JP2022535810A - 抗結合組織成長因子抗体およびその適用 - Google Patents

Abstract

軽鎖および重鎖の可変領域を含む抗ＣＴＧＦ抗体、ならびに薬剤としてのその使用が提供される。該抗体は、ＣＴＧＦ関連疾患または状態の処置用医薬を製造するために使用されうる。

Description

本願は、中国特許出願第２０１９１０４８０１６９．４号（発明の名称：抗結合組織成長因子抗体およびその適用；優先日：２０１９年６月４日）の優先権を主張する。

発明の分野
本開示は、生物医療の分野に属し、特に、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）に結合する抗体およびその適用に関する。

発明の背景
ここでの記載は、本開示に関する背景の情報を提供するものに過ぎず、必ずしも従来技術を構成するものではない。

ＣＴＧＦの発現は、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）スーパーファミリーのメンバーによって誘導される。このスーパーファミリーは、ＴＧＦβ－１、－２および－３、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）－２、ならびにアクチビンを包含する。多くの調節剤（デキサメタゾン、トロンビン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）およびアンギオテンシンIIを包含する）および環境ストレス（高血糖および高血圧を包含する）も、ＣＴＧＦの発現を誘導する（例えば、Franklin (1997) Int J Biochem Cell Biol 29:79-89; Wunderlich (2000) Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 238: 910-915; Denton and Abraham (2001) Curr Opin Rheumatol 13: 505-511; およびRiewald (2001) Blood 97: 3109-3116; Riser et al. (2000) J Am SocNephrol 11: 25-38; および国際特許出願公開WO 00/13706参照）。

ＣＴＧＦ発現に対するＴＧＦβの刺激作用は速やか、かつ持続的であり、ＴＧＦβの持続的適用を必要としない（Igarashi et al. (1993) Mol BiolCell 4:637-645）。ＴＧＦβは、ＣＴＧＦプロモーター中に存在するＤＮＡ調節エレメントを介して転写を活性化して、ＣＴＧＦ発現の増加をもたらす（Grotendorst et al. (1996) Cell Growth Differ 7: 469-480; Grotendorst and Bradham, 米国特許第6,069,006号; Holmes et al. (2001) J Biol Chem 276: 10594-10601）。

ＣＴＧＦ発現は、糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、巣状および分節性糸球体硬化症、および糖尿病性腎症においてアップレギュレートされる（例えばRiser et al. (2000) J Am Soc Nephrol 11:25-38参照)。ＣＴＧＦ発現細胞数の増加は、慢性尿細管間質性傷害部位においても観察されており、ＣＴＧＦレベルは傷害の程度に相関する（Ito et al. (1998) Kidney Int 53:853-861）。さらに腎実質の瘢痕形成および硬化を伴うさまざまな腎症においても、糸球体および尿細管間質におけるＣＴＧＦ発現は増加する。高レベルＣＴＧＦは、肝繊維症、心筋梗塞および肺線維症にも関連する。例えば、ＣＴＧＦは、特発性肺線維症（ＩＰＦ）患者の生検および気管支肺胞洗浄液に由来する細胞においても著しくアップレギュレートされている（Ujike et al. (2000) Biochem Biophys Res Commun 277:448-454; Abou -Shady et al. (2000) Liver 20: 296-304; Williams et al. (2000) J Hepatol 32: 754-761）。したがって、ＣＴＧＦは、前記疾患の治療の効果的な標的である。

しかしながら、現在臨床的に用いられている有効なＣＴＧＦ標的化抗体薬は無く、安全かつ有効な新規ＣＴＧＦ抗体薬の開発が依然必要である。

発明の概要
本開示は、抗ＣＴＧＦ抗体を提供する。抗ＣＴＧＦ抗体は、抗ヒトＣＴＧＦ完全長抗体およびその抗原結合フラグメントを包含する。

いくつかの態様において、抗ＣＴＧＦ抗体は重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、ここで：
ｉ）重鎖可変領域は配列番号６に示される重鎖可変領域のものと同じＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列を含み、軽鎖可変領域は配列番号７に示される軽鎖可変領域のものと同じＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列を含む；または
ii）重鎖可変領域は配列番号８に示される重鎖可変領域のものと同じＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列を含み、軽鎖可変領域は配列番号９に示される軽鎖可変領域のものと同じＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列を含む。

いくつかの態様において、抗ＣＴＧＦ抗体は重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、ここで：
ii－ｉ）重鎖可変領域は配列番号６９に示される重鎖可変領域のものと同じＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列を含み、軽鎖可変領域は配列番号７０に示される軽鎖可変領域のものと同じＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列を含む；または
ii－ii）重鎖可変領域は配列番号８５に示される重鎖可変領域のものと同じＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列を含み、軽鎖可変領域は配列番号７０に示される軽鎖可変領域のものと同じＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列を含む。

いくつかの態様において、抗ＣＴＧＦ抗体は重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、ここで：
iii）重鎖可変領域は配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域は配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む；または
iv）重鎖可変領域は配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域は配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む。

いくつかの態様において、抗ＣＴＧＦ抗体は重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、ここで：
iv－i）重鎖可変領域は配列番号７１、配列番号７２および配列番号７３にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域は配列番号７４、配列番号７５および配列番号７６にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む；または
iv－ii）重鎖可変領域は配列番号１０２、配列番号１０３および配列番号１０４にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域は配列番号７４、配列番号７５および配列番号７６にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む。

いくつかの態様において、抗ＣＴＧＦ抗体は、マウス抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である。

いくつかの態様において、抗ＣＴＧＦ抗体は重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、ここで：
（v－１）重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号６、２７、２８または２９との配列同一性が少なくとも９０％であり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７、２２、２３、２４、２５または２６との配列同一性が少なくとも９０％である；
（vi－１）重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８、３３、３４、３５または３６との配列同一性が少なくとも９０％であり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号９、３０、３１または３２との配列同一性が少なくとも９０％である；または
（vi－ｉ）重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号６９、８１、８２、８３、８４または８５との配列同一性が少なくとも９０％であり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７０、７７、７８、７９または８０との配列同一性が少なくとも９０％である。

いくつかの態様において、抗ＣＴＧＦ抗体は重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、ここで：
（v）重鎖可変領域は配列番号６、２７、２８または２９に示される重鎖可変領域との同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であり、軽鎖可変領域は配列番号７、２２、２３、２４、２５または２６に示される軽鎖可変領域との同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である；または
（vi）重鎖可変領域は配列番号８、３３、３４、３５または３６に示される重鎖可変領域との同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であり、軽鎖可変領域は配列番号９、３０、３１または３２に示される軽鎖可変領域との同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である；または
重鎖可変領域は配列番号６に示される重鎖可変領域との同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であり、軽鎖可変領域は配列番号７に示される軽鎖可変領域との同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である；
重鎖可変領域は配列番号２７、２８または２９に示される重鎖可変領域との同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であり、軽鎖可変領域は配列番号２２、２３、２４、２５または２６に示される軽鎖可変領域との同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６、９７％、９８％、９９％または１００％である；
重鎖可変領域は配列番号８に示される重鎖可変領域との同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であり、軽鎖可変領域は配列番号９に示される軽鎖可変領域との配列同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である；
重鎖可変領域は配列番号３３、３４、３５または３６に示される重鎖可変領域との同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であり、軽鎖可変領域は配列番号３０、３１または３２に示される軽鎖可変領域との同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である。

いくつかの態様において、抗ＣＴＧＦ抗体は重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、ここで：
（vi－ii）重鎖可変領域は配列番号６９、８１、８２、８３、８４または８５に示される重鎖可変領域との同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であり、軽鎖可変領域は配列番号７０、７７、７８、７９または８０に示される軽鎖可変領域との同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である。

抗ＣＴＧＦ抗体のいくつかの態様において、抗ＣＴＧＦ抗体が、ヒト抗体のフレームワーク領域またはそのフレームワーク領域バリアントを含むヒト化抗体であり、フレームワーク領域バリアントが、ヒト抗体軽鎖フレームワーク領域および／または重鎖フレームワーク領域のそれぞれにおいて１０個までの復帰変異を有する。

いくつかの態様において、抗ＣＴＧＦ抗体は、次に記載される重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む：
（ａ）軽鎖可変領域が、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、４Ｌ、３６Ｆ、４３Ｓ、４５Ｋ、４７Ｗ、５８Ｖまたは７１Ｙからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸復帰変異を含む、および／または重鎖可変領域が、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、２８Ｓ、３０Ｎ、４９Ａ、７５Ｅ、７６Ｓ、９３Ｖ、９４Ｅまたは１０４Ｄからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸復帰変異を含む；または
（ｂ）軽鎖可変領域が、配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、３６Ｖ、４４Ｆ、４６Ｇまたは４９Ｇからなる群から選択される１つ以上の復帰変異を含む、および／または重鎖可変領域が、配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、４４Ｇ、４９Ｇ、２７Ｆ、４８Ｌ、６７Ｌ、７１Ｋ、７８Ｖまたは８０Ｆからなる群から選択される１つ以上の復帰変異を含む。

いくつかの態様において、抗ＣＴＧＦ抗体は、次に記載される重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む：
（ｂ－ｉ）軽鎖可変領域が、配列番号７４、配列番号７５および配列番号７６にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、４５Ｐ、４６Ｗ、４８Ｙ、６９Ｓまたは７０Ｙからなる群から選択される１つ以上の復帰変異を含み、重鎖可変領域が、配列番号７１、配列番号７２および配列番号７３にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、２７Ｆ、３８Ｋ、４８Ｉ、６７Ｋ、６８Ａ、７０Ｌまたは７２Ｆからなる群から選択される１つ以上の復帰変異を含む；または
（ｂ－ii）軽鎖可変領域が、配列番号７４、配列番号７５および配列番号７６にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、４５Ｐ、４６Ｗ、４８Ｙ、６９Ｓまたは７０Ｙからなる群から選択される１つ以上の復帰変異を含み、重鎖可変領域が、配列番号１０２、配列番号１０３および配列番号１０４にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、２７Ｆ、３８Ｋ、４８Ｉ、６７Ｋ、６８Ａ、７０Ｌまたは７２Ｆからなる群から選択される１つ以上の復帰変異を含む。

いくつかの態様において、抗ＣＴＧＦ抗体は、次に記載される重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む：
（vii）重鎖可変領域の配列が配列番号６に示され、軽鎖可変領域の配列が配列番号７に示される；
（viii）重鎖可変領域の配列が配列番号２７、２８または２９に示され、軽鎖可変領域の配列が配列番号２２、２３、２４、２５または２６に示される；
（ix）重鎖可変領域の配列が配列番号８に示され、軽鎖可変領域の配列が配列番号９に示される；または
（ｘ）重鎖可変領域の配列が配列番号３３、３４、３５または３６に示され、軽鎖可変領域の配列が配列番号３０、３１または３２に示される。

いくつかの態様において、抗ＣＴＧＦ抗体は、次に記載される重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む：
（xi）重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号６９に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号７０に示される；または
（xii）重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号８１、８２、８３、８４または８５に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号７７、７８、７９または８０に示される。

いくつかの態様において、抗ＣＴＧＦ抗体は、次の表ａ、表ｂおよび表ｃに示される重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む：

いくつかの態様において、抗ＣＴＧＦ抗体は、次に記載される重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む：
（xiii）重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２７に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２２に示される；
（xiv）重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３４に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３０に示される；または
（xv）重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号８５に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号７７に示される。

抗体が抗体重鎖定常領域および軽鎖定常領域をさらに含む、抗ＣＴＧＦ抗体のいくつかの態様において、好ましくは、重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の定常領域ならびにその通常のバリアントからなる群から選択され、軽鎖定常領域は、ヒト抗体κおよびλ鎖の定常領域ならびにその通常のバリアントからなる群から選択され；より好ましくは、抗体は、配列番号３７または３８に示される重鎖定常領域、および配列番号３９または４０に示される軽鎖定常領域を含む。

いくつかの態様において、抗ＣＴＧＦ抗体は、次のものを含む：
（ｃ）配列番号４１、４３、４４、４５、４６、４７または４８に示される重鎖との同一性が少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である重鎖、および配列番号４２、４９、５０、５１、５２または５３に示される軽鎖との同一性が少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である軽鎖；
（ｄ）配列番号５４、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２または６３に示される重鎖との同一性が少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である重鎖、および配列番号５５、６４、６５または６６に示される軽鎖との同一性が少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である軽鎖；
（ｅ）配列番号４１、４３、４４、４５、４６、４７または４８に示される重鎖、および配列番号４２、４９、５０、５１、５２または５３に示される軽鎖；または
（ｆ）配列番号５４、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２または６３に示される重鎖、および配列番号５５、６４、６５または６６に示される軽鎖。

いくつかの態様において、抗ＣＴＧＦ抗体は、次のものを含む：
（ｇ）配列番号８６、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６または９７に示される重鎖との同一性が少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である重鎖、および配列番号８７、９８、９９、１００または１０１に示される軽鎖との同一性が少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である軽鎖；または
（ｈ）配列番号８６、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６または９７に示される重鎖、および配列番号８７、９８、９９、１００または１０１に示される軽鎖。

いくつかの態様において、抗ＣＴＧＦ抗体は、次のものを含む：
（ｊ）配列番号４６に示される重鎖、および配列番号４９に示される軽鎖；
（ｋ）配列番号６１に示される重鎖、および配列番号６４に示される軽鎖；または
（ｌ）配列番号９７に示される重鎖、および配列番号９８に示される軽鎖。

本開示の他のいくつかの側面において、ヒトＣＴＧＦとの結合を前記抗ＣＴＧＦ抗体またはその抗原結合フラグメントと競合する抗ＣＴＧＦ抗体が提供される。

本開示の他のいくつかの側面において、前記抗ＣＴＧＦ抗体をコードする核酸分子が提供される。

本開示の他のいくつかの側面において、前記核酸分子を含む宿主細胞が提供される。

本開示の他のいくつかの側面において、治療有効量または予防有効量の前記抗ＣＴＧＦ抗体または前記核酸分子および１つ以上の薬学的に許容しうる担体、希釈剤、緩衝剤または賦形剤を含む医薬組成物が提供される。

いくつかの特定の態様において、治療有効量または予防有効量とは、組成物の単位用量が前記抗ＣＴＧＦ抗体を０．１～３０００ｍｇまたは１～１０００ｍｇ含むことを意味する。

本開示の他のいくつかの側面において、前記抗ＣＴＧＦ抗体を適用するステップを含む、ＣＴＧＦの免疫アッセイまたは決定の方法が提供される。

本開示の他のいくつかの側面において、前記抗ＣＴＧＦ抗体を対象またはそのサンプルと接触させるステップを含む、ＣＴＧＦの免疫アッセイまたは決定の方法が提供される。

本開示の他のいくつかの側面において、前記抗ＣＴＧＦ抗体を含むキットが提供される。

本開示の他のいくつかの側面において、前記抗ＣＴＧＦ抗体または前記核酸分子または前記医薬組成物を処置有効量で対象に投与することを含む、ＣＴＧＦ関連疾患の処置方法が提供され、ここで、前記疾患は好ましくは、線維性疾患（線維性疾患は好ましくは特発性肺線維症、糖尿病性腎症、糖尿病網膜症、骨関節炎、強皮症、慢性心不全、肝硬変または腎線維症である）、高血圧症、糖尿病、心筋梗塞、関節炎、ＣＴＧＦ関連細胞増殖性疾患、アテローム性動脈硬化、緑内障またはがん（がんは好ましくは、急性リンパ芽球性白血病、皮膚線維腫、乳がん、血管脂肪腫、血管平滑筋腫、結合組織生成がん、前立腺がん、卵巣がん、結腸直腸がん、膵臓がん、胃腸がんまたは肝臓がんである）である。

本開示の他のいくつかの側面において、ＣＴＧＦ関連疾患処置用医薬の製造における前記抗ＣＴＧＦ抗体または前記核酸分子または前記医薬組成物の使用が提供され、ここで、前記ＣＴＧＦ関連疾患は、線維性疾患（線維性疾患は好ましくは特発性肺線維症、糖尿病性腎症、糖尿病網膜症、骨関節炎、強皮症、慢性心不全、肝硬変または腎線維症である）、高血圧症、糖尿病、心筋梗塞、関節炎、ＣＴＧＦ関連細胞増殖性疾患、アテローム性動脈硬化、緑内障またはがん（がんは好ましくは、急性リンパ芽球性白血病、皮膚線維腫、乳がん、血管脂肪腫、血管平滑筋腫、結合組織生成がん、前立腺がん、卵巣がん、結腸直腸がん、膵臓がん、胃腸がんまたは肝臓がんである）を包含する。

本開示の他のいくつかの側面において、ＣＴＧＦ関連疾患の処置における使用のための前記抗ＣＴＧＦ抗体または前記抗ＣＴＧＦ抗体をコードする核酸分子または前記医薬組成物が提供され、ここで、前記ＣＴＧＦ関連疾患は、線維性疾患（線維性疾患は好ましくは特発性肺線維症、糖尿病性腎症、糖尿病網膜症、骨関節炎、強皮症、慢性心不全、肝硬変または腎線維症である）、高血圧症、糖尿病、心筋梗塞、関節炎、ＣＴＧＦ関連細胞増殖性疾患、アテローム性動脈硬化、緑内障またはがん（がんは好ましくは、急性リンパ芽球性白血病、皮膚線維腫、乳がん、血管脂肪腫、血管平滑筋腫、結合組織生成がん、前立腺がん、卵巣がん、結腸直腸がん、膵臓がん、胃腸がんまたは肝臓がんである）を包含する。

ＥＬＩＳＡにより検出された、ｍａｂ１６４に由来するヒト化抗体のヒトＣＴＧＦに対する親和性。 ｍａｂ１４７またはｍａｂ１６４に由来するヒト化抗体の、ＳＵ８６．８６マウス異種移植腫瘍抑制実験の結果。

発明の詳細な説明
用語
本開示のより容易な理解のために、いくつかの技術用語および科学用語を以下に定義する。本書に使用される他の技術用語および科学用語はいずれも、本書において特に別の定義をしない限り、本開示の属する技術分野の専門家に通常理解される意味を有する。

本開示において用いられるアミノ酸の３文字コードおよび１文字コードは、J.biol.chem, 243, p3558 (1968) に記載されるものである。

結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）は、システインリッチな３６ｋＤのヘパリン結合分泌糖タンパク質で、ヒト臍静脈内皮細胞から初めて単離された（例えば、Bradham et al. (1991) J Cell Biol114: 1285-1294; Grotendorst and Bradham, 米国特許第5,408,040号参照）。ＣＴＧＦは、タンパク質ＣＣＮ（ＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１、Ｎｏｖ）ファミリー（分泌糖タンパク質）に属し、このファミリーは、血清誘導最初期遺伝子産物Ｃｙｒ６１、推定癌遺伝子Ｎｏｖ、ＥＣＭ関連タンパク質ＦＩＳＰ－１２、ｓｒｃ誘導遺伝子ＣＥＦ－１０、Ｗｎｔ誘導分泌タンパク質ＷＩＳＰ－３、および増殖抑制タンパク質ＨＩＣＰ／ｒＣＯＰを含む（Brigstock (1999) Endocr Rev 20: 189-206; O'Brian et al. (1990) Mol Cell Biol 10: 3569-3577; Joliot et al. (1992) Mol Cell Biol 12: 10-21; Ryseck et al. (1990) Cell Growth and Diff 2: 225-233; Simmons et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86: 1178-1182; Pennica et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA, 95: 14717-14722; およびZhang et al. (1998) Mol Cell Biol 18: 6131-6141）。ＣＣＮタンパク質は保存的な３８のシステイン残基によって特徴付けられる。この３８システイン残基は、全アミノ酸の１０％超を構成し、Ｎ末端およびＣ末端ドメインとモジュール構造を形成する。ＣＴＧＦのモジュール構造は、Ｎ末端ドメインのインスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦ－ＢＰ）およびフォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＣ）ならびにＣ末端ドメインのトロンボスポンジン（ＴＳＰ１）およびシステインノットモチーフの保存的モチーフを含む。

本書において「抗体」は免疫グロブリンをいい、完全長抗体は、２本の同一の重鎖および２本の同一の軽鎖の間で鎖間ジスルフィド結合によって繋ぎ合わされた４ペプチド鎖構造である。免疫グロブリン重鎖定常領域は、異なるアミノ酸の組成および順序を示し、したがって、異なる抗原性を示す。したがって、免疫グロブリンは５つのタイプに分類することができ、免疫グロブリンアイソタイプ、すなわちＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥと称することができ、それぞれ対応する重鎖はμ、δ、λ、αおよびεである。ヒンジ領域のアミノ酸組成および重鎖ジスルフィド結合の数と位置によって、同じタイプのＩｇを異なるサブタイプにさらに分類することができ、例えば、ＩｇＧをＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に分類することができる。軽鎖は、定常領域の違いに基づいてκまたはλ鎖に分類することができる。５つのＩｇタイプのそれぞれが、κ鎖またはλ鎖を有しうる。

抗体重鎖および軽鎖のＮ末端から約１１０アミノ酸の配列は非常にさまざまで、可変領域（Ｆｖ領域）として知られ、残りのＣ末端側アミノ酸配列は比較的一定で、定常領域として知られる。可変領域は３つの超可変領域（ＨＶＲ）、および比較的配列の保存された４つのフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。抗体の特異性を決定する３つの超可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる。各軽鎖可変領域（ＶＬ）および各重鎖可変領域（ＶＨ）は、アミノ末端からカルボキシル末端へと次の順序で並ぶ、３つのＣＤＲ領域と４つのＦＲ領域からなる：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４。軽鎖の３つのＣＤＲ領域はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と称され、重鎖の３つのＣＤＲ領域はＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と称される。

本開示の抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、およびヒト化抗体を包含する。

本書において、用語「マウス抗体」とは、当分野における知識および技術によって作製されるヒトＣＴＧＦに対するモノクローナル抗体をいう。作製において、試験対象にＣＴＧＦ抗原が注射され、その後、所望の配列または機能特性を有する抗体を発現するハイブリドーマが単離される。本開示の好ましい態様において、マウス抗ＣＴＧＦ抗体またはその抗原結合フラグメントは、マウスκ、λ鎖の軽鎖定常領域もしくはそのバリアントをさらに含む、またはマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３の重鎖定常領域もしくはそのバリアントをさらに含むことができる。

用語「キメラ抗体」は、マウス抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域に融合することによる抗体であり、そのような抗体は、マウス抗体が誘発する免疫反応を低減することができる。キメラ抗体を作製するには、まず特定のマウスモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作製し、マウスハイブリドーマから可変領域遺伝子をクローン化する。次いで、必要に応じてヒト抗体から定常領域遺伝子をクローン化する。マウス可変領域遺伝子とヒト定常領域遺伝子を連結してキメラ遺伝子を形成し、その後これを発現ベクターに挿入することができる。最後に、キメラ抗体分子を真核生物または原核生物系において発現させうる。本開示の好ましい態様において、キメラ抗体の抗体軽鎖は、ヒトκ、λ鎖の軽鎖定常領域もしくはそのバリアントをさらに含む。ＣＴＧＦキメラ抗体の抗体重鎖は、さらにヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の重鎖定常領域もしくはそのバリアントをさらに含み、好ましくはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４、またはアミノ酸変異（例えば、Ｌ２３４Ａおよび／またはＬ２３５Ａ変異、および／またはＳ２２８Ｐ変異）を有するＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４バリアントの重鎖定常領域を含む。

用語「ヒト化抗体」は、ＣＤＲグラフト抗体とも呼ばれるが、マウスＣＤＲ配列をヒト抗体可変領域フレームワークにグラフトすることにより作製される抗体、すなわちさまざまな種類のヒト生殖細胞系列抗体フレームワーク配列中に作製される抗体をいう。ヒト化抗体は、マウスタンパク質成分を多く含むキメラ抗体によって誘発される異種反応を克服することができる。そのようなフレームワーク配列は、生殖細胞系列抗体遺伝子配列を含む公のＤＮＡデータベース、または刊行物から入手することができる。例えば、生殖細胞系列のヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子ＤＮＡ配列は、“VBase”ヒト生殖細胞系列配列データベース（www.mrccpe.com.ac.uk/vbaseにおいて利用可能）、およびKabat, EA, et al. 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edに見出すことができる。免疫原性低下によって起こる活性低下を回避するために、ヒト抗体可変領域中のフレームワーク配列を、最小限の、活性の維持または増強のための復帰変異に付すことができる。本開示のヒト化抗体は、酵母ディスプレイによってＣＤＲ親和性成熟が行われたヒト抗体をも包含する。

残基の抗原との接触のせいで、ＣＤＲのグラフトは、フレームワーク残基の抗原との接触のせいで、抗体またはその抗原結合フラグメントの抗体に対する親和性の低下をもたらしうる。高度に体細胞的な変異によって、そのような相互作用をもたらすことができる。したがって、そのようなドナーフレームワークアミノ酸をヒト化抗体フレームワークにグラフトすることが依然必要でありうる。非ヒト抗体またはその抗原結合フラグメントに由来する、抗原結合に関与するアミノ酸残基は、動物モノクローナル抗体可変領域の配列および構造を調べることによって特定することができる。生殖細胞系列とは異なるドナーＣＤＲフレームワークアミノ酸残基は、関連するものと考えることができる。最も関連性の高い生殖細胞系列を決定することができない場合は、サブタイプに共通する配列、または類似性パーセンテージの高い動物抗体配列に対して配列を比較することができる。レアなフレームワーク残基は、体細胞における高度の変異の結果と考えられ、結合において重要な役割を果たす。

本開示の一態様において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトまたはマウスκ、λ鎖またはそのバリアントに由来する軽鎖定常領域をさらに含む、またはヒトまたはマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはそのバリアントに由来する重鎖定常領域をさらに含み；それは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４に由来する、またはアミノ酸変異（例えば、Ｌ２３４Ａおよび／またはＬ２３５Ａ変異、および／またはＳ２２８Ｐ変異）を有するＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４バリアントに由来する重鎖定常領域を含みうる。

本書において、ヒト抗体重鎖定常領域およびヒト抗体軽鎖定常領域の「通常のバリアント」とは、従来技術において開示される、抗体可変領域の構造および機能を変化させないヒト重鎖または軽鎖定常領域バリアントをいう。バリアントの例は、重鎖定常領域における部位特異的改変およびアミノ酸置換による、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖定常領域バリアントを包含する。具体的な置換の例は、ＹＴＥ変異、Ｌ２３４Ａおよび／またはＬ２３５Ａ変異、Ｓ２２８Ｐ変異、またはｋｎｏｂ-ｉｎｔｏ-ｈｏｌｅ構造をもたらす変異（抗体重鎖にｋｎｏｂ－Ｆｃとｈｏｌｅ－Ｆｃの組み合わせを持たせる）等である。これらの変異は、抗体可変領域の機能を変化することなく抗体に新たな性質を付与することが証明されている。

「ヒト抗体（ＨｕＭＡｂ）」、「ヒト由来抗体」および「完全ヒト抗体」は、互換的に用いることができ、ヒトに由来する抗体、または特定のヒト抗体を抗原刺激に応答して産生するように当分野で知られる任意の方法で「改変」されている遺伝子改変された生物から得られる抗体であることができ、産生されることができる。いくつかの技術において、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子座のエレメントが、生殖細胞系列幹細胞株由来の生物の細胞株に導入され、該細胞株の内因の重鎖および軽鎖遺伝子座が標的化され分断される。該細胞株に含まれる標的化された内因の重鎖および軽鎖遺伝子座は分断される。トランスジェニック生物は、ヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、該生物を用いてヒト抗体を分泌するハイブリドーマを産生させることができる。ヒト抗体はまた、重鎖および軽鎖が１つ以上のヒトＤＮＡソースに由来するヌクレオチド配列でコードされている抗体でありうる。完全ヒト抗体はまた、遺伝子または染色体トランスフェクション法およびファージディスプレイ技術によって作製する、またはインビトロで活性化されたＢ細胞から作製することができ、それらはいずれも当分野において知られている。

用語「完全長抗体」、「完全抗体」および「全抗体」は、本書において互換的に用いられ、下記に定義する抗原結合フラグメントと区別される、実質的にインタクトな形態の抗体をいう。該用語は特に、軽鎖および重鎖中に定常領域を含む抗体をさす。

本開示の「抗体」は、「完全長抗体」およびその抗原結合フラグメントを包含する。

いくつかの態様において、本開示の完全長抗体は、下記の表１、２および３に挙げられる軽鎖および重鎖の組み合わせに示されるような、軽鎖可変領域と軽鎖定常領域との連結、および重鎖可変領域と重鎖定常領域との連結によって形成される完全長抗体を包含する。当業者は、軽鎖定常領域および重鎖定常領域を、ヒト抗体由来軽鎖定常領域および重鎖定常領域といった、実際の必要に応じたさまざまな抗体ソースから選択することができる。また、表１、２および３に記載される軽鎖および重鎖可変領域のさまざま組み合わせにより、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、またはｓｃＦｖもしくはＦａｂを含む他の形態の抗原結合フラグメントを形成することができる。

注：Ｈｕ１６４－５７は、ｍａｂ１６４から誘導されたヒト化抗体Ｈｕ１６４－５７が、Ｈｕ１６４－ＶＨ５に記載される重鎖可変領域およびＨｕ１６４－ＶＬ７に記載される軽鎖可変領域を有することを意味し；それ以外のものも同じ方式で解釈することができる。

用語「抗原結合フラグメント」または「機能的フラグメント」とは、抗原（例えばＣＴＧＦ）に特異的に結合する能力を維持する、抗体の１つ以上のフラグメントをいう。完全長抗体のフラグメントは、特異的抗原に結合する機能を達成するために使用できることが示されている。抗体の「抗原結合フラグメント」という用語に関する結合フラグメントの例は、次のものを包含する：（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメントである、Ｆａｂフラグメント、（ii）ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントである、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、（iii）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、（iv）抗体の１つのアームのＶＨおよびＶＬドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨおよびＶＬの鎖間ジスルフィド結合によって形成される安定な抗原結合フラグメントである、ｄｓＦｖ、および（vi）ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖおよびＦａｂといったフラグメントを含む、ディアボディ、二重特異的抗体および多重特異的抗体。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインであるＶＬおよびＶＨドメインは２つの別個の遺伝子によりコードされるが、組換え法を用いて合成リンカーによって連結して、ＶＬおよびＶＨドメインが組み合わされて一価分子が形成されている一本鎖のタンパク質を作製することができる（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）と称される；例えば、Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; およびHuston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA85:5879-5883参照）。そのような一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合フラグメント」という用語に包含される。そのような抗体フラグメントは、当分野において知られる通常の技術を用いて得られ、機能的フラグメントについて、インタクトな抗体の場合と同じ方法を用いてスクリーニングされる。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術によって、またはインタクトな免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的切断によって作製することができる。抗体は、さまざまなアイソタイプの形態、例えばＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体でありうる。

Ｆａｂは、ＩｇＧ抗体分子を、パパイン（これはＨ鎖の位置２２４のアミノ酸残基を切断する）で処理することによって得られる抗体フラグメントであり、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で連結されている該抗体フラグメントは、約５００００の分子量を有し、抗原結合活性を有する。

「Ｆ（ａｂ’）_２」は、抗原結合活性を有する分子量が約１０００００の抗体フラグメントであり、これはＩｇＧのヒンジ領域の２つのジスルフィド結合の下流部分をペプシンで消化することによって得られる。Ｆ（ａｂ’）_２は、ヒンジ領域で連結された２つのＦａｂを含む。

Ｆａｂ’は、抗原結合活性を有する分子量が約５００００の抗体フラグメントであり、前記Ｆ（ａｂ’）_２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することによって得られる。本開示のＦａｂ’は、特異的にＣＴＧＦを認識し、その細胞外領域アミノ酸配列または三次元構造に結合する本開示のＦ（ａｂ’）_２を、ジチオスレイトールのような還元剤で処理することによって作製することができる。

Ｆａｂ’はさらに、抗体のＦａｂ’をコードするＤＮＡを原核生物発現ベクターまたは真核生物発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物または真核生物に導入してＦａｂ’を発現させることによって作製することができる。

用語「一本鎖抗体」、「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」は、リンカーによって抗体重鎖可変ドメイン（または領域；ＶＨ）と抗体軽鎖可変ドメイン（または領域；ＶＬ）が連結されたものを含む分子をいう。そのようなｓｃＦｖ分子は、一般構造：ＮＨ_２－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＯＯＨまたはＮＨ_２－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨを有する。従来技術において適当なリンカーは、反復ＧＧＧＧＳアミノ酸配列またはそのバリアント、例えば１～４反復バリアントからなる（Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448）。本開示において使用しうる他のリンカーは、Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8:725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31:94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56:3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56 および Roovers et al. (2001), Cancer Immunolに記載されている。

ディアボディは、ｓｃＦｖまたはＦａｂが二量体化されている抗体フラグメントであり、これは、二価の抗原結合活性を有する抗体フラグメントである。二価抗原結合活性において、２つの抗原は同じかまたは異なりうる。

二重特異的および多重特異的抗体とは、ＣＴＧＦと結合することのできるｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントを含んで、２つまたはより多くの抗原または抗原決定基に同時に結合することのできる抗体をいう。

本開示のディアボディは、下記ステップによって作製することができる：特異的にヒトＣＴＧＦを認識し、その細胞外領域または三次元構造に結合する本開示のモノクローナル抗体のＶＬおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを得る；ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを、リンカーペプチドが８未満のアミノ酸残基の長さとなるように作製する；該ＤＮＡを原核生物発現ベクターまたは真核生物発現ベクターに挿入する；およびその後、該発現ベクターを原核生物または真核生物に導入してディアボディを発現させる。

ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬのそれぞれにおいて１つのアミノ酸残基をシステイン残基で置換し、次いで置換されたポリペプチドを２つのシステイン残基間でジスルフィド結合によって連結することによって得られる。システイン残基で置換するアミノ酸残基は、既知の方法による抗体の三次元構造予測に基づいて選択することができる（Protein Engineering, 7, 697 (1994)）。

本開示の完全長抗体またはその抗原結合フラグメントは、下記ステップによって作製することができる：特異的にヒトＣＴＧＦを認識し、その細胞外領域アミノ酸配列または三次元構造に結合する本開示の抗体をコードするｃＤＮＡを得る；ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを作製する；該ＤＮＡを原核生物発現ベクターまたは真核生物発現ベクターに挿入する；およびその後、該発現ベクターを原核生物または真核生物に導入してｄｓＦｖを発現させる。

用語「アミノ酸変化」または「アミノ酸変異」とは、タンパク質またはポリペプチドのバリアントにおける、元のタンパク質またはポリペプチドと比較したアミノ酸の変化または変異をいい、元のタンパク質またはポリペプチドに基づく１、２、３またはそれ以上のアミノ酸挿入、欠失または置換を包含する。

用語「抗体フレームワーク」または「ＦＲ領域」とは、可変ドメインＶＬまたはＶＨの部分であって、該可変ドメインの抗原結合ループ（ＣＤＲ）の足場としてはたらく部分をいう。これは本質的に、ＣＤＲを除いた可変ドメインである。

用語「相補性決定領域」、「ＣＤＲ」または「超可変領域」とは、抗原結合に主に寄与する抗体可変ドメイン中に存在する６つの超可変領域の１つをいう。一般に、各重鎖可変領域に３つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）が存在し、各軽鎖可変領域に３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）が存在する。ＣＤＲのアミノ酸配列境界は、「Ｋａｂａｔ」ナンバリング基準（Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5th edition, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD参照）、「Ｃｈｏｔｈｉａ」ナンバリング基準（Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273:927-948）、およびＩｍｍｕｎｏＧｅｎＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）ナンバリング基準（Lefranc MP, Immunologist, 7, 132- 136 (1999); Lefranc, MP, etc., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)）等を包含する、よく知られたさまざまなスキームのいずれかによって決定することができる。例えば、伝統的なフォーマットでＫａｂａｔ基準にしたがって、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のＣＤＲアミノ酸残基が、３１～３５（ＨＣＤＲ１）、５０～６５（ＨＣＤＲ２）および９５～１０２（ＨＣＤＲ３）と番号付けられ、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のＣＤＲアミノ酸残基が、２４～３４（ＬＣＤＲ１）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）および８９～９７（ＬＣＤＲ３）と番号付けられる。Ｃｈｏｔｈｉａ基準にしたがって、ＶＨのＣＤＲアミノ酸残基が、２６～３２（ＨＣＤＲ１）、５２～５６（ＨＣＤＲ２）および９５～１０２（ＨＣＤＲ３）と番号付けられ、ＶＬ中のアミノ酸残基が、２６～３２（ＬＣＤＲ１）、５０～５２（ＬＣＤＲ２）および９１～９６（ＬＣＤＲ３）と番号付けられる。ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの両者を組み合わせてＣＤＲを限定すると、ＣＤＲは、ヒトＶＨ中のアミノ酸残基２６～３５（ＨＣＤＲ１）、５０～６５（ＨＣＤＲ２）および９５～１０２（ＨＣＤＲ３）、ならびにヒトＶＬ中のアミノ酸残基２４～３４（ＬＣＤＲ１）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）および８９～９７（ＬＣＤＲ３）からなる。ＩＭＧＴ基準にしたがって、ＶＨのＣＤＲアミノ酸残基が、おおよそ２６～３５（ＣＤＲ１）、５１～５７（ＣＤＲ２）および９３～１０２（ＣＤＲ３）と番号付けられ、ＶＬ中のＣＤＲアミノ酸残基が、おおよそ２７～３２（ＣＤＲ１）、５０～５２（ＣＤＲ２）および８９～９７（ＣＤＲ３）と番号付けられる。ＩＭＧＴ基準にしたがって、IMGT/DomainGap Align Programの使用により、抗体のＣＤＲ領域を決定することができる。別に指定しない限り、本開示の態様に関する抗体可変領域およびＣＤＲ配列は、「Ｋａｂａｔ」ナンバリング基準に適用可能である。

用語「エピトープ」または「抗原決定基」とは、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する抗原上の部分（例えば、ＣＴＧＦ分子上の特定の部分）をいう。エピトープは典型的には、独特の三次コンフォメーションをなす少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の連続または不連続アミノ酸を含む。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G.E. Morris, Ed. (1996)を参照されたい。

「～に特異的に結合する」または「～に選択的に結合する」とは、抗体が抗原上の所定のエピトープに結合することをいう。典型的には、抗体は、約１０^－８Ｍ未満の、例えば約１０^－９Ｍ、１０^－１０Ｍ、１０^－１１Ｍ、１０^－１２Ｍ未満の、またはより小さい親和性（ＫＤ）で結合する。

用語「ＫＤ」とは、特定の抗体－抗原相互作用についての解離平衡定数をいう。本開示の抗体は全般に、ＣＴＧＦに約１０^－７Ｍ未満、例えば約１０^－８Ｍまたは１０^－９Ｍ未満の解離平衡定数（ＫＤ）で結合し、例えば、細胞表面抗原に対する本開示の抗体の親和性は、ＫＤ値をＦＡＣＳ法で測定することによって決定される。

用語「競合」は、同じエピトープについて競合する抗原結合タンパク質（例えば中和性の抗原結合タンパク質または中和抗体）の文脈において用いられるとき、試験する抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその免疫学的に機能的なフラグメント）が共通の抗原（例えば、ＣＴＧＦ抗原またはそのフラグメント）に対する参照抗原結合タンパク質（例えば、リガンドまたは参照抗体）の特異的結合を抑制または阻害（例えば減少）するアッセイによって測定される、抗原結合タンパク質間の競合が起こることを意味する。抗原結合タンパク質どうしが競合するかを決定するために、多くの種類の競合結合アッセイが利用可能である。このようなアッセイは例えば、固相直接または間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接または間接酵素免疫測定（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（例えば、Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9: 242-253参照）；固相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（例えば、Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137: 3614-3619参照）、固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（例えば、Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press参照）；I-125標識を用いる固相直接標識ＲＩＡ（例えば、Morel et al., 1988, Molec. Immunol. 25: 7-15参照）；固相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（例えば、Cheung, et al., 1990, Virology 176: 546-552参照）；および直接標識ＲＩＡ（Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol. 32: 77-82）である。典型的には、アッセイは、標識していない試験抗原結合タンパク質および標識した参照抗原結合タンパク質の両方を搭載した固相または細胞に結合することのできる精製抗原の使用を伴う。競合阻害が、試験抗原結合タンパク質の存在下の固相または細胞に結合した標識の量を測定することによって、測定される。通常、試験抗原結合タンパク質は過剰に存在する。（抗原結合タンパク質との競合の）競合アッセイによって同定される抗原結合タンパク質は、以下のものを包含する：参照抗原結合タンパク質と同じエピトープに結合する抗原結合タンパク質；および参照抗原結合タンパク質が結合するエピトープに十分に近いエピトープに結合する抗原結合タンパク質で、ここで、２つのエピトープが互いに立体障害して結合を妨害するもの）。競合結合を測定する方法についてのさらなる詳細は、本書の実施例に記載される。典型的には、競合抗原結合タンパク質が過剰に存在するとき、それは、共通の抗原に対する参照抗原結合タンパク質の特異的結合を、少なくとも４０～４５％、４５～５０％、５０～５５％、５５～６０％、６０～６５％、６５～７０％、７０～７５％もしくは７５％以上阻害（例えば減少）しうる。いくつかの場合に、結合は少なくとも８０～８５％、８５～９０％、９０～９５％、９５～９７％または９７％以上阻害される。

本書において、用語「核酸分子」とは、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子をいう。核酸分子は一本鎖または二本鎖であることができ、好ましくは二本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ｍＲＮＡもしくは修飾ｍＲＮＡである。核酸は、別の核酸配列との機能的な関連に置かれるとき、「作動可能に連結」される。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、コーディング配列の転写に影響するならば、該コーディング配列と作動可能に連結される。

アミノ酸配列の「同一性」とは、第１および第２の配列間で、アミノ酸配列が配列同一性が最大となるようにアラインされたとき（必要な場合にはギャップが挿入される）、同一であるアミノ酸残基のパーセンテージをいい、いかなる保存的置換も配列同一性を構成するものとはみなされない。アミノ酸配列同一性パーセンテージを決定する目的のために、アラインメントは、当分野の範囲内のさまざまな方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアといった公に利用可能なコンピュータソフトウェアを用いて達成することができる。当業者は、比較する配列全長にわたる最適なアラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含み、アラインメント比較のために適当なパラメータを決定することができる。

用語「発現ベクター」は、それに連結された別の核酸を運ぶことのできる核酸分子をいう。一態様において、ベクターは「プラスミド」であり、これは、そこにさらなるＤＮＡ断片を連結することのできる環状の二本鎖ＤＮＡループをいう。他の一態様において、ベクターはウイルスベクターであり、該ウイルスのゲノムにさらなるＤＮＡ断片を連結することができるものである。本開示のベクターは、導入された宿主細胞中で自己複製することができる（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーマル哺乳動物ベクター）、または宿主細胞に導入後、宿主細胞のゲノムに一体化され、それによって宿主ゲノムと一緒に複製することができる（例えば、非エピソーマル哺乳動物ベクター）。

抗体および抗原結合フラグメントを作製および精製する方法は、当分野においてよく知られている。例えば、A Laboratory Manual for Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, chapters 5-8 and 15。例えば、マウスをヒトＣＴＧＦまたはその断片で免疫し、その後、生じた抗体を当分野においてよく知られる通常の方法を用いて復元、精製およびアミノ酸配列シーケンシングすることができる。抗原結合フラグメントも通常の方法で調製することができる。本開示の抗体または抗原結合フラグメントは、非ヒト抗体由来のＣＤＲ領域に１つ以上のヒトフレームワーク領域を組みこむように改変される。ヒトＦＲ生殖細胞系列配列を、ImMunoGeneTics（IMGT）からウェブサイトhttp://imgt.cines.frを介して、またはThe Immunoglobulin Facts Book, 2001, ISBN 012441351から、ＩＭＧＴヒト抗体可変生殖細胞系列遺伝子データベースにＭＯＥソフトウェアを用いてアラインすることによって得ることができる。

用語「宿主細胞」とは、発現ベクターが導入されている細胞をいう。宿主細胞は、細菌、微生物、植物または動物細胞を包含しうる。導入が容易な細菌は、大腸菌またはサルモネラ株といった腸内細菌科；枯草菌といったバシラス科；肺炎球菌；レンサ球菌およびインフルエンザ菌のメンバーを包含しうる。適当な微生物はサッカロミセス・セレビシエおよびピキア酵母を包含する。適当な動物宿主細胞株はＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細菌株）、２９３細菌、およびＮＳ０細胞を包含する。

本開示の組換え抗体または抗原結合フラグメントは、通常の方法で作製および精製することができる。例えば、重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列をクローン化し、ＧＳ発現ベクター中に組換えることができる。次いで、組換え免疫グロブリンを発現するベクターを、ＣＨＯ細胞に安定にトランスフェクトすることができる。当分野でよく知られる、より推奨される方法として、哺乳動物発現系はグリコシル化を、典型的には高度に保存されたＦｃ領域Ｎ末端部位においてもたらしうる。ヒトＣＴＧＦに特異的に結合する抗体の発現によって、適当なクローンを得ることができる。陽性クローンを、抗体産生用バイオリアクター内で無血清培養培地中で増幅することができる。抗体が分泌されている培養培地を、通常の方法で精製することができる。例えば、精製を、バッファーで調整したプロテインＡまたはＧのSepharose FFカラムにおいて行うことができる。非特異的結合成分を洗い流す。結合した抗体をｐＨ勾配によって溶出させ、抗体分画をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより検出し、プールする。抗体を一般的な方法で濾過し濃縮する。可溶性混合物およびマルチマーを、サイズ排除またはイオン交換といった一般的な方法で効果的に除去することができる。得られた産物は、直ちに凍結、例えば－７０℃で凍結する、または凍結乾燥する必要がある。

「投与する」、「投薬する」または「処置する」とは、動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、器官または生物学的液体に適用されるとき、外来の医薬、治療剤、診断剤または組成物を、動物、ヒト、対象、細胞、組織、器官または生物学的液体と接触させることをいう。「投与する」、「投薬する」または「処置する」とは、例えば治療、薬物動態学的、診断、研究および実験方法をいうことができる。細胞の処置は、薬剤を細胞と接触させること、および薬剤を細胞と接触している液体と接触させることを包含する。「投与する」、「投薬する」または「処置する」とは、インビトロまたはエクスビボで、例えば細胞を、薬剤、診断剤、結合化合物または別の細胞で処理することをも意味する。「処置する」は、ヒト、動物または研究対象に適用されるとき、治療的処置、予防的または抑制的手段、研究および診断適用をいう。

「処置」は、本開示の任意の結合化合物を含む組成物といった処置剤を、それが処置活性を示すことがわかっている１つ以上の疾患症状を有する患者に内用または外用で投与することを意味する。典型的には、処置剤は、臨床的に測定可能な程度で、処置する患者または集団において１つ以上の疾患症状を軽減する、該症状の退行を誘導する、または該症状の進行を抑制するのに有効な量で投与される。任意の特定の疾患症状を軽減するのに有効な処置剤の量（「処置有効量」とも称する）は、患者の疾患状態、年齢および体重、また、患者において所望の反応を引き起こす処置剤の能力、といったさまざまな因子によって変化しうる。疾患症状が軽減されたかは、該症状の重篤度または進行状態を評価するために医師または他の熟練ヘルスケア提供者によって典型的に用いられる任意の臨床的測定によって評価することができる。本開示のある態様（例えば処置方法または製造物品）は、標的疾患症状の軽減において全ての患者において有効ではないかもしれないが、スチューデントのｔ検定、カイ二乗検定、マン・ホイットニーのＵ検定、クラスカル・ウォリス検定（Ｈ検定）、ヨンキー・テルプストラ検定およびウィルコクソン検定といった当分野で知られる任意の統計学的検定によって決定される統計学的に有意な数の患者において標的疾患症状を軽減すべきである。

「保存的改変」または「保存的置換」とは、タンパク質中のアミノ酸が、同様の性質（例えば、電荷、側鎖の大きさ、疎水性／親水性、バックボーンのコンフォメーションおよび剛性等）を有する他のアミノ酸によって、しばしばタンパク質の生物学的活性を変化しないように、置換されることをいう。当業者は、一般にポリペプチドの非本質的領域における単一のアミノ酸置換は生物学的活性を実質的に変化しないことを理解する（例えば、Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., Page 224, (4th edition)参照）。さらに、構造的または機能的に同様であるアミノ酸による置換は、生物学的活性を乱す可能性が低い。保存的置換の例を次に示す。

「有効量」または「有効用量」とは、任意の１つ以上の有益なまたは所望の結果を得るのに必要な医薬、化合物または医薬組成物の量をいう。予防的な適用では、有益なまたは所望の結果は、疾患状態、その合併症、および状態発症の過程の中間的病的表現型の生化学的、組織学的および行動学的兆候を包含して、疾患のリスクの解消もしくは低下、重篤度の低下、または発症の遅延を包含する。治療的適用では、有益なまたは所望の結果は、患者における、本開示の標的抗原に関連するさまざまな状態の発症の低下、もしくは状態の１つ以上の症状の改善、状態の処置に必要な他の薬剤の投与量／投与の減少、他の薬剤の効果の増強、および／または本開示の標的抗原に関連する状態の進行の遅延、といった臨床的結果を包含する。

「外来」とは、状況により生物、細胞またはヒトの外部で生成される物質をいう。「内因」とは、状況により細胞、生物または人体の中で生成される物質をいう。

「相同性」とは、２つのポリヌクレオチド配列間または２つのポリペプチド配列間の配列類似性をいう。比較する２つの配列の両方において、ある位置を同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットが占めるとき、例えば、２つのＤＮＡ分子それぞれにおいて、ある位置をアデニンが占める場合、それら分子はその位置において相同である。２つの配列間の相同性パーセンテージは、２つの配列間でマッチするまたは相同である位置の数を、比較される位置の数で除し、１００を掛けた関数である。例えば、２つの配列が最適にアラインされたとき、２つの配列の１０の位置のうちの６がマッチするまたは相同であるならば、２つの配列の相同性は６０％であり；２つの配列の１００の位置のうちの９５がマッチするまたは相同であるならば、２つの配列の相同性は９５％である。一般に、２つの配列がアラインされるとき、比較は相同性パーセンテージが最高となるようにして行われる。例えば、比較はＢＬＡＳＴアルゴリズムによって行うことができ、ここで、アルゴリズムのパラメータは、各参照配列の全長にわたり各配列の間でマッチが最大となるように選択される。以下の参考文献は、配列解析にしばしば用いられるＢＬＡＳＴアルゴリズムを参照している：ＢＬＡＳＴアルゴリズム（BLAST ALGORITHMS）: Altschul, SF et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. et al., (1993) Nature Genet. 3:266-272; Madden, TL et al., (1996) Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, SF et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. et al. (1997) Genome Res. 7:649-656。NCBI BLASTから利用可能なものといった他の従来のＢＬＡＳＴアルゴリズムも、当業者によく知られている。

本書において用いられる「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」なる表現は、互換的に用いられ、そのような表現はいずれも子孫を包含する。したがって、用語「形質転換細胞」および「形質転換された細胞」は、初代対象細胞、および継代数に関わらずそれに由来する培養物を包含する。意図的または非意図的な変異のために、全ての子孫がＤＮＡの内容において正確に同一ではあり得ないことも理解すべきである。元の形質転換細胞においてスクリーニングされたのと同じ機能または生物学的活性を有する変異子孫が包含される。明確な指定が意図される場合、それは文脈から明らかに理解されうる。

本書において「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」とは、例えば米国特許第４６８３１９５号に記載されるように、微量の核酸、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡの特定の部分を増幅する方法または技術をいう。一般に、オリゴヌクレオチドプライマーがデザインできるように、関心の領域の端部のまたは関心の領域を越える配列の情報が利用可能である必要があり；プライマーは、配列が、増幅しようとするテンプレートの対向する鎖と同一または同様でありうる。２つのプライマーの５’末端ヌクレオチドが、増幅される材料の末端と一致することができる。ＰＣＲは、特定のＲＮＡ配列、トータルゲノムＤＮＡに由来する特定のＤＮＡ配列、およびトータル細胞ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡ、バクテリオファージ、またはプラスミド配列を増幅するために使用することができる。例えば、全般に、Mullis et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Ouant. Biol. 51:263; Erlich editors, (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, NY)を参照されたい。本開示において用いるＰＣＲは、試験核酸サンプルを増幅するポリメラーゼ反応方法の一例であるが、これが唯一の例ではない、と考えられる。方法は、核酸の特定の部分を増幅または作製するために核酸ポリメラーゼと共にプライマーとして知られる核酸配列を使用することを含む。

「単離された」とは、それに係る分子が実質的に、核酸、タンパク質、脂質、炭水化物といった他の生物学的分子、または細胞デブリおよび増殖培地といった他の物質から分離されている純粋な状態をいう。用語「単離された」は通常、本書に記載される化合物の実験または処置用の使用を実質的に妨害する量で存在するのでない限り、完全に前記のような物質が存在しないこと、または水、バッファーもしくは塩が存在しないことを意味することは意図されない。

「任意の」または「任意に」とは、それが係る事象または状況が起こりうるが必ずしも起こらないことを意味し、記載は、事象または状況が起こるまたは起こらない場合を包含する。

「医薬組成物」とは、本開示の１つ以上の化合物またはその生理学的／薬学的に許容しうる塩もしくはプロドラッグ、および生理学的／薬学的に許容しうる担体および賦形剤といった他の化学化合物を含む混合物をいう。医薬組成物は、生体への投与の促進、有効成分の吸収の促進、およびそれによる生物学的効果の発揮を目的とする。

用語「薬学的に許容しうる担体」とは、抗体または抗原結合フラグメントの送達用製剤中に使用するのに適当な任意の不活性物質をいう。担体は、抗付着剤、付着剤、コーティング剤、崩壊剤、充填剤もしくは希釈剤、保存剤（例えば、抗酸化剤、抗細菌剤または抗真菌剤）、甘味剤、吸収遅延剤、湿潤剤、乳化剤等でありうる。適当な薬学的に許容しうる担体の例は、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、デキストロース、植物油（例えばオリーブ油）、塩類液、緩衝剤、緩衝塩類液、および等張化剤（例えば、糖、ポリオール、ソルビトールおよび塩化ナトリウム）を包含する。

さらに、本開示は、本開示の抗ＣＴＧＦ抗体またはその抗原結合フラグメントを有効成分として含む、標的抗原（例えばＣＴＧＦ）陽性細胞に関連する疾患を処置するための薬剤を包含する。有効成分は、処置有効量で対象に投与され、対象においてＣＴＧＦ陽性細胞に関連する疾患を処置することができる。処置有効量とは、組成物の単位用量が、前記のヒトＣＴＧＦに特異的に結合する完全長抗体またはその抗原結合フラグメントを０．１～３０００ｍｇ含むことを意味する。

本開示のＣＴＧＦ関連疾患は、ＣＴＧＦに関連する疾患である限り限定されない。例えば、本開示の分子によって誘発される処置応答は、ヒトＣＴＧＦに結合し、そしてＣＴＧＦがその受容体／リガンドに結合するのを阻止することによって、またはＣＴＧＦを過剰発現する腫瘍細胞を殺すことによって、役割を発揮することができる。したがって、本開示の分子は、処置適用に適当な製剤または処方中に存在するとき、肺線維症、腎線維症、腫瘍発生および増殖、緑内障、細胞増殖性疾患、白内障、脈絡膜新生血管、網膜剥離、増殖性硝子体網膜症、黄斑変性症、糖尿病網膜症、角膜瘢痕および角膜混濁、嚢胞、血管石灰化低下、膵管腺がん、膵臓がん、黒色腫、放射線誘導性線維症（ＲＩＦ）、特発性肺線維症、肺リモデリング疾患で、喘息、慢性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性繊維症、肺気腫等からなる群から選択されるもの、を場合により包含して、腫瘍またはがん、好ましくは膵臓がん、肺線維症および腎線維症を患うような対象に非常に有用である。

本開示はさらに、特異的に標的抗原（例えばヒトＣＴＧＦ）を認識し、その細胞外アミノ酸配列または三次元構造に結合する本開示の抗体または抗原結合フラグメントを（有効成分として）含む、標的抗原（例えばＣＴＧＦ）の免疫アッセイまたは測定の方法、標的抗原（例えばＣＴＧＦ）の免疫アッセイまたは測定用の試薬、標的抗原（例えばＣＴＧＦ）発現細胞の免疫アッセイまたは測定の方法、および標的抗原（例えばＣＴＧＦ）陽性細胞が関与する疾患の診断用の診断剤に関する。

本開示において、標的抗原（例えばＣＴＧＦ）を検出するまたはその量を測定する方法は、任意の既知の方法でありうる。例えば、それは免疫アッセイまたは測定方法を包含する。

免疫アッセイまたは測定方法は、標識した抗原または抗体を用いて抗体または抗原を検出またはその量を測定する方法でありうる。免疫アッセイまたは測定方法の例は、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、発光免疫測定法、ウエスタンブロッティング、物理化学的方法等を包含する。

前記のＣＴＧＦ陽性細胞が関与する疾患は、本開示の抗体または抗体フラグメントを用いてＣＴＧＦ発現細胞を検出または測定することによって診断することができる。

ポリペプチド発現細胞は、既知の免疫検出方法によって、好ましくは免疫沈降、蛍光細胞染色、免疫組織染色等によって検出することができる。さらに、FMAT8100HTSシステム（Applied Biosystem）による蛍光抗体染色法といった方法を用いることができる。

本開示において、標的抗原（例えばＣＴＧＦ）を発現する細胞を含む可能性がある限り、組織、細胞、血液、血漿、血清、膵液、尿、糞便、組織液または培養培地といった、標的抗原（例えばＣＴＧＦ）について検出または測定するサンプルに、特に制限はない。

必要な診断方法に応じて、本開示のモノクローナル抗体またはその抗体フラグメントを含む診断剤は、抗原－抗体反応の実施のための薬剤、または反応の検出のための薬剤をも含みうる。抗原－抗体反応の実施のための薬剤は、バッファー、塩等を包含する。検出に使用する試薬は、免疫アッセイまたは免疫検出方法において通常用いられる薬剤、例えば、モノクローナル抗体、抗体フラグメントまたはそのコンジュゲートを認識する標識された二次抗体、および標識に相当する物質を包含する。

本開示の１つ以上の態様の詳細が上記に記載される。好ましい方法および材料が下記に記載されるが、ここに記載されるものと同様または同一の任意の方法および材料を、本開示の実施または試験に使用することができる。本開示の他の特徴、目的および利点が、本明細書および特許請求の範囲を通じて明らかとなりうる。本明細書および特許請求の範囲において、文脈からそうでないことが明らかでない限り、単数形は複数形を包含することが意図される。本書において使用される技術用語および科学用語はいずれも、本書において別の定義が明らかになされない限り、本開示が属する分野の専門家によって通常理解される意味を有する。本明細書中に引用される特許および刊行物はいずれも、参照することにより組み込まれる。下記の実施例は、本開示の好ましい態様をより詳細に説明するために供されるものである。実施例は本開示の範囲に何らかの限定をするものと解釈されるべきではなく、本開示の範囲は特許請求の範囲によって規定される。

実施例１：ＣＴＧＦ抗原および抗体の作製
Ｉ．抗原のデザインおよび発現
ヒトＣＴＧＦタンパク質（Genbank number: NM_001901.2）を、抗原および検出用タンパク質のアミノ酸配列をデザインするためのテンプレートとして用いた。場合により、ＣＴＧＦタンパク質またはその断片にさまざまなタグを融合し、ｐＴＴ５ベクターまたはｐＸＣベクター中に個別にクローン化し、２９３細胞において一過性に発現させるか、またはＬＯＮＺＡ ＣＨＯ細胞において安定に発現させて、本開示の抗原および検出用タンパク質を得た。特にし示さない限り、以下のＣＴＧＦ抗原をヒトＣＴＧＦという：

ヒトＣＴＧＦ完全長タンパク質（免疫用）；配列番号１：

ＣＴＧＦ－ｈｉｓ（ヒトＣＴＧＦ成熟タンパク質とｈｉｓタグの融合タンパク質）を検出に使用することができる；配列番号２：

（注：一重下線はシグナルペプチドを示し、イタリック体はｈＣＴＧＦの細胞外領域を示し、二重下線はｈｉｓタグを示す。）

ｍＣＴＧＦ－ｍＦｃ（検出に使用することができる、マウスＣＴＧＦコーディング領域とマウスＦｃタグの融合タンパク質）；配列番号３：

（注：一重下線はシグナルペプチドを示し、イタリック体はマウスＣＴＧＦコーディング領域を示し、二重下線はｍＦｃタグを示す。）

マウスＣＴＧＦタンパク質－Ｈｉｓタグ；配列番号４：

（注：一重下線はシグナルペプチドを示し、イタリック体はマウスＣＴＧＦコーディング領域を示し、二重下線はｈｉｓタグを示す。）

カニクイザルＣＴＧＦ－Ｆｃ（検出に使用することができる、カニクイザルＣＴＧＦコーディング領域とＦｃの融合タンパク質）；配列番号５：

（注：一重下線はシグナルペプチドを示し、イタリック体はカニクイザルＣＴＧＦコーディング領域を示し、二重下線はＦｃタグを示す。）

II．ＣＴＧＦ関連組換えタンパク質の精製、ならびに抗ヒトＣＴＧＦハイブリドーマ抗体および組換え抗体の精製
１．プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーによるハイブリドーマ上清の分離および精製
マウスハイブリドーマ上清の精製のために、プロテインＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーが好適であった。培養の結果生じたハイブリドーマを遠心分離し、上清を取り、上清の体積に基づいて１０～１５体積％の１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０～８．５）を加えて、上清のｐＨを中性に調節した。プロテインＧカラムを、カラム容積の３～５倍の６Ｍグアニジン塩酸塩で洗い、次いでカラム体積の３～５倍の純水で洗い；カラム体積の３～５倍の１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）でカラムを平衡化し；細胞上清を結合のために低流速でロードし、流速は保持時間が約１分間以上となるように調節し；ＵＶ吸収がベースラインに低下するまで、カラム体積の３～５倍の１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）でカラムを洗い；サンプルを０．１Ｍ酢酸／酢酸ナトリウム（ｐＨ３．０）バッファーで溶出し、ＵＶ検出にしたがって溶出ピークをプールした。溶出物を速やかに１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）でｐＨ５～６に調節した。溶出物を、当業者によく知られる方法にしたがって溶液交換に付すことができ、例えば、限外濾過チューブを用いる限外濾過－濃縮によって溶液を所望のバッファー系に交換する、またはＧ－２５脱塩といった分子排除によって溶液を所望のバッファー系に交換する、またはSuperdex 200といった高分離能分子排除カラムの使用によって溶出物から凝集物を除去してサンプル純度を改善することができた。

２．プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによる抗体の精製
まず、抗体を発現している細胞培養上清を高速で遠心分離して、上清を集めた。プロテインＡアフィニティーカラムをカラム体積の３～５倍の６Ｍグアニジン塩酸塩で洗い、次いでカラム体積の３～５倍の純水で洗った。カラム体積の３～５倍の、例えば１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で、カラムを平衡化した。細胞上清を結合のために低流速でロードし、流速は保持時間が約１分間以上となるように調節し；結合が終了したら、ＵＶ吸収がベースラインに低下するまで、カラム体積の３～５倍の１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）でカラムを洗った。サンプルを０．１Ｍ酢酸／酢酸ナトリウム（ｐＨ３．０～３．５）バッファーで溶出し、ＵＶ検出にしたがって溶出ピークをプールした。溶出物を速やかに１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）でｐＨ５～６に調節した。溶出物を、当業者によく知られる方法にしたがって溶液交換に付すことができ、例えば、限外濾過チューブを用いる限外濾過－濃縮によって溶液を所望のバッファー系に交換する、またはＧ－２５脱塩といった分子排除によって溶液を所望のバッファー系に交換する、またはSuperdex 200といった高分離能分子排除カラムの使用によって溶出物から凝集物を除去してサンプル純度を改善することができた。

３．ＣＴＧＦ関連組換えタンパク質（例えばヒトＣＴＧＦ－ｈｉｓ）のニッケルカラムによる精製
細胞発現上清サンプルを高速で遠心分離して不純物を除去し、バッファーをＰＢＳと交換し、イミダゾールを終濃度５ｍＭで加えた。ニッケルカラムを５ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳ溶液で平衡化し、カラム体積の２～５倍で洗った。交換後の上清サンプルを結合のためにカラムにロードし、異なる会社から入手可能なニッケルカラムを媒体として選択することができる。カラムを、Ａ２８０の読み取りがベースラインに低下するまで、５ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳ溶液で洗った。非特異的に結合したタンパク質不純物を除去するためにクロマトグラフィーカラムをＰＢＳ＋１０ｍＭイミダゾールで洗い、流出液を集めた。３００ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳ溶液で標的タンパク質を溶出し、溶出ピークを集めた。

集めた溶出物を濃縮したが、その後、それを、ＰＢＳを移動相とするゲルクロマトグラフィーSuperdex200（GE）によってさらに精製して、凝集物および不純物タンパク質ピークを除去し標的産物溶出ピークを集めることができる。得られたタンパク質を、電気泳動、ペプチドマッピングおよびＬＣ－ＭＳによって同定し、適正なタンパク質を使用のために小分けした。

４．ＣＴＧＦ関連組換えタンパク質（例えばヒトＣＴＧＦ－Ｆｃ、カニクイザルＣＴＧＦ－Ｆｃ）のプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによる精製
まず、培養上清を高速で遠心分離して上清を集めた。プロテインＡアフィニティーカラムを、カラム体積の３～５倍の６Ｍグアニジン塩酸塩で洗い、次いでカラム体積の３～５倍の純水で洗った。カラム体積の３～５倍の、例えば１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で、カラムを平衡化した。細胞上清を結合のために低流速でロードし、流速は保持時間が約１分間以上となるように調節し；結合が終了したら、ＵＶ吸収がベースラインに低下するまで、カラム体積の３～５倍の１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）でカラムを洗った。サンプルを０．１Ｍ酢酸／酢酸ナトリウム（ｐＨ３．０～３．５）バッファーで溶出し、ＵＶ検出にしたがって溶出ピークをプールした。

採取した溶出物を濃縮したが、その後、それを、ＰＢＳを移動相とするゲルクロマトグラフィーSuperdex200（GE）によってさらに精製して、凝集物および不純物タンパク質ピークを除去し標的産物溶出ピークを集めることができる。得られたタンパク質を、電気泳動、ペプチドマッピングおよびＬＣ－ＭＳによって同定し、適正なタンパク質を使用のために小分けした。

実施例２：抗ヒトＣＴＧＦモノクローナル抗体の作製
Ｉ．免疫
抗ヒトＣＴＧＦモノクローナル抗体を、マウスを免疫することによって作製した。６～８週齢の雌ＳＪＬ白マウスを実験に使用した（Beijing Charles River Experimental Animal Technology Co., Ltd., animal production license number: SCXK (Beijing) 2012-0001）。飼育環境：ＳＰＦレベル。マウスを購入後、１２／１２時間の明／暗サイクル、温度２０～２５℃、湿度４０～６０％の実験室環境に１週間維持した。環境に順応したマウスを下記スキームにしたがって免疫した。免疫用抗原として、ＣＴＧＦ（R&D）およびｍＣＴＧＦ－ｍＦｃを使用した。

免疫スキーム：２５μｇ／マウス／回のＣＴＧＦタンパク質腹腔内注射によってマウスを免疫した。０日目に１００μｌ／マウスを腹腔内（ＩＰ）注射し、１４日毎に１回の追加免疫を行った。２１、３５、４９および６３日目に血液サンプルを採り、マウス血清中の抗体力価をＥＬＩＳＡ法により測定した。７～９回の免疫後、高い血清抗体力価がプラトーに近づいたマウスを脾細胞融合のために選択した。脾細胞融合の３日前に、追加免疫のために、２５μｇ／マウスで、塩類液中に調製したＣＴＧＦタンパク質抗原溶液を腹腔内注射（ＩＰ）した。

II．脾細胞融合
ＰＥＧ仲介融合法を用いて脾臓リンパ球とミエローマＳｐ２／０（ATCC（登録商標）CRL-8287（商標））を融合することにより、ハイブリドーマ細胞を得た。融合ハイブリドーマ細胞を完全培地（２０％ＦＢＳ、１×ＨＡＴ、１×ＯＰＩを含むＩＭＤＭ培地）に０．５～１×１０^６／ｍｌの密度で再懸濁し、９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェルで播種し、３７℃および５％ＣＯ_２で３～４日間インキュベートし、１００μｌ／ウェルのＨＡＴ完全培地を補充し、ピンポイントのクローンを形成するまで３～４日間培養を続けた。上清を除去し、２００μｌ／ウェルのＨＴ完全培地（２０％ＦＢＳ、１×ＨＴ、１×ＯＰＩを含むＩＭＤＭ培地）を加え、３７℃、５％ＣＯ_２で３日間インキュベートし、その後、ＥＬＩＳＡ検出に付した。

III．ハイブリドーマ細胞のスクリーニング
ハイブリドーマ細胞の増殖密度にしたがって、ハイブリドーマ培養上清を結合ＥＬＩＳＡ法によって検出した。陽性ウェルの細胞上清を、サルＣＴＧＦ／マウスＣＴＧＦ／ヒトＣＴＧＦタンパク質との結合についてＥＬＩＳＡアッセイによって検出した（具体的な方法は実施例３のものと同じであった）。タンパク質ＥＬＩＳＡ結合アッセイで陽性のウェルの細胞を適時に増殖させ、凍結保存し；単一細胞クローンが得られるまで２～３回サブクローニングした。

各サブクローニング後の細胞もＣＴＧＦ結合ＥＬＩＳＡによって試験した。上記アッセイによるスクリーニングによってハイブリドーマクローンを得た。無血清細胞培養法によって抗体をさらに調製した。抗体を、試験実施例における使用のために、精製の実施例にしたがって精製した。

IV．陽性ハイブリドーマクローンのシーケンシング
陽性ハイブリドーマ由来の配列をクローニングする手順は、次のとおりであった。対数増殖期にあるハイブリドーマ細胞を集めた。Trizol（Invitrogen, Cat No. 15596-018）をキットの指示書にしたがって使用してＲＮＡを抽出し、PrimeScript（商標）逆転写キット（Takara, Cat No. 2680A）を用いて逆転写した。逆転写により生じたｃＤＮＡを、マウスＩｇプライマーセット（Novagen, TB326 Rev. B 0503）を用いるＰＣＲによって増幅し、増幅生成物をシーケンシングに付した。シーケンシング後、マウス抗ＣＴＧＦ抗体ｍａｂ１４７、ｍａｂ１６４およびｍａｂ９５を得た。可変領域のアミノ酸配列は次のとおりである：

ｍａｂ１４７のＶＨアミノ酸配列は、配列番号６：

で示される。
ｍａｂ１４７のＶＬアミノ酸配列は、配列番号７：

で示される。

ｍａｂ１６４のＶＨアミノ酸配列は、配列番号８：

で示される。
ｍａｂ１６４のＶＬアミノ酸配列は、配列番号９：

で示される。

ｍａｂ９５のＶＨアミノ酸配列は、配列番号６９：

で示される。
ｍａｂ９５のＶＬアミノ酸配列は、配列番号７０：

で示される。

上記ｍａｂ１４７、ｍａｂ１６４およびｍａｂ９５抗体可変領域配列において、イタリック体はＦＲ配列を表し、下線付きイタリック体はＣＤＲ配列を表し、配列の並びはＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４である。

Ｖ．ヒトＩｇＧ１キメラ抗体の作製
候補分子ｍａｂ１４７、ｍａｂ１６４およびｍａｂ９５を増幅し、シーケンシングして、可変領域をコードする遺伝子配列を得た。シーケンシングによって得た配列に基づいてフォワードおよびリバースプライマーをデザインし、シーケンシングされる遺伝子をテンプレートとして使用して各抗体のＶＨ／ＶＫ遺伝子フラグメントをＰＣＲにより作製し、次いでそれを相同組換えによって発現ベクターｐＨｒ（シグナルペプチドおよびｈＩｇＧ１／ｈκ／ｈλ定常領域遺伝子（ＣＨ１－Ｆｃ／ＣＬ）フラグメントを有する）に挿入して、完全長組換えキメラ抗体の発現プラスミドＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ－ｐＨｒ／ＶＬ－ＣＬ－ｐＨｒを作製し、結果として３つのキメラ抗体Ｃｈ１４７、Ｃｈ１６４およびＣｈ９５を得た。

VI．マウス抗ヒトＣＴＧＦ抗体のヒト化
マウス抗体との相同性の高い重鎖および軽鎖可変領域生殖細胞系列遺伝子を、ＩＭＧＴ（http://imgt.cines.fr）ヒト抗体重鎖および軽鎖可変生殖細胞系列遺伝子データベースに対してＭＯＥソフトウェア（Molecular Operating Environment）のソフトウェアを用いてアラインすることによって、テンプレートとして選択した。マウス抗体ＣＤＲを対応するヒトテンプレート中にグラフトして、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の並びの可変領域配列を形成した。

１．ｍａｂ１４７のヒト化
マウス抗体ｍａｂ１４７に対しては、ヒト化用の軽鎖テンプレートはＩＧＫＶ３－１１＊０１およびＩＧＫＪ２＊０１、またはＩＧＫＶ１－３９＊０１およびＩＧＫＪ２＊０１であり、ヒト化用の重鎖テンプレートは、ＩＧＨＶ３－７２＊０１およびＩＧＨＪ１＊０１であった。マウス抗体ｍａｂ１４７の各ＣＤＲをそのヒトテンプレートにグラフトし、次いでヒト化抗体のＦＲのアミノ酸を復帰変異に付した。そのなかで、軽鎖可変領域中の復帰変異は、４Ｌ、３６Ｆ、４３Ｓ、４５Ｋ、４７Ｗ、５８Ｖまたは７１Ｙからなる群から選択される１つ以上を含み、重鎖可変領域中の復帰変異は、２８Ｓ、３０Ｎ、４９Ａ、７５Ｅ、７６Ｓ、９３Ｖ、９４Ｅまたは１０４Ｄからなる群から選択される１つ以上を含み（軽鎖および重鎖可変領域中の復帰変異位置は、Ｋａｂａｔナンバリング基準にしたがって決定した）、その結果、異なる配列の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を得た。ｍａｂ１４７のＣＤＲを含むヒト化抗体を得たが、その可変領域配列は次のとおりである：

ｍＡｂ１４７のヒト化抗体の具体的な可変領域配列は次のとおりである：
Ｈｕ１４７－ＶＬ１のアミノ酸配列は、配列番号２２：

で示される。
Ｈｕ１４７－ＶＬ２のアミノ酸配列は、配列番号２３：

で示される。
Ｈｕ１４７－ＶＬ３のアミノ酸配列は、配列番号２４：

で示される。
Ｈｕ１４７－ＶＬ４のアミノ酸配列は、配列番号２５：

で示される。
Ｈｕ１４７－ＶＬ５のアミノ酸配列は、配列番号２６：

で示される。
Ｈｕ１４７－ＶＨ１のアミノ酸配列は、配列番号２７：

で示される。
Ｈｕ１４７－ＶＨ２のアミノ酸配列は、配列番号２８：

で示される。
Ｈｕ１４７－ＶＨ３のアミノ酸配列は、配列番号２９：

で示される。

注：Ｋａｂａｔ基準にしたがって決定されたＣＤＲ配列に下線を付しており、配列の並びはＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の順である。

２．ｍａｂ１６４のヒト化
マウス抗体ｍａｂ１６４に対しては、ヒト化用の軽鎖テンプレートはそれぞれＩＧＬＶ７－４３＊０１およびＩＧＬＪ２＊０１、ＩＧＬＶ８－６１＊０１およびＩＧＬＪ２＊０１、またはＩＧＬＶ１－４０＊０２およびＩＧＬＪ２＊０１からなり、ヒト化用の重鎖テンプレートはそれぞれＩＧＨＶ２－２６＊０１およびＩＧＨＪ６＊０１、またはＩＧＨＶ４－３１＊０２およびＩＧＨＪ６＊０１からなった。マウス抗体ｍａｂ１６４の各ＣＤＲをそのヒトテンプレートにグラフトし、次いでヒト化抗体のＦＲのアミノ酸を復帰変異に付した。そのなかで、軽鎖可変領域中の復帰変異は、３６Ｖ、４４Ｆ、４６Ｇまたは４９Ｇからなる群から選択される１つ以上を含み、重鎖可変領域中の復帰変異は、４４Ｇ、４９Ｇ、２７Ｆ、４８Ｌ、６７Ｌ、７１Ｋ、７８Ｖまたは８０Ｆからなる群から選択される１つ以上を含み（軽鎖および重鎖可変領域中の復帰変異位置はＫａｂａｔナンバリング基準にしたがって決定した）、その結果、下記可変領域配列を有する、ｍａｂ１６４のヒト化重鎖および軽鎖を得た：

ｍＡｂ１６４のヒト化抗体の具体的な可変領域配列は次のとおりである：
Ｈｕ１６４－ＶＬ７のアミノ酸配列は、配列番号３０：

で示される。
Ｈｕ１６４－ＶＬ８のアミノ酸配列は、配列番号３１：

で示される。
Ｈｕ１６４－ＶＬ９のアミノ酸配列は、配列番号３２：

で示される。
Ｈｕ１６４－ＶＨ５のアミノ酸配列は、配列番号３３：

で示される。
Ｈｕ１６４－ＶＨ６のアミノ酸配列は、配列番号３４：

で示される。
Ｈｕ１６４－ＶＨ７のアミノ酸配列は、配列番号３５：

で示される。
Ｈｕ１６４－ＶＨ８のアミノ酸配列は、配列番号３６：

で示される。

注：上記Ｈｕ１６４抗体配列において、下線はＣＤＲ配列を示し、配列の並びはＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４であり、ここで、ＣＤＲ配列はＫａｂａｔ基準にしたがって規定される。

３．ｍａｂ９５のヒト化
マウス抗体ｍａｂ９５に対しては、ヒト化用の軽鎖テンプレートはＩＧＫＶ３－２０＊０２およびＩＧＫＶ１－４０＊０１であり、ヒト化用の重鎖テンプレートは、ＩＧＨＶ１－３＊０１であった。マウス抗体ｍａｂ９５の各ＣＤＲをそのヒトテンプレートにグラフトし、次いでヒト化抗体のＦＲのアミノ酸を復帰変異に付した。そのなかで、軽鎖可変領域中の復帰変異は、４５Ｐ、４６Ｗ、４８Ｙ、６９Ｓまたは７０Ｙからなる群から選択される１つ以上を含み、重鎖可変領域中の復帰変異は、２７Ｆ、３８Ｋ、４８Ｉ、６７Ｋ、６８Ａ、７０Ｌまたは７２Ｆからなる群から選択される１つ以上を含み（軽鎖および重鎖可変領域中の復帰変異位置は、Ｋａｂａｔナンバリング基準にしたがって決定した）、その結果、異なる配列の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を得た。ｍａｂ９５のＣＤＲを含むヒト化抗体を得たが、その可変領域配列は次のとおりである：

ｍＡｂ９５のヒト化抗体の具体的な可変領域配列は次のとおりである：
Ｈｕ９５－ＶＬ１のアミノ酸配列は、配列番号７７：

で示される。
Ｈｕ９５－ＶＬ２のアミノ酸配列は、配列番号７８：

で示される。
Ｈｕ９５－ＶＬ３のアミノ酸配列は、配列番号７９：

で示される。
Ｈｕ９５－ＶＬ４のアミノ酸配列は、配列番号８０：

で示される。
Ｈｕ９５－ＶＨ１のアミノ酸配列は、配列番号８１：

で示される。
Ｈｕ９５－ＶＨ２のアミノ酸配列は、配列番号８２：

で示される。
Ｈｕ９５－ＶＨ３のアミノ酸配列は、配列番号８３：

で示される。
Ｈｕ９５－ＶＨ４のアミノ酸配列は、配列番号８４：

で示される。
Ｈｕ９５－ＶＨ５のアミノ酸配列は、配列番号８５：

で示される。

注：Ｋａｂａｔ基準にしたがって決定されたＣＤＲ配列に下線を付しており、配列の並びはＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の順である。

上記のうち、Ｈｕ９５－ＶＨ５のＣＤＲ領域はさらに改変されており、ＨＣＤＲ１は配列番号１０２（NYAIH）で示され、ＨＣＤＲ２は配列番号１０３（LVYPYTGGTAYNQKFKD）で示され、ＨＣＤＲ３は配列番号１０４（WGMIPGTNSYFDV）で示される。

４．抗ＣＴＧＦヒト化抗体の作製および発現
プライマーをデザインし、各ヒト化抗体のＶＨ／ＶＬ遺伝子フラグメントをＰＣＲによって作製して、相同組換えによって発現ベクターｐＨｒ（シグナルペプチドおよび定常領域遺伝子（ＣＨ／ＣＬ）フラグメントを有する）に挿入することにより、完全長抗体の発現ベクターＶＨ－ＣＨ－ｐＨｒ／ＶＬ－ＣＬ－ｐＨｒを作製した。ヒト化抗体用に、定常領域を、ヒトκ、λ鎖の軽鎖定常領域からなる群から選択することができ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４の重鎖定常領域またはそのバリアントからなる群から選択することができる。非限定的な例は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４の定常領域を抗体の機能を改善するために最適化することを包含する。例えば、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ（ＹＴＥ）部位の変異といった定常領域中の点変異、および定常領域中のＳ２２８Ｐ、Ｆ２３４ＡおよびＬ２３５Ａといった変異によって、抗体の半減期を延長することができる。

抗ＣＴＧＦヒト化抗体定常領域配列の例は次のとおりである：
重鎖定常領域のアミノ酸配列が、配列番号３７：

で示される（該完全長抗体重鎖は名称末尾のｗで示される）。

ＹＴＥ改変された抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列が、配列番号３８：

で示される（該完全長抗体重鎖は名称末尾のｙで示される）。

抗ＣＴＧＦヒト化抗体の軽鎖κ定常領域のアミノ酸配列が、配列番号３９：

で示される（該完全長抗体重鎖は名称末尾のｋで示される）。

抗ＣＴＧＦヒト化抗体の軽鎖λ定常領域のアミノ酸配列が、配列番号４０：

で示される（該完全長抗体重鎖は名称末尾のｌで示される）。

ヒト化抗体の重鎖可変領域を配列番号３７に示される重鎖定常領域に連結し、ヒト化抗体の軽鎖可変領域を配列番号３９に示される軽鎖κ定常領域に連結して、次のものを包含するｍａｂ１４７由来の完全長ヒト化抗体を得た：

ヒト化抗体の重鎖可変領域を配列番号３８に示される重鎖定常領域ＹＴＥバリアントに連結し、ヒト化抗体の軽鎖可変領域を配列番号３９に示される軽鎖κ定常領域に連結して、次のものを包含するｍａｂ１４７由来の完全長ヒト化抗体を得た：

ヒト化抗体の重鎖可変領域を配列番号３７に示される重鎖定常領域に連結し、ヒト化抗体の軽鎖可変領域を配列番号４０に示される軽鎖λ定常領域に連結して、次のものを包含するｍａｂ１６４由来の完全長ヒト化抗体を得た：

ヒト化抗体の重鎖可変領域を配列番号３８に示される重鎖定常領域ＹＴＥバリアントに連結し、ヒト化抗体の軽鎖可変領域を配列番号４０に示される軽鎖λ定常領域に連結して、次のものを包含するｍａｂ１６４由来の完全長ヒト化抗体を得た：

ヒト化抗体の重鎖可変領域を配列番号３７に示される重鎖定常領域に連結し、ヒト化抗体の軽鎖可変領域を配列番号３９に示される軽鎖κ定常領域に連結して、次のものを包含するｍａｂ９５由来の完全長ヒト化抗体を得た：

ヒト化抗体の重鎖可変領域を配列番号３８に示される重鎖定常領域ＹＴＥバリアントに連結し、ヒト化抗体の軽鎖可変領域を配列番号３９に示される軽鎖κ定常領域に連結して、次のものを包含するｍａｂ９５由来の完全長ヒト化抗体を得た：

完全長抗ＣＴＧＦ抗体のアミノ酸配列の例は次のとおりである：

陽性対照ＣＴＧＦ抗体ｍＡｂ１（CN1829740Bより；抗体名称はパムレブルマブで、ＦＧ－３０１９としても知られる）の配列は次のとおりである：
重鎖（配列番号６７）：

軽鎖（配列番号６８）：

実施例３：ＣＴＧＦ抗体の結合活性の検出
Ｉ．ヒトＣＴＧＦタンパク質に対するＣＴＧＦ抗体の結合のＥＬＩＳＡアッセイ
ヒトＣＴＧＦタンパク質に対する抗ヒトＣＴＧＦ抗体の結合活性を、ＥＬＩＳＡアッセイおよびＢｉａｃｏｒｅによって試験した。９６ウェルマイクロタイタープレートにＣＴＧＦ組換えタンパク質を直接コーティングした。抗体添加後のシグナル強度を利用して、ＣＴＧＦに対する抗体の結合活性を測定した。具体的な実験手順は次のとおりであった：

ＣＴＧＦタンパク質（R&D, Cat No. 9190-CC）をＰＢＳ（ｐＨ７．４）（Shanghai Yuanpei, Cat No. B320）バッファーで０．２μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、５０μｌ／ウェルで９６ウェルマイクロタイタープレート（Corning, Cat No. CLS3590-100EA）に入れ、３７℃のインキュベーター内で２時間、または４℃で一晩（１６～１８時間）、インキュベートした。液体を除去し、２５０μｌ／ウェルのブロッキング溶液（ＰＢＳで希釈した５％スキムミルク（BDスキムミルク, Cat No.232100））を加え、３７℃のインキュベーター内で３時間、または４℃で一晩（１６～１８時間）、インキュベートしてブロッキングした。ブロッキングの終了後、ブロッキング溶液を除去し、プレートをＰＢＳＴバッファー（０．１％のTween-20を含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）で５回洗い、サンプル希釈溶液で希釈したさまざまな濃度の各試験抗体（ハイブリドーマから精製された抗体、またはヒト化抗体）を５０μｌ／ウェルで加え、３７℃のインキュベーター内で１時間インキュベートした。インキュベーションの終了後、プレートをＰＢＳＴで３回洗い、サンプル希釈溶液で希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウス二次抗体（Jackson Immuno Research, Cat No. 115-035-003）またはヤギ抗ヒト二次抗体（Jackson Immuno Research, Cat No. 109-035-003）を５０μｌ／ウェルで加え、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで３回洗い、ＴＭＢ発色基質（KPL, Cat No. 52-00-03）を５０μｌ／ウェルで加え、室温で５～１０分間インキュベートし、１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を５０μｌ／ウェルで加えて反応を停止した。波長４５０ｎｍにおける吸光度の値をマイクロプレートリーダー（Molecular Devices, VERSA max）で読み取り、データをGraphPad Prism 5で分析した。ヒトＣＴＧＦタンパク質に対するＣＴＧＦ抗体の結合を、ＥＣ５０値として計算した。実験結果を図１および表１２に示す。

実験結果は、本開示のヒト化完全長抗ＣＴＧＦ抗体はいずれも、ヒトＣＴＧＦタンパク質との結合作用に優れていることを示している。

II．カニクイザルＣＴＧＦタンパク質に対するＣＴＧＦ抗体の結合のＥＬＩＳＡアッセイ
サルＣＴＧＦタンパク質に対する抗サルＣＴＧＦ抗体の結合活性を、ＥＬＩＳＡアッセイによって試験した。９６ウェルマイクロタイタープレートに抗ｍＦｃタンパク質を直接コーティングし、次いでＦｃタグ付きカニクイザルＣＴＧＦタンパク質をプレートに結合し、その後、抗体を加えた。抗体添加後のシグナル強度を利用して、カニクイザルＣＴＧＦに対する抗体の結合活性を測定した。具体的な実験手順は次のとおりであった：

抗ｍＦｃタンパク質（Sigma, Cat No. M4280）をＰＢＳ（ｐＨ７．４）（Shanghai Yuanpei, Cat No. B320）バッファーで２μｇ／ｍｌに希釈し、５０μｌ／ウェルで９６ウェルマイクロタイタープレート（Corning, Cat No. CLS3590-100EA）に入れ、３７℃のインキュベーター内で２時間インキュベートした。液体を除去し、２５０μｌ／ウェルのブロッキング溶液（ＰＢＳで希釈した５％スキムミルク（BDスキムミルク, Cat No.232100））を加え、３７℃のインキュベーター内で３時間、または４℃で一晩（１６～１８時間）、インキュベートしてブロッキングした。ブロッキングの終了後、ブロッキング溶液を除去し、プレートをＰＢＳＴバッファー（０．１％のTween-20を含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）で３回洗い、５０μｌの１μｇ／ｍｌカニクイザルＣＴＧＦ－ｍＦｃタンパク質を各ウェルに加え、３７℃のインキュベーター内で１時間インキュベートし、その後、プレートをＰＢＳＴバッファー（０．１％のTween-20を含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）で３回洗った。サンプル希釈溶液で希釈したさまざまな濃度の各試験抗体（ハイブリドーマから精製された抗体、またはヒト化抗体）を５０μｌ／ウェルで加え、３７℃のインキュベーター内で１時間インキュベートした。インキュベーションの終了後、プレートをＰＢＳＴで３回洗い、サンプル希釈溶液で希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウス二次抗体（Jackson Immuno Research, Cat No. 115-035-003）またはヤギ抗ヒト二次抗体（Jackson Immuno Research, Cat No. 109-035-003）を５０μｌ／ウェルで加え、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで５回洗い、ＴＭＢ発色基質（KPL, Cat No. 52-00-03）を５０μｌ／ウェルで加え、室温で５～１０分間インキュベートし、１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を５０μｌ／ウェルで加えて反応を停止した。波長４５０ｎｍにおける吸光度の値をマイクロプレートリーダー（Molecular Devices, VERSA max）で読み取り、データをGraphPad Prism 5で分析した。カニクイザルＣＴＧＦタンパク質に対するＣＴＧＦ抗体の結合を、ＥＣ５０値として計算した。実験結果を表１３に示す。

実験結果は、本開示のヒト化完全長抗ＣＴＧＦ抗体はいずれも、サルＣＴＧＦタンパク質との結合作用に優れていることを示している。

III．マウスＣＴＧＦタンパク質に対するＣＴＧＦ抗体の結合のＥＬＩＳＡアッセイ
マウスＣＴＧＦタンパク質に対する抗マウスＣＴＧＦ抗体の結合活性を、ＥＬＩＳＡアッセイによって試験した。９６ウェルマイクロタイタープレートにマウスＣＴＧＦ融合タンパク質を直接コーティングした。抗体添加後のシグナル強度を利用して、マウスＣＴＧＦに対する抗体の結合活性を測定した。具体的な実験手順は次のとおりであった：

マウスＣＴＧＦ－ｈｉｓタンパク質をＰＢＳ（ｐＨ７．４）（Shanghai Yuanpei, Cat No. B320）バッファーで０．５μｇ／ｍｌに希釈し、５０μｌ／ウェルで９６ウェルマイクロタイタープレート（Corning, Cat No. CLS3590-100EA）に入れ、３７℃のインキュベーター内で２時間インキュベートした。液体を除去し、２５０μｌ／ウェルのブロッキング溶液（ＰＢＳで希釈した５％スキムミルク（BDスキムミルク, Cat No.232100））を加え、３７℃のインキュベーター内で３時間、または４℃で一晩（１６～１８時間）、インキュベートしてブロッキングした。ブロッキングの終了後、ブロッキング溶液を除去し、プレートをＰＢＳＴバッファー（０．１％のTween-20を含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）で３回洗い、サンプル希釈溶液で希釈したさまざまな濃度の各試験抗体（ハイブリドーマから精製された抗体、またはヒト化抗体）を５０μｌ／ウェルで加え、３７℃のインキュベーター内で１時間インキュベートした。インキュベーションの終了後、プレートをＰＢＳＴで３回洗い、サンプル希釈溶液で希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウス二次抗体（Jackson Immuno Research, Cat No. 115-035-003）またはヤギ抗ヒト二次抗体（Jackson Immuno Research, Cat No. 109-035-003）を５０μｌ／ウェルで加え、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで５回洗い、ＴＭＢ発色基質（KPL, Cat No. 52-00-03）を５０μｌ／ウェルで加え、室温で５～１０分間インキュベートし、１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を５０μｌ／ウェルで加えて反応を停止した。波長４５０ｎｍにおける吸光度の値をマイクロプレートリーダー（Molecular Devices, VERSA max）で読み取り、データをGraphPad Prism 5で分析した。マウスＣＴＧＦタンパク質に対するＣＴＧＦ抗体の結合を、ＥＣ５０値として計算した。実験結果を表１４に示す。

実験結果は、本開示のヒト化完全長抗ＣＴＧＦ抗体はいずれも、マウスＣＴＧＦタンパク質との結合作用に優れていることを示している。

実施例４：ＣＴＧＦ抗体の機能阻害アッセイ
本アッセイにおいて、Ｂｉａｃｏｒｅ装置を使用して、試験するヒト化抗ＣＴＧＦ抗体のヒトＴＧＦ－β１機能阻害活性を検出した。

まず、抗原のヒトＣＴＧＦをＣＭ５バイオセンサーチップ（Cat. # BR-1005-30, GE）上にアミノカップリングによって１５００ＲＵの固定化レベルで固定化し、次いで、高濃度のＣＴＧＦ抗体（１５０μｇ／ｍｌ）をチップ表面に１５０秒間流し；５０ｎＭ ＴＧＦ－β１タンパク質を１２０秒間注入し、Biacore T200装置で反応シグナルをリアルタイムで検出して、結合および解離曲線を作成した。各実験サイクルにおいて解離の完了後、バイオセンサーチップを洗い、再生バッファーで再生した。

得られた実験データを、GE Biacore T200 Evaluationバージョン3.0ソフトウェアによって統計学的に分析した。

阻害効率＝［１－（サンプルのレスポンス値／ブランク対照のレスポンス値）］×１００％。具体的な結果を表１５に示す。

実験結果は、本開示のヒト化ＣＴＧＦ抗体はいずれも、高い機能阻害活性を有することを示している。

Ｂｉａｃｏｒｅによる抗ＣＴＧＦ抗体の親和性の測定
本実験において、Ｂｉａｃｏｒｅ装置を使用して、試験するヒト化抗ＣＴＧＦ抗体の、ヒトＣＴＧＦおよびマウスＣＴＧＦに対する親和性を測定した。

ある量の各試験抗体をプロテインＡバイオセンサーチップ（Cat. # 29127556, GE）に親和捕捉させ、次いで、ある濃度のヒトまたはマウスＣＴＧＦをチップ表面に流した。Ｂｉａｃｏｒｅ装置で反応シグナルをリアルタイムで検出して、結合および解離曲線を作成した。各実験サイクルにおいて解離の完了後、バイオセンサーチップを洗い、グリシン－ＨＣｌ再生溶液（ｐＨ１．５）（Cat. # BR-1003-54, GE）で再生した。アッセイ用のランニングバッファーは１×ＨＢＳ－ＥＰバッファー溶液（Cat. # BR-1001-88, GE）であった。

得られた実験データを、GE Biacore T200 Evaluationバージョン3.0ソフトウェアを用いて（１：１）Langmuirモデルに対してフィッティングし、表１６および１７に詳細に示すように親和性の値を得た。

実験結果は、マウス抗体ｍＡｂ１４７およびｍＡｂ１６４から誘導されたキメラ抗体Ｃｈ１４７およびＣｈ１６４ならびにヒト化抗ＣＴＧＦ抗体はいずれも、ヒトおよびマウスＣＴＧＦに高い親和性で結合できることを示している。ヒト生殖細胞系列抗体ＦＲ領域における置換も復帰変異も、ヒト化抗体の親和性を損なわず、むしろいくつかの改変は抗原に対する抗体の親和性を高めることができる。

実施例５：インビトロでＴＧＦβによって誘発されるＣ２Ｃ１２細胞遊走の、ＣＴＧＦ抗体による抑制のアッセイ
Ｃ２Ｃ１２細胞（マウス筋芽細胞、Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, #GNM26）を０．２５％トリプシン（Gibco, #25200-072）で消化し、遠心分離し、無血清ＤＭＥＭ培地（Gibco, #10564-029）に再懸濁した。細胞－抗体混合物およびＴＧＦβ１－抗体混合物を無血清ＤＭＥＭ培地で調製した。ここで、細胞密度は２×１０^５／ｍｌであり、組換えヒトＴＧＦβ１（Cell signaling Technology, #8915LC）の濃度は１０ｎｇ／ｍｌであり、試験する抗体の濃度は３０μｇ／ｍｌであった。

ChemoTx（登録商標）Disposable Chemotaxis System（Neuro Probe, #106-8）のカバーおよびフィルター膜を開け、ＴＧＦβ－抗体混合物を下部チャンバーに３０μｌ／ウェルで入れ、各群に４対のウェルを用いた。フィルター膜で覆い、細胞－抗体混合物を５０μｌ／ウェルで膜上に加え、各群に４対のウェルを用いた。カバーを閉じ、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内に置いた。

インキュベーション後４８時間で、フィルター膜上の液体を清潔なペーパータオルで除去し、フィルター膜を開け、１０μｌの予め冷却した０．２５％トリプシンを下部チャンバーへと各ウェルに加え、フィルター膜で覆った。消化後５分で、サンプルを１０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。フィルター膜を開け、２０μｌのCell Titer-Glo溶液（Promega, #G7573）を下部チャンバーへと各ウェルに加え、室温で１０分間インキュベートした。液体を３８４ウェル白色底プレート（Thermo Scientific, #267462）に移し、マイクロプレートリーダー（BMG, #PheraStar）を用いて化学発光によるプレート読み取りを行った。データをGraphpad Prism 6により分析および処理した。

抑制率＝［（ＴＧＦβの平均値－サンプル群の平均値）／（ＴＧＦβ群の平均値－未処置群の平均値）］×１００％

実験結果を表１８に示す。

結果は、本開示のヒト化抗ＣＴＧＦ抗体が、インビトロでＴＧＦβ１により誘導されるＣ２Ｃ１２細胞の遊走能力を抑制できることを示し、陽性対照抗体ｍＡｂ１と比較してＣ２Ｃ１２細胞遊走能力に対する抑制作用がより強いことを示している。

実施例６：インビトロでＴＧＦβによって誘発されるＰＡＮＣ１細胞遊走に対するＣＴＧＦ抗体の抑制効果を示すアッセイ
ＰＡＮＣ１細胞（ヒト膵臓がん細胞、ATCC, #CRL-1469）を０．２５％トリプシン（Gibco, #25200-072）で消化し、遠心分離し、０．１％ウシ胎児血清（Gibco, #10099-141）を含むＤＭＥＭ培地（Gibco, #10564-029）に再懸濁した。細胞－抗体混合物およびＴＧＦβ－抗体混合物を、０．１％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で調製した。ここで、細胞密度は４×１０^５／ｍｌであり、組換えヒトＴＧＦβ（Cell signaling Technology, #8915LC）の濃度は１０ｎｇ／ｍｌであり、試験する抗体の濃度は３０μｇ／ｍｌであった。

ChemoTx（登録商標）Disposable Chemotaxis System（Neuro Probe, #106-8）のカバーおよびフィルター膜を開け、ＴＧＦβ－抗体混合物を下部チャンバーに３０μｌ／ウェルで入れ、各群に４対のウェルを用いた。フィルター膜で覆い、細胞－抗体混合物を５０μｌ／ウェルで膜上に加え、各群に４対のウェルを用いた。カバーを閉じ、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内に置いた。

インキュベーション後４８時間で、フィルター膜上の液体を清潔なペーパータオルで除去し、フィルター膜を開け、１０μｌの予め冷却した０．２５％トリプシンを下部チャンバーへと各ウェルに加え、フィルター膜で覆った。消化後５分で、サンプルを１０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。プレート底に接着した細胞を倒立顕微鏡（Leica, #DMIL LED）下にカウントした。データをGraphpad Prism 6により分析および処理した。抑制率＝［（ＴＧＦβの平均値－サンプル群の平均値）／（ＴＧＦβ群の平均値－未処置群の平均値）］×１００％

実験結果を表１９に示す。

結果は、本開示のヒト化抗ＣＴＧＦ抗体がいずれも、インビトロでＴＧＦβ１により誘導されるＰＡＮＣ１細胞の遊走能力を抑制できることを示している。

実施例７：インビトロ軟寒天上のＰＡＮＣ１増殖に対する、ＣＴＧＦ抗体による抑制効果のアッセイ
寒天（BD, #214220）に脱イオン水を加えて加熱して、１．４％ゲル溶液を調製した。２×ＤＭＥＭ培地（Thermo, #12100046）をゲル溶液に１：１の体積比で混合し、５００μｌを２４ウェルプレート（Costar, #3524）の各ウェルに入れ、４度に置いて凝固させた。

ＰＡＮＣ－１細胞（ヒト膵臓がん細胞、ATCC, #CRL-1469）を０．２５％トリプシン（Gibco, #25200-072）で消化し、遠心分離し、４％ウシ胎児血清（Gibco, #10099-141）を含むＤＭＥＭ培地（GE, #SH30243.01）で細胞密度５×１０^４細胞／ｍｌに調節した。２×ＤＭＥＭ培地で２ｍｇ／ｍｌの抗体を調製した。細胞、抗体および１．４％ゲル溶液を２：１：１の体積比で混合し、２００μｌを、下方のゲル層で覆われた２４ウェルプレートの各ウェルに入れた。上方のゲルが凝固した後、２００μｌの２％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ培地を前記２４ウェルプレートに加えた。インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内でのインキュベーション後２８日で、ハイコンテント分析システム（Molecular Devices, ImageXpress）を使用して画像化し、生成した細胞クローンの領域を分析した。抑制率＝（１－サンプル群の平均値／未処置群の平均値）×１００％。実験結果を表２０に示す。

結果は、ｍＡｂ１４７およびｍＡｂ１６４クローンから誘導されたヒト化抗体が、インビトロでヒト膵臓がん細胞（ＰＡＮＣ－１細胞）増殖に対する顕著な抑制作用を有することを示している。

実施例８：動物におけるＣＴＧＦ抗体のインビボ生物学的活性
Ｉ．ブレオマイシンにより誘発されるマウス肺線維症の、ＣＴＧＦ抗体による抑制効果のアッセイ
実験プロトコル：４０匹のマウスを体重にしたがいランダムに次の４群に分けた：正常対照群（ＰＢＳ、ｉ.ｐ.、ｑｏｄ）、ｍＡｂ１群（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ.ｐ.、ｑｏｄ）、Ｈｕ１６４－６７ｗｌ群（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ.ｐ.、ｑｏｄ）、およびＨｕ１６４－６７ｙｌ群（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ.ｐ.、ｑｏｄ）。各群１０匹で、群分けの詳細は下記の表２１に示す。実験の１日目に、溶媒および抗体のそれぞれを、体重にしたがって腹腔内注射し（１０ｍｌ／ｋｇ；正常対照およびモデル群にはＰＢＳを投与した）；２時間後にエアロゾルブレオマイシン（５０ｍｇ／８ｍｌの噴霧を３０分間、および保持を５分間）を用いてモデルを構築した。次いで、上記群に応じて溶媒または抗体を１日置きに腹腔内注射した。実験期間は２１日間で、全部で１１回の腹腔内投与を行った。実験の２２日目にマウスを１％ペントバルビタールナトリウム（１０ｍｌ／ｋｇ）の腹腔内注射によって麻酔し、手術台上に仰臥位に固定した。頸の正中線に沿って１ｃｍの皮膚切開を行い、切開の下端は胸の入口に至らしめた。鉗子で皮下結合組織および筋肉を鈍的分離して、気管を露出した。気管の両端上、および気管と食道との間の結合組織を分離して、気管を離した。静脈留置針を挿入し、カニューレが気管に入る場所で繋いで縫合糸で固定した。０．８ｍｌのＰＢＳを充填した１ｍｌシリンジを静脈留置針の入口端に連結し、ＰＢＳをゆっくりと気管に注入し、３０秒間滞留させ、その後ＰＢＳをゆっくりと引き戻した。引き戻しの際、乳状泡状液体を観察することができた。洗浄を３回繰り返し、洗浄液をＥＰチューブに移し、その後０．５ｍｌのＰＢＳを取り、前記ステップを繰り返した。２つの洗浄液を混合し、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を試験用に－２０℃で保存した。ＢＡＬＦ上清を再度１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を取って可溶性コラーゲンを検出した（キット：Biocolor, Batch No. AA883）。

Excel統計ソフトウェアを使用した：平均値をａｖｇ（平均）として計算した；ＳＤ（標準偏差）値をＳＴＤＥＶ（標準偏差）として計算した；ＳＥＭ（平均の標準誤差；標本平均の標準偏差）値をＳＴＤＥＶ／ＳＱＲＴ（平方根）（各群の動物数）として計算した；プロッティングにはGraphPad Prismソフトウェアを使用し、データの統計学的分析には二元配置ＡＮＯＶＡ（二元配置分散分析）または一元配置ＡＮＯＶＡ（一元配置分散分析）を用いた。

実験結果を表２２に示す。

結果は、Ｈｕ１６４－６７ｗｌまたはＨｕ１６４－６７ｙｌが、マウスの肺線維症に対して強い抑制効果を示すことを示している。

II．Ｓｕ８６．８６ヒト膵臓がん細胞の皮下移植腫瘍の、ＣＴＧＦ抗体による抑制のアッセイ
実験プロトコル：２００μｌのＳＵ８６．８６細胞（ATCC, CRL-1837, ３．０×１０^６細胞）をＮｕ／Ｎｕヌードマウスの右脇腹に皮下接種した。腫瘍体積が約１４０ｍｍ^３となった接種後１１日に、体重または腫瘍体積が大きすぎるまたは小さすぎるマウスを除外した。マウスを腫瘍体積にしたがってランダムに、各群１０匹の５群に分け、同日に投与を開始した。抗体を、全部で１８日間にわたり週に２回、腹腔内注射した。腫瘍体積および体重を週に１～２回測定し、データを記録した。群分けおよび投与レジメンを表２３に示す。

Excel統計ソフトウェアを使用した：平均値をａｖｇとして計算した；ＳＤ値をＳＴＤＥＶとして計算した；ＳＥＭ値をＳＴＤＥＶ／ＳＱＲＴ（各群の動物数）として計算した；プロッティングにはGraphPad Prismソフトウェアを使用し、データの統計学的分析には二元配置ＡＮＯＶＡまたは一元配置ＡＮＯＶＡを用いた。

次式にしたがって腫瘍体積（Ｖ）を計算した：
Ｖ＝１／２×Ｌ_ｌｏｎｇ×Ｌ_{ｓｈｏｒｔ} ^２

相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）＝（Ｔ_ｔ－Ｔ_０）／（Ｃ_ｔ－Ｃ_０）×１００
ここで、Ｔ_ｔおよびＣ_ｔは、実験終了時の処置群および対照群の腫瘍体積であり；Ｔ_０およびＣ_０は、実験開始時の腫瘍体積である。

腫瘍抑制率ＴＧＩ（％）＝１－Ｔ／Ｃ（％）

実験結果：
Ｄ１からＤ１８まで、週に２回皮下注射を行い、ＳＵ８６．８６腫瘍増殖抑制についてＣＴＧＦ抗体の効果を検出した。実験結果を表２４および図２に示す。同じアイソタイプヒトＩｇＧのブランク対照群と比較して、ｍＡｂ１－４０ｍｇ／ｋｇ、Ｈｕ１６４－６７ｙｌ－４０ｍｇ／ｋｇ、Ｈｕ１６４－６７ｙｌ－２０ｍｇ／ｋｇおよびＨｕ１４７－３３ｗｋ（４０ｍｇ／ｋｇ）群の腫瘍抑制率はそれぞれ、４５％、５３％、４７％および５４％であった。ｍＡｂ１－４０ｍｇ／ｋｇ、Ｈｕ１６４－６７ｙｌ－４０ｍｇ／ｋｇ、Ｈｕ１６４－６７ｙｌ－２０ｍｇ／ｋｇおよびＨｕ１４７－３３ｗｋ（４０ｍｇ／ｋｇ）群はＳｕ８６．８６腫瘍の増殖を顕著に抑制することができ（ｐ＜０．００１）、ＳＵ８６．８６腫瘍に対する抑制効果は用量依存的である。さらに、各群のマウスの体重に顕著な変化は無かった。

Claims (15)

1. 重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗ＣＴＧＦ抗体であって、
   ｉ）重鎖可変領域が配列番号６に示される重鎖可変領域のものと同じＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号７に示される軽鎖可変領域のものと同じＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列を含む；
   ii）重鎖可変領域が配列番号８に示される重鎖可変領域のものと同じＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号９に示される軽鎖可変領域のものと同じＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列を含む；
   ii－ｉ）重鎖可変領域が配列番号６９に示される重鎖可変領域のものと同じＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号７０に示される軽鎖可変領域のものと同じＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列を含む；または
   ii－ii）重鎖可変領域が配列番号８５に示される重鎖可変領域のものと同じＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号７０に示される軽鎖可変領域のものと同じＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列を含む、
   抗ＣＴＧＦ抗体。
2. iii）重鎖可変領域が配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域が配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む；
   iv）重鎖可変領域が配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域が配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む；
   iv－i）重鎖可変領域が配列番号７１、配列番号７２および配列番号７３にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域が配列番号７４、配列番号７５および配列番号７６にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む；または
   iv－ii）重鎖可変領域が配列番号１０２、配列番号１０３および配列番号１０４にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域が配列番号７４、配列番号７５および配列番号７６にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む、
   重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗ＣＴＧＦ抗体。
3. 抗ＣＴＧＦ抗体が、マウス抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項１または２に記載の抗ＣＴＧＦ抗体。
4. （v）重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号６、２７、２８または２９との配列同一性が少なくとも９０％であり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号７、２２、２３、２４、２５または２６との配列同一性が少なくとも９０％である；
   （vi）重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号８、３３、３４、３５または３６との配列同一性が少なくとも９０％であり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号９、３０、３１または３２との配列同一性が少なくとも９０％である；または
   （vi－ｉ）重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号６９、８１、８２、８３、８４または８５との配列同一性が少なくとも９０％であり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号７０、７７、７８、７９または８０との配列同一性が少なくとも９０％である、
   重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、請求項１～３のいずれかに記載の抗ＣＴＧＦ抗体。
5. 抗ＣＴＧＦ抗体がヒト化抗体であり、該ヒト化抗体がヒト抗体のフレームワーク領域またはそのフレームワーク領域バリアントを含み、該フレームワーク領域バリアントが、ヒト抗体軽鎖フレームワーク領域および／または重鎖フレームワーク領域のそれぞれにおいて１０個までの復帰変異を有し；
   好ましくは、該ヒト化抗体が、下記（ａ）、（ｂ）または（ｂ－ｉ）からなる群から選択される軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む、請求項２に記載の抗ＣＴＧＦ抗体：
   （ａ）配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、および４Ｌ、３６Ｆ、４３Ｓ、４５Ｋ、４７Ｗ、５８Ｖおよび７１Ｙからなる群から選択される１つ以上の復帰変異を含む軽鎖可変領域、ならびに
   配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、および２８Ｓ、３０Ｎ、４９Ａ、７５Ｅ、７６Ｓ、９３Ｖ、９４Ｅおよび１０４Ｄからなる群から選択される１つ以上の復帰変異を含む重鎖可変領域；
   （ｂ）配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、および３６Ｖ、４４Ｆ、４６Ｇおよび４９Ｇからなる群から選択される１つ以上の復帰変異を含む軽鎖可変領域、ならびに
   配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、および４４Ｇ、４９Ｇ、２７Ｆ、４８Ｌ、６７Ｌ、７１Ｋ、７８Ｖおよび８０Ｆからなる群から選択される１つ以上の復帰変異を含む重鎖可変領域；
   （ｂ－ｉ）配列番号７４、配列番号７５および配列番号７６にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、および４５Ｐ、４６Ｗ、４８Ｙ、６９Ｓおよび７０Ｙからなる群から選択される１つ以上の復帰変異を含む軽鎖可変領域、ならびに
   配列番号７１、配列番号７２および配列番号７３にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、および２７Ｆ、３８Ｋ、４８Ｉ、６７Ｋ、６８Ａ、７０Ｌおよび７２Ｆからなる群から選択される１つ以上の復帰変異を含む重鎖可変領域；
   または
   （ｂ－ii）配列番号７４、配列番号７５および配列番号７６にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、および４５Ｐ、４６Ｗ、４８Ｙ、６９Ｓおよび７０Ｙからなる群から選択される１つ以上の復帰変異を含む軽鎖可変領域、ならびに
   配列番号１０２、配列番号１０３および配列番号１０４にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、および２７Ｆ、３８Ｋ、４８Ｉ、６７Ｋ、６８Ａ、７０Ｌおよび７２Ｆからなる群から選択される１つ以上の復帰変異を含む重鎖可変領域。
6. （vii）重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号６に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号７に示される；
   （viii）重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２７、２８または２９に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２２、２３、２４、２５または２６に示される；
   （ix）重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号８に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号９に示される；
   （ｘ）重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３３、３４、３５または３６に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３０、３１または３２に示される；
   （xi）重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号６９に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号７０に示される；または
   （xii）重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号８１、８２、８３、８４または８５に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号７７、７８、７９または８０に示される、
   重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、好ましくは、
   （xiii）重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２７に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２２に示される；
   （xiv）重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３４に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３０に示される；または
   （xv）重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号８５に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号７７に示される、
   重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、請求項５に記載の抗ＣＴＧＦ抗体。
7. 抗体が抗体重鎖定常領域および軽鎖定常領域をさらに含み、好ましくは、重鎖定常領域が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の定常領域ならびにそのバリアントからなる群から選択され、軽鎖定常領域が、ヒト抗体κおよびλ鎖の定常領域ならびにそのバリアントからなる群から選択され；より好ましくは、抗体が、配列番号３７または３８に示される重鎖定常領域、および配列番号３９または４０に示される軽鎖定常領域を含む、請求項１～６のいずれかに記載の抗ＣＴＧＦ抗体。
8. （ｃ）配列番号４１、４３、４４、４５、４６、４７または４８との配列同一性が少なくとも８５％である重鎖、および配列番号４２、４９、５０、５１、５２または５３との配列同一性が少なくとも８５％である軽鎖；
   （ｄ）配列番号５４、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２または６３との配列同一性が少なくとも８５％である重鎖、および配列番号５５、６４、６５または６６との配列同一性が少なくとも８５％である軽鎖；
   （ｅ）配列番号４１、４３、４４、４５、４６、４７または４８に示される重鎖、および配列番号４２、４９、５０、５１、５２または５３に示される軽鎖；
   （ｆ）配列番号５４、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２または６３に示される重鎖、および配列番号５５、６４、６５または６６に示される軽鎖；
   （ｇ）配列番号８６、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６または９７との配列同一性が少なくとも８５％である重鎖、および配列番号８７、９８、９９、１００または１０１との配列同一性が少なくとも８５％である軽鎖；または
   （ｈ）配列番号８６、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６または９７に示される重鎖、および配列番号８７、９８、９９、１００または１０１に示される軽鎖
   を含む、好ましくは
   （ｊ）配列番号４６に示される重鎖、および配列番号４９に示される軽鎖；
   （ｋ）配列番号６１に示される重鎖、および配列番号６４に示される軽鎖；または
   （ｌ）配列番号９７に示される重鎖、および配列番号９８に示される軽鎖。
   を含む、請求項１～７のいずれかに記載の抗ＣＴＧＦ抗体。
9. ヒトＣＴＧＦとの結合を請求項１～８のいずれかに記載の抗ＣＴＧＦ抗体と競合する、単離された抗ＣＴＧＦ抗体。
10. 請求項１～９のいずれかに記載の抗ＣＴＧＦ抗体をコードする核酸分子。
11. 請求項１０に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
12. 処置有効量の請求項１～９のいずれかに記載の抗ＣＴＧＦ抗体または請求項１０に記載の核酸分子、および１つ以上の薬学的に許容しうる担体、希釈剤、緩衝剤または賦形剤を含む医薬組成物。
13. 請求項１～９のいずれかに記載の抗ＣＴＧＦ抗体を対象またはそのサンプルと接触させるステップを含む、ＣＴＧＦの免疫アッセイまたは決定の方法。
14. 請求項１～９のいずれかに記載の抗ＣＴＧＦ抗体を含むキット。
15. ＣＴＧＦ関連疾患を治療または予防する方法であって、該方法が、請求項１～９のいずれかに記載の抗ＣＴＧＦ抗体または請求項１０に記載の核酸分子または請求項１２に記載の医薬組成物を治療有効量または予防有効量で対象に投与することを含み、該ＣＴＧＦ関連疾患が、好ましくは線維性疾患、高血圧症、糖尿病、心筋梗塞、関節炎、ＣＴＧＦ関連細胞増殖性疾患、アテローム性動脈硬化、緑内障またはがんであり；
    前記線維性疾患が、好ましくは特発性肺線維症、糖尿病性腎症、糖尿病網膜症、骨関節炎、強皮症、慢性心不全、肝硬変または腎線維症からなる群から選択され；
    前記がんが、好ましくは急性リンパ芽球性白血病、皮膚線維腫、乳がん、血管脂肪腫、血管平滑筋腫、結合組織生成がん、前立腺がん、卵巣がん、結腸直腸がん、膵臓がん、胃腸がんまたは肝臓がんからなる群から選択される、
    方法。

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