JP2024001035A - ウイルス汚染物質を不活性化する方法 - Google Patents

Abstract

【課題】培養細胞から開始するウイルス汚染物質を含まない抗体含有溶液を作製する方法を提供する。【解決手段】ウイルス不活性化抗体溶液を作製するための方法であって、（ｉ）細胞培養を経た、抗体のコード配列を含むトランスフェクトされた細胞によって産生された前記抗体材料を採取する工程、（ｉｉ）前記採取された抗体材料に対するウイルス不活性化処理の工程であって、前記ウイルス不活性化処理が、溶媒及び洗浄剤の混合物とのインキュベーションであり、ならびに、前記採取された抗体材料が、非ヒト哺乳動物細胞で産生される、清澄化された採取物であり、かつ多重特異性であるモノクローナル組換え抗体を含む、前記工程、を含む、方法を提供する。【選択図】図１

Description

本発明は、ウイルス不活性化の方法に関する。特に、本発明は、治療用抗体を含むウイ
ルスを含まない溶液の製造に関する。本発明はまた、治療用抗体の精製及びウイルス不活
化処理の工程を含むバルク原薬の製造方法に関する。

タンパク質のような生体分子が疾患の治療のための医薬品として使用される場合、製造
プロセスはヒトの健康を保証するように設計される。通常、治療用タンパク質の生産に使
用される細胞培養物及び他の生体材料は、原材料に存在するか、製造プロセス中に導入さ
れるウイルスによって汚染される可能性がある。除去されない又は不可逆的に不活性化さ
れない場合、ウイルス汚染物質は薬物を使用している個人の健康に対するリスクである。
したがって、ヒトでの使用に安全な医薬品を製造するには、生産されたタンパク質に活性
なウイルス汚染物質がないことが必要とされる（ＣＰＭＰ／ＩＣＨ／２９５／９５）。

治療用タンパク質を生産するため、精製プロセスを実施して、治療用タンパク質を残り
の出発混合生体材料から分離する。クロマトグラフィー及び濾過等の精製工程は、ウイル
ス除去に貢献し、ウイルスクリアランスを保証するために特定のウイルス不活化技術と組
み合わされる。ウイルス不活性化の方法は、当技術分野でよく知られている。血漿生成物
中のウイルス不活化を保証する方法は、世界保健機構（ＷＨＯ）の技術報告、付録４のガ
イドラインで確立されるように、ウイルス脂質エンベロープを可溶化することによりウイ
ルス活性を損なう、溶媒／洗浄剤（Ｓ／Ｄ）ミックスで上記血漿製剤を処理することで構
成される。この処理の最適化は、使い捨てバッグシステムでの血漿製剤のＳ／Ｄ処理を可
能にするために実施されており（Ｈｓｉｅｈ， ＹＴ． ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｆｕｓ
ｉｏｎ．２０１６ Ｊｕｎ；５６（６）：１３８４－９３）、ＷＨＯ技術報告、付録４ガ
イドライン（国際公開第２０１２０８２９３１号）に示されている条件と比較して、より
低温で短時間の条件で組換え第ＶＩＩＩ因子を処理する。さらに、非商業的な研究規模で
Ｓ／Ｄ処理は、ヒトハイブリドーマ細胞株由来のサンプルを含む抗Ｄ抗体の追加のウイル
ス除去工程として適用されている（Ｒｏｂｅｒｔｓ ＰＬ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐ
ｒｏｇ．２０１４ Ｎｏｖ－Ｄｅｃ； ３０（６）：１３４１－７）。不活性化はまた、
ウイルスタンパク質の変性を引き起こす低ｐＨによる処理（Ｓｈｕｋｌａ ＡＡ ａｔ
ａｌ．， Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ．， ２０１５， ３（２）：１２７－１
３８）又は高温（殺菌）（米国特許第４７４９７８３号）によっても達成され得る。これ
らの処理は、エンベロープウイルス及び非エンベロープウイルスに対して有効であるが、
治療用タンパク質も変性の影響を受けやすいため、全ての治療用タンパク質とは適合しな
い場合がある。

治療用タンパク質の重要なクラスは、動物の身体によって産生される抗体のような、自
然な構造を持つことができるモノクローナル抗体、及び複数の方法でそれらの特性を強化
するように操作されたモノクローナル抗体である。抗体は、様々な種類の癌及び免疫系の
障害を含む多様な疾患の治療及び診断のための薬物として使用され得る。モノクローナル
抗体は通常、抗体のコード配列を含むトランスフェクトされた細胞株を使用して商業的に
生産され、それらは制御された細胞培養条件下で大規模に生育された後採取される。採取
に続いて抗体を精製し、精製プロセスでは、ウイルス不活化の標準手順は低ｐＨでのサン
プルのインキュベーションを含む（国際公開第２０１００４８１９２号、Ｌｉｕ ＨＦ
ｅｔ ａｌ．ＭＡｂｓ．２０１０ Ｓｅｐ－Ｏｃｔ； ２（５）：４８０－９９）。

抗体は、低ｐＨ等の非生理学的条件の影響を受けやすく、またエフェクター機能が強化
されるか、又はホモ二量体よりもヘテロ二量体を優先的に形成するように操作されている
場合、より分解されやすい。抗体ベースの治療法が拡大し続け、これらの製品の複雑さも
拡大するにつれて、新たなウイルス不活化戦略の開発が必要となっている。

さらに、抗体等の治療用タンパク質の精製プロセスは、ウイルス不活性化に一般的に使
用される低ｐＨに適合しない可能性があることから、代替のウイルス不活化方法を利用可
能にすることは、精製プロセスの開発及び改善を促進するであろう。

本発明は、既存のウイルス不活性化アプローチが機能せず、抗体産物の分解若しくは他
の望ましくない結果につながるか、又は抗体精製プロセスに適合しない、商業的に生産さ
れた抗体に対するウイルス不活性化の新たな方法に関するものである。

本発明は、抗体等の治療用タンパク質の精製プロセスに適合されるウイルス不活性化の
新たな方法に関する。抗体精製のプロセスで使用される古典的な方法は、低ｐＨでの抗体
含有溶液のインキュベーションである。それにもかかわらず、精製プロセスの最適化は、
低ｐＨと適合しない工程の開発をもたらす可能性がある。さらに、低ｐＨ不安定抗体の場
合、この方法は、抗体の安定性を損なうため適切でないことが観察されている。本発明に
おいて提示されるウイルス不活性化の新たな方法は、これらの問題を克服することを可能
にする。

特に、本発明は、抗体精製のプロセスの間にウイルス汚染物質を含まない抗体溶液を作
製する方法に関し、このウイルス不含抗体溶液の作製は、抗体を発現するトランスフェク
ト細胞の培養から始まり、（ｉ）トランスフェクトされた細胞によって産生された抗体材
料を採取する工程と、（ｉｉ）溶媒洗浄剤又は高ｐＨにより抗体採取材料を処理する工程
を含む。

より詳しくは、本発明は、（ｉ）細胞培養を経た、上記抗体のコード配列を含むトラン
スフェクトされた細胞により産生された抗体材料を収集する工程、ｉｉ）溶媒及び洗浄剤
の混合物とのインキュベーション又は高ｐＨでのインキュベーションからなる群から選択
される、上記採取された抗体材料に対するウイルス不活化処理の工程を含む、ウイルス不
活化抗体溶液を作製する方法に関する。

一実施形態では、本発明の採取された抗体材料は、非ヒト哺乳動物細胞で産生される。

別の実施形態では、本発明の採取された抗体材料はモノクローナル抗体を含む。より具
体的な実施形態では、モノクローナル抗体は組換え抗体である。特定の態様では、上記組
換え抗体は多重特異性である。

本発明の一実施形態では、採取された抗体材料を溶媒及び洗浄剤の混合物とインキュベ
ートし、ここで、溶媒はＴｎＢＰであり、洗浄剤は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ポリソ
ルベート８０及びポリソルベート２０からなる群から選択される。

より具体的な実施形態では、上記ＴｎＢＰの濃度は、約０．１％（重量／重量）以上約
１％（重量／重量）以下であり、特に、上記ＴｎＢＰの濃度は約０．１％（重量／重量）
、約０．３％（重量／重量）、約０．５％（重量／重量）及び約１％（重量／重量）を含
む群から選択される。

別の特定の実施形態では、上記ポリソルベート８０又は上記ポリソルベート２０の濃度
は、約０．１％（重量／重量）以上約２％（重量／重量）以下、特に上記ポリソルベート
８０又は上記ポリソルベート２０は、約０．２％、約０．５％（重量／重量）、約０．７
５％（重量／重量）、約１％（重量／重量）、約１．２５％（重量／重量）を含む群から
選択される。

より具体的な実施形態では、溶媒及び洗浄剤の上記混合物は、０．３％（重量／重量）
のＴｎＢＰ及び０．５％（重量／重量）のポリソルベート８０の混合物、並びに０．３％
（重量／重量）のＴｎＢＰ及び１％（重量／重量）のポリソルベート８０の混合物からな
る群から選択される。

さらに具体的には、上記採取された抗体材料を、０．３％（重量／重量）のＴｎＢＰ及
び１％（重量／重量）のポリソルベート８０の混合物と少なくとも５分間インキュベート
する。

特定の実施形態では、上記採取された抗体材料を、プロテインＡクロマトグラフィーに
最初に供し、得られたプロテインＡ溶出液を０．３％（重量／重量）のＴｎＢＰ及び１％
（重量／重量）のポリソルベート８０の混合物と共に室温で少なくとも１０分インキュベ
ートする。

別の特定の実施形態では、上記採取された抗体材料は清澄化された採取物であり、室温
で撹拌しながら約６０分間、０．３％（重量／重量）のＴｎＢＰ及び１％（重量／重量）
のポリソルベート８０の混合物と共にインキュベートされる。

本発明の一実施形態では、採取された抗体材料を高ｐＨでインキュベートし、ここで高
ｐＨは９以上１２．５以下のｐＨである。より具体的には、上記高ｐＨは少なくとも１０
．５である。さらに具体的には、上記高ｐＨは約１１である。

特定の実施形態では、本発明による採取された抗体材料を最初にプロテインＡクロマト
グラフィーに供し、得られたＡ溶出液を上記高ｐＨでインキュベートする。

本発明の一態様では、上記プロテインＡ溶出液を、トリス、ヒスチジンＬ－アルギニン
、リン酸塩及びＮａＯＨ群から選択されるバッファーで目標とする高ｐＨまで滴定し、イ
ンキュベートする。

本発明のより具体的な態様では、上記プロテインＡ溶出液を室温で約６０分間、目標と
するｐＨ１１まで０．５ＭのＮａＯＨで滴定する。

一実施形態では、本発明の方法は、ウイルス不活化アッセイでウイルス不活化抗体溶液
の一部を試験する更なる工程（ｉｉｉ）を含む。

本発明はまた、バルク原薬の製造の方法であって、
（ａ）請求項１３に記載の溶媒洗浄剤処理による採取された抗体材料のウイルス不活化の
工程、
（ｂ）得られたウイルス不活化溶液のプロテインＡクロマトグラフィーの工程、
（ｃ）プロテインＡ溶出液のｐＨ６．０への中和、それに続く０．２μｍ濾過の工程、
（ｄ）中和されたプロテインＡ溶出液の陽イオン交換クロマトグラフィー、それに続く０
．２μｍ濾過の工程、
（ｅ）限外濾過及び連続ダイアフィルトレーションによる陽イオン交換クロマトグラフィ
ー溶出液の濃縮、それに続く０．２μｍ濾過の工程、
（ｆ）膜吸着を使用するフロースルーモードでの陰イオン交換クロマトグラフィーによる
生成物の精製、それに続く０．２μｍ濾過の工程、
（ｇ）ウイルスのナノ濾過の工程、
（ｈ）予備製剤バッファーへの限外濾過及び連続ダイアフィルトレーションによる生成物
の濃縮、それに続く０．２μｍ濾過の工程、
（ｉ）５ｍＭクエン酸塩、１５％スクロース、０．０６％ポリソルベート８０をｐＨ５．
９で混合することによる、最終製剤バッファー中の目標の６ｍｇ／ｍＬの生成物への賦形
剤の添加、それに続く０．２μｍ濾過の工程、
（ｊ）滅菌バッグへの生成物の充填、それに続く－８０±２０℃での凍結及び保存の工程
、
を含む方法に関する。

また、本発明によって開示されるのは、バルク原薬の製造方法であって、
（ａ）採取した抗体材料のプロテインＡクロマトグラフィーの工程、
（ｂ）得られたＰＡ溶出液の請求項１８に記載される高ｐＨでのインキュベーションの工
程、
（ｃ）得られたウイルス不活化溶液のｐＨ５．５への中和、それに続く０．２μｍ濾過の
工程、
（ｄ）中和されたウイルス不活化プロテインＡ溶出液の陽イオン交換クロマトグラフィー
、それに続く０．２μｍ濾過の工程、
（ｅ）限外濾過及び連続ダイアフィルトレーションによる陽イオン交換クロマトグラフィ
ー溶出液の濃縮、それに続く０．２μｍ濾過の工程、
（ｆ）膜吸着を使用するフロースルーモードでの陰イオン交換クロマトグラフィーによる
生成物の精製、それに続く０．２μｍ濾過の工程、
（ｇ）ウイルスのナノ濾過の工程、
（ｈ）予備製剤バッファーへの限外濾過及び連続ダイアフィルトレーションによる生成物
の濃縮、それに続く０．２μｍ濾過の工程、
（ｉ）５ｍＭ Ｌ－ヒスチジン、１５０ｍＭ Ｌ－アルギニン一塩酸塩、１５％スクロー
ス、０．０６％ポリソルベート８０をｐＨ６．０で混合することによる、最終製剤バッフ
ァー中の目標の６ｍｇ／ｍＬの生成物への賦形剤の添加、それに続く０．２μｍ濾過の工
程、
（ｊ）滅菌バッグへの生成物の充填、それに続いく－８０±２０℃での凍結及び保存の工
程、
を含む方法である。

モノクローナル抗体、バッファー、界面活性剤及び安定化剤を含む液体医薬製剤も本発
明によって開示され、ここで上記モノクローナル抗体が約０．０１ｍｇ／ｍＬ以上約１０
０ｍｇ／ｍＬ以下の濃度で、好ましくは約６ｍｇ／ｍＬの濃度で上記医薬製剤中に存在し
、上記バッファーが約５ｍＭの濃度で上記医薬製剤中に存在するクエン酸塩であり、上記
界面活性剤が約０．０６％の割合で上記医薬製剤中に存在するポリソルベートであり、上
記安定化剤が約１５％の割合で上記医薬製剤中に存在するスクロースであり、医薬製剤は
約５．９のｐＨを有する。

モノクローナル抗体、バッファー、界面活性剤及び安定化剤を含む液体医薬製剤がまた
本発明によって開示され、ここで上記モノクローナル抗体が約０．０１ｍｇ／ｍＬ以上約
１００ｍｇ／ｍＬ以下の濃度で、好ましくは約６ｍｇ／ｍＬの濃度で上記医薬製剤中に存
在し、上記バッファーが約５ｍＭの濃度で上記医薬製剤中に存在するＬ－ヒスチジンであ
り、上記界面活性剤が約０．０６％の割合で上記医薬製剤中に存在するポリソルベートで
あり、上記安定化剤が約１５％の割合で上記医薬製剤中に存在するスクロース、及び約１
２０ｍＭの濃度で上記医薬製剤に存在するＬ－アルギニン一塩酸塩であり、医薬製剤は約
６．０のｐＨを有する。

さらに、本発明は、細胞採取材料から不純物を除去する方法であって、細胞採取物を高
ｐＨで処理した後に濾過を行う工程を含む、方法に関する。

本発明では、「抗体」という用語及び「免疫グロブリン」という用語は互換的に使用さ
れる。「抗体」という用語は本明細書で言及される場合、完全長抗体及び抗体フラグメン
トを含む。抗体は、形質細胞によって産生される糖タンパク質であり、抗原分子を認識し
て不活性化することにより免疫応答において役割を果たす。哺乳類では、免疫グロブリン
の５つのクラス、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥが産生される。ネイティブ
型では、免疫グロブリンは、２本の同一の重（Ｈ）鎖及び２本の同一の軽（Ｌ）鎖の４本
のポリペプチド鎖で構成されるＹ字型ユニットの１つ又は複数のコピーとして存在する。
共有結合性のジスルフィド結合と非共有相互作用は、鎖間結合を可能にし、特に重鎖は相
互に連結され、各軽鎖は重鎖と対合する。重鎖と軽鎖はいずれも、Ｎ末端可変（Ｖ）領域
及びＣ末端定常（Ｃ）領域を含む。重鎖では、可変領域は１つの可変ドメイン（ＶＨ）で
構成され、定常領域は抗体クラスに応じて３つ又は４つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２
、ＣＨ３及びＣＨ４）で構成されるのに対し、軽鎖は可変ドメイン（ＶＬ）と単一の定常
ドメイン（ＣＬ）で構成される。可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可
変性の３つの領域を含む。これらは抗原結合部位を形成し、抗体に特異性を付与する。Ｃ
ＤＲは、ＣＤＲの位置を定義するフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、更に４つの保
存された領域の間に位置している。抗原結合は、ドメインの位置の柔軟性によって促進さ
れ、例えば、３つの定常重ドメインを含む免疫グロブリンには、ＣＨ１とＣＨ２の間に「
ヒンジ領域」と呼ばれるスペーサーがあり、標的との相互作用のための動作を可能にする
。無傷でネイティブ型の抗体から開始して、酵素消化は抗体フラグメントの生成をもたら
すことができる。例えば、ＩｇＧとエンドペプチダーゼパパインとのインキュベーション
は、ヒンジ領域でのペプチド結合の破壊、及び結果として、それぞれ抗原結合が可能な２
つの抗体結合（Ｆａｂ）フラグメント、及び結晶化可能フラグメント（Ｆｃ）の３つのフ
ラグメントの産生をもたらす。ペプシンによる消化は、代わりに、ジスルフィド結合で連
結された２つのＦａｂユニットで構成される１つの大きなフラグメントＦ（ａｂ’）２、
及びＦｃ領域の分解から得られる多くの小さなフラグメントを生じる。それらの性質に応
じて、抗体及び抗体フラグメントは、単量体又は多量体、一価又は多価、単一特異性又は
多重特異性であり得る。

「完全長抗体」という用語は本明細書で使用される場合、少なくとも２対の重鎖及び軽
鎖を含むそれらのネイティブで無傷の構造の抗体を含む。

「抗体フラグメント」という用語は本明細書で使用される場合、完全長抗体の１つ又は
複数の部分を含む。抗体フラグメントの非限定的な例としては以下が挙げられる：（ｉ）
ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＧではＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインからなり、並びにＩｇ
Ｅ及びＩｇＭではＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメインからなる２つの定
常重鎖フラグメントによって構成され、ジスルフィド結合及び非共有相互作用により対合
する、結晶化可能フラグメント（Ｆｃ）；（ｉｉ）ジスルフィド結合によって接続された
ＶＬ、ＣＬ及びＶＨ、ＣＨ１からなる、フラグメント抗原結合（Ｆａｂ）；（ｉｉｉ）ジ
スルフィド結合で接続されたＶＬ、ＣＬ及びＶＨ、ＣＨ１、及びヒンジ領域に由来する１
つ又は複数のシステイン残基からなる、Ｆａｂ’；（ｉｖ）その中のシステイン残基が遊
離スルフヒドリル基を含むＦａｂ’フラグメントである、Ｆａｂ’‐ＳＨ；（ｖ）ジスル
フィド結合によってヒンジ領域で接続された２つのＦａｂフラグメントからなるＦ（ａｂ
’）２；（ｖｉ）ＶＬ鎖及びＶＨ鎖からなり、非共有相互作用によって共に対合する、可
変フラグメント（Ｆｖ）；（ｖｉｉ）リンカーによって共に対合するＶＬ鎖及びＶＨ鎖か
らなる、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）；（ｉｘ）二重特異性一本鎖Ｆｖ二量体、
（ｘ）ｓｃＦｖ－Ｆｃフラグメント；（ｘｉ）ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインからなる
Ｆｄフラグメント；（ｘｉｉ）ＶＨドメイン又はＶＬドメインからなる、単一ドメイン抗
体ｄＡｂ；（ｘｉｉｉ）その中でＶＨドメイン及びＶＬドメインが同じ鎖におけるそれら
の対合を防ぎ２つのｓｃＦｖの非共有結合的な二量体化を可能にする短いペプチドで接続
される２つのｓｃＦｖフラグメントからなる、ダイアボディ；（ｘｉｖ）短いペプチドで
接続されるＶＨドメイン及びＶＬドメインを有する３つのｓｃＦｖが三量体を形成する、
３価の１０トリアボディ（ｔｒｉｖａｌｅｎｔ １０ ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）；（ｘｖ
）単一の重鎖及び単一の可変鎖を含む半ＩｇＧ（ｈａｌｆ－ＩｇＧ）。

「ホモ二量体抗体」又は「ホモ二量体フラグメント」又は「ホモ二量体」という用語は
本明細書で使用される場合、免疫グロブリン分子、又は第１及び第２のドメインのような
少なくとも第１及び第２のポリペプチドを含む部分を含み、ここで、第２のポリペプチド
はアミノ酸配列において第１のポリペプチドと同一である。好ましくは、ホモ二量体免疫
グロブリンは２本のポリペプチド鎖を含み、第１の鎖は少なくとも１つの第２の鎖に同一
なドメインを有し、両方の鎖が集合する、すなわちそれらの同一ドメインを介して相互作
用する。具体的には、ホモ二量体免疫グロブリンは、少なくとも２つの同一のドメインを
含み、両方のドメインが集合する、すなわち、それらのタンパク質－タンパク質界面を介
して相互作用する。好ましくは、ホモ二量体免疫グロブリンフラグメントは、少なくとも
２つのドメインを含み、第１ドメインは第２ドメインと同一であり、両方のドメインが集
合する、すなわちそれらのタンパク質－タンパク質界面を介して相互作用する。

「ヘテロ二量体抗体」又は「ヘテロ二量体フラグメント」又は「ヘテロ二量体」という
用語は本明細書で使用される場合、免疫グロブリン分子又は第１及び第２のドメインのよ
うな少なくとも第１及び第２のポリペプチドを含む部分を含み、ここで、第２のポリペプ
チドは、第１のポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。好ましくは、ヘテロ二量体免疫
グロブリンは２本のポリペプチド鎖を含み、第１鎖は少なくとも１つの第２鎖と非同一な
ドメインを有し、両方の鎖は集合する、すなわちそれらの非同一ドメインを介して相互作
用する。具体的には、ヘテロ二量体免疫グロブリンは少なくとも２つのドメインを含み、
第１のドメインは第２のドメインと同一ではなく、両方のドメインが集合する、すなわち
それらのタンパク質－タンパク質界面を介して相互作用する。より好ましくは、ヘテロ二
量体免疫グロブリンは、少なくとも２つの異なるリガンド、抗原又は結合部位に対して結
合特異性を有する、すなわち二重特異性である。

「原子価」という用語は本明細書で使用される場合、抗体中の結合部位の数を指す。２
以上の原子価を持つ抗体は多価と呼ばれ、多価抗体の非限定的な例としては、２つの結合
部位を特徴とする二価抗体、３つの結合部位を特徴とする三価抗体、及び４つの結合部位
を特徴とする四価抗体が挙げられる。

「単一特異性抗体」という用語は本明細書で使用される場合、全てが同じエピトープを
結合する、１つ又は複数の結合部位を有する任意の抗体又はフラグメントを指す。

「多重特異性抗体」という用語は本明細書で使用される場合、同じ抗原又は異なる抗原
の異なるエピトープを結合できる２以上結合部位を有する任意の抗体又はフラグメントを
指す。多重特異性抗体の非限定的な例は、二重特異性抗体である。

「二重特異性抗体」という用語は、同じ抗原の２つの異なるエピトープ、又は２つの異
なる抗原を結合できる２つの結合部位を有する任意の抗体を指す。

「抗原」という用語は本明細書で使用される場合、それに抗体が特異的に結合できる任
意の分子を指す。抗原の例としては、ポリペプチド、タンパク質、多糖及び脂質分子が挙
げられる。抗原には、１つ又は複数のエピトープが存在し得る。「エピトープ」又は「抗
原決定基」という用語は本明細書で使用される場合、抗体との直接的な化学的相互作用を
引き起こす抗原の部分を指す。

「モノクローナル抗体」という用語は本明細書で使用される場合、全て同じ単一細胞に
由来するクローン細胞によって産生され、標的抗原の同じエピトープを特異的に結合する
抗体を指す。治療用抗体が産生される場合、ポリクローナル抗体よりもモノクローナル抗
体を生成することが好ましい。実際に、モノクローナル抗体は単一のクローンに起源を持
つ細胞によって産生され、全て同じエピトープを結合するが、ポリクローナル抗体は異な
る免疫細胞によって産生され、特定の抗原の複数のエピトープを認識する。モノクローナ
ル抗体は、バッチ間の均一性、交差反応性の低下、及び標的に対する高い特異性を保証す
る。組換えＤＮＡを使用して、例えば宿主細胞でモノクローナル抗体を発現させて、組換
え抗体を生じることができる。

「組換え抗体」という用語は本明細書で使用される場合、組換えＤＮＡの使用を伴う任
意のプロセスによって産生された抗体を指す。組換え抗体は、免疫原性、結合親和性、分
子サイズ、特異性、半減期及びフォーマット等の特性を改善するように設計され得る。組
換え抗体の例としては、操作抗体（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、キメラ
抗体、ＣＤＲグラフト抗体（ヒト化抗体等）、完全ヒト抗体、抗体フラグメント、Ｆｃ操
作抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体等）、単量
体抗体及び多量体抗体（ホモ二量体抗体及びヘテロ二量体抗体等）が挙げられるが、これ
らに限定されない。

「キメラ抗体」という用語は本明細書で使用される場合、可変領域が１つの種に由来し
、それが別の種に由来する定常領域に融合される抗体を指し、キメラ抗体の非限定的な例
としては、マウス可変領域がヒト定常領域に融合される抗体が挙げられる。

「ＣＤＲグラフト抗体」という用語は本明細書で使用される場合、ある種に由来するＣ
ＤＲが別の種のフレームワーク領域にグラフトされる抗体を指し、ＣＤＲグラフト抗体の
非限定的な例は、マウス等の哺乳動物種に由来するＣＤＲがヒトフレームワーク領域にグ
ラフトされたヒト化抗体である。

「細胞トランスフェクション」という用語は、真核細胞への外来遺伝物質の導入を指す
。人工的に導入された核酸によって体系化されたタンパク質が細胞によって発現されると
、遺伝子改変細胞にそれぞれの野生型形態とは異なる特性が与えられる。導入される核酸
は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。外因性核酸を宿主細胞に導入するために一般的に使用
される手法の例としては、リン酸カルシウム、リポソーム、カチオン性ポリマー又はデン
ドリマー等のトランスフェクション試薬によってトランスフェクションが媒介される化学
物質に基づく方法；エレクトロポレーション及びマイクロインジェクション等の物理学に
基づく方法；及びウイルス感染が遺伝子送達を媒介する、ウイルスに基づく方法が挙げら
れる。これらの手法を使用して、一過性の又は安定したトランスフェクションを実現する
ことができる。一過性トランスフェクションでは、核酸配列は宿主細胞のゲノムに組み込
まれないため、外因性遺伝物質によって体系化されたタンパク質の発現は時間が限定され
るのに対し、細胞が外来遺伝物質をそれらのゲノム中に一体化すると安定なトランスフェ
クションが達成され、安定なトランスフェクト細胞株をもたらす。

「宿主細胞」という用語は、外来核酸が直接導入された細胞及びその子孫を含む、トラ
ンスフェクトされた核酸物質によって体系化されたタンパク質が発現される全ての細胞を
指す。抗体の発現に適した細胞株としては、細菌、哺乳動物、昆虫、植物及び酵母の細胞
が挙げられるが、これらに限定されない。治療用抗体の発現及び生産によく使用される細
胞株は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯマウス骨髄腫細胞、ヒト子
宮頸癌（ＨｅＬａ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞等の哺乳胴動物細胞株である。宿
主細胞は、それらの成長及び抗体の発現を助ける条件で培養される。最適な培養条件は、
細胞培養培地の処方、バイオリアクターの操作パラメーター、栄養供給様式及び培養時間
を含む幾つかのパラメーターの制御及び調整によって得られる。培養培地の処方は、好ま
しい細胞の生存率及び繁殖に合わせて最適化する必要があり、細胞培養培地の成分の例と
しては、必須アミノ酸、塩、グルコース、増殖因子及び抗生物質が含挙げられるが、これ
らに限定されない。重要なバイオリアクターの操作パラメーターは、温度、ｐＨ、攪拌速
度、酸素負荷及び二酸化炭素レベルである。栄養素を様々な方法で供給することができ、
バッチモード培養では、必要な栄養素の全てが最初の基本培地に存在し、廃棄物を蓄積し
ながら使い尽くされるまで使用する；流加培養では、栄養素の枯渇を防ぎ、培養期間を延
長するため、追加のフィード培地を供給する；それらとは異なり、灌流様式では、培養中
の細胞は、細胞廃棄物を除去するバイオリアクターを流れる栄養素を含む新鮮な培地を継
続的に補充される。培養期間は、細胞が一定量の生成物を産生するのに十分な長さが必要
であるため重要であるが、細胞の生存率を損なうほど長すぎてはならない。

「採取された抗体材料」という用語は、細胞培養により得られた、宿主細胞により発現
された抗体を含む材料を指す。採取された抗体材料は、最初に宿主細胞培養物を採取する
こと、および次いで、遠心分離及び／又は濾過の工程により細胞片を除去できる清澄化の
プロセスに採取物を供することにより製造され得る。

「ウイルスクリアランス」という用語は、目的の材料を汚染する可能性のあるウイルス
を効果的に除去及び／又は不活性化する任意の処理を指す。治療用抗体の精製プロセスに
適用される場合、ウイルスクリアランスとは、ウイルスの不活性化又は抗体含有材料から
のウイルス除去をもたらす任意の方法を指す。

「ウイルス不活化」という用語は、ウイルスが生体サンプルに感染すること又は複製す
ることができないようにする任意の処理を指す。ウイルス不活化は、ウイルスエンベロー
プの可溶化によりウイルスの不活化を引き起こす、溶媒及び界面活性剤（Ｓ／Ｄ）との生
体サンプルのインキュベーション、ウイルスタンパク質の変性をもたらす、低又は高ｐＨ
でのインキュベーション、高温によりウイルスタンパク質の変性が達成される、殺菌処理
、等の様々な手法によって実現され得る。

「インキュベーション」という用語は、特定の条件で或る材料を維持する操作を指し、
そのためにその材料が修飾を受ける条件を含む。ウイルス不活性化のプロセスでは、ウイ
ルス不活性化を引き起こす化学的特性を有する溶液との或る材料のインキュベーションは
、活性なウイルス汚染物質を含まない材料の生成をもたらす。

「溶媒界面活性剤処理」という用語は、有機溶媒等の溶媒との、又は有機溶媒及び界面
活性剤との採取された抗体材料のインキュベーションを指す。

「高ｐＨ処理」という用語は、採取した抗体材料のｐＨが７を超えるバッファー液との
インキュベーションを指す。

「ウイルス除去」という用語は、処理されたサンプルからのウイルス粒子の物理的分離
を可能にする処理を指す。治療用タンパク質の精製プロセスでは、ウイルス除去は濾過工
程によって行われる。さらに、クロマトグラフィー工程等の精製プロセスの他のフェーズ
は、ウイルス粒子の除去を助ける。

「濾過」という用語は、固体を流体から分離する操作を指す。

「クロマトグラフィー」という用語は、クロマトグラフィーカラムの固定相と相互作用
する化合物の能力に基づいて混合物の化合物を分離する操作を指し、クロマトグラフィー
カラムの固定相から化合物を保持又は溶出することができる。

「ウイルス不活化アッセイ」及び「ウイルス除去検証（ＶＲＶ：ｖｉｒａｌ ｒｅｍｏ
ｖａｌ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）」という用語は本明細書で使用される場合、互換的であ
り、効果的なウイルス減少を試験するための手順を指す。ウイルス不活化アッセイを行う
ために、サンプル中のウイルスの存在を、既知量のストックウイルスでスパイクする前後
に、アウトプットウイルス力価をそれぞれのロードウイルス力価と比較することにより測
定する。ｌｏｇ_１０減少係数（ＲＦ）を、次の式に従って次いで決定できる：ＲＦ＝ｌｏ
ｇ_１０｛インプットウイルス力価×インプットボリューム／アウトプットウイルス力価×
アウトプットボリューム｝。ウイルスの不活化／除去を次の通り記載できる：ＲＦが４
ｌｏｇ_１０を超える場合、「有効」；ＲＦが２ ｌｏｇ_１０～４ ｌｏｇ_１０の間に含ま
れる場合、「適度に有効」；ＲＦが１ ｌｏｇ_１０～２ ｌｏｇ_１０の間に含まれる、「
ウイルス減少に対する貢献」；ＲＦが１ ｌｏｇ_１０未満の場合、「無効」。

本発明では、開始抗体採取材料はモノクローナル抗体を含む。好ましくは、モノクロー
ナル抗体は組換え体である。本発明の特定の実施形態では、モノクローナル組換え抗体は
ヘテロ二量体二重特異性抗体である。

本発明では、ヘテロ二量体二重特異性抗体は、ＢＥＡＴ（登録商標）技術（国際公開第
２０１２１３１５５５号）により生成され得る。本発明の一実施形態では、ＢＥＡＴ（登
録商標）１と呼ばれる二重特異性抗体は、Ｔ細胞により発現される分化クラスター３（Ｃ
Ｄ３）及び乳癌細胞でしばしば過剰発現されるヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）を
結合する。別の実施形態では、ＢＥＡＴ（登録商標）２と呼ばれるモノクローナル二重特
異性抗体（配列番号１、配列番号２及び配列番号３）は、多発性骨髄腫細胞で過剰発現さ
れるＣＤ３及び分化クラスター３８（ＣＤ３８）を結合する。別の実施形態では、モノク
ローナル二重特異性抗体はＢＥＡＴ（登録商標）３（配列番号４、配列番号５及び配列番
号６）であり、これはＣＤ３及びＥＧＦＲに結合し、結腸直腸癌を含む様々なタイプの癌
の標的であることが知られている。別の実施形態では、Ａｂ１と呼ばれるモノクローナル
抗体（配列番号７及び配列番号８）は、自己免疫疾患及び炎症性疾患に関与するＯＸ４０
受容体を標的とするＩｇＧ１である。

本発明の抗体は、細胞トランスフェクションにより宿主細胞で発現される。本発明で採
用される細胞トランスフェクション法としては、トランスフェクション試薬を利用する化
学物質に基づく方法が挙げられるが、これらに限定されない。本発明に適したトランスフ
ェクション試薬としては、リン酸カルシウム、リポソーム、カチオン性ポリマー及びデン
ドリマーが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の一実施形態では、細胞トラン
スフェクションはカチオン性ポリマーにより実施される。カチオン性ポリマーの非限定的
な例は、ジエチルエタノールアミン及びポリエチレンイミンである。本発明の特定の実施
形態では、カチオンポリマーはポリエチレンイミンである。

本発明の特定の態様によれば、抗体産生に利用される宿主細胞株としては真核細胞株が
挙げられるが、これに限定されない。本発明の一実施形態では、宿主細胞株は哺乳動物細
胞株である。より具体的な実施形態では、哺乳動物細胞株は非ヒト細胞株である。本発明
の更により具体的な実施形態では、哺乳動物細胞株はＣＨＯ細胞株、特にＣＨＯ－Ｓ細胞
株である。

本発明の宿主細胞は、溶存Ｏ_２が空気飽和の４０％に維持され温度が３７℃に維持され
る、動物由来成分を含まない（ＡＤＣＦ：ａｎｉｍａｌ ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｏｍｐｏｎ
ｅｎｔ ｆｒｅｅ）培地を含む２５０Ｌ作業容量の単回使用バイオリアクターで培養され
得る。培養はフィードバッチ培養であってもよく、この場合、フィードは接種後３日目に
開始される。フィードの毎日の大量投与をバイオリアクターに行う。フィード開始後１１
日目又は細胞生存率が８０％若しくは８５％に達した際に培養物を採取する。

本発明では、ウイルス不活化抗体溶液は、採取された抗体材料から調製され得る。特に
、採取された抗体材料は、宿主細胞培養物のバルク採取物の清澄化の生成物である。本発
明の特定の実施形態では、採取された抗体材料は、「デッドエンド」深層濾過を含む濾過
工程に続いて０．２μｍフィルターによる無菌濾過によりバルク採取物を清澄化すること
により調製される。

採取された抗体材料はクロマトグラフィーカラムにロードされ得る。本発明の特定の実
施形態では、採取された抗体材料を、プロテインＡ（ＰＡ）クロマトグラフィーにロード
する。プロテインＡクロマトグラフィーにロードされる採取された抗体材料を「ＰＡロー
ド」とも呼ぶ。収集した溶液を「ＰＡ溶出液」と呼ぶ。本発明では、プロテインＡクロマ
トグラフィーの樹脂を、最初にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でｐＨ７．４に平衡化す
る。本発明の特定の実施形態では、次いでカラムを洗浄し（例えば、トリス及び／又はア
セテートによって）、グリシン又はアセテート等の溶出バッファーを使用してカラムから
抗体を溶出する。本発明の一態様では、プロテインＡ溶出液を約５以上７以下のｐＨ、よ
り具体的には、５．５以上６．５以下のｐＨに中和する。

本発明の好ましい実施形態では、ウイルス不活性化は、溶媒洗浄処理により実施される
。本明細書に開示される方法に有用な有機溶媒としては、リン酸ｔｒｉ－（ｎ－ブチル）
（ＴｎＢＰ）のようなリン酸ジアルキルが挙げられる。有機溶媒の濃度は、約０．１％（
重量／重量）以上約１％（重量／重量）以下であってよい。特に、有機溶媒の濃度は、約
０．１％（重量／重量）、約０．２％（重量／重量）、約０．３％（重量／重量）、約０
．４％（重量／重量）、約０．５％（重量／重量）、約０．６％（重量／重量）、約０．
７％（重量／重量）、約０．８％（重量／重量）、約０．９％（重量／重量）又は約１％
（重量／重量）からなる群から選択される。より詳しくは、有機溶媒の濃度は、少なくと
も約０．１％（重量／重量）、少なくとも約０．３％（重量／重量）、少なくとも約０．
５％（重量／重量）又は少なくとも約１％（重量／重量）である。特定の好ましい実施形
態では、有機溶媒の濃度は、約０．２％（重量／重量）以上約０．４％（重量／重量）以
下である。特に、有機溶媒の濃度は、約０．２％（重量／重量）、又は約０．３％（重量
／重量）、又は約０．４％（重量／重量）である。より好ましくは、有機溶媒の濃度は約
０．３％（重量／重量）である。本発明はまた、上記の濃度の間の０．１％（重量／重量
）、０．２％（重量／重量）、０．３％（重量／重量）、０．４％（重量／重量）、０．
５％（重量／重量）、０．６％（重量／重量）、０．７％（重量／重量）、０．８％（重
量／重量）、０．９％（重量／重量）又は１％（重量／重量）の間隔での有機溶媒の濃度
を含む。

本明細書に開示される方法において有用な洗浄剤としては、ポリソルベート２０（Ｔｗ
ｅｅｎ２０（登録商標）等）、ポリソルベート４０（Ｔｗｅｅｎ４０（登録商標）等）、
ポリソルベート６０（Ｔｗｅｅｎ６０（登録商標）等）、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅ
ｎ８０（登録商標）等）等のポリソルベート、及びポリオキシエチレンオクチルフェニル
エーテル（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００等）を含む、ポリオキシチレングリコー
ルソルビタンアルキルエステル（ｐｏｌｙｏｘｅｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｓｏ
ｒｂｉｔａｎ ａｌｋｙｌ ｅｓｔｅｒｓ）のような非イオン性界面活性剤が挙げられる
。「ポリソルベート」及び「Ｔｗｅｅｎ」という用語は本明細書で使用される場合、互換
的である。洗浄剤の濃度は、約０．１％（重量／重量）以上約２％（重量／重量）以下で
あり、特に、洗浄剤の濃度は０．２％（重量／重量）以上１．５％（重量／重量）以下で
ある。本発明のより具体的な実施形態では、洗浄剤の濃度は、０．７５％（重量／重量）
以上１．２５％（重量／重量）以下である。より具体的には、洗浄剤の濃度は、約０．１
％（重量／重量）、約０．２％（重量／重量）、約０．３％（重量／重量）、約０．４％
（重量／重量）、約０．５％（重量／重量）、約０．６％（重量／重量）、約０．７％（
重量／重量）、約０．８％（重量／重量）、約０．９％（重量／重量）、約１％（重量／
重量）、約１．２％（重量／重量）、約１．５％（重量／重量）、約１．７％（重量／重
量）、又は約２％（重量／重量）からなる群から選択される。より詳しくは、有機溶媒の
濃度は、少なくとも約０．２％（重量／重量）、少なくとも約０．５％（重量／重量）、
少なくとも約０．７５％（重量／重量）、少なくとも約１％（重量／重量）又は少なくと
も約１．２５％（重量／重量）である。特定の好ましい実施形態では、界面活性剤の濃度
は、約０．７５％（重量／重量）、又は約１％（重量／重量）又は約１．２５％（重量／
重量）である。より好ましい実施形態では、洗浄剤の濃度は約１％（重量／重量）である
。本発明はまた、上記濃度の間の０．０５％（重量／重量）、０．１％（重量／重量）、
０．２％（重量／重量）、０．３％（重量／重量）、０．４％（重量／重量）、０．５％
（重量／重量）、０．６％（重量／重量）、０．７％（重量／重量）、０．８％（重量／
重量）、０．９％（重量／重量）又は１％（重量／重量）の間隔での有機溶媒の濃度を含
む。

本発明の一態様では、抗体含有材料は、約５分以上約１２０分以下のインキュベーショ
ン時間の間溶媒若しくは洗浄剤、又は溶媒と洗浄剤の混合物とインキュベートされる。具
体的には、インキュベーション時間は、約５分、約１０分、約２０分、約３０分、約６０
分、約９０分及び約１２０分を含む群から選択される。より具体的には、上記インキュベ
ーション時間は、少なくとも約５分、少なくとも約１０分、少なくとも約２０分、少なく
とも約３０分、少なくとも約６０分、少なくとも約９０分、及び少なくとも約１２０分で
ある。さらにより具体的には、インキュベーション時間は３０分以上９０分以下であり、
好ましくはインキュベーション時間は６０分である。本発明はまた、上記のインキュベー
ション間隔の間の１分、２分、５分、１０分、１５分、３０分、６０分、７５分又は９０
分の間隔での溶媒及び洗浄剤のインキュベーション時間を含む。

本発明の一実施形態では、最終濃度が約０．３％（重量／重量）のＴｎＢＰ及び約０．
２％（重量／重量）～約１％重量／重量）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００であるように、抗
体含有溶液をＴｎＢＰ及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で処理する。この実施形態の別の態
様では、最終濃度が約０．３％（重量／重量）のＴｎＢＰ及び約０．２％（重量／重量）
～約１％（重量／重量）のポリソルベート８０であるように、抗体含有溶液をＴｎＢＰ及
びポリソルベート８０で処理する。この実施形態の別の態様では、最終濃度が約０．３％
（重量／重量）のＴｎＢＰ及び約０．２％（重量／重量）～約１％（重量／重量）のポリ
ソルベート２０であるように、抗体を含む溶液をＴｎＢＰ及びポリソルベート２０で処理
する。

本発明の一態様では、抗体を含む溶液はＰＡ溶出液である。特定の態様では、ＰＡ溶出
液を、約０．１％（重量／重量）ＴｎＢＰ、又は約０．３％（重量／重量）ＴｎＢＰ、又
は約０．５％（重量／重量）ＴｎＢＰ、又は約１％（重量／重量）ＴｎＢＰ、又は約０．
３％（重量／重量）ＴｎＢＰ及び約０．２％（重量／重量）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、
又は約０．３％（重量／重量）ＴｎＢＰ及び約０．５％（重量／重量）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ
－１００、又は約０．３％（重量／重量）ＴｎＢＰ及び約１％（重量／重量）Ｔｒｉｔｏ
ｎ Ｘ－１００、又は約０．３％（重量／重量）ＴｎＢＰ及び約０．２％（重量／重量）
ポリソルベート８０、又は約０．３％（重量／重量）ＴｎＢＰ及び約０．５％（重量／重
量）ポリソルベート８０、又は約０．３％（重量／重量）ＴｎＢＰ及び約１％（重量／重
量）ポリソルベート８０、又は約０．３％（重量／重量）ＴｎＢＰ及び約０．２％（重量
／重量）ポリソルベート２０、又は約０．３％（重量／重量）ＴｎＢＰ及び約０．５％（
重量／重量）ポリソルベート２０、又は約０．３％（重量／重量）ＴｎＢＰ及び約１％（
重量／重量）ポリソルベート２０で処理する。より具体的な態様では、ＰＡ溶出液を、約
０．２％（重量／重量）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００又は約０．５％（重量／重量）Ｔｒｉ
ｔｏｎ Ｘ－１００、又は約０．５％（重量／重量）ポリソルベート８０、又は約１％（
重量／重量）ポリソルベート８０、又は約０．２％（重量／重量）ポリソルベート２０、
又は約０．５％（重量／重量）ポリソルベート２０、又は約１ ％（重量／重量）ポリソ
ルベート２０と組み合わせた約０．３％（重量／重量）ＴｎＢＰで処理する。

本発明のより具体的な態様では、抗体を含む溶液はＰＡ溶出液であり、ＰＡ溶出液は０
．３％（重量／重量）ＴｎＢＰと１％（重量／重量）ポリソルベート８０の混合物と室温
で少なくとも１０分間、好ましくは室温で約６０分間インキュベートされる。

本発明の別の態様では、抗体含有溶液はＰＡロードであり、ＰＡロードは、約１％（重
量／重量）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、又は約１％（重量／重量）ポリソルベート８０、
又は約１％（重量／重量）ポリソルベート２０と組み合わせた約０．３％（重量／重量）
ＴｎＢＰで処理される。

本発明の特定の態様では、ＰＡロードは、先に明示されるインキュベーション時間の間
、溶媒若しくは洗浄剤、又は溶媒と洗浄剤の混合物とインキュベートされる。さらに、上
記溶媒若しくは上記洗浄剤、又は上記溶媒と洗浄剤の混合物とインキュベートされた上記
ＰＡロードはＰＡクロマトグラフィーカラムにロードされ、ローディング時間は約７時間
以下である。特定の実施形態では、ローディング時間は約３時間である。好ましくは、イ
ンキュベーション時間及びローディング時間の合計は７時間以下である。

本発明のより具体的な態様では、抗体を含む溶液はＰＡロードであり、ＰＡロードを、
ＰＡクロマトグラフィーカラムにロードする前に０．３％（重量／重量）ＴｎＢＰ及び１
％（重量／重量）ポリソルベート８０の混合物と少なくとも５分間、好ましくは室温で６
０分間インキュベートする。

本発明の別の実施形態では、ウイルス不活性化の方法は高ｐＨ処理である。本明細書に
開示される方法において有用なバッファー液としては、酢酸塩、クエン酸塩、トリス、ヒ
スチジン、Ｌ－アルギニン、リン酸塩、ＮａＯＨを含むが、これらに限定されないアルカ
リ溶液が挙げられる。バッファー液のｐＨは、約７．５以上約１４以下であり得る。特に
、バッファー液のｐＨは、約７．５、約８、約８．５、約９、約９．５、約１０、約１０
．５、約１１、約１１．５、約１２、約１２．５、又は約１３、又は約１３．５、又は約
１４の群から選択される。より具体的な実施形態では、バッファー液のｐＨは約１０以上
約１２以下であり、より具体的には、バッファー液のｐＨは約１０．５以上約１１．５以
下である。具体的には、バッファー液のｐＨは少なくとも１０．５であり、より具体的に
は、バッファー液のｐＨは約１１．５であり、より好ましくは約１１．２、更により好ま
しくは約１１である。本発明はまた、上記のｐＨ値の間の０．１、０．２、０．３、０．
４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９又は１の間隔でｐＨ値を含む。この実施形
態の特定の態様では、抗体を含む溶液はＰＡ溶出液であり、ＰＡ溶出液はリン酸塩２５０
ｍＭ、ＮａＯＨ ０．１Ｍ及びＮａＯＨ ０．５Ｍで処理される。

本発明の一実施形態では、抗体含有材料を、約１分以上約４時間以下のインキュベーシ
ョン時間に亘り高ｐＨでインキュベートする。具体的には、インキュベーション時間は、
約１分、約５分、約１０分、約３０分、約４５分、約６０分、約９０分、約２時間、約３
時間及び約４時間を含む群から選択される。より具体的には、上記インキュベーション時
間は、少なくとも約１分、少なくとも約５分、少なくとも約１０分、少なくとも約３０分
、少なくとも約４５分、少なくとも約６０分、少なくとも約９０分、少なくとも約２時間
、少なくとも約３時間及び少なくとも約４時間である。更により具体的には、インキュベ
ーション時間は３０分以上９０分以下であり、好ましくはインキュベーション時間は６０
分である。本発明はまた、上記のインキュベーション間隔の間の１分、５分、１０分、１
５分、３０分、６０分、７５分、９０分又は１２０分の間隔での高ｐＨインキュベーショ
ン時間も含む。

プロテインＡクロマトグラフィー及びウイルス不活化処理後に、又はウイルス不活化処
理及びプロテインＡクロマトグラフィー後に、抗体を含む溶液を他のクロマトグラフィー
及び濾過工程で更に処理して抗体を更に精製及び濃縮し、治療用抗体を含む原薬を製造す
ることができる。本発明の一態様では、バルク原薬の製造方法が開示される。バルク原薬
の製造方法は、（ａ）溶媒洗浄剤処理によるウイルス不活性化、（ｂ）プロテインＡクロ
マトグラフィー精製、（ｃ）陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）、（ｄ）限外濾
過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）、（ｅ）陰イオン交換膜吸収剤、（ｆ）ウ
イルスナノ濾過、（ｇ）ＵＦ／ＤＦ、（ｈ）賦形剤の添加及び濃度調整、の結果としての
工程（ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｔ ｓｔｅｐｓ）；又は（ａ’）プロテインＡクロマトグラフ
ィー精製、（ｂ’）溶媒洗浄剤処理によるウイルス不活性化、（ｃ’）ＣＥＸ、（ｄ’）
ＵＦ／ＤＦ、（ｅ’）陰イオン交換膜吸収剤、（ｆ’）ウイルスナノ濾過、（ｇ’）ＵＦ
／ＤＦ、（ｈ’）添加剤の添加及び濃度調整の結果としての工程、又は（ａ’’）プロテ
インＡクロマトグラフィー精製、（ｂ’’）高ｐＨ処理、（ｃ’’）ＣＥＸ、（ｄ’’）
ＵＦ／ＤＦ、（ｅ’’）陰イオン交換膜吸収剤、（ｆ’’）ウイルスのナノ濾過、（ｇ’
’）ＵＦ／ＤＦ、（ｈ’’）添加剤の添加及び濃度調整、の結果としての工程を含んでも
よい。

本発明のより具体的な態様では、バルク原薬の製造方法は、撹拌下で６０分間ＴｎＢＰ
０．３％（重量／重量）及びポリソルベート８０ １％（重量／重量）での溶媒洗浄剤
処理により採取された抗体材料のウイルス不活性化を最初に行うことからなる。次いで、
ウイルス不活化溶液のプロテインＡクロマトグラフィーを行い、得られたＰＡ溶出液をｐ
Ｈ６．０に中和し、０．２μｍ濾過を行い、次に、中和された中間ＰＡ溶出液を陽イオン
交換クロマトグラフィーカラムにロードし、生成物を０．２μｍフィルターに通す。次い
で、抗体を２５ｍｇ／ｍＬの目標に濃縮し、限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ
／ＤＦ）システムにより５０ｍＭヒスチジンｐＨ６．５で透析する。次いで、生成物を０
．２μｍ濾過し、フロースルーモードでの陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー用
の正に帯電したＮａｔｒｉＦｌｏの使い捨てメンブレンで精製する。その後、溶出液を０
．２μｍ濾過する。次に、物理的にウイルスを除去するため、生成物を使い捨てのミキシ
ングバッグに無菌的に接続されたＶｉｒｏｓａｒｔ（登録商標）ＨＦでナノ濾過する。０
．２濾過済の予備製剤バッファー、５ｍＭクエン酸塩 ｐＨ６．０へのバッファー交換の
ために２回目のＵＦ／ＤＦを行う。次いで、得られた生成物を０．２μｍフィルターで濾
過する。最終製剤バッファー中の６ｍｇ／ｍＬの最終濃度を達成するために、生成物を計
算量の５ｍＭクエン酸塩、１５％スクロース、０．０６％ポリソルベート８０ ｐＨ５．
９と混合し、０．２μｍ濾過する。次いで、得られた生成物を０．２μｍフィルターで濾
過した後、ポリオレフィン単層フィルムで構成される滅菌バッグに充填し、－８０±２０
℃で凍結保存する。

本発明の別の特定の実施形態では、バルク原薬の製造方法は、清澄化された採取物をプ
ロテインＡクロマトグラフィーにまず通すこと、それに続く室温でのインキュベーション
時間６０分に亘る高ｐＨ（目標ｐＨ＝１１）でのＰＡ溶出液のインキュベーションからな
る。次に、ウイルス不活化溶液をｐＨ５．５に中和し、０．２μｍ濾過する。次いで、中
和された中間ＰＡ溶出液を陽イオン交換クロマトグラフィーカラムにロードし、生成物を
０．２μｍフィルターに通す。次いで、抗体を２５ｍｇ／ｍＬの目標に濃縮し、限外濾過
／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）システムにより５０ｍＭヒスチジンｐＨ６．
５で透析する。次いで、生成物を０．２μｍ濾過し、フロースルーモードでの陰イオン交
換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー用の正に帯電したＮａｔｒｉＦｌｏの使い捨てメンブレ
ンで精製する。その後、溶出液を０．２μｍ濾過する。次に、物理的にウイルスを除去す
るため、生成物を使い捨てのミキシングバッグに無菌的に接続されたＶｉｒｏｓａｒｔ（
登録商標）ＨＦでナノ濾過する。０．２μｍ濾過済の予備製剤バッファー、５ｍＭヒスチ
ジン、１５０ｍＭアルギニン一塩酸塩、ｐＨ６．０へのバッファー交換のために２回目の
ＵＦ／ＤＦ工程を行う。最終製剤バッファー中の６ｍｇ／ｍＬの最終濃度を達成するため
に、生成物を計算量の５ｍＭ Ｌ－ヒスチジン、１５０ｍＭ Ｌ－アルギニン一塩酸塩、
１５％スクロース、０．０６％ポリソルベート８０、ｐＨ６．０と混合する。次いで、得
られた生成物を０．２μｍフィルターで濾過した後、ポリオレフィン単層フィルムで構成
される滅菌バッグに充填し、－８０±２０℃で凍結保存する。

本発明の特定の実施形態では、モノクローナル抗体、バッファー、界面活性剤及び安定
化剤を含む液体医薬製剤が開示される。

「液体」製剤は本明細書で使用される場合、液体形式で調製されたものである。かかる
製剤は、被験体への直接投与に適している可能性があり、代替的には、液体形態、凍結状
態、又は後で液体形態若しくは被験体への投与に適した他の形態に再構成する乾燥形態（
例えば、凍結乾燥）のいずれかで保存用に包装することが可能である。

「バッファー」という用語は本明細書で使用される場合、その酸－塩基複合体成分の作
用によりｐＨの変化に抵抗する緩衝された溶液を指す。本発明のバッファーは、約５．０
～約７．０の範囲のｐＨを有し、好ましくは６．０±０．５である。この範囲でｐＨを制
御できるバッファーの例としては、酢酸塩（例えば酢酸ナトリウム）、コハク酸塩（コハ
ク酸ナトリウム等）、グルコン酸塩、ヒスチジン（例えばＬ－ヒスチジン）、クエン酸塩
、リン酸塩及び他の有機酸バッファーが挙げられる。

典型的な界面活性剤の例としては、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ソルビタンモ
ノカプリレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート）、グリセリ
ン脂肪酸エステル（例えば、グリセリンモノカプリレート、グリセリンモノミリステート
、グリセリンモノステアレート）、ポリグリセリン脂肪酸エステル（例えば、デカグリセ
リルモノステアレート、デカグリセリルジステアレート、デカグリセリルモノリノレート
）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビ
タンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレ
ンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリ
オキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレ
ート）、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル（例えば、ポリオキシエチレン
ソルビトールテトラステアレート、ポリオキシエチレンソルビトールテトラオレエート）
、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル（例えば、ポリオキシエチレングリセリ
ルモノステアレート）、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例えば、ポリエチレン
グリコールジステアレート）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（例えば、ポリオキ
シエチレンラウリルエーテル）ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテ
ル（例えば、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールエーテル、ポリオキシ
エチレンポリオキシプロピレンプロピルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピ
レンセチルエーテル）、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（例えば、ポリオ
キシエチレンノニルフェニルエーテル）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（例えば、ポ
リオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油）、ポリオキシエチレンミ
ツロウ誘導体（例えば、ポリオキシエチレンソルビトールミツロウ）、ポリオキシエチレ
ンラノリン誘導体（例、ポリオキシエチレンラノリン）、及びポリオキシエチレン脂肪酸
アミド（例えば、ポリオキシエチレンステアリルアミド）等の非イオン性界面活性剤（Ｈ
ＬＢ６～１８）；Ｃｉｏ－Ｃｉｓアルキル硫酸塩（例：セチル硫酸ナトリウム、ラウリル
硫酸ナトリウム、オレイル硫酸ナトリウム）、平均２モル～４モルのエチレンオキシドを
含むポリオキシエチレンＣｉｏ－Ｃｉｓアルキルエーテル硫酸塩（例えば、ポリオキシエ
チレンラウリル硫酸ナトリウム）、及びＣｓ－Ｃｉｓアルキルスルホコハク酸エステル塩
（例えば、ラウリルスルホコハク酸ナトリウムエステル）；並びにレシチン、グリセロホ
スホ脂質、スフィンゴホスホ脂質（例えばスフィンゴミエリン）、及びＣ１２～Ｃ１８脂
肪酸のショ糖エステル等の天然界面活性剤が挙げられる。好ましくは、界面活性剤は、ポ
リオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルから選択される。特に好ましくは、界面活性
剤はポリソルベート２０、２１、４０、６０、６５、８０、８１及び８５であり、最も好
ましくはポリソルベート８０である。

タンパク質を安定化するために、製剤に安定化剤を添加してもよい。上記安定化は、酢
酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、酢酸カリウム、重
炭酸カリウム、炭酸カリウム、塩化カリウム、ショ糖、ポリオール、糖、ヒスチジン、ア
ルギニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アルギニン一塩酸塩、グリシン、メチオニン、プロリン
、リジン、グルタミン酸等のアミノ酸、アミン及びトレハロースを含む群から選択される
。

本発明の特定の実施形態では、モノクローナル抗体、バッファー、界面活性剤及び安定
化剤を含む液体医薬製剤を開示し、ここで上記モノクローナル抗体が約０．０１ｍｇ／ｍ
Ｌ以上約１００ｍｇ／ｍＬ以下の濃度で、好ましくは約６ｍｇ／ｍＬの濃度で上記医薬製
剤中に存在し、上記バッファーが約５ｍＭの濃度で上記医薬製剤中に存在するクエン酸塩
であり、上記界面活性剤が約０．０６％の割合で上記医薬製剤中に存在するポリソルベー
トであり、上記安定化剤が約１５％の割合で上記医薬製剤中に存在するスクロースであり
、ここで医薬製剤は約５．９のｐＨを有する。

本発明の別の実施形態では、モノクローナル抗体、バッファー、界面活性剤及び安定化
剤を含む液体医薬製剤を開示し、ここで上記モノクローナル抗体が約０．０１ｍｇ／ｍＬ
以上約１００ｍｇ／ｍＬ以下の濃度で、好ましくは約６ｍｇ／ｍＬの濃度で上記医薬製剤
中に存在し、上記バッファーが約５ｍＭの濃度で上記医薬製剤中に存在するクエン酸塩で
あり、上記界面活性剤が約０．０６％の割合で上記医薬製剤中に存在するポリソルベート
であり、上記安定化剤が約１５％の割合で上記医薬製剤中に存在するスクロース、及び約
１２０ｍＭの濃度で上記医薬製剤に存在するＬ－アルギニン一塩酸塩であり、ここで医薬
製剤は約６．０のｐＨを有する。

ウイルス不活化アッセイは、抗体溶液の純度を試験し、ウイルス安全性を確保するため
に必要である。本発明の好ましい実施形態では、抗体含有溶液をモデルウイルスでスパイ
クし、サンプル中のウイルスの存在をスパイクの前後に測定する。モデルウイルスとして
は、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、マウス微小ウイルス（ＭＭＶ）、仮性狂犬病ウイ
ルス（ＰＲＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明は、古典的に採用されている低ｐＨ処理の代替として使用できるウイルス不活性
化の方法を提案する。これらの代替方法は、精製する治療用抗体が低ｐＨ不安定である場
合、及び／又は低ｐＨが精製プロセスに適合しない場合に特に有利である。

低ｐＨによるウイルス不活性化、ラン１、単量体ＨＰＬＣ－ＳＥの％を示す図である。 低ｐＨによるウイルス不活化、ラン１；ＨＰＬＣ－ＳＥによる（Ａ）凝集物及び（Ｂ）ショルダーを示す図である。 低ｐＨ処理後の分解サンプルのＨＰＬＣ－ＳＥプロファイルを示す図である。 低ｐＨ処理後のＨＰＬＣ－ＨＩＣ結果、％メインピークを示す図である。 低ｐＨ処理後のＨＰＬＣ－ＨＩＣ結果、％凝集物＋ショルダーを示す図である。 低ｐＨでのウイルス不活化＋ＮａＣｌスパイク：ＨＰＬＣ－ＳＥの結果を示す図である。 低ｐＨでのウイルス不活化＋ＮａＣｌスパイク：ＣＧＥの結果を示す図である。 カプリル酸インキュベーション：ＨＰＬＣ－ＳＥの結果を示す図である。 カプリル酸インキュベーション：ＨＰＬＣ－ＨＩＣの結果を示す図である。 ＢＥＡＴ（登録商標）２高ｐＨ保持時間の影響－ＳＥ－ＨＰＬＣを示す図である。 ＢＥＡＴ（登録商標）２高ｐＨ保持時間の影響－ＮＲ ＣＧＥを示す図である。 ＢＥＡＴ（登録商標）２高ｐＨ保持時間の影響－還元ＣＧＥを示す図である。 ＢＥＡＴ（登録商標）２高ｐＨ保持時間の影響－ＩＣＥを示す図である。 用量反応曲線及びＥＣ５０値を示す図である。 低ｐＨインキュベーション後のＨＰＬＣ－ＳＥによる単量体％を示す図である。 低ｐＨインキュベーション後のＨＰＬＣ－ＳＥによるショルダー種及び凝集物％を示す図である。 低ｐＨインキュベーション後の分解サンプルのＨＰＬＣ－ＳＥプロファイルを示す図である。 低ｐＨインキュベーション後のサンプルｔ０のＣａｌｉｐｅｒ ＣＧＥ非還元プロファイルを示す図である。 低ｐＨインキュベーション後のサンプルＴ４８ｈのＣａｌｉｐｅｒ ＣＧＥ非還元プロファイルを示す図である。 種々の高ｐＨインキュベーション時間に対するＣＧＥ非還元プロファイルの比較を示す図である。 種々の高ｐＨインキュベーション時間に対するＩＣＥプロファイルの比較を示す図である。 パイロットスケールのＶＩ高ｐＨランに対するＣＧＥ非還元プロファイルの比較を示す図である。 パイロットスケールのＶＩ高ｐＨランに対するＩＣＥプロファイルの比較を示す図である。 高ｐＨ処理期間に応じた用量反応曲線及びＥＣ５０を示す図である。 高ｐＨ処理速度論を示す図である。 Ａｂ１高ｐＨ保持時間の影響－ＳＥ－ＨＰＬＣを示す図である。 Ａｂ１高ｐＨ保持時間の影響－ＮＲ ＣＧＥを示す図である。 Ａｂ１高ｐＨ保持時間の影響－還元ＣＧＥを示す図である。 Ａｂ１高ｐＨ保持時間の影響－ＩＣＥを示す図である。 用量反応曲線及びＥＣ５０値を示す図である。

実施例１：治療用タンパク質の精製プロセスでウイルス不活化工程として一般的に使用さ
れる低ｐＨ処理は、低ｐＨ不安定抗体の安定性を損なう
治療用タンパク質精製のプロセスでウイルスを不活性化するために一般的に使用される
手法は、低ｐＨでタンパク質含有溶液をインキュベートすることからなる。ここでは、ウ
イルスを不活性化する低ｐＨ処理の能力、及びモノクローナルヘテロ二量体抗体の安定性
に対するその効果を調査した。この調査の結果は、ＢＥＡＴ（登録商標）１抗体の場合で
のように、ウイルス不活化が有効でありかつ抗体の安定性が一般的に維持される低ｐＨ条
件は、ＢＥＡＴ（登録商標）２等の低ｐＨ不安定抗体には適さないことを示唆する。この
課題を克服するため、ＢＥＡＴ（登録商標）２の安定性及び活性に対するウイルス不活化
の代替方法の効果を試験するための追加の研究を行った。この実施例は、（ａ）ＢＥＡＴ
（登録商標）１含有プロテインＡ（ＰＡ）クロマトグラフィー溶出液の低ｐＨ処理に関す
るウイルス除去検証（ＶＲＶ）研究；（ｂ）ＢＥＡＴ（登録商標）２の安定性に対する有
効な低ｐＨレベルの影響；代替のウイルス不活化手法を使用する場合に実施される（ｃ）
ＢＥＡＴ（登録商標）２の安定性及び（ｄ）活性に関する研究、を示している。

ａ．ＢＥＡＴ（登録商標）１分子含有ＰＡ溶出液の低ｐＨ処理に関するＶＲＶ研究
まず、ＢＥＡＴ（登録商標）１抗体の精製プロセスの工程として、低ｐＨでのＢＥＡＴ
（登録商標）１含有ＰＡ溶出液のインキュベーションによるウイルス不活化の有効性を調
査した。

材料、方法及び機器
このＶＲＶ研究に使用したモデルウイルスは、内因性ウイルスの関連モデルであるマウ
ス白血病ウイルス（ＭＬＶ）であった。このウイルスモデルの主な特徴を表１に示す。

低ｐＨ処理を、ＢＥＡＴ（登録商標）１分子含有ＰＡ溶出液に適用した。ＢＥＡＴ（登
録商標）１精製プロセスで実施されたＶＲＶ研究中に使用された出発物質を表２に示す。

ＶＲＶ研究では、試験サンプルを低ｐＨ処理の前に採取し、ウイルス力価について分析
した。サンプルを既知量のストックウイルスでスパイクし、アウトプットウイルス力価を
それぞれのロードウイルス力価と比較して、減少係数を計算した。これは、表３に示され
る「最悪の場合」の条件下で行われた。

この工程を、図４に示すように、３つの異なるｐＨ条件（設定点、＋０．２及び－０．
２）で重複して行った。低ｐＨ不活性化工程の温度（Ｔ）仕様は２０℃～２５℃である。
しかしながら、実施中の目標温度は、最悪の場合のシナリオデータを得るため１６℃であ
った。

Ｌｏｇ減少係数を中和ロード（Ｌ）サンプルに関して計算し、サンプルを、異なるイン
キュベーション時間（ｔ）点、５分、１０分、３０分及び６０分の後に取り出し、その後
、異なる低ｐＨ処理の速度論を得るため、０．２５ＭヒスチジンｐＨ１２．０を使用して
ｐＨ６．０～ｐＨ８．０に中和する。次いで、サンプルを滴定の直前に氷上に置く。ロー
ドホールド（Ｈ）サンプルを、プロセス期間中１６℃±１℃に保持し、ｔ＝６０分のサン
プルを収集する。標準滴定に加えて、ｔ＝６０分のサンプルに対して大量プレーティング
（ＬＶＰ）を行った。低ｐＨ不活性化工程中に行われたアッセイの概要を表５に示す。

結果及び結論
ロードサンプル及びロードホールドサンプルの間にウイルス力価において統計的に有意
な変動が観察されなかった場合（注：１ ｌｏｇ_１０未満の差は有意でないとみなされる
）、これは減少係数の計算に使用されるロードサンプル、又は追加の濾過が行われた場合
のロード２サンプル（ＶＲＦ工程のみ）であった。ロードとロードホールドの結果の間に
は、工程に関係なくウイルス力価の有意な変動は観察されなかったため（追加の濾過が行
われたＶＲＦを除く）、ｌｏｇ_１０減少係数を実施するためにロードの結果を使用した。

低ｐＨウイルス不活化工程ＢＥＡＴ（登録商標）１を、ＰＡ溶出液を使用してｐＨ３．
５、ｐＨ３．７及びｐＨ３．９でのＭＬＶクリアランスに対する効率について評価した。
表６は、様々な低ｐＨレベルで得られたｌｏｇ_１０値及び実験ごとに計算されたｌｏｇ_１
０減少係数を示す。

ウイルス不活化研究は以下を示す：
－ｐＨ３．５での低ｐＨ不活性化は、ラン１及びラン２でそれぞれ５．９４ ｌｏｇ_１０
及び４．７１ ｌｏｇ_１０の減少係数をもたらし、これは低ｐＨ不活性化がｐＨ３．５で
ＭＬＶに有効であることを意味する。しかしながら、表６に示される結果は、ラン１とラ
ン２の間の変動が１ ｌｏｇ_１０を超える差を有して顕著であり（ラン１で０．０８ ｌ
ｏｇ_１０、ラン２で１．６６ ｌｏｇ_１０）従って反復ランの間で結果を比較できなかっ
たことを示す。しかしながら、ｐＨ３．５での低ｐＨ不活性化は、ｐＨ３．５でのＭＬＶ
不活性化の挙動に関するデータを提供するためにのみ実施され、そのためこれらの結果は
全体のｌｏｇ減少係数の計算には使用されなかった。
－標準アッセイ（ｔ＝ ６０分の時間点で行ったＬＶＰ）で決定されたように、ｐＨ３．
７での低ｐＨ不活性化はＭＬＶウイルスの不活性化に寄与した。２．１９ ｌｏｇ_１０及
び１．７５ ｌｏｇ_１０（それぞれ、ラン１及びラン２）の減少係数が、低ｐＨ不活性化
ランから得られた。表６に提示される結果は、ラン１と２の間の変動はラン１について４
．１８ ｌｏｇ_１０及びラン２について４．２７ ｌｏｇ_１０を有して顕著でなく従って
反復ランの間で結果を比較できることを示す。
－標準アッセイで（ｔ＝６０分の時間点で行われたＬＶＰ）決定されたように、ｐＨ３．
９での低ｐＨ不活性化はＭＬＶウイルスの不活性化に寄与した。１．０５ ｌｏｇ_１０及
び１．０５ ｌｏｇ_１０（それぞれ、ラン１及びラン２）の減少係数が、低ｐＨ不活性化
ランから得られた。表６に示される結果は、ラン１とラン２の間の変動はラン１と２の両
方で５．４９ ｌｏｇ１０を有して顕著でなく従って反復ランの間で結果は同等であるこ
とを示す。

得られた結果に基づいて、ｐＨ３．５での低ｐＨ不活性化はＭＬＶウイルスの不活性化
に有効であることが示され、最小減少係数は４．７１ ｌｏｇ_１０であった。ｐＨ３．７
での低ｐＨ不活性化は、ＭＬＶウイルスの不活性化に寄与することが示され、最小減少係
数は１．７５ ｌｏｇ_１０であった。ｐＨ３．９での低ｐＨ不活性化は、ＭＬＶウイルス
の不活性化に寄与することが示され、最小減少係数は１．０５ ｌｏｇ_１０であった。

これらの結果は、モノクローナル抗体の生産プロセスでウイルスの不活性化に従来使用
される低ｐＨ処理が、ｐＨ３．５でＭＬＶウイルスを効果的に不活性化できることを示す
。

ｂ．低ｐＨに供したＢＥＡＴ（登録商標）２の安定性研究
次に、他の抗体の安定性に関する研究を実施して、低ｐＨ処理の効果を評価した。特に
、ＢＥＡＴ（登録商標）２を低ｐＨでインキュベートした。

材料、方法及び機器
この研究で使用した出発物質は、Ｋａｎｅｋａ製ＫａｎＣａｐＡ樹脂を使用するアフィ
ニティクロマトグラフィーから得られたＰＡ溶出液であった。

細胞培養を通常、生存率が８０％を下回ったときに終了し、細胞片をデッドエンド深層
濾過とそれに続く０．２μｍフィルターでの濾過により除去した。細胞培養上清はＣＨＯ
細胞に由来した。

この研究では異なる出発物質を使用し、出発物質は代表的でないバルク採取物（２つの
クローン、小規模バイオリアクター又はウェーブバッグ培養に由来するクローン１及びク
ローン２）及び代表的なバルク採取物（選択されたクローン１、使い捨てバイオリアクタ
ー２５０Ｌ）に由来した。

インプロセス０．２μｍ濾過工程を通常、ＴＰＰ ２５０ｍＬフィルタートップ、Ｓｔ
ｅｒｉｆｌｉｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）又はＳａｒｔｏｐｏｒｅ ２フィルター（Ｓａｒ
ｔｏｒｉｕｓ）を使用して行った。０．２μｍの濾過工程を全てのバッファーと全ての中
間体に対して、それらの中間体を直ちに更に処理しない限り行った。バッファーを室温で
保管し、プロセス中間体を通常＋５±３℃で保管した。ウイルス不活化研究では、磁気攪
拌機及びｐＨメーターのみを使用した。

出発物質として使用したＰＡ溶出液は、直径１．１ｃｍのＶａｎｔａｇｅ Ｌカラム（
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用するＡＫＴＡＥｘｐｌｏｒｅｒ及びＡＫＴＡＰｕｒｉｆｉｅ
ｒシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で行われたプロテインＡ小規模クロマトグラ
フィー開発実験に由来した。

採取力価をＰＡ－ＨＰＬＣを使用して決定した。ＰＡ溶出液をＨＰＬＣ－ＳＥで分析し
て、凝集物及びフラグメントの割合を推定した。しかしながら、ＳＥ－ＨＰＬＣはホモ二
量体不純物の残留パーセンテージを判断するには十分ではなかった。したがって、ＰＡ溶
出液サンプルを、ルーチンで非還元ＣＧＥによっても分析した。出発物質としてＰＡ溶出
液を使用した幾つかのランでは、ウイルス不活化工程の収率を２８０ｎｍでＮａｎｏｄｒ
ｏｐ装置（Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００分光光度計、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉ
ｃ）により処理する前後の濃度を測定し、計算した。ＢＥＡＴ（登録商標）２のモル吸光
係数は１．５２である。ＨＰＬＣ－ＨＩＣ及びｉＣＥ３を使用して、幾つかの実験を分析
し、疎水性種及び電荷バリアントに対する処理の効果があるかどうかを調べた。

結果及び結論
クローン１及びクローン２の細胞培養物からの少量のＰＡ溶出液（約３ｍＬ）を、ＨＣ
ｌ３．７％を使用してｐＨ３．６、ｐＨ３．７、ｐＨ３．８及びｐＨ３．９に酸性化した
。ＢＥＡＴ（登録商標）２を、攪拌しながら室温（ＲＴ）で６０分～１２０分間、低ｐＨ
でインキュベートした。反応を停止するため、２５０ｍＭヒスチジンｐＨ１２．０を使用
してｐＨをｐＨ６．０又はｐＨ５．５に上げた。この実験を数回繰り返して、結果を確認
した。塩が分子に対する保護効果を有するかどうかを観察するため、低ｐＨでのインキュ
ベーション前に最初にＰＡ溶出液をＮａＣｌでスパイクすることにより、同じ研究を行っ
た。様々な濃度、すなわち１５０ｍＭ、５００ｍＭ及び１ＭのＮａＣｌを、ｐＨ３．７で
９０分間の酸性化と組み合わせて試験した。次いで、生成物をＨＰＬＣ－ＳＥ、ＨＰＬＣ
－ＨＩＣ及びＣＧＥ（非還元）により分析した。表７に低ｐＨインキュベーションで試験
した条件の概要を示す。

ＮａＣｌを含まないＰＡ溶出液
クローン２で行った実験でも同様の結果が得られたため、クローン１で得られた結果の
みを示している。ＰＡ溶出液で４回繰り返し低ｐＨ実験を行ったが、結果は全て同様であ
り、それら全てについて比較可能であった。様々な時間点の様々なｐＨでのＨＰＬＣ－Ｓ
Ｅによる単量体の割合を図１に示す。グラフに示されるように、ｐＨ３．６での最も酸性
の高い条件では、単量体の割合が大幅に減少し、それは６０分間のインキュベーション後
に９５％から８０％に低下する。ｐＨ３．７での処理は、ＢＥＡＴ（登録商標）２の安定
性にも悪影響を及ぼした。ｐＨ３．８及びｐＨ３．９のより低い酸性条件のみが抗体に悪
影響を及ぼさなかった。図２は、単量体、凝集物及び「ショルダー」種の分解中に他の種
が増加することを示している。単量体のメインピークの前にショルダー種が現れていた。
重要な量（１３％）の「ショルダー」種を含むＨＰＬＣ－ＳＥによるプロファイルの例を
図３に示す。中和をｐＨ６．０又はｐＨ５．５まで行った、２つの異なる低ｐＨ処理ラン
のＣＧＥ（非還元）結果を表８に示す。

ＣＧＥデータは、フラグメント及び他の種の割合が全ての条件で類似していたことから
、インキュベーションのｐＨ及び時間がＢＥＡＴ（登録商標）２の量に影響しないことを
示している。ｐＨ５．５での中和は、ＢＥＡＴ（登録商標）２が１％劣っていたことから
、ｐＨ６．０での中和と比ベて良好であった。図４及び図５に示すように、ＨＰＬＣ－Ｈ
ＩＣによる分解が観察され、メインピークの割合は、凝集物種の増加に伴い、時間と共に
より酸性のｐＨで減少した。これらの結果は、ＢＥＡＴ（登録商標）２がｐＨ３．９の条
件でのみ安定であることを示しているにもかかわらず、ＢＥＡＴ（登録商標）１での以前
の実験は、このｐＨは有効なウイルス不活化作用を持つには十分に酸性ではないことを示
した。

ＮａＣｌを含むＰＡ溶出液
塩を使用してタンパク質の安定性を高め、低ｐＨで処理する前に様々な濃度のＮａＣｌ
で１つの実験を行って、低ｐＨ処理のもとでＢＥＡＴ（登録商標）２の安定性が改善され
たかどうかを確認した。０．１５Ｍ～１ＭのＮａＣｌの様々な濃度をｐＨ３．７で９０分
間酸性化する前に試験し、ＨＰＬＣ－ＳＥ及びＣＧＥ非還元をそれぞれ図６及び図７に示
す。結果は、ＮａＣｌによりスパイクされた場合でも、ＢＥＡＴ（登録商標）２は低ｐＨ
で安定でないことを示している。収載されていないＨＰＬＣ－ＨＩＣにより、分解が観察
され、メインピークが全ての塩条件で９０分間のインキュベーション後に８２％から６０
％に減少した。図７では、ＣＧＥによる変動は観察されなかった。

これらの実験の結果は、低ｐＨ処理はＢＥＡＴ（登録商標）２抗体精製プロセスに適し
たウイルス不活化工程ではないことを示している。

ｃ．代替のウイルス不活化処理に供した場合のＢＥＡＴ（登録商標）２の安定性の試験
低ｐＨ処理がＢＥＡＴ（登録商標）２の安定性を損なうことを考慮して、ウイルス不活
化の他の方法を試験し、抗体の安定性に対するそれらの影響を調査した。試験した処理は
、ＰＡ溶出液の殺菌処理、ＰＡ溶出液のカプリル酸（ＣＡ）処理、ＰＡ溶出液のアルギニ
ン処理、ＰＡ溶出液の溶媒及び洗浄剤（Ｓ／Ｄ）処理、清澄化した採取物のＳ／Ｄ処理、
並びにＰＡ溶出液の高ｐＨ処理を含む。

材料、方法及び機器
以下のＢＥＡＴ（登録商標）２の安定性に使用される材料、方法及び機器は、「ｂ．低
ｐＨに供したＢＥＡＴ（登録商標）２の安定性の研究」に記載されるものと同じである。
さらに、殺菌に加熱ブロックを使用した。

結果及び結論
ＰＡ溶出液の殺菌処理
ウイルス不活化の商業プロセスで一般的に使用される殺菌を、低ｐＨ処理の代替として
試験した。クローン１及びクローン２のＰＡ溶出液を使用して、ＢＥＡＴ（登録商標）２
抗体の安定性に対する殺菌の効果を試験した。ＰＡ溶出液を、２５０ｍＭヒスチジンｐＨ
１２．０を使用してｐＨ６．０に中和した。水浴を使用する３０分間及び６０分間の室温
（ＲＴ）及び６０℃でのインキュベーションを含む、様々なインキュベーション条件を試
験した。実験後、生成物をＨＰＬＣ－ＳＥ、ＨＰＬＣ－ＨＩＣ及びＣＧＥ（非還元）で分
析した。

沈殿が全ての条件で観察された。表９に処理後の結果の概要を示す。

ＨＰＬＣ－ＳＥ及びＨＰＬＣ－ＨＩＣの結果は、ＢＥＡＴ（登録商標）２が高温で安定
でないことを示しており、３０分後でも両方の分析でメインピークの割合が大幅に減少し
ている（ＨＰＬＣ－ＳＥでは９４．６％から４３．４％、ＨＩＣ－ＨＰＬＣでは８８．０
から１３．３）。

これらの結果に基づき、殺菌を更なる調査及び開発のために選択しなかった。

ＰＡ溶出液のカプリル酸処理
カプリル酸は、ウイルスタンパク質を沈殿させるためのウイルス不活性化に使用可能な
沈殿剤である。クローン１由来のＰＡ溶出液を使用して、ＢＥＡＴ（登録商標）２抗体の
安定性に対するカプリル酸の効果を試験した。幾つかの濃度のカプリル酸を使用して、最
終量を０．２％、０．５％、０．７％及び１％に到達させた。溶出後（ｐＨ４．３付近）
又はｐＨ５．５で中和（２５０ｍＭヒスチジンｐＨ１２．０バッファーを使用する）した
ＰＡ溶出液を出発物質として使用した。適用したインキュベーション時間は３０分、６０
分及び９０分であった。反応を停止するために、珪藻土（ＤＥ）を２ｍＬのＰＡ溶出液生
成物に対してＤＥ０．５ｇの比率で使用した。０．２μｍのｓｔｅｒｉｆｌｉｐフィルタ
ーを、ＤＥにより生成物を精製するために使用した。処理後に、生成物をＨＰＬＣ－ＳＥ
、ＨＰＬＣ－ＨＩＣ及びＣＧＥ（非還元）で分析した。表１０にカプリル酸処理の試験条
件の概要を示す。

ｐＨ５．５での結果は、０．２％超のカプリル酸で沈殿が観察されたため、示していな
い。ｐＨ４．３の結果を図８、図９及び表１１に報告する。ＨＰＬＣ－ＳＥの結果は、ｔ
＝０分～ｔ＝３０分、ｔ＝６０分、及びｔ＝９０分を比較すると経時的な分解を示し、単
量体の減少（約６％）及び凝集物の増加を伴う。

大幅な分解はＣＧＥ及びＨＰＬＣ－ＨＩＣで認めらなかった。ＳＥ－ＨＰＬＣの結果に
よると、ＢＥＡＴ（登録商標）２は低い酸カプリル濃度（０．２％）でも３０分後に安定
でない。それにもかかわらず、カプリル酸の毒性及び試薬を除去するためのＤＥ濾過の必
要性を考慮して、この代替案を捨て、ウイルス不活化代替法として選択しなかった。

ＰＡ溶出液のアルギニン処理
アルギニンの使用は、エンベロープモデルウイルスを有効に不活性化することが知られ
ている。この研究では、クローン１由来のＰＡ溶出液を出発物質として使用した。ＰＡ溶
出液のｐＨを、ｐＨ４．０、ｐＨ４．７５、ｐＨ４．７９及びｐＨ５．５に調整した。０
．３８Ｍ、０．４Ｍ及び０．８Ｍのアルギニンの最終濃度を目標にするため、様々な量の
アルギニン（３０ｍＭ酢酸塩中）を添加した。実験を様々なインキュベーション時間：イ
ンキュベーション時間なし、６０分間又は１２０分間で行った（表１２を参照されたい）
。反応を停止するために、ＰＤ１０をＰＢＳバッファーでのバッファー交換に使用した。

表１３にこの実験の結果を示す。

ｐＨ４．０のＰＡ溶出液はアルギニンとインキュベートされた場合、不安定であること
が観察され、実際に、ＨＰＬＣ－ＳＥによる１３％の単量体損失が０．４Ｍアルギニン（
９２．７％～７９．３％）を使用するわずか６０分間のインキュベーション後に、そして
８％の単量体損失が０．８Ｍアルギニン（９０．９％～８２．５％％）と１２０分間イン
キュベートされた後にあった。ｐＨ４．７５以上の条件では、分解はｐＨ５．５で０．８
Ｍアルギニンを最大１２０分使用しても観察されなかった。４．７５以上のｐＨを使用す
るアルギニン処理は、低ｐＨ処理の代替法の可能性があると考えられた。

ＰＡ溶出液の溶媒洗浄剤処理
溶媒及び洗浄剤は、エンベロープウイルスのエンベロープの脂質を溶解する能力がある
ため、ウイルスの不活性化に使用可能である。

クローン１由来のＰＡ溶出液を出発物質として使用した。最初に（研究１）、ＴｎＢＰ
処理を様々な濃度：０．１％、０．３％、０．５％及び１％で試験した。次に（研究２）
、ＴｎＢＰとＴｗｅｅｎ ８０及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００及びＴｗｅｅｎ ２０のよ
うな他の洗浄剤との組み合わせによる処理を試験した（生成物とのインキュベーションの
１５分前にＳ／Ｄミックスを調製し、攪拌した）。ＰＤ１０を使用するバッファー交換は
、Ｓ／Ｄを除去するのに効率的ではなく、ＰＢＳを使用する４ｇ／Ｌから０．３ｇ／Ｌへ
の１回の希釈を使用して、反応を停止しようとした。表１４に、ＰＡ溶出液に対してＳ／
Ｄを使用して試験した１４の異なる条件の概要を報告する。

研究の第１の部分（研究１）の結果を表１５に報告する。この実験では、各時間点で、
ＰＤ－１０バッファー交換を１回行った。

これらの結果は、１２０分間のインキュベーションの間、沈殿が観察され分析結果が得
られなかった１％ＴｎＢＰを除く、全てのＴｎＢＰ条件でＢＥＡＴ（登録商標）２が安定
であることを示している。分解はＨＰＬＣ－ＳＥによるｔ０以降、０．３％ＴｎＢＰ＋１
％Ｔｗｅｅｎ ８０の条件で認められたが、ＣＧＥ及びＨＰＬＣ－ＨＩＣでは確認されな
かった。ＨＰＬＣ－ＳＥ生データの分析後に、凝集物の割合は、処理後のサンプルにＴｗ
ｅｅｎ ８０が残っているため増加し、Ｔｗｅｅｎ８０は方法に干渉し、実際に、Ｔｗｅ
ｅｎ ８０の保持時間は凝集物の保持時間に非常に近い。したがって、０．３％ＴｎＢＰ
＋１％Ｔｗｅｅｎ ８０の条件でサンプルの分解は観察されなかった。この第１の実験は
、ＰＤ－１０バッファー交換で反応が停止せず、ＨＰＬＣ－ＳＥ分析中にサンプルにＴｗ
ｅｅｎ ８０がまだ存在していたため、最適ではなかった。次に、他の２つの洗浄剤、Ｔ
ｗｅｅｎ ２０及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を試験し、各時間点で各サンプルにＰＢＳ
バッファーを使用する０．３ｇ／Ｌへの希釈を行って反応を停止した（研究２）。表１６
にＨＰＬＣ－ＳＥ及びＨＰＬＣ－ＨＩＣの分析を示す。

表１６は、０．３％ＴｎＢＰをＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００と組み合わせて処理したサン
プルでは、分解が高濃度（１％）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で見られ、ＨＰＬＣ－ＳＥ
によりおよそ１５％の凝集物及び８％のフラグメントが見られたことを示す。Ｔｗｅｅｎ
８０及びＴｗｅｅｎ ２０と組み合わせた０．３％ＴｎＢＰで処理したサンプルでは、
０．２％Ｔｗｅｅｎ ８０の条件を除いて、分解の兆候は希釈したＰＡ溶出液と比較して
ＨＰＬＣ－ＳＥ及びＨＰＬＣ－ＨＩＣで認められなかった。違いは、全てのサンプル条件
でｔ＝０分とｔ＝９０分との間で観察されなかった。

全体として、これらの結果は、ＢＥＡＴ（登録商標）２が１２０分までのほとんどのＳ
／Ｄ処理条件で安定であることを示し、したがって、Ｓ／Ｄ処理はＢＥＡＴ（登録商標）
２含有溶液のウイルス不活化の重要な選択肢である。

清澄化した採取物のＳ／Ｄ処理（ＰＡロード）
ＰＡ溶出液のＳ／Ｄ処理に関する研究から得られた結果に基づいて、溶媒及び洗浄剤の
より良好な除去を確保しそれにより安全性を高めるために、清澄化した採取物に対するＳ
／Ｄ処理を試験することにした。

最初の２つの精製工程は、ＰＡクロマトグラフィーに続くウイルス不活化ではなく、Ｐ
Ａクロマトグラフィー及びウイルス不活化であった。

この工程では、ＴｎＢＰをＴｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ８０及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ
－１００と組み合わせて使用して、様々な条件を試験した。溶媒と洗浄剤の混合物をＰＡ
ロードに加え、およそ２０分間インキュベートし、Ｋａｎｅｋａ ＫａｎＣａｐＡ樹脂カ
ラムにロードした。全ての結果を表１８に報告する。

同様のパフォーマンスが全てのＳ／Ｄ条件で得られ、ＰＡ溶出液処理（ラン２、ラン３
及びラン４）の結果は、収率及び全ての分析データでラン１（Ｓ／Ｄインキュベーション
なし）に匹敵するが、それらはわずかに高いＣＶ溶出（３．５～およそ５）及びより低い
濃度値（７．０ｇ／Ｌ～およそ５ｇ／Ｌ）を有した。Ｔｗｅｅｎ ８０の除去は効率的で
あり、ＰＡ精製後にごくわずかなＴｗｅｅｎ ８０のみが存在した。

ＰＡ工程の前に実施したＳ／Ｄ処理は、ＰＡの精製によって反応が停止し純度に影響が
なかったため、ウイルスの不活性化に使用できる可能性があることが実証された。さらに
、後続のＣＥＸクロマトグラフィーは、ＰＡクロマトグラフィー後に存在する残留するわ
ずかなＳ／Ｄを更に除去する。

様々な洗浄剤で得られた結果は類似していたため、他のプロセス工程で既に使用されて
いるＴｗｅｅｎ ８０を後続の分析に選択した。したがって、０．３％ＴｎＢＰ＋１％Ｔ
ｗｅｅｎ ８０を組み合わせた条件を、清澄化した採取物のＳ／Ｄ処理、及びＢＥＡＴ（
登録商標）２含有溶液のウイルス不活性化を考慮した処理のために選択した。

ＰＡ溶出液の高ｐＨ処理
クローン１からの少量（２０ｍＬ）のＰＡ溶出液を使用して、高ｐＨインキュベーショ
ン下でのＢＥＡＴ（登録商標）２の安定性を試験した。まず、表１９に示されるように、
幾つかのバッファーを、目標とするｐＨ１１．０に達するように、０．５Ｍ酢酸塩ｐＨ１
２．０、０．５Ｍクエン酸塩ｐＨ１２．０、１ＭトリスｐＨ１２．０、０．２５Ｍヒスチ
ジンｐＨ１２．０、０．５Ｍ Ｌ－アルギニンｐＨ１２．０、０．２５Ｍリン酸塩ｐＨ１
２、０．１Ｍ ＮａＯＨ、そして最後に０．５Ｍ ＮａＯＨで試験した。

全てのバッファーで目標とするｐＨ１１．０に到達したわけではなく、例えば酢酸塩及
びクエン酸塩０．５Ｍ ｐＨ１２．０のトリス１Ｍ ｐＨ１２．０では到達しなかった。
ｐＨ調整用の比体積は、バッファー選択の１つの基準であり、その目的は、次の工程のた
めに大容量を避けて最小比率にすることであった。

この最初のスクリーニングの後、０．２５Ｍリン酸塩ｐＨ１２．０、０．１Ｍ ＮａＯ
Ｈ及び０．５Ｍ ＮａＯＨを選択して、更なる研究を行った。

選択したバッファーを用いて３０分間、４５分間及び６０分間、ｐＨ１１．２でのイン
キュベーション行った、表２０を参照されたい。全ての実験で、処理後、生成物をＨＰＬ
Ｃ－ＳＥ、ＨＰＬＣ－ＨＩＣ、ＣＧＥ（非還元）及びｉＣＥ３で分析した。結果を表２１
に示す。

全ての実験の間、沈殿がｐＨ６．０付近で観察され、ｐＨ１１．０で消失した。収率は
およそ９５％であったが、それは、不純物の分析を行わなくても不純物の沈殿であると想
定され、他のプロジェクトでも同じ現象が見られ、生成物を失うことなく低ｐＨインキュ
ベーション後に中和された。ＢＥＡＴ（登録商標）２は最大６０分間のインキュベーショ
ンにおいてｐＨ１１．２で安定であった。実際、ＮａＯＨ ０．５Ｍバッファーでは、Ｈ
ＰＬＣ－ＳＥによる単量体の割合はｐＨ１１．２で６０分後に安定であり、ＣＧＥ（最終
時間点のみを試験）、ｉＣＥ３及びＨＰＬＣ－ＨＩＣで同等の結果が得られ、分解は出発
物質と比較して観察されなかった。この実験を繰り返し、結果を確認した。これらの結果
に基づいて、０．５Ｍ ＮａＯＨバッファーを使用するｐＨ処理は、低ｐＨウイルス不活
化の代替手段の可能性があると見なされた。

ｄ．ＢＥＡＴ（登録商標）２の活性の試験
材料、方法及び機器
溶媒／洗浄剤、アルギニン及び高ｐＨの処理の影響を調査するため、結合親和性アッセ
イを、０．８ ＭアルギニンとのｐＨ４．０及びｐＨ５．５でのインキュベーション後に
、及び高ｐＨ処理（ＮａＯＨ ０．５Ｍ、ｐＨ１１．２）後に、溶媒洗浄剤（０．３％Ｔ
ｎＢＰ＋１％Ｔｗｅｅｎ ８０）で処理した様々なサンプルに対して実施した。２つの抗
原標的、ＣＤ３８及びＣＤ３を試験した。

結果及び結論
全てのサンプルで有意な差は観察されず、実際、Ｋｄ値は同等である。したがって、抗
体活性に対するこれら全ての処理の影響はなかった。この分析の結果を表２２に報告する
。

実施例２：低ｐＨ不安定抗体を含むＰＡ溶出液のアルギニン処理は、抗体の安定性を損な
うｐＨレベルでのみ有効なウイルス不活性化をもたらす
実施例１で報告された安定性及び活性の研究に基づいて、最も有望なウイルス不活化方
法を、ウイルスを不活化するそれらの能力について更に試験した。ウイルス不活化の有効
性を、Ｂｉｏｒｅｌｉａｎｃｅでスパイク研究を行うことにより評価した。試験サンプル
を各処理の前後に採取し、ウイルス力価について分析した。まず、アルギニン処理に関す
るＶＲＶ研究を実施した。

材料、方法及び機器
この研究では、１種類のウイルスのみ、すなわちモノクローナル抗体等のＣＨＯ細胞株
に由来する生物学的製剤に使用される典型的なモデルウイルスであるＭＬＶを使用した。
合計７回のランを行った。開発ランからのＰＡ溶出液を出発物質として使用した。異なる
ｐＨ（ｐＨ４．０、ｐＨ４．７５、ｐＨ４．７９及びｐＨ５．５）のアルギニンの様々な
ストックバッファーを使用して、目標のｐＨ及び濃度に到達させた。サンプルを、反応を
停止するために２５０ｍＭヒスチジンｐＨ１２．０バッファーを使用してｐＨ６．０付近
に中和した。表２３は、ＶＲＶ研究の間に試験した条件を要約する。

Ｌｏｇ減少値を中和したロードサンプルに関し計算し、５プレートの大容量プレーティ
ングおよび標準的な滴定をｔ＝６０分のサンプルに対して行った。中和したロードホール
ドサンプルを、１６．０℃～２０．０℃で６０分間（ラン２、ラン４及びラン６）又は１
２０分間（ラン１、ラン３、ラン５及びラン７）保持した。

結果及び結論
アルギニン処理に関するＶＲＶ研究の結果を表２４に示す。

ｐＨ４．０での処理のみが有効なウイルスクリアランスをもたらし、かつこのｐＨ条件
でＢＥＡＴ（登録商標）２が分解されることが示されたため（実施例１）、アルギニン処
理をＢＥＡＴ（登録商標）２含有溶液のウイルス不活化処理の可能性のある選択肢から除
外した。

実施例３：低ｐＨ不安定抗体を含むＰＡ溶出液のＳ／Ｄ処理は、有効なウイルス不活化を
もたらす
次に、ＢＥＡＴ（登録商標）２含有ＰＡ溶出液の溶媒洗浄剤処理の、ウイルスを不活性
化する能力を試験した。

材料、方法及び機器
ＰＡ溶出液のＳ／Ｄ処理を使用するウイルス不活化の有効性を、Ｂｉｏｒｅｌｉａｎｃ
ｅでスパイク研究を行うことにより評価した。この研究では、１種類のウイルス、すなわ
ちモノクローナル抗体等のＣＨＯ細胞株に由来する生物学的製剤に使用される典型的なモ
デルウイルスであるＭＬＶのみを使用した。目標濃度は、ＴｎＢＰ ０．３％及びＴｗｅ
ｅｎ ８０ １％であった。この研究を、ＰＡ溶出液（ｐＨ４．２付近）及び中和ＰＡ溶
出液（ｐＨ６．０）に対して行った。温度の操作条件は１５℃＋／－２℃であり、これは
化学的不活性化の最悪のシナリオである（温度が低いと不活性化が遅くなる）。プロセス
の操作条件は、製造施設により通常１８℃～２５℃である。速度論を０分、１０分、３０
分及び６０分の時間点で行った。ＢＥＡＴ（登録商標）２について試験した条件の概要を
表２５に示す。

表２６のＶＲＶ研究の結果は、ＰＡ溶出液のＳ／Ｄ処理が、ＰＡ溶出液が中和されない
場合は効率的なウイルス不活性化をもたらし、６０分間のインキュベーション後にＰＡ溶
出液が中和されると中程度の不活性化をもたらすことを示し、ＰＡ溶出液のＳ／Ｄ処理は
ＢＥＡＴ（登録商標）２精製プロセスに有効なＶＩ方法であることを確認する。

実施例４：低ｐＨ不安定抗体を含む清澄化した採取物のＳ／Ｄ処理は、有効なウイルス不
活性化をもたらす
さらに、溶媒及び洗浄剤によるＢＥＡＴ（登録商標）２含有清澄化採取物の処理につい
てＶＲＶ研究を行った。

ＶＲＶ研究１
材料、方法及び機器
この研究では、１種類のウイルス、すなわちモノクローナル抗体等のＣＨＯ細胞株に由
来する生物学的製剤に使用される典型的なモデルウイルスであるＭＬＶのみを使用した。
合計３回のランを、ＴｎＢＰとＴｗｅｅｎ ８０のミックスを使用して実施した。同じ割
合のＴｎＢＰ（０．３％）と異なる割合のＴｗｅｅｎ ８０を試験した（０．２５％、０
．５％及び１．０％）。Ｓ／Ｄでスパイクした後、生成物をインキュベーション終了まで
攪拌した。各時間点を収集して、１／２５に希釈しｐＨ６．００～ｐＨ８．００に中和す
ることにより直ちにクエンチした。表２７は、Ｓ／Ｄ処理に関するＶＲＶ研究の間、Ｂｉ
ｏＲｅｌｉａｎｃｅで試験した条件を報告する。

Ｌｏｇ減少値をクエンチしたロードサンプルに関して計算し、５プレートの大量プレー
ティングおよび標準的な滴定をｔ＝６０分のサンプルに対して行った。クエンチしたロー
ドホールドサンプルを１６．０℃～２０．０℃で６０分間保持した。

結果及び結論
表２８に、ＶＲＶの研究結果の概要を示す。

清澄化採取物のＳ／Ｄ処理は、より低い濃度のＴｗｅｅｎ ８０（０．２５％）を使用
した場合でも、全ての試験条件でＭＬＶウイルスの不活性化において結果的に有効であっ
た。

ＶＲＶ研究２
さらに、清澄化した採取物の溶媒洗浄剤処理の、ＭＬＶ及びＰＲＶウイルスを不活性化
する能力を、より悪い場合の条件下で評価した。

材料、方法及び機器
プロセスロードサンプルをウイルスストックでスパイクし、Ｂｉｏｒｅｌｉａｎｃｅで
分析した。

これは、表２９に示される「最悪の場合」の条件下で行われた。各重複について最低ク
リアランス係数を報告した。

結果及び結論
ＢＥＡＴ（登録商標）２用に開発された化学的ウイルス不活化工程を、採取ロット１及
びロット２を使用して、０．２％ＴｎＢＰ＋０．７５％Ｔｗｅｅｎ ８０及び０．４％Ｔ
ｎＢＰ＋１．２５％Ｔｗｅｅｎ ８０のＳ／ＤミックスによるＭＬＶ及びＰＲＶの不活化
に対するそれらの効率について評価した。

両方のウイルス実験について、同じプロトコルを適用し、スケールダウンされたプロセ
スから臨床スケールのプロセスへの比較を表３０に示す。

表３１は、ＭＬＶについて、実験ごとに計算したＬｏｇ減少係数を示す。

これらの結果は、Ｓ／Ｄ処理中のウイルスの不活性化が有効であることを示し、ｌｏｇ
_１０全ウイルスは経時的に減少し、５分、１０分、３０分及び６０分のインキュベーショ
ン後にそれぞれ１．３１ ｌｏｇ_１０、２．４４ ｌｏｇ_１０、２．８８ ｌｏｇ_１０及
び４．０３ ｌｏｇ_１０未満である。

さらに、アリコートをＳ／Ｄラン中に収集し、凍結し、Ｔｗｅｅｎ ８０及びＴｎＢＰ
のパーセント含有量について分析し、結果を以下に示す。

これらの結果は次のことを示している：
低濃度（０．７５％Ｔｗｅｅｎ ８０／０．２％ＴｎＢＰ）での化学的不活性化は、ラ
ン１及びラン２でそれぞれ４．０３ ｌｏｇ_１０及び３．７９ ｌｏｇ_１０の減少係数を
示し、これは低Ｓ／Ｄ濃度がＭＬＶの不活性化に適度に有効であったことを意味する。し
かしながら、表３１に示される結果は、ラン１とラン２（０．７１％と０．５２％）の間
の変動がＴｗｅｅｎ ８０の割合に関して顕著であることを実証する。ラン２では０．５
２％のＴｗｅｅｎ ８０及び０．１５％のＴｎＢＰのみを測定したが、これは、それらが
低濃度であるため最悪の場合である。０．７５％のＴｗｅｅｎ ８０及び０．２％のＴｎ
ＢＰの目標に到達していないと結論付けることができる。減少は、より低濃度のＴｗｅｅ
ｎ ８０及びＴｎＢＰ、０．５２％Ｔｗｅｅｎ ８０及び０．１５％ＴｎＢＰで行ったラ
ン（ラン２）でより少なく、これは最悪の場合と見なされる。

高濃度（１．２５％Ｔｗｅｅｎ ８０／０．４％ＴｎＢＰ）での化学的不活性化は、ラ
ン３とラン４でそれぞれ５．３７ ｌｏｇ_１０以上及び５．０２ ｌｏｇ_１０以上の減少
係数を示し、これは、予想通り、より高いＳ／Ｄ濃度がＭＬＶ不活性化により有効である
ことを意味する。表３１に示す結果は、ラン３とラン４（０．９１と０．８９）の間の変
動が、Ｔｗｅｅｎ ８０の割合に関して顕著でなかったことを実証する。しかしこの場合
も目標とする１．２５％Ｔｗｅｅｎ ８０は両方のランで達成されず、実際に、ラン３及
びラン４で測定されたのはそれぞれ０．９１％及び０．８９％に過ぎなかった。ＴｎＢＰ
データに関しては、ランを０．４０％ではなく０．４８％で行った（ラン３ ｔ６０分）
。この場合も、ウイルスの不活性化の結果は非常に論理的であり、より高いＴｗｅｅｎ
８０及びＴｎＢＰ％でのラン３は、最良のウイルス不活性化を得ることを可能にする。結
論として、ＭＬＶウイルス不活性化の最悪の場合のシナリオ（ラン２、０．５２％Ｔｗｅ
ｅｎ ８０及び０．１５％ＴｎＢＰ）でさえ、３．７９ ｌｏｇ_１０の中程度の効果的な
減少が得られた。

表３３は、ＰＲＶについて、測定されたＴｗｅｅｎ ８０及びＴｎＢＰの％、並びに様
々な化学的ウイルス不活化サンプルについて得られたｌｏｇ_１０値、及び各ランで計算さ
れたＬｏｇ減少係数を示す。

ウイルス不活化はインキュベーション中に有効であり、合計ｌｏｇ_１０ウイルスは時間
の経過と共に減少し、５回の処理直後で３．６８ ｌｏｇ_１０未満、及び６０分のインキ
ュベーション後で５．４９ ｌｏｇ_１０である。アリコートを、Ｓ／Ｄラン中に収集し、
凍結し、Ｔｗｅｅｎ ８０及びＴｎＢＰのパーセント含有量について分析し、結果を以下
に示す。

ＰＲＶの結果は次のことを示している：
低濃度（０．７５％Ｔｗｅｅｎ ８０／０．２％ＴｎＢＰ）での化学的不活性化は、ラ
ン１及びラン２でそれぞれ５．４６ ｌｏｇ_１０以上及び５．１９ ｌｏｇ_１０以上の減
少係数を示し、これは低Ｓ／Ｄ濃度がＰＲＶの不活性化に有効であったことを意味する。
しかしながら、表３３に示す結果は、ラン１とラン２の間の変動がＴｗｅｅｎ ８０の割
合の結果（０．７４％及び０．５７％）に関して顕著であることを実証する。ラン２では
目標とする０．７５％Ｔｗｅｅｎ ８０に到達せず、実際には０．５７％が測定されたに
過ぎず、これは、洗浄剤の濃度が低いので、最悪のシナリオである。ＴｎＢＰの場合、両
方のランは目標よりも低い比較可能な値、０．２０％ではなく０．１５％、を示す。予想
通り、より低いＴｗｅｅｎ ８０の割合では、ラン２は５．１９ ｌｏｇ_１０以上であっ
たラン１と比較して低いウイルス減少を示した。

高濃度（１．２５％Ｔｗｅｅｎ ８０／０．４％ＴｎＢＰ）での化学的不活性化は、ラ
ン３及びラン４でそれぞれ５．１９ ｌｏｇ_１０以上及び５．４６ ｌｏｇ_１０以上の減
少係数を示し、これは、予想どおり、より高いＳ／Ｄ濃度がＰＲＶの不活性化により有効
であること意味する。表３３に示す結果は、両方のランの時間点ｔ０と時間点ｔ６０との
間でＴｗｅｅｎ ８０及びＴｎＢＰの値に変動があったことを示し、実質的にラン３では
、Ｔｗｅｅｎ ８０含有量はｔ０で０．８０％、ｔ６０で１．０１％であり、同じくＴｎ
ＢＰについてｔ０で０．２７％及びｔ６０分で０．３３％である。この場合も、両方のラ
ンで目標とする１．２５％Ｔｗｅｅｎ ８０に達したが、それでも低濃度のＳ／Ｄがウイ
ルス不活化の最悪の場合である。ＴｎＢＰデータに関しては、ランを０．４０％ではなく
０．４８％で実施した（ラン３ ｔ６０分）。繰り返すが、ウイルス減少の結果は非常に
論理的であり、Ｔｗｅｅｎ ８０及びＴｎＢＰ％がより高い実施例３は、より優れたウイ
ルスクリアランスを示した。

同一の化学的不活性化を使用してＭＬＶと比較してＰＲＶウイルスで得られたより高い
ウイルス不活性化は、実際にＰＲＶの物理化学的耐性が低いことを予想させる。

全てのデータを結論付けると、最悪のシナリオ（ラン２）では、５．１９ ｌｏｇ_１０
の有効なＰＲＶウイルスの不活性化がある。

総合すると、研究１及び研究２の結果は、ＰＡロードのＳ／Ｄ処理を使用してＶＩが達
成されることを実証する。

実施例５：低ｐＨ不安定抗体を含むＰＡ溶出液の高ｐＨ処理は、抗体の安定性を保持する
ｐＨでの適度に有効なウイルス不活性化をもたらす
材料、方法及び機器
ＢＥＡＴ（登録商標）２を含むＰＡ溶出液の高ｐＨ処理に関するＶＲＶ研究を行った。
この研究では、１つのウイルス、ＭＬＶのみを使用した。実験をｐＨ１０．８での１回の
ランで行った（ｐＨ１１．０のプロセス目標、より低いｐＨの最悪の場合の条件に基づく
）。この研究には開発ランに由来するＰＡ溶出液を使用し、ｐＨを、選択したバッファー
０．５Ｍ ＮａＯＨを使用して上げた。収集時に、全てのサンプルを３．７％ＨＣｌでｐ
Ｈ６～ｐＨ８に中和した。

Ｌｏｇ減少値を中和したロードサンプルに関し計算し、５プレートの大容量プレーティ
ングおよび標準的な滴定をｔ＝６０分のサンプルに対して行った。中和ロードホールドサ
ンプルを１６．０℃～２０．０℃で６０分間保持した。

結果及び結論
この研究中に得られたＶＲＶの結果を表３５に示す。

高ｐＨでのＢＥＡＴ（登録商標）２含有ＰＡ溶出液のインキュベーションは、減少係数
が３．１８ ｌｏｇ_１０の場合、１分間のインキュベーション後から６０分間のインキュ
ベーションまでのＭＬＶウイルスの不活化に適度に有効である。したがって、高ｐＨ処理
は、ＢＥＡＴ（登録商標）２の精製プロセスにおける低ｐＨ処理の有効な代替手段と見な
すことができる。

実施例６：ＰＡ溶出液の高ｐＨ処理は、低ｐＨ不安定抗体ＢＥＡＴ（登録商標）２の精製
プロセスにおける効率的な不活性化工程である
高ｐＨ処理をＢＥＡＴ（登録商標）２の製造プロセスでウイルス不活化工程として使用
する可能性を更に調査するため、追加の安定性及び活性の研究を行った。保持時間の影響
を、２４時間のインキュベーションで等の、より悪い場合のシナリオを含む様々な時間点
で評価した。

材料、方法及び機器
この研究で使用した出発物質は、代表的なＰＡ溶出液であった。

全ての化学物質は薬局方グレード（米国又は欧州）であった。インプロセスの０．２μ
ｍ濾過工程を通常、全てのバッファー及びプロセス中間体に対して行った。さらに、マグ
ネチックスターラー、ｐＨメーター及び導電率計を使用した。

試験した時間点は室温にて１時間、２時間及び４時間、並びにこの時間点を超え、生成
物を最大２４時間５±３℃に置いた。約１００ｍＬのＰＡ溶出液を、ＮａＯＨ ０．５Ｍ
を使用してＮａｌｇｅｎｅボトル中でｐＨ１１．２に、マグネチックスターラーを用いて
攪拌しながら塩基化した。このｐＨは、このプロセスの目標とするｐＨ１１．０を検証す
るために、生成物の品質について最悪の場合のシナリオとして選択された。以下に記載す
るように直ちに中和した時間点ｔ０を除いて、高ｐＨで生成物をインキュベートした。各
時間点で、約１０ｍＬの高ｐＨ生成物を５０ｍＬのＴＰＰチューブに移し、凍結する前に
、ＶＩ反応を停止するためにＨＣｌ ３．７％を使用してｐＨを最大ｐＨ６．０に下げる
ことにより中和した（中和工程）。

生成物の品質を、全ての時間点についてＨＰＬＣ－ＳＥ、ｉＣＥ及びＣＧＥによって分
析した。中和されておらず、どのＶＩ処理も行っていなＰＡ溶出液も分析し、基準として
使用した。

上記のサンプルの幾つかを、表面プラズモン共鳴によって試験するために選択した（表
３７）。目的は、高ｐＨ処理がＢＥＡＴ（登録商標）２分子の目標ＣＤ３ε１－２６－Ｆ
ｃ及びＣＤ３８への結合親和性に、したがって間接的にはその活性に影響を与えたかどう
かを検証することであった。さらに、ＢＥＡＴ（登録商標）２分子活性に対する高ｐＨの
影響を直接検証するため、細胞ベースの機能アッセイも行った。

結果及び結論
表３８及び図１０に示すように、ＢＥＡＴ（登録商標）２に対する高ｐＨでの保持時間
の影響をＳＥ－ＨＰＬＣにより分析して、様々な時間点でのインキュベーション後のサン
プルの純度を確立した。

表３８に示すように、単量体の割合は条件間で同等であり、２４時間までの高ｐＨ処理
では著しい凝集は見られず、実際に、観察された変動は方法のばらつきの範囲内である。

これらの結果は、ＢＥＡＴ（登録商標）２が、通常は６０分以上９０分以下であるプロ
セス時間を安全マージンを有して網羅する２４時間まで安定であることを示唆している。

さらに、表３９及び図１１に示すように、非還元ＣＧＥを行い、ＢＥＡＴ（登録商標）
２の安定性を更に確認した。

ＢＥＡＴ％は基準サンプル（ＰＡ溶出液）と同等であり、４時間まで大幅なフラグメン
ト化は示されない。ＢＥＡＴ（登録商標）２は、最大通常６０分以上９０分以下であるプ
ロセス時間を安全マージンを有して網羅する２時間まで安定である。

さらに、還元ＣＧＥは、ＢＥＡＴ（登録商標）２が、通常６０分以上９０分以下である
プロセス時間を安全マージンを有して網羅する２４時間まで安定であることを示す（表４
０及び図１２を参照されたい）。

電荷バリアントのバリエーションを評価するため、ｉＣＥを行った（図１３及び表４１
）。

酸性種の増加が時間の経過と共に観察される。それでも、方法のばらつきは１０％以下
であるため、２時間までに観測された差は方法のばらつきの範囲内であり、許容可能であ
り統計的に有意ではないと見なすことができた。観察される酸性％の増加は予想される傾
向であるが、２時間の安全マージンは、通常６０分以上９０分以下であるプロセス時間を
（及びそれを超えて）網羅する。

細胞ベースの機能アッセイの結果を図１４及び表４２に示す。５０％最大有効濃度（Ｅ
Ｃ５０）を用量反応曲線に基づいて決定した。得られたＥＣ５０値は、ゼロに等しい高ｐ
Ｈインキュベーション時間のサンプルを基準として、各サンプルの相対的効力を決定する
ことを可能にした。

相対的な効力の値に時間の経過に伴う傾向は見られない。ｔ１ｈ及びｔ２ｈでの高ｐＨ
処理は、基準として使用されたＰＡ溶出液と比較べて非常に類似した効力をもたらす。方
法のばらつきが２５％以下の場合、高ｐＨ処理は２時間のインキュベーション後でもＢＥ
ＡＴ（登録商標）２の機能を大幅に変えず、通常６０分以上９０分以下であるプロセス時
間を網羅する。

様々な時間点で評価された、標的ＣＤ３及びＣＤ３８に対するＢＥＡＴ（登録商標）２
抗体の結合親和性を表４３に収載する。

プロテインＡ溶出液と高ｐＨでインキュベートした全てのサンプルの間で、ヒトＣＤ３
８への結合活性に違いは見られない。また、プロテインＡ溶出液と高ｐＨでインキュベー
トした全てのサンプルの間で、ヒトＣＤ３εへの結合活性の機能的重要性に違いは見られ
ない。ヒトＣＤ３εへの親和性のわずかな違いがｔ０サンプルと他の全てのサンプルとの
間で観察されたものの、親和性はなお同じ範囲（低ナノモル、ＰＡ溶出液より３２％高い
）にあり、おそらく注入された濃度のわずかな違いによるものである。

結論として、高ｐＨインキュベーションはＢＥＡＴ（登録商標）２の安定性及び活性に
影響を与えず、ＢＥＡＴ（登録商標）２の製造プロセスで使用可能である。

実施例７：ＰＡ溶出液の高ｐＨ処理は低ｐＨ不安定抗体ＢＥＡＴ（登録商標）３の精製プ
ロセスにおける効率的な不活性化工程である
第３のＢＥＡＴ抗体であるＢＥＡＴ（登録商標）３に対する最適なウイルス不活化方法
を評価するため、安定性、活性及びＶＲＶの研究を行って、ＰＡ溶出液の低ｐＨ処理及び
高ｐＨ処理の効果および清澄化した採取物の溶媒／洗浄剤処理を調査した。

材料、方法及び機器
この研究で使用した出発物質は、清澄化採取物及びＫａｎｅｋａ製のＫａｎＣａｐＡ樹
脂を使用するアフィニティクロマトグラフィー後のＰＡ溶出液であった。

細胞培養を通常、生存率が８０％を下回ったときに終了し、細胞片をデッドエンド深層
濾過の後に続く０．２μｍフィルターでの濾過により除去した。細胞培養上清はＣＨＯ細
胞に由来した。初期開発試験を、最終的に選択されたクローンの親クローンからの代表的
ではない材料を使用して、行った。開発の後期アッセイを、最終的に選択されたクローン
に由来する、代表的な材料を使用して行った。

インプロセスの０．２μｍ濾過工程を通常、全てのバッファー及びプロセス中間体に対
して行った。ＶＩ研究では、マグネチックスターラー、ｐＨメーター及び導電率計のみを
使用した。

ＰＡ溶出液－低ｐＨウイルス不活化
ＰＡ溶出液約２５ｍＬを、３．７％ＨＣｌを使用して５０ｍＬ ＴＰＰチューブ中でｐ
Ｈ３．７に酸性化した。低ｐＨの生成物を、以下に記載されるように直ちに中和した時間
点ｔ０を除いて、マグネチックスターラーを使用して撹拌しながらインキュベートした。
試験した時間点は、室温で１時間、２時間、４時間及び６時間、並びにこの時間点を超え
、生成物を５±３℃で最大２４時間及び４８時間インキュベーションした。各時間点で、
約３ｍＬの低ｐＨ生成物を１５ｍＬ ＴＰＰチューブに移し、凍結前に、ＶＩ反応を停止
するために２５０ｍＭヒスチジンｐＨ１２．０を使用してｐＨ５．０までｐＨを上げるこ
とにより中和した（中和工程）。

ハイスループットＨＰＬＣ－ＳＥ分析を使用して、全ての時間点を特性評価した。Ｃａ
ｌｉｐｅｒ ＣＧＥ（非還元）及びｉＣＥ分析を、ｔ０及びＴ４８時間にのみ行った。結
果を、様々な時間点を時間点ｔ０（サンプルを低ｐＨでインキュベートし、直ちにｐＨ５
．０に中和した）と比較することにより分析した。中和されておらず、どのＶＩ処理も行
っていないＰＡ溶出液も分析し、ｔ０と比較するための基準として使用した。

清澄化した採取物－溶媒洗浄剤処理
混合物の均一性を確保するために、０．３％ＴｎＢＰ及び１％Ｔｗｅｅｎ ８０のミッ
クスを調製し、インキュベーションの１５分前に攪拌した。先のプロジェクトで観察され
たように、十分なウイルス不活性化を得るために、ミックスをＰＡローディング工程の前
に最低６０分の間、マグネチックスターラーを使用してインキュベートし清澄化した採取
物と混合した。ＶＩ反応を停止するために、処理した材料をＫａｎｅｋａ ＫａｎＣａｐ
Ａ 樹脂の直径１．１ｃｍのカラムを使用して直ちに精製した。５±３℃で保たれたＰ
Ａ溶出液を、その後ＨＰＬＣ－ＳＥ、ＣＧＥ（還元及び非還元）及びｉＣＥで分析した。

ＰＡ溶出液－高ｐＨウイルス不活化
試験した時間点は、室温で１時間、２時間、４時間及び６時間、並びにこの時間点を超
え、生成物を５±３℃で最大２４時間及び４８時間インキュベーションした。約２５ｍＬ
のＰＡ溶出液を、ＮａＯＨ ０．５Ｍを使用して５０ｍＬ ＴＰＰチューブ中でｐＨ１１
．２に塩基化した。このｐＨは、プロセスの目標ｐＨ１１．０を検証するために、生成物
の品質について最悪の場合のシナリオとして選択された。高ｐＨの生成物を、以下に記載
されるように直ちに中和された時間点ｔ０を除いて、マグネチックスターラーを使用して
撹拌しながらインキュベートした。各時間点で、約３ｍＬの高ｐＨ生成物を１５ｍＬ Ｔ
ＰＰチューブに移し、凍結する前に、ＶＩ反応を停止するために、ＨＣｌ ３．７％を使
用してｐＨ６．０までｐＨを下げることにより中和した（中和工程）。

生成物の品質を、全ての時間点についてＨＰＬＣ－ＳＥ、ｉＣＥ及びＣＧＥによって分
析した。分析結果を、様々な時間点を時間点ｔ０（サンプルを高ｐＨでインキュベートし
、直ちにｐＨ６．０で中和した）と比較することにより分析した。中和されておらず、ど
のＶＩ処理も行っていないＰＡ溶出液も分析し、ｔ０と比較するための基準として使用し
た。

結合親和性アッセイ
高ｐＨ処理開発ランからの幾つかのサンプル（表４６を参照されたい）を、表面プラズ
モン共鳴によって試験するため選択した。目的は、高ｐＨ処理がＢＥＡＴ（登録商標）３
分子の標的のＣＤ３ε１－２６－Ｆｃ及びＥＧＦＲへの結合親和性、したがって間接的に
はその活性に影響を与えるかどうかを検証することであった。

第１のアッセイは、ヒトＣＤ３ε１－２６－Ｆｃ抗原への結合親和性を決定することを
目的としている。それをＳｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５（ＧＥ Ｈ
ｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。ヒトＣＤ３ε１－２６－Ｆｃを、酢酸塩ｐＨ４．
５バッファー中の濃度２５ｎＭで調製した。ＢＥＡＴ（登録商標）３サンプルを、１００
０ｎＭ～１．３７ｎＭで、希釈当たり２００μｌの最終容量で調製した。ランを、Ｂｉａ
ｃｏｒｅ Ｔ２００プロセシングユニット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して行
った。

第２のアッセイは、ヒトＥＧＦＲ－ｈｉｓ抗原への結合親和性を決定することを目的と
している。それをＳｅｒｉｅ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ（ＧＥ
Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して行った。ＢＥＡＴ（登録商標）３サンプルを、ＨＢ
Ｓ－ＥＰ ＋（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）バッファーでそれぞれ２５ｎＭに希釈した
。ＥＧＦＲを１００ｎＭ～０．１３ｎＭで調製し、希釈当たり２５０μｌの最終容量を実
現した。

細胞ベースの機能アッセイ
細胞ベースの機能アッセイの目的は、高ｐＨ処理がＢＥＡＴ（登録商標）３分子の活性
に影響を及ぼすかどうかを検証することであった。高ｐＨ処理の開発から選択したサンプ
ルを、表４７に記載の通り試験した。

細胞ベースの効力アッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａで商業的に入手可能な相さされたＪｕｒ
ｋａｔ Ｔ細胞株を使用した。これらの細胞を、ルシフェラーゼｃＤＮＡ配列がＮＦＡＴ
応答要素（ＲＥ）の制御下にあるレポーター構築物で安定的にトランスフェクトした。ル
シフェラーゼの産生は、ＣＤ３ε（及びＴ細胞受容体複合体）に由来するシグナル等、Ｎ
ＦＡＴ転写因子を活性化するシグナルに直接依存した。アッセイを、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦ
ＡＴ細胞（レスポンダー細胞）（ＣＤ３ε＋、ＥＧＦＲ－）をＳＫ－ＢＲ－３目標細胞（
ＥＧＦＲ ＋ＣＤ３ε－）及びＢＥＡＴ（登録商標）３又は対照抗体と同時インキュベー
トすることにより設定した。レスポンダー細胞の活性化を、発光応答によって定量化した
。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞株は６週間の培養を有し（Ｐ６）、ＳＫ－ＢＲ－３細胞株
は３週間の培養を有した（Ｐ３）。

アッセイを９６ウェルＥＬＩＳＡプレートＵ字型底（ＴＰＰ）で行った。ＳＫ－ＢＲ－
３発現ＥＧＦＲ細胞株（ＡＴＣＣ）を３×１０^５細胞／ｍｌで再懸濁し、１００μｌを９
６ウェルプレートの各ウェルに分配した。アッセイプレートを３７℃、５％ＣＯ_２で一晩
インキュベートした。翌日、２５μＬのＳＫ－ＢＲ－３発現ＥＧＦＲ細胞株をアッセイプ
レート中に保持し、６μｇ／ｍＬ（最終２μｇ／ｍＬ）に希釈した２５μＬの異なるＢＥ
ＡＴ（登録商標）３サンプルを異なるウェルに移した。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ Ｃｅｌ
ｌｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を１．２×１０^６細胞／ｍｌで再懸濁し、２５μｌをアッセイプ
レートの各ウェルに分配した。プレートを覆い、３７℃、５％ＣＯ_２で５時間インキュベ
ートした。インキュベーションの終わりに、７５μＬのＢｉｏ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェ
ラーゼアッセイ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）をウェルに添加し、プレートをマイクロプレート
リーダーで取得した。発光を、次の設定：読み取りテープ－エンドポイント；積分時間－
１分；発光－ホール；光学位置－上部；ゲイン１３５；読み取り高さ－１．００ｍｍを使
用して測定した。データを次いで、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）ソフトウェアを使用
してプロット及び分析した。非線形回帰フィッティングをＸ＝Ｌｏｇ（Ｘ）変換後に適用
し、シグモイド用量反応フィッティングを全てのデータセットに適用してＥＣ５０値を決
定した。各サンプルについて相対的効力を、次の計算を使用して計算した。相対的効力％
＝ＥＣ５０基準／ＥＣ５０サンプル×１００。

残留ＤＮＡ及びＨＣＰアッセイ
ＶＩ工程の主な目的は、生成物の品質を確保しながらウイルスを効率的に不活化するこ
とである。それでも下流のプロセスでは、各工程が不純物レベルに影響を与える可能性が
ある。以下に説明するアッセイの目的は、ＣＨＯ細胞からの残留ＤＮＡ及びＨＣＰレベル
に対する高ｐＨ処理の影響を評価することであった。

ＨＣＰの定量には、２つの異なるアッセイ、ＣｙｇｎｕｓＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの
３Ｇ ＨＣＰ Ｅｌｉｓａキット及びＦｏｒｔｅＢｉｏ－Ｃｙｇｎｕｓ製のＡｎｔｉ－Ｃ
ＨＯ ＨＣＰ検出キットを使用し、データ処理にＰａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏのＯｃｔｅ
ｔ Ｒｅｄ ９６機器を使用した。最初に両方の手法を使用して高ｐＨ処理によるＨＣＰ
除去を評価し、また両方の手法、すなわち、より感度が高いことが知られているハイスル
ープットオクテット及びＥＬＩＳＡも比較した。

ＥＬＩＳＡのサンプル調製を、３Ｇ Ｅｌｉｓａ ＨＣＰキット（Ｃｙｇｎｕｓ ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ）により、１／１００希釈を使用して行った。サンプルを、抗ＣＨＯ
ＨＣＰ捕捉抗体で被覆したマイクロタイターウェル中で、アフィニティ精製した西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ標識抗体と反応させた。洗浄後、基質テトラメチルベンジジン（ＴＭ
Ｂ）を反応させた。加水分解された基質の量は、存在するＣＨＯタンパク質の濃度に正比
例した。定量を、サンプルのシグナルを同時にアッセイされたＨＣＰ標準と比較すること
により達成した。データを、ＰＲＩＳＭソフトウェアを使用して処理した。

Ｏｃｔｅｔに関しては、Ａｎｔｉ－ＣＨＯ ＨＣＰ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｆ
ｏｒｔｅＢｉｏ－Ｃｙｇｎｕｓ）を使用して、２つのサンプル希釈液（１／２００及び１
／４００）を試験した。測定は、Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のゴールド
スタンダード３Ｇ抗ＣＨＯ ＨＣＰ抗体でプレコートしたＡｎｔｉ－ＣＨＯ ＨＣＰ Ｂ
ｉｏｓｅｎｓｏｒでのサンドイッチ型アッセイを含んだ。調製した９６ウェルプレートを
、Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏのＯｃｔｅｔ Ｒｅｄ ９６機器で直接読み取った。デー
タを、Ｏｃｔｅｔシステムデータ取得ソフトウェアにより処理した。

残留ＤＮＡの定量に関しては、アッセイはタンパク質を除去するためのプロテイナーゼ
Ｋによるサンプルの処理を含んだ。次いで、ＤＮＡを、磁気ビーズを使用して抽出し、洗
浄し、最後に溶出した。その後、ＤＮＡを、Ｆａｓｔ ５０００ ＰＣＲ装置（Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を使用するリアルタイムＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）
により定量する。サンプルの調製は、ｒｅｓＤＮＡＳＥＱ（商標）定量的ＣＨＯ ＤＮＡ
キットＶ３．０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行った。

表４８に収載される、高ｐＨの開発に由来する幾つかのサンプルを、上に記載される残
留ＤＮＡ及びＨＣＰアッセイにより試験するために選択した。ＶＩ後の０．２μｍ濾過も
試験した。

いずれのＰＡ溶出液もＶＩ工程の前に０．２μｍで濾過した。

ＶＲＶ ＮＲＴ研究
ＶＩ実験によるデータを分析し、高ｐＨ処理を、得られた生成物の品質に関するＶＲＶ
ＮＲＴ研究のために選択した。ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅによって行ったこのウイルスク
リアランス研究の目的は、この処理がウイルスを効果的に不活性化する能力を評価するこ
とであった。この研究は、モノクローナル抗体等のＣＨＯ細胞株に由来する生物学的産物
に使用される典型的なモデルウイルスである異種指向性マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）
で行われた。ＭＬＶはまた、物理化学的処理に感受性であることが知られている（表４９
を参照されたい）。

１回のランをｐＨ１０．８＋／－０．０５で行い、これはｐＨ１１．０のプロセス設定
値の最悪の場合である（すなわち、下限のｐＨ範囲は不活性化するウイルスがより少ない
はずである）。高ｐＨ処理の温度仕様は２０℃以上２５℃以下であったが、仕様外（ＯＯ
Ｓ：Ｏｕｔ Ｏｆ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）の場合に最悪の場合のシナリオデータ
を得るため、ＭＬＶを１６℃±１℃でスパイクした。開発ランに由来するＰＡ溶出液を出
発物質として使用した。０．５Ｍ ＮａＯＨを使用してｐＨを上昇させ、ＶＩ速度論を追
跡するために、表５０に記載される様々な保持点の間、高ｐＨでサンプルをインキュベー
トした。反応を停止するために、サンプルを３．７％ＨＣｌでｐＨ６．０～ｐＨ８．０に
中和した。

ＢＥＡＴ（登録商標）３の精製プロセスの工程としての高ｐＨを試験するＶＲＶ研究
さらに、ＢＥＡＴ（登録商標）３精製プロセスの様々な工程がウイルスを不活性化又は
除去する能力を、独立した２回のランで調査した。これらの中で、ＰＡ溶出液に対する高
ｐＨ処理の能力を評価した。実験をＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅで行った。Ｌｏｇ減少係数を
中和ロードサンプルに関して計算し、サンプルを様々なインキュベーション時間（ｔ）点
、５分、１０分、３０分及び６０分に採取し、その後中和する。

結果及び結論
ａ．ＰＡ溶出液－低ｐＨウイルス不活化
試験した様々な時間点でのＨＰＬＣ－ＳＥの結果を表５１に示し、図１５及び図１６で
解説する。

ＨＰＬＣ－ＳＥの結果は、時間点ｔ０を含む低ｐＨで処理した全てのサンプルでの単量
体％の大幅な減少を示し、低ｐＨインキュベーション及び中和の直後に生成物の高い分解
を示した。この分解は、凝集物及び「ショルダー」種の増加に直接関連している。実際に
、低ｐＨ処理は即座に凝集物の割合に影響を与え、割合はＰＡ溶出液での２．４％から時
間点ｔ０での１３．１％に増加した。さらに、ｔ０での６．９％～Ｔ４８ｈでの１２．０
％の範囲で「ショルダー」種の増加が観察された。この「ショルダー」種は、単量体のメ
インピークの前に現れた。図１７において、重要な量（１２％）の「ショルダー」種を含
むＨＰＬＣ－ＳＥ分析プロファイルの一例。

さらに、様々なフラグメントの割合を特定及び評価することが可能な、Ｃａｌｉｐｅｒ
非還元の結果を表５２に収載する。ＨＰＬＣ－ＳＥの結果で観察された重要かつ重大な分
解を考慮して、ｔ０及びｔ２４時間の時間点のみを分析した。

低ｐＨインキュベーションは、生成物のフラグメント化を示し、ＰＡ溶出液の３．１％
からｔ０で中和されたＶＩの１２．４％へのＢＥＡＴ’％の増加をもたらした。これらの
ＣＧＥデータは、前述のＨＰＬＣ－ＳＥデータと相関しているようであり、ＨＰＬＣ－Ｓ
Ｅで観察される「ショルダー種」はＢＥＡＴ’種と同等である可能性があった。それでも
、４８時間の時間点は、約３．８％で、ｔ０よりも低いＢＥＡＴ’の割合を示した。この
結果は驚くべきものであり、一貫性がなかった。このデータは、採用された分析方法によ
って説明できる可能性がある。実際に、分析開発グループとの議論の後、Ｃａｌｉｐｅｒ
ＣＧＥは、検出及び定量が十分に正確ではない又はＣＧＥと同程度であるスクリーニン
グ方法としてみなされるに過ぎなかった。情報として、ｔ０及びｔ２４ｈの分析プロファ
イルを図１８及び図１９に示す。任意の決定的な結論を、これらの結果により出すことが
でき、Ｃａｌｉｐｅｒ分析はＶＩ工程開発の追求のため古典的なＣＧＥに完全に置き換え
られた。

ＩＣＥ３分析による電荷バリアントの結果を表５３に記載する。Ｃａｌｉｐｅｒ分析に
ついては、時間点ｔ０及びｔ２４時間のみを分析した。

電荷バリアント率の変動は低ｐＨ処理後に観察されなかった。酸性種の割合は約４９％
～５０％にとどまり、塩基性種は約９％、メインピークは約４１％であった。低ｐＨ処理
は、４８時間のインキュベーションまでＢＥＡＴ（登録商標）３分子の電荷バリアントに
影響を与えなかった。
結論として、低ｐＨ ＶＩ戦略は、ＨＰＬＣ－ＳＥデータで観察される高い生成物分解を
考慮して、ＶＩプロセスの適切な代替手段として明確に無効とされた。

ｂ．清澄化した採取物－溶媒洗浄剤処理
清澄化した採取物のＳ／Ｄ処理を、代表的な材料を使用して２回行った。Ｓ／Ｄ処理の後
にＰＡ工程が続き、反応を停止し、生成物の品質を得られたＰＡ溶出液中で直接確認した
。それらを、ＰＡ工程の開発に由来する、Ｓ／Ｄによって先に処理されなかった２回の基
準ランと比較した。これらの２つの基準ランを、同じ出発物質を使用し同等のローディン
グ係数で行った。溶出バッファーのｐＨのみが異なり、基準及びＳ／Ｄランではそれぞれ
ｐＨ４．３及びｐＨ４．２５であった。

表５４は、これらのランで取得されたデータの要約を示す。

先にＳ／Ｄで処理したランに対応するラン１及びラン２を、それぞれ最小及び最大のロ
ーディング係数（すなわち、１０ｇ／Ｌ及び３４ｇ／Ｌ）で行った。この差は、最小及び
最大のローディング係数についてそれぞれ５８％及び６７％の工程収量に影響を及ぼした
。これらの結果は、Ｓ／Ｄなしの基準ランの結果と同等であった。

品質に関して、ＨＰＬＣ－ＳＥ分析は、９４．９％～９９．２％でばらつき０．８％～
４．３％の範囲の凝集物パーセンテージに関係したＰＡ溶出液の単量体％を示した。フラ
グメントの割合は、全てのランで１％未満のままであった。単量体及び凝集物の割合の変
動は、ＰＡ溶出液濃度に直接関係していた。実際に、濃度はより高く、凝集物の割合はよ
り高かった。それにもかかわらず、単量体の割合は９５％を超える値でなお許容された。
さらに、還元ＣＧＥの結果に関して、差はランの間で観察されず（例えば、全てのランで
９４．４％～９５．７％の全ＢＥＡＴ％）、Ｓ／Ｄの使用による生成物のフラグメント化
は見られなかった。最後に、電荷バリアントプロファイルは、３７．８％～３９．８％の
メインピークのパーセンテージを示し、酸性種又は塩基性種の出現が観察された。生成物
の分解はＳ／Ｄ処理後に発生しなかった。

さらに、ＰＡ工程のＳ／Ｄ除去能力を評価するために、Ｔｗｅｅｎ ８０及びＴｎＢＰ
の濃度をＰＡ工程の前後に測定した。採取物中のＴｗｅｅｎ ８０濃度は、ＰＡ溶出液中
の０．００１％（重量／重量）に対して１．１％（重量／重量）であり、測定されたＴｎ
ＢＰは、採取物中で０．３％（重量／重量）及びＰＡ溶出液中で１ｍｇ／Ｌ（約０．０１
％（重量／重量）に対応する）であった。その結果、プロテインＡ工程はＳ／Ｄを効率的
に除去した。

結論として、ＰＡ工程前のＳ／Ｄ処理は、ＢＥＡＴ（登録商標）３ウイルス不活性化に
適した選択肢であった。

ｃ．ＰＡ溶出液－高ｐＨウイルス不活化
小規模開発
このセクションでは、高ｐＨ処理について小規模で得られた生成物の品質データを示す
。ＨＰＬＣ－ＳＥの結果を表５５に要約し、続いてＣＧＥ非還元及び電荷バリアントの結
果をそれぞれ表５６及び表５７に示す。

単量体の割合は条件間で同等であり（例えば、Ｔ０で９５．０％、Ｔ４８ｈで９４．９
％）、インキュベーションの４８時間まで高ｐＨ処理で凝集が発生しなかったことを確認
できた。それでも、ＰＡ溶出液サンプルと高ｐＨ処理サンプルの間には１％の差があった
。これは、高ｐＨインキュベーションの結果である可能性がある凝集物％のわずかな増加
によるものであった。しかしながら、１％の差は方法のばらつきの範囲内であり、統計的
に有意ではない可能性が高い。さらに、サンプルは同じ方法で保管されず、処理なしのＰ
Ａ溶出液は５±３℃で保管され、高ｐＨで処理されたサンプルは凍結されたため、凍結サ
ンプルでより可逆的な凝集をもたらした。

非還元ＣＧＥの結果を表５６に示す。

ＣＧＥ非還元によって与えられたＢＥＡＴの割合は、ｔ０と比較して、試験した全ての
サンプルで同じままであった（例えば、ＢＥＡＴ％はｔ０で８７．１％、Ｔ４８ｈで８７
．２％であった）。さらに、フラグメントの増加は４８時間まで観察できなかった。これ
らのデータを、図２０に示す同等のＣＧＥプロファイルオーバーレイによって確認した。

ＩＣＥ３の結果による電荷バリアントを下記表５７に示す。

ＩＣＥ３の結果は、Ｔ０で約４２．８％、１時間で４２．５％及び２時間で４１．８％
のメインピーク％を示した。これらの同じ時間点で、酸性度はそれぞれ４９．２％、５０
．２％及び５０．９％であった。電荷バリアントは、最長２時間まで同等である。２時間
のインキュベーション後に、酸性バリアント％は増加し、４時間で５４．０％、４８時間
で５９．６％である。それでも、方法のばらつきは１０％以下であり、４時間及び６時間
のメインピーク％で観測される差は、方法のばらつき内の値で統計的に有意ではない可能
性がある（例えば、ｔ０で４２．８％、Ｔ４ｈで３９．１％のメインピーク）。しかしな
がら、観測される酸性の％増加は予想される傾向であるが、２時間の安全マージンは、通
常６０分以上９０分以下であるプロセス時間（及びそれよりも長い）を網羅している。高
ｐＨインキュベーションの各時間点のプロファイルオーバーレイを図２１に示す。

結論として、データは、２時間まで生成物の品質に高ｐＨ処理の影響がないことを示し
た。２時間を超えても、凝集又はフラグメント化をもたらすことはないであろう。しかし
ながら、２４時間後には７％、４８時間後には１０％の酸性種の増加が観察された。この
提示される信頼性の高い高ｐＨインキュベーションは、低ｐＨの適切な代替手段である。

上記のＳ／Ｄ処理及び高ｐＨのデータに照らして、高ｐＨ戦略が好ましい選択肢として
選択された。実際に、同等の生成物品質データが２つのＶＩ戦略で得られた。それでも、
スケーラビリティ、工業化のコスト、安全性又はウイルスクリアランスとして、他のパラ
メーターを考慮する必要がある。

スケールアップ開発
小規模で開発されたプロセスをパイロット規模でスケールアップした。これらの実験に
より、以前に決定された結果を確認し、より大規模なプロセスデータを生成することがで
きた。２つのランのプロセスパラメータ及び結果を表５８に記載する。

２回のランを、パイロットスケールでのＰＡ工程の後に、ラン１について１１ｇ／Ｌ、
ラン２について２２ｇ／Ｌのローディング係数で行った。目標とするｐＨはｐＨ１１．２
であり、インキュベーション時間は最悪の場合のシナリオを模倣するため９０分を超えて
行った。幾つかのインプット操作範囲は、７７．９ｍＬ／Ｌ～８３．４ｍＬ／Ｌの塩基化
率及び４．１ｍＬ／Ｌ～５．６ｍＬ／Ｌの中和率で得られた。これとは対照的に、代表的
でない小規模ランの間、比率はこれらの範囲内であり、塩基化は８１．５ｍＬ／Ｌ、中和
は４．７ｍＬ／Ｌであった。さらに、アウトプット操作範囲は、ローディング係数に直接
関係する、約６．０で循環する（ｒｅｖｏｌｖｉｎｇ）ｐＨ、４．０ｍＳ／ｃｍ～４．４
ｍＳ／ｃｍの導電率及び１．７ｇ／Ｌ～３．３ｇ／ＬのＰＡ溶出液濃度を示した。最後に
、９４％の工程収量は、低／高ｐＨ不活性化工程について通常通りである。

生成物の品質の結果に関して、ＨＰＬＣ－ＳＥは、２回のランで同様の結果を示し９４
．３％の単量体であり、１時間のインキュベーションで９４．８％、２時間で９４．６％
が観察された小規模データに匹敵した。さらに、ＢＥＡＴ％がラン１で８９．９％、ラン
２で８７．６％であるＣＧＥ非還元結果は、約８８％のＢＥＡＴ％を示す小規模データに
近似していた。ＢＥＡＴ％で見られたわずかな違いは、ＢＥＡＴ”％の変動に直接関連し
ていた。実際に、ＢＥＡＴ”％はラン１で２．８％、ラン２で４．１％であった。１０％
以下の方法のばらつき及び分析のピーク積分がこれらの変動を説明し得る。図２２に示さ
れているプロファイルオーバーレイは、明らかなフラグメント化を示さない。

最後に、４％の差が電荷バリアントのメインピークに現れ、ラン１で４０％、ラン２で
３６％であった。この変動は、ラン１とラン２の間の酸性種の２％の増加に直接関連して
おり、かつ塩基性種に対しても同じであり、方法のばらつき内のため関連のない４％の減
少をもたらす。比較のために、プロファイルオーバーレイを図２３に示す。近似値（Ｃｌ
ｏｓｅｄ ｖａｌｕｅ）が、約４２％のメインピークを伴って小規模において見られた。

結論として、高ｐＨスケールアップは、小規模データと同等の良好な生成物の品質結果
を示した。追加のデータを収集するため、細胞ベースの機能アッセイ及び結合親和性アッ
セイ等の他のアッセイを行った。

結合親和性アッセイ
ＣＤ３ε１－２６－Ｆｃ及びＥＧＦＲに対する相対的親和性を表５９及び表６０にそれ
ぞれ収載する。

高ｐＨで処理したサンプル間では、ＣＤ３ε１－２６－Ｆｃ標的に対する親和性の違い
は観察されなかった。相対解離定数の平均は、基準については１．０であり、２４時間の
高ｐＨインキュベーション後はそれぞれ１．０７であった。

ＥＧＦＲ標的に関しては、わずかな増加のみが２時間超のインキュベーション後に現れ
た。相対解離定数の平均は２時間後に１．０２、４時間後に１．０９及び２４時間後に１
．１５であった。

結論として、ＢＥＡＴ（登録商標）３のＥＧＦＲ及びＣＤ３ε１－２６－Ｆｃに対する
親和性の違いは、通常６０分以上９０分以下であるプロセス時間を網羅する２時間のイン
キュベーションまで高ｐＨで観察されなかった。

細胞ベースの機能アッセイ
細胞ベースの機能アッセイの結果を図２４に示す。５０％最大有効濃度（ＥＣ５０）を
、用量反応曲線に基づいて決定した。異なる用量反応曲線の比較には、高ｐＨ条件間でわ
ずかな変動を示した。実際に、右へのわずかなシフトが、インキュベーション時間が長く
なるとｘ軸上で観察される。このシフトは、ＥＣ５０値の増加に直接関係する生成物の効
力の低下を明らかにする（例えば、ｔ０でＥＣ５０＝０．００６３、ｔ２４ｈで０．００
９４）。

得られたＥＣ５０値により、ゼロに等しい高ｐＨインキュベーション時間によるサンプ
ルを基準として、各サンプルの相対的効力を決定することができた。結果を表６１に示す
。

結果は、２時間のインキュベーション後に９７％、４時間後に８５％及び２４時間後に
６７％の相対的効力を示した。方法のばらつきが２５％以下であり、相対的効力は２時間
のインキュベーションまで安定していることがわかり、その後、観察された減少はＢＥＡ
Ｔ（登録商標）３活性の変化を示しているようである。実際に、例えば、２４時間のイン
キュベーション後に、同じ活性レベルを得るには、ＢＥＡＴ（登録商標）３の濃度は基準
サンプルの濃度（すなわち、インキュベーション時間がゼロに等しい）よりも高い必要が
ある。相対的効力パーセンテージのこの減少は、レスポンダー細胞の活性化の減少とその
結果としての発光応答の減少に関与する分子の潜在的な酸化に関連している可能性がある
。この仮説は、酸性種の増加が時間の経過と共に観察された前述のＩＣＥの結果と相関し
ているようであった。実際に、酸化は負に帯電した電子の損失を伴い、その結果、正に帯
電した酸性種の増加を間接的に伴う。

結論として、高ｐＨインキュベーション時間が増加すると、ＢＥＡＴ（登録商標）３活
性の低下が見られるようである。それでも、ＢＥＡＴ（登録商標）３の活性は、通常６０
分以上９０分以下であるプロセス時間を網羅する、２時間のインキュベーションまで変化
しなかった。高ｐＨ処理が適切であることが再度確認された。

残留ＤＮＡ及びＨＣＰアッセイ
パイロットスケールの高ｐＨサンプルで行われた残留ＤＮＡアッセイを表６２に示す。

ＶＩ工程の前に、全てのＰＡ溶出液を０．２μｍで濾過した。

残留ＤＮＡ濃度は、タンパク質１ミリグラム当たりのＤＮＡのピクトグラムで表され、
各サンプルのタンパク質濃度に関係なく、全てのサンプルをそれらの間で比較することが
可能である。高ｐＨでの処理後に、ＤＮＡ濃度は１５９ｐｇ／ｍｇ（ロード＝ＰＡ溶出液
で１８２ｐｇ／ｍｇに対して）であり、濾過後は３０ｐｇ／ｍｇであった。沈殿が高ｐＨ
インキュベーション中に観察され、おそらく、ＤＮＡ及び宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）
を含む不純物の沈殿のためである。その結果、高ｐＨ工程は沈殿によりＤＮＡを除去し、
沈殿は次いで、０．２μｍ濾過により除去される。全体的な除去工程のパーセンテージは
約８４％であった。

ＨＣＰ汚染物質レベルに対する高ｐＨ工程の影響を評価し、結果を表６３に示す。

ＶＩ工程の前に、全てのＰＡ溶出液を０．２μｍで濾過した。

残留ＨＣＰ濃度は、各サンプルのタンパク質濃度に関係なく、全てのサンプルを比較す
るため、タンパク質１ミリグラム当たりのＨＣＰのナノグラムで表された。第１のサンプ
ルの残留ＨＣＰの濃度は、Ｏｃｔｅｔ機器により１４２５ｎｇ／ｍｇ、ＥＬＩＳＡ方法に
より２８０３ｎｇ／ｍｇである。Ｏｃｔｅｔを使用したアッセイは、従来のＥＬＩＳＡア
ッセイと比較してより感度が高いと供給業者によって説明されていたため、これらの結果
は予想外であった。これらの２つの未処理サンプルを、各方法の基準として独立して使用
した。

Ｏｃｔｅｔの結果に関しては、高ｐＨ処理後に、ＨＣＰ濃度は、処理していないＰＡ溶
出液の１４２５ｎｇ／ｍｇに対して１１５４ ｎｇ／ｍｇであった。濾過後、濃度は１８
５ｎｇ／ｍｇであった。残留ＤＮＡアッセイで観察されたように、高ｐＨ処理は、おそら
く高ｐＨインキュベーション中に沈殿し、０．２μｍ濾過により除去されるＨＣＰを除去
する可能性を示した。ＥＬＩＳＡアッセイでは、より高い感度が示された（すなわち、よ
り高い濃度が測定された）にもかかわらず、ＨＣＰ除去率は、両方のＶＩで約８０％の除
去であり、両方の方法の間で同等であった。

結論として、高ｐＨ処理は、ＤＮＡ及びＨＣＰの不純物を除去する興味深い可能性を示
した。工程の最後に行われる０．２μｍ濾過は、高ｐＨインキュベーション中に沈殿した
ＨＣＰ及びＤＮＡを物理的に除去するために不可欠であった。

ＶＲＶ ＮＲＴ研究
ウイルスを効率的に不活性化する能力について、高ｐＨ処理を試験した。Ｂｉｏｒｅｌ
ｉａｎｃｅで非規制試験を行い、ウイルスクリアランスの結果を表６４に要約する。

異種指向性マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）に対して行われたウイルスクリアランスは
、ｐＨ１０．８（＋／－０．０５）で６０分間の高ｐＨ処理後、５．６５ ｌｏｇ_１０の
減少係数を示した。したがって、高ｐＨ処理はウイルスクリアランスの観点から非常に有
効であると考えられた。

また、ＢＥＡＴ（登録商標）３精製プロセスのウイルス不活化工程として高ｐＨでのＢ
ＥＡＴ（登録商標）３のインキュベーションを使用してウイルスクリアランスを試験する
場合、クリアランスは、図２５の高ｐＨ処理速度論によって示されるように有効である。

ウイルス力価及び計算されたｌｏｇ減少係数を下記表６６に要約する。

両方の重複するランは、同様の不活性化の速度論を示し、時間の経過と共に顕著且つ急
速に減少し（例えば、５分、１０分、３０分及び６０分のインキュベーション後２．１５
ｌｏｇ_１０、１．８１ ｌｏｇ_１０、１．６２ ｌｏｇ_１０及び１．４７ ｌｏｇ_１０
）、大きな減少が５分間のインキュベーション後に体系的に観察された。

高ｐＨ処理で得られたＭＬＶ減少係数は５．７７ ｌｏｇ_１０及び５．６５ ｌｏｇ_１
０（それぞれラン１及びラン２）であり、ＶＩがＭＬＶウイルスの不活化に有効であると
結論付けることができた（すなわち、全てのＬＲＦ＞４．００ ｌｏｇ_１０）。

要約すると、抗体ＢＥＡＴ（登録商標）３に対する最適な処理を選択するために、様々
なＶＩ戦略を検討した。ＶＩ条件の選択基準は、第１に処理後の分子の安定性、第２に許
容可能なｌｏｇ減少でウイルスを不活性化する方法の効率、そして最後に製造プロセスを
ＧＭＰエリアに導入する容易さであった。

ＰＡ溶出液に対する低ｐＨインキュベーションは、高分子量種の増加を伴う重要な生成
物の分解を示した。この戦略は、このプロジェクトには適さないとされた。

バルク採取物に対する溶媒／洗浄剤（Ｓ／Ｄ）処理及びＰＡ溶出液に対する高ｐＨはど
ちらも適していることがわかり、物理化学的特性のみに関する生成物の品質の観点では同
様の結果を示した。さらに、新たな処理方法と見なされた高ｐＨ ＶＩは、生成物の活性
又はウイルスクリアランスに基づく他のアッセイに適しているとうまく確認された。

結論として、この報告で検討されている全てのパラメーターを考慮して、高ｐＨ処理が
ＢＥＡＴ（登録商標）３プロジェクトに最適なＶＩ戦略として選択され、ＰＡとＣＥＸの
工程の間のプロセスで実施された。Ｓ／Ｄ処理をバックアップ選択と考えた。

また、ＢＥＡＴ（登録商標）３精製プロセスのウイルス不活化工程として高ｐＨでのＢ
ＥＡＴ（登録商標）３のインキュベーションの際のウイルス除去を試験する場合、除去は
、図２５の高ｐＨ処理速度論によって示されるように結果的に有効である。

ウイルス力価及び計算したｌｏｇ減少係数を下記表６６に要約する。

重複ランはいずれも、同様の不活性化の速度論を示し、時間の経過と共に顕著且つ急速
に減少し（例えば、５分、１０分、３０分及び６０分のインキュベーション後に２．１５
ｌｏｇ_１０、１．８１ ｌｏｇ_１０、１．６２ ｌｏｇ_１０及び１．４７ ｌｏｇ_１０
）、大きな減少が５分間のインキュベーション後に体系的に観察された。

高ｐＨ処理で得られたＭＬＶ減少係数は５．７７ ｌｏｇ_１０及び５．６５ ｌｏｇ_１
０（それぞれラン１及びラン２）であり、ＶＩがＭＬＶウイルスの不活化に有効であると
結論付けることができた（すなわち、全てのＬＲＦ＞４．００ ｌｏｇ_１０）。

実施例８：高ｐＨは非低ｐＨ不安定抗体の精製プロセスにおいても低ｐＨ処理の有効な代
替手段である
非ｐＨ不安定抗体の精製プロセスにおいて低ｐＨインキュベーションの代替として高ｐ
Ｈを使用する可能性を試験するため、ヒト化ＩｇＧ１（ここではＡｂ１と呼ぶ）の安定性
及び活性における高ｐＨインキュベーションの効果を調査した。

材料、方法及び機器
この研究で使用した出発物質は、代表的なＰＡ溶出液であった。

全ての化学物質は薬局方グレード（米国又は欧州）であった。インプロセス０．２μｍ
濾過工程を通常、全てのバッファー及びプロセス中間体に対して行った。さらに、マグネ
チックスターラー、ｐＨメーター及び導電率計を使用した。

試験した時間点は室温にて１時間、２時間及び４時間、並びにこの時間点を超え、生成
物を５±３℃で最大２４時間インキュベーションした。約１００ｍＬのＰＡ溶出液を、Ｎ
ａＯＨ ０．５Ｍを使用してＮａｌｇｅｎｅボトル中でｐＨ１１．２にマグネチックスタ
ーラーを用いて攪拌しながら塩基化した。このｐＨを、プロセスの目標ｐＨ１１．０を検
証するために、生成物の品質について最悪の場合のシナリオとして選択した。高ｐＨの生
成物を、以下に記載するように直ちに中和された時間点ｔ０を除いて、インキュベートし
た。各時間点で、約１０ｍＬの高ｐＨ生成物を５０ｍＬ ＴＰＰチューブに移し、凍結す
る前に、ＶＩ反応を停止するためＨＣｌ ３．７％（中和工程）を使用してｐＨ５．２ま
でｐＨを下げて中和した。

生成物の品質を、全ての時間点でＨＰＬＣ－ＳＥ、ｉＣＥ及びＣＧＥによって分析した
。中和されておらず、どのＶＩ処理も行っていないＰＡ溶出液も分析し、基準として使用
した。

上記の試験による幾つかのサンプルを、表面プラズモン共鳴により試験するため選択し
た（表３７）。目的は、高ｐＨ処理が標的のＯＸ４０Ｒ及びＦｃｇＲ３ａに対するＡｂ１
分子の結合親和性に影響を与え、したがって間接的にその活性に影響を与えるかどうかを
検証することであった。さらに、細胞ベースの機能アッセイも、Ａｂ１分子活性に対する
高ｐＨの影響を直接検証するために行った。

結果及び結論
Ａｂ１の高ｐＨインキュベーションの保持時間の影響をＳＥ－ＨＰＬＣによって分析し
、結果を図２６及び表６９に示す。

この研究は、単量体の割合が条件間で同等であることに加えて、２４時間までの高ｐＨ
処理では凝集が見られないことを示している。観察された変動は方法のばらつき内に含ま
れ、統計的に有意ではない。したがって、これらの結果によれば、Ａｂ１は、通常６０分
以上９０分以下であるプロセス時間を安全マージンで網羅する２４時間まで安定である。

高ｐＨ処理時のサンプルの純度及び同一性を更に調査するため、保持時間の影響を非還
元ＣＧＥで分析した、表７０及び図２７。また、これらの実験は、中間体の割合が基準サ
ンプル（ＰＡ溶出液）と同等であり、顕著なフラグメント化は２時間まで発生しないこと
を示している。１２５ｋＤａのフラグメントの割合は２時間後にわずかに増加し、ＩｇＧ
の割合の減少と相関している。

これらの結果を総合すると、Ａｂ１は、通常は６０分以上９０分以下であるプロセス時
間の安全マージンを網羅する２時間まで安定である。

還元ＣＧＥ（図２８及び表７１）はまた、顕著なフラグメントの増加が２時間までなく
、２時間後に「不明なフラグメント」の割合のわずかな増加が起こり、これはＨＣ％の減
少と相関することを示す。

これらの結果は、Ａｂ１が、通常６０分以上９０分以下であるプロセス時間の安全マー
ジンを網羅する２時間まで安定であることを確認する。

高ｐＨでの保持時間の影響をｉＣＥにより更に分析して、電荷バリアントを評価した。
表７２及び図２９において、結果は、時間の経過と共に酸性種が増加することを示すが、
それでも方法のばらつきは１０％以下であり、２時間までに観測される差は方法のばらつ
きの範囲内であり、許容可能であって統計的に有意ではないと見なすことができた。言い
換えれば、観察された酸性パーセンテージの増加は予想される傾向であり、２時間の安全
マージンは、通常６０分以上９０分以下であるプロセス時間（及びそれよりも長い）を網
羅している。

分子活性に対する高ｐＨでの保持時間の影響を評価するため、細胞ベースの機能アッセ
イを行った。結果によれば、図３０及び表７３において、相対的効力の値における時間の
経過に伴う傾向は見られない。ｔ１ｈ及びｔ２ｈでの高ｐＨ処理は、基準として使用され
るＰＡ溶出液と比較して非常に類似した効力をもたらす。方法のばらつきが２５％以下で
あることを考慮すると、高ｐＨ処理は、通常６０分以上９０分以下であるプロセス時間を
網羅する、２時間のインキュベーションまでＡｂ１活性を大幅に変化させない。

Ａｂ１の活性に対する高ｐＨインキュベーションの影響を評価するため、結合親和性ア
ッセイ（Ｂｉａｃｏｒｅで）を実施した（表７４）。

ヒトＯＸ４０への結合活性における機能的重要性の違いは、プロテインＡ溶出液と高ｐ
Ｈでインキュベートした全てのサンプルとの間で見られない。わずかな違いは、注入され
た濃度がわずかに異なるためかもしれない。

ヒトＦｃγＲ３ａへの結合活性における機能的重要性の違いは、プロテインＡ溶出液と
高ｐＨでインキュベートした全てのサンプルとの間で見られない。わずかな違いは、注入
された濃度がわずかに異なるためかもしれない。

総合するとこれらの結果は、ＰＡ溶出液の高ｐＨ処理が、非低ｐＨ不安定抗体の精製プ
ロセスでも低ｐＨ処理の有効な代替手段であることを示している。

Claims (22)

1. ウイルス不活性化抗体溶液を作製するための方法であって、（ｉ）細胞培養を経た、抗
   体のコード配列を含むトランスフェクトされた細胞によって産生された前記抗体材料を採
   取する工程、（ｉｉ）溶媒及び洗浄剤の混合物とのインキュベーション又は高ｐＨでのイ
   ンキュベーションからなる群から選択される、前記採取された抗体に対するウイルス不活
   性化処理の工程を含む、方法。
2. 前記採取された抗体材料が非ヒト哺乳動物細胞で産生される、請求項１に記載の方法。
3. 前記採取された抗体材料がモノクローナル抗体を含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記モノクローナル抗体が組換え抗体である、請求項３に記載の方法。
5. 前記組換え抗体が多重特異性である、請求項４に記載の方法。
6. 前記溶媒がＴｎＢＰでありかつ、前記洗浄剤がＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ポリソルベ
   ート８０及びポリソルベート２０からなる群から選択される、請求項１～５のいずれか一
   項に記載の方法。
7. 前記ＴｎＢＰの濃度が約０．１％（重量／重量）以上、及び約１％（重量／重量）以下
   であり、特に前記ＴｎＢＰの濃度が約０．１％（重量／重量）、約０．３％（重量／重量
   ）、約０．５％（重量／重量）及び約１％（重量／重量）を含む群から選択される、請求
   項６に記載の方法。
8. 前記ポリソルベート８０又は前記ポリソルベート２０の濃度が約０．１％（重量／重量
   ）以上、及び約２％（重量／重量）以下であり、特に前記ポリソルベート８０又は前記ポ
   リソルベート２０の濃度が約０．２％（重量／重量）、約０．５％（重量／重量）、約０
   ．７５％（重量／重量）、約１％（重量／重量）、約１．２５％（重量／重量）を含む群
   から選択される、請求項６に記載の方法。
9. 溶媒及び洗浄剤の前記混合物が０．３％（重量／重量）のＴｎＢＰ及び０．５％（重量
   ／重量）のポリソルベート８０の混合物及び０．３％（重量／重量）のＴｎＢＰ及び１％
   （重量／重量）ポリソルベート８０の混合物からなる群から選択される、請求項１～８の
   いずれか一項に記載の方法。
10. 前記採取された抗体材料が少なくとも５分間０．３％（重量／重量）のＴｎＢＰ及び１
    ％（重量／重量）のポリソルベート８０の混合物とインキュベートされる、請求項１～９
    のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記採取された抗体材料がプロテインＡクロマトグラフィーに最初に供され、かつ得ら
    れたプロテインＡ溶出液が室温で少なくとも１０分間０．３％（重量／重量）のＴｎＢＰ
    及び１％（重量／重量）のポリソルベート８０の混合物とインキュベートされる、請求項
    １０に記載の方法。
12. 前記採取された抗体材料が清澄化された採取物でありかつ室温で、攪拌しながら、約６
    ０分間０．３％（重量／重量）のＴｎＢＰ及び１％（重量／重量）のポリソルベート８０
    の混合物とインキュベートされる、請求項１０に記載の方法。
13. 前記高ｐＨが９以上かつ１２．５以下である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方
    法。
14. 前記高ｐＨが少なくとも１０．５である、請求項１３に記載の方法。
15. 前記高ｐＨが約１１である、請求項１４に記載の方法。
16. 前記採取された抗体材料がプロテインＡクロマトグラフィーに最初に供され、かつ得ら
    れたＡ溶出液が前記高ｐＨでインキュベートされる、請求項１３～１５のいずれか一項に
    記載の方法。
17. 前記プロテインＡ溶出液が目標の高ｐＨにトリス、ヒスチジン Ｌ－アルギニン、リン
    酸塩及びＮａＯＨの群から選択されるバッファーで滴定されかつインキュベートされる、
    請求項１６に記載の方法。
18. 前記プロテインＡ溶出液が室温で約６０分間、目標のｐＨ１１に０．５ＭのＮａＯＨで
    滴定される、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の方法。
19. ウイルス不活化アッセイにより請求項１に記載のウイルス不活化抗体溶液の一部を試験
    する更なる工程（ｉｉｉ）を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
20. バルク原薬の製造の方法であって、
    （ａ）請求項１２に記載の溶媒洗浄剤処理による採取された抗体材料のウイルス不活化の
    工程、
    （ｂ）前記得られたウイルス不活化溶液のプロテインＡクロマトグラフィーの工程、
    （ｃ）ｐＨ６．０への前記プロテインＡ溶出液の中和、それに続く０．２μｍ濾過の工程
    、
    （ｄ）前記中和されたプロテインＡ溶出液の陽イオン交換クロマトグラフィー、それに続
    く０．２μｍ濾過の工程、
    （ｅ）限外濾過及び連続ダイアフィルトレーションによる陽イオン交換クロマトグラフィ
    ー溶出液の濃縮、それに続く０．２μｍ濾過の工程、
    （ｆ）膜吸着を使用する、フロースルーモードでの陰イオン交換クロマトグラフィーによ
    る前記生成物の精製、それに続く０．２μｍ濾過の工程、
    （ｇ）ウイルスナノ濾過の工程、
    （ｈ）予備製剤バッファーへの限外濾過及び連続ダイアフィルトレーションによる前記生
    成物の濃縮、それに続く０．２μｍ濾過の工程、
    （ｉ）ｐＨ５．９で５ｍＭクエン酸塩、１５％スクロース、０．０６％ポリソルベート８
    ０を混合することによる、最終製剤バッファー中の目標の６ｍｇ／ｍＬ生成物への賦形剤
    添加、それに続く０．２μｍ濾過の工程、
    （ｊ）滅菌バッグへの前記生成物の充填、それに続く－８０±２０℃での凍結及び保存の
    工程、
    を含む方法。
21. バルク原薬の製造の方法であって、
    （ａ）採取した抗体材料のプロテインＡクロマトグラフィーの工程、
    （ｂ）請求項１８に記載される高ｐＨでの前記得られたＰＡ溶出液のインキュベーション
    の工程、
    （ｃ）ｐＨ５．５への前記得られたウイルス不活化溶液の中和、それに続く０．２μｍ濾
    過の工程、
    （ｄ）中和されたウイルス不活化プロテインＡ溶出液の陽イオン交換クロマトグラフィー
    、それに続く０．２μｍ濾過の工程、
    （ｅ）限外濾過及び連続ダイアフィルトレーションによる陽イオン交換クロマトグラフィ
    ー溶出液の濃縮、それに続く０．２μｍ濾過の工程、
    （ｆ）膜吸着を使用する、フロースルーモードでの陰イオン交換クロマトグラフィーによ
    る生成物の精製、それに続く０．２μｍ濾過の工程、
    （ｇ）ウイルスナノ濾過の工程、
    （ｈ）予備製剤バッファーへの限外濾過及び連続ダイアフィルトレーションによる前記生
    成物の濃縮、それに続く０．２μｍ濾過の工程、
    （ｉ）５ｍＭ Ｌ－ヒスチジン、１５０ｍＭ Ｌ－アルギニン一塩酸塩、１５％スクロー
    ス、０．０６％ポリソルベート８０、ｐＨ６．０を混合することによる、最終製剤バッフ
    ァー中の目標の６ｍｇ／ｍＬ生成物への賦形剤添加、それに続く０．２μｍ濾過の工程、
    （ｊ）滅菌バッグへの前記生成物の充填、それに続く－８０±２０℃での凍結及び保存の
    工程、
    を含む方法。
22. 細胞採取物を高ｐＨで処理する工程それに続く濾過工程を含む前記細胞採取材料からの
    不純物の除去の方法。

Images