JP7366747B2 - 血液凝固抗体 - Google Patents
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Description
「160163WO02_ST25」と題する配列表は198キロバイトであり、2018年1月30日に作成され、参照により本明細書に組み込まれる。
配列番号1は、ヒト凝固第IX因子のアミノ酸配列である。
配列番号2は、ヒト凝固第X因子のアミノ酸配列である。
配列番号3~188は、本明細書に記載の抗FIXおよび抗FXモノクローナル抗体(mAbs)の重鎖可変ドメイン(VH)および軽鎖可変ドメイン(VL)の配列である。対応するワンアームド(OA)抗体ならびに特定の二重特異性抗体のIDも表に示す。CDR1-3配列を図1のボックスで強調する。
FIXは、第VII因子、プロトロンビン、第X因子、およびタンパク質Cと構造的に類似したビタミンK依存性凝固因子である。循環する酵素前駆体型は、N末端γ-カルボキシグルタミン酸リッチ(Gla)ドメイン、二つのEGFドメイン、およびC末端トリプシン様セリンプロテアーゼドメインを含む、四つの異なるドメインに分割された415個のアミノ酸から成る。FIXは、血漿中で単鎖酵素前駆体(配列番号1)として循環する。FIXの活性化は、Arg145およびArg180での限定的タンパク質分解によって生じ、活性化ペプチドを放出する(配列番号1の残基146~180)。したがって、活性化されたFIX(FIXa)は、配列番号1(軽鎖)の残基1~145、および配列番号1(重鎖)の残基181~415から構成される。
FXは、第VII因子、プロトロンビン、FIX、およびタンパク質Cと構造的に類似したビタミンK依存性凝固因子である。ヒトFX酵素前駆体は、N末端ガンマ-カルボキシグルタミン酸リッチ(Gla)ドメイン、二つのEGFドメイン、およびC末端トリプシン様セリンプロテアーゼドメインを含む、四つの異なるドメインを含む。FXは、配列番号2(軽鎖)の残基1~139および配列番号2(重鎖)の残基143~448を含む、二鎖酵素前駆体として血漿中で循環する。FXの活性化は、Arg194での限定されたタンパク質分解によって起こり、活性化ペプチドの放出をもたらす(Aa143~194)。したがって、活性化FX(FXa)は、配列番号2(軽鎖)の残基1~139および配列番号2(活性化重鎖)の残基195~448から構成される。したがって、循環FX分子は、FX酵素前駆体、および活性型のFXを含み、これは本明細書では、配列番号2に関してそれぞれFXおよびFXaと呼ばれる。本発明では、FXは、FXのすべての天然変異体を網羅することを意図している。「FX(配列番号2)および/またはその活性型(FXa)」という用語は、「FX/FXa」または「FX(a)」とも呼ばれる。
本明細書において「抗体」という用語は、抗原またはその一部に結合する能力を有する免疫グロブリン配列に由来するタンパク質を指す。抗体という用語には、任意のクラス(またはアイソタイプ)、すなわち、IgA、IgD、IgE、IgG、IgMおよび/またはIgYの全長抗体が含まれるが、これらに限定されない。抗体という用語は、二重特異性抗体などの二価である抗体を含むが、これに限定されない。
当技術分野で公知の「同一性」という用語は、配列を比較することによって決定される、二つ以上のポリペプチドの配列の間の関係を指す。当技術分野では、「同一性」はまた、二つ以上のアミノ酸残基の文字列の間の一致の数によって決定される、ポリペプチド間の配列の関連性の程度を意味する。「同一性」とは、特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラム(すなわち、「アルゴリズム」)によって対処された隙間調整(もしあれば)を有する二つ以上の配列の小さい方の間の同一の一致の割合を測定する。関連するポリペプチドの同一性は、公知の方法によって容易に計算することができる。このような方法は、限定されるものではないが、以下に記載されている。Computational Molecular Biology、Lesk、A.M.、ed.、Oxford University Press、New York、1988;Biocomputing:Informatics and Genome Projects、Smith、D.W.、ed.、Academic Press、New York、1993;Computer Analysis of Sequence Data、Part 1、Griffin、A.M.、および Griffin,H.G.,eds.、Humana Press,New Jersey、1994;Sequence Analysis in Molecular Biology、von Heinje,G.,Academic Press、1987;Sequence Analysis Primer、Gribskov,M.and Devereux、J.,eds.、M.Stockton Press、New York、1991;および Carilloら、SIAM J.Applied Math.1988;48:1073。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗体などの本発明の化合物を含む組成物および製剤を提供する。例えば、本発明は、薬学的に許容可能な担体と共に製剤化された、本発明の一つまたは複数の抗体を含む医薬組成物を提供する。
抗体などの本発明の化合物は、静脈内、筋肉内、皮下など、非経口的に投与してもよい。別の方法として、本発明の抗体は、経口的または局所的など、経口経路を介して投与されてもよい。本発明の抗体は、予防的に投与されてもよい。本発明の抗体は、(要求に応じて)治療的に投与されてもよい。
送達される化合物の用量は、一日あたり約0.01mg~500mgの化合物、好ましくは一日あたり約0.1mg~250mg、より好ましくは一日あたり約0.5mg~約250mgであってもよく、状態の重症度に応じて、初回量および維持量として、一日、一週間、二週間、または一ヶ月に一回でもよい。適切な用量は、特定の化合物について、そのインビボ半減期または平均滞留時間およびその生物活性を含む、その化合物の特性に基づいて調整されてもよい。例えば、送達される化合物は、一実施形態では一週間に一回、または別の実施形態では一週間おきに一回、または別の実施形態では一ヶ月に一回投与されてもよく、前記実施形態のいずれかにおいて、例えば体重一kgあたり0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、または10mgの用量で投与されてもよい。
一実施形態では、本発明の抗体は、FIX(配列番号1)またはその活性型(FIXa)の残基H256を含むエピトープを結合することができる。
一実施形態では、抗体は、FIX/FIXaおよびFX/FXaを結合する二重特異性抗体であり、FIX/FIXa結合ドメインはビン1の抗体に由来し、FX/FXa結合ドメインはビンCまたはDの抗体に由来する。
a)第一の抗原結合部位は、以下のCDR配列を含み、
VH-CDR1:DYAMH
VH-CDR2:GISWRGDIIGYVDSVKG
VH-CDR3:SYGSGSFYNAFDS
VL-CDR1:RASQSISSWLA
VL-CDR2:KASRLDR
VL-CDR3:LEYSSYIRT
および
b)第二の抗原結合部位は、以下のCDR配列を含み、
VH-CDR1:TSWIV
VH-CDR2:MIDPSDSFTSYSPSFQG
VH-CDR3:LHYYHSEEFDV
VL-CDR1:RASQSVSSSYLA
VL-CDR2:GASSRAR
VL-CDR3:QQFGSSRLFT
a)第一の抗原結合部位は、以下のCDR配列を含み、
VH-CDR1:DYAMH
VH-CDR2:GISWRGDIIGYVDSVKG
VH-CDR3:SYGSGSFYNAFDS
VL-CDR1:RASQSISSWLA
VL-CDR2:KASRLDR
VL-CDR3:LEYSSYIRT
および
b)第二の抗原結合部位は、以下のCDR配列を含み、
VH-CDR1:TSWIV
VH-CDR2:MIDPSDSFTSYSPSFQG
VH-CDR3:LHYYHSEEFDV
VL-CDR1:RASQSVSSSYLA
VL-CDR2:GASSRTR
VL-CDR3:QQFGSSRLFT
1.配列番号1による第IX因子(FIX)またはこの活性型(FIXa)に結合することができる抗体またはその抗原結合性断片。
a.配列番号15によって識別された重鎖可変ドメイン、および配列番号16によって識別された軽鎖可変ドメイン、または
b.配列番号19によって識別された重鎖可変ドメイン、および配列番号20によって識別された軽鎖可変ドメインを含む、抗体またはその抗原結合性断片。
a.配列番号15によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号16によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である軽鎖可変ドメイン、
b.配列番号19によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号20によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である軽鎖可変ドメイン、
c.配列番号69によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号70によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である軽鎖可変ドメイン、
d.配列番号71によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号72によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である軽鎖可変ドメイン、
e.配列番号73によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号74によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である軽鎖可変ドメイン、
f.配列番号83によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号84によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である軽鎖可変ドメイン、
g.配列番号81によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号82によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である軽鎖可変ドメイン、
h.配列番号75によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号76によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である軽鎖可変ドメイン、
i.配列番号77によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号78によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である軽鎖可変ドメイン、または
j.配列番号177によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号178によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である軽鎖可変ドメインを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
a.
i.配列番号15によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖CDR配列、および
ii.配列番号16によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖CDR配列、
b.
i.配列番号19によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖CDR配列、および
ii.配列番号20によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖CDR配列、
c.
i.配列番号69によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖CDR配列、および
ii.配列番号70によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖CDR配列、
d.
i.配列番号71によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖CDR配列、および
ii.配列番号72によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖CDR配列、
e.
i.配列番号73によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖CDR配列、および
ii.配列番号74によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖CDR配列、
f.
i.配列番号83によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖CDR配列、および
ii.配列番号84によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖CDR配列、
g.
i.配列番号81によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖CDR配列、および
ii.配列番号82によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖CDR配列、
h.
i.配列番号75によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖CDR配列、および
ii.配列番号76によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖CDR配列、または
i.
i.配列番号77によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖CDR配列、および
ii.配列番号78により識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖CDR配列、または
j.
i.配列番号177により識別された重鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖CDR配列、および
ii.配列番号178によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖CDR配列を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
a.配列番号15によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列、および配列番号16によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列、または
b.配列番号19によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列、および配列番号20によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列、または
c.配列番号3によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列、および配列番号4によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列、または
d.配列番号109によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列、および配列番号110によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列、または
e.配列番号153によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列、および配列番号154によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列、または
f.配列番号171によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列、および配列番号172によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列、または
g.配列番号177によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列、および配列番号178によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列、または
h.配列番号187によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列、および配列番号188によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
a.配列番号15によって識別された重鎖可変ドメイン、および配列番号16によって識別された軽鎖可変ドメイン、または
b.配列番号19によって識別された重鎖可変ドメイン、および配列番号20によって識別された軽鎖可変ドメイン、または
c.配列番号3によって識別された重鎖可変ドメイン、および配列番号4によって識別された軽鎖可変ドメイン、または
d.配列番号109によって識別された重鎖可変ドメイン、および配列番号110によって識別された軽鎖可変ドメイン、または
e.配列番号153によって識別された重鎖可変ドメイン、および配列番号154によって識別された軽鎖可変ドメイン、または
f.配列番号171によって識別された重鎖可変ドメイン、および配列番号172によって識別された軽鎖可変ドメイン、または
g.配列番号177によって識別された重鎖可変ドメイン、および配列番号178によって識別された軽鎖可変ドメイン、または
h.配列番号187によって識別された重鎖可変ドメイン、および配列番号188によって識別された軽鎖可変ドメインを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
a.R338、S339、T340、K341およびT343、
b.L337、S339、T340、K341およびT343、
c.L337、R338、T340、K341およびT343、
d.L337、R338、S339、K341およびT343、
e.L337、R338、S339、T340およびT343または
f.L337、R338、S339、T340およびK341
を含むエピトープを結合することができる、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
a.D332、R333、A334、T335、R338およびN346
b.K301、R333、A334、T335、R338およびN346
c.K301、D332、A334、T335、R338およびN346
d.K301、D332、R333、T335、R338およびN346
e.K301、D332、R333、A334、R338およびN346
f.K301、D332、R333、A334、T335およびN346または
g.K301、D332、R333、A334、T335およびR338
を含むエピトープを結合することができる、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
a.配列番号17によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号18によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である軽鎖可変ドメイン、
b.配列番号85によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号86によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である軽鎖可変ドメイン、または
c.配列番号79によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号80によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である軽鎖可変ドメインを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
a.
i.配列番号17によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖CDR配列、および
ii.配列番号18によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖CDR配列、
b.
i.配列番号85によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖CDR配列、および
ii.配列番号86によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖CDR配列、または
c.
i.配列番号79によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖CDR配列、および
ii.配列番号80によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖CDR配列を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
a.配列番号17によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列と、
配列番号18によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列とを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体または抗原結合性断片。
a.配列番号17によって識別された重鎖可変ドメイン、および配列番号18によって識別された軽鎖可変ドメインを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
a.H257、N258、K293、R403、Y404、N406、W407、E410およびK411、
b.H256、N258、K293、R403、Y404、N406、W407、E410およびK411、
c.H256、H257、K293、R403、Y404、N406、W407、E410およびK411、
d.H256、H257、N258、R403、Y404、N406、W407、E410およびK411、
e.H256、H257、N258、K293、Y404、N406、W407、E410およびK411、
f.H256、H257、N258、K293、R403、N406、W407、E410およびK411、
g.H256、H257、N258、K293、R403、Y404、W407、E410およびK411、
h.H256、H257、N258、K293、R403、Y404、N406、E410およびK411、
i.H256、H257、N258、K293、R403、Y404、N406、W407およびK411または
j.H256、H257、N258、K293、R403、Y404、N406、W407およびE410
を含むエピトープを結合することができる、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
a.配列番号65によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖CDR配列、および
b.配列番号66によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖CDR配列を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
a.配列番号67によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号68によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である軽鎖可変ドメイン、
b.配列番号23によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号24によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である軽鎖可変ドメイン、
c.配列番号39によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号40によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である軽鎖可変ドメイン、または
d.配列番号59によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号60によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である軽鎖可変ドメインを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
a.
i.配列番号67によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖CDR配列、および
ii.配列番号68によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖CDR配列、
b.
i.配列番号23によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖CDR配列、および
ii.配列番号24によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖CDR配列、
c.
i.配列番号39によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖CDR配列、および
ii.配列番号40によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖CDR配列、または
d.
i.配列番号59によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖CDR配列、および
ii.配列番号60によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖CDR配列を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
a.配列番号67によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列、および配列番号68によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
b.配列番号23によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列、および配列番号24によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
c.配列番号39によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列、および配列番号40によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列、または
d.配列番号59によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列、および配列番号60によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
a.配列番号67によって識別された重鎖可変ドメイン、および配列番号68によって識別された軽鎖可変ドメイン、
b.配列番号23によって識別された重鎖可変ドメイン、および配列番号24によって識別された軽鎖可変ドメイン、
c.配列番号39によって識別された重鎖可変ドメイン、および配列番号40によって識別された軽鎖可変ドメイン、または
d.配列番号59によって識別された重鎖可変ドメイン、および配列番号60によって識別された軽鎖可変ドメインを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
a.配列番号21によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号22によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である軽鎖可変ドメイン、
b.配列番号25によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号26によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である軽鎖可変ドメイン、
c.配列番号27によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号28によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である軽鎖可変ドメイン、
d.配列番号29によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号30によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である軽鎖可変ドメイン、
e.配列番号31によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号32によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である軽鎖可変ドメイン、
f.配列番号33によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号34によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である軽鎖可変ドメイン、
g.配列番号35によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号36によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である軽鎖可変ドメイン、
h.配列番号37によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号38によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である軽鎖可変ドメイン、
i.配列番号39によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号40によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である軽鎖可変ドメイン、
j.配列番号41によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号42によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である軽鎖可変ドメイン、
k.配列番号43によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号44によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である軽鎖可変ドメイン、
l.配列番号51によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号52によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である軽鎖可変ドメイン、
m.配列番号53によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号54によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である軽鎖可変ドメイン、
n.配列番号55によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号56によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である軽鎖可変ドメイン、
o.配列番号57によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号58によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である軽鎖可変ドメイン、
p.配列番号59によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号60によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である軽鎖可変ドメイン、
q.配列番号61によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号62によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である軽鎖可変ドメイン、または
r.配列番号63によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号64によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である軽鎖可変ドメインを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
a.
i.配列番号21によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖CDR配列、および
ii.配列番号22によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖CDR配列、
b.
i.配列番号25によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖CDR配列、および
ii.配列番号26によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖CDR配列、
c.
i.配列番号27によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖CDR配列、および
ii.配列番号28によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つ軽鎖CDR配列、または
d.
i.配列番号29によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖CDR配列、および
ii.配列番号30によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖CDR配列、
e.
i.配列番号31によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖CDR配列、および
ii.配列番号32によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖CDR配列、
f.
i.配列番号33によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖CDR配列、および
ii.配列番号34によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖CDR配列、
g.
i.配列番号35によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖CDR配列、および
ii.配列番号36によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つ軽鎖CDR配列、または
h.
i.配列番号37によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖CDR配列、および
ii.配列番号38によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖CDR配列、
i.
i.配列番号39によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖CDR配列、および
ii.配列番号40によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖CDR配列、
j.
i.配列番号41によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖CDR配列、および
ii.配列番号42によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖CDR配列、
k.
i.配列番号43によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖CDR配列、および
ii.配列番号44によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つ軽鎖CDR配列、または
l.
m.
i.配列番号51によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖CDR配列、および
ii.配列番号52によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つ軽鎖CDR配列、または
n.
i.配列番号53によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖CDR配列、および
配列番号54によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖CDR配列、
o.
i.配列番号55によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖CDR配列、および
ii.配列番号56によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖CDR配列、
p.
i.配列番号57によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖CDR配列、および
ii.配列番号58によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖CDR配列、
q.
i.配列番号59によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖CDR配列、および
ii.配列番号60によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖CDR配列、
r.
i.配列番号61によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖CDR配列、および
ii.配列番号62によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つ軽鎖CDR配列、または
s.
i.配列番号63によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖CDR配列、および
ii.配列番号64によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖CDR配列を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
a.配列番号21によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列、および配列番号22によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列、
b.配列番号25によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列、および配列番号26によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列、
c.配列番号27によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列、および配列番号28によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列、
d.配列番号29によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列、および配列番号30によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列、
e.配列番号31によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列、および配列番号32によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列、
f.配列番号33によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列、および配列番号34によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列、
g.配列番号35によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列、および配列番号36によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列、
h.配列番号37によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列、および配列番号38によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列、
i.配列番号39によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列、および配列番号40によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列、
j.配列番号41によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列、および配列番号42によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列、
k.配列番号43によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列、および配列番号44によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列、
l.配列番号51によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列、および配列番号52によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列、
m.配列番号53によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列、および配列番号54によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列、
n.配列番号55によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列、および配列番号56によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列、
o.配列番号57によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列、および配列番号58によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列、
p.配列番号59によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列、および配列番号60によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列、
q.配列番号61によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列、および配列番号62によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列、または
r.配列番号63によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列、および配列番号64によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
a.配列番号21および22、
b.配列番号25および26、
c.配列番号27および28、
d.配列番号29および30、
e.配列番号31および32、
f.配列番号33および34、
g.配列番号35および36、
h.配列番号37および38、
i.配列番号39および40、
j.配列番号41および42、
k.配列番号43および44、
l.配列番号51および52、
m.配列番号53および54、
n.配列番号55および56、
o.配列番号57および58、
p.配列番号59および60、
q.配列番号61および62または
r.配列番号63および配列番号64によってそれぞれ識別された、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
a.配列番号47によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号48によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である軽鎖可変ドメイン、
b.配列番号45によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号46によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である軽鎖可変ドメイン、
c.配列番号51によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号52によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である軽鎖可変ドメイン、
または
d.配列番号61によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号62によって識別された配列に対し、少なくとも90%同一である軽鎖可変ドメインを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
a.
i.配列番号47によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖CDR配列、および
ii.配列番号48によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖CDR配列、
b.
i.配列番号45によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖CDR配列、および
ii.配列番号46によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖CDR配列、
c.
i.配列番号51によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖CDR配列、および
ii.配列番号52によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つ軽鎖CDR配列、または
d.
i.配列番号61によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖CDR配列、および
ii.配列番号62によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖CDR配列を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
a.配列番号47によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列、および配列番号48によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列、
b.配列番号45によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列、および配列番号46によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列、
c.配列番号51によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列、および配列番号52によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列、
または
d.配列番号61によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列、および配列番号62によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
a.配列番号47によって識別された重鎖可変ドメイン、および配列番号48によって識別された軽鎖可変ドメイン、
b.配列番号45によって識別された重鎖可変ドメイン、および配列番号46によって識別された軽鎖可変ドメイン、
c.配列番号51によって識別された重鎖可変ドメイン、および配列番号52によって識別された軽鎖可変ドメイン、
または
d.配列番号61によって識別された重鎖可変ドメイン、および配列番号62によって識別された軽鎖可変ドメインを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
a.配列番号49によって識別された重鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖CDR配列、および
b.配列番号50によって識別された軽鎖可変ドメインのCDR配列と比較して、最大で10個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖CDR配列を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
a)第一の抗原結合部位は、mAb1-5743、mAb1-6584、mAb1-8768、mAb1-6037、mAb1-6081、mAb1-4857、mAb1-8780、mAb1-9016、mAb1-9015、mAb1-8467、mAb1-5783、またはmAb1-5781からなる群から選択される抗体のCDRを含み、
b)第二の抗原結合部位は、mAb1-6738、mAb1-6463、mAb1-6723、mAb1-7503、またはmAb1-6097からなる群から選択される抗体のCDRを含む、多重特異性抗体。
FIX/FIXaを認識する第一のポリペプチドと、
FX/FXaを認識する第二のポリペプチドを含み、
a)第一のポリペプチドが、mAb1-5743、mAb1-6584、mAb1-8768、mAb1-6037、mAb1-6081、mAb1-4857、mAb1-8780、mAb1-9016、mAb1-9015、mAb1-8467、mAb1-5783、またはmAb1-5781の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含み、
b)第二のポリペプチドは、mAb1-6738、mAb1-6463、mAb1-6723、mAb1-7503、またはmAb1-6097の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、多重特異性抗体。
FIX(配列番号1)またはその活性型(FIXa)を認識する第一の抗原結合部位、、およびFX(配列番号2)またはその活性型(FXa)を認識する第二の抗原結合部位、を含み、ここで
第一の抗原結合部位は、FIX/FIXaのアミノ酸残基R338を含むエピトープを特異的に結合することができ、および
第二の抗原結合部位は、EGF-2ドメインおよび/またはFX/FXaの触媒サブユニットで結合することができる、多重特異性抗体。
第一の抗原結合部位は、FIX/FIXaのアミノ酸残基R338およびK341を含むエピトープを特異的に結合することができる、多重特異性抗体。
第一の抗原結合部位は、FIX/FIXaのアミノ酸残基L337、R338、S339、T340、K341およびT343を含むエピトープを特異的に結合することができる、多重特異性抗体。
ここで
第一の抗原結合部位は、FIX/FIXaのアミノ酸残基D332、R333、L337およびR338を含むエピトープを特異的に結合することができ、および
第二の抗原結合部位は、EGF-2ドメインおよび/またはFX/FXaの触媒サブユニットで結合することができる、多重特異性抗体。
第一の抗原結合部位は、FIX/FIXaのアミノ酸残基K301、D332、R333、A334、T335、R338、N346を含むエピトープを特異的に結合することができる、多重特異性抗体。
FIX/FIXaを認識する第一の抗原結合部位と、
FX/FXaを認識する第二の抗原結合部位とを含み、
ここで
第一の抗原結合部位は、FIX/FIXaのアミノ酸残基H257、K293およびN406を含むエピトープを特異的に結合することができ、および
第二の抗原結合部位は、EGF-2ドメインおよび/またはFX/FXaの触媒サブユニットで結合することができる、多重特異性抗体。
ACN:アセトニトリル
CDR:相補性決定領域
EGR-CK:EGR-クロロメチルケトン
LC-MS 液体クロマトグラフィー質量分析
FACS:蛍光活性化細胞ソーティング
FIX:凝固第IX因子
FIXa:凝固第IXa因子
FX:凝固第X因子
FXa:凝固第Xa因子
HA:血友病A
HA-PPP:HA誘発ヒト乏血小板血漿
HA-PRP:HA誘発ヒト多血小板血漿
hFIXa:ヒト凝固第IXa因子
ITC:等温滴定熱量測定
MACS:磁気活性化細胞ソーティング
OA:ワンアームド
PCR:ポリメラーゼ連鎖反応
SPR:表面プラズモン共鳴
本明細書に開示されるようなFIX/FIXa結合抗体は、様々な抗体開発方法を使用して特定された。FIXaおよびFX を標的とする多様な抗体のセットを生成するために、マウスおよびウサギの免疫化ならびにファージディスプレイおよびAdimab酵母ディスプレイからの選択が実施された。
Adimabプラットフォームは、1010の多様性を持ち、42のVHファミリーのうち20をカバーする、完全ヒトナイーブ型IgG1/カッパライブラリを包含する酵母ディスプレイシステムである。利用される抗体ファージディスプレイプラットフォームは、専有の完全ヒトFabディスプレイライブラリである。ライブラリには1010のサイズがあり、軽鎖の化学合成を利用する組み合わせ可能なアプローチ、ならびにヒト末梢血単核細胞からの重鎖CDR3のPCR増幅により相補された重鎖CDR1およびCDR2によって構築された。抗体選択プロセスは、リアルタイムで適用された選択基準を監視することを可能にするMACSおよびFACSベースの方法を使用して指示される。選択はMACSおよびFACSに基づいているため、標識された抗原(例えば、ビオチン)が必要である。ビオチン標識された活性部位阻害hFIXa(FIXa-EGR-ビオチン)、またはhFIXaの抗体媒介性固定化をを使用して選択キャンペーンを実施した。バイオレイヤー干渉法(Octet fortebio systems)を使用して、結合のヒットを評価した。
エピトープ多様性のカバレッジを最大化するために、ビオチン化FIXa-EGR、FX、活性部位阻害FXa、または抗FIXa抗体を使用した抗原捕捉を使用したパニングを含む、異なるパニング戦略を実施した。初期ヒットはファージELISAによって識別された。配列分析後、特有のヒットがクローン化され、IgG1として発現し、SPR(Biacore)またはバイオレイヤー干渉法(Octet fortebio systems)を使用してランク付けした。
マウスにおける完全ヒト抗体の生成については、Kymouse(商標)マウスHKおよびHL1.0(それぞれカッパ鎖およびラムダ鎖を利用)を使用した。抗体多様性を最大化するために、野生型マウスおよびウサギで追加免疫を実施した。
標準的なプロトコルを使用して、マウスまたはウサギをFIXa、FIXa-EGR、またはFXで免疫化した。マウスまたはウサギで生成された抗体を、ELISAでスクリーニングした。FIXa結合ウサギB細胞は、ランダムにビオチン化されたFIXa-EGRを使用してFACSソーティングされた。ウサギおよびマウスからの抗体ヒットは、組み換えで発現(ウサギmAbs)または繁殖(マウスハイブリドーマ)のいずれかであり、続いて抗体は小規模精製された。
Kymouseマウスおよびウサギは、標準または複数部位での反復免疫(RIMMS)プロトコルを用いてFXで免疫化した。ウサギB細胞を、ランダムにビオチン化されたFXを使用してFACSソーティングにより単離した。融合およびソーティングからの抗FX mAbは、ELISAおよびOctet fortebio systemsを使用してスクリーニングされた。
Kymouseのマウスまたはwtマウスに由来するハイブリドーマを産生する抗FIXaおよび抗FX抗体を配列決定し、標準技術を使用してHEK293細胞に発現した。Octet fortebio systemsを使用して、発現抗体の結合を評価した。
抗体および抗体Fab断片は、製造業者の指示に本質的に従って、HEK293懸濁細胞(293Expi、Invitrogen)の一過性導入を使用して発現された。293Expi細胞は典型的には、1%のP/S(GIBCOカタログ番号15140-122)で補充されたExpi293F発現培地(Invitrogen、カタログ番号A1435104)で、3~4日ごとに継代培養された。Expi293F細胞は、Expifectamineを使用して2.5~3mill/mLの細胞密度でトランスフェクトされた。Expi293F細胞の各リットルについて、合計1 mgのプラスミドDNA(VH-CH1(Fab)またはVH-CH1-CH2-CH3(mAb)およびLCプラスミドを1:1の比で)を、50mLのOptimem(GIBCO、カタログ番号番号51985-026、希釈A)に希釈することによって、および2.7mLのExpifectamineを50mLのOptimem(希釈B)に希釈することによって、トランスフェクションを実施した。同時導入を産生するFabおよびmAbの場合、VH-CH1およびLCプラスミド(Fab)ならびにVH-CH1-CH2-CH3およびLCプラスミド(mAb)をそれぞれ1:1の比で使用した。希釈AおよびBを混合し、室温で10~20分間インキュベートした。この後、導入混合物をExpi293F細胞に加え、細胞を軌道回転(85~125 rpm)を有する加湿インキュベーター中で、37℃でインキュベートした。導入一日後、導入された細胞を、5mlのExpiFectamine293トランスフェクションエンハンサー1および50mlのExpiFectamine293トランスフェクションエンハンサー2で補充した。細胞培養上清は、遠心分離によって導入4~5日後に典型的に回収し、濾過した。
Fab精製および特徴付け
Fab分子の精製は、kappaSelect樹脂(GE Healthcare、カタログ番号17-5458-11)を使用したアフィニティークロマトグラフィー、およびSuperdex200樹脂(GE Healthcare、カタログ番号17-1043-04)を使用した分子ふるいクロマトグラフィーから構成される2ステップのプロセスとして実施された。精製は、AktaExplorerクロマトグラフィーシステム(GE Healthcare、カタログ番号18-1112-41)を使用して行われた。アフィニティ精製工程に使用される緩衝液システムは、20mMのリン酸Na pH7.2、150mMのNaclで構成される平衡緩衝液、10mMのギ酸pH3.5で構成される溶出緩衝液、および0.4Mのリン酸Na pH9.0で構成されるpH調節緩衝液であった。細胞上清は、予め平衡化されたkappaSelect SuReカラムを調整することなく直接適用された。カラムを10カラム容積の平衡緩衝液で洗浄し、Fab分子を溶出緩衝液の約5カラム容積で均一濃度で溶出した。プールした画分のpHは、溶出直後に、記述されたpH調節緩衝液を使用して中性に調節された。Fab分子をさらに精製し、カラム内で予め包装された該ゲル濾過樹脂を用いて緩衝液を交換した。分子ふるいクロマトグラフィで使用されるランニング緩衝液は、25mMのHEPESおよび150mMのNacl、pH7.4であった。Fab分子は、約0.5カラム容積で単一ピークとして溶出した。ピークをカバーする画分は、BIOSep-SEC-S3000 300×7.8mmカラム(Phenomenex、カタログ番号00H-2146-K0)、ならびに200mMのリン酸Na pH6.9、300mMのNacl、および10 %のイソプロパノールで構成されたランニング緩衝液を用いた、Agilent LC 1100/1200システム上の分子ふるい高性能液体クロマトグラフィー(SE-HPLC)法を使用して分析した。この分析に基づき、画分をプールして均質なタンパク質調製を得た。最終調製物は、1ml/分の流量で約10分の保持時間で、単一の対称ピークとして溶出した。
抗体の精製は、Protein A MabSelect SuRe樹脂(GE Healthcare、カタログ番号17-5438-01)を用いたアフィニティークロマトグラフィで行われた。精製は、AktaExplorerクロマトグラフィーシステム(GE Healthcare、カタログ番号18-1112-41)を使用して行われた。アフィニティ精製工程に使用される緩衝液システムは、20mMのリン酸Na pH7.2、150mMのNaclで構成される平衡緩衝液、10mMのギ酸pH3.5で構成される溶出緩衝液、および0.4Mのリン酸Na pH9.0で構成されるpH調節緩衝液であった。細胞上清は、予め平衡化されたMabSelect SuReカラムを調整することなく直接適用された。カラムを10カラム容積の平衡緩衝液で洗浄し、抗体を溶出緩衝液の約2~5カラム容積で均一濃度で溶出した。プールした画分のpHは、溶出直後に、記述されたpH調節緩衝液を使用して中性に調節された。
FXに対するFIXaの酵素活性を刺激することができるとして選択された抗体は、ビニング実験で解析され、以下に記載の方法を使用して特定された抗体の結合特性を決定した。
ビニング実験は、抗ヒトIgGセンサー(Pall Life Sciences、米国カリフォルニア州メンローパーク)を備えたOctet fortebioシステム(HTX、Red384)、および8または32チャネルモード(Red384およびHTX)を使用して実施された。ビニングアッセイは、古典的なサンドイッチエピトープビニングの設定を使用して実施された。簡潔に述べると、(1)一次抗体は、抗ヒトAHCチップ(抗ヒトIgG Fc捕捉チップ(AHC部品番号18-5064)により捕捉され、(2)AHCチップ上の非ブロックIgG結合部位は、ヒトポリクローナルIgG(I4506 SIGMA社)によってブロックされ、(3)FIXaは一次抗体に結合しており、(4)競合する抗体がチップ上の抗体-抗原複合体に提示され、二次抗体の結合が検出されない場合、抗体は同じビンに属すると評価された。
分析は、それぞれ抗体mAb0-1886およびmAb1-1307によって定義される二つの異なるビン、ビン1および2を特定した。
本実施例でデータが提供される抗体変異体は、実施例5で提供される親抗体-FIXa複合体の結晶構造に基づいて、エピトープ認識に重要であることが示された位置にアミノ酸置換を含まないため、当業者であれば、開始点としての変異体が同じビンに属し、結合について競合し、それらが由来する抗体、すなわち、mAb0-1998、mAb0-1886、またはmAb1-1307と少なくとも同じホットスポット残基を、FIX/FIXaエピトープ内に認識することを理解するであろう。
結晶化に使用されるFIXaタンパク質(Cambridge Protein Works、プロダクトコード10316)は、細菌発現の結果としてN末端に結合した非天然メチオニン残基を有する切断型軽鎖(配列番号1の残基85~142)、および配列番号1の残基181~415を含有する重鎖で構成される。プロテアーゼの活性部位は、EGR-クロロメチルケトンによって遮断される。
Fab0-7237:FIXa
FIXaタンパク質と1対1モル比で混合したFab0-7237(mAb0-1886に対応するFab断片)の結晶を、18 °Cでハンギングドロップ蒸気拡散法で成長させた。20mMのTris-Hcl、pH7.4、50mMのNaCl、および2.5mMのCaCl2 中の0.8μl 7.5mg/mlのタンパク質溶液を、等量の4Mギ酸ナトリウムと沈殿剤として混合し、1mlの沈殿剤でインキュベートした。
FIXaタンパク質と1対1モル比で混合したFab0-7238(mAb0-1998に対応するFab断片)の結晶を、18°Cでシッティングドロップ蒸気拡散法で成長させた。20mMのTris-Hcl、pH7.4、50mMのNaCl、および2.5mMのCaCl2中の0.1μl 6.2mg/mlのタンパク質溶液を、0.1μlの100mMカコジル酸ナトリウム、pH 6.5および1 Mクエン酸三ナトリウムと沈殿剤として混合し、60μlの沈殿剤でインキュベートした。
FIXaタンパク質と1対1モル比で混合したFab0-7236(mAb1-1307に対応するFab断片)の結晶を、18°Cでシッティングドロップ蒸気拡散法で成長させた。20mMのTris-Hcl、pH7.4、50mMのNaCl、および2.5mMのCaCl2中の0.1μl 6.4mg/mlのタンパク質溶液を、等量の0.2Mの硫酸リチウム、40(v/v)%のPEG400、および0.1MのTris pH 8.5と沈殿剤として混合し、1mlの沈殿剤でインキュベートした。
Fab0-7237:FIXa
結晶は、液体窒素でフラッシュ冷却する前に、3Mのギ酸ナトリウム、4%のグリセロール、4%のエチレングリコール、4.5%のスクロース、および1%のグルコースからなる溶液中で凍結保護された。回折データを、DectrisのPilatus2M画素検出器を使用して、Swiss Light SourceビームラインX06DA(1.0000Å波長)で100Kで収集した。データの自動インデックス、統合およびスケーリングは、XDSパッケージからのプログラムで実行された(回析データ統計を表1に要約する)。
結晶は、液体窒素でフラッシュ冷却する前に、75mMのカコジル酸ナトリウム pH6.5、および0.75Mのクエン酸三ナトリウム、4%のグリセロール、4%のエチレングリコール、4.5%のスクロース、および1%のグルコースからなる溶液中で凍結保護された。回折データを、DectrisのPilatus2M画素検出器を使用して、Swiss Light SourceビームラインX06DA(1.0000Å 波長)で100Kで収集した。データの自動インデックス、統合およびスケーリングは、XDSパッケージからのプログラムで実行された(回析データ統計を表1に要約する)。
三つの結晶は、液体窒素中のフラッシュ冷却の前に、0.15Mの硫酸リチウム、30(v/v)%のPEG400、および0.075MのTris pH8.5、4%のグリセロール、4%のエチレングリコール、4.5%のスクロース、および1%のグルコースからなる溶液中で凍結保護された。回折データを、DectrisのPilatus2M画素検出器を使用して、Swiss Light SourceビームラインX06DA(1.0000Å波長)で100Kで収集した。データの自動インデックス、統合、併合およびスケーリングは、XDSパッケージからのプログラムで実行された(回析データ統計を表1に要約する)。
Fab0-7237:FIXa
構造は、タンパク質データバンクエントリ4NP4のH鎖およびL鎖、ならびにタンパク質データバンクエントリ3KCGのH鎖およびL鎖を含むプログラムスイートPhenixで実装されたPhaserを使用した分子置換によって決定された。非対称ユニットは、二つのFab:FIXa複合体を含む。モデルは、COOTにおいて、Phenix改良および手動再構築の工程を使用して改良された。改良統計が表1に示される。
構造は、タンパク質データバンクエントリ4PUBのH鎖およびL鎖、ならびにタンパク質データバンクエントリ3KCGのH鎖およびL鎖を含むプログラムスイートPhenixで実装されたPhaserを使用した分子置換によって決定された。非対称ユニットは、二つのFab:FIXa複合体を含む。モデルは、COOTにおいて、Phenix改良および手動再構築の工程を使用して改良された。改良統計が表1に示される。
上記のFab0-7238:FIXa複合体の複雑な構造のFab部分とタンパク質データバンクエントリ3KCGからのH鎖およびL鎖を含むプログラムスイートPhenixで実装されたPhaserを使用した分子置換により、構造を決定した。非対称ユニットは、一つのFab:FIXa複合体を含む。モデルは、COOTにおいて、Phenix改良および手動再構築の工程を使用して改良された。改良統計が表1に示される。
上記に基づき、mAb0-1998、mAb1-1307、およびmAb0-1886が、エピトープが抗体の重原子から3.5Åの距離内で少なくとも一つの重原子を有する残基として定義される、FIXa上の異なるエピトープに結合することが見出された。
上記実施例4および以下の特定の実施例でデータが提供される抗体変異体は、本実施例で提供される親抗体-FIXa複合体の結晶構造に基づいて、エピトープ認識に重要であることが示された位置にアミノ酸置換を含まないため、当業者であれば、開始点としての変異体が同じビンに属し、結合について競合し、それらが由来する抗体、すなわち、mAb0-1998、mAb0-1886、またはmAb1-1307と少なくとも同じホットスポット残基を、FIX/FIXaエピトープ内に認識することを理解するであろう。
二価抗FIX/FIXa抗体のFXに対するFIXaの酵素活性への刺激効果は、Scheiflingerら、(2008)J Thromb Haemost、6:315-322により説明された原理による血液凝固リン脂質膜の存在下でFIXaによるFX活性化を促進する能力から決定された。Scheiflingerらによって特定された抗体中で抗FIXa抗体224F3の高い活性を考えると、224F3は、以下の実験の参照として選択された(224F3構造の情報のための実施例1を参照)。
従来的な単一特異性および二価抗体、例えば、FXa生成アッセイ(実施例8)および特定のSPR実験(実施例14および15)に関連する潜在的なアビディティー効果を避けるために、一価のワンアームド(OA)抗体型を使用した。Martensら。A Novel One-Armed Anti-c-Met Antibody Inhibits Glioblastoma Growth In vivo.Clin.Cancer Res.12、6144-6152(2006)に記載されるように、全重鎖、切断型重鎖(Fab領域を欠く)および軽鎖は共発現される。Martensらによって記述された三つの鎖の共発現の代わりに、本発明では、二重特異性抗体ついて記載されたDuobody(登録商標)を使用して、一価抗体を調製した(実施例10)。したがって、一価抗体は、完全単一特異性および二価抗体と、切断型重鎖二量体(正式にはFab領域を除去することにより完全な抗体に由来する)を混合することにより調製され、実施例10に記載される同じ実験条件下で鎖の交換を進めることができた。一価抗体の形成には、実施例10に記載されるように、抗体および切断型重鎖二量体が、ヘテロ二量体化を促進するために適切な相補的変異を持っていることが必要である、すなわち、IgG1に対してF405L/K409R、およびIgG4に対してF405L+R409K/WT。
従来の抗体型の二価の結果として生じる潜在的なアビディティー効果を避けるために、FXに対するFIXa酵素活性の抗FIX/FIXa抗体の刺激活性が、一価のワンアームド(OA)抗体型への再フォーマット後に決定された(実施例8参照)。試験した抗体を以下の表4に示す。実施例7でも参照される抗FIXa抗体224F3(mAb1-1582と表示)の一価OAバージョンは、比較のために含めた。
要約すると、刺激指数の計算について以下のように説明することができる。
刺激指数=((AFIXa +OA - Abckg)/[FIXa]total)/AFIXa、norm
式中、AFIXa+OAは、OA抗体の存在下で測定される活性であり、Abckgは、FIXaおよび一価抗体の非存在下で測定されるバックグラウンド活性であり、[FIXa]totalは、アッセイのFIXa濃度であり、AFIXa、normは、遊離FIXaの平均正規化活性である。
アッセイで、OA抗体で飽和したFIXaの割合は、FIXaとOA抗体の濃度、およびそれらの相互作用を支配する平衡解離定数(Kd)によって決定される。後者は、等温滴定熱量測定(ITC)などの当分野で公知の技術によって測定することができる。
抗FIX mAb IDは、OA形式への再フォーマットに使用される抗体のIDを指す。「OA抗体濃度(nM)」および「刺激指数」と表示した列は、アッセイで使用されるOA抗体(nM)の濃度および遊離FIXaに対して測定されたFIXa活性の対応する刺激を示す。
本明細書に開示される抗FX/FXa抗体は、標準抗体開発方法を使用して開発され、発現プラスミドは、抗FIX/FIXa FabおよびmAb発現プラスミドについて実施例1に記載されるように調製された。実施例2および3の抗FIX/FIXa抗体について記載されるように、抗FX/Xa抗体の発現、精製および特徴付けを同様に行った。
二重特異性抗体は、二重特異性IgG1抗体について記載した(Labrijnら、PNAS、2013、vol.110、pp.5145-5150)Duobody(登録商標)法(Genmab)による一次および二次抗体のインビトロアセンブリによって、以下に詳述される二重特異性IgG4抗体のわずかに改変された変異体を使用して生成される。
IgG4の場合、一次抗体の重鎖定常領域はIgG4 S228P(抗FIX/FIXa)であり、二次抗体の重鎖定常領域はIgG4 S228P F405L R409K(抗FX)である。二つの親抗体は、実施例1~3に記載されるように産生される。Fabアーム交換反応は、75mMの2-メルカプトエチルアミン(2-MEA)を使用した還元条件下でHEPES緩衝液(pH7.4)中で実施され、30°Cで3時間インキュベートされる。
抗FIXa抗体と抗hFX抗体との対は、上記のDuobody(登録商標)技術の手段により、二重特異性抗体に作製された(実施例10)。二重特異性抗体は、以下の段落に記載されるように、上述のFXa生成アッセイ(実施例6)およびトロンビン生成試験(TGT)などの様々なアッセイにおける血液凝固活性について試験された。
TGTは、カオリントリガーを使用した自動化HTP 384ウェルセットアップで行われた(Haemonetics Corporation、#6300)。簡潔に述べると、抗体を111nMの濃度で(55nMで追加されたmAb1-1371および166nMで追加されたmAb1-0021を除き)血友病A(HA)プラズマ(George King)に加えた。次いで、リン脂質(Rossix、#PL604T)と混合したカオリンを加え、その後FIIa基質を添加した(FluCa、Thrombinoscope、#TS50.00)。蛍光を、1分間隔で2時間、Perkin Elmer EnVisionのマルチラベルプレートリーダー上で測定した。ピークの高さは、トロンボグラムで観察された最大値として計算され、その後、参照抗FIXaおよび抗FX抗体について観察されたピークの高さに正規化した。参照には常に、mAb1-4707、mAb1-5788およびmAb1-4857で表される三つのファミリーの各々からのFIXドメインと組み合わせて、抗FX抗体mAb1-2375(配列番号93および94により識別)からの結合ドメインが含まれる。抗体を、低い(0~24%)、+(24~50%)、++(50%~75%)および+++(>75%)として相対的TGT-活性にしたがってグループ化し、+が好ましく、++がより好ましく、+++は最も好ましい。
三つの系統mAb1-1307、mAb0-1886およびmAb0-1998に属する抗FIXa抗体変異体と組み合わせて、多数の抗FX抗体を二重特異性抗体として試験した。TGTアッセイにおける有意な活性を示す抗FIXa/抗FX対の選択された組み合わせを表5に示す。
選択された抗FIXa/抗FX二重特異性抗体の対は、TGTアッセイ中でその活性と共に示される(上述のように)。二重特異性抗体(Duobody)は、IgG1であったIgG1-0021、mAb1-1335、およびmAb1-0985を除き、IgG4サブタイプであった。
抗hFIXa抗体(実施例11)と組み合わせた二重特異性抗体型における有意なTGT活性を示す特定の抗FX抗体は、FIXaをFXで置換することを除いて、抗FIXa抗体(実施例4)について説明したものと同じセットアップを使用するOctet fortebio systemsを使用して、互いにビニングした。
選択された抗FX抗体は互いにビニングされ、五つの異なるビン(ビンA-E)が特定された。数字は抗体IDを指し、例えば1-6723はmAb1-6723を示す。
結晶化
Fab0-8954(mAb1-6723に対応するFab断片)をFXと複合体で結晶化する試みは失敗したが、活性部位阻害FXaを有する良質な結晶が得られた。したがって、活性部位阻害des-gla FXa(ヒトEGR阻害因子Xa glaドメインレス(野生型)細菌発現、Lot# hGDFXAEGR-022、Cambridge ProteinWorks)と1:1モル比で混合されたFab0-8954の結晶は、18℃でシッティングドロップ蒸気拡散技術を使用して成長させた。20mMのTris-HCl、pH7.4、50mMのNaCl、および2.5mMのCaCl2中の、150nlの6.7mg/ml複合体のタンパク質溶液は、沈殿剤として、50nlの0.2Mの酢酸マグネシウム、0.1Mのカコジル酸ナトリウム、pH6.5、20%(w/v)のPEG 8000と混合し、60μlの沈殿剤を介してインキュベートした。
結晶は、液体窒素でフラッシュ冷却する前に、結晶化ドロップに20%のエチレングリコールを加えた1μlの沈殿剤の添加により凍結保護した。回折データを、DectrisのPilatus2M画素検出器を使用して、Swiss Light SourceビームラインX06DA(1.0000Å波長)で100Kで収集した。データの自動インデックス、統合およびスケーリングは、XDSパッケージからのプログラムで実行された(回析データ統計を表7に要約する)。
非対称ユニットは、Matthews係数解析から判断された四つのFab:FXa複合体を含む。構造は分子置換によって決定された。プログラムスイートPhenixに実装されたPhaserは、四つのFabを局在化する検索モデルとして、タンパク質データバンク入力5I1KのH鎖とL鎖と併用された。これらは、COOT を使用して正しいアミノ酸配列を用いて構築され、その後Phenix改良を使用して改良された。検索モデルとしてタンパク質データバンク入力1G2LからのA鎖およびB鎖を用いて、CCP4スイートからMolrepで分子置換を適用しながら、改良されたFabモデルは修正された。四つのFXa断片が見つかった。モデルは、COOTにおいて、Phenix改良および手動再構築の工程を使用して改良された。改良統計が表7に示される。
Fab0-8954:FXa複合体の結晶構造は、非対称なユニット内に複合体の四つのコピーを持ち、これらを個別に分析して、3.5Åカットオフ距離を使用してエピトープおよびパラトープを特定した。
FX/FXa(配列番号2)のEGF-2およびプロテアーゼドメインにおけるmAb1-6723のエピトープ残基を、それぞれ第一および第二の列に列挙する。抗体VH(配列番号21)およびVL(配列番号22)のパラトープ残基は、それぞれ列3および4に列挙されている。
本明細書の実施例でデータが提供される抗体変異体は、本実施例で提供される親抗体-FXa複合体の結晶構造に基づいて、エピトープ認識に重要であることが示された位置にアミノ酸置換を含まないため、当業者であれば、開始点としての変異体が同じビンに属し、結合について競合し、それらが由来する抗体、すなわち、mAb1-6723と少なくとも同じホットスポット残基を、FX/FXaエピトープ内に認識することを理解するであろう。
実施例15に記載されるように、mAb1-1307、mAb0-1886およびmAb0-1998に対するFIX上のホットスポットエピトープ残基のマッピングと同様に、本実施例に提供されるデータは、mAb1-6723のFX上のホットスポットエピトープ残基を決定する。使用したFX変異体は、短いGSリンカー(GGGGSGGGGS)を介してN末端Hisタグ(HHHHHH、アフィニティー精製用)が付加されている、配列番号2の残基86~448に対応する、desGla-desEGF1-FXの単一部位アラニン変異体(野生型のアラニンであり、アラニンからセリンへの置換が導入された位置118を除く)である。実施例13に定義されるエピトープ残基をカバーする変異体を表9に列挙する。
表9-生成されたdesGla-desEGF1-FX変異体のリスト
結合(%)= 100% × [(Rmax_FXvar,Ab)/(Rmax_Ab)] / [(Rmax_FXwt,Ab)/(Rmax_Ab)]
式中、Rmax_Ab は抗FX抗体の捕捉レベル(RU)を表し、Rmax_FXvar、Abおよび Rmax_FXwt、Ab は捕捉抗FX抗体への同じ濃度(すべての濃度は5μM、Y230A変異体のみ10μM)でのFX変異体および野生型の結合(RU)をそれぞれ表す。結果を表10に示す。
mAb1-6723のエピトープ残基をカバーする選択されたFX変異体へのmAb1-6723結合の一価変異体のSPR解析の結果。
mAb1-6723のホットスポット残基は、野生型残基のアラニンによる置換(またはアラニンをセリンで置換した位置118)が、5μMのWT(または変異体)desGLA-desEGF1-FXの濃度での抗体の野生型FXへの結合と比較して、抗体の結合を30%以下に減少させる位置として定義される。
R113、Y230、K420、D423、R424およびK427
抗FIX/FIXa Abs、mAb0-1886、mAb0-1998およびmAb1-1307とFIX の間の相互作用(ホットスポットと呼ばれる)に対して重要な残基を決定するために、対応するFab断片と複合するFIXaの結晶構造に基づいて、FIX変異体一式が選択された(それぞれFab7237、Fab7238 およびFab7236)。以下に詳述するように、選択されたFIX変異体は哺乳類細胞で一時的に発現され、表面プラズモン共鳴(SPR)を使用してmAb0-1886、mAb0-1998およびmAb1-1307の一価変異体への結合に関して、精製され、特徴付けられた。
一過性哺乳類発現に適したDNAプラスミドは、ヒトFIXのアミノ酸残基1-461をコードする発現カセット(UNIPROTナンバリングによるT194A変異を除き、配列番号1のT148Aに対応)と、それに続く六つのヒスチジン(6×His-タグ、アフィニティー精製用)で構築された。この構築物を使用して産生された分泌型の成熟FIXタンパク質鎖は、C末端His-タグの追加を除き、ヒトFIX(Ansonら。EMBO J.1984 3:1053-1060、McGrawら、Proc Natl Acad Sci USA.1985 82:2847-2851)のA148対立遺伝子型と同一である。
FIX変異体へのアミノ酸置換の導入が不安定化と不適切なフォールディングにつながるかどうかをテストするために、変異体の熱変性遷移の中間点(Tm)を決定した。
FIX変異体は、C末端Hisタグを介してFIX変異体を捕捉することにより、表面プラズモン共鳴(SPR)を使用したmAb0-1886、mAb0-1998およびmAb1-1307への結合に関して特徴付けられた。従来の二価抗体に関連する潜在的なアビディティー効果を避けるために、すなわち、1:1相互作用を確保するために、それぞれmAb4-0673、mAb4-0004およびmAb3-3279と表記されるmAb0-1886、mAb0-1998およびmAb1-1307の一価変異体(実施例7に記載したように調製された)を分析物として使用した。
式中、Rmax_FIXvarおよびRmax_FIXwtは、FIX変異体および野生型FIXの捕捉レベル(RU)をそれぞれ表し、またRmax_Ab、FIX_varおよびRmax_Ab、FIX_wtは、抗体の捕捉されたFIX変異体および野生型FIXへの結合(RU)をそれぞれ表す。結果を表12に示す。
mAb1-1307、mAb0-1998およびmAb0-1886のエピトープ残基をカバーする選択されたFIX変異体へのmAb3-3279、mAb4-0004、およびmAb4-0673(それぞれmAb1-1307、mAb0-1998およびmAb0-1886の一価変異体)の結合のSPR分析の結果。
mAb1-1307、mAb0-1998およびmAb0-1886のホットスポット残基は、野生型残基のアラニンによる置換が、抗体の野生型FIXへの結合と比較して、抗体の結合を30%以下に減少させる位置として定義される。
H257、K293、およびN406
R338およびK341
D332、R333、L337およびR338
抗FIXa/FX二重特異性抗体の血液凝固活性は、血液凝固リン脂質膜の存在下で、FIXaによるFX活性化を促進する能力に基づいて決定された。試験された二重特異性抗体(BiAb)を表13に記載し、ACE910は比較のために含めた。
各二重特異性抗体の血液凝固活性は、所与の抗体濃度での遊離FIXaによるFX活性化に対する何倍かの刺激として報告される。二重特異性抗体は、アッセイ緩衝液(50mMのHEPES、100mMのNacl、5mMのCaCl2、0.1%(w/v)のPEG8000、pH7.3 + 1 mg/ml BSA)中で、125pMのヒト血漿由来FIXa(Haematologic Technologies Inc、米国)および500μM 25:75のホスファチジルセリン:ホスファチジルコリン脂質ベシクル(Haematologic Technologies Inc、米国)と共に10分間のプレインキュベーションにより、8濃度(アッセイ緩衝液での三倍段階希釈で作製)で試験された。次いで、ヒト血漿由来FX(Haematologic Technologies Inc、米国)を、25nMの濃度に加えることにより、活性化が開始された。室温で15分の活性化後、反応物(50μl)を25μlの冷却緩衝液(50mMのHEPES、100mMのNacl、60mMのEDTA、0.1%のPEG8000、pH7.3+1 mg/mlのBSA)の添加によりクエンチした。25μlの2mM S-2765発色基質(Chromogenix、スウェーデン)を添加し、マイクロプレートリーダーで405nmの吸光度測定(ΔOD/分)により発色基質変換を測定することによって、生成されるFXaの量を決定した。同様に、遊離FIXaによるFX活性化は、25nMのFIXa濃度および60分の反応時間で決定された。
測定された活性は、アッセイに存在するFIXaの濃度および反応時間にしたがって正規化された。この数を、抗体の非存在下での同様に正規化されたFXa生成の割合で割ることにより、所与の濃度での抗体による何倍かの刺激を計算した。
BiAb刺激=(AFIXa+biAb/([FIXa]assay×treaction))/AFIXa、norm
式中、AFIXa+biAbは、二重特異性抗体の存在下で測定された活性であり、[FIXa]assayは、アッセイ中のFIXa濃度であり、treactionは、反応時間であり、AFIXa、normは、遊離FIXaの正規化活性である。
表13-二重特異性抗FIXa/FX抗体による最大刺激
二重特異性抗体mAb4-7761、mAb4-7762、mAb4-7789、mAb5-0057、およびmAb5-1409(表14 を参照)の血液凝固活性は、血液凝固合成リン脂質膜または血小板のいずれかの存在下でのトロンビン生成を促進する能力に基づいて決定され、これはHemkerらにより説明された原理による(Pathophysiol Haemost Thromb、2002;32:249-253)。ACE910は比較のために含めた。各抗体(試験化合物)は、プールされた血友病A(HA)患者の乏血小板血漿(HA-PPP)および/またはHA誘発ヒト多血小板血漿(HA-PRP)でトロンビン生成試験(TGT)を試験した。
血液は、静脈穿刺によって健康的な同意ドナーから得た。6容量の血液を1容量のクエン酸デキストロース(ACD;85mMのクエン酸ナトリウム、110mMのデキストロース、62.3mMのクエン酸、pH4.9)最終pH6.5に収集し、室温(RT)で220gで20分間遠心分離した。多血小板血漿(PRP)を採取し、Medonic CA 620血液分析器(Boule Diagnostics AB、SpÅnga、スウェーデン)を用いて血小板濃度を決定した。血漿部分を含有する赤血球を、室温で600gでさらに10分間遠心分離した。乏血小板血漿(PPP)を採取し、300,000血小板/μlに希釈したPRPに使用した。HA条件は、最終濃度0.1mg/mlにFVIII-中和抗ヒトFVIII 抗体(ヒツジ抗ヒト第VIII因子-5mg、Haematologic Technologies、VT、米国)を添加することによって誘発され、室温で30分間、2rpmで穏やかに回転された。
HA-PRPおよびHA-PPP(George King Bio-Medical Inc、KS、米国)のトロンビン生成試験(TGT)を、96ウェルプレート蛍光光度計(Fluoroscan Ascent FL、Thermolabsystems、Helsinki、フィンランド)を使用して、標準較正自動化されたトロンボグラフィーにより実施した。反応混合物は、70μl HA-PRP(300,000血小板/μl)またはHA-PPP、10 μlの試験化合物希釈(20mMのHEPES、140mMのNaCl、pH7.4、2%のBSAmに希釈)、組織因子(TF)を含む20μlのCAT試薬(PRP試薬;合成リン脂質を含まないTF、PPP試薬LOW;合成リン脂質を含むTF、1pMのTF最終、Thrombinoscope BV、Maastricht、オランダ)またはThrombin Calibrator(Thrombinoscope BV)、ならびに蛍光標識されたトロンビン基質z-Gly-Gly-Arg-AMC(3 mM)およびCaCl2(90 mM)(Thrombinoscope BV)を含む20μlの混合物を含む。TGTは、最大8濃度の試験化合物(0.3、1.0、3、10、30、100、300、および900nM、最終血漿濃度)または追加緩衝液(20mMのHEPES、140mMのNaCl、pH7.4、2%のBSA)のみ(HA対照を表す)で実施された。濃度範囲は、HA-PPPにおける少なくとも三つの独立した実験で、同じストックから、または異なる四人のドナーからの血液中で試験された。TGT中の正常な対照レベルを、未処理のヒトPRPまたはCRYOcheck(商標)でプールした正常ヒトPPP血漿(Precision Biologic Inc.、Dartmouth、カナダ)を添加した緩衝液(20mMのHEPES、140mMのNaCl、pH7.4、2%のBSA)のみを使用して測定した。TGTを合計90分間進行させ、TGTパラメーターのピークトロンビン高さ(nM)をThrombinoscopeソフトウェア(Thrombinoscope BV)で解析した。
表15- 二重特異性抗体mAb4-7761、mAb4-7762、mAb4-7789、mAb5-0057、mAb5-1409およびACE910のトロンビン生成試験(TGT)
ヒト組織因子活性化血友病A乏血小板血漿(PPP)における二重特異性抗体mAb4-7761、mAb4-7762、mAb4-7789、mAb5-0057、mAb5-1409、およびACE910のトロンビン生成試験(TGT)。HA-PPPの少なくとも三つの独立した実験で、試験された各化合物濃度で測定した平均ピークトロンビン生成レベル±標準偏差。実験A~Dは、図2の凡例に記載された独立した実験を意味する。
ヒト組織因子活性化血友病A多血小板血漿(PRP)の二重特異性抗体mAb5-0057、mAb5-1409、およびACE910のトロンビン生成試験(TGT)。HA-PRPの四つの独立した実験から試験された各化合物濃度での平均ピークトロンビン生成±標準偏差。
mAb1-9016の一価ワンアームド(OA)バージョンの血液凝固活性は、血液凝固リン酸脂質膜の存在下でのトロンビン生成を促進する能力に基づいて決定され、これはHemkerらにより説明された原理による(2002)Pathophysiol Haemost Thromb、32:249-253。224F3抗体(mAb1-1582)のワンアームドバージョンを、比較のために含めた。各抗体(試験化合物)は、96ウェルプレート蛍光光度計(Fluoroscan Ascent FL、Thermolabsystems、Helsinki、フィンランド)を使用して、標準較正自動化されたトロンボグラフィーにより、プールされた血友病A(HA)患者の乏血小板血漿(HA-PPP)(George King Bio-Medical Inc、KS、米国)でトロンビン生成試験(TGT)を試験した。反応混合物は、70μlのHA-PPP、10μlの試験化合物(20mMのHEPES、140mMのNaCl、pH7.4、2%のBSAmに希釈)、活性化ヒト血漿由来第XI因子(hFXIa、8.3 mU/mL最終)(Enzyme Research Laboratories、IN、米国)含有の20μlのPRP試薬(合成リン脂質、Thrombinoscope BV、Maastricht、オランダ)またはThrombin Calibrator(Thrombinoscope BV)、ならびに蛍光標識されたトロンビン基質Z-Gly-Gly-Arg-AMC(3 mM)およびCaCl2(90 mM)(Thrombinoscope BV)を含む20μlの混合物を含む。TGTは、5濃度の試験化合物(30、100、300、600および900nM、最終血漿濃度)または追加緩衝液(20mMのHEPES、140mMのNaCl、pH7.4、2%のBSA)のみ(HA対照を表す)で実施された。濃度範囲は、同じストックからのHA-PPPで、二つの独立した実験で試験された。TGTを合計90分間進行させ、TGTパラメーターのピークトロンビン高さ(nM)をThrombinoscopeソフトウェア(Thrombinoscope BV)で解析した。図4および表17は、試験された濃度の各一価ワンアームド抗体に対する測定されたピークトロンビン生成率を示す/列挙する。データは、mAb1-9016のOA抗体バージョンが、抗体の非存在化下で観察されたレベルを超えてトロンビン形成のピークを増加させることを示し、すなわち、血液凝固活性を示す。さらに、mAb1-9016のOA抗体バージョンによって誘発されるトロンビン生成は、224F3抗体(mAb1-1582)の一価OAバージョンで観察されたものよりも高い。
FIX/FIXaおよびFX/FXaに結合する抗FIX/FIXa抗体および抗FX/FXa抗体の結合親和性は、それぞれPEAQ-ITC熱量計(Malvern、英国)を使用して、等温滴定熱量測定(ITC)によって測定される。実験は、25mMのTris、150mMのNaCl、5mMのCaCl2(Tris-緩衝液)を使用して、37℃およびpH7.4で行われる。サンプルセル(200μl)には、FIX、FIXa、FX、またはFXaのいずれかが含まれ、抗FIX/FIXaおよび抗FX/FXa抗体がシリンジを介して注入される。一致した緩衝液条件を確保するために、測定前にすべてのタンパク質をTris緩衝液中で広範囲に透析する。熱平衡工程に続いて60秒の遅延があり、その後、抗体の最初の0.2μlの注入、その後120秒間隔で2.5μlの抗体の注入を14回行った。攪拌速度は750rpmで維持され、参照電力は5~10μcal/秒で一定に保たれる。抗体の各注入に伴う熱を統合し、リガンドと高分子のモル比に対してプロットする。得られた等温線は、製造業者によって提供されるソフトウェアを使用して、親和性(KD)、化学量論(n)、および相互作用のエンタルピー(ΔH)を得るために、一部位結合モデルに適合される。実験は二重または三重で実施された。
Claims (10)
- FIX(配列番号1)および/またはその活性型(FIXa)に結合することができる第一の抗原結合部位、ならびにFX(配列番号2)および/またはその活性型(FXa)に結合することができる第二の抗原結合部位を含む、FXに対するFIXaの酵素活性を刺激することができる多重特異性抗体またはその抗原結合性断片であって、
前記第一の抗原結合部位が、FIX/FIXaのアミノ酸残基R338およびK341を含むエピトープに結合することができ、
前記第二の抗原結合部位が、FX/FXaのアミノ酸残基R113、Y230、K420、D423、R424およびK427を含むエピトープに結合することができる、多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。 - 前記第一の抗原結合部位が、FIX/FIXaのアミノ酸残基L337、R338、S339、T340、K341およびT343を含むエピトープに結合することができる、請求項1に記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
- 前記第二の抗原結合部位が、FX/FXaのアミノ酸残基H101、E103、T116、L117、A118、T127、S227、E228、F229、E266、R287、L303、P304、E305、L419、M426およびT428のうちの一つまたは複数を更に含むエピトープに結合することができる、請求項1または2に記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
- 前記多重特異性抗体またはその抗原結合性断片が、FIX/FIXaへの結合について参照抗体と競合し、前記参照抗体が、
a)配列番号15に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、および配列番号16に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、または
b)配列番号17に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、および配列番号18に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、または
c)配列番号19に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、および配列番号20に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む、請求項1に記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。 - 前記多重特異性抗体またはその抗原結合性断片が、FX/FXaへの結合について参照抗体と競合し、前記参照抗体が、配列番号179に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、および配列番号180に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む、請求項1または4に記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
- FIX(配列番号1)および/またはその活性型(FIXa)に結合することができる第一の抗原結合部位、ならびにFX(配列番号2)および/またはその活性型(FXa)に結合することができる第二の抗原結合部位を含む、FXに対するFIXaの酵素活性を刺激することができる多重特異性抗体またはその抗原結合性断片であって、
a.配列番号177に示されるアミノ酸配列を有する抗FIX/FIXa抗体重鎖可変ドメインのCDR配列と、配列番号178に示されるアミノ酸配列を有する抗FIX/FIXa抗体軽鎖可変ドメインのCDR配列と、配列番号179に示されるアミノ酸配列を有する抗FX/FXa抗体重鎖可変ドメインのCDR配列と、配列番号180に示されるアミノ酸配列を有する抗FX/FXa抗体軽鎖可変ドメインのCDR配列と、
b.配列番号181に示されるアミノ酸配列を有する抗FIX/FIXa抗体重鎖可変ドメインのCDR配列と、配列番号182に示されるアミノ酸配列を有する抗FIX/FIXa抗体軽鎖可変ドメインのCDR配列と、配列番号183に示されるアミノ酸配列を有する抗FX/FXa抗体重鎖可変ドメインのCDR配列と、配列番号184に示されるアミノ酸配列を有する抗FX/FXa抗体軽鎖可変ドメインのCDR配列のCDR配列と、または
c.配列番号187に示されるアミノ酸配列を有する抗FIX/FIXa抗体重鎖可変ドメインのCDR配列と、配列番号188に示されるアミノ酸配列を有する抗FIX/FIXa抗体軽鎖可変ドメインのCDR配列と、配列番号185に示されるアミノ酸配列を有する抗FX/FXa抗体重鎖可変ドメインのCDR配列と、配列番号186示されるアミノ酸配列を有する抗FX/FXa抗体軽鎖可変ドメインのCDR配列とを含む、多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。 - 前記多重特異性抗体またはその抗原結合性断片が二重特異性抗体である、請求項1~6のいずれかに記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
- 阻害物質を有する血友病Aまたは阻害物質を有しない血友病Aの治療のための、請求項1~7のいずれかに記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
- 請求項1~7のいずれかに記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片および薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
- 阻害物質を有する血友病Aまたは阻害物質を有しない血友病Aの治療のための、請求項1~7のいずれかに記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片を含む、医薬組成物。
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