CN113840836B - 抗结缔组织生长因子抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

提供一种包含轻链和重链可变区的抗CTGF抗体及其作为药物的用途，该抗体可用于制备治疗CTGF相关疾病或病症的药物。

Description

抗结缔组织生长因子抗体及其应用
本申请要求申请号为201910480169.4的中国专利申请(名称为：抗结缔组织生长因子抗体及其应用，优先权日2019年6月4日)的优先权。
技术领域
本公开属于生物医药领域，具体涉及结合结缔组织生长因子(Connective TissueGrowth Factor，CTGF)的抗体及其应用。
背景技术
这里的陈述仅提供与本公开有关的背景信息，而不必然地构成现有技术。
CTGF表达由转化生长因子β(TGFβ)超家族的成员诱导。该超家族包括TGFβ-1、-2、和-3、骨形态发生蛋白(BMP)-2和活化素。许多调节剂包括地塞米松、凝血酶、血管内皮生长因子(VEGF)和血管紧张肽II；以及环境刺激包括高血糖和高血压也诱导CTGF的表达(参见例如，Franklin(1997)Int J Biochem Cell Biol 29：79-89；Wunderlich(2000)GraefesArch Clin Exp Ophthalmol 238：910-915；Denton and Abraham(2001)Curr OpinRheumatol 13：505-511；和Riewald(2001)Blood 97：3109-3116；Riser等人(2000)J AmSocNephrol 11：25-38；和国际公开WO 00/13706)。
TGFβ对CTGF表达的刺激是快速且长期的，无需持久施加TGFβ(Igarashi等人(1993)Mol BiolCell 4：637-645)。TGFβ通过CTGF启动子中的DNA调控元件进行的转录激活，导致的CTGF的增强表达(Grotendorst等人(1996)Cell Growth Differ 7：469-480；Grotendorst和Bradham，U.S.专利No.6,069,006；Holmes等人(2001)J Biol Chem 276：10594-10601)。
在肾小球性肾炎、IgA肾病、间灶性和节段性肾小球硬化症和糖尿病性肾病中，CTGF的表达被上调(参见例如，Riser等人(2000)J Am Soc Nephrol 11：25-38)。在慢性肾小管间质(tubulointerstitial)损伤部位也观察到表达CTGF的细胞数增加，并且CTGF水平与损伤程度相关(Ito等人(1998)Kidney Int 53：853-861)。另外，在与肾实质瘢痕化和硬化相关的各种肾病中，CTGF在肾小球和肾小管间质中的表达也增加。CTGF的升高水平也与肝纤维化、心肌梗死和肺纤维化相关。例如，在患有自发性肺纤维化(IPF)患者中，在生物活检和支气管肺泡灌洗液细胞中，CTGF被强烈上调(Ujike等人(2000)Biochem Biophys ResCommun 277：448-454；Abou-Shady等人(2000)Liver 20：296-304；Williams等人(2000)JHepatol 32：754-761)。因此，在如上所述的疾病中，CTGF代表了有效的治疗靶。
然而，目前仍无有效靶向CTGF的抗体药物应用于临床，仍需研发新的安全、有效的CTGF抗体药物。
发明内容
本公开提供一种抗CTGF抗体。所述的抗CTGF抗体包括抗人CTGF全长抗体及其抗原结合片段。
在一些实施方案中，该抗CTGF抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：
i)所述重链可变区包含与如SEQ ID NO：6所示的重链可变区相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含与如SEQ ID NO：7所示的轻链可变区相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
ii)所述重链可变区包含与如SEQ ID NO：8所示的重链可变区相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含与如SEQ ID NO：9所示的轻链可变区相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，该抗CTGF抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：
ii-i)所述重链可变区包含与如SEQ ID NO：69所示的重链可变区相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含与如SEQ ID NO：70所示的轻链可变区相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
ii-ii)所述重链可变区包含与如SEQ ID NO：85所示的重链可变区相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含与如SEQ ID NO：70所示的轻链可变区相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，该抗CTGF抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：
iii)所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQID NO：15所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
iv)所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20和SEQID NO：21所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，该抗CTGF抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：
iv-i)所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：73所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75和SEQ ID NO：76所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
iv-ii)所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103和SEQ ID NO：104所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75和SEQ ID NO：76所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，该抗CTGF抗体是鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
在一些实施方案中，该抗CTGF抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：
(v-1)所述重链可变区，其氨基酸序列与SEQ ID NO：6、27、28或29具有至少90％的序列同一性，和所述轻链可变区，其氨基酸序列与SEQ ID NO：7、22、23、24、25或26具有至少90％的序列同一性：
(vi-1)所述重链可变区，其氨基酸序列与SEQ ID NO：8、33、34、35或36具有至少90％的序列同一性，和所述轻链可变区，其氨基酸序列与SEQ ID NO：9、30、31或32具有至少90％的序列同一性；或
(vi-i)所述重链可变区，其氨基酸序列与SEQ ID NO：69、81、82、83、84或85具有至少90％的序列同一性，和所述轻链可变区，其氨基酸序列与SEQ ID NO：70、77、78、79或80具有至少90％的序列同一性。
在一些实施方案中，该抗CTGF抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：
(v)所述重链可变区与SEQ ID NO：6、27、28或29中所示的重链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，和所述轻链可变区与SEQ ID NO：7、22、23、24、25或26中所示的轻链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；或
(vi)所述重链可变区与SEQ ID NO：8、33、34、35或36所示的重链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，和所述轻链可变区与SEQ ID NO：9、30、31或32所示的轻链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；或
所述重链可变区与SEQ ID NO：6中所示的重链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，和所述轻链可变区与SEQ IDNO：7中所示的轻链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；
所述重链可变区与SEQ ID NO：27、28或29中所示的重链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，和所述轻链可变区与SEQ ID NO：22、23、24、25或26中所示的轻链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；
所述重链可变区与SEQ ID NO：8所示的重链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，和所述轻链可变区与SEQ IDNO：9所示的轻链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；
所述重链可变区与SEQ ID NO：33、34、35或36所示的重链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，和所述轻链可变区与SEQ ID NO：30、31或32所示的轻链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
在一些实施方案中，该抗CTGF抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：
(vi-ii)所述重链可变区与SEQ ID NO：69、81、82、83、84或85中所示的重链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，和所述轻链可变区与SEQ ID NO：70、77、78、79或80中所示的轻链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
在一些实施方案中，该抗CTGF抗体，其中所述抗CTGF抗体为人源化抗体，所述人源化抗体包含人抗体的框架区或其框架区变体，所述框架区变体在人抗体的轻链框架区和/或重链框架区上分别具有至多10个的回复突变；
在一些实施方案中，该抗CTGF抗体，其包含如下所述的重链可变区和轻链可变区：
(a)所述轻链可变区，其包含分别如SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且包含选自4L、36F、43S、45K、47W、58V或71Y中的一个或更多个氨基酸回复突变，和/或所述重链可变区，其包含序列分别如SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11和SEQ ID NO：12所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且包含选自28S、30N、49A、75E、76S、93V、94E或104D中的一个或更多个氨基酸回复突变；或
(b)所述轻链可变区，其包含分别如SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区中包含选自36V、44F、46G或49G中的一个或更多个回复突变，和/或所述重链可变区，其包含序列分别如SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQID NO：18所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且包含44G、49G、27F、48L、67L、71K、78V或80F中的一个或更多个回复突变。
在一些实施方案中，该抗CTGF抗体，其包含如下所述的重链可变区和轻链可变区：
(b-i)轻链可变区，其包含分别如SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75和SEQ ID NO：76所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，以及选自45P、46W、48Y、69S或70Y中的一个或更多个回复突变，和重链可变区，其包含分别如SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：73所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及27F、38K、48I、67K、68A、70L或72F中的一个或更多个回复突变；或
(b-ii)轻链可变区，其包含分别如SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75和SEQ ID NO：76所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，且包含选自45P、46W、48Y、69S或70Y中的一个或更多个回复突变，和重链可变区，其包含分别如SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103和SEQ ID NO：104所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，且包含27F、38K、48I、67K、68A、70L或72F中的一个或更多个回复突变。
在一些实施方案中，该抗CTGF抗体，其包含如下所示的重链可变区和轻链可变区：
(vii)所述重链可变区序列如SEQ ID NO：6所示和所述轻链可变区序列如SEQ IDNO：7所示；
(viii)所述重链可变区序列如SEQ ID NO：27、28或29所示和所述轻链可变区序列如SEQ ID NO：22、23、24、25或26所示；
(ix)所述重链可变区序列如SEQ ID NO：8所示和所述轻链可变区序列如SEQ IDNO：9所示；或
(x)所述重链可变区序列如SEQ ID NO：33、34、35或36所示和所述轻链可变区序列如SEQ ID NO：30、31或32所示。
在一些实施方案中，该抗CTGF抗体，其包含如下所示的重链可变区和轻链可变区：
(xi)所述重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：69所示；和所述轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：70所示；或
(xii)所述重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：81、82、83、84或85所示；和所述轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：77、78、79或80所示。
在一些实施方案中，该抗CTGF抗体，其包含如下表a、表b和表c所示的重链可变区和轻链可变区：
表a：mab147来源的人源化抗体轻链可变区和重链可变区组合
Figure GPA0000313349910000061
表b：mab164人源化抗体轻链可变区和重链可变区组合
Figure GPA0000313349910000071
表c：mab95人源化抗体轻链可变区和重链可变区组合
Figure GPA0000313349910000072
在一些实施方案中，该抗CTGF抗体，其包含如下所示的重链可变区和轻链可变区：
(xiii)所述重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：27所示；和所述轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示；
(xiv)所述重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：34所示；和所述轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：30所示；或
(xv)所述重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：85所示；和所述轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：77所示。
在一些实施方案中，该抗CTGF抗体，其中所述抗体进一步包含抗体重链恒定区和轻链恒定区；优选地，所述重链恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4恒定区及其常规变体，所述轻链恒定区选自人抗体κ和λ链恒定区及其常规变体；更优选地，所述抗体包含序列如SEQ ID NO：37或38所示的重链恒定区和序列如SEQ ID NO：39或40所示的轻链恒定区。
在一些实施方案中，该抗CTGF抗体，其包含：
(c)与序列如SEQ ID NO：41、43、44、45、46、47或48所示的重链具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的重链和与序列如SEQ ID NO：42、49、50、51、52或53所示的轻链具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的轻链；
(d)与序列如SEQ ID NO：54、56、57、58、59、60、61、62或63所示的重链具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的重链和与序列如SEQ ID NO：55、64、65或66所示的轻链具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的轻链；
(e)序列如SEQ ID NO：41、43、44、45、46、47或48所示的重链和序列如SEQ ID NO：42、49、50、51、52或53所示的轻链；或
(f)序列如SEQ ID NO：54、56、57、58、59、60、61、62或63所示的重链和序列如SEQID NO：55、64、65或66所示的轻链。
在一些实施方案中，该抗CTGF抗体，其包含：
(g)与SEQ ID NO：86、88、89、90、91、92、93、94、95、96或97具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链，和与SEQID NO：87、98、99、100或101具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链；或
(h)如SEQ ID NO：86、88、89、90、91、92、93、94、95、96或97所示的重链和如SEQ IDNO：87、98、99、100或101所示的轻链。
在一些实施方案中，该抗CTGF抗体，其包含：
(j)如SEQ ID NO：46所示的重链和如SEQ ID NO：49所示的轻链；
(k)如SEQ ID NO：61所示的重链和如SEQ ID NO：64所示的轻链；或
(l)如SEQ ID NO：97所示的重链和如SEQ ID NO：98所示的轻链。
本公开另一些方面提供一种抗CTGF抗体，该抗体与如前所述的抗CTGF抗体或其抗原结合片段竞争性结合人CTGF。
本公开另一些方面提供一种核酸分子，其编码如前所述的抗CTGF抗体。
本公开另一些方面提供一种宿主细胞，其包含如前所述的核酸分子。
本公开另一些方面提供一种药物组合物，其含有治疗有效量或预防有效量的如前所述的抗CTGF抗体，或如前所述的核酸分子，以及一种或更多种药学上可接受的载体、稀释剂、缓冲剂或赋形剂。
在一些具体的实施方案中，所述治疗有效量或预防有效量为单位剂量的组合物中含有0.1-3000mg或1-1000mg如前所述的抗CTGF抗体。
本公开另一些方面提供一种用于免疫检测或测定CTGF的方法，所述方法包括使用如前所述的抗CTGF抗体的步骤。
本公开另一些方面提供一种用于免疫检测或测定CTGF的方法，所述方法包括使如前所述的抗CTGF抗体接触受试者或其样品的步骤。
本公开另一些方面提供一种试剂盒，其包含如前所述的抗CTGF抗体。
本公开另一些方面提供一种治疗与CTGF相关的疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的如前所述的抗CTGF抗体，或如前所述的核酸分子，或如前所述的药物组合物，其中所述疾病优选为纤维性疾病(纤维性疾病优选自发性肺纤维化、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病骨关节炎、硬皮病、慢性心力衰竭、肝硬化或肾纤维化)、高血压、糖尿病、心肌梗死、关节炎、CTGF相关细胞增殖性疾病、动脉粥样硬化、青光眼或癌症(癌症优选急性淋巴母细胞性白血病、皮肤纤维瘤、乳腺癌、血管脂肪瘤、血管平滑肌瘤、结缔组织生成性癌症、前列腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃肠道癌症或肝癌)。
本公开另一些方面提供如前所述的抗CTGF抗体，或如前所述的核酸分子，或如前所述的药物组合物在制备用于治疗CTGF相关疾病的药物中的用途，所述CTGF相关疾病包括纤维性疾病(纤维性疾病优选自发性肺纤维化、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病骨关节炎、硬皮病、慢性心力衰竭、肝硬化或肾纤维化)、高血压、糖尿病、心肌梗死、关节炎、CTGF相关细胞增殖性疾病、动脉粥样硬化、青光眼或癌症(癌症优选急性淋巴母细胞性白血病、皮肤纤维瘤、乳腺癌、血管脂肪瘤、血管平滑肌瘤、结缔组织生成性癌症、前列腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃肠道癌症或肝癌)。
本公开另一些方面提供用于治疗CTGF相关疾病的如前所述的抗CTGF抗体，或编码如前所述的抗CTGF抗体的核酸分子，或如前所述的药物组合物；所述CTGF相关疾病包括纤维性疾病(纤维性疾病优选自发性肺纤维化、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病骨关节炎、硬皮病、慢性心力衰竭、肝硬化或肾纤维化)、高血压、糖尿病、心肌梗死、关节炎、CTGF相关细胞增殖性疾病、动脉粥样硬化、青光眼或癌症(癌症优选急性淋巴母细胞性白血病、皮肤纤维瘤、乳腺癌、血管脂肪瘤、血管平滑肌瘤、结缔组织生成性癌症、前列腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃肠道癌症或肝癌)。
附图说明
图1：通过ELISA检测，源自mab164的人源化抗体与人CTGF的亲和力。
图2：源自mab147或源自mab164的人源化抗体对SU86.86小鼠移植瘤的抑制实验结果。
具体实施方式
发明详述
术语
为了更容易理解本公开，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本公开所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
本公开所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。
结缔组织生长因子(Connective Tissue Growth Factor，CTGF)是一种最初分离自人脐静脉内皮细胞的36kD富含半胱氨酸的肝素结合分泌糖蛋白(参见例如，Bradham等人(1991)J Cell Biol114：1285-1294；Grotendorst and Bradham，美国专利No.5,408,040)。CTGF属于蛋白质CCN(CTGF，Cyr61，Nov)家族(分泌糖蛋白)，该家族包括血清诱导的立即早期基因产物Cyr61、推断的癌基因Nov、ECM相关蛋白FISP-12、src诱导的基因CEF-10、Wnt诱导的分泌蛋白WISP-3以及抗增殖蛋白HICP/rCOP(Brigstock(1999)Endocr Rev 20：189-206；O′Brian等人(1990)Mol Cell Biol 10：3569-3577；Joliot等人(1992)Mol Cell Biol12：10-21；Ryseck等人(1990)Cell Growth andDiff 2：225-233；Simmons等人(1989)ProcNatl Acad Sci USA86：1178-1182；Pennica等人(1998)Proc Natl Acad Sci USA，95：14717-14722；和Zhang等人(1998)Mol Cell Biol 18：6131-6141)。CCN蛋白的特征在于保守的38个半胱氨酸残基，该38个半胱氨酸残基占总氨基酸含量10％以上并且形成具有N-末端和C-末端结构域的模块结构(modular structure)。CTGF模块结构包括在N-末端结构域的针对胰岛素样生长因子结合蛋白(IGF-BP)和von Willebrand因子(VWC)的保守基序，以及在C-末端结构域的血小板反应蛋白(TSP1)和半胱氨酸结基序。
本公开所述的“抗体”指免疫球蛋白，全长抗体是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中每类Ig都可以有κ链或λ链。
抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(Fv区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)由3个CDR区4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1、HCDR2和HCDR3。
本公开的抗体包括鼠源抗体、嵌合抗体和人源化抗体。
术语“鼠源抗体”在本公开中为根据本领域知识和技能制备的针对人CTGF的单克隆抗体。制备时用CTGF抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。在本公开一个优选的实施方案中，所述的鼠源抗CTGF抗体或其抗原结合片段，可进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，或进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或其变体的重链恒定区。
术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要先建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再根据需要克隆人抗体的恒定区基因，将鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入表达载体中，最后在真核系统或原核系统中表达嵌合抗体分子。在本公开一个优选的实施方案中，所述嵌合抗体的抗体轻链进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。所述的CTGF嵌合抗体的抗体重链进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区，或者使用氨基酸突变(例如L234A和/或L235A突变，和/或S228P突变)的IgG1、IgG2或IgG4变体。
术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-graftedantibody)，是指将鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体框架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量鼠蛋白成分，从而诱导的异源性反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(在因特网www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可获得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991 Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版中找到。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变，以保持或增强活性。本公开的人源化抗体也包括进一步由酵母菌展示对CDR进行亲和力成熟突变后的人源化抗体。
由于抗原的接触残基，CDR的移植可由于与抗原接触的构架残基而导致产生的抗体或其抗原结合片段对抗原的亲和力减弱。此类相互作用可以可能是体细胞高度突变的结果。因此，可能仍然需要将此类供体构架氨基酸移植至人源化抗体的构架。来自非人抗体或其抗原结合片段的参与抗原结合的氨基酸残基可通过检查动物单克隆抗体可变区序列和结构来鉴定。CDR供体构架中与种系不同的各残基可被认为是相关的。如果不能确定最接近的种系，那么可将序列与亚类共有序列或具有高相似性百分数的动物抗体序列的共有序列相比较。稀有构架残基被认为可能是体细胞高度突变的结果，从而在结合中起着重要作用。
在本公开一个的实施方案中，所述的抗体或其抗原结合片段，可进一步包含人源或鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，或进一步包含人源或鼠源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区；可以包含人源IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区，或者使用氨基酸突变(例如L234A和/或L235A突变、和/或S228P突变)的IgG1、IgG2或IgG4变体。
本公开中所述人抗体重链恒定区和人抗体轻链恒定区的“常规变体”是指现有技术已公开的来源于人的不改变抗体可变区结构和功能的重链恒定区或轻链恒定区的变体，示例性变体包括对重链恒定区进行定点改造和氨基酸替换的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区变体，具体替换如现有技术已知的YTE突变，L234A和/或L235A突变，S228P突变，和/或获得knob-into-hole结构的突变(使得抗体重链具有knob-Fc和hole-Fc组合)，这些突变已被证实使得抗体具有新的性能，但不改变抗体可变区的功能。
“人抗体”(HuMAb)、“人源抗体”、“全人抗体”、“完全人抗体”可以互换使用，可以是源于人的抗体或者是从一种转基因生物体中获得的抗体，该转基因生物体经“改造”以响应于抗原刺激而产生特异性人抗体并且可以通过本领域已知的任何方法产生。在某些技术中，将人重链和轻链基因座的元素元件引入到源于胚胎干细胞系的生物体的细胞株中，这些细胞系中的内源性重链和轻链基因座被靶向破坏这些细胞系中包含靶向的内源性重链和轻链基因座破坏。转基因生物可以合成对人抗原特异的人抗体，并且该生物可以用于产生人抗体-分泌杂交瘤。人抗体还可以是一种抗体，其中重链和轻链是由源于一个或更多个人DNA来源的核苷酸序列编码的。完全人抗体还可以通过基因或染色体转染方法以及噬菌体展示技术来构建，或者由体外活化的B细胞构建，所有的这些都是本领域已知的。
术语“全长抗体”、“完整抗体”、“完全抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，指基本上完整形式的抗体，与下文定义的抗原结合片段相区分。该术语特别指轻链和重链包含恒定区的抗体。
本公开的“抗体”包含“全长抗体”及其“抗原结合片段”。
在一些实施方案中，本公开的全长抗体包括由以下表1、表2和表3中轻重链可变区组合中的轻链可变区与轻链恒定区连接和重链可变区与重链恒定区连接后所形成的全长抗体。本领域技术人员可以根据实际需要选择不同的抗体来源的轻链恒定区、重链恒定区，例如人抗体来源的轻链恒定区和重链恒定区。同时，表1、表2和表3中不同轻链可变区和重链可变区组合可以形成单链抗体(scFv)、Fab或其他包含scFv或Fab的抗原结合片段形式。
表1.mab147来源的人源化抗体轻链可变区和重链可变区组合
Hu147-VL1 Hu147-VL2 Hu147-VL3 Hu147-VL4 Hu147-VL5
Hu147-VH1 Hu147-11 Hu147-12 Hu147-13 Hu147-14 Hu147-15
Hu147-VH2 Hu147-21 Hu147-22 Hu147-23 Hu147-24 Hu147-25
Hu147-VH3 Hu147-31 Hu147-32 Hu147-33 Hu147-34 Hu147-35
表2.mab164人源化抗体轻链可变区和重链可变区组合
Hu164-VH5 Hu164-VH6 Hu164-VH7 Hu164-VH8
Hu164-VL7 Hu164-57 Hu164-67 Hu164-77 Hu164-87
Hu164-VL8 Hu164-58 Hu164-68 Hu164-78 Hu164-88
Hu164-VL9 Hu164-59 Hu164-69 Hu164-79 Hu164-89
表3.mab95人源化抗体轻链可变区和重链可变区组合
Hu95-VH1 Hu95-VH2 Hu95-VH3 Hu95-VH4 Hu95-VH5
Hu95-VL1 Hu95-11 Hu95-21 Hu95-31 Hu95-41 Hu95-51
Hu95-VL2 Hu95-12 Hu95-22 Hu95-32 Hu95-42 Hu95-52
Hu95-VL3 Hu95-13 Hu95-23 Hu95-33 Hu95-43 Hu95-53
Hu95-VL4 Hu95-14 Hu95-24 Hu95-34 Hu95-44 Hu95-54
注：Hu164-57表示mab164人源化抗体Hu164-57具有如Hu164-VH5所述重链可变区和如Hu164-VL7所述轻链可变区，其它依此类推。
术语“抗原结合片段”或“功能片段”是指抗体的保持特异性结合抗原(例如，CTGF)的能力的一个或更多个片段。已显示可利用全长抗体的片段来进行抗体的抗原结合功能。术语抗体的“抗原结合片段”中包含的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段，(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VH和VL结构域组成的Fv片段；(v)dsFv，由VH和VL经链间二硫键形成的稳定的抗原结合片段；(vi)包含scFv、dsFv、Fab等片段的双抗体、双特异性抗体和多特异性抗体。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但可使用重组方法，通过合成的接头连接它们，从而使得其能够产生为其中VL和VH区配对形成单价分子的单个蛋白质链(称为单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等人(1988)Science242：423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.SciUSA85：5879-5883)。此类单链抗体也包括在术语抗体的“抗原结合片段”中。使用本领域技术人员已知的常规技术获得此类抗体片段，并且以与对于完整抗体的方式相同的方式就功用性筛选片段。可通过重组DNA技术或通过酶促或化学断裂完整免疫球蛋白来产生抗原结合部分。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
Fab是通过用蛋白酶木瓜蛋白酶(切割H链的224位的氨基酸残基)处理IgG抗体分子所获得的片段中的具有约50,000的分子量并具有抗原结合活性的抗体片段，其中H链N端侧的约一半和整个L链通过二硫键结合在一起。
F(ab′)2是通过用酶胃蛋白酶消化IgG铰链区中两个二硫键的下方部分而获得的分子量为约100,000并具有抗原结合活性并包含在铰链位置相连的两个Fab区的抗体片段。
Fab′是通过切割上述F(ab′)2的铰链区的二硫键而获得的分子量为约50,000并具有抗原结合活性的抗体片段。本公开的Fab′可以通过用还原剂例如二硫苏糖醇处理本公开的特异性识别CTGF并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的F(ab′)2来生产。
此外，可以通过将编码抗体的Fab′片段的DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中并将载体导入到原核生物或真核生物中以表达Fab′来生产所述Fab′。
术语“单链抗体”、“单链Fv”或“scFv”意指包含通过接头连接的抗体重链可变结构域(或区域；VH)和抗体轻链可变结构域(或区域；VL)的分子。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成，例如使用1-4个重复的变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448)。可用于本公开的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8：725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immuno l.31：94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56：3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293：41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。
双抗体是其中scFv或Fab被二聚体化的抗体片段，是具有二价抗原结合活性的抗体片段。在二价抗原结合活性中，两个抗原可以是相同或不同的。
双特异性抗体和多特异性抗体是指能同时结合两个或多个抗原或抗原决定簇的抗体，其中包含能结合CTGF的scFv或Fab片段。
本公开的双抗体可以通过以下步骤来生产：获得本公开的特异性识别人CTGF并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体的VH和VL的编码cDNA，构建编码scFv的DNA以使肽接头的氨基酸序列长度为8个残基或更少，将所述DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将所述表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达双抗体。
dsFv是通过将其中每个VH和VL中的一个氨基酸残基被半胱氨酸残基取代的多肽经由半胱氨酸残基之间的二硫键相连而获得的。可以按照已知方法(ProteinEngineering，7，697(1994))基于抗体的三维结构预测来选择被半胱氨酸残基取代的氨基酸残基。
本公开的全长抗体或抗原结合片段可以通过以下步骤来生产：获得本公开的特异性识别人CTGF并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的抗体的编码cDNA，构建编码dsFv的DNA，将所述DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将所述表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达dsFv。
术语“氨基酸差异”或“氨基酸突变”是指相较于原蛋白质或多肽，变体蛋白质或多肽存在氨基酸的改变或突变，包括在原蛋白质或多肽的基础上发生1个、2个、3个或更多个氨基酸的插入、缺失或替换。
术语“抗体框架”或“FR区”，是指可变结构域VL或VH的一部分，其用作该可变结构域的抗原结合环(CDR)的支架。从本质上讲，其是不具有CDR的可变结构域。
术语“互补决定区”、“CDR”或“高变区”是指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一。通常，每个重链可变区中存在三个CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，每个轻链可变区中存在三个CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。可以使用各种公知方案中的任何一种来确定CDR的氨基酸序列边界，包括“Kabat”编号规则(参见Kabat等(1991)，“Sequences ofProteins of Immunological Interest”，第5版，Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD)、“Chothia”编号规则(参见Al-Lazikani等人，(1997)JMB 273：927-948)和ImMunoGenTics(IMGT)编号规则(Lefranc M.P.，Immunologist，7，132-136(1999)；Lefranc，M.P.等，Dev.Comp.Immunol.，27，55-77(2003)等。例如，对于经典格式，遵循Kabat规则，所述重链可变域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；轻链可变域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。遵循Chothia规则，VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且VL中的氨基酸残基编号为26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。通过组合Kabat和Chothia两者的CDR定义，CDR由人VH中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)和人VL中的氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)构成。遵循IMGT规则，VH中的CDR氨基酸残基编号大致为26-35(CDR1)、51-57(CDR2)和93-102(CDR3)，VL中的CDR氨基酸残基编号大致为27-32(CDR1)、50-52(CDR2)和89-97(CDR3)。遵循IMGT规则，抗体的CDR区可以使用程序IMGT/DomainGap Align确定。除非另有说明，本公开实施例涉及的抗体可变区和CDR序列均适用“Kabat”编号规则。
术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位(例如，CTGF分子上的特定部位)。表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个连续或非连续的氨基酸。参见，例如，Epitope Mapping Protocols inMethods in Molecular B iology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。
术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体以大约小于10-8M，例如大约小于10-9M、10- 10M、10-11M、10-12M或更小的亲和力(KD)结合。
术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。通常，本公开的抗体以小于大约10-7M，例如小于大约10-8M或10-9M的解离平衡常数(KD)结合CTGF，例如，在本公开中抗体与细胞表面抗原的亲和力采用FACS法测定KD值。
当术语“竞争”用于竞争相同表位的抗原结合蛋白(例如中和抗原结合蛋白或中和抗体)的情况中时，意指在抗原结合蛋白之间竞争，其通过以下测定法来测定：在所述测定法中，待检测的抗原结合蛋白(例如抗体或其免疫学功能片段)防止或抑制(例如降低)参考抗原结合蛋白(例如配体或参考抗体)与共同抗原(例如CTGF抗原或其片段)的特异性结合。众多类型的竞争性结合测定可用于确定一种抗原结合蛋白是否与另一种竞争，这些测定例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见例如Stahli等，1983，Methodsin Enzymology 9：242-253)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见例如Kirkland等，1986，J.Immunol.137：3614-3619)、固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见例如Harlow和Lane，1988，Antibodies，ALaboratory Manual(抗体，实验室手册)，Cold Spring Harbor Press)；用I-125标记物的固相直接标记RIA(参见例如Morel等，1988，Molec.Immunol.25：7-15)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见例如Cheung，等，1990，Virology176：546-552)；和直接标记的RIA(Moldenhauer等，1990，Scand.J.Immunol.32：77-82)。通常所述测定法涉及使用结合荷有未标记的检测抗原结合蛋白及标记的参考抗原结合蛋白任一种的固态表面或细胞的纯化的抗原。通过测量在所测抗原结合蛋白存在下结合固态表面或细胞的标记的量来测量竞争性抑制。通常所测抗原结合蛋白过量存在。由竞争性测定(竞争抗原结合蛋白)鉴定的抗原结合蛋白包括：结合与参考抗原结合蛋白同一表位的抗原结合蛋白；和结合充分接近参考抗原结合蛋白的结合表位的邻近表位的抗原结合蛋白，所述两个表位在空间上互相妨碍发生结合。在本文实施例中提供关于用于测定竞争性结合的方法的其它详细资料。通常当竞争的抗原结合蛋白过量存在时，其将抑制(例如降低)至少40-45％、45-50％、50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％或75％或更多参考抗原结合蛋白与共同抗原的特异性结合。在某些情况下，结合被抑制至少80-85％、85-90％、90-95％、95-97％或97％或更多。
本文中使用的术语“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，优选是双链DNA或单链mRNA或修饰的mRNA。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。
氨基酸序列“同一性”指在比对氨基酸序列及必要时引入间隙，以达成最大序列同一性百分比，且不将任何保守性取代视为序列同一性的一部分，第一序列中与第二序列中的氨基酸残基同一的氨基酸残基的百分比。为测定氨基酸序列同一性百分比的目的，比对可以通过属于本领域技术的范围内的多种方式来实现，例如使用公开可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定适用于测量比对的参数，包括在所比较的序列全长上达成最大比对所需的任何算法。
术语“表达载体”是指能够运输已与其连接的另一个核酸的核酸分子。在一个实施方案中，载体是“质粒”，其是指可将另外的DNA区段连接至其中的环状双链DNA环。在另一个实施方案中，载体是病毒载体，其中可将另外的DNA区段连接至病毒基因组中。本文中公开的载体能够在已引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌的复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)或可在引入宿主细胞后整合入宿主细胞的基因组，从而随宿主基因组一起复制(例如，非附加型哺乳动物载体)。
现有技术中熟知生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法，如冷泉港的抗体实验技术指南，5-8章和15章。例如，鼠可以用人CTGF或其片段免疫，所得到的抗体能被复性、纯化，并且可以用常规的方法进行氨基酸测序。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。公开所述的抗体或抗原结合片段用基因工程方法在非人源的CDR区加上一个或更多个人源FR区。人FR种系序列可以通过比对IMGT人类抗体可变区种系基因数据库和MOE软件，从ImMunoGeneTics(IMGT)的网站http：//imgt.cines.fr得到，或者从免疫球蛋白杂志，2001ISBN012441351上获得。
术语“宿主细胞”是指已向其中引入了表达载体的细胞。宿主细胞可包括细菌、微生物、植物或动物细胞。易于转化的细菌包括肠杆菌科(enterobacteriaceae)的成员，例如大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢杆菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；链球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。适当的微生物包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)。适当的动物宿主细胞系包括CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)、293细胞和NS0细胞。
本公开工程化的抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。比如，编码重链和轻链的cDNA序列，可以克隆并重组至GS表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染CHO细胞。作为一种更推荐的现有技术，哺乳动物类表达系统会导致抗体的糖基化，特别是在Fc区的高度保守N端位点。通过表达与人CTGF特异性结合的抗体得到稳定的克隆。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化。比如，用含调整过的缓冲液的A或G Sepharose FF柱进行纯化。洗去非特异性结合的组分。再用pH梯度法洗脱结合的抗体，用SDS-PAGE检测抗体片段，收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛、离子交换。得到的产物需立即冷冻，如-70℃，或者冻干。
“施用”、“给予”和“处理”，当其应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“施用”、“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“施用”、“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“处理，”当其应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断应用。
“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂，例如包含本公开的任一种结合化合物的组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，以诱导这类症状退化或抑制这类症状发展到任何临床右测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在患者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。尽管本公开的实施方案(例如治疗方法或制品)在缓解每个目标疾病症状方面可能无效，但是根据本领域已知的任何统计学检验方法如Student t检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验确定，其在统计学显著数目的患者中应当减轻目标疾病症状。
“保守修饰”或“保守置换或取代”是指具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸，使得可频繁进行改变而不改变蛋白的生物学活性。本领域技术人员知晓，一般而言，多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等(1987)Molecular Biology ofthe Gene，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224页，(第4版))。另外，结构或功能类似的氨基酸的置换不大可能破环生物学活性。示例性保守取代于下方陈述。
Figure GPA0000313349910000191
“有效量”或“有效剂量”指指获得任一种或多种有益的或所需的治疗结果所必需的药物、化合物或药物组合物的量。对于预防用途，有益的或所需的结果包括消除或降低风险、减轻严重性或延迟病症的发作，包括病症、其并发症和在病症的发展过程中呈现的中间病理表型的生物化学、组织学和/或行为症状。对于治疗应用，有益的或所需的结果包括临床结果，诸如减少各种本公开靶抗原相关病症的发病率或改善所述病症的一个或更多个症状，减少治疗病症所需的其它药剂的剂量，增强另一种药剂的疗效，和/或延缓患者的本公开靶抗原相关病症的进展。
“外源性”指根据情况在生物、细胞或人体外产生的物质。“内源性”指根据情况在细胞、生物或人体内产生的物质。
“同源性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个DNA分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100的函数。例如，在序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60％同源；如果两个序列中的100个位置有95个匹配或同源，那么两个序列为95％同源。通常，当比对两个序列时进行比较以给出最大百分比同源性。例如，可以通过BLAST算法执行比较，其中选择算法的参数以在各个参考序列的整个长度上给出各个序列之间的最大匹配。以下参考文献涉及经常用于序列分析的BLAST算法：BLAST算法(BLAST ALGORITHMS)：Altschul，S.F.等人，(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；Gish，W.等人，(1993)Nature Genet.3：266-272；Madden，T.L.等人，(1996)Meth.Enzymol.266：131-141；Altschul，S.F.等人，(1997)Nucleic AcidsRes.25：3389-3402；Zhang，J.等人，(1997)Genome Res.7：649-656。其他如NCBI BLAST提供的常规BLAST算法也为本领域技术人员所熟知。
本文使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这类名称都包括后代。因此，单词“转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞和由其衍生的培养物，而不考虑转移数目。还应当理解的是，由于故意或非有意的突变，所有后代在DNA含量方面不可能精确相同。包括具有与最初转化细胞中筛选的相同的功能或生物学活性的突变后代。在意指不同名称的情况下，其由上下文清楚可见。
本文使用的“聚合酶链式反应”或“PCR”是指其中微量的特定部分的核酸、RNA和/或DNA如在例如美国专利号4,683,195中所述扩增的程序或技术。一般来说，需要获得来自目标区域末端或之外的序列信息，使得可以设计寡核苷酸引物；这些引物在序列方面与待扩增模板的对应链相同或相似。2个引物的5’末端核苷酸可以与待扩增材料的末端一致。PCR可用于扩增特定的RNA序列、来自总基因组DNA的特定DNA序列和由总细胞RNA转录的cDNA、噬菌体或质粒序列等。一般参见Mullis等(1987)Cold Spring HarborSymp.Ouant.Biol.51：263；Erlich编辑，(1989)PCR TECHNOLOGY(Stockton Press，N.Y.)。本文使用的PCR被视为用于扩增核酸测试样品的核酸聚合酶反应法的一个实例，但不是唯一的实例，所述方法包括使用作为引物的已知核酸和核酸聚合酶，以扩增或产生核酸的特定部分。
“分离的”指纯化状态，并且在这种情况下意味着在指定的分子基本上不含其他生物分子，例如核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物或其他材料，例如细胞碎片和生长培养基。通常，术语“分离的”并不意图指完全不存在这些材料或不存在水、缓冲液或盐，除非它们以显著干扰如本文所述的化合物的实验或治疗用途的量存在。
“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生的场合。
“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，所述其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
术语“药学上可接受的载体”指适合用于制剂中用于递送抗体或抗原结合片段的任何无活性物质。载体可以是抗粘附剂、粘合剂、包衣、崩解剂、充填剂或稀释剂、防腐剂(如抗氧化剂、抗菌剂或抗真菌剂)、增甜剂、吸收延迟剂、润湿剂、乳化剂、缓冲剂等。合适的药学上可接受的载体的示例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)右旋糖、植物油(例如橄榄油)、盐水、缓冲液、缓冲的盐水和等渗剂例如糖、多元醇、山梨糖醇和氯化钠。
此外，本公开包括用于治疗与目标抗原(例如CTGF)阳性细胞相关的疾病的药剂，所述药剂包含本公开的抗CTGF抗体或其抗原结合片段作为活性成分。活性成分以治疗有效量施与受试者，可以治疗受试者CTGF阳性细胞相关疾病。所述治疗有效量为单位剂量的组合物中含有0.1-3000mg的如前所述的特异性结合人GCGR的全长抗体或其抗原结合片段。
本公开中与CTGF相关的疾病没有限制，只要它是与CTGF相关的疾病即可，例如利用本公开的分子诱导的治疗反应可通过结合人类CTGF，然后阻遏CTGF与其受体/配体的结合，或杀伤过表达CTGF的肿瘤细胞。因此，当处于适于治疗应用的制备物和制剂中时，本公开的分子对这样一些人是非常有用的，他们患有肿瘤或癌症，可选地包括肺纤维化、肾纤维化、肿瘤形成和生长、青光眼、细胞增殖性疾病、白内障、脉络膜新血管形成、视网膜剥脱、增生性玻璃体视网膜病变、黄斑变性、糖尿病性视网膜病、角膜瘢痕形成和角膜浑浊、囊肿、减少血管钙化、胰腺导管腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、放射性纤维化(radiation-inducedfibrosis(RIF))、特发性肺纤维化、肺重塑疾病选自集团构成的哮喘、慢性支气管炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、囊性纤维化、肺气肿等，优选胰腺癌、肺纤维化、肾纤维化。
此外，本公开涉及用于免疫检测或测定目标抗原(例如CTGF)的方法、用于免疫检测或测定目标抗原(例如CTGF)的试剂、用于免疫检测或测定表达目标抗原(例如CTGF)的细胞的方法和用于诊断与目标抗原(例如CTGF)阳性细胞相关的疾病的诊断剂，其包含本公开的特异性识别目标抗原(例如人CTGF)并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的抗体或抗体片段作为活性成分。
在本公开中，用于检测或测定目标抗原(例如CTGF)的量的方法可以是任何已知方法。例如，它包括免疫检测或测定方法。
免疫检测或测定方法是使用标记的抗原或抗体检测或测定抗体量或抗原量的方法。免疫检测或测定方法的实例包括放射性物质标记的免疫抗体方法(RIA)、酶免疫测定法(EIA或ELISA)、荧光免疫测定法(FIA)、发光免疫测定法、蛋白质免疫印迹法、物理化学方法等。
上述与CTGF阳性细胞相关的疾病可以通过用本公开的抗体或抗体片段检测或测定表达CTGF的细胞来诊断。
为了检测表达多肽的细胞，可以使用已知的免疫检测方法，并优选使用免疫沉淀法、荧光细胞染色法、免疫组织染色法等。此外，可以使用利用FMAT8100HTS系统(AppliedBiosystem)的荧光抗体染色法等。
在本公开中，对用于检测或测定目标抗原(例如CTGF)的活体样品没有特别限制，只要它具有包含表达目标抗原(例如CTGF)的细胞的可能性即可，例如组织细胞、血液、血浆、血清、胰液、尿液、粪便、组织液或培养液。
根据所需的诊断方法，含有本公开的单克隆抗体或其抗体片段的诊断剂还可以含有用于执行抗原-抗体反应的试剂或用于检测反应的试剂。用于执行抗原-抗体反应的试剂包括缓冲剂、盐等。用于检测的试剂包括通常用于免疫检测或测定方法的试剂，例如识别所述单克隆抗体、其抗体片段或其结合物的标记的第二抗体和与所述标记对应的底物等。
在以上说明书中提出了本公开一种或多种实施方式的细节。虽然可使用与本文所述类似或相同的任何方法和材料来实施或测试本公开，但是以下描述优选的方法和材料。通过说明书和权利要求书，本公开的其他特点、目的和优点将是显而易见的。在说明书和权利要求书中，除非上下文中有清楚的另外指明，单数形式包括复数指代物的情况。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语都具有本公开所属领域普通技术人员所理解的一般含义。说明书中引用的所有专利和出版物都通过引用纳入。提出以下实施例是为了更全面地说明本公开的优选实施方式。这些实施例不应以任何方式理解为限制本公开的范围，本公开的范围由权利要求书限定。
实施例
实施例1.CTGF抗原、抗体的制备
一、抗原的设计及表达
以人CTGF蛋白(Genbank编号：NM_001901.2)作为模板，设计抗原及检测用蛋白的氨基酸序列，可选的在CTGF蛋白或者片段上融合不同的标签，分别克隆到pTT5载体上或pXC载体上，在293细胞瞬转表达或LONZA CHO细胞稳定表达，获得编码本公开抗原及检测用蛋白。以下CTGF抗原未特殊说明的均指人CTGF。
人CTGF全长蛋白(用于免疫)，SEQ ID NO：1)
Figure GPA0000313349910000221
CTGF-his(人CTGF成熟蛋白与his标签的融合蛋白)，可用于检测，SEQ ID NO：2
Figure GPA0000313349910000222
Figure GPA0000313349910000231
(备注：单下划线为信号肽，斜体为人CTGF编码区，双下划线为his标签。)
mCTGF-mFc(小鼠CTGF编码区与小鼠Fc标签的融合蛋白，可用于检测)SEQ ID NO：3
Figure GPA0000313349910000232
(备注：单下划线为信号肽，斜体为小鼠CTGF编码区，双下划线为mFc标签。)
小鼠CTGF蛋白-His标签，SEQ ID NO：4
Figure GPA0000313349910000233
(备注：单下划线为信号肽，斜体为小鼠CTGF编码区，双下划线为his标签。)
食蟹猴CTGF-Fc(食蟹猴CTGF编码区与Fc的融合蛋白，可用于检测)，SEQ ID NO：5
Figure GPA0000313349910000234
Figure GPA0000313349910000241
(备注：单下划线为信号肽，斜体食蟹猴CTGF编码区，双下划线为Fc标签。)
二、CTGF相关重组蛋白的纯化，以及抗人CTGF杂交瘤抗体、重组抗体的纯化
1.ProteinG亲和层析分离纯化杂交瘤上清
对于小鼠杂交瘤上清纯化，首选ProteinG进行亲和层析，将培养所得杂交瘤离心取上清，根据上清体积加入10-15％体积的1M Tris-HCl(pH8.0-8.5)调节上清pH至中性。利用6M盐酸胍，将ProteinG柱洗3-5倍柱体积，然后利用纯水清洗3-5倍柱体积；利用如1×PBS(pH7.4)对层析柱平衡3-5倍柱体积；细胞上清利用低流速上样结合，控制流速使保留时间约1min或更长时间；利用1×PBS(pH7.4)洗涤层析柱3-5倍柱体积至紫外吸收回落至基线；利用0.1M醋酸/醋酸钠(pH3.0)缓冲液进行样品洗脱，根据紫外检测收集洗脱峰，洗脱产物利用1M Tris-HCl(pH8.0)快速调节洗脱产物的pH至5-6。可以利用本领域技术人员熟知的方法，对洗脱产物进行溶液置换，如利用超滤管进行超滤浓缩及溶液置换至所需的缓冲体系，或者利用分子排阻如G-25脱盐替换成所需的缓冲体系，或者利用如Superdex 200等高分辨率分子排阻柱去除洗脱产物中的聚体成分以提高样品纯度。
2.Protein A亲和层析纯化抗体
首先将表达抗体的细胞培养上清进行高速离心收取上清。利用6M盐酸胍将ProteinA亲和柱洗3-5倍柱体积，然后利用纯水清洗3-5倍柱体积。利用如1×PBS(pH7.4)对层析柱平衡3-5倍柱体积。细胞上清利用低流速上样结合，控制流速使保留时间约1min或更长时间，结合完毕后利用1×PBS(pH7.4)洗涤层析柱3-5倍柱体积至紫外吸收回落至基线。利用0.1M醋酸/醋酸钠(pH3.0-3.5)缓冲液进行样品洗脱，根据紫外检测收集洗脱峰，洗脱产物利用1M Tris-HCl(pH8.0)快速调节洗脱产物的pH至5-6。可以利用本领域技术人员熟知的方法，对洗脱产物进行溶液置换，如利用超滤管进行超滤浓缩及溶液置换至所需的缓冲体系，或者利用分子排阻如G-25脱盐替换成所需的缓冲体系，或者利用如Superdex 200等高分辨率分子排阻柱去除洗脱产物中的聚体成分以提高样品纯度。
3.镍柱纯化人CTGF-his等CTGF相关重组蛋白
将细胞表达上清样品高速离心去除杂质，并将缓冲液置换为PBS，加入咪唑至终浓度为5mM。用含有5mM咪唑的PBS溶液平衡镍柱，冲洗2-5倍柱体积。将置换后的上清样品上柱结合，介质可以选择不同公司的镍柱。用含有5mM咪唑的PBS溶液冲洗柱子，至A280读数降至基线。后用PBS+10mM咪唑冲洗层析柱，除去非特异结合的杂蛋白，并收集流出液。再用含有300mM咪唑的PBS溶液洗脱目的蛋白，并收集洗脱峰。
收集的洗脱产物浓缩后可用凝胶层析Superdex200(GE)进一步纯化，流动相为PBS，去除聚体及杂蛋白峰，收集目的产物洗脱峰。所得到的蛋白经电泳，肽图，LC-MS鉴定为正确后分装备用。
4.Protein A亲和层析纯化人CTGF-Fc，食蟹猴CTGF-Fc等CTGF相关重组蛋白
首先将培养上清进行高速离心收取上清。利用6M盐酸胍将ProteinA亲和柱洗3-5倍柱体积，然后利用纯水清洗3-5倍柱体积。利用如1×PBS(pH7.4)对层析柱平衡3-5倍柱体积。细胞上清利用低流速上样结合，控制流速使保留时间约1min或更长时间，结合完毕后利用1×PBS(pH7.4)洗涤层析柱3-5倍柱体积至紫外吸收回落至基线。利用0.1M醋酸/醋酸钠(pH3.0-3.5)缓冲液进行样品洗脱，根据紫外检测收集洗脱峰。
收集的洗脱产物浓缩后可用凝胶层析Superdex200(GE)进一步纯化，流动相为PBS，去除聚体及杂蛋白峰，收集目的产物洗脱峰。所得到的蛋白经电泳，肽图，LC-MS鉴定为正确后分装备用。
实施例2.抗人CTGF单克隆抗体的制备
一、免疫
抗人CTGF单克隆抗体通过免疫小鼠产生。实验用SJL白小鼠，雌性，6-8周龄(北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK(京)2012-0001)。饲养环境：SPF级。小鼠购进后，实验室环境饲养1周，12/12小时光/暗周期调节，温度20-25℃；湿度40-60％。将已适应环境的小鼠按以下方案免疫。免疫抗原为CTGF(R&D)和mCTGF-mFc。
免疫方案：用CTGF蛋白进行小鼠免疫，25微克/只/次，腹腔内注射。第0天腹膜内(IP)注射100μl/只，之后每14天进行一次加强免疫。于第21、35、49、63天取血，用ELISA方法确定小鼠血清中的抗体滴度。在7-9次免疫以后，选择血清中抗体滴度高并且滴度趋于平台的小鼠进行脾细胞融合。在进行脾细胞融合前3天加强免疫，腹膜内(IP)注射25μg/只的生理盐水配制的CTGF蛋白抗原溶液。
二、脾细胞融合
采用PEG介导的融合步骤将脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0(
Figure GPA0000313349910000251
CRL-8287TM)进行融合得到杂交瘤细胞。融合好的杂交瘤细胞以0.5-1×106/ml的密度用完全培养基(含20％FBS、1×HAT、1×OPI的IMDM培养基)重悬，100μl/孔接种于96孔板中，37℃，5％CO2孵育3-4天后，补充HAT完全培养基100μl/孔，继续培养3-4天至形成针尖般克隆。去除上清，加入200μl/孔的HT完全培养基(含20％FBS、1×HT和1×OPI的IMDM培养基)，37℃，5％CO2培养3天后进行ELISA检测。
三、杂交瘤细胞的筛选
根据杂交瘤细胞生长密度，用结合ELISA方法进行杂交瘤培养上清检测。并将结合ELISA检测的阳性孔细胞上清与猴CTGF/小鼠CTGF/人CTGF蛋白结合实验(具体方法实施例3相同)。对蛋白ELISA结合实验为阳性的孔细胞及时进行扩增冻存保种及2到3次亚克隆直至获得单细胞克隆。
每次亚克隆细胞也均需进行CTGF结合ELISA。通过以上实验筛选得到杂交瘤克隆，用无血清细胞培养法进一步制备抗体，按纯化实例纯化抗体，供在检测例中使用。
四、杂交瘤阳性克隆序列测定
从阳性杂交瘤中克隆序列的过程如下。收集对数生长期的杂交瘤细胞，用Trizol(Invitrogen，Cat No.15596-018)按照试剂盒说明书步骤提取RNA，用PrimeScriptTMReverse Transcriptase试剂盒反转录(Takara，Cat No.2680A)。将反转录得到的cDNA采用mouse Ig-Primer Set(Novagen，TB326 Rev.B 0503)进行PCR扩增后，将扩增产物送测序公司测序。经测序得到鼠源抗CTGF抗体：mab147、mab164、mab95的可变区氨基酸序列如下：
mab147 VH氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，
Figure GPA0000313349910000261
mab147 VL氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，
Figure GPA0000313349910000262
mab164 VH氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，
Figure GPA0000313349910000263
mab164 VL氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，
Figure GPA0000313349910000264
mab95 VH氨基酸序列如SEQ ID NO：69所示，
Figure GPA0000313349910000265
mab95 VL氨基酸序列如SEQ ID NO：70所示，
Figure GPA0000313349910000266
上述mab147、mab164、mab95抗体可变区序列中，斜体为FR序列，下划线斜体为CDR序列，序列顺序依次为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
表4.抗CTGF抗体重链及轻链CDR区氨基酸序列表*
Figure GPA0000313349910000271
*表格中CDR由Kabat编号规则确定。
五、人IgG1嵌合抗体制备
mab147、mab164、mab95候选分子经过扩增测序可得到可变区编码基因序列，以测序所得序列设计首尾引物，以测序基因为模板，经过PCR搭建各抗体VH/VK基因片段，再与表达载体pHr(带信号肽及hIgG1/hkappa/hlambda恒定区基因(CH1-Fc/CL)片段)进行同源重组，构建重组嵌合抗体的全长表达质粒VH-CH1-Fc-pHr/VL-CL-pHr，形成Ch147，Ch164，Ch95三个嵌合抗体。
六、鼠源抗人CTGF抗体的人源化
通过比对IMGT(http：//imgt.cines.fr)人类抗体重轻链可变区种系基因数据库和MOE(Molecular Operating Environment，分子操作环境)软件，分别挑选与鼠源抗体同源性高的重链和轻链可变区种系基因作为模板，将鼠源抗体的CDR分别移植到相应的人源模板中，形成次序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可变区序列。
1.mab147的人源化改造
鼠源抗体mab147的人源化轻链模板为IGKV3-11*01和IGKJ2*01或IGKV1-39*01和IGKJ2*01，人源化重链模板为IGHV3-72*01和IGHJ1*01，将鼠源抗体mab147的CDR分别移植到其人源模板中，进而，对人源化抗体的FR部分氨基酸进行回复突变改造，其中轻链可变区回复突变包括4L、36F、43S、45K、47W、58V或71Y中的一个或更多个，重链可变区回复突变包括28S、30N、49A、75E、76S、93V、94E或104D中的一个或更多个(轻链可变区和重链可变区中的回复突变位点的位置根据Kabat编号规则确定)，得到具有不同序列的轻链可变区和重链可变区。即获得含有mab147的CDR的人源化抗体，其可变区序列如下：
mAb147人源化抗体可变区具体序列如下：
Hu147-VL1氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示：
Figure GPA0000313349910000281
Hu147-VL2氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示：
Figure GPA0000313349910000282
Hu147-VL3氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示：
Figure GPA0000313349910000283
Hu147-VL4氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示：
Figure GPA0000313349910000284
Hu147-VL5氨基酸序列如SEQ ID NO：26所示：
Figure GPA0000313349910000285
Hu147-VH1氨基酸序列如SEQ ID NO：27所示：
Figure GPA0000313349910000286
Hu147-VH2氨基酸序列如SEQ ID NO：28所示：
Figure GPA0000313349910000287
Hu147-VH3氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示：
Figure GPA0000313349910000288
注：下划线为以Kabat规则定义的CDR序列，顺序依次为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
2.mab164的人源化改造
鼠源抗体mab164的人源化轻链模板分别由IGLV7-43*01和IGLJ2*01、IGLV8-61*01和IGLJ2*01，或IGLV1-40*02和IGLJ2*01构成，人源化重链模板分别由IGHV2-26*01和IGHJ6*01，或IGHV4-31*02和IGHJ6*01构成，将鼠源抗体mab164的CDR分别移植到其人源模板中，进而，对人源化抗体的FR部分氨基酸进行回复突变改造，其中轻链可变区回复突变包括36V、44F、46G或49G中的一个或更多个，重链可变区回复突变包括44G、49G、27F、48L、67L、71K、78V或80F中的一个或更多个(其中的回复突变位点的位置根据Kabat编号规则确定)，即获得mab164的人源化抗体重链，人源化抗体轻链，其可变区序列如下：
mAb164人源化抗体可变区具体序列如下：
Hu164-VL7氨基酸序列如SEQ ID NO：30所示：
Figure GPA0000313349910000291
Hu164-VL8氨基酸序列如SEQ ID NO：31所示：
Figure GPA0000313349910000292
Hu164-VL9氨基酸序列如SEQ ID NO：32所示：
Figure GPA0000313349910000293
Hu164-VH5氨基酸序列如SEQ ID NO：33所示：
Figure GPA0000313349910000294
Hu164-VH6氨基酸序列如SEQ ID NO：34所示：
Figure GPA0000313349910000295
Hu164-VH7氨基酸序列如SEQ ID NO：35所示：
Figure GPA0000313349910000296
Hu164-VH8氨基酸序列如SEQ ID NO：36所示：
Figure GPA0000313349910000297
注：上述Hu164抗体序列中，下划线为CDR序列，顺序依次为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中的CDR序列根据Kabat规则进行定义。
3.mab95的人源化改造
鼠源抗体mab95的人源化轻链模板为IGKV3-20*02和IGKV1-40*01，人源化重链模板为IGHV1-3*01，将鼠源抗体mab95的CDR分别移植到其人源模板中，进而，对人源化抗体的FR部分氨基酸进行回复突变改造，其中轻链可变区回复突变包括45P、46W、48Y、69S或70Y中的一个或更多个，重链可变区回复突变包括27F、38K、48I、67K、68A、70L或72F中的一个或更多个(轻链可变区和重链可变区中的回复突变位点的位置根据Kabat编号规则确定)，得到具有不同序列的轻链可变区和重链可变区。即获得含有mab95的CDR的人源化抗体，其可变区序列如下：
mAb95人源化抗体可变区具体序列如下：
Hu95-VL1氨基酸序列如SEQ ID NO：77所示：
Figure GPA0000313349910000301
Hu95-VL2氨基酸序列如SEQ ID NO：78所示：
Figure GPA0000313349910000302
Hu95-VL3氨基酸序列如SEQ ID NO：79所示：
Figure GPA0000313349910000303
Hu95-VL4氨基酸序列如SEQ ID NO：80所示：
Figure GPA0000313349910000304
Hu95-VH1氨基酸序列如SEQ ID NO：81所示：
Figure GPA0000313349910000305
Hu95-VH2氨基酸序列如SEQ ID NO：82所示：
Figure GPA0000313349910000306
Hu95-VH3氨基酸序列如SEQ ID NO：83所示：
Figure GPA0000313349910000307
Hu95-VH4氨基酸序列如SEQ ID NO：84所示：
Figure GPA0000313349910000308
Hu95-VH5氨基酸序列如SEQ ID NO：85所示：
Figure GPA0000313349910000309
注：下划线为以Kabat规则定义的CDR序列，顺序依次为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
其中，Hu95-VH5的CDR区进行了进一步的修饰，其HCDR1如SEQ ID NO：102(NYAIH)所示，HCDR2如SEQ ID NO：103(LVYPYTGGTAYNQKFKD)所示，HCDR3如SEQ ID NO：104(WGMIPGTNSYFDV)所示。
4.抗CTGF人源化全长抗体的构建和表达
设计引物PCR搭建各人源化抗体VH/VL基因片段，再与表达载体pHr(带信号肽及恒定区基因(CH/CL)片段)进行同源重组，构建抗体全长表达载体VH-CH-pHr/VL-CL-pHr。所述人源化抗体的恒定区可选自人κ、λ链轻链恒定区，以及选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区，非限制性实施包括对人IgG1、IgG2、IgG4的恒定区进行优化设计，改善抗体功能，如恒定区的M252Y/S254T/T256E(”YTE”)位点突变可以延长抗体的半衰期，S228P、F234A和L235A等其他恒定区位点突变等。
示例性的抗CTGF人源化抗体恒定区序列如下：
重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO：37所示(所形成的全长抗体重链的名称后缀为w)：
Figure GPA0000313349910000311
YTE改造抗体的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO：38所示(所形成全长抗体重链的名称后缀为y)：
Figure GPA0000313349910000312
抗CTGF人源化抗体的轻链kappa恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO：39所示(所形成全长抗体重链的名称后缀为k)：
Figure GPA0000313349910000313
抗CTGF人源化抗体轻链lambda恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO：40所示(所形成全长抗体重链的名称后缀为l)：
Figure GPA0000313349910000321
人源化抗体的重链可变区与SEQ ID NO：37所示的重链恒定区连接，以及人源化抗体的轻链可变区与SEQ ID NO：39所示的轻链kappa恒定区连接形成的来源自mab147的全长人源化抗体包括：
表5
Hu147-VL1 Hu147-VL2 Hu147-VL3 Hu147-VL4 Hu147-VL5
Hu147-VH1 Hu147-11wk Hu147-12wk Hu147-13wk Hu147-14wk Hu147-15wk
Hu147-VH2 Hu147-21wk Hu147-22wk Hu147-23wk Hu147-24wk Hu147-25wk
Hu147-VH3 Hu147-31wk Hu147-32wk Hu147-33wk Hu147-34wk Hu147-35wk
人源化抗体重链的可变区与SEQ ID NO：38所示的重链恒定区YTE变体连接，以及人源化抗体的轻链可变区与SEQ ID NO：39所示的轻链kappa恒定区连接形成的来源自mab147的全长人源化抗体包括：
表6
Hu147-VL1 Hu147-VL2 Hu147-VL3 Hu147-VL4 Hu147-VL5
Hu147-VH1 Hu147-11yk Hu147-12yk Hu147-13yk Hu147-14yk Hu147-15yk
Hu147-VH2 Hu147-21yk Hu147-22yk Hu147-23yk Hu147-24yk Hu147-25yk
Hu147-VH3 Hu147-31yk Hu147-32yk Hu147-33yk Hu147-34yk Hu147-35yk
人源化抗体重链可变区与SEQ ID NO：37所示的重链恒定区连接，以及人源化抗体轻链可变区与SEQ ID NO：40所示的轻链lambda恒定区连接形成的来源自mab164的全长人源化抗体包括：
表7
Hu164-VH5 Hu164-VH6 Hu164-VH7 Hu164-VH8
Hu164-VL7 Hu164-57wl Hu164-67wl Hu164-77wl Hu164-87wl
Hu164-VL8 Hu164-58wl Hu164-68wl Hu164-78wl Hu164-88wl
Hu164-VL9 Hu164-59wl Hu164-69wl Hu164-79wl Hu164-89wl
人源化抗体重链可变区与SEQ ID NO：38所示的重链恒定区YTE变体连接，以及人源化抗体轻链可变区与SEQ ID NO：40所示的轻链lambda恒定区连接形成的来源自mab164的全长人源化抗体包括：
表8
Hu164-VH5 Hu164-VH6 Hu164-VH7 Hu164-VH8
Hu164-VL7 Hu164-57yl Hu164-67yl Hu164-77yl Hu164-87yl
Hu164-VL8 Hu164-58yl Hu164-68yl Hu164-78yl Hu164-88yl
Hu164-VL9 Hu164-59yl Hu164-69yl Hu164-79yl Hu164-89yl
人源化抗体重链可变区与SEQ ID NO：37所示的重链恒定区连接，以及人源化抗体轻链可变区与SEQ ID NO：39所示的轻链kappa恒定区连接形成的来源自mab95的全长人源化抗体包括：
表9
Hu95-VH1 Hu95-VH2 Hu95-VH3 Hu95-VH4 Hu95-VH5
Hu95-VL1 Hu95-11wk Hu95-21wk Hu95-31wk Hu95-41wk Hu95-51wk
Hu95-VL2 Hu95-12wk Hu95-22wk Hu95-32wk Hu95-42wk Hu95-52wk
Hu95-VL3 Hu95-13wk Hu95-23wk Hu95-33wk Hu95-43wk Hu95-53wk
Hu95-VL4 Hu95-14wk Hu95-24wk Hu95-34wk Hu95-44wk Hu95-54wk
人源化抗体重链可变区与SEQ ID NO：38所示的重链恒定区YTE变体连接，以及人源化抗体轻链可变区与SEQ ID NO：39所示的轻链kappa恒定区连接形成的来源自mab95的全长人源化抗体包括：
表10
Hu95-VH1 Hu95-VH2 Hu95-VH3 Hu95-VH4 Hu95-VH5
Hu95-VL1 Hu95-11yk Hu95-21yk Hu95-31yk Hu95-41yk Hu95-51yk
Hu95-VL2 Hu95-12yk Hu95-22yk Hu95-32yk Hu95-42yk Hu95-52yk
Hu95-VL3 Hu95-13yk Hu95-23yk Hu95-33yk Hu95-43yk Hu95-53yk
Hu95-VL4 Hu95-14yk Hu95-24yk Hu95-34yk Hu95-44yk Hu95-54yk
示例性的抗CTGF抗体全长氨基酸序列如下：
表11全长抗体的轻链或重链
Figure GPA0000313349910000331
Figure GPA0000313349910000341
Figure GPA0000313349910000351
Figure GPA0000313349910000361
Figure GPA0000313349910000371
Figure GPA0000313349910000381
Figure GPA0000313349910000391
Figure GPA0000313349910000401
Figure GPA0000313349910000411
作为阳性对照的CTGF抗体mAb1(来源自CN1829740B，抗体名称为pamrevlumab，又名为FG-3019)的序列如下：
重链：(SEQ ID NO：67)
Figure GPA0000313349910000412
轻链：(SEQIDNO：68)
Figure GPA0000313349910000413
实施例3.CTGF抗体的结合活性检测
一、CTGF抗体结合人CTGF蛋白的ELISA实验
抗人CTGF抗体的结合力通过抗体与人CTGF蛋白的ELISA实验和Biacore来检测。用CTGF重组蛋白直接包被在96孔酶标板中，抗体加入后信号的强弱被用于判断抗体和CTGF的结合活性。具体实验方法如下：
用pH7.4的PBS(上海源培，Cat No.B320)缓冲液将CTGF蛋白(R&D，Cat No.9190-CC)稀释至0.2μg/ml浓度，以50μl/孔的体积加入96孔酶标板(Corning，Cat No.CLS3590-100EA)中，于37℃孵育箱中放置2小时或4℃放置过夜(16-18小时)。弃去液体后，加入用PBS稀释的5％脱脂牛奶(BD skim milk，Cat No.232100)封闭液250μl/孔，37℃孵育箱孵育3小时或4℃放置过夜(16-18小时)进行封闭。封闭结束后，弃去封闭液，并用PBST缓冲液(含0.1％Tween-20的PBS，pH7.4)洗板5次后，加入50μl/孔用样品稀释液稀释的不同浓度待测抗体(杂交瘤纯化抗体或人源化抗体)，放于37℃孵育箱孵育1小时。孵育结束后用PBST洗板3次，加入50μl/孔用样品稀释液稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.115-035-003)或羊抗人二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.109-035-003)，37℃孵育1小时。用PBST洗板3次后，加入50μl/孔TMB显色底物(KPL，Cat No.52-00-03)，于室温孵育5-10min，加入50μl/孔1M H2SO4终止反应，用酶标仪(Molecular Devices，VERSAmax)在波长450nm处读取吸收值，用GraphPad Prism 5分析数据，计算CTGF抗体对人CTGF蛋白的结合EC50值。实验结果见图1及表12所示。
表12.CTGF抗体结合人CTGF蛋白ELISA实验结果
Figure GPA0000313349910000421
实验结果显示，本公开的人源化全长抗CTGF抗体均与人CTGF蛋白有很好的结合作用。
二、CTGF抗体结合食蟹猴CTGF蛋白的ELISA实验
抗猴CTGF抗体的结合力通过抗体与猴CTGF蛋白的ELISA实验来检测。用抗-mFc蛋白直接包被在96孔酶标板中，后续用带有Fc标签的cyno-CTGF蛋白与板子结合，然后加入抗体加入后信号的强弱被用于判断抗体和cyno-CTGF的结合活性。具体实验方法如下：
用pH7.4的PBS(上海源培，Cat No.B320)缓冲液将抗-mFc蛋白(Sigma，CatNo.M4280)稀释至2μg/ml浓度，以50μl/孔的体积加入96孔酶标板(Corning，CatNo.CLS3590-100EA)中，于37℃孵育箱中放置2小时。弃去液体后，加入用PBS稀释的5％脱脂牛奶(BD skim milk，Cat No.232100)封闭液250μl/孔，37℃孵育箱孵育3小时或4℃放置过夜(16-18小时)进行封闭。封闭结束后，弃去封闭液，并用PBST缓冲液(含0.1％Tween-20的PBS，pH7.4)洗板3次后，每孔加入50μl的1μg/ml的cyno-CTGF-mFc蛋白，37℃孵育箱孵育1小时后，用PBST缓冲液(含0.1％Tween-20的PBS，pH7.4)洗板3次后，加入50μl/孔用样品稀释液稀释的不同浓度待测抗体(杂交瘤纯化抗体或人源化抗体)，放于37℃孵育箱孵育1小时。孵育结束后用PBST洗板3次，加入50μl/孔用样品稀释液稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.115-035-003)或羊抗人二抗(Jackson ImmunoResearch，Cat No.109-035-003)，37℃孵育1小时。用PBST洗板5次后，加入50μl/孔TMB显色底物(KPL，CatNo.52-00-03)，于室温孵育5-10min，加入50μl/孔1M H2SO4终止反应，用酶标仪(Molecular Devices，VERSA max)在波长450nm处读取吸收值，用GraphPad Prism 5分析数据，计算CTGF抗体对食蟹猴CTGF蛋白的结合EC50值。实验结果见表13所示。
表13.CTGF抗体结合食蟹猴CTGF蛋白ELISA实验结果
Figure GPA0000313349910000431
实验结果表明，本公开的人源化抗CTGF抗体均与猴CTGF蛋白有很好的结合作用。
三、CTGF抗体与小鼠CTGF蛋白的ELISA实验
抗小鼠CTGF抗体的结合力通过抗体与小鼠CTGF蛋白的ELISA实验来检测。用小鼠-CTGF融合蛋白直接包被在96孔酶标板中，抗体加入后信号的强弱被用于判断抗体和小鼠-CTGF的结合活性。具体实验方法如下：
用pH7.4的PBS(上海源培，Cat No.B320)缓冲液将小鼠CTGF-his蛋白稀释至0.5μg/ml浓度，以50μl/孔的体积加入96孔酶标板(Corning，Cat No.CLS3590-100EA)中，于37℃孵育箱中放置2小时。弃去液体后，加入用PBS稀释的5％脱脂牛奶(BD skim milk，CatNo.232100)封闭液250μl/孔，37℃孵育箱孵育3小时或4℃放置过夜(16-18小时)进行封闭。封闭结束后，弃去封闭液，并用PBST缓冲液(pH7.4 PBS含0.1％tween-20)洗板3次后，加入50μl/孔用样品稀释液稀释的不同浓度待测抗体(杂交瘤纯化抗体或人源化抗体)，放于37℃孵育箱孵育1小时。孵育结束后用PBST洗板3次，加入50μl/孔用样品稀释液稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.115-035-003)或羊抗人二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.109-035-003)，37℃孵育1小时。用PBST洗板5次后，加入50μl/孔TMB显色底物(KPL，Cat No.52-00-03)，于室温孵育5-10min，加入50μl/孔1MH2SO4终止反应，用酶标仪(Molecular Devices，VERSA max)在波长450nm处读取吸收值，用GraphPad Prism 5分析数据，计算CTGF抗体对小鼠CTGF蛋白的结合EC50值。实验结果见表14所示。
表14.CTGF抗体结合小鼠CTGF蛋白ELISA实验结果
Figure GPA0000313349910000441
实验结果表明，本公开的人源化全长抗CTGF抗体均与小鼠CTGF蛋白有很好的结合作用。
实施例4.CTGF抗体的功能阻断实验
该试验用Biacore仪器检测待测人源化抗CTGF抗体对人TGF-β1功能的阻断活性。
首先将抗原人CTGF以氨基偶联的方式固定到CM5生物传感芯片(Cat.#BR-1005-30，GE)上，固化水平1500RU，然后于芯片表面流经高浓度的CTGF抗体(150μg/ml)150s，再进样50nM TGF-β1蛋白120s，用Biacore T200仪器实时检测反应信号获得结合和解离曲线。在每个试验循环解离完成后，用再生缓冲液将生物传感芯片洗净再生。
试验得到的数据用GE Biacore T200 Evaluation version 3.0软件进行统计分析。
阻断效率(Blocking efficiency)＝[1-(样品响应值/空白对照响应值)]×100％。
具体结果见表15所示。
表15.CTGF抗体的功能阻断实验结果
Figure GPA0000313349910000442
Figure GPA0000313349910000451
试验结果表明，本公开的人源化抗CTGF抗体均具有高功能阻断活性。
抗CTGF抗体亲和力的Biacore测定
该试验用Biacore仪器测定待测人源化抗CTGF抗体与人CTGF、小鼠CTGF的亲和力。
分别用Protein A生物传感芯片(Cat.#29127556，GE)亲和捕获一定量的待测抗体，然后于芯片表面流经一定浓度的人、鼠CTGF抗原，利用Biacore仪器实时检测反应信号从而获得结合和解离曲线。在每个循环解离完成后，pH1.5的甘氨酸-盐酸再生溶液(Cat.#BR-1003-54，GE)将生物芯片洗净再生。试验运行缓冲液为1×HBS-EP缓冲溶液(Cat.#BR-1001-88，GE)。
试验得到的数据用GE Biacore T200 Evaluation version 3.0软件以(1∶1)Langmuir模型进行拟合，得出亲和力数值，具体见表16、17所示。
表16.CTGF抗体与人CTGF蛋白的反应亲和力
Figure GPA0000313349910000452
Figure GPA0000313349910000461
表17.CTGF抗体与小鼠CTGF蛋白的反应亲和力
抗体 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
Ch147 3.12E+07 3.84E-02 1.23E-09
Ch164 1.23E+08 1.01E-02 8.22E-11
Ch95 1.38E+07 2.35E-02 1.71E-09
Hu147-11wk 1.20E+08 3.74E-01 3.11E-09
Hu147-12wk 3.75E+07 1.16E-01 3.09E-09
Hu147-13wk 5.73E+07 1.46E-01 2.55E-09
Hu147-23wk 8.18E+07 1.73E-01 2.12E-09
Hu147-31wk 3.83E+07 1.07E-02 2.79E-09
Hu147-32wk 1.37E+08 3.43E-01 2.49E-09
Hu147-33wk 9.01E+07 1.74E-01 1.93E-09
Hu164-57wl 7.35E+07 2.37E-03 3.22E-11
Hu164-67wl 6.36E+07 1.17E-03 1.84E-11
Hu164-67yl 5.34E+07 1.94E-03 3.63E-11
Hu164-77wl 5.98E+07 8.83E-03 1.48E-10
Hu164-87wl 5.24E+07 4.40E-03 8.40E-11
Hu164-68wl 5.70E+07 7.60E-03 1.33E-10
Hu164-69wl 6.17E+07 7.74E-03 1.26E-10
Hu95-21wk 5.29E+06 2.11E-02 3.99E-09
Hu95-31wk 7.84E+06 2.25E-02 2.87E-09
Hu95-41wk 1.39E+07 3.39E-02 2.44E-09
Hu95-42wk 5.66E+06 1.37E-02 2.42E-09
Hu95-51yk 2.56E+07 5.16E-04 2.02E-11
试验结果表明，来源自鼠源抗体mAb147和mAb164的嵌合抗体Ch147和Ch164及人源化抗CTGF抗体均能与人CTGF和小鼠CTGF以高亲和力结合，多种人来源抗体种系FR区的替换和回复突变改造均不影响人源化抗体的亲和力，部分改造甚至会增强抗体与抗原的亲和力。
实施例5.CTGF抗体对TGFβ诱导的C2C12细胞体外迁移抑制实验
C2C12细胞(小鼠成肌细胞，中科院细胞库，#GNM26)用0.25％胰酶(Gibco，#25200-072)消化，离心后用无血清的DMEM培养基(Gibco，#10564-029)重悬。用无血清的DMEM培养基配制细胞-抗体混合物及TGFβ1-抗体混合物，细胞密度为2×105/ml，重组人TGFβ1(Cellsignaling Technology，#8915LC)浓度为10ng/ml，待测抗体浓度均为30μg/ml。
打开
Figure GPA0000313349910000471
Disposable Chemotaxis System(Neuro Probe，#106-8)的上盖及过滤膜，将TGFβ-抗体混合物加入下室中，每孔30μl，每组4副孔。盖上过滤膜，在膜上加细胞-抗体混合物，每孔加入50μl，每组4副孔。盖上上盖，置于培养箱(37℃，5％CO2)中。
孵育48小时后，用干净纸巾吸去过滤膜上液体，打开过滤膜，向下室中每孔加入10μl预冷的0.25％胰酶，盖上过滤膜。消化5分钟后，1000rpm离心1分钟。打开过滤膜，向下室中每孔加入20μl Cell Titer-Glo溶液(Promega，#G7573)，室温孵育10分钟。将液体转移至384孔白底板(Thermo Scientific，#267462)中，用酶标仪(BMG，#PheraStar)采用化学发光法读板。用Graphpad Prism 6对数据进行分析处理。
抑制率＝[(TGFβ平均值-样品组平均值)/(TGFβ组平均值-未处理组平均值)]×100％
实验结果见表18。
表18.CTGF抗体对C2C12细胞体外迁移实验的抑制结果
受试样品 对C2C12细胞体外迁移的抑制百分比(％)
Hu147-11wk 72.2％
Hu147-33wk 63.8％
Hu164-57wl 75.4％
Hu164-67wl 78.8％
Hu164-67yl 76.5％
Hu164-77wl 72.8％
Hu164-87wl 76.4％
Hu164-68wl 76.3％
Hu164-69wl 74.2％
Hu95-51yk 80.0％
mAb1 63.0％
结果表明，本公开的人源化抗CTGF抗体可抑制TGFβ1诱导后C2C12细胞在体外的迁移能力，对C2C12细胞迁移能力的抑制均比阳性对照抗体mAb1强。
实施例6.CTGF抗体对TGFβ诱导PANC1细胞体外迁移抑制实验
PANC-1细胞(人胰腺癌细胞，ATCC，#CRL-1469)用0.25％胰酶(Gibco，#25200-072)消化，离心后用含0.1％胎牛血清(Gibco，#10099-141)的DMEM培养基(Gibco，#10564-029)重悬。用含0.1％胎牛血清的DMEM培养基配制细胞-抗体混合物及TGFβ-抗体混合物，细胞密度为4x105/ml，重组人TGFβ(Cell signaling Technology，#8915LC)浓度为10ng/ml，待测抗体浓度均为30μg/ml。
打开
Figure GPA0000313349910000481
Disposable Chemotaxis System(Neuro Probe，#106-8)的上盖及过滤膜，将TGFβ-抗体混合物加入下室中，每孔30μl，每组4副孔。盖上过滤膜，在膜上加细胞-抗体混合物，每孔加入50μl，每组4副孔。盖上上盖，置于培养箱(37℃，5％CO2)中。
孵育48小时后，用干净纸巾吸去过滤膜上液体，打开过滤膜，向下室中每孔加入10μl预冷的0.25％胰酶，盖上过滤膜。消化5分钟后，1000rpm离心1分钟。在倒置显微镜(Leica，#DMIL LED)下计数沉于板底的细胞。用Graphpad Prism 6对数据进行分析处理。抑制率＝[(TGFβ平均值-样品组平均值)/(TGFβ组平均值-未处理组平均值)]×100％
实验结果见表19。
表19.CTGF抗体对PANC1细胞体外迁移实验的抑制结果
Figure GPA0000313349910000482
结果表明，本公开的人源化抗CTGF抗体均可抑制TGFβ1诱导后PANC1细胞在体外的迁移能力。
实施例7.CTGF抗体抑制PANC1软琼脂体外增殖实验
在琼脂(BD，#214220)中加入去离子水，加热配制成1.4％的凝胶溶液。将2×DMEM培养基(Thermo，#12100046)与凝胶溶液按照1∶1的体积比混合，在24孔板(Costar，#3524)中每孔加入500μl，4度放置使其凝固。
PANC-1细胞(人胰腺癌细胞，ATCC，#CRL-1469)用0.25％胰酶(Gibco，#25200-072)消化，离心后用含4％胎牛血清(Gibco，#10099-141)的DMEM培养基(GE，#SH30243.01)调整细胞密度至5×104个/ml。用2×DMEM培养基配制抗体至2mg/ml。将细胞、抗体及1.4％的凝胶溶液按照2∶1∶1的体积比混合，在铺了下层胶的24孔板中每孔加入200μl。待上层胶凝固后，在24孔板中再加入200μl含2％胎牛血清的DMEM培养基。在培养箱中(37℃，5％CO2)培养28天后，用高内涵分析系统(Molecular Devices，ImageXpress)拍照，并分析形成的细胞克隆面积。抑制率＝(1-样品组平均值/未处理组平均值)×100％。实验结果见表20。
表20.CTGF抗体对PANC1细胞软琼脂体外增殖实验的抑制结果
受试样品 对PANC1细胞体外增殖的抑制百分比(％)
Hu147-11wk 23.76％
Hu147-33wk 22.30％
Hu164-67wl 24.2％
Hu164-67yl 21.7％
Hu95-51yk 20.24％
结果表明，来自mAb147和mAb164克隆的人源化抗体对人胰腺癌细胞(PANC-1细胞)的体外增殖具有显著的抑制作用。
实施例8.CTGF抗体的动物体内生物学活性
一、CTGF抗体对博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化抑制试验
实验方法：将40只小鼠按照体重随机分成以下4组：正常对照组(PBS，ip，qod)、mAb1组(10mg/kg，ip，qod)、Hu164-67wl(10mg/kg，ip，qod)组、Hu164-67yl(10mg/kg，ip，qod)组。每组10只，具体分组见下表21。实验第1天按照体重腹腔注射相应溶剂和抗体(10ml/kg，正常对照和模型组给予PBS)，2小时后进行博莱霉素雾化(50mg/8ml雾化30min并停留5min)造模。然后按照上述组别每隔日一次腹腔注射溶剂或抗体，实验周期21天，累计腹腔给药共11次。实验第22天，小鼠腹腔内注射1％戊巴比妥钠(10ml/kg)麻醉后，将小鼠仰卧固定在操作台上，沿颈部正中线切开1cm皮肤，切口下缘至胸腔入口处，用止血钳钝性分离皮下结缔组织和肌肉，暴露气管，分离气管两侧及气管与食管间结缔组织，游离气管，插入静脉留置针，使用手术缝线在套管进入气管处结扎固定。以1ml注射器抽吸0.8ml PBS，接在静脉套管针进液端，将PBS缓缓注入气管，停留30s后将PBS缓缓回抽，可见回抽出带乳白色泡沫状液体，重复灌洗三次，将灌洗液转移至EP管中，再吸取0.5ml PBS，重复以上步骤。将两次灌洗液混合后1500rpm离心5min，保存上清液-20℃待测，BALF上清再次10000rpm离心10min后取上清检测可溶性胶原(试剂盒：Biocolor，批号AA883)。
表21.试验分组及给药情况
组别 动物数量 药物 药物剂量(mg/ml) 给药途径 给药时间
1 10 PBS - i.p. 隔日1次
2 10 mAb1 10 i.p. 隔日1次
3 10 Hu164-67wl 10 i.p. 隔日1次
4 10 Hu164-67yl 10 i.p. 隔日1次
使用Excel统计软件：平均值以avg(Average，平均值)计算；SD(Standarddiviation，标准偏差)值以STDEV(Standard diviation，标准差)计算；SEM(StandardError of Mean，样本均数的标准差)值以STDEV/SQRT(Square root，开平方根)(每组动物数)计算；GraphPad Prism软件作图，采用Two-way ANOVA(双因素方差分析)或One-wayANOVA(单因素方差分析)对数据进行统计学分析。
实验结果见表22。
表22.CTGF抗体对博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化抑制试验结果
Figure GPA0000313349910000501
结果显示，Hu164-67wl或Hu164-67yl显示出很强的小鼠肺纤维化抑制作用。
二、CTGF抗体对Su86.86人胰腺癌细胞皮下移植瘤的抑制实验
实验方法：将SU86.86细胞(ATCC，CRL-1837、3.0×106个)200μl接种于Nu/Nu裸鼠右肋部皮下，接种11天后，待肿瘤体积在～140mm3后去除体重、肿瘤过大和过小的，按肿瘤体积将小鼠随机分为5组，每组10只，当天开始给药。通过腹腔注射抗体，每周注射2次，共18天。每周测1-2次瘤体积，称体重，记录数据。分组及给药情况见表23。
表23.试验分组及给药情况
Figure GPA0000313349910000502
使用Excel统计软件记录数据：平均值以avg计算；SD值以STDEV计算；SEM值以STDEV/SQRT(每组动物数)计算；采用GraphPad Prism软件作图，采用Two-way ANOVA或One-way ANOVA对数据进行统计学分析。
肿瘤体积(V)计算公式为：V＝1/2×L长×L短 2
相对肿瘤增殖率T/C(％)＝(Tt-T0)/(Ct-C0)×100，其中Tt、Ct为实验结束时治疗组和对照组的肿瘤体积；T0、C0为实验开始时的肿瘤体积。
抑瘤率TGI(％)＝1-T/C(％)。
实验结果：
D1-18天，每周皮下注射给药2次，检测CTGF抗体对SU86.86肿瘤的生长抑制作用。试验结果见表24和图2所示。与同型人IgG的空白对照组相比，mAb1-40mg/kg、Hu164-67yl-40mg/kg、Hu164-67yl-20mg/kg、Hu147-33wk(40mg/kg)组抑瘤率分别为45％、53％、47％和54％，mAb1-40mg/kg、Hu164-67yl-40mg/kg、Hu164-67yl-20mg/kg、Hu147-33wk(40mg/kg)组能够显著抑制Su86.86肿瘤的生长(p＜0.001)，且对SU86.86肿瘤的抑制作用具有一定剂量依赖性。另外，各组小鼠体重没有明显变化。
表24.CTGF抗体对SU86.86小鼠移植瘤的抑制实验结果
Figure GPA0000313349910000511

Claims (18)

1.一种抗CTGF抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：
所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ IDNO:15所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
2.根据权利要求1所述的抗CTGF抗体，其中所述抗CTGF抗体是鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
3.根据权利要求2所述的抗CTGF抗体，其中所述抗CTGF抗体为人源化抗体，所述人源化抗体包含选自以下所述的轻链可变区和重链可变区：
轻链可变区，其包含：
分别如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，以及在人抗体的轻链框架区上分别具有选自4L、36F、43S、45K、47W、58V或71Y中的一个或更多个回复突变，和
重链可变区，其包含：
分别如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及在人抗体的重链框架区上分别具有选自28S、30N、49A、75E、76S、93V、94E或104D中的一个或更多个回复突变。
4.根据权利要求3所述的抗CTGF抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：
(vii)所述重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；和所述轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；
(viii)所述重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:27、28或29所示；和所述轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:22、23、24、25或26所示。
5.根据权利要求4所述的抗CTGF抗体，其包含如下所示的重链可变区和轻链可变区，其中：
所述重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示；和所述轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示。
6.根据权利要求1至5任一项所述的抗CTGF抗体，其中所述抗体进一步包含抗体重链恒定区和轻链恒定区。
7.根据权利要求1至5任一项所述的抗CTGF抗体，所述重链恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的恒定区及其变体，所述轻链恒定区选自人抗体κ和λ链的恒定区及其变体。
8.根据权利要求1至5任一项所述的抗CTGF抗体，所述抗体包含如SEQ ID NO:37或38所示的重链恒定区和如SEQ ID NO:39所示的轻链恒定区。
9.根据权利要求1至5任一项所述的抗CTGF抗体，其包含：
如SEQ ID NO:41、43、44、45、46、47或48所示的重链和如SEQ ID NO:42、49、50、51、52或53所示的轻链。
10.根据权利要求9所述的抗CTGF抗体，其包含：
如SEQ ID NO:46所示的重链和如SEQ ID NO:49所示的轻链。
11.一种核酸分子，其编码权利要求1至10任一项所述的抗CTGF抗体。
12.一种宿主细胞，其包含如权利要求11所述的核酸分子。
13.一种药物组合物，其含有治疗有效量的根据权利要求1至10任一项所述的抗CTGF抗体，或根据权利要求11所述的核酸分子，以及一种或更多种药学上可接受的载体、稀释剂、缓冲剂或赋形剂。
14.一种用于免疫检测或测定CTGF的方法，所述方法包括使权利要求1至10任一项所述的抗CTGF抗体接触受试者或其样本的步骤。
15.一种试剂盒，其包含根据权利要求1至10任一项所述的抗CTGF抗体。
16.权利要求1至10任一项所述的抗CTGF抗体，或权利要求11所述的核酸分子，或权利要求13所述的药物组合物在制备治疗或预防与CTGF相关的疾病的药物中的用途，其包括向受试者施用治疗有效量或预防有效量的权利要求1至10任一项所述的抗CTGF抗体，或权利要求11所述的核酸分子，或权利要求13所述的药物组合物。
17.根据权利要求16所述的用途，其中所述与CTGF相关的疾病为纤维性疾病、高血压、糖尿病、心肌梗死、关节炎、CTGF相关细胞增殖性疾病、动脉粥样硬化、青光眼或癌症。
18.根据权利要求17所述的用途，所述纤维性疾病选自：自发性肺纤维化、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病骨关节炎、硬皮病、慢性心力衰竭、肝硬化或肾纤维化；
所述癌症选自：急性淋巴母细胞性白血病、皮肤纤维瘤、乳腺癌、血管脂肪瘤、血管平滑肌瘤、结缔组织生成性癌症、前列腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃肠道癌症或肝癌。
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