).
요약하면, 항체 BEAT®3에 가장 적절한 처리를 선택하기 위해 여러 VI 전략이 고려되었다. VI 조건에 대한 선택 기준은 첫째 처리 후 분자의 안정성, 둘째 허용가능한 log 감소로 바이러스를 불활성화시키는 방법의 효율 및 마지막으로 GMP 영역 내로 제조 공정의 구현 용이성이었다.
PA 용출액에 대한 낮은 pH 항온처리는 고분자량 종의 증가와 함께 중요한 생성물 분해를 나타내었다. 이 전략은 이 프로젝트에 적합하지 않은 것으로 간주되었다.
대량 수확물에 대한 용매/세제(S/D) 처리 및 PA 용출액에 대한 높은 pH는 모두 단지 이화학적 특성에 관한 제품 품질의 측면에서 유사한 결과를 나타내어 적합한 것으로 밝혀졌다. 또한, 그리고 새로운 처리로 간주된, 높은 pH VI는 생성물 활성 또는 바이러스 청소에 기초하는 다른 분석에 적합한 것으로 성공적으로 확인되었다.
결론적으로, 이 보고서에 논의된 모든 파라미터를 고려하여, 높은 pH 처리가 BEAT®3 프로젝트에 가장 적합한 VI 전략으로서 선택되었고, PA 및 CEX 단계 사이의 공정에서 실행되었다. S/D 처리는 백업 옵션으로서 간주되었다.
또한, BEAT®3 정제 공정의 바이러스 불활성화 단계로서 높은 pH에서 BEAT®3 의 항온처리 시에 바이러스 제거를 시험할 때, 제거는 도 25에서 높은 pH 처리 동역학으로 나타낸 바와 같이 효과적인 것으로 결론지어진다.
바이러스 역가 및 계산된 log 감소 계수는 표 66에 요약된다.
Figure pct00068
2회반복 실행은 둘 다 시간 경과에 따라 유의적이고 신속한 감소(예를 들어, 5, 10, 30 및 60 분 항온처리 후 2.15 log10, 1.81 log10, 1.62 log10 및 1.47 log10)를 가진 불활성화의 유사한 동역학을 나타내었고, 5분 항온처리 후에는 큰 저하가 체계적으로 관찰되었다. 높은 pH 처리에서 수득된 5.77 log10 및 5.65 log10(즉, 각각 실행 1 및 실행 2)의 MLV 감소 계수는 VI가 MLV 바이러스의 불활성화에 효과적이라는 결론을 내리게 하였다(즉, 모든 LRF > 4.00 log10).
실시예 8: 높은 pH는 낮은 pH-취약성 항체를 제외한 항체의 정제 공정에서도 낮은 pH 처리에 대한 유효한 대안이다
비-pH-취약성 항체의 정제 공정에서 낮은 pH 항온처리의 대안으로서 높은 pH의 사용 가능성을 시험하기 위해, 인간화된 IgGl(여기서는 Abl로 지칭됨)의 안정성 및 활성에 있어서 높은 pH 항온처리의 효과를 조사하였다.
재료, 방법 및 장치
본 연구에서 사용된 출발 물질은 대표적인 PA 용출액이었다.
모든 화학물질은 약전 등급(US 또는 EP)이었다. 공정내 0.2 ㎛ 여과 단계는 모든 완충액 및 공정 중간물질에 대해 전형적으로 수행하였다. 또한, 자기 교반기, pH 및 전도도 측정기를 사용하였다.
시험한 시점은 RT에서 1 시간, 2 시간 및 4 시간이었고, 이 시점 이후 생성물은 항온처리 24 시간까지 5±3℃에 두었다. 약 100 mL의 PA 용출액은 NaOH 0.5 M 을 사용하여 Nalgene 병에서 자기 교반기를 사용하여 교반하에 pH 11.2로 염기성화시켰다. 이 pH는 생성물 품질에 대한 최악의 경우의 시나리오로서 선택하여, 공정의 목표 pH 11.0을 확인하려 하였다. 높은 pH에서 생성물은 후술하는 바와 같이 즉시 중화시킨 시점 t0을 제외하고는 항온처리되었다. 각 시점에서, 약 10 mL의 고 pH 생성물은 50 mL TPP 튜브로 옮기고, 동결되기 전에 VI 반응을 정지시키기 위해 HCl 3.7%(중화 단계)를 사용하여 pH 5.2 까지 pH를 감소시켜 중화시켰다.
모든 시점에서 생성물 품질은 HPLC-SE, iCE 및 CGE에 의해 분석하였다. 중화도 임의의 VI 처리도 하지 않은 PA 용출액도 분석하였으며, 참조군으로서 사용하였다.
Figure pct00069
상기 기재된 시험 유래의 몇몇 샘플은 표면 플라스몬 공명에 의해 시험하기 위해 선택하였다(표 37). 목적은 높은 pH 처리가 Abl 분자의 이의 표적 OX40R 및 FcgR3a에 대한 결합 친화도에 영향을 미치고, 이에 따라 간접적으로 그의 활성에 영향을 미치는 지를 확인하는 것이었다. 또한, 세포 기반 기능 분석을 수행하여 Abl 분자 활성에 대한 높은 pH의 영향을 직접적으로 확인하였다.
Figure pct00070
결과 및 결론
Abl의 높은 pH 항온처리의 유지 시간 영향은 SE-HPLC로 분석하였고, 그 결과는 도 26, 및 표 69에 제시된다.
Figure pct00071
이 연구는 단량체의 백분율이 조건 간에 비슷하고, 또한 높은 pH 처리에 의해 24 시간까지 응집을 나타내지 않는다는 것을 보여준다. 관찰된 변화는 방법 가변성 내에 포함되고 통계적으로 유의하지 않다. 따라서, 이들 결과에 따르면, Abl은 보통 ≥60 내지 ≤90 분인 공정 시간을 안전 마진으로 커버하는 최대 2 시간까지 안정하다는 것을 보여준다.
높은 pH 처리시 샘플의 순도와 동일성을 추가로 조사하기 위해 유지 시간 영향은 비 환원 CGE, 표 70 및 도 27에 의해 분석되었다. 또한 이들 실험은 중간물질 백분율이 참조 샘플 (PA 용출액)과 비교할 수 있으며 2 시간까지 심각한 단편이 발생하지 않는다. 2 시간 후에 125kDa 단편 백분율의 약간의 증가가 나타나고, IgG 백분율 감소와 상관 관계가 있다.
이 결과를 종합하면 Ab1은, 공정 시간이 보통 ≥60 내지 ≤ 90 분의 안전 한계로 커버되는 최대 2 시간 동안 안정하다.
Figure pct00072
환원 CGE(도 28 및 표 71에서)는 또한 2 시간까지 유의적인 단편 증가는 없는 반면, 2시간 후에는 "미지 단편" 백분율이 약간의 증가가 일어나고 HC% 감소와 상관관련이 있음을 시사한다.
이 결과들은 Ab1이 보통 ≥60 내지 ≤90 분인 공정 시간을 안전 마진으로 커버하는 최대 2 시간까지 안정하다는 것을 확인시켜 준다.
Figure pct00073
높은 pH에서 유지 시간 영향은 추가로 전하 변이체를 평가하는 iCE에 의해 추가 분석되었다. 표 72 및 도 29에서 결과는 시간 경과에 따른 산성 종의 증가를 나타내고, 그럼에도 불구하고, 방법 가변성이 ≤10%이며, 2 시간까지 관찰된 차이는 방법 가변성 내에 있고, 허용되고 통계적으로 유의하지 않은 것으로 간주될 수 있다. 환언하면, 관찰된 산성 백분율 증가는 예상된 경향이며 2시간 안전 마진은 보통 ≥60 내지 ≤90 분인 공정 시간(및 그 이상)으로 커버한다.
Figure pct00074
세포 기반 기능 분석을 수행하여 분자 활성에 대한 높은 pH에서의 유지 시간 영향을 평가하였다. 그 결과에 따라, 도 30 및 표 73에서는 상대적 효능 값에서 경시적으로 관찰되는 경향은 없었다. tlh 및 t2h에서 높은 pH 처리는 참조군으로 사용된 PA 용출액과 비교하여 높은 유사한 효능을 제공한다. 방법 가변성이 ≤25%인 것으로 감안하면, 높은 pH 처리는 보통 ≥60 내지 ≤90 분인 공정 시간을 커버하는 최대 2 시간 항온처리까지 Ab1 활성을 유의적으로 변경시키지 않는다.
Figure pct00075
Ab1 활성에 대한 높은 pH 항온처리의 영향을 평가하기 위해, 결합 친화도 분석(Biacore에서)을 수행하였다(표 74).
Figure pct00076
인간 OX40에 대한 결합 활성에 있어서 기능적 유의성의 차이는 단백질 A 용출액과 높은 pH에서의 항온처리된 모든 샘플 사이에서 관찰되지 않는다. 작은 차이는 주입된 약간 상이한 농도로 기인한 것일 수 있다.
인간 FcγR3a에 대한 결합 활성에서 기능적 유의성의 차이는 단백질 A 용출액과 높은 pH에서의 항온처리된 모든 샘플 사이에서 관찰되지 않는다. 작은 차이는 주입된 약간 상이한 농도로 기인한 것일 수 있다.
이들 결과를 종합해 보면, PA 용출액의 높은 pH 처리는 낮은 pH-취약성 항체를 제외한 항체의 정제 공정에서도 낮은 pH 처리에 대한 유효한 대안이라는 것을 보여준다.
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Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 165 170 175 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 2 <211> 470 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain sequence (h9G7 1133 BTA LALA FTO (dA)) <400> 2 Met Arg Ser Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Ile Pro 1 5 10 15 Gly Thr Asn Ala Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val 20 25 30 Lys Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Leu Ser 35 40 45 Leu Ser Thr Ser Gly Lys Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly 50 55 60 Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg 65 70 75 80 Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser 85 90 95 Lys Asn Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr 100 105 110 Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Glu Leu Gly Arg Ser Tyr Val Met 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 145 150 155 160 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 210 215 220 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 225 230 235 240 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 275 280 285 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp 290 295 300 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 305 310 315 320 Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 325 330 335 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 340 345 350 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg 355 360 365 Glu Pro Ala Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 370 375 380 Asn Gln Val Lys Leu Val Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 385 390 395 400 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Tyr 405 410 415 Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Ser Leu Val Ser 420 425 430 Trp Leu Asn Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser 435 440 445 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser 450 455 460 Leu Ser Leu Ser Pro Gly 465 470 <210> 3 <211> 501 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv-Fc sequence: hSP34_H3K21_W100eY/T29E-W91F-L95T (hSP34v.3) scFv_11_BTB_D401Q_LALA <400> 3 Met Arg Ser Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Ile Pro 1 5 10 15 Gly Thr Asn Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly 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Thr Val Ser 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 145 150 155 160 Glu Ile Val Val Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 165 170 175 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Glu 180 185 190 Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg 195 200 205 Gly Leu Ile Gly Gly Ala Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg 210 215 220 Phe Ser Gly Ser Leu Ser Gly Asp Glu Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser 225 230 235 240 Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Leu Phe Tyr Ser 245 250 255 Asn Thr Trp Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly 260 265 270 Gly Gly Thr Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 275 280 285 Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val 290 295 300 Ser Ser Gly Asp Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys 305 310 315 320 Gly Leu Glu Trp Ile Gly His Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr 325 330 335 Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys 340 345 350 Thr Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala 355 360 365 Ile Tyr Tyr Cys Val Arg Asp Arg Val Thr Gly Ala Phe Asp Ile Trp 370 375 380 Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 385 390 395 400 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 405 410 415 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 420 425 430 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 435 440 445 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 450 455 460 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 465 470 475 480 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 485 490 495 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 500 505 510 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 515 520 525 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 530 535 540 His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 545 550 555 560 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 565 570 575 Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 580 585 590 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 595 600 605 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Ala 610 615 620 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 625 630 635 640 Lys Leu Val Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 645 650 655 Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Tyr Thr Thr Pro 660 665 670 Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Ser Leu Val Ser Trp Leu Asn 675 680 685 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val 690 695 700 Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 705 710 715 720 Ser Pro Gly <210> 5 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SF3_Lc <400> 5 Met Arg Ser Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Ile Pro 1 5 10 15 Gly Thr Asn Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln His Phe Asp 100 105 110 His Leu Pro Leu Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 165 170 175 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 6 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Glu Ser Asp Gly Ser Phe Ala Leu Ser Ser 195 200 205 Arg Leu Arg Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 210 215 220 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 225 230 235 240 Leu Ser Leu Ser Pro Gly 245 <210> 7 <211> 469 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG1 heavy chain sequence <400> 7 Met Glu Ser Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Gly Val His Ala Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu 20 25 30 Val Lys Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe 35 40 45 Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro 50 55 60 Gly Lys Ala Leu Glu Trp Ile Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys 65 70 75 80 Tyr Tyr Asn Thr Ala Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr 85 90 95 Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp 100 105 110 Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Asp Trp Asp Gly Phe Ala Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 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Claims (22)

  1. 바이러스 불활성화된 항체 용액을 제조하는 방법으로서, (i) 세포 배양이 수행된 항체의 암호화(coding) 서열을 포함하는 형질감염된 세포에 의해 생성된 항체 물질을 수확하는 단계, (ii) 상기 수확된 항체 물질에 대해, 용매와 세제의 혼합물로의 항온처리 또는 높은 pH에서의 항온처리로 이루어진 군으로부터 선택되는, 바이러스 불활성화 처리 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 수확된 항체 물질이 인간을 제외한 포유동물 세포에서 생성되는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 수확된 항체 물질이 모노클로날 항체를 포함하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 재조합 항체인, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 재조합 항체가 다중특이성(multispecific)인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용매가 TnBP이고, 상기 세제가 Triton X-100, 폴리소르베이트 80 및 폴리소르베이트 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 TnBP의 농도는 약 0.1%(w/w) 이상, 약 1%(w/w) 이하이고, 특히 상기 TnBP의 농도는 약 0.1%(w/w), 약 0.3%(w/w), 약 0.5%(w/w) 및 약 1%(w/w)를 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 폴리소르베이트 80 또는 상기 폴리소르베이트 20의 농도가 약 0.1%(w/w) 이상, 약 2%(w/w) 이하이고, 특히 상기 폴리소르베이트 80 또는 상기 폴리소르베이트 20의 농도가 약 0.2%, 약 0.5%(w/w), 약 0.75%(w/w), 약 1%(w/w), 약 1.25%(w/w)를 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용매와 세제의 혼합물이 0.3%(w/w) TnBP와 0.5%(w/w) 폴리소르베이트 80의 혼합물 및 0.3%(w/w) TnBP와 1%(w/w) 폴리소르베이트 80의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수확된 항체 물질이 0.3%(w/w) TnBP와 1%(w/w) 폴리소르베이트 80의 혼합물로의 5분 이상 항온처리되는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 수확된 항체 물질이 먼저 단백질 A 크로마토그래피로 처리되고, 상기 생성된 단백질 A 용출액이 실온에서 10분 이상 동안 0.3%(w/w) TnBP와 1%(w/w) 폴리소르베이트 80의 혼합물로 항온처리되는, 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 수확된 항체 물질이 청징화된 수확물(clarified harvest)이고, 실온에서 교반하에 약 60분 동안 0.3%(w/w) TnBP와 1%(w/w) 폴리소르베이트 80의 혼합물로 항온처리되는, 방법.
  13. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 높은 pH는 9 이상 및 12.5 이하인, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 높은 pH는 적어도 10.5인, 방법
  15. 제14항에 있어서, 상기 높은 pH는 약 11인, 방법.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수확된 항체 물질이 먼저 단백질 A 크로마토그래피로 처리되고, 상기 생성된 A 용출액이 상기 높은 pH에서의 항온처리되는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 단백질 A 용출액이 Tris, 히스티딘, L-아르기닌, 인산염 및 NaOH의 군으로부터 선택된 완충액에 의해 상기 높은 pH 목표로 적정되고 항온처리되는, 방법.
  18. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 A 용출액이 실온에서 약 60분 동안 NaOH 0.5M에 의해 목표 pH 11로 적정되는, 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, (iii) 제1항에 기재된 상기 바이러스 불활성화된 항체 용액의 일부를 바이러스 불활성화 분석으로 시험하는 추가 단계를 포함하는, 방법.
  20. 대량 원료 약물(bulk drug substance)을 생산하는 방법으로서, 다음 단계를 포함하는 방법:
    (a) 제12항에서와 같이 용매 세제 처리에 의한 상기 수확한 항체 물질의 바이러스 불활성화 단계;
    (b) 상기 생성된 바이러스 불활성화된 용액의 단백질 A 크로마토그래피 단계;
    (c) 상기 단백질 A 용출액을 pH 6.0으로 중화한 후, 0.2 ㎛ 여과하는 단계;
    (d) 상기 중화된 단백질 A 용출액을 양이온 교환 크로마토그래피한 후, 0.2 ㎛ 여과하는 단계;
    (e) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 용출액을 한외여과 및 연속 정용여과(diafiltration)하여 농축한 후, 0.2 ㎛ 여과하는 단계;
    (f) 막 흡착을 사용하여 관통(flow through) 방식의 음이온 교환 크로마토그래피로 생성물을 정제한 후, 0.2 ㎛ 여과하는 단계;
    (g) 바이러스 나노여과하는 단계;
    (h) 상기 생성물을 예비조제(preformulation) 완충액 내로 한외여과 및 연속 정용여과하여 농축한 후, 0.2 ㎛ 여과하는 단계,
    (i) pH 5.9에서 5mM 구연산염, 15% 수크로오스, 0.06% 폴리소르베이트 80를 혼합한 후, 0.2 ㎛ 여과하여 최종 조제 완충액에 생성물 6 mg/ml을 목표로 부형제를 첨가하는 단계,
    (j) 상기 생성물을 멸균 백에 충진한 후, 동결시키고 -80±20℃에서 보관하는 단계.
  21. 대량 원료 약물을 생산하는 방법으로서, 다음 단계를 포함하는 방법:
    (a) 수확한 항체 물질을 단백질 A 크로마토그래피하는 단계;
    (b) 상기 수확한 PA 용출액을 제18항에서와 같은 높은 pH에서의 항온처리하는 단계;
    (c) 생성된 바이러스 불활성화된 용액을 pH 5.5로 중화한 후, 0.2 ㎛ 여과하는 단계;
    (d) 상기 중화된 바이러스 불활성화된 단백질 A 용출액을 양이온 교환 크로마토그래피한 후, 0.2 ㎛ 여과하는 단계;
    (e) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 용출액을 한외여과 및 연속 정용여과에 의해 농축한 후, 0.2 ㎛ 여과하는 단계;
    (f) 막 흡착을 사용하여 관통 방식의 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 생성물을 정제한 후, 0.2 ㎛ 여과하는 단계;
    (g) 바이러스 나노여과하는 단계;
    (h) 상기 생성물을 예비조제 완충액 내로 한외여과 및 연속 정용여과하여 농축한 후, 0.2 ㎛ 여과하는 단계,
    (i) pH 6.0에서 5mM L-히스티딘, 150mM L-아르기닌 일염산염, 15% 수크로오스, 0.06% 폴리소르베이트 80을 혼합한 후, 0.2 ㎛ 여과하여 최종 조제 완충액에 상기 생성물 6 mg/ml을 목표로 부형제를 첨가하는 단계,
    (j) 상기 생성물을 멸균 백에 충진한 후, 동결시키고 -80±20℃에서 보관하는 단계.
  22. 세포 수확물로부터 불순물을 제거하는 방법으로서, 상기 세포 수확물을 높은 pH로 처리하는 단계 및 그 후 여과 단계를 포함하는, 방법.
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