CN115716871A - 灭活病毒污染物的方法 - Google Patents

Abstract

描述了本发明涉及一种用于从培养的细胞开始制备不含病毒污染物的含抗体溶液的方法。该方法包括使含抗体溶液经受溶剂和洗涤剂的混合物或经受高pH的步骤。

Description

灭活病毒污染物的方法

相关申请的交叉引用

本申请是于2018年8月27日提交的申请号为201880054111.7的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及病毒灭活的方法。特别地，本发明涉及含有治疗性抗体的无病毒溶液的生产。本发明还涉及用于生产原料药物质的方法，该方法包括纯化治疗性抗体和病毒灭活处理的步骤。

背景技术

当将蛋白类的生物分子用作治疗疾病的药物时，其生产过程被设计为确保人类健康。通常用于生产治疗性蛋白的细胞培养物和其它生物材料可能会被病毒污染，这些病毒可能存在于原料中，也可能在生产过程期间被引入。如果不除去或不可逆转地灭活，病毒污染物代表使用该药物的个体健康的风险。因此，为了制造可安全用于人类的药物，要求了生产的蛋白质不含活性病毒污染物(CPMP/ICH/295/95)。

为了产生治疗性蛋白，进行纯化过程以将其与其余的起始混合生物材料分离。纯化步骤(例如色谱和过滤)有助于除去病毒，并与特定病毒灭活技术组合以确保病毒清除。病毒灭活的方法是本领域众所周知的。一种用于确保血浆产品中病毒灭活的方法由用溶剂/洗涤剂(S/D)混合物处理所述等离子产品组成，该产品通过溶解病毒脂质包膜而损害病毒活性，如由世界卫生组织(WHO)技术报告附件4指南所建立。已经对该处理进行优化以允许在一次性袋子系统中对血浆产品进行S/D处理(Hsieh,YT等人Transfusion.2016Jun；56(6):1384-93)；与WHO技术报告附件4指南(WO2012082931)指出的方法相比，在较低温度和较短时间条件下处理重组VIII因子。另外，在非商业领域中，研究规模的S/D处理已被用作含有来自人类杂交瘤细胞系的样品的抗-D抗体的额外病毒清除步骤(Roberts PL,Biotechnol Prog.2014Nov-Dec；30(6):1341-7)。还可以通过用低pH处理(Shukla AA atal.,Pharm.Bioprocess.,2015,3(2):127-138)或导致病毒蛋白变性的高温(巴氏灭菌)(US4749783)来实现灭活。这些处理针对包膜和非包膜病毒均有效，但它们可能与所有治疗性蛋白均不兼容，因为它们也可能容易变性。

一类重要的治疗性蛋白是单克隆抗体，该抗体可以具有天然结构，例如由动物体产生的一种抗体，以及已经工程化以多种方式增强其特性的抗体。抗体可用作治疗和诊断多种疾病的药物，包括不同类型的癌症和免疫系统障碍。通常使用转染的细胞系商业生产单克隆抗体，该细胞系包含抗体的编码序列，它们在受控的细胞培养条件下大规模生长，并然后被收获。收获后，将抗体纯化，且在纯化过程中病毒灭活的标准程序包括在低pH下温育样品(WO2010048192；Liu HF等人MAbs.2010 Sep-Oct；2(5):480-99)。

抗体可能易受非生理条件(例如低pH)的影响，并且当设计成具有增强的效应子功能或优先形成异二聚体而不是同二聚体时，它们可能更容易降解。随着基于抗体的疗法继续扩大以及这些产品的复杂性也在扩大，需要开发新型病毒灭活策略。

另外，治疗性蛋白(例如抗体)的纯化过程可能与通常用于病毒灭活的低pH不兼容，因此，提供可用的替代病毒灭活方法将有助于纯化过程的开发和改进。

本发明涉及用于商业生产抗体的病毒灭活的新型方法，对于这些方法，现有的病毒灭活方法不起作用或导致抗体产品的降解或导致某些其它不希望的结果或与抗体纯化过程不兼容。

发明内容

本发明涉及在治疗性蛋白(例如抗体)的纯化过程中采用的病毒灭活的新方法。抗体纯化过程中所用的经典方法是在低pH下温育含抗体的溶液。然而，纯化过程的优化可能导致与低pH不兼容步骤的开发。另外，已经观察到对于低pH可靠的抗体，该方法不合适，因为它损害了抗体的稳定性。本发明提出的病毒灭活的新型方法允许克服这些问题。

特别地，本发明涉及一种用于在抗体纯化过程期间制备无病毒污染的抗体溶液的方法，其中，所述无病毒抗体溶液的制备从表达抗体的转染细胞的培养开始，并且包括以下步骤：(i)收获由转染的细胞产生的抗体材料，和(ii)通过溶剂洗涤剂或高pH处理抗体收获材料。

更具体地讲，本发明涉及一种制备病毒灭活的抗体溶液的方法，其包括以下步骤：(i)收获由转染的细胞产生的抗体材料，所述转染的细胞包含已经过细胞培养的所述抗体的编码序列，(ii)对所述收获的抗体材料进行病毒灭活处理，所述处理选自由与溶剂和洗涤剂的混合物温育或在高pH下温育组成的组。

在一个实施方式中，本发明的收获的抗体材料是在非人类哺乳动物细胞中产生的。

在另一个实施方式中，本发明的收获的抗体材料包含单克隆抗体。在一个更具体的实施方式中，该单克隆抗体是重组抗体。在一个特定方面，所述重组抗体是多特异性的。

在本发明的一个实施方式中，将收获的抗体材料与溶剂和洗涤剂的混合物温育，其中所述溶剂是TnBP，并且其中所述洗涤剂选自由Triton X-100、聚山梨酯80和聚山梨酯20组成的组。

在一个更具体的实施方式中，所述TnBP的浓度等于或大于约0.1％(w/w)，并且等于或小于约1％(w/w)，特别地，所述TnBP的浓度选自包含以下的组：约0.1％(w/w)、约0.3％(w/w)、约0.5％(w/w)和约1％(w/w)。

在另一个具体实施方式中，所述聚山梨酯80或所述聚山梨酯20的浓度等于或大于约0.1％(w/w)，并且等于或小于约2％(w/w)，特别地，所述聚山梨酯80或所述聚山梨酯20的浓度选自包含以下的组：约0.2％、约0.5％(w/w)、约0.75％(w/w)、约1％(w/w)、约1.25％(w/w)。

在一个更具体的实施方式中，所述溶剂和洗涤剂的混合物选自由0.3％(w/w)TnBP和0.5％(w/w)聚山梨酯80的混合物、以及0.3％(w/w)TnBP和1％(w/w)聚山梨酯80的混合物组成的组。

更具体地，将所述收获的抗体材料与0.3％(w/w)TnBP和1％(w/w)聚山梨酯80的混合物温育至少5分钟。

在一个具体实施方式中，首先将所述收获的抗体材料进行蛋白A色谱，并且其中将所得的蛋白A洗脱液与0.3％(w/w)TnBP和1％(w/w)聚山梨酯80的混合物在室温下温育至少10分钟。

在另一个具体实施方式中，所述收获的抗体材料是澄清收获物，并且与0.3％(w/w)TnBP和1％(w/w)聚山梨酯80的混合物在室温在搅拌下温育约60分钟。

在本发明的一个实施方式中，将收获的抗体材料在高pH下温育，其中高pH为等于或高于9且等于或低于12.5的pH。更具体地，所述高pH为至少10.5。甚至更具体地，所述高pH为约11。

在一个具体实施方式中，首先将根据本发明的收获的抗体材料进行蛋白A色谱，并将所得的A洗脱液在所述高pH下温育。

在本发明的一方面，将所述蛋白A洗脱液用选自由Tris、组氨酸L-精氨酸、磷酸盐和NaOH组成的组的缓冲液滴定至目标高pH并温育。

在本发明的一个更特定方面，所述蛋白A洗脱液在室温下用0.5M的NaOH滴定约60分钟至目标pH 11。

在一个实施方式中，本发明的方法包括用病毒灭活测定测试一部分病毒灭活的抗体溶液的另一步骤(iii)。

本发明还涉及一种生产原料药物质的方法，该方法包括以下步骤：

(a)如权利要求13所述的通过溶剂洗涤剂处理对收获的抗体材料进行病毒灭活；

(b)将所得的病毒灭活溶液进行蛋白A色谱；

(c)将蛋白A洗脱液中和至pH 6.0，然后进行0.2μm过滤；

(d)将中和的蛋白A洗脱液进行阳离子交换色谱，然后进行0.2μm过滤；

(e)通过超滤和连续渗滤将阳离子交换色谱洗脱液浓缩，然后进行0.2μm过滤；

(f)通过阴离子交换色谱使用膜吸附在流通模型下将产品纯化，然后进行0.2μm过滤；

(g)病毒纳滤；

(h)通过超滤和连续渗滤将产品浓缩至预配制缓冲液中，然后进行0.2μm过滤；

(i)通过与pH 5.9的5mM柠檬酸盐、15％蔗糖、0.06％聚山梨酯80混合，以添加赋形剂至最终制剂缓冲液中的产品为目标6mg/mL，然后进行0.2μm过滤；

(j)将产品填充到无菌袋中，然后冷冻并在-80±20℃下保存；

本发明还公开了一种生产原料药物质的方法，该方法包含以下步骤：

(a)将收获的抗体材料进行蛋白A色谱；

(b)如权利要求18所述的在高pH下温育所得PA洗脱液；

(c)将所得病毒灭活溶液中和至pH 5.5，然后进行0.2μm过滤；

(d)将中和的病毒灭活的蛋白A洗脱液进行阳离子交换色谱，然后进行0.2μm过滤；

(e)通过超滤和连续渗滤将阳离子交换色谱洗脱液浓缩，然后进行0.2μm过滤；

(f)通过阴离子交换色谱使用膜吸附在流通模型下将产品纯化，然后进行0.2μm过滤；

(g)病毒纳滤；

(h)通过超滤和连续渗滤将产品浓缩至预配制缓冲液中，然后进行0.2μm过滤；

(i)通过与pH 6.0的5mM L-组氨酸、150mM L-精氨酸一盐酸盐、15％蔗糖、0.06％聚山梨酯80混合，以添加赋形剂至最终制剂缓冲液中的产品为目标6mg/mL，然后进行0.2μm过滤；

(j)将产品填充到无菌袋中，然后冷冻并在-80±20℃下保存。

本发明还公开了一种包含单克隆抗体、缓冲液、表面活性剂和稳定剂的液体药物制剂，其中所述单克隆抗体以等于或大于约0.01mg/mL且等于或小于约100mg/mL的浓度(优选以约6mg/mL的浓度)存在于所述药物制剂中，所述缓冲液是以约5mM的浓度存在于所述药物制剂中的柠檬酸盐，所述表面活性剂是以约0.06％的百分比存在于所述药物制剂中的聚山梨酯，所述稳定剂是以约15％的百分比存在于所述药物制剂中的蔗糖，并且其中所述药物制剂具有约5.9的pH。

本发明还公开了一种包含单克隆抗体、缓冲液、表面活性剂和稳定剂的液体药物制剂，其中，所述单克隆抗体以等于或大于约0.01mg/mL且等于或小于约100mg/mL的浓度(优选以约6mg/mL的浓度)存在于所述药物制剂中，所述缓冲液是以约5mM的浓度存在于所述药物制剂中的L-组氨酸，所述表面活性剂是以约0.06％的百分比存在于所述药物制剂中的聚山梨酯，所述稳定剂是以约15％的百分比存在于所述药物制剂中的蔗糖和以约120mM的浓度存在于所述药物制剂中的L-精氨酸一盐酸盐，并且其中所述药物制剂具有约6.0的pH。

另外，本发明涉及一种从细胞收获材料中除去杂质的方法，该方法包括用高pH处理所述细胞收获物的步骤，然后进行过滤的步骤。

在本发明中，术语“抗体”和术语“免疫球蛋白”可互换使用。如本文所指的术语“抗体”包括全长抗体和抗体片段。抗体是浆细胞产生的糖蛋白，该浆细胞通过识别和灭活抗原分子在免疫响应中发挥作用。在哺乳动物中，产生五类免疫球蛋白：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。免疫球蛋白以天然形式存在，是由四个多肽链组成的Y形单元的一个或多个副本：两条相同的重(H)链和两条相同的轻(L)链。共价二硫键和非共价相互作用允许链间连接；特别地，该重链相互连接，而每个轻链与重链配对。重链和轻链均包含N末端可变(V)区和C末端恒定(C)区。在在重链中，可变区由一个可变结构域(VH)组成，恒定区由三个或四个恒定结构域(CH1、CH2、CH3和CH4)组成，这取决于抗体类别；而轻链包含可变结构域(VL)和单个恒定结构域(CL)。可变区含有三个高度可变区，称为互补决定区(CDR)。这些形成了抗原结合位点并赋予抗体特异性。CDR位于另外四个保守区之间，称为定义了CDR位置的框架区(FR)。结构域位置的灵活性有助于抗原结合。例如，含三个恒定重结构域的免疫球蛋白在CH1和CH2之间存在间隔区，称为允许移动以与靶标相互作用的“铰链区”。从完整的天然形式的抗体开始，酶促消化可以导致抗体片段的产生。例如，将IgG与内肽酶木瓜蛋白酶温育会导致铰链区中肽键的破坏，并随后产生三个片段：两个抗体结合(Fab)片段和一个可结晶片段(Fc)，每个抗体结合片段都能与抗原结合。胃蛋白酶消化得到一个大片段F(ab′)2，它由通过二硫键连接的两个Fab单元组成，还有许多由Fc区的降解而导致的小片段。取决于它们的性质，抗体和抗体片段可以是单体或多聚体、单价或多价、单特异性或多特异性的。

如本文所用的术语“全长抗体”包括其天然完整结构的抗体，其包含至少两对重链和轻链。

如本文所用的术语“抗体片段”包括全长抗体的一个或多个部分。抗体片段的非限制性示例包括：(i)由两个恒定重链片段组成的可结晶片段(Fc)，该恒定重链片段由IgA、IgD和IgG中的CH2和CH3结构域以及IgE和IgM中的CH2、CH3和CH4结构域组成，并通过二硫键和非共价相互作用配对；(ii)由通过二硫键连接的VL、CL和VH、CH1组成的抗原结合片段(Fab)；(iii)由通过二硫键连接的VL、CL和VH、CH1以及来自铰链区的一个或多个半胱氨酸残基组成的Fab'；(iv)其中半胱氨酸残基含有游离巯基的Fab’片段的Fab’-SH；(v)由两个通过二硫键在铰链区连接的Fab片段组成的F(ab')2；(vi)由通过非共价相互作用配对在一起的VL和VH链组成的可变片段(Fv)；(vii)由通过连接子配对在一起的VL和VH链组成的单链可变片段(scFv)；(ix)双特异性单链Fv二聚体，(x)scFv-Fc片段；(xi)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(xii)由VH结构域或VL结构域组成的单结构域抗体dAb；(xiii)由两个scFv片段组成的双抗体，其中VH和VL结构域通过短肽连接，该短肽防止它们在同一链中配对并允许两个scFv的非共价二聚化；(xiv)10个三价三抗体，其中具有通过短肽连接的VH和VL结构域的三个scFv形成三聚体。(xv)包含单重链和单可变链的半IgG(half-IgG)。

如本文所用的术语“同源二聚抗体”或“同源二聚片段”或“同源二聚体”包括免疫球蛋白分子或包含至少第一多肽和第二多肽的部分，例如第一结构域和第二结构域，其中第二多肽与第一多肽的氨基酸序列相同。优选地，同源二聚体免疫球蛋白包含两条多肽链，其中第一条链与第二条链具有至少一个相同的结构域，并且其中两条链组装，即通过它们的相同结构域相互作用。具体地，同源二聚体免疫球蛋白包含至少两个相同的结构域，并且其中两个结构域组装，即通过它们的蛋白-蛋白界面相互作用。优选地，同源二聚体免疫球蛋白片段包含至少两个结构域，其中第一结构域与第二结构域相同，并且其中两个结构域组装，即通过它们的蛋白-蛋白界面相互作用。

如本文所用的术语“异源二聚抗体”或“异源二聚片段”或“异源二聚体”包括免疫球蛋白分子或包含至少第一多肽和第二多肽的部分，例如第一结构域和第二结构域，其中第二多肽与第一多肽的氨基酸序列不同。优选地，异源二聚体免疫球蛋白包含两条多肽链，其中第一条链与第二条链具有至少一个不同的结构域，并且其中两条链组装，即通过它们的不同结构域相互作用。具体地，异源二聚体免疫球蛋白包含至少两个结构域，其中第一结构域与第二结构域不同，并且其中两个结构域组装，即通过它们的蛋白-蛋白界面相互作用。更优选地，异源二聚体免疫球蛋白对至少两个不同的配体、抗原或结合位点具有结合特异性，即是双特异性的。

如本文所用的术语“价”是指抗体中结合位点的数量。具有多于一价的抗体被称为多价抗体；多价抗体的非限制性示例是：以两个结合位点为特征的二价抗体、以三个结合位点为特征的三价抗体和以四个结合位点为特征的四价抗体。

如本文所用的术语“单特异性抗体”是指具有一个或多个结合位点的任何抗体或片段，所有均结合相同的表位。

如本文所用的术语“多特异性抗体”是指具有多于一个结合位点的任何抗体或片段，所述结合位点可以结合相同抗原或不同抗原的不同表位。多特异性抗体的非限制性示例是双特异性抗体。

术语“双特异性抗体”是指具有两个结合位点的任何抗体，所述结合位点可以结合相同抗原或两个不同抗原的两个不同表位。

如本文所用的术语“抗原”是指抗体可以特异性结合的任何分子。抗原的示例包括多肽、蛋白质、多糖和脂质分子。在抗原中可以存在一个或多个表位。如本文所用的术语“表位”或“抗原决定簇”是指与抗体直接化学相互作用的抗原部分。

如本文所用的术语“单克隆抗体”是指由全部源自相同单细胞的克隆细胞产生并特异性结合靶标抗原的相同表位的抗体。当产生治疗性抗体时，单克隆抗体的产生优于多克隆抗体。实际上，虽然单克隆抗体是由源自单个克隆的细胞产生的并结合所有相同的表位，但多克隆抗体是由不同免疫细胞产生的并识别某种抗原的多个表位。单克隆抗体可确保批次之间的均匀性、降低的交叉反应性以及对靶标的高度特异性。可以使用重组DNA在例如宿主细胞中表达单克隆抗体，从而产生重组抗体。

如本文所用的术语“重组抗体”是指已经通过涉及使用重组DNA的任何方法产生的抗体。可以以改善例如免疫原性、结合亲和力、分子大小、特异性、半衰期和形式的特征的方式将重组抗体工程化。重组抗体的示例包括但不限于工程化抗体，嵌合抗体，CDR移植抗体(例如人源化抗体)，完全人类抗体，抗体片段，Fc工程化抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体)，单体抗体和多聚体抗体(例如同源二聚体抗体和异源二聚体抗体)。

如本文所用的术语“嵌合抗体”是指其中可变区源自一个种类的抗体，并且其与源自另一个种类的恒定区融合。嵌合抗体的非限制性示例是其中鼠可变区与人类恒定区融合的抗体。

如本文所用的术语“CDR移植抗体”是指其中源自一个种类的CDR被移植到另一种类的框架区中的抗体。CDR移植抗体的非限制性示例是人源化抗体，其中来自哺乳动种类(例如小鼠)的CDR被移植到人类框架区中。

术语“细胞转染”是指将外来遗传物质引入到真核细胞中。当由人工引入的核酸编码的蛋白在细胞中表达时，它为遗传修饰的细胞提供了与相应的野生型形式不同的特性。引入的核酸可以是DNA或RNA。通常用于将外源核酸引入到宿主细胞中的技术的示例包括基于化学的方法，其中通过转染试剂(例如磷酸钙、脂质体、阳离子聚合物或树状聚合物)；基于物理的方法(例如电穿孔和显微注射)；以及基于病毒的方法(其中，病毒感染介导基因递送)来介导转染。使用这些技术，可以实现瞬时转染或稳定转染。在瞬时转染中，核酸序列未整合到宿主细胞的基因组中，因此由外源遗传物质编码的蛋白的表达受到时间限制，而当细胞将外源遗传物质整合到其基因组中时，可实现稳定转染，从而产生稳定转染的细胞系。

术语“宿主细胞”是指其中表达了由转染的核酸材料编码的蛋白的所有细胞，包括其中直接引入外源核酸的那些细胞及其后代。适合于抗体表达的细胞系包括但不限于细菌、哺乳动物、昆虫、植物和酵母细胞。通常用于表达和产生治疗性抗体的细胞系是哺乳动物细胞系，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO小鼠骨髓瘤细胞、人类宫颈癌(HeLa)细胞和人类胚肾(HEK)细胞。在有助于其生长和抗体表达的条件下培养宿主细胞。通过控制和调节几个参数可以获得最佳的培养条件，这些参数包括：细胞培养基的配方、生物反应器操作参数、营养供应方式和培养时间段。必须优化培养基的配方以使其具有最佳的细胞活力和繁殖力。细胞培养基成分的示例包括但不限于必需氨基酸、盐、葡萄糖、生长因子和抗生素。重要的生物反应器操作参数为：温度、pH、搅拌速度、氧合和二氧化碳水平。可以以不同的方式提供营养：分批培养模型中，所有必需营养都存在于初始基础培养基中，并被使用直至耗尽，同时废物累积；分批补料培养中，提供了额外的补料培养基以防止营养消耗并延长培养；不同的是，在灌注方式中，在培养的细胞中连续补充含有营养的新鲜培养基，该培养基在生物反应器中流动，从而除去细胞废物。培养时间段是重要的，因为它需要足够长的时间以使细胞产生一致量的产品，但不能太长而损害细胞活力。

术语“收获的抗体材料”是指通过细胞培养获得的含有由宿主细胞表达的抗体的材料。可以通过首先收获宿主细胞培养物，然后使收获物经过澄清过程来产生收获的抗体材料，该澄清过程允许通过离心和/或过滤步骤除去细胞碎片。

术语“病毒清除”是指有效除去和/或灭活可能污染目标物质的病毒的任何处理。在用于治疗性抗体的纯化过程中时，病毒清除是指导致病毒灭活或从含有抗体的材料中除去病毒的任何方法。

术语“病毒灭活”是指使病毒无法感染生物样品或无法复制的任何处理。可以通过不同技术实现病毒灭活，例如将生物样品与溶剂和洗涤剂(S/D)温育，这通过溶解病毒包膜而导致病毒灭活；在低或高pH条件下温育，这导致病毒蛋白变性；巴氏灭菌处理，其中通过高温实现病毒蛋白变性。

术语“温育”是指将材料保持在某些条件下的操作，该条件包含材料经历修饰的条件。在病毒灭活的过程中，将材料与具有导致病毒灭活的化学特性的溶液温育，导致产生不含活性病毒污染物的材料。

术语“溶剂洗涤剂处理”是指将收获的抗体材料与溶剂(例如有机溶剂)或与有机溶剂和洗涤剂温育。

术语“高pH处理”是指将收获的抗体材料与pH大于7的缓冲液温育。

术语“病毒除去”是指允许从处理的样品中物理分离病毒颗粒的任何处理。在治疗性蛋白的纯化过程中，病毒除去是通过过滤步骤完成的。另外，纯化过程的其它阶段，例如色谱步骤，有助于除去病毒颗粒。

术语“过滤”是指将固体与流体分离的操作。

术语“色谱”是指基于其与色谱柱的固定相相互作用的能力来分离混合物中的化合物的操作，从中可以保留或洗脱所述化合物。

如本文所用的术语“病毒灭活测定”和“病毒除去验证(VRV)”是可互换的，并且是指用于测试有效病毒减少的程序。为了进行病毒灭活测定，在用已知量的原种病毒加标之前和之后并通过将输出的病毒滴度与相应的负荷病毒滴度进行比较来测量样品中病毒的存在。然后可以根据以下公式确定log₁₀减少因子(RF)：RF＝log₁₀{输入病毒滴度X输入体积/输出病毒滴度X输出体积。可以将病毒的灭活/除去描述为：当RF大于4log₁₀时为“有效”；当RF包括在2log₁₀和4log₁₀之间时为“中等有效的”；RF包括在1log10和2log10之间为“有助于减少病毒”；当RF小于1log₁₀时为“无效”。

在本发明中，起始抗体收获材料包含单克隆抗体。优选地，单克隆抗体是重组的。在本发明具体实施方式中，单克隆重组抗体是异源二聚体双特异性抗体。

在本发明中，异源二聚体双特异性抗体可通过

技术(WO2012131555)产生。在本发明的一个实施方式中，称为

1的双特异性抗体可结合由T细胞表达的分化3簇(CD3)和通常在乳腺癌中过表达的人类表皮生长因子受体2(HER2)。在另一个实施方式中，单克隆双特异性抗体称为

2(SEQ ID No：1、2和3)，其可结合在多发性骨髓瘤细胞中过表达的CD3和分化簇38(CD38)。在另一个实施方式中，单克隆双特异性抗体是

3(SEQ ID NO：4、5和6)，其与CD3和EGFR结合，而CD3和EGFR已知是不同类型癌症(包括结直肠癌)的靶标。在另一个实施方式中，单克隆抗体称为Ab1(SEQ ID NO：7和8)，是靶向OX40受体的IgG1，参与自身免疫和炎性疾障碍。

细胞转染后，本发明的抗体在宿主细胞中表达。本发明采用的细胞转染方法包括但不限于利用转染试剂的基于化学的方法。适合于本发明的转染试剂包括但不限于磷酸钙、脂质体、阳离子聚合物和树状聚合物。在本发明的一个实施方式中，细胞转染是通过阳离子聚合物进行的。阳离子聚合物的非限制性示例是二乙基乙醇胺和聚乙烯亚胺。在本发明的一个具体实施方式中，阳离子聚合物是聚乙烯亚胺。

根据本发明的一个特定方面，用于抗体生产的宿主细胞系包括但不限于真核细胞系。在本发明的一个实施方式中，该宿主细胞系是哺乳动物细胞系。在一个更具体实施方式中，该哺乳动物细胞系是非人类细胞系。在本发明的一个甚至更具体的实施方式中，该哺乳动物细胞系是CHO细胞系，特别是CHO-S细胞系。

本发明的宿主细胞可以在有无动物衍生组分(ADCF)培养基的250L工作体积的一次性生物反应器中培养，其中溶解的O₂保持在40％空气饱和度并且温度保持在37℃。培养物可以是分批补料培养，其中在接种后第3天开始补料。将每日大剂量的补料添加到生物反应器中。补料开始后11天或当细胞活力达到80％或85％时收获培养物。

在本发明中，可以从收获的抗体材料开始制备病毒灭活的抗体溶液。特别地，收获的抗体材料是澄清宿主细胞培养物的大量收获物的产品。在本发明的一个具体实施方式中，通过过滤步骤澄清大量收获物来制备收获的抗体材料，该过滤步骤包括“死角”深度过滤，然后通过0.2μm过滤器进行无菌过滤。

可以将收获的抗体材料加载到色谱柱上。在本发明某些实施方式中，将收获的抗体材料加载到蛋白A(PA)色谱中。加载到蛋白A色谱上的收获的抗体材料也称为“PA加载”。收集的溶液称为“PA洗脱液”。在本发明中，首先用磷酸盐缓冲盐水(PBS)将蛋白A色谱的树脂平衡至pH 7.4。在本发明某些实施方式中，然后洗涤柱(例如通过Tris和/或乙酸盐)，并使用洗脱缓冲液(例如甘氨酸或乙酸盐)从柱上洗脱抗体。在本发明的一个方面，将蛋白A洗脱液中和至等于或大于约5且等于或小于7的pH；更具体地，中和至等于或大于5.5且等于或小于6.5的pH。

在本发明优选实施方式中，通过溶剂洗涤剂处理进行病毒灭活。可用于本文所公开的方法的有机溶剂包括磷酸二烷基酯，例如磷酸三正丁酯(TnBP)。有机溶剂的浓度可以等于或大于约0.1％(w/w)且等于或小于约1％(w/w)。特别地，有机溶剂的浓度选自由以下组成的组：约0.1％(w/w)、约0.2％(w/w)、约0.3％(w/w)、约0.4％(w/w)、约0.5％(w/w)、约0.6％(w/w)、约0.7％(w/w)、约0.8％(w/w)、约0.9％(w/w)或约1％(w/w)。更特别地，有机溶剂的浓度为至少约0.1％(w/w)、至少约0.3％(w/w)、至少约0.5％(w/w)或至少约1％(w/w)。在某些优选实施方式中，有机溶剂的浓度等于或大于约0.2％(w/w)且等于或小于约0.4％(w/w)。特别地，有机溶剂的浓度为约0.2％(w/w)、或约0.3％(w/w)、或约0.4％(w/w)。更优选地，有机溶剂的浓度为约0.3％(w/w)。本发明还包括有机溶剂的浓度为以0.1％(w/w)、0.2％(w/w)、0.3％(w/w)、0.4％(w/w)、0.5％(w/w)、0.6％(w/w)、0.7％(w/w)、0.8％(w/w)、0.9％(w/w)或1％(w/w)的间隔在上述浓度之间的值。

可用于本文所公开的方法的洗涤剂包括非离子型表面活性剂，例如聚氧乙二醇脱水山梨醇烷基酯(包括聚山梨酯，例如聚山梨酯20(例如

)、聚山梨酯40(例如

)、聚山梨酯60(例如

)和聚山梨酯80(例如Tween

))；和聚氧乙烯辛基苯基醚(例如

X-100)。本文所用的术语“聚山梨酯”和“Tween(吐温)”是可互换的。洗涤剂的浓度等于或大于约0.1％(w/w)且等于或小于约2％(w/w)；特别地，洗涤剂的浓度等于或大于0.2％(w/w)且等于或小于1.5％(w/w)。在本发明的一个更具体实施方式中，洗涤剂的浓度等于或大于0.75％(w/w)且等于或小于1.25％(w/w)。更具体地，洗涤剂的浓度选自由以下组成的组：约0.1％(w/w)、约0.2％(w/w)、约0.3％(w/w)、约0.4％(w/w)、约0.5％(w/w)、约0.6％(w/w)、约0.7％(w/w)、约0.8％(w/w)、约0.9％(w/w)、约1％(w/w)、约1.2％(w/w)、约1.5％(w/w)、约1.7％(w/w)或约2％(w/w)。更特别地，有机溶剂的浓度为至少约0.2％(w/w)、至少约0.5％(w/w)、至少约0.75％(w/w)、至少约1％(w/w)或至少约1.25％(w/w)。在某些优选实施方式中，洗涤剂的浓度为约0.75％(w/w)、或约1％(w/w)、或约1.25％(w/w)。在一个更优选实施方式中，洗涤剂的浓度为约1％(w/w)。本发明还包括有机溶剂的浓度为以0.05％(w/w)、0.1％(w/w)、0.2％(w/w)、0.3％(w/w)、0.4％(w/w)、0.5％(w/w)、0.6％(w/w)、0.7％(w/w)、0.8％(w/w)、0.9％(w/w)或1％(w/w)的间隔在上述浓度之间的值。

在本发明的一方面，将含抗体的材料与溶剂、或洗涤剂、或溶剂和洗涤剂的混合物温育等于或大于约5分钟且等于或小于约120分钟的时间。具体地，温育时间选自包含以下的组：约5分钟、约10分钟、约20分钟、约30分钟、约60分钟、约90分钟和约120分钟。更具体地，所述温育时间为至少约5分钟、至少约10分钟、至少约20分钟、至少约30分钟、至少约60分钟、至少约90分钟和至少约120分钟。甚至更具体地，温育时间等于或大于30分钟且等于或小于90分钟，优选地，温育时间为60分钟。本发明还包括溶剂和洗涤剂的温育时间为以1、2、5、10、15、30、60、75或90分钟的间隔在上述温育间隔之间的值。

在本发明的一个实施方式中，用TnBP和TritonX-100处理含抗体的溶液，使得最终浓度为约0.3％(w/w)TnBP和约0.2％(w/w)至约1％(w/w)TritonX-100。在该实施方式的另一方面，用TnBP和聚山梨酯80处理含抗体的溶液，使得最终浓度为约0.3％(w/w)TnBP和约0.2％(w/w)至约1％(w/w)聚山梨酯80。在该实施方式的另一方面，用TnBP和聚山梨酯20处理含抗体的溶液，使得最终浓度为约0.3％(w/w)TnBP和约0.2％(w/w)至约1％(w/w)聚山梨酯20。

在本发明的一方面，含抗体的溶液是PA洗脱液。在一个特定方面，用约0.1％(w/w)TnBP、或约0.3％(w/w)TnBP、或约0.5％(w/w)TnBP、或约1％(w/w)TnBP、或约0.3％(w/w)TnBP和约0.2％(w/w)TritonX-100、或约0.3％(w/w)TnBP和约0.5％(w/w)TritonX-100、或约0.3％(w/w)TnBP和约1％(w/w)TritonX-100、或约0.3％(w/w)TnBP和约0.2％(w/w)聚山梨酯80、或约0.3％(w/w)TnBP和约0.5％(w/w)聚山梨酯80、或约0.3％(w/w)TnBP和约1％(w/w)聚山梨酯80、或约0.3％(w/w)TnBP和约0.2％(w/w)聚山梨酯20、或约0.3％(w/w)TnBP和约0.5％(w/w)聚山梨酯20、或约0.3％(w/w)TnBP和约1％(w/w)聚山梨酯20处理PA洗脱液。在一个更特定方面，用约0.3％(w/w)TnBP和约0.2％(w/w)TritonX-100或约0.5％(w/w)TritonX-100或约0.5％(w/w)聚山梨酯80、或约1％(w/w)聚山梨酯80、或约0.2％(w/w)聚山梨酯20、或约0.5％(w/w)聚山梨酯20、或约1％(w/w)聚山梨酯20的组合处理PA洗脱液。

在本发明的一个更特定方面，含抗体的溶液是PA洗脱液，并且在室温下将PA洗脱液与0.3％(w/w)TnBP和1％(w/w)聚山梨酯80的混合物温育至少10分钟，优选在室温下温育约60分钟。

在本发明的另一方面，含抗体的溶液是PA加载物，并且用约0.3％(w/w)TnBP与约1％(w/w)TritonX-100、或约1％(w/w)聚山梨酯80、或约1％(w/w)聚山梨酯20的组合处理PA加载物。

在本发明的一个特定方面，将PA加载物与溶剂、洗涤剂或溶剂和洗涤剂的混合物温育之前指定的温育时间。另外，将与所述溶剂、或所述洗涤剂或所述溶剂和洗涤剂的混合物温育的所述PA加载物加载到PA色谱柱上，并且加载时间等于或小于约7小时。在某个实施方式中，加载持续时间为约3小时。优选地，温育时间和加载持续时间之和等于或小于7小时。

在本发明的更特定方面，含抗体的溶液是PA加载物，并且将PA加载物与0.3％(w/w)TnBP和1％(w/w)聚山梨酯80的混合物温育至少5分钟，在加载到PA色谱柱之前，优选在室温下温育约60分钟。

在本发明的另一个实施方式中，病毒灭活的方法是高pH处理。可用于本文所公开的方法的缓冲溶液包括碱性溶液，包括但不限于乙酸盐、柠檬酸盐、Tris、组氨酸、L-精氨酸、磷酸盐、NaOH。缓冲溶液的pH可以等于或大于约7.5且等于或小于约14。特别地，缓冲溶液的pH选自以下的组：约7.5、约8、约8.5、约9、约9.5、约10、约10.5、约11、约11.5、约12、约12.5、或约13、或约13.5、或约14。在一个更具体实施方式中，缓冲溶液的pH等于或大于约10且等于或小于约12；更具体地，缓冲溶液的pH等于或大于约10.5且等于或小于约11.5。具体地，缓冲溶液的pH为至少10.5；更具体地，缓冲溶液的pH约为11.5；更优选约为11.2；甚至更优选约为11。本发明还包括pH为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1的间隔以及上述pH之间的值。在该实施方式的一个特定方面，含抗体溶液是PA洗脱液，用250mM磷酸盐、0.1M NaOH和0.5M NaOH处理PA洗脱液。

在本发明的一个实施方式中，将含抗体的材料在高pH下温育等于或大于约1分钟且等于或小于约4小时的温育时间。具体地，温育时间选自包含以下的组：约1分钟、约5分钟、约10分钟、约30分钟、约45分钟、约60分钟、约90分钟、约2小时、约3小时和约4小时。更具体地，所述温育时间为至少约1分钟、至少约5分钟、至少约10分钟、至少约30分钟、至少约45分钟、至少约60分钟、至少约90分钟、至少约2小时、至少约3小时和至少约4小时。甚至更具体地，温育时间等于或大于30分钟且等于或小于90分钟，优选地，温育时间为60分钟。本发明还包括高pH的温育时间为以1、5、10、15、30、60、75、90或120分钟的间隔在上述温育间隔之间的值。

在蛋白A色谱和病毒灭活处理之后，或在病毒灭活处理和蛋白A色谱之后，可以通过其它色谱和过滤步骤进一步处理含抗体的溶液来进一步纯化和浓缩抗体，以产生含治疗性抗体的原料药物质。在本发明的一个方面，公开了生产原料药物质的方法。生产原料药物质的方法可以包括以下步骤：(a)通过溶剂洗涤剂处理使病毒失活，(b)蛋白A色谱纯化，(c)阳离子交换色谱(CEX)，(d)超滤/渗滤(UF/DF)，(e)阴离子交换膜吸收剂，(f)病毒纳滤，(g)UF/DF，(h)赋形剂添加和浓度调节；或以下后续步骤：(a')蛋白A色谱纯化，(b')通过溶剂洗涤剂处理使病毒失活，(c')CEX，(d')UF/DF，(e')阴离子交换膜吸收剂，(f')病毒纳滤，(g')UF/DF，(h')赋形剂添加和浓度调节；或以下后续步骤：(a”)蛋白A色谱纯化，(b”)高pH处理，(c”)CEX，(d”)UF/DF，(e”)阴离子交换膜吸收剂，(f”)病毒纳滤，(g”)UF/DF，(h”)赋形剂添加和浓度调节。

在本发明的一个更特定方面，原料药物质的生产方法由首先在搅拌下通过用0.3％(w/w)TnBP和1％(w/w)聚山梨酯80的溶剂洗涤剂处理对收获的抗体材料进行病毒灭活60分钟组成。然后，对病毒灭活的溶液进行蛋白A色谱，将所得PA洗脱液中和至pH 6.0，并进行0.2μm过滤；接下来将中和的中间PA洗脱液加载到阳离子交换色谱柱上，并使产品通过0.2μm过滤器。然后将抗体浓缩至25mg/mL的目标，并通过超滤/渗滤(UF/DF)系统用50mM组氨酸pH 6.5透析。然后将产品进行0.2μm过滤并在用于流通模型的阴离子交换(AEX)色谱的带正电的NatriFlo一次性膜上纯化。随后将洗脱液进行0.2μm过滤。接下来，通过与一次性混合袋无菌连接的

HF将产品纳滤以便物理除去病毒。进行第二次UF/DF步骤以将缓冲液交换到0.2过滤的预配制缓冲液(5mM柠檬酸盐，pH 6.0)中。然后将所得产品通过0.2um过滤器进行过滤。为使最终制剂缓冲液中的最终浓度达到6mg/mL，将产品与计算量的5mM柠檬酸盐、15％蔗糖、0.06％聚山梨酯80(pH 5.9)混合，并进行0.2μm过滤。然后将所得产品通过0.2um过滤器进行过滤，然后填充到由聚烯烃单层膜组成的无菌袋中，冷冻并在80±20℃下保存。

在本发明的另一个具体实施方式中，原料药物质的生产方法由首先将澄清收获物通过蛋白A色谱，然后在高pH、室温下将PA洗脱液(目标pH＝11)温育60分钟的温育时间组成。接下来，将病毒灭活的溶液中和至pH 5.5，并进行0.2μm过滤。然后将中和的中间PA洗脱液加载到阳离子交换色谱柱上，并使产品通过0.2μm过滤器。然后将抗体浓缩至25mg/mL的目标，并通过超滤/渗滤(UF/DF)系统用50mM组氨酸pH 6.5透析。然后将产品进行0.2μm过滤并在用于流通模型的阴离子交换(AEX)色谱的带正电的NatriFlo一次性膜上纯化。随后将洗脱液进行0.2μm过滤。接下来通过与一次性混合袋无菌连接的

HF将产品纳滤以便物理除去病毒。进行第二次UF/DF步骤以将缓冲液交换到0.2μm过滤的预配制缓冲液(5mM组氨酸、150mM精氨酸一盐酸盐，pH 6.0)中。为使最终制剂缓冲液中的最终浓度达到6mg/mL，将产品与计算量的5mM L-组氨酸、150mM L-精氨酸一盐酸盐、15％蔗糖、0.06％聚山梨酯80(pH 6.0)混合。然后将所得产品通过0.2μm过滤器进行过滤，然后填充到由聚烯烃单层膜组成的无菌袋中，冷冻并在80±20℃下保存。

在本发明的某些实施方式中，公开了包含单克隆抗体、缓冲液、表面活性剂和稳定剂的液体药物制剂。

如本文所用，“液体”制剂是已经以液体形式制备的制剂。这种制剂可能适合直接施用于受试者，或者可以可替代地将其包装成液体形式、冷冻状态或干燥形式(例如冻干)保存以后来重构成液体形式或适合于施用于受试者的其它形式。

如本文所用的术语“缓冲液”是指通过其酸碱共轭成分的作用而抵抗pH变化的缓冲溶液。本发明的缓冲液具有在约5.0至约7.0范围内的pH；优选为6.0±0.5。可以将pH控制在该范围内的缓冲液的示例包括乙酸盐(例如乙酸钠)、琥珀酸盐(例如琥珀酸钠)、葡萄糖酸盐、组氨酸(例如L-组氨酸)、柠檬酸盐、磷酸盐和其它有机酸缓冲液。

典型表面活性剂的示例包括：非离子表面活性剂(HLB 6至18)，例如脱水山梨糖醇脂肪酸酯(例如脱水山梨糖醇单辛酸酯、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、脱水山梨糖醇单棕榈酸酯)，甘油脂肪酸酯(例如甘油单辛酸酯、单肉豆蔻酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯)，聚甘油脂肪酸酯(例如十硬脂酸单甘油酯、癸二硬脂酸甘油酯、十甘油单亚油酸酯)，聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯(例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇三油酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇三硬脂酸酯)，聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯(例如聚氧乙烯山梨糖醇四硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇四油酸酯)，聚氧乙烯甘油脂肪酸酯(例如聚氧乙烯单硬脂酸甘油酯)，聚乙二醇脂肪酸酯(例如聚乙二醇二硬脂酸酯)，聚氧乙烯烷基醚(例如聚氧乙烯月桂基醚)，聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚(例如聚氧乙烯聚氧丙二醇醚、聚氧乙烯聚氧丙烯丙醚、聚氧乙烯聚氧丙烯十六烷基醚)，聚氧乙烯烷基苯基醚(例如聚氧乙烯壬基苯基醚)，聚氧乙烯氢化蓖麻油(例如聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油)，聚氧乙烯蜂蜡衍生物(例如聚氧乙烯山梨糖醇蜂蜡)，聚氧乙烯羊毛脂衍生物(例如聚氧乙烯羊毛脂)和聚氧乙烯脂肪酸酰胺(例如聚氧乙烯硬脂酰胺)；阴离子表面活性剂，例如Cio-Cis烷基硫酸盐(例如鲸蜡基硫酸钠、月桂基硫酸钠、油基硫酸钠)，具有平均2-4摩尔环氧乙烷的聚氧乙烯Cio-Cis烷基醚硫酸盐(例如聚氧乙烯月桂基硫酸钠)和Cs-Cis磺基磺酸烷基酯盐(例如月桂基磺基蔗糖酸钠)；天然表面活性剂，例如卵磷脂，甘油磷酸脂，鞘磷脂脂质(例如鞘磷脂)和C12-C18脂肪酸的蔗糖酯。优选地，表面活性剂选自聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯。特别优选地，表面活性剂是聚山梨酯20、21、40、60、65、80、81和85，最优选为聚山梨酯80。

可以将稳定剂添加到制剂中以稳定蛋白。所述稳定剂选自包含以下的组：乙酸钠，碳酸氢钠，碳酸钠，氯化钠，乙酸钾，碳酸氢钾，碳酸钾，氯化钾，蔗糖，多元醇，糖，氨基酸(例如组氨酸、精氨酸、L-精氨酸盐酸盐、L-精氨酸一盐酸盐、甘氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、赖氨酸、谷氨酸)，胺和海藻糖。

在本发明的特定实施方式中，公开了包含单克隆抗体、缓冲液、表面活性剂和稳定剂的液体药物制剂，其中所述单克隆抗体以等于或大于约0.01mg/mL且等于或小于约100mg/mL的浓度(优选以约6mg/mL的浓度)存在于所述药物制剂中，所述缓冲液是以约5mM的浓度存在于所述药物制剂中的柠檬酸盐，所述表面活性剂是以约0.06％的百分比存在于所述药物制剂中的聚山梨酯，所述稳定剂是以约15％的百分比存在于所述药物制剂中的蔗糖，并且其中所述药物制剂具有约5.9的pH。

在本发明的另一个实施方式中，公开了包含单克隆抗体、缓冲液、表面活性剂和稳定剂的液体药物制剂，其中所述单克隆抗体以等于或大于约0.01mg/mL且等于或小于约100mg/mL的浓度(优选以约6mg/mL的浓度)存在于所述药物制剂中，所述缓冲液是以约5mM的浓度存在于所述药物制剂中的L-组氨酸，所述表面活性剂是以约0.06％的百分比存在于所述药物制剂中的聚山梨酯，所述稳定剂是以约15％的百分比存在于所述药物制剂中的蔗糖和以约120mM的浓度存在于所述药物制剂中的L-精氨酸一盐酸盐，并且其中所述药物制剂具有约6.0的pH。

病毒灭活测定对于测试抗体溶液的纯度并确保病毒安全性是必需的。在本发明一个优选实施方式中，用模型病毒加标含抗体的溶液，并在加标之前和之后测定样品中病毒的存在。模型病毒包括但不限于鼠白血病病毒(MLV)、鼠细小病毒(MMV)、伪狂犬病病毒(PRV)。

本发明提出了病毒灭活的方法，其可以用作经典采用的低pH处理的替代方法。当要纯化的治疗性抗体是低pH可靠的和/或低pH与纯化过程不兼容时，这些替代方法特别有利。

附图说明

图1：HPLC-SE测得的运行1低pH病毒灭活的单体百分比。

图2：HPLC-SE测得的运行1低pH的病毒灭活；(A)聚集体和(B)肩部。

图3：低pH处理后降解样品的HPLC-SE图谱。

图4：低pH处理后HPLC-HIC结果的主峰百分比。

图5：低pH处理后HPLC-HIC结果的聚集体+肩部百分比。

图6：低pH+NaCl加标下病毒灭活的HPLC-SE结果。

图7：低pH+NaCl加标下病毒灭活的CGE结果。

图8：辛酸温育的HPLC-SE结果。

图9：辛酸温育的HPLC-HIC结果。

图10：SE-HPLC测得的高pH下保持时间对

2的影响。

图11：NR CGE测得的高pH下保持时间对

2的影响。

图12：减少CGE测得的高pH下保持时间对

2的影响。

图13：ICE测得的高pH下保持时间对

2的影响。

图14：剂量响应曲线和EC50值。

图15：低pH温育后HPLC-SE测得的单体百分比

图16：低pH温育后HPLC-SE测得的肩部种类和聚集体百分比。

图17：低pH温育后降解样品的HPLC-SE图谱。

图18：低pH温育后样品t0的未减少Caliper CGE图谱。

图19：低pH温育后样品T48h的未减少Caliper CGE图谱。

图20：不同高pH温育时间未减少CGE图谱的比较。

图21：不同高pH温育时间ICE图谱的比较。

图22：中试规模VI高pH运行的未减少CGE图谱的比较。

图23：中试规模VI高pH运行的ICE图谱的比较。

图24：根据高pH处理持续时间的剂量响应曲线和EC50。

图25：高pH处理动力学。

图26：SE-HPLC测得的高pH下保持时间对Ab1的影响。

图27：NR CGE测得的高pH下保持时间对Ab1的影响。

图28：减少CGE测得的高pH下保持时间对Ab1的影响。

图29：ICE测得的高pH下保持时间对Ab1的影响。

图30：剂量响应曲线和EC50值。

具体实施方式

实施例1：通常在治疗性蛋白纯化过程中用作病毒灭活步骤的低pH处理会损害低pH可靠抗体的稳定性

通常在治疗性蛋白纯化过程中用于灭活病毒的技术由在低pH下温育含蛋白的溶液组成。在此，研究了低pH处理病毒灭活的能力及其对单克隆异源二聚抗体稳定性的影响。该研究的结果表明，在低pH条件下，病毒灭活是有效的并且通常保持了抗体的稳定性，例如在

1抗体的情况下，其不适用于低pH可靠抗体，例如

2。为了克服这个问题，已经进行了其它研究来测试病毒灭活的替代方法对

2稳定性和活性的影响。本实施例说明了(a)对含

1的蛋白A(PA)色谱洗脱液进行低pH处理的病毒除去验证(VRV)研究；(b)有效的低pH对

2稳定性的影响；当使用替代病毒灭活技术时，进行了(c)

2稳定性和(d)活性的研究。

a.对低pH处理含

1分子的PA洗脱液的VRV研究

首先，作为

1抗体纯化过程的一步，研究了通过在低pH下温育含

1的PA洗脱液来灭活病毒的功效。

材料、方法和设备

用于该VRV研究的模型病毒是鼠白血病病毒(MLV)，其是一种内源病毒的相关模型。该病毒模型的主要特征在表1中给出。

表1：MLV模型病毒的特性

病毒	家族	结构，基因组	尺寸(nm)	理化抗性
					MLV	Retro viridae	包膜的ssRNA	80-110	低

将低pH处理应用于含

1分子的PA洗脱液。表2显示了在

1纯化过程中进行VRV研究期间所用的原料。

表2：中间加载材料

研究	描述	浓度(g/L)
			低pH灭活	PA洗脱液	5.8

对于VRV研究，在低pH处理之前采集测试样品并分析病毒滴度。用已知量的原种病毒加标样品。将输出的病毒滴度与相应的加载病毒滴度进行比较以计算减少因子。这是在“最坏情况”条件下进行的，如表3所示。

表3：“最坏情况”条件

减少病毒的过程步骤	最坏情况	温度
			低pH灭活	16℃，pH设定值+0.2	16±1℃

该步骤在3种不同的pH条件(设定值，+0.2和-0.2)下重复进行，如表4所示。低pH灭活步骤的温度(T)规格为20℃-25℃。然而，运行期间的目标温度为16℃以具有最坏情况的方案数据：

表4：低pH病毒灭活的pH和温度条件总结

pH条件	温度
		3.5±0.1(目标pH 3.5)	16±1℃(目标16℃)
3.7±0.1(目标pH 3.7)	16±1℃(目标16℃)
		3.9±0.1(目标pH 3.9)	16±1℃(目标16℃)

对数减少因子是针对中和加载(L)样品计算的；在不同温育时间(t)点(5、10、30和60分钟)后抽取样品，随后使用0.25M组氨酸(pH 12.0)在pH 6.0-8.0下中和以具有不同低pH处理动力学。然后在即将滴定之前将样品放在冰上。在16℃±1℃下将加载保持(H)样品保持过程持续时间并收集t＝60分钟的样品。除标准滴定外，还对t＝60分钟的样品进行了大容量电镀(large volume plating，LVP)。表5显示了在低pH灭活步骤期间的测定总结：

表5：在加标研究中针对低pH病毒灭活进行的测定总结

病毒	标准滴定	LVP
			MLV	L，H，t＝5分钟，t＝10分钟，t＝30分钟，t＝60分钟	t＝60分钟

结果与结论

如果在加载样品和负载保持样品之间未观察到病毒滴度统计学上的显著差异(注意：小于1log₁₀差异视为不显著)，则这是用于计算减少因子的加载样品或加载2样品，其中已经进行了额外的过滤(仅用于VRF步骤)。不论在哪个步骤中，在加载结果和加载保持结果之间均未观察到病毒滴度显著差异(除了其中进行额外过滤的VRF外)，因此加载结果用于做log₁₀减少因子。

使用PA洗脱液评估了低pH病毒灭活步骤

1在pH 3.5、pH 3.7和pH3.9下的MLV清除效率。表6显示了针对不同的低pH水平所获得的log₁₀值以及每次运行计算的log₁₀减少因子。

表6：低pH灭活的MLV log₁₀病毒减少值(标准测定)

病毒灭活研究表明了：

-pH 3.5下的低pH灭活导致运行1和运行2的减少因子分别为5.94log₁₀和4.71log₁₀，这意味着低pH灭活对于pH 3.5的MLV有效。然而，在表6中显示的结果表明了运行1和运行2之间的差异显著，差异超过1个log₁₀(分别运行1为0.08log₁₀，运行2为1.66log₁₀)，因此重复运行之间的结果是不相当的。然而，在pH 3.5下进行低pH灭活仅是为了提供有关在pH 3.5下MLV灭活行为的数据，因此这些结果未用于总对数减少因子的计算。

-如标准测定(在t＝60分钟的时间点进行LVP)所确定的，在pH 3.7下的低pH灭活导致MLV病毒灭活。从低pH灭活运行中获得了2.19log₁₀和1.75log₁₀的减少因子(分别为运行1和运行2)。表6显示的结果表明了运行1和运行2之间的差异不显著，运行1为4.18log₁₀，运行2为4.27log₁₀，因此，重复运行之间的结果是相当的。

-如标准测定(在t＝60分钟的时间点进行LVP)所确定的，在pH 3.9下的低pH灭活导致MLV病毒灭活。从低pH灭活运行中获得了1.05log₁₀和1.05log₁₀的减少因子(分别为运行1和运行2)。表6显示的结果表明了运行1和运行2之间的差异不显著，运行1和运行2均为5.49log₁₀，因此，重复运行之间的结果是相当的。

根据所获得的结果，在pH 3.5下低pH灭活显示出对MLV病毒的灭活有效，最小减少因子为4.71log₁₀。在pH 3.7下低pH灭活显示出导致MLV病毒的灭活，最小减少因子为1.75log₁₀。在pH 3.9下低pH灭活显示出导致MLV病毒的灭活，最小减少因子为1.05log₁₀。

这些结果表明了在单克隆抗体生产过程中通常用于病毒灭活的低pH处理可以在pH 3.5下有效灭活MLV病毒。

b.对经受低pH的

2的稳定性研究

接下来，对其它抗体的稳定性进行了研究以评估低pH处理的效果。特别地，在低pH下将

2温育。

材料、方法和设备

本研究中所用的原料是使用来自Kaneka的KanCapA树脂通过亲和色谱获得的PA洗脱液。

当活力低于80％时通常会终止细胞培养，并通过死角深度过滤然后在0.2μm过滤器上过滤除去细胞碎片。细胞培养上清液来自CHO细胞。

本研究使用了不同的原料，这些原料分别来自非代表性的大批量收获物(两个克隆，克隆1和克隆2来自小规模生物反应器或波袋培养(wave bag culture))和代表性大批量收获物(选定的克隆1，一次性生物反应器250L)。

通常地，使用TPP 250mL滤芯、Steriflip(Millipore)或Sartopore 2过滤器(Sartorius)进行0.2μm过滤步骤工艺。除非立即进一步加工这些中间体，否则对所有缓冲液和所有中间体均进行0.2μm过滤步骤。在室温下保存缓冲液，工艺中间体通常保存在+5±3℃下。对于病毒灭活研究，仅使用磁力搅拌器和pH计。

用作原料的PA洗脱液来自在

Explorer和

Purifier系统(GEHealthcare)上使用直径为1.1厘米的Vantage L色谱柱(Millipore)进行的蛋白A小规模色谱开发运行。

使用PA-HPLC测定收获滴度。通过HPLC-SE分析PA洗脱液以估计聚集体和片段的百分比。然而，SE-HPLC不足以评价同二聚体杂质的剩余百分比。因此，也可以通过常规未减少CGE分析PA洗脱液样品。对于使用PA洗脱液作为原料的某些运行，使用Nanodrop设备(Nanodrop 2000分光光度计，赛默飞世尔科技(Thermo Scientific))在280nm处测量处理前和处理后的浓度来计算病毒灭活步骤的收率。

2的摩尔消光系数为1.52。将HPLC-HIC和iCE3用于分析一些实验以查看该处理是否对疏水性种类和电荷变体有任何影响。

结果与结论

使用3.7％的HCl将来自克隆1和克隆2细胞培养物中的少量PA洗脱液(约3mL)酸化至pH 3.6、3.7、3.8和3.9。将

2在低pH下于室温(RT)搅拌下温育60至120分钟。为了终止反应，使用250mM组氨酸(pH 12.0)将pH增加至pH 6.0或5.5。重复几次该实验以确认结果。为了观察盐是否对分子具有保护作用，在低pH下温育之前，先用NaCl加标PA洗脱液来进行相同的研究。测试了不同浓度的NaCl：与在pH 3.7下酸化90分钟组合的150mM、500mM和1M。然后通过HPLC-SE、HPLC-HIC和CGE(未减少)分析产品。表7中显示了在低pH温育下测试条件的总结。

表7：低pH温育条件

pH目标	3.6-3.7-3.8-3.9
		温育时间(min)	0-60-90-120
NaCl加标(mM)	0-150-500-1000

不含NaCl的PA洗脱液

仅显示了使用克隆1获得的结果，因为使用克隆2进行的实验给出了类似的结果。对PA洗脱液进行了四次重复的低pH实验，结果对所有实验都是类似和相当的。图1说明了在不同pH下不同时间点通过HPLC-SE测得的单体百分比。如图所示，pH 3.6的最酸性条件导致单体百分比显著下降，在温育60分钟后，该百分比从95％下降至80％。pH 3.7下的处理对

2稳定性也有负影响。仅pH 3.8和3.9的弱酸性条件才对抗体无负影响。图2显示了单体、聚集体和“肩部”种类降解期间其它种类的增加。肩部种类出现在单体的主峰前面。图3中显示了HPLC-SE谱图的示例，其中含有重要量(13％)的“肩部”种类。表8中列出了两次不同的低pH处理运行的CGE(未减少)结果，其中，进行中和至pH 6.0或pH 5.5。

表8：低pH处理后降解的样品的HPLC-SE图谱：

CGE数据表明了pH和温育时间不会影响

2的量，因为在所有条件下片段和其它种类的百分比均类似。与pH 6.0下的中和相比，pH 5.5下的中和更好，因为

2劣于1％。通过HPLC-HIC观察到降解，如图4和图5所示，随着聚集体种类的增加，随着时间的推移，在更高酸性pH下主峰百分比降低了。这些结果表明了

2仅在pH 3.9的条件下稳定。但是，以前在

1上进行的实验表明了该pH酸性不足以具有有效的病毒灭活作用。

含NaCl的PA洗脱液

将盐用于提高蛋白的稳定性，在低pH处理之前，用不同浓度的NaCl进行一项实验以查看低pH处理下

2的稳定性是否得到改善。测试了从0.15M到1M NaCl的不同浓度，然后在pH 3.7酸化90分钟，未减少HPLC-SE和CGE分别显示在图6和图7中。结果表明了即使当用氯化钠加标时，

2在低pH下也不稳定。通过HPLC-HIC(未列出)观察到降解，在所有盐条件下温育90分钟后，主峰从82％下降至60％。在图7中，通过CGE未观察到任何差异。

这些实验的结果表明了低pH处理不是

2抗体纯化过程的合适病毒灭活步骤。

c.在经受替代病毒灭活处理时测试

2的稳定性

考虑到低pH处理会损害

2的稳定性，因此测试了病毒灭活的其它方法，并研究了它们对抗体稳定性的影响。测试的处理包括：PA洗脱液的巴氏灭菌处理、PA洗脱液的辛酸(CA)处理、PA洗脱液的精氨酸处理、PA洗脱液的溶剂和洗涤剂(S/D)处理、澄清收获物的S/D处理和PA洗脱液的高pH处理。

材料、方法和设备

用于以下

2稳定性的材料、方法和设备与“b.对经受低pH的

2的稳定性研究”中所述的相同。另外，将加热块用于巴氏灭菌。

结果与结论

PA洗脱液的巴氏灭菌处理

将通常用于商业过程的病毒灭活的巴氏灭菌以替代为低pH处理进行测试。将来自克隆1和来自克隆2的PA洗脱液用于测试巴氏灭菌对

2抗体稳定性的影响。使用250mM组氨酸(pH 12.0)将PA洗脱液中和至pH 6.0。测试了不同的温育条件，包括使用水浴在室温(RT)和60℃下温育30和60分钟。实验后，通过HPLC-SE、HPLC-HIC和CGE(未减少)分析产品。

在所有条件下均观察到沉淀。在表9中，显示了处理后结果的总结。

表9：巴氏灭菌后的HPLC-SE、HPLC-HIC和CGE

HPLC-SE和HPLC-HIC结果表明了即使在30分钟后，

2在高温下也不稳定，两个分析物的主峰百分比均显著下降(HPLC-SE中从94.6％下降至43.4％，HIC-HPLC中从88.1％下降至13.3％)。

基于这些结果，不选择巴氏灭菌以进行进一步的研究和开发。

PA洗脱液的辛酸处理

辛酸是一种沉淀剂，其可用于病毒灭活以沉淀病毒蛋白。将来自克隆1的PA洗脱液用于测试辛酸对

2抗体稳定性的影响。使用几种浓度的辛酸以达到0.2％、0.5％、0.7％和1％的最终量。将洗脱后(约pH 4.3)或在pH 5.5下中和(使用250mM组氨酸(pH12.0)缓冲液)的PA洗脱液用作原料。应用的温育时间为30、60和90分钟。为了终止反应，使用硅藻土(DE)比例为用于2mL PA洗脱液的0.5g DE。使用0.2μm的steriflip过滤器通过DE纯化产品。处理后，通过HPLC-SE、HPLC-HIC和CGE(未减少)分析产品。表10中给出了辛酸处理测试条件的总结。

表10：辛酸处理条件

辛酸％	0.2-0.5-0.7-1.0
		温育时间(分钟)	0-30-60-90
原料pH	4.3-5.5

由于观察到超过0.2％的辛酸有沉淀，因此未说明在pH 5.5下的结果。图8、图9和表11中报告了pH 4.3的结果。HPLC-SE结果表明了将t＝0与t＝30、t＝60和t＝90分钟相比，随着单体减少(约6％)且聚集体增加，随着时间降解。

表11：辛酸处理：CGE结果

在CGE和HPLC-HIC中未发现重要降解。根据SE-HPLC结果，即使在较低的酸性辛酸浓度(0.2％)下，

2在30分钟后仍不稳定。但是，考虑到辛酸的毒性和需要DE过滤以去除试剂，该替代方法已被放弃，因此并未被选作病毒灭活的替代方法。

PA洗脱液的精氨酸处理

已知使用精氨酸以有效灭活包膜模型病毒。在该研究中，将来自克隆1的PA洗脱液用作原料。将PA洗脱液的pH调节至pH 4.0、pH 4.75、pH 4.79和pH 5.5。添加不同量的精氨酸(在30mM乙酸酯中)以靶向0.38M、0.4M和0.8M精氨酸的最终浓度。在不同的温育时间下进行实验：无温育时间、60或120分钟(参见表12)。为了终止反应，将PD10用于PBS缓冲液中的缓冲液交换。

表12：精氨酸处理条件

pH目标	4.0-4.75-4.79-5.5
		温育时间(min)	0-60-120
精氨酸(M)	0-0.4-0.8

在表13中显示了该实验的结果。

表13：精氨酸处理结果

观察到当与精氨酸温育时，pH 4.0下的PA洗脱液不稳定，实际上，仅在使用0.4M精氨酸温育60分钟后，通过HPLC-SE的单体损失13％(92.7至79.3％)，而当与0.8M精氨酸温育120分钟时损失8％(90.9％至82.5％)。对于高于或等于pH 4.75的条件，即使在pH 5.5下使用0.8M精氨酸长达120分钟时，也未观察到降解。使用高于或等于4.75的pH的精氨酸处理被认为是低pH处理的潜在替代方法。

PA洗脱液的溶剂洗涤剂处理

因为它们具有溶解包膜病毒的包膜脂质的能力，将溶剂和洗涤剂用于病毒灭活。

将来自克隆1的PA洗脱液用作原料。首先(研究1)，以不同浓度测试TnBP处理：0.1％、0.3％、0.5％和1％。接下来(研究2)，测试用TnBP和Tween 80以及其它洗涤剂(如Triton X-100和Tween 20)的组合的处理(制备S/D混合物并在与产品温育前搅拌15分钟)。使用PD10的缓冲液交换并不能有效除去S/D，使用PBS从4g/L稀释至0.3g/L被用来尝试终止反应。在表14中报告了在PA洗脱液上使用S/D测试的14种不同条件的总结。

表14：PA洗脱液的S/D处理条件

研究的第一部分(研究1)的结果报告于表15中。在该实验中，在每个时间点进行一次PD-10缓冲液交换。

表15：PA洗脱液的S/D处理结果，研究1

⁽¹⁾1％TnBP温育120分钟的条件完全沉淀且未进行分析

这些结果表明

2在温育120分钟期间对所有TnBP条件(除1％TnBP外)均稳定，其中观察到沉淀并且未提供分析结果。从通过HPLC-SE的t0以来，在0.3％TnBP+1％Tween 80的条件下注意到降解，但通过CGE和HPLC-HIC未证实。分析HPLC-SE原始数据后，由于在样品处理后残留了Tween 80，聚集体百分比增加了，Tween 80干扰了该方法，实际上Tween 80的保留时间非常接近聚集体保留时间。因此，在0.3％TnBP+1％Tween 80的条件下，未观察到样品的降解。第一个实验不是最佳的，因为用PD-10缓冲液交换并没有终止反应，并且在HPLC-SE分析期间样品中仍然存在Tween 80。接下来，测试了另外两种洗涤剂Tween 20和Triton X-100，在每个时间点将使用PBS缓冲液稀释至0.3g/L应用于每个样品以终止反应(研究2)。表16中说明了HPLC-SE和HPLC-HIC的结果分析。

表16：PA洗脱液的S/D处理结果，研究2

表16显示了：对于使用0.3％TnBP与Triton X-100组合处理的样品，较高浓度的Triton X-100(1％)会出现降解，通过HPLC-SE约有15％的聚集体和8％的片段。在使用0.3％TnBP与Tween 80和Tween 20组合处理的样品中，除使用0.2％Tween 80的条件外，与稀释的PA洗脱液相比，通过HPLC-SE和HPLC-HIC均未发现降解迹象。在所有样品条件下，在t＝0和t＝90分钟之间未观察到差异。

总体而言，这些结果表明了

2在大多数S/D处理条件下(长达120分钟)都是稳定的，因此S/D处理是含

2的溶液的病毒灭活的重要选择。

澄清收获物的S/D处理(PA加载)

基于获自对PA洗脱液S/D处理研究的结果，决定对澄清收获物S/D处理的测试以确保更好地除去溶剂和洗涤剂，因此提高了安全性。

前两个纯化步骤是病毒灭活和PA色谱，而不是PA色谱然后病毒灭活。

表17：澄清收获物S/D处理的条件

对于该步骤，使用TnBP与Tween 20、Tween 80和Triton X-100组合测试了不同的条件。将溶剂和洗涤剂的混合物添加至PA加载液中温育约20分钟，然后加载至KanekaKanCapA树脂柱中。所有结果均报告于表18中。

表18：澄清收获物S/D处理的结果

在所有S/D条件下均获得了类似的性能，经处理的PA洗脱液(运行2、3和4)的结果在收率和所有分析数据上均与运行1(无S/D温育)相当，但它们具有略高的CV洗脱量(从3.5至约5)和较低的浓度值(从7.0g/L至5g/L)。Tween 80的除去非常有效，在PA纯化后仅存在痕量Tween 80。

在PA步骤之前进行的S/D处理证明了具有用于病毒灭活的潜力，因为通过PA纯化可以终止反应，并且纯度不会受到影响。此外，随后的CEX色谱还除去了PA色谱后存在的残留痕量S/D。

由于使用不同洗涤剂所获得的结果类似，因此选择Tween 80进行后续分析，因为它已用于其它工艺步骤。因此，选择0.3％TnBP+1％Tween 80组合的条件进行澄清收获物的S/D处理，并考虑将含

2的溶液进行病毒灭活处理。

PA洗脱液的高pH处理

将来自克隆1的小体积(20mL)PA洗脱液用于测试在高pH温育下

2的稳定性。首先，测试了几种缓冲液以达到目标pH 11.0，0.5M乙酸盐pH 12.0、0.5M柠檬酸盐pH12.0、1M Tris pH 12.0、0.25M组氨酸pH 12.0、0.5M L-精氨酸pH 12.0、0.25M磷酸盐pH12.0、0.1M NaOH以及最后0.5M NaOH，如表19所示。

表19：高pH处理的缓冲液和比例

所有缓冲液(例如乙酸盐和柠檬酸盐0.5M pH 12.0和Tris 1M pH 12.0)均未达到目标pH 11.0。pH调节的比例体积是选择缓冲液的标准之一，目的是使比例最小化以避免大体积用于下一步。

第一次筛选后，选择0.25M磷酸盐pH 12.0、0.1M NaOH和0.5M NaOH进行进一步研究。

用选定的缓冲液在pH 11.2下温育30、45和60分钟，参见表20。对于所有实验，处理后，通过HPLC-SE、HPLC-HIC、CGE(未减少)以及iCE3分析产品。结果显示于表21中。

表20：高pH处理条件

表21：高pH处理结果

在所有实验期间，在约pH 6.0观察到沉淀，在约pH 11.0消失。收率运行约为95％，即使没有对杂质进行分析，也可以认为是杂质的沉淀，其它项目也观察到了相同的现象，可在低pH温育后中和，而不会损失产品。

2在pH 11.2下温育长达60分钟是稳定的。实际上，使用NaOH 0.5M缓冲液，在pH 11.2下60分钟后，通过HPLC-SE的单体百分比稳定，CGE(仅测试了最后一个时间点)、iCE3和HPLC-HIC的结果相同，与原料相比未观察到降解。重复该实验并确认结果。基于这些结果，使用0.5M NaOH缓冲液的pH处理被认为是低pH病毒灭活的潜在替代方法。

d.测试

2的活性

材料、方法和设备

为了研究溶剂/洗涤剂、精氨酸和高pH处理的影响，用0.8M精氨酸在pH 4.0和pH5.5下温育后，以及在高pH处理(NaOH 0.5M，pH 11.2)后，对用溶剂洗涤剂(0.3％TnBP+1％Tween 80)处理的不同样品进行了结合亲和力测定。测试了两个抗原靶标，即CD38和CD3。

结果与结论

所有样品均未观察到显著差异，实际上Kd值是相当的。因此，所有这些处理对抗体活性均无影响。该分析的结果报告于表22中。

表22：结合亲和力测定结果

A.hsCD38

B.hsCD3e 1-26Fc

实施例2：含低pH可靠抗体的PA洗脱液的精氨酸处理仅在会损害抗体稳定性的pH水平下才导致有效的病毒灭活

基于实施例1中报告的稳定性和活性研究，进一步测试了最有希望的病毒灭活方法的灭活病毒能力。通过在Bioreliance进行加标研究来评估病毒灭活的有效性。在每次处理之前和之后获取测试样品，并分析病毒滴度。首先，进行了关于精氨酸治疗的VRV研究。

材料、方法和设备

本研究仅使用一种病毒MLV，其是一种用于源自CHO细胞系的生物产品(例如单克隆抗体)的典型模型病毒。总共进行了7次运行。将来自开发运行的PA洗脱液用作原料。在不同的pH(pH 4.0、pH 4.75、pH 4.79和pH 5.5)下将精氨酸的不同储备缓冲液用于达到目标pH和浓度。使用pH 6.0左右的250mM组氨酸pH 12.0缓冲液中和样品以终止反应。表23总结了在VRV研究期间测试的条件。

表23：精氨酸处理的VRV研究条件

计算了相对于中和加载样品的对数减少值，在t＝60分钟的样品上进行5板大容量电镀以及标准滴定。将中和加载保持样品在16.0℃至20.0℃下保持60分钟(运行2、4和6)或120分钟(运行1、3、5和7)。

结果与结论

精氨酸处理的VRV研究结果显示于表24中。

表24：精氨酸处理的VRV研究结果

由于仅在pH 4.0下的处理才能有效清除病毒，并且显示在该pH条件下

2被降解(实施例1)，因此，从含

2的溶液的病毒灭活处理的潜在选择中放弃了精氨酸处理。

实施例3：S/D处理含低pH可靠抗体的PA洗脱液可导致有效的病毒灭活接下来，测试了溶剂洗涤剂处理含

2的PA洗脱液以灭活病毒的能力。

材料、方法和设备

通过在Bioreliance进行加标研究来评估使用S/D处理PA洗脱液来病毒灭活的有效性。本研究仅使用一种病毒MLV，其是一种用于源自CHO细胞系的生物产品(例如单克隆抗体)的典型模型病毒。目标浓度为0.3％TnBP和1％Tween 80。对PA洗脱液(约pH 4.2)和中和的PA洗脱液(pH 6.0)进行了研究。温度的操作条件为15℃+/-2℃，这是化学灭活的最坏方案(温度越低导致越慢灭活)。根据制造设备的不同，工艺操作条件通常为18至25℃。在时间点0、10、30和60分钟进行动力学。

2的测试条件总结显示于表25中。

表25：PA洗脱液S/D处理的VRV研究条件

表26中的VRV研究结果表明了温育60分钟后，当未中和PA洗脱液时S/D处理PA洗脱液可导致有效的病毒灭活，当中和PA洗脱液时可导致中度灭活，确认了S/D处理PA洗脱液是

2纯化过程的有效VI方法。

表26：PA洗脱液S/D处理的VRV研究结果

实施例4：S/D处理含低pH可靠抗体的澄清收获物可导致有效的病毒灭活

另外，通过溶剂和洗涤剂对含

2的澄清收获物进行了VRV研究。

VRV研究1

材料、方法和设备

本研究仅使用一种病毒MLV，其是一种用于源自CHO细胞系的生物产品(例如单克隆抗体)的典型模型病毒。使用TnBP和Tween 80的混合物进行了总共3次运行。测试了相同百分比的TnBP(0.3％)和不同百分比的Tween 80(0.25％、0.5％和1.0％)。用S/D加标后，将产品搅拌直至温育结束。收集每个时间点后，立即通过稀释1/25并中和至pH 6.00-8.00进行淬灭。表27报告了在VRV研究期间用于S/D处理的BioReliance测试条件：

表27：S/D处理澄清收获物的VRV研究条件

运行	TnBP％	Tween 80％	时间点(min)
				1	0.3	0.25	0、10、30和60
2	0.3	0.5	0、10、30和60
				3	0.3	1.0	0、10、30和60

计算了相对于猝灭的加载样品的对数减少值，在t＝60分钟的样品上进行5板大容量电镀以及标准滴定。将猝灭的加载保持样品在16.0℃至20.0℃下保持60分钟。

结果与结论

在表28中显示了VRV研究结果的总结。

表28：S/D处理澄清收获物的VRV研究结果

即使当使用较低浓度的Tween 80(0.25％)时，在所有测试条件下S/D处理澄清收获物的结果为有效灭活MLV病毒。

VRV研究2

另外，在较差情况条件下评估了溶剂洗涤剂处理澄清收获物灭活MLV和PRV病毒的能力。

材料、方法和设备

用病毒原种加标过程加载样品，并在Bioreliance进行分析。

这是在“最坏情况”条件下进行的，如表29所示。报告了每个重复的最低清除因子。

表29：VRV验证研究的“最坏情况”条件

结果与结论

使用收获批次1和批次2，用0.2％TnBP+0.75％Tween 80和0.4％TnBP+1.25％Tween 80的S/D混合物评估针对

2开发的化学病毒灭活步骤对MLV和PRV灭活的效率。

对于两个病毒实验，都应用了相同的方案，表30中显示了从按比例缩小过程到临床规模过程的比较。

表30：化学灭活按比例缩小模型

表31显示了针对MLV每次运行计算的对数减少因子。

表31：针对MLV的化学病毒灭活的log₁₀病毒减少值(标准测定)

这些结果表明了在S/D处理期间病毒灭活是有效的，在温育5、10、30和60分钟后，总log₁₀病毒随时间减少，分别减少1.31log₁₀、2.44log₁₀、2.88log₁₀和4.03log₁₀。

另外，在S/D运行期间收集了等分试样，将其冷冻并对Tween 80和TnBP百分比含量进行分析，结果显示于下表32中。

表32：针对MLV的化学病毒灭活的Tween 80和TnBP结果

这些结果表明：

低浓度(0.75％Tween 80/0.2％TnBP)的化学灭活显示了运行1和运行2的减少因子分别为4.03log₁₀和3.79log₁₀，这意味着低S/D浓度对MLV的灭活是中等有效的。然而，表31中显示的结果证明了对于Tween 80百分比，运行1和2之间的差异(0.71％和0.52％)显著。运行2仅测得0.52％Tween 80和0.15％TnBP，但这是最坏的情况，因为它们的浓度很低。可以得出结论，没有达到0.75％Tween 80和0.2％TnBP的目标。对于使用较低浓度的Tween80和TnBP(0.52％Tween 80和0.15％TnBP)(试验2)进行的运行的减少量较小，这被认为是最差的情况。

高浓度(1.25％Tween 80/0.4％TnBP)的化学灭活显示了运行3和运行4的减少因子分别为≥5.37log₁₀和≥5.02log₁₀，这意味着如预期的高S/D浓度对MLV的灭活更有效。表31中显示的结果证明了对于Tween 80百分比，运行3和4之间的差异(0.91和0.89)无显著不同。但是，同样两次运行均未达到1.25％Tween 80的目标，实际上运行3和运行4分别测得仅为0.91％和0.89％。关于TnBP数据，以0.48％而不是0.40％进行运行(运行3t60min)。同样，病毒灭活的结果是非常合乎逻辑的，具有较高Tween 80和TnBP％的运行3允许获得最佳的病毒灭活。综上所述，即使在最坏的情况方案下MLV病毒也会灭活(运行2，0.52％Tween 80和0.15％TnBP)，获得了3.79log₁₀的中等效力减少。

表33显示了测得的PRV Tween 80和TnBP百分比以及针对不同化学病毒灭活样品获得的log₁₀值以及针对每次运行计算的对数减少因子：

表33：针对PRV的化学病毒灭活的log₁₀病毒减少值(标准测定)

在温育期间病毒灭活是有效的，总log₁₀病毒随时间减少，经5次处理后直接减少3.68log₁₀，温育60分钟后减少5.49log₁₀。在S/D运行期间收集了等分试样，将其冷冻并对Tween 80和TnBP百分比含量进行分析，结果显示于下表34中。

表34：针对PRV的化学病毒灭活的Tween 80和TnBP结果

PRV结果表明：

低浓度(0.75％Tween 80/0.2％TnBP)的化学灭活显示了运行1和运行2的减少因子分别为≥5.46log₁₀和≥5.19log₁₀，这意味着低S/D浓度对PRV的灭活是有效的。然而，表33中显示的结果证明了对于Tween 80百分比结果，运行1和2之间的差异(0.74％和0.57％)显著。运行2未达到0.75％Tween 80的目标，实际上测得仅为0.57％，这是最坏的情况方案，因为洗涤剂浓度低。对于TnBP，两次运行均显示相当的值低于目标值，是0.15％而不是0.20％。如预期的，在Tween 80百分比较低下，与具有≥5.19log₁₀的运行1相比，运行2显示了病毒减少量较低。

高浓度(1.25％Tween 80/0.4％TnBP)下的化学灭活显示了运行3和运行4的减少因子分别为≥5.19log₁₀和≥5.46log₁₀，这意味着，如预期的高S/D浓度对PRV的灭活更有效。表33中显示的结果表明了两次运行的时间点t0和时间点t60分钟之间的Tween 80和TnBP值均存在差异，对于运行3而言有效，t0时Tween 80的含量为0.80％，而t60min时Tween80的含量为1.01％，同样地，t0时TnBP为0.27％且t60min时TnBP为0.33％。同样，两次运行都达到了1.25％Tween 80的目标，但是尽管如此，因为病毒灭活的最坏情况是低浓度的S/D。关于TnBP数据，以0.48％而不是0.40％进行运行(运行3t60min)。同样，病毒减少的结果是非常合乎逻辑的，具有较高Tween 80和TnBP％的运行3显示更好的病毒清除。

使用相同的化学灭活，预期用PRV病毒获得的病毒灭活比MLV更高，实际上，PRV具有较低的物理化学抗性。

总结所有数据，在最坏的情况方案下(运行2)，存在具有5.19log_10.的PRV病毒灭活。

总之，研究1和研究2的结果证明了使用PA加载的S/D处理可以实现VI。

实施例5：在保持抗体稳定性的pH下含低pH可靠抗体的PA洗脱液的高pH处理导致中等有效的病毒灭活

材料、方法和设备

进行高pH处理含

2的PA洗脱液的VRV研究。本研究仅使用一种病毒MLV。在pH 10.8(基于pH 11.0的工艺目标，pH较低的最坏情况条件)下单次运行进行该实验。将来自开发运行的PA洗脱液用于该研究，使用选定的0.5M NaOH缓冲液提高pH。收集后，所有样品均用3.7％HCl中和至pH 6-8。

计算了相对于中和加载样品的对数减少值，在t＝60分钟的样品上进行5板大容量电镀以及标准滴定。将中和加载保持样品在16.0℃至20.0℃下保持60分钟。

结果与结论

在表35中显示了在该研究期间获得的VRV结果。

表35：高pH处理的VRV结果

当减少因子为3.18log₁₀时，在温育1分钟至温育60分钟后，在高pH下温育含

2的PA洗脱液在MLV病毒灭活中是中等有效的。因此，在纯化

2的过程中，高pH处理可被认作低pH处理的有效替代方法。

实施例6：高pH处理PA洗脱液是在低pH可靠抗体

2的纯化过程中有效的灭活步骤

为了进一步研究在

2的制造过程中使用高pH处理作为病毒灭活步骤的可能性，已进行了额外的稳定性和活性研究。已在不同时间点(包括最坏的情况方案，例如温育24小时)评估了保持时间的影响。

材料、方法和设备

本研究中所用的原料是代表性的PA洗脱液。

所有化学品均为药典级(美国或欧洲)。通常对所有缓冲液和加工中间体进行0.2μm过滤步骤工艺。另外，使用磁力搅拌器、pH和电导率仪。

测试的时间点是在室温下分别为1小时、2小时和4小时，超过该时间点后，将产品置于5±3℃下温育长达24小时。在Nalgene瓶中使用0.5M NaOH，使用磁力搅拌器搅拌下将约100mL PA洗脱液碱化至pH 11.2。选择该pH作为产品质量的最坏情况方案以便验证过程的目标pH 11.0。除了在如下所述立即中和时间点t0外，将产品在高pH下温育。在每个时间点，将约10mL的高pH产品转移到50mL TPP管中，并通过使用3.7％的HCl将pH降低至pH 6.0进行中和(中和步骤)以便终止VI反应，然后进行冷冻。

通过HPLC-SE、iCE和CGE在所有时间点分析产品质量。还分析了未中和且未进行任何VI处理的PA洗脱液，并将其用作参考。

表36：高pH测试条件

选择了上述样品中的一些样品以通过表面等离子体共振进行测试(表37)。目的是验证高pH处理是否会影响

2分子与其靶标CD3ε1-26-Fc和CD38的结合亲和力，从而间接影响其活性。另外，还进行了基于细胞的功能测定以直接验证高pH对

2分子活性的影响。

表37：测试样品的结合亲和力和基于细胞的功能测定

结果与结论

通过SE-HPLC已分析了高pH下保持时间对

2的影响，从而确定了在不同时间点温育后样品的纯度，如表38和图10所示。

表38：HPLC-SE结果

如表38所示，各条件之间的单体百分比相当，并且在长达24小时的高pH处理下均未出现显著的聚集现象，实际上观察到的差异落在方法变异性之内。

这些结果表明了

2可以在长达24小时内是稳定的，安全裕度覆盖通常为≥60至≤90分钟的处理时间。

另外，已运行了未减少CGE，进一步确认了

2的稳定性，如表39和图11所示。

表39：未减少CGE结果

BEAT％与参考样品(PA洗脱液)相当，直到4小时才显示出显著的片段。

2可以在长达2小时内是稳定的，安全裕度覆盖通常为≥60至≤90分钟的处理时间。

此外，减少CGE表明了

2可以在长达24小时内是稳定的，安全裕度覆盖通常为≥60至≤90分钟的处理时间(参见表40和图12)。

表40：减少CGE结果

为了评估电荷变量的差异，进行了iCE(图13和表41)。

表41：结果iCE

观察到酸性物质随时间增加。但是，方法变异性≤10％，因此，直到2小时为止观察到的差异都在方法变异性之内，且可以被认为是可接受的，并且在统计上不显著。观察到的酸性百分比增加是一种预期趋势，但是2小时的安全裕度覆盖通常为≥60至≤90分钟的处理时间(及以上)。

基于细胞的功能测定结果显示于图14和表42中。基于剂量响应曲线确定最大有效浓度的一半(EC50)。所获得的EC50值允许确定每个样品的相对效力，将高pH温育时间等于零的样品作为参考。

表42：根据高pH处理持续时间的相对效力。

在相对效力值上未观察到随时间的趋势。与用作参考的PA洗脱液相比，t1h和t2h下高pH处理具有高度类似的效力。考虑到方法变异性≤25％，即使温育2小时(覆盖通常为≥60至≤90分钟处理时间)后，高pH处理也不会显著改变

2的功能性。

表43中列出了在不同时间点评估的

2抗体与其靶标CD3和CD38的结合亲和力。

表43：

2与其靶标的相对亲和力

在高pH下温育的蛋白A洗脱液和所有样品之间未观察到与人类CD38的结合活性的差异。而且，在高pH下温育的蛋白A洗脱液和所有样品之间未观察到与人类CD3ε的结合活性的功能显著性差异。在t0样品和所有其它样品之间观察到与人类CD3ε的亲和力差异很小，但亲和力仍在相同范围内(低纳摩尔，比PA洗脱液高32％)，并且可能是由于注入浓度的微小差异所致。

总之，高pH温育不会影响

2的稳定性和活性，并可用于

2的制造过程。

实施例7：高pH处理PA洗脱液是在低pH可靠抗体

3的纯化过程中有效的灭活步骤

为了评价第三种BEAT抗体最合适的病毒灭活方法，已进行稳定性、活性和VRV研究以研究低pH和高pH处理PA洗脱液以及澄清收获物的溶剂/洗涤剂处理的效果。

材料、方法和设备

本研究中所用的原料是使用来自Kaneka的KanCapA树脂的亲和色谱后的澄清收获物和PA洗脱液。

当活力低于80％时通常会终止细胞培养，并通过死角深度过滤然后在0.2μm过滤器上过滤除去细胞碎片。细胞培养上清液来自CHO细胞。使用来自最终选定克隆的亲本克隆的非代表性材料进行初步开发测试。使用代表性材料(来自最终选定克隆)进行开发的后续测定。

通常对所有缓冲液和加工中间体进行0.2μm过滤步骤工艺。对于VI研究，仅使用磁力搅拌器、pH和电导率仪。

PA洗脱液-低pH病毒灭活

在50mL TPP管中使用3.7％HCl将约25mL PA洗脱液酸化至pH 3.7。除了在如下所述立即中和时间点t0外，在磁力搅拌器搅拌下将产品在低pH下温育。测试的时间点是在室温下为1小时、2小时、4小时和6小时，超过该时间点后，将产品置于5±3℃下温育长达24和48小时。在每个时间点，将约3mL的低pH产品转移到50mL TPP管中，并通过使用250mM组氨酸(pH 12.0)将pH提高至pH 5.0进行中和(中和步骤)以便终止VI反应，然后进行冷冻。

将高通量HPLC-SE分析用于表征所有时间点。仅在t0和T48小时进行Caliper(Caliper)CGE(未减少)和iCE分析。通过将不同时间点与时间点t0比较(样品在低pH下温育并在pH 5.0下立即中和)来分析结果。还分析了未中和且未进行任何VI处理的PA洗脱液，并用作与t0比较的参考。

表44：低pH测试条件

澄清收获物-溶剂洗涤剂处理

制备0.3％TnBP和1％Tween 80的混合物，并在温育前搅拌15分钟以便确保混合物均匀性。将混合物温育并在PA加载步骤之前在至少60分钟期间使用磁力搅拌器将其与澄清收获物混合以便在以前项目中观察到足够的病毒灭活。立即将处理的材料纯化以便使用直径为1.1cm的Kaneka KanCap A树脂柱终止VI反应。随后通过HPLC-SE、CGE(减少和未减少)和iCE分析保持在5±3℃下的PA洗脱液。

PA洗脱液–高pH病毒灭活

测试的时间点是在室温下为1小时、2小时、4小时和6小时，超过该时间点后，将产品置于5±3℃下温育长达24和48小时。在50mL TPP管中使用0.5MNaOH将约25mL PA洗脱液碱化至pH 11.2。选择该pH作为产品质量的最坏情况方案以便验证过程的靶标pH 11.0。除了在如下所述立即中和时间点t0外，在使用磁力搅拌器搅拌下将产品在高pH下温育。在每个时间点，将约3mL的高pH产品转移到15mL TPP管中，并通过使用3.7％的HCl将pH降低至pH6.0进行中和(中和步骤)以便终止VI反应，然后进行冷冻。

通过HPLC-SE、iCE和CGE在所有时间点分析产品质量。通过将不同时间点与时间点t0比较(样品在高pH下温育并在pH 6.0下立即中和)来分析分析结果。还分析了未中和且未进行任何VI处理的PA洗脱液，并用作与t0比较的参考。

表45：高pH测试条件

结合亲和力测定

选择了一些来自高pH处理开发运行的样品以通过表面等离子体共振进行测试(参见表46)。目的是验证高pH处理是否会影响

3分子与其靶标CD3ε1-26-Fc和EGFR的结合亲和力，从而间接影响其活性。

第一种测定旨在确定与人类CD3ε1-26-Fc抗原的结合亲和力。它是使用Series S传感器芯片CM5(GE Healthcare)进行的。在乙酸盐pH 4.5缓冲液中以25nM的浓度制备人类CD3ε1-26-Fc。从1000nM至1.37nM制备

3样品，每次稀释的最终体积为200μl。使用Biacore T200处理单元(GE Healthcare)进行运行。

第二种测定旨在确定与人类EGFR-his抗原的结合亲和力。它是使用Serie S传感器芯片蛋白G(GE Healthcare)进行的。将

3样品分别在HBS-EP+(GE Healthcare)缓冲液中稀释为25nM。从100nM至0.13nM制备EGFR，实现每次稀释的最终体积为250μl。

表46：样品进行结合亲和力测定

基于细胞的功能测定

基于细胞的功能测定的目的是验证高pH处理是否影响

3分子活性。如表47中所述，测试了从高pH处理开发中选定的样品。

表47：样品进行基于细胞的功能测定

基于细胞的效力测定使用可从Promega商购的工程化Jurkat T细胞系。将这些细胞用报告构建体稳定转染，其中荧光素酶cDNA序列处于NFAT响应元件(RE)的控制下。萤光素酶的产生直接取决于活化NFAT转录因子的信号，例如源自CD3ε(和T细胞受体复合物)的信号。通过将Jurkat-NFAT细胞(响应细胞)(CD3ε+，EGFR-)与SK-BR-3靶标细胞(EGFR+CD3ε-)和

3或对照抗体共温育来设置测定。通过发光响应定量响应细胞的活化。将Jurkat NFAT细胞系培养了6周(P6)，且将SK-BR-3细胞系培养了3周(P3)。

在96孔ELISA板U型底(TPP)中进行该测定。将表达SK-BR-3的EGFR细胞系(ATCC)以3x10⁵细胞/ml重悬，并将100μl分配于96孔板的每个孔中。将测定板在37℃和5％CO_2.下温育过夜。第二天，将25μL表达SK-BR-3的EGFR细胞系保存在测定板中，并将25μL稀释为6μg/mL(最终2μg/mL)的不同

3样品转移到不同孔中。将Jurkat NFAT细胞系(Promega)以1.2x10⁶细胞/ml重悬，并将25μl分配于测定板的每个孔中。覆盖该板并在37℃、5％CO₂下温育5小时。温育结束时，将75μL Bio-GloTM萤光素酶测定底物(Promega)添加至孔中，并且在微孔板分析仪中获取该板。使用以下设置测量发光：读带-终点；积分时间-1分钟；发射-孔；光学位置-顶部；增益135；读取高度-1.00mm。然后使用Prism(GraphPad)软件绘制数据并进行分析。X＝Log(X)转换后应用非线性回归拟合，并将S形剂量响应拟合应用于所有数据集以确定EC₅₀值。使用以下计算方法计算每个样品的相对效力：相对效力％＝EC50参考值/EC50样品x100。

残留DNA和HCP测定

VI步骤的主要目标是在确保产品质量的同时有效地灭活病毒。但是，在下游工艺中，每个步骤都会影响杂质水平。下述测定的目的是评价高pH处理对CHO细胞中残留DNA和HCP水平的影响。

对于HCP定量，使用了两种不同的测定：来自Cygnus Technologies的3GHCP Elisa试剂盒和来自ForteBio-Cygnus的Anti-CHO HCP检测试剂盒，使用来自Pall ForteBio的Octet Red 96仪器进行数据处理。这两种技术首先用于评价通过高pH处理的HCP除去，还用于比较两种技术，已知更灵敏的高通量八位位组(octet)和ELISA。

用3G Elisa HCP试剂盒(Cygnus Technologies)并使用1/100稀释液进行ELISA样品制备。将样品与亲和纯化的辣根过氧化物酶标记的抗体在涂有抗CHO HCP捕获抗体的微量滴定孔中反应。洗涤后，使底物四甲基联苯胺(TMB)反应。水解底物的量与存在的CHO蛋白的浓度成正比。通过将样品信号与同时测定的HCP标准品进行比较来实现定量。使用PRISM软件处理数据。

关于Octet，使用Anti-CHO HCP检测试剂盒(ForteBio-Cygnus)测试了两种样品稀释液(1/200和1/400)。该测量涉及在Anti-CHO HCP生物传感器上进行夹心型测定，该生物传感器已预涂了来自Cygnus Technologies的金标准3GAnti-CHO HCP抗体。用来自PallForteBio的Octet Red 96仪器直接读取准备的96孔板。通过Octet系统数据采集软件处理数据。

关于残留DNA的定量，该测定涉及通过蛋白酶K除去蛋白的样品处理。然后，使用磁珠提取DNA，洗涤并最终洗脱。之后，使用Fast 5000PCR设备(Applied Biosystem)通过实时PCR(聚合酶链反应)定量DNA。用resDNASEQ^TM定量CHO DNA试剂盒V3.0(AppliedBiosystems)进行样品制备。

选择了来自高pH开发的一些样品(列在表48中)以通过上述残留DNA和HCP测定进行测试。对VI后的0.2μm过滤也进行了测试。

表48：样品进行残留DNA和HCP测定

VI步骤之前，还将所有PA洗脱液以0.2μm过滤。

VRV NRT研究

分析了来自VI实验的数据，并且关于获得的产品质量选择了高pH处理用于VRVNRT研究。由BioReliance进行的该病毒清除研究的目的是评估该治疗有效灭活病毒的能力。该研究是对异种鼠白血病病毒(MLV)进行的，该病毒是一种用于源自CHO细胞系的生物产品(例如单克隆抗体)的典型模型病毒。已知MLV对物理化学处理敏感(参见表49)。

表49：MLV物理化学特性

在pH 10.8+/-0.05下进行单次运行，该pH是pH11.0的过程设定值的最坏情况(即pH范围的下限应该可灭活较少的病毒)。高pH处理的温度规格为≥20至≤25℃，但是，MLV会在16℃±1℃下加标，如果超出规格(OOS)，则可具有最坏情况的方案数据。将来自开发运行的PA洗脱液用作原料。使用0.5M NaOH提高pH，并在如表50所述的不同保持点期间将样品在高pH下温育以便遵循VI动力学。为了终止反应，样品用3.7％HCl中和至pH 6.0-8.0。

表50：VRV研究期间的样品条件

将测试高pH作为

3纯化过程步骤的VRV研究

进一步地，在独立的重复运行中研究了

3纯化过程不同步骤灭活或除去病毒的能力。其中，评价了PA洗脱液的高pH处理能力。实验在BioReliance进行。对数减少因子是针对中和加载样品计算的；在不同温育时间(t)点(5、10、30和60分钟)后抽取样品，随后中和。

结果与结论

a.PA洗脱液-低pH病毒灭活

在不同测试时间点的HPLC-SEE结果显示于表51中，并说明于图15和图16中。

表51：VI低pH的HPLC-SE结果

HPLC-SE结果表明了在低pH下(包括时间点t0)所有处理样品的单体％均显著降低，表明了在低pH温育和中和后，产品立即高度降解。这种降解与聚集体和“肩部”种类增加直接相关。实际上，低pH处理会立即影响聚集体百分比，从PA洗脱液的2.4％增加到t0时间点的13.1％。此外，观察到的“肩部”种类随时间从t0的6.9％增加到T48h的12.0％。这种“肩部”种类出现在单体的主峰前面。在图17中，HPLC-SE分析谱图的一个示例含有大量(12％)的“肩部”种类。

另外，表52列出了Caliper未减少结果允许鉴定和评价不同片段的百分比。鉴于HPLC-SE结果中观察到的重要降解和关键降解，仅分析了时间点t0和t24小时。

表52：低pHVI的Caliper未减少结果

低pH温育表明了产品的片段化会导致PA洗脱液中的BEAT’％的3.1％增加至t0时中和VI的12.4％。这些CGE数据似乎与上面讨论的HPLC-SE数据相关，其中HPLC-SE中观察到的“肩部”种类可能等同于BEAT’种类。但是，在48小时的时间点表明了BEAT’的百分比低于t0(约3.8％)。这个结果令人惊讶，而且不一致。该数据可以通过采用的分析方法来解释。实际上，在与分析开发小组讨论之后，Caliper CGE只能被认作检测和定量不够准确甚至不能与CGE相当的筛选方法。关于信息，t0和t24h的分析图谱显示于图18和图19中。利用这些结果能够得出任何明确的结论，并且为了追求VI步骤开发，用经典的CGE最终取代了Caliper分析。

通过ICE3分析的电荷变体结果描述于表53中。对于Caliper分析，仅分析了时间点t0和t24小时。

表53：低pHVI的ICE3结果

低pH处理后未观察到电荷变体百分比的差异。酸性种类的百分比保持在约49-50％，碱性种类的百分比保持在约9％，主峰的百分比保持在约41％。低pH处理对

3分子的电荷变体没有影响直到温育48小时。

综上所述，鉴于在HPLC-SE数据中观察到的较高产品降解，低pHVI策略作为VI工艺的合适替代方法最终是无效的。

b.澄清收获物-溶剂洗涤剂处理

使用代表性材料对澄清收获物进行S/D处理两次。S/D处理后进行PA步骤以终止反应，并直接在所得PA洗脱液中验证产品质量。将它们与2个参考运行进行了比较，这些参考运行先前未经过S/D处理(来自PA步骤开发)。这两个参考运行是使用相同的原料并在相当的加载因子下进行的。只有洗脱缓冲液的pH不同，pH 4.3和pH 4.25分别用于参考和S/D运行。

表54显示了在这些运行中获得数据的总结：

表54：具有澄清收获物+S/D的PA步骤、工艺参数、回收率和产品质量结果

在最小和最大加载因子(即10和34g/L)下分别进行与先前用S/D处理的运行相对应的运行1和2。这种差异对回收步骤有影响，最小和最大加载因子分别为58％和67％。这些结果与无S/D的参考运行的结果相当。

关于质量，HPLC-SE分析表明了PA洗脱液的单体％在94.9％和99.2％之间变化，并且相关聚合体百分比在0.8％至4.3％范围内。所有运行的片段百分比均保持在1％以下。单体和聚集体百分比的差异与PA洗脱液浓度直接相关。实际上，浓度越高，聚集体的百分比越高。但是，单体百分比仍然可以接受，其值超过95％。另外，关于减少CGE结果，在各运行之间未观察到差异(例如所有运行的总BEAT％在94.4％和95.7％之间)，并且由于使用S/D，没有出现产品片段化。最后，电荷变体图谱显示出主峰百分比在37.8％和39.8％之间，并且观察到任何酸性或碱性种类的出现。经S/D处理后，产品未发生降解。

此外，在PA步骤之前和之后测量Tween 80和TnBP浓度以便评估PA步骤除去S/D的能力。收获物中的Tween 80浓度为1.1％(w/w)，而PA洗脱液中的浓度为0.001％(w/w)，所测得收获物中的TnBP为0.3％(w/w)和PA洗脱液中的TnBP为1mg/L(其对应约0.01％(w/w))。因此，蛋白A步骤有效除去了S/D。

总之，PA步骤之前的S/D处理是

3病毒灭活的合适选择。

c.PA洗脱液-高pH病毒灭活

小规模开发

本节显示了针对高pH处理以小规模获得的产品质量数据。HPLC-SE结果总结于表55

表中，其次是未减少CGE，电荷变体结果分别总结于表56和表57中。

表55：高pH处理的HPLC-SE结果

在各条件之间单体的百分比是相当的(例如T0为95.0％且T48h为94.9％)，并且允许确认在长达48小时的温育下高pH处理都不会发生聚集。但是，PA洗脱液样品和高pH处理的样品之间存在1％的差异。这是由于高pH温育可能导致聚集体百分比略有增加。然而，1％的差异在方法变异性之内，并且可能在统计学上不显著。此外，样品的保存方式不同，未经处理的PA洗脱液保存于5±3℃下，将高pH处理的样品冷冻，因此，导致冷冻样品中更多的可逆聚集体。

未减少CGE结果显示于表56中：

表56：高pHVI的未减少CGE结果

与t0相比，对于所有测试样品，通过未减少CGE得到的BEAT百分比均保持不变(例如BEAT％在t0时为87.1％，在T48h时为87.2％)。此外，长达48h都没能观察到片段增加。这些数据已由图20所示的相当的CGE图谱叠加确认。

ICE3结果的电荷变体显示于下表57中：

表57：高pH病毒灭活的ICE3结果

ICE3结果说明了T0的主峰％约为42.8％，1h的主峰％约为42.5％，2h的主峰％约为41.8％。对于这些相同的时间点，酸性％分别为49.2％、50.2％和50.9％。长达2小时内电荷变体是相当的。温育2小时后，酸性变体％增加，在4小时时为54.0％且在48小时时为59.6％。但是，方法变异性≤10％，并且在4小时和6小时的主峰％中观察到的差异在方法变异性内的值可能在统计上不显著(例如主峰在t0时为42.8％且在T4h时为39.1％)。然而，观察到的酸性百分比增加是一种预期趋势，但是2小时的安全裕度覆盖通常为≥60至≤90分钟的处理时间(及以上)。每个高pH温育时间点的图谱叠加显示于图21中。

综上所述，数据表明了高pH处理对长达2小时的产品质量没有影响。超过2小时不会导致任何聚集或片段化。然而，在24小时后观察到酸性种类增加了7％，在48小时后观察到酸性种类增加了10％。这提供了高pH温育是低pH的合适替代方法的置信度。

鉴于针对上面S/D处理和高pH所显示的数据，选择高pH策略作为优选选择。实际上，两种VI策略均获得了相当的产品质量数据。但是，还需要考虑其它参数，例如扩展性、工业化成本、安全性或病毒清除。

放大开发

将小规模开发的过程以中试规模放大规模。这些运行允许确认先前所确定的结果并产生更大规模的工艺数据。两次运行的工艺参数和结果描述于表58中。

表58：高pH中试规模运行工艺参数、回收率和产品稳定性结果

两次运行均在中试规模的PA步骤之后进行，运行1的加载因子为11g/L，运行2的加载因子为22g/L。靶标pH为pH 11.2，进行温育时间超过90分钟以便模拟最坏的情况方案。获得了一些输入操作范围，碱化比例在77.9和83.4mL/L之间且中和比在4.1和5.6mL/L之间。相比之下，在非代表性小规模运行中，比例在这些范围内，碱化为81.5mL/L，中和为4.7mL/L。另外，输出操作范围显示了pH在6.0左右旋转，电导率在4.0和4.4mS/cm之间，PA洗脱液浓度在1.7和3.3g/L之间，这些与加载因子直接相关。最后，低/高pH灭活步骤的步骤收率通常为94％。

关于产品质量结果，HPLC-SE在两次运行之间显示出类似的结果，这些运行具有94.3％单体且与小规模数据相当，其中已观察到1小时温育为94.8％和2小时温育为94.6％。另外，运行1的BEAT％为89.9％且运行2的BEAT％为87.6％的未减少CGE结果与小数据接近，该数据表明了BEAT％为约88％。在BEAT％上观察到的略微差异与BEAT“％的差异直接相关。实际上，运行1的BEAT”％为2.8％，运行2的BEAT”％为4.1％。方法变异性≤10％，分析峰积分可以解释这些差异。图谱叠加显示于图22中，没有显示出任何显著的片段化。

最后，电荷变体的主峰出现了4％的差异，运行1的电荷变体的主峰为40％，运行2的电荷变体的主峰为36％。这种差异直接与运行1和运行2之间的酸性种类增加2％相关，而碱性种类相同，这导致不相关减少为4％，因为在方法变异性内。为进行比较，图23中显示了图谱叠加。小规模观察到接近值，主峰约为42％。

总之，高pH放大显示了良好的产品质量结果，与小规模数据相当。进行了其它测定，例如基于细胞的功能测定和结合亲和力测定以收集额外数据。

结合亲和力测定

对CD3ε1-26-Fc和EGFR的相对亲和力分别列于表59和表60中。

表59：

3对CD3ε1-26-Fc靶标的相对亲和力。

表60：

3与EGFR靶标的相对亲和力。

在高pH下处理的样品之间未观察到对CD3ε1-26-Fc靶标的亲和力差异。参考和高pH温育24小时后的相对解离常数平均值分别为1.0和1.07。

关于EGFR靶标，温育2小时以上后仅出现略微增加。相对解离常数的平均值在2小时后为1.02、在4小时后为1.09且在24小时后为1.15。

总之，在高pH下未观察到

3对EGFR和CD3ε1-26-Fc的亲和力差异直至温育2小时，该温育时间覆盖通常为≥60至≤90分钟的处理时间。

基于细胞的功能测定

基于细胞的功能测定结果显示于图24中。基于剂量响应曲线确定最大有效浓度的一半(EC50)。不同剂量响应曲线的比较表明了高pH条件之间的略微差异。实际上，当温育时间增加时，在x轴上观察到向右的小位移。该位移揭示了产品效力下降与EC50值的增加直接相关(例如在t0时EC50＝0.0063且在t24h时EC50＝0.0094)。

所获得的EC50值允许确定每个样品的相对效力，将高pH温育时间等于零的样品作为参考。结果显示于表61中。

表61：根据高pH处理持续时间的相对效力。

该结果表明了温育2小时后相对效力为97％，4小时后相对效力为85％且24小时后相对效力为67％。方法变异性≤25％时，发现相对效力直到温育2小时才是稳定的，此后观察到的降低似乎表明了

3活性的改变。实际上，例如，温育24小时后，

3的浓度应高于参考样品的浓度(即温育时间等于零)以获得相同的活性水平。相对效力百分比的这种降低可能与分子的潜在氧化有关，该潜在氧化涉及响应细胞活化的降低，因此发光响应降低。该假设似乎与先前所述的ICE结果相关，观察到酸性种类随时间增加。实际上，氧化可能会涉及带负电的电子损失，因此间接涉及带正电的酸性种类增加。

总之，当高pH温育时间增加时，似乎发现了

3活性降低。但是，

3活性直到温育2小时才改变，该温育时间覆盖通常为≥60至≤90分钟的处理时间。高pH处理再次被验证是合适的。

残留DNA和HCP测定

在中试规模的高pH样品上进行的残留DNA测定显示于表62中。

表62：残留DNA测定结果

VI步骤之前，将所有PA洗脱液以0.2μm过滤。

残留的DNA浓度以DNA(pg)/蛋白(mg)表示，无论每个样品的蛋白浓度，都允许比较它们之间的所有样品。高pH下处理后，DNA浓度为159pg/mg(加载＝PA洗脱液时为182pg/mg)，过滤后为30pg/mg。在高pH温育期间观察到沉淀，可能是由于杂质沉淀(包括DNA和宿主细胞蛋白(HCP))。因此，通过沉淀高pH步骤除去了DNA，然后通过0.2μm过滤除去沉淀。总除去步骤百分比为约84％。

评价了高pH步骤对HCP污染物水平的影响且结果显示于表63中。

表63：使用Octet和ELISA方法的HCP测定结果。

VI步骤之前，将所有PA洗脱液以0.2μm过滤。

残留的HCP浓度以HCP(ng)/蛋白(mg)表示，无论每个样品的蛋白浓度，都可以比较它们之间的所有样品。按照Octet仪器，第一个样品的残留HCP浓度为1425ng/mg，按照ELISA方法为2803ng/mg。这些结果是无法预期的，因为供应商将使用Octet的测定描述为比经典ELISA的测定更灵敏。将这两种未处理的样品独立用作每种方法的参考。

关于Octet结果，高pH处理后HCP浓度为1154ng/mg，未处理的PA洗脱液中HCP浓度为1425ng/mg。过滤后，HCP浓度为185ng/mg。正如残留DNA测定所观察到的，高pH处理显示了在高pH温育期间可能沉淀除去并通过0.2μm过滤除去HCP的潜力。对于ELISA测定，显示了更好的灵敏度(即所测得的更高浓度)，但是两种方法之间的HCP除去率相当，两种VI的除去率约为80％。

总之，高pH处理显示了除去DNA和HCP杂质的有趣潜力。在该步骤结束时进行的0.2μm过滤至关重要，目的是在高pH温育期间物理除去HCP和沉淀的DNA。

VRV NRT研究

测试了高pH处理用于有效灭活病毒的能力。Bioreliance进行了非调节性试验且病毒清除结果总结于表64中。

表64：高pH处理后MLV病毒清除率的总结。

在pH 10.8(+/-0.05)下高pH处理60分钟后，对异种鼠白血病病毒(MLV)进行的病毒清除显示出5.65log₁₀减少因子。因此，就病毒清除而言，高pH处理似乎非常有效。

而且，当使用高pH下的

3温育作为

3纯化过程的病毒灭活步骤来测试病毒清除时，如图25中高pH处理动力学所示，清除结果是有效的。

病毒滴度和计算的对数减少因子总结于下表66中：

表65：高pH处理病毒对数减少

两次重复运行均显示出类似的灭活动力学，随时间显著迅速降低(例如温育5、10、30和60分钟后为2.15log₁₀、1.81log₁₀、1.62log₁₀和1.47log₁₀)，并且温育5分钟后系统观察到巨大的下降。

高pH处理获得的MLV减少因子为5.77log₁₀和5.65log₁₀(分别为运行1和运行2)允许得出结论：VI对MLV病毒的灭活有效(即所有LRF>4.00log₁₀)。

总而言之，考虑了不同的VI策略以便为抗体

3选择最合适的处理。VI条件的选择标准首先是处理后分子的稳定性，其次是用可接受的对数减少灭活病毒方法的效率，最后是将制造过程实施到GMP区域的难易程度。

PA洗脱液的低pH温育表明了随着高分子量种类的增加，重要的产品降解。该策略被认为不适合该项目。

发现对批量收获物进行溶剂/洗涤剂(S/D)处理和对PA洗脱液进行高pH均适合，在仅关于理化性质的产品质量方面显示出类似结果。另外，被认为是一种新型处理，基于产品活性或病毒清除，已成功验证了高pH的VI适合于其它测定。

总之，考虑到本报告中所讨论的所有参数，高pH处理被选为

3项目最合适的VI策略并在PA和CEX步骤之间的过程中实施。S/D处理被认作备用选择。

而且，当高pH下的

3温育作为

3纯化过程的病毒灭活步骤来测试病毒除去时，如图25中高pH处理动力学所示，除去结果是有效的。

病毒滴度和计算的对数减少因子总结于下表66中：

表66：高pH处理病毒对数减少

两次重复运行均显示出类似的灭活动力学，随时间显著迅速降低(例如温育5、10、30和60分钟后为2.15log₁₀、1.81log₁₀、1.62log₁₀和1.47log₁₀)，并且温育5分钟后系统观察到巨大的下降。

高pH处理获得的MLV减少因子为5.77log₁₀和5.65log₁₀(分别为运行1和运行2)允许得出结论：VI对MLV病毒的灭活是有效的(即所有LRF>4.00log₁₀)。

实施例8：在非低pH可靠抗体的纯化过程中高pH也是低pH的有效替代方法

为了测试在非pH可靠抗体的纯化过程中在低pH温育下使用高pH作为替代方法的可能性，已经研究了高pH温育对人源化IgG1(此处称为Ab1)的稳定性和活性的影响。

材料、方法和设备

本研究中所用的原料是代表性的PA洗脱液。

所有化学品均为药典级(美国或欧洲)。通常对所有缓冲液和加工中间体进行0.2μm过滤步骤工艺。另外，使用磁力搅拌器、pH和电导率仪。

测试的时间点是在室温下分别为1小时、2小时和4小时，超过该时间点后，将产品置于5±3℃下温育长达24小时。在Nalgene瓶中使用0.5M NaOH，使用磁力搅拌器搅拌下将约100mL PA洗脱液碱化至pH 11.2。选择该pH作为产品质量的最坏情况方案以便验证过程的靶标pH 11.0。除了在如下所述立即中和时间点t0外，将产品在高pH下温育。在每个时间点，将约10mL的高pH产品转移到50mL TPP管中，并通过使用3.7％的HCl将pH降低至pH 5.2进行中和(中和步骤)以便终止VI反应，然后进行冷冻。

通过HPLC-SE、iCE和CGE在所有时间点分析产品质量。还分析了未中和且未进行任何VI处理的PA洗脱液，并将其用作参考。

表67：高pH测试条件

选择了一些上述测试样品以通过表面等离子体共振进行测试(表37)。目的是验证高pH处理是否会影响Ab1分子与其靶标OX40R和FcgR3a的结合亲和力，从而间接影响其活性。另外，还进行了基于细胞的功能测定以直接验证高pH对Ab1分子活性的影响。

表68：测试样品的结合亲和力和基于细胞的功能测定

结果与结论

通过SE-HPLC已分析了高pH温育Ab1对保持时间的影响，结果显示于图26和表69中。

表69：HPLC-SE结果

研究表明，单体百分比在不同条件下是相当的，另外，在长达24小时的高pH处理下，不会出现聚集。观察到的差异包括在方法变异性之内，并且在统计学上不显著。因此，根据这些结果，Ab1可以在长达24小时内是稳定的，安全裕度覆盖通常为≥60至≤90分钟的处理时间。

在表70和图27中，为了进一步研究高pH处理后样品的纯度和特性，通过未减少CGE已分析了保持时间的影响。这些实验还表明了中间体百分比与参考样品(PA洗脱液)相当，并且直到2小时才发生显著的片段化。2小时后出现125kDa片段百分比的略微增加，并且与IgG百分比的减低相关。

这些结果一起表明了Ab1可以在长达2小时内是稳定的，安全裕度覆盖通常为≥60至≤90分钟的处理时间。

表70：未减少CGE结果

减少CGE(在图28和表71中)还表明了直到2小时才出现显著的片段化增加，而2小时后，发生“未知片段”百分比略微增加，并且与HC％降低相关。

这些结果确认了Ab1可以在长达2小时内是稳定的，安全裕度覆盖通常为≥60至≤90分钟的处理时间。

表71：减少CGE结果

另外，通过iCE分析高pH下保持时间的影响以评估电荷变体。在表72和图29中，结果表明了酸性种类随时间增加，但是方法变异性≤10％，直到2小时内观察到的差异均在方法变异性内，并且可以被认作可接受的，并且在统计学上不显著。换句话说，观察到的酸性百分比增加是一种预期趋势，2小时的安全裕度覆盖通常为≥60至≤90分钟的处理时间(及以上)。

表72：iCE结果

进行了基于细胞的功能测定以评估高pH下的保持时间对分子活性的影响。根据结果，在图30和表73中，在相对效力值中未观察随时间的趋势。与用作参考的PA洗脱液相比，t1h和t2h下高pH处理具有高度类似的效力。考虑到方法变异性≤25％，直到温育2小时(覆盖通常为≥60至≤90分钟的处理时间)后，高pH处理也不会显著改变Ab1活性。

表73：根据高pH处理持续时间的相对效力

为了评估高pH温育对Ab1活性的影响，已进行了结合亲和力测定(在Biacore)(表74)。

表74：Ab1与其靶标的相对亲和力

在高pH下温育的蛋白A洗脱液和所有样品之间未观察到与人类OX40的结合活性的功能显著性差异。差异很小可能是由于注入的浓度略微不同。

在高pH下温育的蛋白A洗脱液和所有样品之间未观察到与人类FcγR3a的结合活性的功能显著性差异。差异很小可能是由于注入的浓度略微不同。

这些结果一起表明了在非低pH可靠抗体的纯化过程中，高pH处理PA洗脱液也是低pH处理的有效替代方法。

Claims (13)

1.一种用于制备病毒灭活的抗体溶液的方法，其包括以下步骤：(i)收获由转染的细胞产生的抗体材料，所述转染的细胞包含已经过细胞培养的所述抗体的编码序列，(ii)对所述收获的抗体材料进行病毒灭活处理，其中所述病毒灭活处理是在高pH下温育。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述收获的抗体材料是在非人类哺乳动物细胞中产生的。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述收获的抗体材料包含单克隆抗体。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述单克隆抗体是重组抗体。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述重组抗体是多特异性的。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述高pH为9或更高且12.5或更低。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述高pH为至少10.5。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述高pH为约11。

9.根据权利要求6-8中任一项所述的方法，其中，首先将所述收获的抗体材料进行蛋白A色谱，并且其中，将所得的A洗脱液在所述高pH下温育。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，将所述蛋白A洗脱液用选自以下组的缓冲液滴定至目标高pH并温育：Tris、组氨酸L-精氨酸、磷酸盐和NaOH。

11.根据权利要求6-7中任一项所述的方法，其中，将所述蛋白A洗脱液在室温下用0.5M的NaOH滴定约60分钟至目标pH 11。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其包括用病毒灭活测定测试一部分根据权利要求1中所述的病毒灭活的抗体溶液的另一步骤(iii)。

13.一种生产原料药物质的方法，其包括以下步骤：

(a)将收获的抗体材料进行蛋白A色谱；

(b)如权利要求11所述的在高pH下温育所得的PA洗脱液；

(c)将所得的病毒灭活溶液中和至pH 5.5，然后进行0.2μm过滤；

(d)将中和的病毒灭活的蛋白A洗脱液进行阳离子交换色谱，然后进行0.2μm过滤；

(e)通过超滤和连续渗滤将阳离子交换色谱洗脱液浓缩，然后进行0.2μm过滤；

(f)通过阴离子交换色谱使用膜吸附在流通模型下将产品纯化，然后进行0.2μm过滤；

(g)病毒纳滤；

(h)通过超滤和连续渗滤将产品浓缩至预配制缓冲液中，然后进行0.2um过滤；

(i)通过与pH 6.0的5mM L-组氨酸、150mM L-精氨酸一盐酸盐、15％蔗糖、0.06％聚山梨酯80混合，以添加赋形剂至最终制剂缓冲液中的所述产品为目标6mg/mL，然后进行0.2μm过滤；

(j)将产品填充到无菌袋中，然后冷冻并在-80±20℃下保存。

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