CN110248964A - 促凝血抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及改进的促凝血抗体，包括能够结合凝血因子IX(FIX)或其活化形式因子IXa(FIXa)且任选地能够结合因子X(FX)及其活化形式因子Xa(FXa)并促进FIXa对FX的激活的双特异性抗体，结合其表位的抗体，以及用于治疗患有诸如A型血友病等凝血病的受试者的方法和组合物。
Description
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背景
在凝血病患者中，诸如在患有A型和B型血友病的人中，凝血级联的各个步骤由于例如功能性凝血因子的缺乏或存在不足而成为功能障碍的。凝血级联的一部分的这种功能障碍导致不充分的血液凝固以及潜在危及生命的出血，或对内脏器官如关节的损伤。
凝血因子VIII(FVIII)缺乏症，常被称为A型血友病，是影响全世界约420,000人的先天性出血性病症，其中约有105,000人目前得到诊断。
A型血友病患者可以接受凝血因子替代疗法，如外源性FVIII。常规治疗由替代疗法组成，其作为出血发作的预防或按需治疗而提供。直到最近，对严重A型血友病患者的预防性治疗是最多每周三次静脉内注射血浆来源的FVIII或重组FVIII或其长效变体。
然而，这类患者具有生成针对此类外源因子的中和抗体(所谓的“抑制物”)的风险，从而使得先前有效的疗法变得无效。具有抑制物的A型血友病患者是部分先天性、部分获得性的凝血病的非限制性实例。已经生成FVIII抑制物的患者不能用常规替代疗法治疗。最近，一种新药Hemlibra已被批准用于皮下预防性治疗具有抑制物的A型血友病。外源性凝血因子只可以静脉内施用，这对于患者是相当不便和不适的。例如，婴儿和幼儿可能必须经手术向胸部静脉内插入静脉内导管，以确保静脉通路。这使他们具有很大的发生细菌感染的风险。因此，即使有了Hemlibra，具有抑制物的血友病也需要替代性皮下治疗。
在出血的个体中，当血管外TF暴露于血液中活化的FVII(FVIIa)时，通过形成组织因子/因子VIIa(TF/VIIa)复合物引发凝血。TF/VIIa复合物的形成导致凝血因子X(FX)被激活为活化的凝血因子Xa(FXa)，FXa与活化的凝血因子V(FVa)一起产生有限量的凝血酶，凝血酶继而激活血小板。活化的血小板支持由活化的因子VIII(FVIIIa)和活化的凝血因子IX(FIXa)组成的tenase复合物的组装。tenase复合物是FX活化的非常有效的催化剂，而在该第二步中生成的FXa充当FVa/FXa凝血酶原酶复合物中的活性蛋白酶，该复合物负责最终的凝血酶爆发。凝血酶裂解纤维蛋白原以生成纤维蛋白单体，纤维蛋白单体聚合形成纤维蛋白网状物，该网状物密封泄漏的血管并终止出血。快速而广泛的凝血酶爆发是形成固态且稳定的纤维蛋白凝块的先决条件。
由FVIII活性降低或缺乏引起的FXa形成不足和凝血酶生成减少是A型血友病患者的出血素质的根本原因。
如前所述，FX向其酶活性形式FXa的蛋白水解转化可以通过包含FIXa及其辅因子FVIIIa的内在FX激活复合物来实现。辅因子结合使FIXa的酶活性增加约五个数量级，并且据信通过Scheiflinger等人(2008)J Thromb Haemost,6:315-322所概述的多种机制发生。值得注意的是，已发现FVIIIa使FIXa的构象得到稳定，FIXa具有增加的对FX的蛋白水解活性(Kolkman JA,Mertens K(2000)Biochemistry,39:7398-7405，BrandstetterH(2009)Biol Chem,390:391-400)。基于这一观察结果并意识到抗体是能够模拟多种蛋白质-蛋白质相互作用的通用结合蛋白质，Scheiflinger等人对激动性抗FIXa抗体进行了筛选，这些抗体的特征在于在磷脂表面和钙的存在下，但是在不存在天然辅因子FVIIIa的情况下，增强FIXa对FX的激活的能力。从对5280个杂交瘤上清液的筛选中发现有88个产生表现出不同程度的FIXa激动活性的抗体，参见EP1220923 B1和EP1660536 B1。关于FX激活的动力学和在缺乏FVIII的人血浆中刺激凝血酶生成的能力，EP1660536 B1始终指出224F3是最有效的抗体(参见，例如，第0060和0062部分)。
ACE910或Emicizumab(商品名)是由Chugai Pharmaceutical开发的用于治疗A型血友病的人源化双特异性抗FIX(a)/抗FX(a)单克隆抗体。ACE910旨在模拟FVIII辅因子功能(参见Sampei等人:(2013)PLoS One,8,e57479和WO2012067176)。
通常在患有凝血病的受试者中，特别是在血友病群体中，仍存在许多尚未得到满足的医疗需求，而本发明涉及能够替代FVIII并因此可用于治疗诸如A型血友病等凝血病的改进的化合物。
发明内容
本发明涉及化合物，其在患有凝血病的患者，特别是缺乏功能性FVIII的患者，如A型血友病患者，包括具有抑制物的A型血友病患者中，充当凝血因子VIII(FVIII)的替代物。
因此，本发明的一个方面涉及能够增强FXa的生成并因此使缺乏FVIII的患者部分或完全恢复凝血的化合物。
在一个方面，所述化合物是抗体。在一个这样的方面，所述化合物是多特异性抗体，如双特异性抗体。
在一个具体方面，本发明涉及在缺乏FVIII的患者如A型血友病患者中充当FVIII的替代物的促凝血抗体。
在一个这样的方面，所述抗体结合并增加FIXa对FX的酶活性，任选地还结合FX。
在一个方面，本发明涉及结合FX的促凝血抗体，包括双特异性促凝血抗体，其增加FIXa对FX的酶活性并结合FX。
在一个方面，本发明涉及能够与凝血FIX/FIXa和FX/FXa结合的促凝血双特异性抗体。
在一个方面，所述抗体是人抗体或人源化抗体。
本发明的另一方面涉及作为促凝血抗体的一部分的单独抗体或其抗原结合片段，如特定的抗FIX或抗FIXa抗体或其抗原结合片段。本发明的另一方面涉及作为促凝血抗体的一部分的单独抗体或其抗原结合片段，如特定的抗FX或抗FXa抗体或其抗原结合片段。
本发明的另一方面涉及如本文公开的抗体及其中间体的制备。
本发明的另一方面涉及与本文公开的促凝血抗体或其抗原结合片段竞争结合FIX/FIXa的抗体。
本发明的另一方面涉及与本文公开的抗体或其抗原结合片段竞争结合FX/FXa的促凝血抗体。
本发明的又一方面涉及包含本文公开的促凝血抗体的药物组合物，其被配制用于递送所述抗体以供预防和/或治疗凝血病。
本发明的另一方面涉及本文公开的促凝血抗体，其用于预防和/或治疗凝血病、伴随凝血病的疾病或由凝血病引起的疾病。
本发明还可以解决从示例性实施方案的公开内容中可以明显看出的其它问题。
附图说明
图1显示SEQ ID NO:3-188的比对序列，其中重链和轻链可变域的互补决定区1、2和3(CDR1、CDR2和CDR3)已在框中连续突出显示。
图2显示双特异性抗体mAb4-7761、mAb4-7762、mAb4-7789、mAb5-0057、mAb5-1409和ACE910在人组织因子激活的A型血友病贫血小板血浆(HA-PPP)中的凝血酶生成试验(TGT)数据。该实验如实施例17所述进行。点线和虚线分别表示在HA-PPP和正常PPP中不存在抗FVIII抗体时观察到的峰值凝血酶水平(nM)，并且其标准偏差用点线表示。mAb4-7761、mAb4-7762、mAb4-7789、mAb5-0057和mAb5-1409的曲线用向上指向的三角形表示，而ACE910的曲线用向下指向的三角形表示。实验A-D是指独立的实验；在这些实验的每一个中，在每种抗体浓度下的峰值凝血酶水平代表至少三次独立运行的平均值±标准偏差。
图3显示双特异性抗体mAb5-0057、mAb5-1409和ACE910在人组织因子激活的A型血友病富血小板血浆(HA-PRP)中的凝血酶生成试验(TGT)数据。该实验如实施例17所述进行。点线和虚线分别表示在HA-PRP和正常PRP中不存在抗FVIII抗体时观察到的峰值凝血酶水平(nM)，并且其标准偏差用点线表示。mAb5-0057和mAb5-1409的曲线用向上指向的三角形表示，而ACE910的曲线用向下指向的三角形表示。结果显示为来自四个独立实验的平均值±标准偏差。
图4显示mAb1-9016和224F3的单价单臂(OA)抗体在人因子Xla激活的贫血小板血浆中的凝血酶生成试验(TGT)数据。该实验如实施例18所述进行。虚线表示在不存在抗体时观察到的平均峰值凝血酶水平(nM)，并且其标准偏差(±1SD)用点线表示。mAb1-9016和224F3(mAb1-1582)的OA形式的曲线分别用向上和向下指向的三角形表示。
序列简述
SEQ ID NO:1是人凝血因子IX的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2是人凝血因子X的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3-188是本文所述的抗FIX和抗FX单克隆抗体(mAb)的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)的序列。相应的单臂(OA)抗体以及某些双特异性抗体的ID也显示在表中。在图1中，CDR1-3序列在框中突出显示。
相应VH和VL序列的抗体缩写、靶标和SEQ ID NO的概述：
第一列(“OA或双特异性抗体ID”)包含单价单臂(OA)抗体和/或双特异性抗体的缩写。第二列(“mAb ID”)代表相应组分抗体的缩写(对于双特异性抗体，第二列中第一个提到的抗体是抗FIX/FIXa抗体，第二个是抗FX/FXa抗体)。第四列(“SEQ ID NO(VH)”)和第五列(“SEQ ID NO(VL)”)分别代表VH和VL序列的SEQ ID NO，其中每列中的第一个SEQ ID NO代表抗FIX/FIXa抗体，第二个代表抗FX/FXa抗体。
描述
在患有凝血病的受试者中，诸如在患有A型血友病的人中，由于功能性FVIII的缺乏或存在不足，凝血级联出现功能障碍。凝血级联的一部分的这种功能障碍导致不充分的血液凝固以及潜在危及生命的出血，或对内部器官如关节的损伤。本发明涉及化合物，其在患有凝血病的患者，特别是缺乏功能性FVIII的患者，如A型血友病患者，包括具有抑制物的A型血友病患者中，充当凝血因子VIII(FVIII)的替代物。在一个方面，这样的化合物是抗体。
特别是，本发明的发明人惊奇地鉴定了具有高效力和功效的模拟FVIII辅因子活性的抗体。
在一个具体方面，本发明涉及在缺乏功能性FVIII的患者如A型血友病患者中充当FVIII的替代物的促凝血抗体。
在一个这样的方面，所述促凝血抗体结合并增加凝血因子IXa(FIXa)对凝血因子X(FX)的酶活性，任选地还结合FX。在一个这样的方面，本发明的抗体是能够与FIX/FIXa和FX结合的双特异性抗体。
凝血因子IX
FIX是与因子VII、凝血酶原、因子X和蛋白C具有结构相似性的维生素K依赖性凝血因子。循环酶原形式由分为四个不同结构域的415个氨基酸组成，这四个结构域包括N-末端富含γ-羧基谷氨酸(Gla)的结构域、两个EGF结构域和C-末端胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶结构域。FIX在血浆中作为单链酶原(SEQ ID NO:1)循环。通过在Arg145和Arg180处的有限蛋白水解来释放活化肽(SEQ ID NO:1的残基146至180)，发生FIX的激活。因此，活化的FIX(FIXa)由SEQ ID NO:1的残基1-145(轻链)和SEQ ID NO:1的残基181-415(重链)组成。
因此，循环FIX分子包含FIX酶原和FIX的活化形式，它们参考SEQ ID NO:1在本文中通常被称为FIX和FIXa。活化的因子IX被称为因子IXa或FIXa。术语“FIX(SEQ ID NO:1)和/或其活化形式(FIXa)”也可被称为“FIX/FIXa”或“FIX(a)”。
FIXa是一种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，其通过在凝血过程中产生支持形成适当凝血酶所必需的大多数因子Xa作为tenase复合物的一部分而在止血中发挥关键作用。
FIX在本文中用SEQ ID NO:1表示，SEQ ID NO:1对应于人FIX的Ala148等位基因形式(Anson等人.EMBO J.19843:1053-1060；McGraw等人,Proc Natl Acad Sci USA.198582:2847-2851；Graham等人.Am.J.Hum.Genet.198842:573-580)。在本发明中，FIX旨在涵盖FIX的所有天然变体，如T148变体(Uniprot ID P00740)。
凝血因子X
FX是与因子VII、凝血酶原、FIX和蛋白C具有结构相似性的维生素K依赖性凝血因子。人FX酶原包含四个不同的结构域，包括N-末端富含γ-羧基谷氨酸(Gla)的结构域、两个EGF结构域和C-末端胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶结构域。FX在血浆中作为双链酶原循环，其包含SEQ ID NO:2的残基1-139(轻链)和SEQ ID NO:2的残基143-448(重链)。通过Arg194处的有限蛋白水解——这导致活化肽(Aa143-194)的释放，发生FX的激活。因此，活化的FX(FXa)由SEQ ID NO:2的残基1-139(轻链)和SEQ ID NO:2的残基195-448(活化的重链)组成。因此，循环FX分子包含FX酶原和活化形式的FX，它们参考SEQ ID NO:2在本文中分别被称为FX和FXa。在本发明中，FX旨在涵盖FX的所有天然变体。术语“FX(SEQ ID NO:2)和/或其活化形式(FXa)”也可称为“FX/FXa”或“FX(a)”。
抗体
本文中的术语“抗体”是指自免疫球蛋白序列衍生的蛋白质，其能够与抗原或其一部分结合。术语抗体包括但不限于任何类别(或同种型)的全长抗体，即IgA、IgD、IgE、IgG、IgM和/或IgY。术语抗体包括但不限于二价的抗体，如双特异性抗体。
天然的全长抗体包含至少四条多肽链：通过二硫键连接的两条重链(HC)和两条轻链(LC)。在一些情况下，天然抗体包含少于四条链，如在软骨鱼类(Chondrichthyes)中发现的IgNAR的情况。药学上特别感兴趣的一类免疫球蛋白是IgG。在人类中，根据其重链恒定区的序列，IgG类别可被分为4个亚类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。根据其序列组成的差异，轻链可被分为两种类型：κ和λ链。IgG分子由两条通过两个或更多个二硫键相互连接的重链和两条各自通过二硫键连接至重链的轻链组成。IgG重链可包含一个重链可变域(VH)和最多三个重链恒定(CH)域：CH1、CH2和CH3。轻链可包含轻链可变域(VL)和轻链恒定域(CL)。VH和VL区可进一步细分为被称为互补决定区(CDR)或高变区(HvR)的高变性区域，其中散布有被称为框架区(FR)的更加保守的区域。VH和VL域通常由三个CDR和四个FR组成，它们从氨基末端到羧基末端以如下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。含有高变区的重链和轻链可变域(CDR)构成能够与抗原相互作用的结构，而抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，该宿主组织或因子包括但不限于免疫系统的各种细胞(效应细胞)、Fc受体和经典补体系统的C1复合物的第一组分，C1q。
本发明的抗体可以是单克隆抗体(mAb)，这是从它们代表由单个B细胞或由B细胞的克隆群体表达的一组独特的重链和轻链可变域序列这个意义来讲的。本发明的抗体可采用本领域技术人员已知的各种方法来生产并纯化。例如，抗体可从杂交瘤细胞产生。抗体可通过B细胞扩充来产生。抗体或其片段可以在哺乳动物或微生物表达系统中或通过体外翻译来重组表达。抗体或其片段还可通过例如噬菌体展示、细菌展示、酵母展示、哺乳动物细胞展示或核糖体或mRNA展示而重组表达为细胞表面结合分子。
本发明的抗体可以是分离的。术语“分离的抗体”是指已经从其产生环境中的其它组分中分离和/或回收的抗体，和/或已经从在其产生环境中存在的组分的混合物中纯化的抗体。
抗体的某些抗原结合片段在本发明的情况下可能是合适的，因为已经证明，抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段来行使。术语抗体的“抗原结合片段”是指一个或多个保留如本文所述的特异性结合或识别抗原如FIX/FIXa、FX/FXa或另一种靶分子的能力的抗体片段。抗原结合片段的实例包括(但不限于)Fab、Fab'、Fab2、Fab'2、Fv(一般为抗体单臂的VL和VH域的组合)、单链Fv(scFv)；参见例如Bird等人,Science 1988242:423-426；和Huston等人PNAS 198885:5879-5883)、dsFv、Fd(一般为VH和CH1域)；包含单个VH和单个VL域的单价分子；微体(minibodies)、双抗体(diabodies)、三抗体(triabodies)、四抗体(tetrabodies)和κ体(kappa bodies)(参见例如Ill等人(1997)Protein Eng 10:949-57)；以及一个或多个分离的CDR或功能互补位，其中分离的CDR或抗原结合残基或多肽可以缔合或连接在一起，以形成功能抗体片段。这些抗体片段可采用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且可以以与完整抗体相同的方式针对应用性筛选这些片段。
抗体的“Fab片段”，包括“Fab”和“Fab’2”片段，可通过分别在连接抗体重链的铰链半胱氨酸残基的N-末端或C-末端侧上的铰链区中切割重链而由抗体得到。“Fab”片段包括轻链的可变域和恒定域以及重链的可变域和CH1域。“Fab’2”片段包含一对通常通过其铰链半胱氨酸共价连接的“Fab”片段。Fab'通过切割Fab’2中连接重链的铰链二硫键而在形式上衍生自Fab’2片段。除了抗体片段的二硫键连接以外的其它化学偶联也是本领域已知的。Fab片段保留了亲本抗体与其抗原结合的能力，潜在地具有更低的亲和力。Fab’2片段能够二价结合，而Fab和Fab’片段仅能够单价结合。通常，Fab片段缺乏恒定CH2和CH3域，即在其中将发生与Fc受体和C1q的相互作用的Fc部分。因此，Fab片段通常缺乏效应功能。Fab片段可以通过本领域已知的方法通过抗体的酶切而产生，例如使用木瓜蛋白酶以获得Fab或使用胃蛋白酶以获得Fab’2，包括Fab、Fab'、Fab’2在内的Fab片段可以使用本领域技术人员公知的技术重组产生。
“Fv”(片段可变)片段是含有完全抗原识别和结合位点的抗体片段，且通常包含缔合(其在性质上可以是共价的)的一个重链可变域和一个轻链可变域，例如在单链可变域片段(scFv)中。以这种构型，每个可变域的三个高变区相互作用，以在VH-VL二聚体的表面上限定出抗原结合位点。这六个高变区或其亚组共同地对抗体赋予抗原结合特异性。
“单链Fv”或“scFv”抗体包含抗体的VH和VL域，其中这些结构域存在于单条多肽链中。通常，Fv多肽进一步在VH和VL域之间包含多肽连接体，该连接体使得scFv能够形成用于抗原结合的所需结构。关于scFv的综述，参见Pluckthun,1994,In:The PharmacologyofMonoclonal Antibodies,Vol.113,Rosenburg and Moore eds.Springer-Verlag,NewYork,pp.269-315。
“单链Fab”或“scFab”抗体包含抗体的VH、CH1、VL和CL域，其中这些结构域存在于单条多肽链中。通常，Fab多肽还在VH和CL或VL和CH1域之间包含多肽连接体，该连接体使得scFab能够形成用于抗原结合的所需结构(Koerber等人(2015)J Mol Biol.427:576-86)。
术语“双抗体(diabodies)”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，其中片段包含在同一多肽链(VH和VL)中连接至轻链可变域(VL)的重链可变域(VH)。通过使用由于过短而无法允许在同一条链上的两个可变域之间配对的连接体，使得这些可变域与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。
表述“线性抗体”是指如在Zapata等人(1995)Protein Eng.8:1057-1062中描述的抗体。简言之，这些抗体含有一对串联的Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，该区段与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性的或单特异性的。
可采用常规的重组或蛋白质工程技术获得抗体片段，并且可以以与完整抗体相同的方式，针对与FIX及其活化形式FX的结合或另一种功能筛选这些片段。
本发明的抗体片段可通过截短，例如通过从多肽的N-末端和/或C-末端去除一个或多个氨基酸来制备。也可以通过一个或多个内部缺失来生成片段。
本发明的抗体可以是或者可包含抗体的片段或本文公开的抗体中任意一种的变体。本发明的抗体可以是或可包含这些抗体之一的抗原结合部分或其变体。例如，本发明的抗体可以是这些抗体之一的Fab片段或其变体，或者其可以是衍生自这些抗体之一的单链抗体或其变体。而且，本发明的抗体可以是全长抗体及其片段的组合。
如本文所用的术语“单臂”是指由抗体重链、缺少Fab区的截短重链和单条轻链构成的特定类型的单价抗体。
如本文所用的术语“单特异性”抗体是指能够与一种特定表位结合的抗体(包括但不限于二价抗体)。
如本文所用的术语“双特异性”抗体是指能够与两种不同抗原或相同抗原上的两种不同表位结合的抗体。
如本文所用的术语“三特异性”抗体是指能够与三种不同抗原或相同抗原上的三种不同表位或两种不同抗原上存在的三种不同表位结合的抗体。
如本文所用的术语“多特异性”抗体是指能够与两种或更多种不同抗原或相同抗原上的两种或更多种不同表位结合的抗体。因此，多特异性抗体包括双特异性和三特异性抗体。
全长IgG形式的双特异性抗体可以通过两个单独的杂交瘤融合以形成杂合四价体瘤而生成，该四价体瘤产生包括一部分的双特异性异二聚化抗体的抗体混合物(CheliusD.等人；MAbs.2010年5-6月；2(3):309–319)。或者，双特异性异二聚化抗体可以通过使用重组技术产生。异二聚化也可以通过改造Fc区的二聚化界面以促进异二聚化来实现。其中一个实例是所谓的把手-孔穴式(knob-in-hole)突变，其中空间上庞大的侧链(把手)被引入一个Fc中，该Fc被相对Fc上的空间上较小的侧链(孔穴)匹配，从而产生促进异二聚化的空间互补性。用于工程化异二聚化Fc界面的其它方法是静电互补、与非IgG异二聚化结构域融合或利用人IgG4的自然Fab-臂交换现象来控制异二聚化。异二聚化的双特异性抗体的实例在文献中有充分描述，例如(Klein C等人；MAbs.2012Nov-Dec；4(6):653–663)。必须特别注意异二聚体抗体中的轻链。通过使用共同的轻链可以实现LC与HC的正确配对。再次，LC/HC界面的工程化可用来促进异二聚化或轻链交叉工程化，如CrossMabs。在轻度还原条件下，在体外从含有适当突变的两个单独IgG重装配抗体也可用来产生双特异性抗体(例如，Labrijn等人,PNAS,110,5145-5150(2013))。还报道了自然Fab-臂交换方法以确保正确的轻链配对。基于多特异性抗体的分子也可以重组表达为融合蛋白，该融合蛋白组合了IgG的天然模块以形成如文献中描述的多特异性和多价抗体衍生物。融合抗体的实例是DVD-Ig、IgG-scFV、双抗体、DART等。可以将特异性检测或纯化标签、半衰期延长部分或其它组分掺入融合蛋白中。另外的非IgG模式也可以掺入融合蛋白中。基于Fc异二聚化的双特异性全长抗体通常被称为不对称IgG，与LC配对方法无关。
通常，如Brinkmann等人(Brinkmann等人.The making of bispecificantibodies.Mabs 9,182-212(2017))所综述的，双特异性抗体可以以多种分子形式产生。
基于多特异性抗体的分子还可以通过化学缀合或偶联单独的全长IgG或偶联IgG的片段以形成如文献中描述的多特异性和多价抗体衍生物来产生。实例是化学偶联的Fab片段、IgG-二聚体等。特异性检测或纯化标签、半衰期延长分子或其它组分可以掺入缀合蛋白中。另外的非IgG多肽也可以掺入融合蛋白中。多特异性分子也可以通过组合重组和化学方法来产生，包括上述那些方法。
在一个方面，本发明的抗体是嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。这样的抗体可以通过使用例如合适的抗体展示或免疫平台或本领域已知的其它合适的平台或方法来产生。如本文所用的，术语“人抗体”旨在包括具有可变域的抗体，在该可变域中，框架区的至少一部分和/或CDR区的至少一部分来源于人种系免疫球蛋白序列。例如，人抗体可具有其中框架区和CDR区均来源于人种系免疫球蛋白序列的可变域。此外，如果抗体含有恒定区，则该恒定区或其部分也来源于人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。
这样的人抗体可以是人单克隆抗体。这样的人单克隆抗体可以由杂交瘤产生，该杂交瘤包括与无限增殖化细胞融合的B细胞，该B细胞从转基因非人类动物例如转基因小鼠获得，具有包含人免疫球蛋白重链和轻链基因区段的所有组成成分的基因组。
人抗体可以从基于人种系序列的选择而建立的、用天然和合成序列多样性进一步多样化的序列文库中分离。
人抗体可以通过人淋巴细胞的体外免疫及随后用EB病毒转化该淋巴细胞来制备。
人抗体可以通过本领域已知的重组方法产生。
术语“人抗体衍生物”是指人抗体的任何修饰形式，如抗体与另一种物质或抗体的缀合物。
如本文所用的，术语“人源化抗体”是指含有来源于非人免疫球蛋白的序列(CDR区或其部分)的人/非人抗体。因此，人源化抗体是这样的人免疫球蛋白(接受体抗体)，其中至少来自该接受体的高变区的残基被来自非人类物种如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的抗体(供体抗体)的高变区的残基所替代，其具有所需的特异性、亲和力、序列组成和功能性。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架(FR)残基被相应的非人类残基所替代。这类修饰的一个实例是引入一个或多个所谓的回复突变，该回复突变一般是来源于供体抗体的氨基酸残基。抗体的人源化可采用本领域技术人员已知的重组技术进行(参见，例如，AntibodyEngineering,Methods in Molecular Biology,vol.248,由Benny K.Lo编著)。对轻链和重链可变域均适合的人类接受体框架可通过例如序列或结构同源性来鉴定。或者，例如，可基于对结构、生物物理学和生物化学性质的了解使用固定的接受体框架。该接受体框架可以是种系衍生的或衍生自成熟的抗体序列。来自供体抗体的CDR区可以通过CDR移植进行转移。可通过确定关键框架位置来进一步在例如亲和力、功能性和生物物理学性质方面优化CDR移植的人源化抗体，在该关键框架位置处再次引入(回复突变)来自供体抗体的氨基酸残基对人源化抗体的性质具有有利影响。除了来源于供体抗体的回复突变外，还可通过在CDR或框架区中引入种系残基、消除免疫原性表位、定点诱变、亲和力成熟等对人源化抗体进行工程化。
此外，人源化抗体可包含在接受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。通常，人源化抗体将包含至少一个—一般两个—可变域，其中全部或基本上全部的CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区，并且其中全部或基本上全部的FR残基是人免疫球蛋白序列的FR残基。人源化抗体也可任选地包含免疫球蛋白恒定区的至少一部分(Fc)，一般是人免疫球蛋白的相应部分。
术语“人源化抗体衍生物”是指人源化抗体的任何修饰形式，如抗体与化学试剂的缀合物或抗体与另一抗体的缀合物。
如本文所用的，术语“嵌合抗体”是指包含来源于两个或更多个物种的抗体的部分的抗体。例如，编码这类抗体的基因包括编码源自两个不同物种的可变域的基因和编码源自两个不同物种的恒定域的基因。例如，编码小鼠单克隆抗体可变域的基因可以连接至编码人源抗体恒定域的基因。
抗体的片段可结晶区(“Fc区”/“Fc域”)是包含铰链和恒定CH2和CH3域的抗体C-末端区。Fc域可与被称为Fc受体的细胞表面受体以及补体系统的一些蛋白质相互作用。Fc区使得抗体能够与免疫系统相互作用。在本发明的一个方面，可对抗体进行工程化以在Fc区内包含修饰，一般用来改变其一种或多种功能性质，如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合、蛋白质稳定性和/或抗原依赖性细胞毒性，或这些性质的缺乏，等等。此外，可对本发明的抗体进行化学修饰(例如，可将一个或多个化学部分连接至该抗体)或进行修饰以改变其糖基化，从而再次改变该抗体的一种或多种功能性质。IgG1抗体可携带修饰的Fc域，该Fc域包含一个或多个以及可能全部以下突变，这些突变将分别导致对某些Fc-γ受体的亲和力降低(L234A、L235E和G237A)以及C1q介导的补体固定减少(A330S和P331S)(残基根据EU索引编号)。或者，可以使用本领域已知的其它氨基酸置换及其组合以及与以上所述修饰的组合，以导致改变的(减少的或增加的)Fc-γ受体结合。
本发明抗体的同种型可以是IgG，如IgG1，如IgG2，如IgG4。如果需要，抗体的类别可通过已知技术进行“转换”。例如，最初作为IgM分子产生的抗体可类别转换为IgG抗体。类别转换技术还可用来将一个IgG亚类转换成另一个亚类，例如：从IgG1转换成IgG2或IgG4；从IgG2转换成IgG1或IgG4；或从IgG4转换成IgG1或IgG2。还可以进行通过来自不同IgG亚类的区域的组合而生成恒定区嵌合分子的抗体工程化。
在一个实施方案中，对抗体的铰链区进行修饰，以使得该铰链区中的半胱氨酸残基数目发生改变，例如增加或减少。该方法在例如Bodmer等人的第5,677,425号美国专利中进一步描述。
可对恒定区进行修饰以使抗体稳定化，例如，降低二价抗体分离成半抗体的风险。例如，在lgG4恒定区中，残基S228(根据EU编号索引，根据Kabat为S241)可突变成脯氨酸(P)残基，以使铰链处的重链间二硫键形成得到稳定(参见，例如，Angal等人.MolImmunol.1993；30:105-8)。
抗体或其片段可按照其互补决定区(CDR)来定义。术语“互补决定区”或“高变区”在本文中使用时是指参与抗原结合的氨基酸残基位于其中的抗体区域。高变区或CDR可被鉴定为在抗体可变域的氨基酸比对中具有最高可变性的区域。数据库如Kabat数据库可用于CDR鉴定，例如，CDR被定义为包含轻链可变域的氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重链可变域的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；(Kabat等人.1991；Sequences ofProteins ofImmunological Interest,第五版,U.S.Department of Healthand Human Services,NIH PublicationNo.91-3242)。或者，CDR可被定义为来自“高变环”的那些残基(轻链可变域中的残基26-33(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重链可变域中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.1987；196:901-917)。通常，该区域中氨基酸残基的编号通过Kabat等人(同上)描述的方法进行。本文中诸如“Kabat位置”、“Kabat残基”和“根据Kabat”等短语是指用于重链可变域或轻链可变域的这一编号体系。通过使用Kabat编号体系，肽的实际线性氨基酸序列可含有较少的或额外的氨基酸，这对应于可变域的框架(FR)或CDR的缩短或向其中的插入。例如，重链可变域可包含在CDRH2的残基52后的氨基酸插入(根据Kabat的残基52a、52b和52c)以及在重链FR残基82后插入的残基(例如，根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。可通过将抗体序列的同源性区域与“标准的”Kabat编号的序列进行比对，来确定给定抗体的残基的Kabat编号。
术语“框架区”或“FR”残基是指如本文定义的不在CDR内的那些VH或VL氨基酸残基。
本发明的抗体可包含来自本文公开的一种或多种特异性抗体的CDR区。
术语“促凝血抗体”是指例如通过加速血液凝固过程和/或增加一种或多种凝血因子的酶活性来增强血液凝固的抗体。
术语“促凝血活性”是指化合物如抗体例如通过加速血液凝固过程和/或增加一种或多种凝血因子的酶活性来增强血液凝固的能力。
术语“抗原”(Ag)是指用于对免疫活性脊椎动物进行免疫以产生识别该Ag的抗体(Ab)的分子实体。在本文中，Ag的含义更加广泛，并且通常旨在包括被Ab特异性识别的靶分子，因此包括在用于产生Ab的免疫过程或其它过程例如噬菌体展示中使用的分子片段或模拟物。
如本文所用的术语“表位”在“抗原结合多肽”如抗体(Ab)与其相应抗原(Ag)之间的分子相互作用的背景下来定义。通常，“表位”是指在Ag上的、与Ab结合的区或区域，即与Ab物理接触的区或区域。物理接触可采用针对Ab和Ag分子中的原子的各种标准(例如，距离截止值为如如如如如或溶剂可及性)来定义。
FIX/FIXa和FX/FXa可包含许多不同的表位，这些表位可包括但不限于(1)线性肽表位；(2)由在成熟FIX/FIXa或FX/FXa构象中彼此靠近的一个或多个非连续氨基酸组成的构象表位；以及(3)全部或部分由共价连接至FIX/FIXa或FX/FXa的分子结构如碳水化合物基团组成的表位。
可采用多种实验和计算表位作图方法在不同的详细度水平上描述和表征给定抗体(Ab)/抗原(Ag)对的表位。这些实验方法包括诱变、X射线晶体学、核磁共振(NMR)谱法、氢氘交换质谱法(HDX-MS)以及各种竞争结合方法；本领域已知的方法。由于每种方法均依赖于独特的原理，因此对表位的描述与确定表位的方法紧密相关。因此，根据所采用的表位作图方法，给定Ab/Ag对的表位可有不同地描述。
在由Ab例如Fab片段与其Ag之间的复合物的空间坐标限定的X射线衍生的晶体结构的背景下，除非另有说明或与上下文相矛盾，否则术语表位在本文中被具体定义为FIX/FIXa或FX残基，其特征在于在距Ab中的重原子的距离内具有重原子(即非氢原子)。
如果在氨基酸水平上描述的，例如由X射线结构确定的表位含有相同的一组氨基酸残基，则这些表位被称为是相同的。如果表位共有至少一个氨基酸残基，则这些表位被称为是重叠的。如果表位没有共有氨基酸残基，则这些表位被称为是不同的(独特的)。
术语“互补位”的定义通过反转视角，来源于以上对“表位”的定义。因此，术语“互补位”是指在Ab上与Ag结合的区或区域，即与Ag物理接触的区或区域。
在由Ab如Fab片段与其Ag之间的复合物的空间坐标限定的X射线衍生的晶体结构的背景下，除非另有说明或与上下文相矛盾，否则术语互补位在本文中被具体定义为Ab残基，其特征在于在距FIX/FIXa或FX中的重原子的距离内具有重原子(即非氢原子)。
给定抗体(Ab)/抗原(Ag)对的表位和互补位可通过常规方法来鉴定。例如，表位的一般位置可通过评估抗体与FIX/FIXa或FX的不同片段或变体结合的能力来确定。FIX/FIXa或FX内与抗体接触的特定氨基酸(表位)和在抗体中与FIX/FIXa或FX接触的特定氨基酸(互补位)也可使用常规方法来确定。例如，抗体和靶分子可以组合，并且可以使Ab:Ag复合物结晶。可以确定该复合物的晶体结构，并用其鉴定抗体与其靶标之间相互作用的特异性位点。
抗原上的表位可以包含一个或多个热点残基，即对于与同源抗体的相互作用特别重要的残基，并且其中由所述热点残基的侧链介导的相互作用显著有助于用于抗体/抗原相互作用的结合能(Peng等人(2014)PNAS 111,E2656-E2665)。可以通过测试其中单个表位残基已经被置换为例如丙氨酸的抗原(在此是FIX/FIXa和FX)变体与同源抗体的结合，来鉴定热点残基。如果用丙氨酸置换表位残基对与抗体的结合具有强烈影响，则所述表位残基被认为是热点残基，因此对于抗体与抗原的结合特别重要。
与相同抗原结合的抗体可就其同时与其共同抗原结合的能力进行表征，并且可以经历“竞争结合”/“分箱(binning)”。在该语境下，术语“分箱”是指对与相同抗原结合的抗体进行分组的方法。抗体的“分箱”可以基于在以标准技术为基础的试验中两种抗体与其共同抗原的竞争结合。
使用参考抗体来定义抗体的“箱元”。如果第二抗体不能与参考抗体同时与抗原结合，则称第二抗体与参考抗体属于同一“箱元”。在这种情况下，参考抗体和第二抗体竞争性地结合抗原的相同部分，因此被划归为“竞争抗体”。如果第二抗体能够与参考抗体同时与抗原结合，则称第二抗体属于不同的“箱元”。在这种情况下，参考抗体和第二抗体不会竞争性地结合抗原的相同部分，因此被划归为“非竞争抗体”。
抗体“分箱”不提供关于表位的直接信息。
竞争抗体，即属于同一“箱元”的抗体，可具有相同的表位、重叠的表位或甚至不同的表位。如果与其在抗原上的表位结合的参考抗体占据了第二抗体与其在抗原上的表位接触所需的空间(“空间位阻”)，则是后一种情况。非竞争抗体通常具有不同的表位。因此，在一些实施方案中，本发明的抗体将与至少一种本文具体公开的抗体结合相同的表位。
用于确定抗体是否与本文公开的抗FIX/FIXa或抗X抗体竞争结合的竞争试验是本领域已知的。示例性的竞争试验包括免疫测定(例如，ELISA测定、RIA测定)、表面等离子体共振分析(例如，使用BIAcoreTM仪器)、生物层干涉测量法和流式细胞术。
通常，竞争试验涉及使用与固体表面结合或在细胞表面上表达的抗原、测试FIX-或FIXa结合抗体和参考抗体。参考抗体被标记，而测试抗体未被标记。通过测定在测试抗体的存在下与固体表面或细胞结合的经标记参考抗体的量来测量竞争性抑制。通常，测试抗体过量存在(例如，1、5、10、20、100、1000、10000或100000倍)。在竞争试验中被鉴定为具有竞争性的抗体(即，竞争抗体)包括与参考抗体结合相同表位或重叠表位的抗体，以及结合与参考抗体所结合的表位足够接近以发生空间位阻的相邻表位的抗体。
在示例性竞争试验中，使用市售试剂对参考抗FIX或抗FIXa抗体进行生物素化。将生物素化的参考抗体与测试抗体或未标记的参考抗体(自竞争对照)的系列稀释液混合，得到各种摩尔比(例如，1、5、10、20、100、1000、10000或100000倍)的测试抗体(或未标记的参考抗体)与标记的参考抗体的混合物。将该抗体混合物加至FIX或FIXa多肽包被的ELISA板上。然后洗板，并将辣根过氧化物酶(HRP)-链霉抗生物素蛋白加至板上作为检测试剂。在加入本领域已知的生色底物(例如，TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)或ABTS(2,2"-连氮-二-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸盐))后检测与靶抗原结合的经标记参考抗体的量。光密度读取(OD单位)使用分光计(例如，M2分光计(Molecular Devices))进行。对应于0％抑制的响应(OD单位)从没有任何竞争抗体的孔确定。对应于100％抑制的响应(OD单位)，即试验背景，从没有任何经标记的参考抗体或测试抗体的孔确定。每种浓度下测试抗体(或未标记的参考抗体)对FIX或FIXa的标记参考抗体的抑制百分比计算如下：％抑制＝(1-(OD单位-100％抑制)/(0％抑制-100％抑制))*100。
本领域技术人员将会理解，可以进行类似的试验来确定两种或更多种抗FX/FXa抗体是否共有结合区、箱元并且/或者竞争性结合抗原。本领域技术人员还将理解，可以使用本领域已知的各种检测系统进行竞争试验。如果过量的一种抗体(例如，1、5、10、20、100、1000、10000或100000倍)抑制另一种抗体的结合，如在竞争性结合试验中测量的，例如抑制至少50％、75％、90％、95％或99％，则测试抗体与参考抗体竞争结合抗原。
除非另有说明，否则使用如上所述的竞争性ELISA测定来确定竞争。
术语“结合亲和力”在本文中用作两种分子(例如抗体或其片段和抗原)之间的非共价相互作用的强度的度量。术语“结合亲和力”用来描述单价相互作用。
通过测定平衡解离常数(KD)，可以对两种分子(例如抗体或其片段和抗原)之间通过单价相互作用的结合亲和力进行定量。通过测量复合物形成和解离的动力学，例如通过表面等离子体共振(SPR)法或等温滴定量热(ITC)法，可以测定KD。与单价复合物的结合和解离相对应的速率常数分别被称为结合速率常数ka(或k结合)和解离速率常数kd(或k解离)。通过方程KD＝kd/ka，将KD与ka和kd相关联。
按照上面的定义，通过比较单个抗体/抗原复合物的KD值，可以比较与不同的分子相互作用有关的结合亲和力，例如比较不同抗体对给定抗原的结合亲和力。
可以通过众所周知的方法直接测定解离常数的值。用来评价诸如抗体等配体与靶标的结合能力的标准试验是本领域已知的，并且包括，例如，ELISA、Western印迹法、RIA和流式细胞术分析。通过本领域已知的标准试验，如SPR，也可以评估抗体的结合动力学和结合亲和力。然而，优选地，等温滴定量热法(ITC)可用来测量抗体/靶标相互作用的亲和力以及得到该相互作用的热力学参数。
可以进行竞争性结合试验，其中将抗体与靶标的结合和该靶标的另一种配体如另一种抗体对该靶标的结合进行比较。
本发明的抗体对其靶标可具有1x 10-4M或更低，1x 10-5M或更低，1x 10-6M或更低，1x 10-7M或更低，1x 10-8M或更低，或1x 10-9M或更低，或1x 10-10M或更低，1x 10-11M或更低，1x 10-12M或更低，1x10-13M或更低，或1x 10-14M或更低的KD。
本发明的抗体的KD可以小于100μM，如小于10μM，如小于1μM，如小于0.9μM，如小于0.8μM，如小于0.7μM，如小于0.6μM，如小于0.5μM，如小于0.4μM，如小于0.3μM，如小于0.2μM，如小于0.1μM。
在一个这样的实施方案中，所述抗体是包含抗FX臂的双特异性抗体，该抗FX臂对FX的KD小于100μM，如小于10μM，如小于1μM，如小于0.9μM，如小于0.8μM，如小于0.7μM，如小于0.6μM，如小于0.5μM，如小于0.4μM，如小于0.3μM，如小于0.2μM，如小于0.1μM，如小于0.09μM，如小于0.08μM，如小于0.07μM，如小于0.06μM，如小于0.05μM，如小于0.04μM，如小于0.03μM，如小于0.02μM，如小于0.01μM，如小于9nM，如小于8nM，如小于7nM，如小于6nM，如小于5nM，如小于4nM，如小于3nM，如小于2nM，如小于1nM，如小于0.5nM。
如本文所述的抗体及其抗体片段可以与本领域已知的其它抗体和抗体片段组合，产生双特异性、三特异性或多特异性抗体分子。先前已经使用其它FIX/IXa和FX/Xa结合域产生了模拟FVIII辅因子功能的化合物，这些结构域可以潜在地各自替代本文所述的FIX/IXa和/或FX/Xa结合域。由此可见，本发明的FIX/IXa和FX/Xa结合域作为单独的分子以及作为包含至少一个FIX/IXa和/或FX/Xa结合域的双特异性、三特异性或多特异性抗体的一部分的“中间体”具有独立的意义。
包括双特异性、三特异性和多特异性抗体在内的促凝血抗体的活性可以通过本领域已知的方法来确定。标准测定包括全血-凝血酶-生成试验(TGT)，通过血栓弹性描记术(TEG)和FXa生成试验测量凝血时间。
同一性
本领域已知的术语“同一性”是指通过比较序列而确定的两种或更多种多肽的序列之间的关系。在本领域中，“同一性”还表示多肽之间的序列相关性程度，如根据两个或更多个氨基酸残基的残基串之间的匹配数所确定的。“同一性”衡量两个或更多个序列中的较小序列之间相同匹配的百分比，其中缺口比对(如果有的话)由特定数学模型或计算机程序(即“算法”)来解决。通过已知方法可以容易地计算相关多肽的同一性。这类方法包括但不限于以下文献中描述的方法：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,OxfordUniversity Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of SequenceData,Part 1,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M.Stockton Press,NewYork,1991；和Carillo等人.SIAM J.Applied Math.1988；48:1073。
用于确定同一性的优选方法被设计为给出所测试的序列之间的最大匹配。在可公开获得的计算机程序中描述了确定同一性的方法。用于确定两个序列之间的同一性的优选计算机程序方法包括GCG程序包，包括GAP(Devereux等人.Nucl.Acid.Res.1984；12:387；Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,Wis.)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等人.J.Mol.Biol.1990；215:403-410)。BLASTX程序可从国家生物技术信息中心(NCBI)和其它来源公开获得(BLAST Manual,Altschul等人.NCB/NLM/NIHBethesda,Md.20894；Altschul等人，同上)。众所周知的Smith Waterman算法也可用来确定同一性。
例如，使用计算机算法GAP(Genetics Computer Group,University ofWisconsin,Madison,Wis.)，比对将要确定其序列同一性百分比的两种多肽各自的氨基酸的最佳匹配(“匹配的跨度”“，如通过算法所确定的)。空位开放罚分(其被计算为平均对角(diagonal)的3倍；“平均对角”是使用的比较矩阵的对角的平均值；“对角”是特定比较矩阵分配给每个完美氨基酸匹配的评分或数字)和空位延伸罚分(其通常是空位开放罚分的1/10)以及诸如PAM 250或BLOSUM 62的比较矩阵与该算法结合使用。该算法也使用标准比较矩阵(对于PAM 250比较矩阵，参见Dayhoff等人.1978；Atlas of Protein Sequence andStructure,vol.5,supp.3；对于BLOSUM 62比较矩阵，参见Henikoff等人PNAS 1992；89:10915-10919)。
肽序列比较的优选参数包括以下：算法：Needleman等人.J.Mol.Biol.1970；48:443-453；比较矩阵：来自Henikoff等人.PNAS 1992；89:10915-10919的BLOSUM 62；空位罚分：12，空位长度罚分：4，相似度阈值：0。
GAP程序可以使用上述参数。上述参数是使用GAP算法进行肽比较的默认参数(并且对于末端空位没有罚分)。
术语“相似性”是一个相关的概念，但与“同一性”不同，是指包括相同匹配和保守置换匹配的序列关系。如果两个多肽序列具有例如10/20个相同的氨基酸，并且其余的都是非保守置换，那么同一性百分比和相似性百分比都将是50％。如果在相同的实例中，还有5个位置存在保守置换，那么同一性百分比为25％，相似性百分比为75％(分数15/20)。因此，在存在保守置换的情况下，两种多肽之间的相似性程度将高于这两种多肽之间的同一性百分比。
药物制剂
在另一方面，本发明提供了包含本发明化合物，如本文所述抗体的组合物和制剂。例如，本发明提供了包含与药学上可接受的载体一起配制的一种或多种本发明抗体的药物组合物。
相应地，本发明的一个目的在于提供一种药物制剂，其包含以0.25mg/ml至250mg/ml的浓度存在的这样的抗体，并且其中所述制剂具有2.0至10.0的pH。该制剂可以进一步包含缓冲体系、防腐剂、张度剂、螯合剂、稳定剂或表面活性剂及其各种组合中的一种或多种。防腐剂、等渗剂、螯合剂、稳定剂和表面活性剂在药物组合物中的使用是本领域技术人员公知的。可参考Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第19版,1995。
在一个实施方案中，所述药物制剂是水性制剂。这样的制剂一般是溶液或悬浮液，但也可以包括胶体、分散体、乳液和多相物质。术语“水性制剂”被定义为包含至少50％w/w水的制剂。类似地，术语“水性溶液”被定义为包含至少50％w/w水的溶液，而术语“水性悬浮液”被定义为包含至少50％w/w水的悬浮液。
在另一个实施方案中，所述药物制剂是冷冻干燥的制剂，在使用前医师或患者向其中添加溶剂和/或稀释剂。
在进一步的方面，所述药物制剂包含这样的抗体的水溶液和缓冲液，其中该抗体以1mg/ml或以上的浓度存在，并且其中所述制剂具有约2.0至约10.0的pH。
施用
本发明的化合物，如抗体，可以肠胃外施用，如静脉内施用，如肌肉内施用，如皮下施用。或者，本发明的抗体可以通过非肠胃外途径如经口或局部施用。本发明的抗体可以预防性地施用。本发明的抗体可以治疗性地施用(根据需要)。
剂量
待递送的化合物的剂量可以是每天、每周、每两周或每月约0.01mg至500mg化合物，优选约0.1mg至250mg，更优选约0.5mg至约250mg作为负荷和维持剂量，这取决于病况的严重程度。基于该化合物的性质，包括其体内半衰期或平均停留时间及其生物活性，还可以针对特定化合物调整合适的剂量。例如，在一个实施方案中，待递送的化合物可以每周施用一次，或者在另一个实施方案中每隔一周施用一次，或者在另一个实施方案中每月施用一次，并且在所述实施方案的任一个中，以例如0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg/kg体重的剂量施用。
含有本文公开的化合物的组合物可以施用以用于预防性处置和/或在一些实施方案中用于治疗性处置。在治疗性应用中，将组合物以足以治愈、减轻或部分阻止疾病及其并发症的量施用于已经患有疾病如上述任何出血性病症的受试者。足以实现该目的的量被定义为“治疗有效量”。如本领域技术人员将会理解的，对于该目的有效的量将取决于疾病或损伤的严重程度以及受试者的体重和一般状态。
实施方案
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合包含FIX(SEQ ID NO:1)或其活化形式(FIXa)的残基H256的表位。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合包含FIX(SEQ ID NO:1)或其活化形式FIXa的残基H257的表位。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合包含FIX(SEQ ID NO:1)或其活化形式(FIXa)的残基N258的表位。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合包含FIX(SEQ ID NO:1)或其活化形式(FIXa)的残基K293的表位。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合包含FIX(SEQ ID NO:1)或其活化形式(FIXa)的残基K301的表位。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合包含FIX(SEQ ID NO:1)或其活化形式(FIXa)的残基D332的表位。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合包含FIX(SEQ ID NO:1)或其活化形式(FIXa)的残基R333的表位。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合包含FIX(SEQ ID NO:1)或其活化形式(FIXa)的残基A334的表位。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合包含FIX(SEQ ID NO:1)或其活化形式(FIXa)的残基T335的表位。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合包含FIX(SEQ ID NO:1)或其活化形式(FIXa)的残基L337的表位。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合包含FIX(SEQ ID NO:1)或其活化形式(FIXa)的残基R338的表位。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合包含FIX(SEQ ID NO:1)或其活化形式(FIXa)的残基S339的表位。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合包含FIX(SEQ ID NO:1)或其活化形式(FIXa)的残基T340的表位。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合包含FIX(SEQ ID NO:1)或其活化形式(FIXa)的残基K341的表位。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合包含FIX(SEQ ID NO:1)或其活化形式(FIXa)的残基T343的表位。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合包含FIX(SEQ ID NO:1)或其活化形式(FIXa)的残基N346的表位。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合包含FIX(SEQ ID NO:1)或其活化形式(FIXa)的残基R403的表位。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合包含FIX(SEQ ID NO:1)或其活化形式(FIXa)的残基Y404的表位。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合包含FIX(SEQ ID NO:1)或其活化形式(FIXa)的残基N406的表位。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合包含FIX(SEQ ID NO:1)或其活化形式(FIXa)的残基W407的表位。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合包含FIX(SEQ ID NO:1)或其活化形式(FIXa)的残基E410的表位。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合包含FIX(SEQ ID NO:1)或其活化形式(FIXa)的残基K411的表位。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合包含FIX(SEQ ID NO:1)或其活化形式(FIXa)的残基L337、R338、S339、T340、K341和T343的表位。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合包含FIX(SEQ ID NO:1)或其活化形式(FIXa)的残基K301、D332、R333、A334、T335、R338和N346的表位。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合包含FIX(SEQ ID NO:1)或其活化形式(FIXa)的残基H256、H257、N258、K293、R403、Y404、N406、W407、E410和K411的表位。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合FIX(SEQ ID NO:1)或其活化形式(FIXa)，其中所述抗体与Fab7236竞争结合FIX。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合FIX(SEQ ID NO:1)或其活化形式(FIXa)，其中所述抗体与Fab7237竞争结合FIX。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合FIX(SEQ ID NO:1)或其活化形式(FIXa)，其中所述抗体与Fab7238竞争结合FIX。
在一个实施方案中，本发明的抗体结合FIX(SEQ ID NO:1)或其活化形式(FIXa)，其中所述抗体与Fab7236属于同一“箱元”。
在一个实施方案中，本发明的抗体结合FIX(SEQ ID NO:1)或其活化形式(FIXa)，其中所述抗体与Fab7237属于同一“箱元”。
在一个实施方案中，本发明的抗体结合FIX(SEQ ID NO:1)或其活化形式(FIXa)，其中所述抗体与Fab7238属于同一“箱元”。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合FX(SEQ ID NO:2)或其活化形式FXa，其中所述抗体与包含mAb1-6723的CDR的抗体竞争。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合FX/FXa，其中所述抗体包含根据SEQID NO:21和SEQ ID NO:22的mAb1-6723的可变域。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够特异性结合FX/FXa，其中所述抗体包含根据SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的mAb1-6723的CDR。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合FX/FXa，其中所述抗体与包含根据SEQID NO:21和SEQ ID NO:22的mAb1-6723可变域的Fab属于同一“箱元”。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够特异性结合FX/FXa，其中所述抗体与包含根据SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的mAb1-6723属于同一“箱元”。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够特异性结合FX/FXa，其中所述抗体与包含根据SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的抗原结合域的抗体或Fab属于同一“箱元”。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合FX/FXa，其中所述抗体与包含mAb1-1371的CDR的抗体竞争。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合FX/FXa，其中所述抗体包含根据SEQID NO:65和SEQ ID NO:66的mAb1-1371的可变域。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合FX/FXa，其中所述抗体包含根据SEQID NO:65和SEQ ID NO:66的mAb1-1371的CDR。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合FX/FXa，其中所述抗体与包含根据SEQID NO:65和SEQ ID NO:66的mAb1-1371可变域的Fab属于同一“箱元”，在此被称为“箱元A”。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合FX/FXa，其中所述抗体与根据SEQ IDNO:65和SEQ ID NO:66的mAb1-1371属于同一“箱元”。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合FX/FXa，其中所述抗体与包含根据SEQID NO:65和SEQ ID NO:66的抗原结合域的抗体或Fab属于同一“箱元”。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够特异性结合FX/FXa，其中所述抗体与包含mAb1-1376、mAb1-6705、mAb1-7388或mAb1-7563的CDR的抗体竞争。这类抗体在此被称为属于箱元B。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合FX/FXa，其中所述抗体包含分别由SEQID NO:67和68、SEQ ID NO:23和24、SEQ ID NO:39和40以及SEQ ID NO:59和60表示的mAb1-1376、mAb1-6705、mAb1-7388或mAb1-7563的可变域。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合FX/FXa，其中所述抗体包含分别由SEQID NO:67和68、SEQ ID NO:23和24、SEQ ID NO:39和40以及SEQ ID NO:59和60表示的mAb1-1376、mAb1-6705、mAb1-7388或mAb1-7563的CDR。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合FX/FXa，其中所述抗体与包含分别由SEQ ID NO:67和68、SEQ ID NO:23和24、SEQ ID NO:39和40以及SEQ ID NO:59和60表示的mAb1-1376、mAb1-6705、mAb1-7388或mAb1-7563的可变域的Fab属于同一“箱元”。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合FX/FXa，其中所述抗体与分别由SEQID NO:67和68、SEQ ID NO:23和24、SEQ ID NO:39和40以及SEQ ID NO:59和60表示的mAb1-1376、mAb1-6705、mAb1-7388或mAb1-7563属于同一“箱元”。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合FX/FXa，其中所述抗体与包含根据SEQID NO:67和68、SEQ ID NO:23和24、SEQ ID NO:39和40或者SEQ ID NO:59和60的抗原结合域的抗体或Fab属于同一“箱元”。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合FX/FXa，其中所述抗体包含选自mAb1-6723、1-6716、1-6721、1-6730、1-6731、1-6737、1-6754、1-7378、1-7413、1-7424、1-7466、1-7481、1-7483和mAb1-7591的抗体的CDR或可变域。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合FX/FXa，其中所述抗体包含选自mAb1-6723、1-6716、1-6721、1-6730、1-6731、1-6737、1-6754、1-7378、1-7413、1-7424、1-7466、1-7481、1-7483、1-7591、1-7388、1-7563、1-7462和mAb1-7571的抗体的CDR或可变域。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合FX/FXa，其中所述抗体与选自包含可变序列或其CDR的mAb的mAb属于同一“箱元”，该可变序列或其CDR选自：SEQ ID NO:21和22，SEQ ID NO:25和26，SEQ ID NO:27和28，SEQ ID NO:29和30，SEQ ID NO:31和32，SEQ IDNO:33和34，SEQ ID NO:35和36，SEQ ID NO:37和38，SEQ ID NO:39和40，SEQ ID NO:41和42，SEQ ID NO:43和44，SEQ ID NO:45和46，SEQ ID NO:51和52，SEQ ID NO:53和54，SEQ IDNO:55和56，SEQ ID NO:57和58，SEQ ID NO:59和60，SEQ ID NO:61和62，以及SEQ ID NO:63和64。这种抗体“箱元”在此被称为箱元C，其实例为大量单独的抗体，如mAb1-6723、1-6716、1-6721、1-6730、1-6731、1-6737、1-6754、1-7378、1-7413、1-7424、1-7466、1-7481、1-7483、1-7591、1-7388、1-7563、1-7462和mAb1-7571。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合FX/FXa，其中所述抗体与参考抗体竞争结合FX、FX酶原或FXa，该参考抗体选自由包含可变序列或其CDR的mAb组成的抗体，该可变序列或其CDR选自：SEQ ID NO:21和22，SEQ ID NO:25和26，SEQ ID NO:27和28，SEQ IDNO:29和30，SEQ ID NO:31和32，SEQ ID NO:33和34，SEQ ID NO:35和36，SEQ ID NO:37和38，SEQ ID NO:41和42，SEQ ID NO:43和44，SEQ ID NO:53和54，SEQ ID NO:55和56，SEQ IDNO:57和58，以及SEQ ID NO:63和64。
在一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段与包含SEQ ID NO:21和22、SEQ ID NO:25和26、SEQ ID NO:27和28、SEQ ID NO:29和30、SEQ ID NO:31和32、SEQ IDNO:33和34、SEQ ID NO:35和36、SEQ ID NO:37和38、SEQ ID NO:41和42、SEQ ID NO:43和44、SEQ ID NO:53和54、SEQ ID NO:55和56、SEQ ID NO:57和58或者SEQ ID NO:63和64的CDR的抗原结合片段竞争结合FX/FXa。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合FX/FXa，其中所述抗体与包含mAb1-7447、1-7441、1-7571或1-7462的CDR的抗体竞争。这些在此被称为箱元D的抗体。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合FX/FXa，其中所述抗体包含分别根据SEQ ID NO:47和48、SEQ ID NO:45和46、SEQ ID NO:51和53或者SEQ ID NO:61和62的mAb1-7447、1-7441、1-7571或1-7462的可变域。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合FX/FXa，其中所述抗体包含分别根据SEQ ID NO:47和48、SEQ ID NO:45和46的mAb1-7447或1-7441的可变域。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合FX/FXa，其中所述抗体包含分别根据SEQ ID NO:47和48、SEQ ID NO:45和46、SEQ ID NO:51和53或者SEQ ID NO:61和62的mAb1-7447、1-7441、1-7571或1-7462的CDR。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合根据SEQ ID NO:2的FX/FXa，其中所述抗体与包含分别根据SEQ ID NO:47和48、SEQ ID NO:45和46、SEQ ID NO:51和53或者SEQID NO:61和62的mAb1-7447、1-7441、1-7571或mAb1-7462可变域的Fab属于同一“箱元”。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合FX/FXa，其中所述抗体与分别根据SEQID NO:47和48、SEQ ID NO:45和46、SEQ ID NO:51和53或者SEQ ID NO:61和62的mAb1-7447、1-7441、1-7571或mAb1-7462属于同一“箱元”。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够结合FX/FXa，其中所述抗体与包含根据SEQID NO:47和48、SEQ ID NO:45和46、SEQ ID NO:51和53或者SEQ ID NO:61和62的抗原结合域的抗体或Fab属于同一“箱元”。
在一个实施方案中，本发明的抗体是根据前述实施方案中任一项的抗体，其中所述抗体特异性结合FX酶原。
在这样的实施方案中，所述抗体特异性结合根据SEQ ID NO:2的氨基酸残基1-139、143-448的FX酶原。
在一个实施方案中，本发明的抗体是根据前述实施方案中任一项的抗体，其中所述抗体结合FX。
在一个实施方案中，本发明的抗体是根据前述实施方案中任一项的抗体，其中所述抗体结合FXa。
在一个这样的实施方案中，所述抗体特异性结合根据SEQ ID NO:2的氨基酸残基1-139、195-448的FXa。
在一个实施方案中，所述抗体是单特异性抗体。在一个实施方案中，所述抗体是多特异性抗体。在一个实施方案中，所述抗体是双特异性抗体。在一个这样的实施方案中，所述双特异性抗体能够与FIX或其活化形式(FIXa)和FX/FXa结合。在一个这样的实施方案中，所述双特异性抗体能够与FIX/FIXa和FX/FXa特异性结合。
在一个实施方案中，所述抗体是能够结合FIX/FIXa和FX/FXa的双特异性抗体，其中FIX/FIXa结合域衍生自箱元1的抗体，且FX/FXa结合域衍生自箱元A的抗体。
在一个实施方案中，所述抗体是结合FIX/FIXa和FX/FXa的双特异性抗体，其中FIX/FIXa结合域衍生自箱元2的抗体，且FX/FXa结合域衍生自箱元A的抗体。
在一个实施方案中，所述抗体是结合FIX/FIXa和FX/FXa的双特异性抗体，其中FIX/FIXa结合域衍生自箱元2的抗体，且FX/FXa结合域衍生自箱元B的抗体。
在一个实施方案中，所述抗体是结合FIX/FIXa和FX/FXa的双特异性抗体，其中FIX/FIXa结合域衍生自箱元2的抗体，且FX/FXa结合域衍生自箱元B的抗体。
在一个实施方案中，所述抗体是结合FIX/FIXa和FX/FXa的双特异性抗体，其中FIX/FIXa结合域衍生自箱元1的抗体，且FX/FXa结合域衍生自箱元C或D的抗体。
在一个实施方案中，所述抗体是结合FIX/FIXa和FX/FXa的双特异性抗体，其中结合域衍生自由mAb1-1371/mAb1-1307、
mAb1-6705/mAb1-1307、mAb1-1371/mAb0-1886、
mAb1-7441/mAb0-1886、mAb1-7447/mAb0-1886、
mAb1-7481/mAb0-1886、mAb1-1371/mAb0-1998、
mAb1-6716/mAb0-1998、mAb1-6723/mAb0-1998、
mAb1-6730/mAb0-1998、mAb1-6731/mAb0-1998、
mAb1-6737/mAb0-1998、mAb1-6754/mAb0-1998、
mAb1-7378/mAb0-1998、mAb1-7441/mAb0-1998、
mAb1-7447/mAb0-1998、mAb1-7481/mAb0-1998、
mAb1-1371/mAb1-4707、mAb1-6705/mAb1-4707、
mAb1-1371/mAb1-4071、mAb1-7441/mAb1-5788、
mAb1-7447/mAb1-5788、mAb1-7481/mAb1-5788、
mAb1-1371/mAb1-4857、mAb1-6716/mAb1-4857、
mAb1-6723/mAb1-4857、mAb1-6730/mAb1-4857、
mAb1-6731/mAb1-4857、mAb1-6737/mAb1-4857、
mAb1-6754/mAb1-4857、mAb1-7378/mAb1-4857、
mAb1-7441/mAb1-4857、mAb1-7447/mAb1-4857或
mAb1-7481/mAb1-4857组成的mAb对。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含与FX结合的抗体臂和与FIX/FIXa结合的抗体臂。在一个这样的实施方案中，与FX结合的抗体臂结合包含FX活化肽中的一个或多个残基的表位，并且与FIX/FIXa结合的抗体臂结合包含FIX蛋白酶结构域中的一个或多个残基的表位。
在一个实施方案中，本发明的抗体是多特异性抗体，如双特异性抗体或三特异性抗体。
在一个实施方案中，本发明的抗体是IgG形式，如全长IgG4。
在一个实施方案中，本发明的抗体是两个抗体片段的化学缀合物，如两个Fab片段或scFv片段的缀合物，或其组合。
在一个实施方案中，本发明的抗体是人抗体或人源化抗体。
在一个实施方案中，本文公开的抗体是用于制备双特异性抗体的中间体。
在一个实施方案中，本发明包括与本文公开的抗体竞争结合FIX/FIXa的抗体。
本发明的抗体可用来治疗患有凝血病，特别是A型血友病的受试者。因此，本发明还涉及能够结合FIX/FIXa的蛋白酶结构域的单克隆抗体在治疗有需要的受试者中的用途；以及所述抗体在制备用于治疗有需要的受试者的药物中的用途。此外，本发明包括用能够与FIX/FIXa的蛋白酶结构域结合的单克隆抗体治疗有需要的受试者的方法。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够以比其结合FIX的亲和力更高的亲和力结合FIXa。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够增加FIXa对FX的酶活性。
在一个这样的实施方案中，本发明的抗体能够增加FIXa对FX的酶活性，如使用如本文所述的单价单臂抗体在FXa生成试验中所测量的。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够增加FIXa对FX的酶活性，如使用如本文所述的二价抗体在FXa生成试验中所测量的。
在一个实施方案中，本发明的抗体不是如Rohlena等人(2003)J.Biol.Chem.278(11):9394–9401所述的抗FIX抗体CLB-FIX 13。在一个实施方案中，本发明的抗体不是抗FIX抗体HIX-1(IgG1鼠)(Merck KGaA,SigmaAldrich)。在一个实施方案中，本发明的抗体不是抗FIX抗体AHIX-5041(IgG1)(Haematologic Technologies,Inc.)。
在一个实施方案中，与本领域的促凝血抗体相比，本发明的抗体具有降低的免疫原性。
在一个实施方案中，双特异性抗体或其抗原结合片段包含识别FIX(SEQ ID NO:1)或其活化形式(FIXa)的第一抗原结合位点和识别FX(SEQ ID NO:2)或其活化形式(FXa)的第二抗原结合位点，其中
a)第一抗原结合位点包含以下CDR序列：
VH-CDR1：DYAMH
VH-CDR2：GISWRGDIIGYVDSVKG
VH-CDR3：SYGSGSFYNAFDS
VL-CDR1：RASQSISSWLA
VL-CDR2：KASRLDR
VL-CDR3：LEYSSYIRT
并且
b)第二抗原结合位点包含以下CDR序列：
VH-CDR1：TSWIV
VH-CDR2：MIDPSDSFTSYSPSFQG
VH-CDR3：LHYYHSEEFDV
VL-CDR1：RASQSVSSSYLA
VL-CDR2：GASSRAR
VL-CDR3：QQFGSSRLFT
在一个实施方案中，双特异性抗体或其抗原结合片段包含识别FIX(SEQ ID NO:1)或其活化形式(FIXa)的第一抗原结合位点和识别FX(SEQ ID NO:2)或其活化形式(FXa)的第二抗原结合位点，其中
a)第一抗原结合位点包含以下CDR序列：
VH-CDR1：DYAMH
VH-CDR2：GISWRGDIIGYVDSVKG
VH-CDR3：SYGSGSFYNAFDS
VL-CDR1：RASQSISSWLA
VL-CDR2：KASRLDR
VL-CDR3：LEYSSYIRT
并且
b)第二抗原结合位点包含以下CDR序列：
VH-CDR1：TSWIV
VH-CDR2：MIDPSDSFTSYSPSFQG
VH-CDR3：LHYYHSEEFDV
VL-CDR1：RASQSVSSSYLA
VL-CDR2：GASSRTR
VL-CDR3：QQFGSSRLFT
通过以下实施方案进一步描述本发明：
1.能够与根据SEQ ID NO:1的因子IX(FIX)或其活化形式(FIXa)结合的抗体或其抗原结合片段。
2.根据实施方案1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是“箱元1”的部分。
3.根据实施方案1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与参考抗体竞争，其中所述参考抗体包含
a.由SEQ ID NO:15表示的重链可变域和由SEQ ID NO:16表示的轻链可变域，或者
b.由SEQ ID NO:19表示的重链可变域和由SEQ ID NO:20表示的轻链可变域。
4.根据前述实施方案的抗体，其中所述参考抗体是Fab。
5.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含
a.与SEQ ID NO:15表示的序列至少90％相同的重链可变域和与SEQ ID NO:16表示的序列至少90％相同的轻链可变域，
b.与SEQ ID NO:19表示的序列至少90％相同的重链可变域和与SEQ ID NO:20表示的序列至少90％相同的轻链可变域，
c.与SEQ ID NO:69表示的序列至少90％相同的重链可变域和与SEQ ID NO:70表示的序列至少90％相同的轻链可变域，
d.与SEQ ID NO:71表示的序列至少90％相同的重链可变域和与SEQ ID NO:72表示的序列至少90％相同的轻链可变域，
e.与SEQ ID NO:73表示的序列至少90％相同的重链可变域和与SEQ ID NO:74表示的序列至少90％相同的轻链可变域，
f.与SEQ ID NO:83表示的序列至少90％相同的重链可变域和与SEQ ID NO:84表示的序列至少90％相同的轻链可变域，
g.与SEQ ID NO:81表示的序列至少90％相同的重链可变域和与SEQ ID NO:82表示的序列至少90％相同的轻链可变域，
h.与SEQ ID NO:75表示的序列至少90％相同的重链可变域和与SEQ ID NO:76表示的序列至少90％相同的轻链可变域，
i.与SEQ ID NO:77表示的序列至少90％相同的重链可变域和与SEQ ID NO:78表示的序列至少90％相同的轻链可变域，或
j.与SEQ ID NO:177表示的序列至少90％相同的重链可变域和与SEQ ID NO:178表示的序列至少90％相同的轻链可变域。
6.根据实施方案5的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变域与所示的SEQID至少92％、94％、96％或98％相同。
7.根据实施方案5的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变域与所示的SEQID至少92％、94％、96％或98％相同。
8.根据实施方案6和7的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变域和所述轻链可变域均与所示的SEQ ID至少92％、94％、96％或98％相同。
9.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含
a.
i.三个与SEQ ID NO:15表示的重链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的重链CDR序列，和
ii.三个与SEQ ID NO:16表示的轻链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的轻链CDR序列，
b.
i.三个与SEQ ID NO:19表示的重链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的重链CDR序列，和
ii.三个与SEQ ID NO:20表示的轻链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的轻链CDR序列
c.
i.三个与SEQ ID NO:69表示的重链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的重链CDR序列，和
ii.三个与SEQ ID NO:70表示的轻链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的轻链CDR序列，
d.
i.三个与SEQ ID NO:71表示的重链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的重链CDR序列，和
ii.三个与SEQ ID NO:72表示的轻链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的轻链CDR序列，
e.
i.三个与SEQ ID NO:73表示的重链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的重链CDR序列，和
ii.三个与SEQ ID NO:74表示的轻链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的轻链CDR序列，
f.
i.三个与SEQ ID NO:83表示的重链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的重链CDR序列，和
ii.三个与SEQ ID NO:84表示的轻链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的轻链CDR序列，
g.
i.三个与SEQ ID NO:81表示的重链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的重链CDR序列，和
ii.三个与SEQ ID NO:82表示的轻链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的轻链CDR序列，
h.
i.三个与SEQ ID NO:75表示的重链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的重链CDR序列，和
ii.三个与SEQ ID NO:76表示的轻链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的轻链CDR序列，或
i.
i.三个与SEQ ID NO:77表示的重链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的重链CDR序列，和
ii.三个与SEQ ID NO:78表示的轻链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的轻链CDR序列，或
j.
i.三个与SEQ ID NO:177表示的重链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的重链CDR序列，和
ii.三个与SEQ ID NO:178表示的轻链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的轻链CDR序列。
10.根据实施方案9的抗体或其抗原结合片段，其中与所示的SEQ ID的CDR相比，所述三个重链CDR序列具有至多9个，如8个，如7个或如6个氨基酸改变。
11.根据实施方案9的抗体或其抗原结合片段，其中与所示的SEQ ID的CDR相比，所述三个重链CDR序列具有至多5个，如4个，如3个，如2个或至多1个氨基酸改变。
12.根据实施方案9的抗体或其抗原结合片段，其中与所示的SEQ ID的CDR相比，所述三个轻链CDR序列具有至多9个，如8个，如7个或如6个氨基酸改变。
13.根据实施方案9的抗体或其抗原结合片段，其中与所示的SEQ ID的CDR相比，所述三个轻链CDR序列具有至多5个，如4个，如3个，如2个或至多1个氨基酸改变。
14.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含
a.由SEQ ID NO:15表示的重链可变域的CDR序列和由SEQID NO:16表示的轻链可变域的CDR序列，或者
b.由SEQ ID NO:19表示的重链可变域的CDR序列和由SEQID NO:20表示的轻链可变域的CDR序列，或者
c.由SEQ ID NO:3表示的重链可变域的CDR序列和由SEQID NO:4表示的轻链可变域的CDR序列，或者
d.由SEQ ID NO:109表示的重链可变域的CDR序列和由SEQ ID NO:110表示的轻链可变域的CDR序列，或者
e.由SEQ ID NO:153表示的重链可变域的CDR序列和由SEQ ID NO:154表示的轻链可变域的CDR序列，或者
f.由SEQ ID NO:171表示的重链可变域的CDR序列和由SEQ ID NO:172表示的轻链可变域的CDR序列，或者
g.由SEQ ID NO:177表示的重链可变域的CDR序列和由SEQ ID NO:178表示的轻链可变域的CDR序列，或者
h.由SEQ ID NO:187表示的重链可变域的CDR序列和由SEQ ID NO:188表示的轻链可变域的CDR序列。
15.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含
a.由SEQ ID NO:15表示的重链可变域和由SEQ ID NO:16表示的轻链可变域，或者
b.由SEQ ID NO:19表示的重链可变域和由SEQ ID NO:20表示的轻链可变域，或者
c.由SEQ ID NO:3表示的重链可变域和由SEQ ID NO:4表示的轻链可变域，或者
d.由SEQ ID NO:109表示的重链可变域和由SEQ ID NO:110表示的轻链可变域，或者
e.由SEQ ID NO:153表示的重链可变域和由SEQ ID NO:154表示的轻链可变域，或者
f.由SEQ ID NO:171表示的重链可变域和由SEQ ID NO:172表示的轻链可变域，或者
g.由SEQ ID NO:177表示的重链可变域和由SEQ ID NO:178表示的轻链可变域，或者
h.由SEQ ID NO:187表示的重链可变域和由SEQ ID NO:188表示的轻链可变域。
16.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基L337、R338、S339、T340、K341和T343中的一个或多个残基的表位。
17.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基R338的表位。
18.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基R338和K341的表位。
19.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基L337、R338、S339、T340、K341和T343中的两个或三个残基的表位。
20.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基L337、R338、S339、T340、K341和T343中的四个或五个残基的表位。
21.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够结合包含以下残基的表位：
SEQ ID NO:1的
a.R338、S339、T340、K341和T343，
b.L337、S339、T340、K341和T343，
c.L337、R338、T340、K341和T343，
d.L337、R338、S339、K341和T343，
e.L337、R338、S339、T340和T343或者
f.L337、R338、S339、T340和K341。
22.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基L337、R338、S339、T340、K341和T343的表位。
23.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基K301、D332、R333、A334、T335、R338和N346中的一个或多个残基的表位。
24.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基L337、R338、S339、T340、K341和T343的表位。
25.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基K301、D332、R333、A334、T335、R338和N346中的两个或三个残基的表位。
26.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基K301、D332、R333、A334、T335、R338和N346中的四个或五个残基的表位。
27.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基K301、D332、R333、A334、T335、R338和N346中的五个或六个残基的表位。
28.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够结合包含以下残基的表位：
SEQ ID NO:1的
a.D332、R333、A334、T335、R338和N346
b.K301、R333、A334、T335、R338和N346
c.K301、D332、A334、T335、R338和N346
d.K301、D332、R333、T335、R338和N346
e.K301、D332、R333、A334、R338和N346
f.K301、D332、R333、A334、T335和N346，或
g.K301、D332、R333、A334、T335和R338。
29.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基D332、R333、L337和R338的表位。
30.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基K301、D332、R333、A334、T335、R338和N346的表位。
31.根据实施方案1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段属于“箱元2”。
32.根据实施方案1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与参考抗体竞争，其中所述参考抗体包含由SEQ ID NO:17的序列表示的重链可变域和由SEQID NO:18的序列表示的轻链可变域。
33.根据前述实施方案的抗体，其中所述参考抗体是Fab。
34.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含
a.与SEQ ID NO:17表示的序列至少90％相同的重链可变域和与SEQ ID NO:18表示的序列至少90％相同的轻链可变域，
b.与SEQ ID NO:85表示的序列至少90％相同的重链可变域和与SEQ ID NO:86表示的序列至少90％相同的轻链可变域，或
c.与SEQ ID NO:79表示的序列至少90％相同的重链可变域和与SEQ ID NO:80表示的序列至少90％相同的轻链可变域。
35.根据实施方案34的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变域与所示的SEQID至少92％、94％、96％或98％相同。
36.根据实施方案34的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变域与所示的SEQID至少92％、94％、96％或98％相同。
37.根据实施方案35和36的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变域和所述轻链可变域均与所示的SEQ ID至少92％、94％、96％或98％相同。
38.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含
a.
i.三个与SEQ ID NO:17表示的重链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的重链CDR序列，和
ii.三个与SEQ ID NO:18表示的轻链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的轻链CDR序列，
b.
i.三个与SEQ ID NO:85表示的重链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的重链CDR序列，和
ii.三个与SEQ ID NO:86表示的轻链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的轻链CDR序列，或
c.
i.三个与SEQ ID NO:79表示的重链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的重链CDR序列，和
ii.三个与SEQ ID NO:80表示的轻链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的轻链CDR序列。
39.根据实施方案38的抗体或其抗原结合片段，其中与所示的SEQ ID的CDR相比，所述三个重链CDR序列具有至多9个，如8个，如7个或如6个氨基酸改变。
40.根据实施方案38的抗体或其抗原结合片段，其中与所示的SEQ ID的CDR相比，所述三个重链CDR序列具有至多5个，如4个，如3个，如2个或至多1个氨基酸改变。
41.根据实施方案38的抗体或其抗原结合片段，其中与所示的SEQ ID的CDR相比，所述三个轻链CDR序列具有至多9个，如8个，如7个或如6个氨基酸改变。
42.根据实施方案38的抗体或其抗原结合片段，其中与所示的SEQ ID的CDR相比，所述三个轻链CDR序列具有至多5个，如4个，如3个，如2个或至多1个氨基酸改变。
43.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含
a.由SEQ ID NO:17表示的重链可变域的CDR序列，和由SEQ ID NO:18表示的轻链可变域的CDR序列。
44.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含
a.由SEQ ID NO:17表示的重链可变域和由SEQ ID NO:18表示的轻链可变域。
45.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基H256、H257、N258、K293、R403、Y404、N406、W407、E410和K411中的一个或多个残基的表位。
46.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基H256、H257、N258、K293、R403、Y404、N406、W407、E410和K411的表位。
47.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基H256、H257、N258、K293、R403、Y404、N406、W407、E410和K411中的两个、三个或四个残基的表位。
48.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基H256、H257、N258、K293、R403、Y404、N406、W407、E410和K411中的五个、六个或七个残基的表位。
49.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基H256、H257、N258、K293、R403、Y404、N406、W407、E410和K411中的八个、九个或十个残基的表位。
50.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够结合包含以下氨基酸残基的表位：
SEQ ID NO:1的
a.H257、N258、K293、R403、Y404、N406、W407、E410和K411,
b.H256、N258、K293、R403、Y404、N406、W407、E410和K411,
c.H256、H257、K293、R403、Y404、N406、W407、E410和K411,
d.H256、H257、N258、R403、Y404、N406、W407、E410和K411,
e.H256、H257、N258、K293、Y404、N406、W407、E410和K411,
f.H256、H257、N258、K293、R403、N406、W407、E410和K411,
g.H256、H257、N258、K293、R403、Y404、W407、E410和K411,
h.H256、H257、N258、K293、R403、Y404、N406、E410和K411,
i.H256、H257、N258、K293、R403、Y404、N406、W407和K411，或
j.H256、H257、N258、K293、R403、Y404、N406、W407和E410。
51.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基H256、H257、N258、K293、R403、Y404、N406、W407、E410和K411的表位。
52.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基H257、K293和N406的表位。
53.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是促凝血抗体。
54.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够增加FIXa的促凝血活性。
55.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体能够增加FIXa对FX的酶活性。
56.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体能够在功能上取代FVIII和/或FVIIIa。
57.能够与FX(SEQ ID NO:2)或其活化形式(FXa)结合的抗体或其抗原结合片段。
58.根据实施方案57的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是“箱元A”的部分。
59.根据实施方案57的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与参考抗体竞争，其中所述参考抗体包含由SEQ ID NO:65表示的重链可变域和由SEQ IDNO:66表示的轻链可变域。
60.根据前述实施方案的抗体，其中所述参考抗体是Fab。
61.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够结合包含FX/FXa的氨基酸残基H101、E103、R113、T116、L117、A118、T127、S227、E228、F229、Y230、E266、R287、L303、P304、E305、L419、K420、D423、R424、M426、K427和T428中的一个或多个残基的表位。
62.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够结合包含FX/FXa的氨基酸残基H101、E103、R113、T116、L117、A118、T127、S227、E228、F229、Y230、E266、R287、P304、L303、P304、E305、L419、K420、D423、R424、M426、K427和T428的表位。
63.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够结合包含FX/FXa的氨基酸残基R113、Y230、K420、D423、R424和K427中的一个或多个残基的表位。
64.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够结合包含FX/FXa的氨基酸残基R113、Y230、K420、D423、R424和K427的表位。
65.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:65表示的序列至少90％相同的重链可变域和与SEQ ID NO:66表示的序列至少90％相同的轻链可变域。
66.根据实施方案65的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变域与所示的SEQID至少92％、94％、96％或98％相同。
67.根据实施方案65的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变域与所示的SEQID至少92％、94％、96％或98％相同。
68.根据实施方案66和67的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变域和所述轻链可变域均与所示的SEQ ID至少92％、94％、96％或98％相同。
69.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含
a.三个与SEQ ID NO:65表示的重链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的重链CDR序列，和
b.三个与SEQ ID NO:66表示的轻链可变域CDR序列相比具
有至多10个氨基酸改变的轻链CDR序列。
70.根据实施方案69的抗体或其抗原结合片段，其中与所示的SEQ ID的CDR相比，所述三个重链CDR序列具有至多9个，如8个，如7个或如6个氨基酸改变。
71.根据实施方案69的抗体或其抗原结合片段，其中与所示的SEQ ID的CDR相比，所述三个重链CDR序列具有至多5个，如4个，如3个，如2个或至多1个氨基酸改变。
72.根据实施方案69的抗体或其抗原结合片段，其中与所示的SEQ ID的CDR相比，所述三个轻链CDR序列具有至多9个，如8个，如7个或如6个氨基酸改变。
73.根据实施方案69的抗体或其抗原结合片段，其中与所示的SEQ ID的CDR相比，所述三个轻链CDR序列具有至多5个，如4个，如3个，如2个或至多1个氨基酸改变。
74.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:65表示的重链可变域的CDR序列和由SEQ ID NO:66表示的轻链可变域的CDR序列。
75.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:65表示的重链可变域和由SEQ ID NO:66表示的轻链可变域。
76.根据实施方案57的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是“箱元B”的部分。
77.根据实施方案57的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与参考抗体竞争，其中所述参考抗体包含由SEQ ID NO:67表示的重链可变域和由SEQ IDNO:68表示的轻链可变域。
78.根据前述实施方案的抗体或其抗原结合片段，其中所述参考抗体是Fab。
79.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含
a.与SEQ ID NO:67表示的序列至少90％相同的重链可变域和与SEQ ID NO:68表示的序列至少90％相同的轻链可变域，
b.与SEQ ID NO:23表示的序列至少90％相同的重链可变域和与SEQ ID NO:24表示的序列至少90％相同的轻链可变域，
c.与SEQ ID NO:39表示的序列至少90％相同的重链可变域和与SEQ ID NO:40表示的序列至少90％相同的轻链可变域，或
d.与SEQ ID NO:59表示的序列至少90％相同的重链可变域和与SEQ ID NO:60表示的序列至少90％相同的轻链可变域。
80.根据实施方案79的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变域与所示的SEQID至少92％、94％、96％或98％相同。
81.根据实施方案79的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变域与所示的SEQID至少92％、94％、96％或98％相同。
82.根据实施方案80和81的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变域和所述轻链可变域均与所示的SEQ ID至少92％、94％、96％或98％相同。
83.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含
a.
i.三个与SEQ ID NO:67表示的重链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的重链CDR序列，和
ii.三个与SEQ ID NO:68表示的轻链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的轻链CDR序列，
b.
i.三个与SEQ ID NO:23表示的重链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的重链CDR序列，和
ii.三个与SEQ ID NO:24表示的轻链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的轻链CDR序列，
c.
i.三个与SEQ ID NO:39表示的重链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的重链CDR序列，和
ii.三个与SEQ ID NO:40表示的轻链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的轻链CDR序列，或
d.
i.三个与SEQ ID NO:59表示的重链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的重链CDR序列，和
ii.三个与SEQ ID NO:60表示的轻链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的轻链CDR序列。
84.根据实施方案83的抗体或其抗原结合片段，其中与所示的SEQ ID的CDR相比，所述三个重链CDR序列具有至多9个，如8个，如7个或如6个氨基酸改变。
85.根据实施方案83的抗体或其抗原结合片段，其中与所示的SEQ ID的CDR相比，所述三个重链CDR序列具有至多5个，如4个，如3个，如2个或至多1个氨基酸改变。
86.根据实施方案83的抗体或其抗原结合片段，其中与所示的SEQ ID的CDR相比，所述三个轻链CDR序列具有至多9个，如8个，如7个或如6个氨基酸改变。
87.根据实施方案83的抗体或其抗原结合片段，其中与所示的SEQ ID的CDR相比，所述三个轻链CDR序列具有至多5个，如4个，如3个，如2个或至多1个氨基酸改变。
88.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含
a.由SEQ ID NO:67表示的重链可变域的CDR序列和由SEQID NO:68表示的轻链可变域的CDR序列，
b.由SEQ ID NO:23表示的重链可变域的CDR序列和由SEQID NO:24表示的轻链可变域的CDR序列，
c.由SEQ ID NO:39表示的重链可变域的CDR序列和由SEQID NO:40表示的轻链可变域的CDR序列，或者
d.由SEQ ID NO:59表示的重链可变域的CDR序列和由SEQID NO:60表示的轻链可变域的CDR序列。
89.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含
a.由SEQ ID NO:67表示的重链可变域和由SEQ ID NO:68表示的轻链可变域，
b.由SEQ ID NO:23表示的重链可变域和由SEQ ID NO:24表示的轻链可变域，
c.由SEQ ID NO:39表示的重链可变域和由SEQ ID NO:40表示的轻链可变域，或者
d.由SEQ ID NO:59表示的重链可变域和由SEQ ID NO:60表示的轻链可变域。
90.根据实施方案57的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是“箱元C”的部分。
91.根据实施方案57的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与参考抗体竞争，其中所述参考抗体包含由SEQ ID NO:21表示的重链可变域和由SEQ IDNO:22表示的轻链可变域。
92.根据前述实施方案的抗体或其抗原结合片段，其中所述参考抗体是Fab。
93.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含
a.与SEQ ID NO:21表示的序列至少90％相同的重链可变域和与SEQ ID NO:22表示的序列至少90％相同的轻链可变域，
b.与SEQ ID NO:25表示的序列至少90％相同的重链可变域和与SEQ ID NO:26表示的序列至少90％相同的轻链可变域，
c.与SEQ ID NO:27表示的序列至少90％相同的重链可变域和与SEQ ID NO:28表示的序列至少90％相同的轻链可变域，
d.与SEQ ID NO:29表示的序列至少90％相同的重链可变域和与SEQ ID NO:30表示的序列至少90％相同的轻链可变域，
e.与SEQ ID NO:31表示的序列至少90％相同的重链可变域和与SEQ ID NO:32表示的序列至少90％相同的轻链可变域，
f.与SEQ ID NO:33表示的序列至少90％相同的重链可变域和与SEQ ID NO:34表示的序列至少90％相同的轻链可变域，
g.与SEQ ID NO:35表示的序列至少90％相同的重链可变域和与SEQ ID NO:36表示的序列至少90％相同的轻链可变域，
h.与SEQ ID NO:37表示的序列至少90％相同的重链可变域和与SEQ ID NO:38表示的序列至少90％相同的轻链可变域，
i.与SEQ ID NO:39表示的序列至少90％相同的重链可变域和与SEQ ID NO:40表示的序列至少90％相同的轻链可变域，
j.与SEQ ID NO:41表示的序列至少90％相同的重链可变域和与SEQ ID NO:42表示的序列至少90％相同的轻链可变域，
k.与SEQ ID NO:43表示的序列至少90％相同的重链可变域和与SEQ ID NO:44表示的序列至少90％相同的轻链可变域，
l.与SEQ ID NO:51表示的序列至少90％相同的重链可变域和与SEQ ID NO:52表示的序列至少90％相同的轻链可变域，
m.与SEQ ID NO:53表示的序列至少90％相同的重链可变域和与SEQ ID NO:54表示的序列至少90％相同的轻链可变域，
n.与SEQ ID NO:55表示的序列至少90％相同的重链可变域和与SEQ ID NO:56表示的序列至少90％相同的轻链可变域，
o.与SEQ ID NO:57表示的序列至少90％相同的重链可变域和与SEQ ID NO:58表示的序列至少90％相同的轻链可变域，
p.与SEQ ID NO:59表示的序列至少90％相同的重链可变域和与SEQ ID NO:60表示的序列至少90％相同的轻链可变域，
q.与SEQ ID NO:61表示的序列至少90％相同的重链可变域和与SEQ ID NO:62表示的序列至少90％相同的轻链可变域，或
r.与SEQ ID NO:63表示的序列至少90％相同的重链可变域和与SEQ ID NO:64表示的序列至少90％相同的轻链可变域。
94.根据实施方案93的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变域与所示的SEQID至少92％、94％、96％或98％相同。
95.根据实施方案93的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变域与所示的SEQID至少92％、94％、96％或98％相同。
96.根据实施方案94和95的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变域和所述轻链可变域均与所示的SEQ ID至少92％、94％、96％或98％相同。
97.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含
a.
i.三个与SEQ ID NO:21表示的重链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的重链CDR序列，和
ii.三个与SEQ ID NO:22表示的轻链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的轻链CDR序列，
b.
i.三个与SEQ ID NO:25表示的重链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的重链CDR序列，和
ii.三个与SEQ ID NO:26表示的轻链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的轻链CDR序列，
c.
i.三个与SEQ ID NO:27表示的重链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的重链CDR序列，和
ii.三个与SEQ ID NO:28表示的轻链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的轻链CDR序列，或
d.
i.三个与SEQ ID NO:29表示的重链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的重链CDR序列，和
ii.三个与SEQ ID NO:30表示的轻链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的轻链CDR序列，
e.
i.三个与SEQ ID NO:31表示的重链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的重链CDR序列，和
ii.三个与SEQ ID NO:32表示的轻链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的轻链CDR序列，
f.
i.三个与SEQ ID NO:33表示的重链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的重链CDR序列，和
ii.三个与SEQ ID NO:34表示的轻链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的轻链CDR序列，
g.
i.三个与SEQ ID NO:35表示的重链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的重链CDR序列，和
ii.三个与SEQ ID NO:36表示的轻链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的轻链CDR序列，或
h.
i.三个与SEQ ID NO:37表示的重链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的重链CDR序列，和
ii.三个与SEQ ID NO:38表示的轻链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的轻链CDR序列
i.
i.三个与SEQ ID NO:39表示的重链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的重链CDR序列，和
ii.三个与SEQ ID NO:40表示的轻链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的轻链CDR序列，
j.
i.三个与SEQ ID NO:41表示的重链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的重链CDR序列，和
ii.三个与SEQ ID NO:42表示的轻链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的轻链CDR序列，
k.
i.三个与SEQ ID NO:43表示的重链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的重链CDR序列，和
ii.三个与SEQ ID NO:44表示的轻链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的轻链CDR序列，或
l.
m.
i.三个与SEQ ID NO:51表示的重链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的重链CDR序列，和
ii.三个与SEQ ID NO:52表示的轻链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的轻链CDR序列，或
n.
i.三个与SEQ ID NO:53表示的重链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的重链CDR序列，和
三个与SEQ ID NO:54表示的轻链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的轻链CDR序列
o.
i.三个与SEQ ID NO:55表示的重链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的重链CDR序列，和
ii.三个与SEQ ID NO:56表示的轻链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的轻链CDR序列
p.
i.三个与SEQ ID NO:57表示的重链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的重链CDR序列，和
ii.三个与SEQ ID NO:58表示的轻链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的轻链CDR序列，
q.
i.三个与SEQ ID NO:59表示的重链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的重链CDR序列，和
ii.三个与SEQ ID NO:60表示的轻链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的轻链CDR序列，
r.
i.三个与SEQ ID NO:61表示的重链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的重链CDR序列，和
ii.三个与SEQ ID NO:62表示的轻链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的轻链CDR序列，或
s.
i.三个与SEQ ID NO:63表示的重链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的重链CDR序列，和
ii.三个与SEQ ID NO:64表示的轻链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的轻链CDR序列。
98.根据实施方案97的抗体或其抗原结合片段，其中与所示的SEQ ID的CDR相比，所述三个重链CDR序列具有至多9个，如8个，如7个或如6个氨基酸改变。
99.根据实施方案97的抗体或其抗原结合片段，其中与所示的SEQ ID的CDR相比，所述三个重链CDR序列具有至多5个，如4个，如3个，如2个或至多1个氨基酸改变。
100.根据实施方案97的抗体或其抗原结合片段，其中与所示的SEQ ID的CDR相比，所述三个轻链CDR序列具有至多9个，如8个，如7个或如6个氨基酸改变。
101.根据实施方案97的抗体或其抗原结合片段，其中与所示的SEQ ID的CDR相比，所述三个轻链CDR序列具有至多5个，如4个，如3个，如2个或至多1个氨基酸改变。
102.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含
a.由SEQ ID NO:21表示的重链可变域的CDR序列和由SEQID NO:22表示的轻链可变域的CDR序列，
b.由SEQ ID NO:25表示的重链可变域的CDR序列和由SEQID NO:26表示的轻链可变域的CDR序列，
c.由SEQ ID NO:27表示的重链可变域的CDR序列和由SEQ ID NO:28表示的轻链可变域的CDR序列，
d.由SEQ ID NO:29表示的重链可变域的CDR序列和由SEQ ID NO:30表示的轻链可变域的CDR序列，
e.由SEQ ID NO:31表示的重链可变域的CDR序列和由SEQ ID NO:32表示的轻链可变域的CDR序列，
f.由SEQ ID NO:33表示的重链可变域的CDR序列和由SEQ ID NO:34表示的轻链可变域的CDR序列，
g.由SEQ ID NO:35表示的重链可变域的CDR序列和由SEQ ID NO:36表示的轻链可变域的CDR序列，
h.由SEQ ID NO:37表示的重链可变域的CDR序列和由SEQ ID NO:38表示的轻链可变域的CDR序列，
i.由SEQ ID NO:39表示的重链可变域的CDR序列和由SEQ ID NO:40表示的轻链可变域的CDR序列，
j.由SEQ ID NO:41表示的重链可变域的CDR序列和由SEQ ID NO:42表示的轻链可变域的CDR序列，
k.由SEQ ID NO:43表示的重链可变域的CDR序列和由SEQ ID NO:44表示的轻链可变域的CDR序列，
l.由SEQ ID NO:51表示的重链可变域的CDR序列和由SEQ ID NO:52表示的轻链可变域的CDR序列，
m.由SEQ ID NO:53表示的重链可变域的CDR序列和由SEQ ID NO:54表示的轻链可变域的CDR序列，
n.由SEQ ID NO:55表示的重链可变域的CDR序列和由SEQ ID NO:56表示的轻链可变域的CDR序列，
o.由SEQ ID NO:57表示的重链可变域的CDR序列和由SEQ ID NO:58表示的轻链可变域的CDR序列，
p.由SEQ ID NO:59表示的重链可变域的CDR序列和由SEQ ID NO:60表示的轻链可变域的CDR序列，
q.由SEQ ID NO:61表示的重链可变域的CDR序列和由SEQ ID NO:62表示的轻链可变域的CDR序列，或者
r.由SEQ ID NO:63表示的重链可变域的CDR序列和由SEQID NO:64表示的轻链可变域的CDR序列。
103.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含分别由以下序列表示的重链可变域和轻链可变域：
a.SEQ ID NO:21和22，
b.SEQ ID NO:25和26，
c.SEQ ID NO:27和28，
d.SEQ ID NO:29和30，
e.SEQ ID NO:31和32，
f.SEQ ID NO:33和34，
g.SEQ ID NO:35和36，
h.SEQ ID NO:37和38，
i.SEQ ID NO:39和40，
j.SEQ ID NO:41和42，
k.SEQ ID NO:43和44，
l.SEQ ID NO:51和52，
m.SEQ ID NO:53和54，
n.SEQ ID NO:55和56，
o.SEQ ID NO:57和58，
p.SEQ ID NO:59和60，
q.SEQ ID NO:61和62，或
r.SEQ ID NO:63和64。
104.根据实施方案57的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段属于“箱元D”。
105.根据实施方案57的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与参考抗体竞争，其中所述参考抗体包含由SEQ ID NO:47表示的重链可变域和由SEQ IDNO:48表示的轻链可变域。
106.根据前述实施方案的抗体，其中所述参考抗体是Fab。
107.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含
a.与SEQ ID NO:47表示的序列至少90％相同的重链可变域和与SEQ ID NO:48表示的序列至少90％相同的轻链可变域，
b.与SEQ ID NO:45表示的序列至少90％相同的重链可变域和与SEQ ID NO:46表示的序列至少90％相同的轻链可变域，
c.与SEQ ID NO:51表示的序列至少90％相同的重链可变域和与SEQ ID NO:52表示的序列至少90％相同的轻链可变域，
或
d.与SEQ ID NO:61表示的序列至少90％相同的重链可变域和与SEQ ID NO:62表示的序列至少90％相同的轻链可变域。
108.根据实施方案107的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变域与所示的SEQ ID至少92％、94％、96％或98％相同。
109.根据实施方案107的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变域与所示的SEQ ID至少92％、94％、96％或98％相同。
110.根据实施方案108和109的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变域和所述轻链可变域均与所示的SEQ ID至少92％、94％、96％或98％相同。
111.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含
a.
i.三个与SEQ ID NO:47表示的重链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的重链CDR序列，和
ii.三个与SEQ ID NO:48表示的轻链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的轻链CDR序列，
b.
i.三个与SEQ ID NO:45表示的重链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的重链CDR序列，和
ii.三个与SEQ ID NO:46表示的轻链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的轻链CDR序列，
c.
i.三个与SEQ ID NO:51表示的重链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的重链CDR序列，和
ii.三个与SEQ ID NO:52表示的轻链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的轻链CDR序列，或
d.
i.三个与SEQ ID NO:61表示的重链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的重链CDR序列，和
ii.三个与SEQ ID NO:62表示的轻链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的轻链CDR序列。
112.根据实施方案111的抗体或其抗原结合片段，其中与所示的SEQ ID的CDR相比，所述三个重链CDR序列具有至多9个，如8个，如7个或如6个氨基酸改变。
113.根据实施方案111的抗体或其抗原结合片段，其中与所示的SEQ ID的CDR相比，所述三个重链CDR序列具有至多5个，如4个，如3个，如2个或至多1个氨基酸改变。
114.根据实施方案111的抗体或其抗原结合片段，其中与所示的SEQ ID的CDR相比，所述三个轻链CDR序列具有至多9个，如8个，如7个或如6个氨基酸改变。
115.根据实施方案111的抗体或其抗原结合片段，其中与所示的SEQ ID的CDR相比，所述三个轻链CDR序列具有至多5个，如4个，如3个，如2个或至多1个氨基酸改变。
116.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含
a.由SEQ ID NO:47表示的重链可变域的CDR序列和由SEQID NO:48表示的轻链可变域的CDR序列，
b.由SEQ ID NO:45表示的重链可变域的CDR序列和由SEQID NO:46表示的轻链可变域的CDR序列，
c.由SEQ ID NO:51表示的重链可变域的CDR序列和由SEQ ID NO:52表示的轻链可变域的CDR序列，
或
d.由SEQ ID NO:61表示的重链可变域的CDR序列和由SEQ ID NO:62表示的轻链可变域的CDR序列。
117.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含
a.由SEQ ID NO:47表示的重链可变域和由SEQ ID NO:48表示的轻链可变域，
b.由SEQ ID NO:45表示的重链可变域和由SEQ ID NO:46表示的轻链可变域，
c.由SEQ ID NO:51表示的重链可变域和由SEQ ID NO:52表示的轻链可变域，
或
d.由SEQ ID NO:61表示的重链可变域和由SEQ ID NO:62表示的轻链可变域。
118.根据实施方案57的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段属于“箱元E”。
119.根据实施方案57的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与参考抗体竞争，其中所述参考抗体包含由SEQ ID NO:49表示的重链可变域和由SEQ IDNO:50表示的轻链可变域。
120.根据前述实施方案的抗体，其中所述参考抗体是Fab。
121.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:49表示的序列至少90％相同的重链可变域和与SEQ ID NO:50表示的序列至少90％相同的轻链可变域。
122.根据实施方案121的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变域与所示的SEQ ID至少92％、94％、96％或98％相同。
123.根据实施方案121的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变域与所示的SEQ ID至少92％、94％、96％或98％相同。
124.根据实施方案122和123的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变域和所述轻链可变域均与所示的SEQ ID至少92％、94％、96％或98％相同。
125.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含
a.三个与SEQ ID NO:49表示的重链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的重链CDR序列，和
b.三个与SEQ ID NO:50表示的轻链可变域CDR序列相比具有至多10个氨基酸改变的轻链CDR序列。
126.根据实施方案125的抗体或其抗原结合片段，其中与所示的SEQ ID的CDR相比，所述三个重链CDR序列具有至多9个，如8个，如7个或如6个氨基酸改变。
127.根据实施方案125的抗体或其抗原结合片段，其中与所示的SEQ ID的CDR相比，所述三个重链CDR序列具有至多5个，如4个，如3个，如2个或至多1个氨基酸改变。
128.根据实施方案125的抗体或其抗原结合片段，其中与所示的SEQ ID的CDR相比，所述三个轻链CDR序列具有至多9个，如8个，如7个或如6个氨基酸改变。
129.根据实施方案125的抗体或其抗原结合片段，其中与所示的SEQ ID的CDR相比，所述三个轻链CDR序列具有至多5个，如4个，如3个，如2个或至多1个氨基酸改变。
130.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:49表示的重链可变域的CDR序列和由SEQ ID NO:50表示的轻链可变域的CDR序列。
131.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:49表示的重链可变域和由SEQ ID NO:50表示的轻链可变域。
132.能够与FIX/FIXa和FX/FXa结合的多特异性抗体或其抗原结合片段。
133.根据实施方案132的多特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含根据前述实施方案1-131中任一项的抗原结合片段。
134.根据实施方案132的多特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含根据前述实施方案2-30中任一项的抗原结合片段。
135.根据实施方案132的多特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含根据前述实施方案31-52中任一项的抗原结合片段。
136.根据实施方案132的多特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含根据前述实施方案57-131中任一项的抗原结合片段。
137.根据实施方案132的多特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含根据前述实施方案58-75中任一项的抗原结合片段。
138.根据实施方案132的多特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含根据前述实施方案76-89中任一项的抗原结合片段。
139.根据实施方案132的多特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含根据前述实施方案90-103中任一项的抗原结合片段。
140.根据实施方案132的多特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含根据前述实施方案104-117中任一项的抗原结合片段。
141.根据实施方案132的多特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含根据前述实施方案118-131中任一项的抗原结合片段。
142.根据实施方案132的多特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含根据前述实施方案1-56中任一项的抗原结合片段，和根据前述实施方案57-131中任一项的抗原结合片段。
143.根据实施方案132的多特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含根据前述实施方案2-30中任一项的抗原结合片段，和根据前述实施方案58-75中任一项的抗原结合片段。
144.根据实施方案132的多特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含根据前述实施方案2-30中任一项的抗原结合片段，和根据前述实施方案76-89中任一项的抗原结合片段。
145.根据实施方案132的多特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含根据前述实施方案2-30中任一项的抗原结合片段，和根据前述实施方案90-103中任一项的抗原结合片段。
146.根据实施方案132的多特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含根据前述实施方案31-52中任一项的抗原结合片段，和根据前述实施方案58-75中任一项的抗原结合片段。
147.根据实施方案132的多特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含根据前述实施方案31-52中任一项的抗原结合片段，和根据前述实施方案76-89中任一项的抗原结合片段。
148.根据实施方案132的多特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含根据前述实施方案31-52中任一项的抗原结合片段，和根据前述实施方案90-103中任一项的抗原结合片段。
149.根据实施方案132的多特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是能够特异性结合FIX/FIXa和FX/FXa的双特异性抗体，其中结合域衍生自由mAb1-1371/mAb1-1307、mAb1-6705/mAb1-1307、mAb1-1371/mAb0-1886、mAb1-7441/mAb0-1886、mAb1-7447/mAb0-1886、mAb1-7481/mAb0-1886、mAb1-1371/mAb0-1998、mAb1-6716/mAb0-1998、mAb1-6723/mAb0-1998、mAb1-6730/mAb0-1998、mAb1-6731/mAb0-1998、mAb1-6737/mAb0-1998、mAb1-6754/mAb0-1998、mAb1-7378/mAb0-1998、mAb1-7441/mAb0-1998、mAb1-7447/mAb0-1998、mAb/mAb0-1998、mAb1-6723/mAb1-1307、mAb1-6723/mAb0-1886、mAb1-6705/mAb0-1886、mAb1-7481/mAb0-1998和mAb1-6705/mAb0-1998组成的mAb对。
150.根据实施方案132-149中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是促凝血双特异性抗体。
151.根据实施方案132-149中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是能够增加FIXa的促凝血活性的双特异性抗体。
152.根据实施方案132-149中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是能够增加FIXa对FX的酶活性的双特异性抗体。
153.根据实施方案132-149中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是能够在功能上取代FVIII和/或FVIIIa的双特异性抗体。
154.能够刺激FIXa对FX的酶活性的多特异性抗体，其包含识别FIX(SEQ ID NO:1)或其活化形式(FIXa)的第一抗原结合位点和识别FX(SEQ ID NO:2)或其活化形式(FXa)的第二抗原结合位点，其中
a)第一抗原结合位点包含选自mAb1-5743、mAb1-6584、mAb1-8768、mAb1-6037、mAb1-6081、mAb1-4857、mAb1-8780、mAb1-9016、mAb1-9015、mAb1-8467、mAb1-5783或mAb1-5781的抗体的CDR，并且
b)第二抗原结合位点包含选自mAb1-6738、mAb1-6463、mAb1-6723、mAb1-7503或mAb1-6097的抗体的CDR。
155.能够刺激FIXa对FX的酶活性的多特异性抗体，其包含
识别FIX/FIXa的第一多肽，和
识别FX/FXa的第二多肽，其中
a)第一多肽包含mAb1-5743、mAb1-6584、mAb1-8768、mAb1-6037、mAb1-6081、mAb1-4857、mAb1-8780、mAb1-9016、mAb1-9015、mAb1-8467、mAb1-5783或mAb1-5781的重链可变域和轻链可变域，并且
b)第二多肽包含mAb1-6738、mAb1-6463、mAb1-6723、mAb1-7503或mAb1-6097的重链可变域和轻链可变域。
156.根据实施方案154或155中任一项的抗体，其中所述抗体是双特异性抗体。
157.根据实施方案150-156中任一项的抗体，其中使用单价单臂抗FIX/FIXa抗体在如本文所述的FXa生成试验中测定FIXa对FX的酶活性的刺激，其中当使用导致至少80％的FIXa饱和度的单臂抗体浓度进行测量时，刺激指数至少是94、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、3000、4000或5000倍。
158.能够刺激FIXa对FX的酶活性的多特异性抗体，其包含
识别FIX(SEQ ID NO:1)或其活化形式(FIXa)的第一抗原结合位点和识别FX(SEQID NO:2)或其活化形式(FXa)的第二抗原结合位点，其中
第一抗原结合位点能够特异性结合包含FIX/FIXa的氨基酸残基R338的表位，并且
其中第二抗原结合位点能够结合在FX/FXa的EGF-2结构域和/或催化亚单位中。
159.根据实施方案158的多特异性抗体，其中
第一抗原结合位点能够特异性结合包含FIX/FIXa的氨基酸残基R338和K341的表位。
160.根据实施方案159的多特异性抗体，其中
第一抗原结合位点能够特异性结合包含FIX/FIXa的氨基酸残基L337、R338、S339、T340、K341和T343的表位。
161.能够刺激FIXa对FX的酶活性的多特异性抗体，其包含识别FIX(SEQ ID NO:1)或其活化形式FIXa的第一抗原结合位点和识别FX(SEQ ID NO:2)或其活化形式(FXa)的第二抗原结合位点
其中
第一抗原结合位点能够特异性结合包含FIX/FIXa的氨基酸残基D332、R333、L337和R338的表位，并且
其中第二抗原结合位点能够结合在FX/FXa的EGF-2结构域和/或催化亚单位中。
162.根据实施方案161的多特异性抗体，其中
第一抗原结合位点能够特异性结合包含FIX/FIXa的氨基酸残基K301、D332、R333、A334、T335、R338、N346的表位。
163.能够刺激FIXa对FX的酶活性的多特异性抗体，其包含
识别FIX/FIXa的第一抗原结合位点，和
识别FX/FXa的第二抗原结合位点
其中
第一抗原结合位点能够特异性结合包含FIX/FIXa的氨基酸残基H257、K293和N406的表位，并且
其中第二抗原结合位点能够结合在FX/FXa的EGF-2结构域和/或催化亚单位中。
164.根据实施方案1-56和132-156中任一项的抗体，其中使用单价单臂抗FIX/FIXa抗体在如本文所述的FXa生成试验中测量FIXa对FX的酶活性的刺激，其中当使用导致至少80％的FIXa饱和度的单臂抗体浓度进行测量时，刺激指数至少是94、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、3000、4000或5000倍。
165.根据实施方案1-56和132-156中任一项的抗体，其中使用单价单臂抗FIX/FIXa抗体在如本文所述的FXa生成试验中测量FIXa对FX的酶活性的刺激，其中当使用导致至少80％的FIXa饱和度的单臂抗体浓度进行测量时，刺激指数为50-5000倍，如94至2500倍，如100至2500倍，如200至2500倍，如300至2500倍，如400至2500倍，如500至2500倍，如600至2500倍，如700至2500倍，如800至2500倍，如500至2500倍，如600至2500倍，如700至2500倍，如800至2500倍，如900至2500倍，如1000至2500倍，或如1500至2500倍。
166.根据前述实施方案中任一项的抗体，其中所述抗体是促凝血抗体。
167.根据前述实施方案中任一项的抗体，其中所述抗体在功能上取代FVIII和/或FVIIIa。
168.根据前述实施方案中任一项的抗体，其中所述抗体是双特异性抗体。
169.根据前述实施方案中任一项的抗体，其中抗体同种型是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其组合。
170.根据实施方案57-131中任一项的抗体，其中所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变域包含氨基酸残基R57、R96(SEQ ID NO:22)，并且其中所述抗体的重链可变域包含氨基酸残基W33、D52、D55、H100、Y101、Y102、H103(SEQ ID NO:21)。
171.根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段，其用于凝血病或凝血障碍的治疗方法中。
172.包含根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段的药物组合物，其用于治疗凝血病或凝血障碍。
173.治疗患有凝血病或凝血障碍的受试者的方法，其包括向所述受试者施用根据前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合片段。
174.根据实施方案173的方法，其中所述凝血病或凝血障碍是A型血友病或具有抑制物的A型血友病。
实施例
缩写列表
ACN： 乙腈
CDR： 互补决定区
EGR-CK： EGR-氯甲基酮
LC-MS： 液相色谱-质谱法
FACS： 荧光激活细胞分选
FIX： 凝血因子IX
FIXa： 凝血因子IXa
FX： 凝血因子X.
FXa： 凝血因子Xa
HA： A型血友病
HA-PPP： HA诱导的人贫血小板血浆
HA-PRP： HA诱导的人富血小板血浆
hFIXa： 人凝血因子IXa
ITC： 等温滴定量热法
MACS： 磁激活细胞分选
OA： 单臂
PCR： 聚合酶链反应
SPR： 表面等离子体共振
实施例1：因子IX/FIXa Fab和mAb表达质粒的开发
使用各种抗体开发方法鉴定如本文公开的FIX/FIXa结合抗体。为了产生针对FIXa和FX的一组多样化的抗体，进行了小鼠和兔的免疫以及基于噬菌体展示和Adimab酵母展示的选择。
Adimab酵母展示
Adimab平台是一种酵母展示系统，其包括完全人类幼稚lgG1/kappa文库，该文库的多样性为1010，并且覆盖42个VH家族中的20个。所使用的抗体噬菌体展示平台是专有的完全人类Fab展示文库。该文库的大小为1010，并且通过利用轻链以及重链CDR1和CDR2的化学合成并辅以从人外周血单核细胞中PCR扩增重链CDR3的组合方法构建。使用基于MACS和FACS的方法指导抗体选择过程，该方法允许实时监测所应用的选择标准。由于选择基于MACS和FACS，因此需要标记的抗原(例如生物素)。使用生物素标记的活性位点抑制的hFIXa(FIXa-EGR-生物素)或抗体介导的hFIXa固定进行选择活动。使用Bio-layer干涉测量法(Octet fortebio系统)评价命中物(hit)的结合。
噬菌体展示
为了使表位多样性的覆盖最大化，探索了不同的淘选策略，包括使用生物素化的FIXa-EGR、FX、活性位点抑制的FXa的淘选，或使用抗FIXa抗体的抗原捕获。通过噬菌体ELISA鉴定初始命中物。序列分析后，对独特的命中物进行克隆，表达为IgG1，并使用SPR(Biacore)或Bio-layer干涉测量法(Octet fortebio系统)进行排名。
体内平台
为了在小鼠中产生完全人类抗体，使用KymouseTM小鼠HK和HL1.0(分别使用κ和λ链)。在野生型小鼠和兔中进行另外的免疫，以使抗体多样性最大化。
抗FIXa抗体的生成
使用标准方案，用FIXa、FIXa-EGR或FX免疫小鼠或兔。通过ELISA筛选在小鼠或兔中产生的抗体。使用随机生物素化的FIXa-EGR对FIXa结合兔B细胞进行FACS分选。对来自兔和小鼠的抗体命中物进行重组表达(兔mAb)或扩增(小鼠杂交瘤)，随后对抗体进行小规模纯化。
抗FX抗体的生成
使用标准或多部位重复免疫(RIMMS)方案，用FX免疫Kymouse小鼠和兔。使用随机生物素化的FX，通过FACS分选来分离兔B细胞。使用ELISA和Octet fortebio系统筛选来自融合和分选的抗FX mAb。
Kymouse和wt小鼠来源的抗体的测序
使用标准技术，对来源于Kymouse小鼠或wt小鼠的产生抗FIXa和抗FX抗体的杂交瘤进行测序，并在HEK293细胞中表达。使用Octet fortebio系统评价所表达的抗体的结合。
将得到的所选抗体的可变域(VH和VL)编码DNA序列插入基于pTT的哺乳动物表达载体(Durocher等人(2002)Nucleic Acid Res.30:E9)中或插入含有抗体恒定区编码DNA序列的pcDNA3.4哺乳动物表达载体(Invitrogen)中。对于pTT/pcDNA3.4mAb表达载体，VH和VLDNA序列分别与人IgG1或IgG4S228P(CH1CH2CH3)或人CLκ恒定区编码DNA序列符合读框地插入。对于相应的pTT/pcDNA3.4Fab表达载体，将VH DNA序列与人IgG1CH1编码DNA序列符合读框地插入。
对于以下实施例6、8和18中使用的224F3参考化合物，224F3VH和VL序列获自EP1660536B1(分别为SEQ ID NO:1和2)。224F3VH和VL编码DNA序列分别与人IgG1(CH1CH2CH3)或人CLκ恒定区编码DNA序列符合读框地插入基于pTT5/pcDNA3.4的哺乳动物表达载体中。
所有表达载体均包括含有kozak序列的5'端DNA序列和与抗体编码DNA序列符合读框的编码信号肽的DNA序列。
实施例2：抗体和抗体Fab片段的重组表达
基本上按照制造商的说明，使用HEK293悬浮细胞(293Expi，Invitrogen)的瞬时转染表达抗体和抗体Fab片段。293Expi细胞通常在补充有1％P/S(GIBCO目录号15140-122)的Expi293F表达培养基(Invitrogen，目录号A1435104)中每3-4天进行传代培养。使用Expifectamine以2.5-3mill/mL的细胞密度转染Expi293F细胞。对于每升Expi293F细胞，通过将总共1mg质粒DNA(1:1比例的VH-CH1(对于Fab)或VH-CH1-CH2-CH3(对于mAb)和LC质粒)稀释到50mL Optimem(GIBCO，目录号51985-026，稀释液A)中并将2.7mL Expifectamine稀释到50mL Optimem(稀释液B)中进行转染。对于产生Fab和mAb的共转染，分别以1:1的比例使用VH-CH1和LC质粒(Fab)以及VH-CH1-CH2-CH3和LC质粒(mAb)。将稀释液A和B混合并在室温下孵育10-20分钟。之后将转染混合物加至Expi293F细胞，并将细胞在轨道旋转(85-125rpm)下在潮湿培养箱中于37℃孵育。转染后一天，向转染的细胞补充5ml ExpiFectamine 293转染增强剂(Transfection Enhancer)1和50ml ExpiFectamine 293转染增强剂2。一般在转染后4-5天通过离心然后过滤收获细胞培养上清液。
实施例3：Fab和抗体的纯化和表征
Fab纯化和表征
Fab分子的纯化按照两步过程进行，该过程由使用kappaSelect树脂(GEHealthcare，目录号17-5458-11)的亲和色谱法和使用Superdex200树脂(GE Healthcare，目录号17-1043-04)的大小排阻色谱法组成。使用色谱系统(GEHealthcare，目录号18-1112-41)进行纯化。用于亲和纯化步骤的缓冲液体系是由20mM磷酸钠pH 7.2、150mM NaCl组成的平衡缓冲液和由10mM甲酸pH 3.5组成的洗脱缓冲液以及由0.4M磷酸钠pH 9.0组成的pH调节缓冲液。将细胞上清液无需任何调整直接加样至预平衡的kappaSelect SuRe柱上。用10倍柱体积的平衡缓冲液洗柱，并用大约5倍柱体积的洗脱缓冲液等度洗脱Fab分子。在洗脱后立即使用所述pH调节缓冲液将合并的级分的pH调节至中性。使用预先填充在柱中的所述凝胶过滤树脂进一步纯化Fab分子并进行缓冲液更换。用于大小排阻色谱法的运行缓冲液是25mM HEPES和150mMNaCl，pH 7.4。Fab分子在大约0.5个柱体积时作为单峰洗脱下来。使用在Agilent LC 1100/1200系统上的大小排阻高效液相色谱(SE-HPLC)方法设置并使用BIOSep-SEC-S3000300×7.8mm柱(Phenomenex，目录号00H-2146-K0)和由200mM磷酸钠pH 6.9、300mM NaCl和10％异丙醇组成的运行缓冲液分析覆盖该峰的级分。基于该分析，合并级分以获得同源蛋白质制品。以1ml/min的流速，在大约10min的保留时间时，最终制品作为单一对称峰洗脱下来。
使用SDS-PAGE/考马斯和液相色谱质谱分析进一步表征纯化的Fab分子。使用NuPage 4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen，目录号NP0321BOX)进行SDS-PAGE/考马斯分析。所有Fab分子都显示出预期的轻链和重链组分。在Agilent 6210仪器和脱盐柱MassPREP(Waters，目录号USRM10008656)上使用液相色谱电喷雾离子化飞行时间质谱法设置进行完整分子量测定。使用的缓冲液体系是由在LC-MS级-H2O中的0.1％甲酸组成的平衡缓冲液和由在LC-MS级-ACN中的0.1％甲酸组成的洗脱缓冲液。所有Fab分子都显示出符合序列的预期完整分子量。基于SE-HPLC分析确定最终纯度。不同Fab片段的纯度估计值均在95-99％之间。为了确定最终的蛋白质浓度，使用NanoDrop分光光度计(Thermo Scientific)进行280nm处的吸光度测量，并使用对于每种Fab分子的比消光系数计算浓度。
抗体纯化和表征
使用蛋白A MabSelect SuRe树脂(GE Healthcare，目录号17-5438-01)，通过亲和色谱法进行抗体的纯化。使用色谱系统(GE Healthcare，目录号18-1112-41)进行纯化。用于亲和纯化步骤的缓冲液体系是由20mM磷酸钠pH 7.2、150mM NaCl组成的平衡缓冲液和由10mM甲酸pH 3.5组成的洗脱缓冲液以及由0.4M磷酸钠pH 9.0组成的pH调节缓冲液。将细胞上清液无需任何调整直接加样至预平衡的MabSelect SuRe柱上。用10倍柱体积的平衡缓冲液洗柱，并用大约2-5倍柱体积的洗脱缓冲液等度洗脱抗体。在洗脱后立即使用所述pH调节缓冲液将合并的级分的pH调节至中性。
使用SDS-PAGE/考马斯、大小排阻高压液相色谱法(SE-HPLC)和液相色谱质谱(LC-MS)分析表征纯化的抗体。使用NuPage 4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen，目录号NP0321BOX)进行SDS-PAGE/考马斯分析。在此，所有抗体都显示出预期的轻链和重链组分。在Agilent6210仪器和脱盐柱MassPREP(Waters，目录号USRM10008656)上使用液相色谱电喷雾离子化飞行时间质谱法设置进行完整分子量测定。使用的缓冲液体系是由在LC-MS级-H2O中的0.1％甲酸组成的平衡缓冲液和由在LC-MS级-ACN中的0.1％甲酸组成的洗脱缓冲液。使用和不使用N-糖苷酶F(Roche Diagnostics，目录号11365177001)和还原剂(即，巯基乙醇或DTT)进行分析。所有抗体均显示出符合序列和一个重链N-聚糖的预期完整分子量。基于SE-HPLC测定纯度。基于在Agilent LC1100/1200系统上的SE-HPLC方法设置并使用BIOSep-SEC-S3000300×7.8mm柱(Phenomenex，目录号00H-2146-K0)和由200mM磷酸钠pH6.9、300mM NaCl和10％异丙醇组成的运行缓冲液分析最终蛋白质纯度。UV280和荧光(Ex280nm/Em 354nm)检测器用于检测。抗体作为单一对称峰洗脱下来，保留时间反映抗体的大小。不同抗体的纯度估计值均在95-99％之间。为了测定最终蛋白质浓度，使用NanoDrop分光光度计(Thermo Scientific)以及对于每种抗体的比消光系数。
实施例4：抗FIXa刺激抗体的分箱
在分箱实验中分析被选择为能够刺激FIXa对FX的酶活性的抗体，以使用下述方法确定所鉴定的抗体的结合特征。
抗体分箱方法
使用配备有抗人IgG传感器(Pall Life Sciences,Menlo Park,CA)的Octetfortebio系统(HTX，Red384)并使用8或32通道模式(Red384和HTX)进行分箱实验。使用经典的夹心表位分箱设置进行分箱试验。简言之，(1)通过抗人AHC尖端(抗人IgG Fc捕获尖端(AHC部件号：18-5064)捕获第一抗体，(2)用人多克隆IgG(I4506SIGMA)封闭AHC尖端上的未封闭IgG结合位点，(3)使FIXa与第一抗体结合，(4)向尖端上的抗体-抗原复合物提供竞争抗体，并且如果没有检测到第二抗体的结合，则将抗体评分为属于同一箱元。
该分析鉴定了两个不同的箱元——箱元1和2，分别由抗体mAb0-1886和mAb1-1307定义。
抗FIX抗体的分箱
将选择的抗FIX抗体相对于彼此分箱，并鉴定出两个不同的箱元(箱元1和2)。数字是指mAb ID，例如0-1998表示mAb0-1998。
此概述显示，发现几种抗体属于箱元1，包括mAb0-1886和mAb0-1998。发现箱元2除了mAb1-1307外还包括四种抗体。mAb1-0072和mAb1-0073这两种抗体是箱元1和2共有的。
本文所公开的亲本抗体(谱系)的变体与亲本抗体共有箱元和表位(热点)残基
由于在本实施例中提供数据的抗体变体在基于实施例5中提供的亲本抗体-FIXa复合物的晶体结构显示对表位识别至关重要的位置上不含氨基酸置换，本领域技术人员将理解，作为起点的变体将与它们所源自的抗体即mAb0-1998、mAb0-1886或mAb1-1307属于同一箱元，与之竞争结合，并且至少识别FIX/FIXa表位中相同的热点残基。
实施例5：使用X射线晶体学的抗FIX/FIXa抗体的结晶和表位作图
用于结晶的FIXa蛋白(Cambridge ProteinWorks，产品代码10316)由截短的轻链(SEQ ID NO:1的残基85-142)和含有SEQ ID NO:1的残基181-415的重链组成，由于细菌表达，该轻链具有附接在N末端的非天然甲硫氨酸残基。EGR-氯甲基酮封闭蛋白酶的活性位点。
结晶
Fab0-7237：FIXa
使用悬滴蒸气扩散技术，使得以1:1摩尔比与FIXa蛋白混合的Fab0-7237(对应于mAb0-1886的Fab片段)晶体在18℃下生长。将0.8μl 7.5mg/ml在20mM Tris-HCl，pH 7.4、50mM NaCl和2.5mM CaCl2中的蛋白质溶液与等体积的作为沉淀剂的4M甲酸钠混合，并在1ml沉淀剂上孵育。
Fab0-7238：FIXa
使用沉滴蒸气扩散技术，使得以1:1摩尔比与FIXa蛋白混合的Fab0-7238(对应于mAb0-1998的Fab片段)晶体在18℃下生长。将0.1μl 6.2mg/ml在20mM Tris-HCl，pH 7.4、50mM NaCl和2.5mM CaCl2中的蛋白质溶液与0.1μl作为沉淀剂的100mM二甲胂酸钠，pH 6.5和1M柠檬酸三钠混合，并在60μl沉淀剂上孵育。
Fab0-7236：FIXa
使用沉滴蒸气扩散技术，使得以1:1摩尔比与FIXa蛋白混合的Fab0-7236(对应于mAb1-1307的Fab片段)晶体在18℃下生长。将0.1μl 6.4mg/ml在20mM Tris-HCl，pH 7.4、50mM NaCl和2.5mM CaCl2中的蛋白质溶液与等体积的作为沉淀剂的0.2M硫酸锂、40(v/v)％PEG400和0.1M Tris pH 8.5混合，并在1ml沉淀剂上孵育。
衍射数据收集
Fab0-7237：FIXa
在液氮中快速冷却之前，将晶体在由3M甲酸钠、4％甘油、4％乙二醇、4.5％蔗糖和1％葡萄糖组成的溶液中冷冻保护。使用来自Dectris的Pilatus2M像素检测器，在SwissLight Source光束线X06DA( 波长)下在100K下收集衍射数据。使用来自XDS包的程序进行数据的自动索引、积分和缩放(衍射数据统计信息总结在表1中)。
Fab0-7238：FIXa
在液氮中快速冷却之前，将晶体在由75mM二甲胂酸钠，pH 6.5和0.75M柠檬酸三钠、4％甘油、4％乙二醇、4.5％蔗糖和1％葡萄糖组成的溶液中冷冻保护。使用来自Dectris的Pilatus2M像素检测器，在Swiss Light Source光束线X06DA(波长)下在100K下收集衍射数据。使用来自XDS包的程序进行数据的自动索引、积分和缩放(衍射数据统计信息总结在表1中)。
Fab0-7236：FIXa
在液氮中快速冷却之前，将三种晶体在由0.15M硫酸锂、30(v/v)％PEG400和0.075M Tris pH 8.5、4％甘油、4％乙二醇、4.5％蔗糖和1％葡萄糖组成的溶液中冷冻保护。使用来自Dectris的Pilatus2M像素检测器，在Swiss Light Source光束线X06DA(波长)下在100K下收集衍射数据。使用来自XDS包的程序进行数据的自动索引、积分、合并和缩放(衍射数据统计信息总结在表1中)。
结构确定和精修
Fab0-7237：FIXa
使用如在程序套件Phenix中实施的Phaser，以蛋白质数据库条目4NP4的H和L链以及来自蛋白质数据库条目3KCG的H和L链通过分子替换确定结构。不对称单元含有两个Fab:FIXa复合物。该模型使用Phenix精修和COOT中的手动重建步骤进行精修。精修统计数据见表1。
Fab0-7238：FIXa
使用如在程序套件Phenix中实施的Phaser，以蛋白质数据库条目4PUB的H和L链以及来自蛋白质数据库条目3KCG的H和L链通过分子替换确定结构。不对称单元含有两个Fab:FIXa复合物。该模型使用Phenix精修和COOT中的手动重建步骤进行精修。精修统计数据见表1。
Fab0-7236：FIXa
使用如在程序套件Phenix中实施的Phaser，以上述Fab0-7238:FIXa复合物的复合物结构的Fab部分以及来自蛋白质数据库条目3KCG的H和L链通过分子替换确定结构。不对称单元含有一个Fab:FIXa复合物。该模型使用Phenix精修和COOT中的手动重建步骤进行精修。精修统计数据见表1。
表1-数据收集和精修统计数据
最高分辨率壳层(shell)的统计数据显示在括号中。
表位的确定
基于以上所述，发现mAb0-1998、mAb1-1307和mAb0-1886与FIXa上的不同表位结合，其中表位被定义为在距离抗体中的重原子的距离内具有至少一个重原子的残基。
mAb0-1998表位位于170-环中，并且在蛋白酶结构域中包含以下残基：L337、R338、S339、T340、K341和T343。
mAb1-1307表位包含以下残基：H256、H257、N258、K293、R403、Y404、N406、W407、E410和K411。
mAb0-1886表位位于170-螺旋中，并且在蛋白酶结构域中包含以下残基：K301、D332、R333、A334、T335、R338和N346。
发现mAb0-1998和mAb0-1886的表位重叠，这与这两种抗体竞争结合FIX/FIXa的观察结果(实施例4)非常相符。
本文所公开的亲本抗体(谱系)的变体与亲本抗体共有箱元和表位(热点)残基
由于在以上实施例4和以下某些实施例中提供数据的抗体变体在基于本实施例中提供的亲本抗体-FIXa复合物的晶体结构显示对表位识别至关重要的位置上不含氨基酸置换，本领域技术人员将理解，作为起点的变体将与它们所源自的抗体即mAb0-1998、mAb0-1886或mAb1-1307属于同一箱元，与之竞争结合，并且至少识别FIX/FIXa表位中相同的热点残基。
实施例6：二价抗FIX/FIXa抗体在FXa生成试验中的活性
根据Scheiflinger等人(2008)J Thromb Haemost,6:315-322描述的原理，由其在促凝血磷脂膜的存在下促进FIXa激活FX的能力来确定二价抗FIX/FIXa抗体对于FIXa针对FX的酶活性的刺激作用。鉴于抗FIXa抗体224F3在Scheiflinger等人鉴定的抗体中的高活性，在以下实验中选择224F3作为参考(关于224F3构建的信息参见实施例1)。
在384孔板中的自动化高通量生化试验中测量抗FIXa抗体对FIXa介导的FX向FXa活化的刺激作用。简言之，将FIXa与纯化的抗体以四点、5倍剂量-响应混合。加入FX/磷脂(PL)混合物，通过加入FXa底物(Pefaflour)测量FXa生成，并通过在多标记读数器(PheraSTAR)上检测荧光5分钟来测定底物水解速率。相对FIXa刺激活性被计算为来自FIXa-抗体复合物相比于单独FIXa的FXa生成速率。
通过与3nM人血浆来源的FIXa(Haematologic Technologies Inc,USA)和10μM25:75磷脂酰丝氨酸:磷脂酰胆碱磷脂囊泡(Haematologic Technologies Inc,USA)在测定缓冲液(50mM HEPES，100mMNaCl，5mM CaCl2，0.1％(w/v)PEG8000，pH 7.3+1mg/ml BSA)中预孵育10分钟，然后加入人血浆来源的FX(Haematologic Technologies Inc,USA)至150nM的浓度，在0-200nM的浓度范围内测试每种抗体。在室温下激活10min后，通过加入25μl猝灭缓冲液(50mM HEPES，100mMNaCl，60mM EDTA，0.1％PEG8000，pH 7.3+1mg/ml BSA)猝灭反应(50μl)。然后通过添加25μl 2mM S-2765生色底物(Chromogenix,Sweden)并通过在酶标仪中在405nm处测量吸光度(ΔOD/min)测量生色底物转化来测定生成的FXa的量。从用已知量的人血浆来源的FXa(Haematologic Technologies Inc,USA)制作的标准曲线确定每种抗体浓度下的FXa生成速率。
表2列出了每种抗体在测试浓度下的测量的FXa生成速率。由此，计算每种抗体的峰值刺激活性，作为观察到的相对于224F3的最大FXa生成速率。该数据显示在表3中，其显示属于三个家族(分别为0-1886、0-1998和1-1307)中的每一个的抗体具有是针对224F3观察到的活性(Scheiflinger等人)的10-67倍的活性。
表2-FXa生成速率
对于列出的抗FIX/FIXa抗体，以pM/min(平均值±SD，n＝2)表示的FXa生成速率。如第一列所示，每种抗体在0-200nM的浓度范围内测试。
表3-峰值刺激活性
在FXa生成试验中，抗FIX/FIXa抗体相对于224F3(Scheiflinger等人)的峰值刺激活性(平均值±SD，n＝2)。
实施例7：单价(单臂)抗体的制备
为了避免与常规单特异性和二价抗体相关的任何潜在的亲合力效应，例如，在FXa生成试验(实施例8)和某些SPR实验(实施例14和15)中，使用单价单臂(OA)抗体形式，如Martens等人:A Novel One-Armed Anti-c-Met Antibody Inhibits GlioblastomaGrowth In vivo.Clin.Cancer Res.12,6144-6152(2006)所述，其中完整重链、截短的重链(缺少Fab区)和轻链共表达。本发明并非共表达Martens等人描述的三条链，而是如针对双特异性抗体所述(实施例10)，使用原理制备单价抗体。因此，通过混合完整的单特异性和二价抗体和截短的重链二聚体(在形式上通过去除Fab区而由完整抗体衍生而来)并允许在与实施例10所述相同的实验条件下进行链交换来制备单价抗体。单价抗体的形成需要抗体和截短的重链二聚体携带适当的互补突变以促进异二聚化，即，如实施例10所述，用于lgG1的F405L/K409R和用于IgG4的F405L+R409K/WT。
在IgG1亚型的单价抗体的情况下，重链的截短可以是从N末端到Cys 220与上面的铰链Cys 226之间的位置(EU编号)。截短的IgG1重链的一个具体实例是残基1-220被截短的IgG1重链。
在IgG4亚型的单价抗体的情况下，重链的截短可以是从N末端到Cys 200与上面的铰链Cys 226之间的位置(EU编号)。截短的IgG4重链的一个具体实例是残基1-214被截短的IgG4重链。
实施例8：单价抗FIX/FIXa抗体在FXa生成试验中的活性
为了避免由于常规抗体形式的二价性而产生的任何潜在的亲合力效应，在重新格式化为单价单臂(OA)抗体形式后，确定抗FIX/FIXa抗体对于FIXa针对FX的酶活性的刺激活性(参见实施例8)。所测试的抗体列于以下表4中。包括实施例7中也提及的抗FIXa抗体224F3(表示为mAb1-1582)的单价OA形式以供比较。
在固定浓度的磷脂酰丝氨酸(PS):磷脂酰胆碱(PC)磷脂囊泡(终浓度500μM；Haematologic Technologies Inc,USA)和血浆来源的FIXa(终浓度0.17、0.5或1nM；Haematologic Technologies Inc,USA)下，在测定缓冲液(50mM HEPES，100mM NaCl，5mMCaCl2，0.1％(w/v)PEG8000，pH 7.3+1mg/ml BSA)中测定OA抗体的刺激活性。选择FIXa的浓度以确保少于15％的底物FX转化为FXa。在单价OA抗体(表1中列出的终浓度)的存在下预孵育后，加入150nM血浆来源的FX以达到50μl的最终反应体积，并使激活在室温下进行20min。然后通过加入25μl猝灭缓冲液(50mM HEPES，100mMNaCl，60mM EDTA，0.1％PEG8000，pH 7.3+1mg/ml BSA)猝灭反应，并且通过进一步添加25μl 2mM S-2765生色底物(Chromogenix,Sweden)，并在酶标仪中通过405nm处的吸光度测量(ΔOD/min)测定生色底物转化，来确定生成的FXa的量。通过减去在除了将FIXa和抗体替换为测定缓冲液外相同的试验中测得的信号来针对背景活性校正测得的活性，然后根据该试验中存在的FIXa的浓度([FIXa]总)进行归一化。将该数值除以在不存在抗体的情况下类似归一化的FXa生成速率(AFIXa，norm)，计算抗体刺激指数，提供该抗体在所用浓度下对FIXa活性的刺激倍数。由于游离FIXa产生FXa的速度缓慢，如上所述进行在不存在抗体的情况下的激活反应，但存在5、10或20nM FIXa。然后对测得的活性进行背景减除，并根据该试验中的FIXa浓度进行归一化。为了计算刺激指数，使用游离FIXa的三个归一化活性的平均值。
刺激指数的确定
总之，刺激指数的计算可以描述如下
刺激指数＝((AFIXa+OA–A背景)/[FIXa]总)/AFIXa,norm
其中AFIXa+OA是在OA抗体的存在下测得的活性，A背景是在不存在FIXa和单价抗体的情况下测得的背景活性，[FIXa]总是该试验中的FIXa浓度，而AFIXa,norm是游离FIXa的平均归一化活性。
FIXa饱和度的确定
在该试验中用OA抗体饱和的FIXa的分数通过FIXa和OA抗体的浓度以及控制其相互作用的平衡解离常数(Kd)来确定。后者可以通过本领域已知的技术如等温滴定量热法(ITC)来测量。
由于刺激指数将随着OA抗体浓度的增加而增加，直至达到FIXa饱和，因此应选择该试验中OA抗体的浓度以确保该试验中FIXa的饱和度至少为80％，以提供完全FIXa饱和时刺激指数的适当估计值。
平衡时与OA抗体结合的FIXa的分数(fFIXa+OA)可以使用如Krishnaswamy等人(1992)J.Biol.Chem.,267:23696-23706描述并在以下方程式1和2中详述的二次结合方程式，从该试验中FIXa([FIXa]总)和OA([OA]总)的总浓度以及针对其相互作用的平衡解离常数(Kd)来计算，在该方程式中
[FIXa+OA]assav表示在试验中平衡时FIXa-OA抗体复合物的计算浓度
fFIXa+OA表示在试验中平衡时与OA抗体结合的FIXa的计算分数(以百分比表示)
方程式1：
方程式2：
表4中提供了每种单价OA抗体的刺激指数。对于所有测试的抗体，发现测得的刺激指数均高于针对单价单臂224F3抗体(mAb1-1582)测得的刺激指数。
如Kerschbaumer等人(US7297336-B2)所报道的，在试验中单臂224F3抗体的浓度为3260nM且与FIXa相互作用的Kd为0.477nM的情况下，超过95％的FIXa在试验中与单臂224F3抗体结合。
表4-单价单臂(OA)抗FIXa抗体对FIXa活性的刺激
抗FIX mAb ID是指用于重新格式化为OA形式的抗体的ID。标记为“OA抗体浓度(nM)”和“刺激指数”的列列出了该试验中使用的OA抗体的浓度(nM)以及相对于游离FIXa测得的FIXa活性的相应刺激。
| 抗FIX mAb ID | 谱系 | OA抗体浓度(nM) | 刺激指数 |
| 1-7977 | 0-1998 | 800 | 850 |
| 1-8785 | 0-1998 | 800 | 621 |
| 1-8782 | 0-1998 | 1600 | 417 |
| 1-8780 | 0-1998 | 1600 | 1651 |
| 1-8543 | 0-1998 | 1600 | 283 |
| 1-8679 | 0-1998 | 1600 | 918 |
| 1-9016 | 0-1998 | 1600 | 4319 |
| 1-9015 | 0-1998 | 1600 | 1334 |
| 1-9002 | 0-1998 | 800 | 567 |
| 1-9058 | 0-1998 | 1600 | 531 |
| 1-9134 | 0-1998 | 1600 | 320 |
| 1-8467 | 0-1998 | 1600 | 1020 |
| 1-9285 | 0-1998 | 800 | 732 |
| 1-8459 | 0-1998 | 1600 | 799 |
| 1-5797 | 0-1886 | 474 | 382 |
| 1-5796 | 0-1886 | 900 | 239 |
| 1-5783 | 0-1886 | 264 | 1036 |
| 1-5781 | 0-1886 | 564 | 1219 |
| 1-5754 | 0-1886 | 1478 | 615 |
| 1-6609 | 0-1886 | 800 | 94 |
| 1-6606 | 0-1886 | 800 | 133 |
| 1-6592 | 0-1886 | 800 | 916 |
| 1-6590 | 0-1886 | 800 | 1287 |
| 1-6586 | 0-1886 | 800 | 94 |
| 1-6584 | 0-1886 | 800 | 580 |
| 1-6582 | 0-1886 | 800 | 692 |
| 1-6566 | 0-1886 | 204 | 690 |
| 224F3(1-1582) | - | 3260 | <10 |
实施例9：抗FX/FXa Fab和mAb表达质粒的开发
使用标准抗体开发方法开发如本文公开的抗FX/FXa抗体，并如实施例1中针对抗FIX/FIXa Fab和mAb表达质粒所述制备表达质粒。同样如实施例2和3中针对抗FIX/FIXa抗体所述，进行抗FX/Xa抗体的表达、纯化和表征。
实施例10：通过体外装配制备的双特异性抗体
对于双特异性IgG1抗体通过描述的(Labrijn等人.PNAS 2013,vol.110,pp.5145–5150)方法(Genmab)，而对于双特异性IgG4抗体使用略微修饰的变体，通过体外装配第一和第二抗体产生双特异性抗体，如以下所详述。
对于IgG1，第一抗体的重链恒定区是IgG1K409R(抗FIX/FIXa)，第二抗体的重链恒定区是IgG1F405L(抗FX/FXa)。如前所述，IgG1可以是具有降低的效应功能的IgG1变体。
对于IgG4，第一抗体的重链恒定区是IgG4S228P(抗FIX/FIXa)，第二抗体的重链恒定区是IgG4S228P F405L R409K(抗FX)。这两种亲本抗体如实施例1-3所述产生。Fab臂交换反应在使用75mM 2-巯基乙胺(2-MEA)的还原条件下在HEPES缓冲液(pH 7.4)中进行，并在30℃下孵育3小时。
实施例11：双特异性抗体的促凝血活性
通过如上所述的技术将抗FIXa和抗hFX抗体对制成双特异性抗体(实施例10)。在各种试验如上述FXa生成试验(实施例6)和下段所述的凝血酶生成试验(TGT)中测试这些双特异性抗体的促凝血活性。
凝血酶生成试验(TGT)分析
TGT在使用高岭土触发的自动化HTP 384孔设置下进行(HaemoneticsCorporation，#6300)。简言之，将抗体以111nM的浓度添加(除了以55nM添加的mAb1-1371和以166nM添加的mAb1-0021)至A型血友病(HA)血浆(George King)。然后加入与磷脂混合的高岭土(Rossix，#PL604T)，随后加入FIIa底物(FluCa，Thrombinoscope，#TS50.00)。在Perkin Elmer EnVision多标记读板仪上以1分钟间隔测量荧光2小时。将峰高计算为在凝血图(thrombogram)中观察到的最大值，然后相对于对参考抗FIXa和抗FX抗体观察到的峰高进行归一化。该参考抗体总是包括来自抗FX抗体mAb1-2375的结合域(由SEQ ID NO:93和94表示)与来自三个家族中的每一个的FIX结构域(由mAb1-4707、mAb1-5788和mAb1-4857表示)的组合。根据它们的相对TGT活性，将抗体分组为低(0-24％)、+(24-50％)、++(50-75％)和+++(>75％)，其中+是优选的，++更优选，+++最优选。
双特异性抗FIXa/抗FX抗体的优选组合的选择
大量抗FX抗体作为与属于mAb1-1307、mAb0-1886和mAb0-1998这三个谱系的抗FIXa抗体变体相组合的双特异性抗体进行测试。表5中显示了在TGT试验中显示出显著活性的抗FIXa/抗FX对的选定组合。
表5-双特异性抗体的促凝血活性
所选择的抗FIXa/抗FX双特异性抗体对与它们在TGT试验(如上所述)中的活性一起列出。双特异性抗体(Duobody)属于IgG4亚型，除了mAb 1-0021、mAb1-1335和mAb1-0985，它们是IgG1。
从表5可以明显看出，双特异性抗体所表现出来的活性水平取决于特定抗FIXa/抗FX组合。例如，与抗FIXa抗体mAb0-1998组合的抗FX抗体mAb1-6723表现出强活性(+++)，而mAb1-6723的活性在与mAb0-1886(+)和mAb1-1307(+)组合时较低。
实施例12：抗FX抗体的分箱
除了用FX代替FIXa外，使用与针对抗-FIXa抗体所述(实施例4)相同的设置，使用Octet fortebio系统，将在与抗hFIXa抗体组合的双特异性抗体形式下显示出显著TGT活性(实施例11)的某些抗FX抗体相对于彼此分箱。
该分析鉴定了分别由抗体mAb1-1371、mAb1-1376、mAb1-6723、mAb1-7447和mAb1-7449定义的五个不同的箱元——箱元A-E。两个箱元，即箱元A和箱元E，各自仅由单个抗FX抗体代表(参见表6)。
在箱元C中鉴定出大量克隆与mAb1-6723竞争。
表6-抗FX抗体的分箱
将选择的抗FX抗体相对于彼此分箱，鉴定出5个不同的箱元(箱元A-E)。数字是指抗体ID，例如1-6723表示mAb1-6723。
实施例13：使用X射线晶体学的抗FX抗体的结晶和表位作图
结晶
与FX复合的Fab0-8954(对应于mAb1-6723的Fab片段)的结晶尝试未获成功，而获得与活性位点被抑制的FXa复合的优质晶体。因此，以1:1摩尔比与活性位点被抑制的des-gla FXa(人EGR抑制的因子Xa无gla结构域(野生型)细菌表达，Lot#hGDFXAEGR-022，Cambridge ProteinWorks)混合的Fab0-8954的晶体使用沉滴蒸气扩散技术在18℃下生长。将150nl 6.7mg/ml复合物在20mM Tris-HCl(pH 7.4)、50mM NaCl和2.5mM CaCl2中的蛋白质溶液与50nl 0.2M乙酸镁、0.1M二甲胂酸钠(pH 6.5)、20％(w/v)PEG 8000(作为沉淀剂)混合，并在60μl沉淀剂上孵育。
衍射数据收集
在液氮中快速冷却之前，通过向结晶滴中加入1μl加有20％乙二醇的沉淀剂来冷冻保护晶体。使用来自Dectris的Pilatus2M像素检测器，在Swiss Light Source光束线X06DA(波长)下在100K下收集衍射数据。使用来自XDS包的程序进行数据的自动索引、积分和缩放(衍射数据统计信息总结在表7中)。
结构确定和精修
根据Matthews系数分析判断，不对称单元含有四个Fab:FXa复合物。通过分子替换确定结构。使用在程序套件Phenix中实施的Phaser，以蛋白质数据库条目5I1K的H和L链作为定位四个Fab的搜索模型。这些是使用COOT用正确的氨基酸序列构建、之后使用Phenix精修进行精修的模型。将精修的Fab模型固定，同时在来自CCP4套件的Molrep中以来自蛋白质数据库条目1G2L的A和B链作为搜索模型应用分子替换。发现了四个FXa片段。该模型使用Phenix精修和COOT中的手动重建的步骤进行精修。精修统计数据见表7。
表7-数据收集和精修统计数据
最高分辨率壳层(shell)的统计数据显示在括号中。
表位的确定
Fab0-8954:FXa复合物的晶体结构在不对称单元中具有四个复合物拷贝，并且分别分析这些复合物，以使用截止距离鉴定表位和互补位。
如果在晶胞中Fab0-8954:FXa复合物的四个拷贝中的至少一个中满足距离标准，则残基包括在对于mAb1-6723的表位中。对于mAb1-6723的表位和互补位残基在表8中列出。
表8-对于mAb1-6723的表位和互补位
FX/FXa(SEQ ID NO:2)的EGF-2和蛋白酶结构域中对于mAb1-6723的表位残基分别在第一列和第二列中列出。抗体VH(SEQ ID NO:21)和VL(SEQ ID NO:22)中的互补位残基分别在第3列和第4列中列出。
本文所公开的亲本抗体(谱系)的变体与亲本抗体共有箱元和表位(热点)残基。
由于在实施例中提供数据的抗体变体在基于本实施例中提供的亲本抗体-FXa复合物的晶体结构显示对表位识别至关重要的位置上不含氨基酸置换，本领域技术人员将理解，作为起点的变体将与它们所源自的抗体即mAb1-6723属于同一箱元，与之竞争结合，并且至少识别FX/FXa表位中相同的热点残基。
实施例14：FX上的热点残基的鉴定
类似于如实施例15所述对FIX上对于mAb1-1307、mAb0-1886和mAb0-1998的热点表位残基的作图，本实施例中提供的数据确定FX上对于mAb1-6723的热点表位残基。使用的FX变体是desGla-desEGF1-FX的单位点丙氨酸变体(除了位置118，该位置在野生型中是丙氨酸，在其中引入了丙氨酸至丝氨酸的置换)，其对应于SEQ ID NO:2的残基86-448，具有通过短GS-连接体(GGGGSGGGGS)连接的N-末端His-标签(HHHHHH，用于亲和纯化)。表9中列出了如实施例13中所定义的覆盖表位残基的变体。
表9-生成的desGla-desEGF1-FX变体的列表
1)根据SEQ ID No:2
2)EGF2和PD分别指第二表皮生长因子样和蛋白酶结构域
表9中列出的野生型desGla-desEGF1-FX和变体在HEK293系统中表达，并通过亲和色谱法进行纯化。对于L117A、L303A、P304A和M426A变体，没有观察到表达或纯度较差，并且对于这四种变体不可能评估结合。
使用Biacore T200仪器在25℃下进行热点表位残基的鉴定。使用标准胺偶联化学法，将来自Human Antibody Capture试剂盒(GE Healthcare，目录号BR100839)的抗hIgGFc抗体以2μg/ml固定在Series S传感器芯片CM5(GE Healthcare，目录号BR100530)上。以5μL/min的流速注入抗FX抗体mAb4-6934(mAb1-6723的单价变体)30sec，并通过固定的抗hIgG Fc抗体进行捕获。随后，5μM(2或3倍连续稀释)的T116A、A118S、T127A、F229A和E226A变体，10μM(5倍连续稀释)的Y230A变体，和10μM(2或3倍连续稀释)的WT和H101A、E103A、R113A、S227A、E228A、R287A、E305A、L419A、K420A、D423A、R424A、K427A和T428A变体，以5μL/min的流速注入90sec，以允许与捕获的抗FX抗体结合，然后进行90sec缓冲液注入以使desGLA-desEGF1-FX变体解离。运行缓冲液(也用于稀释抗FX抗体和desGLA-desEGF1-hFX变体)含有10mM HEPES，150mM NaCl，1mg/mL BSA和5mM CaCl2(pH 7.4)。使用1M甲酸实现传感器芯片的再生。根据GE Healthcare提供的Biacore Evaluation Software 2.0中的1:1模型，使用稳态拟合来分析结合数据。结合数据被报告为在注入5或10μM FX变体时，FX变体与抗FX抗体(单价mAb1-6723)的结合相对于野生型FX与抗FX抗体的结合的百分比，并根据以下公式计算：
结合(％)＝100％×[(Rmax_FXvar,Ab)/(Rmax_Ab)]/[(Rmax_FXwt,Ab)/(Rmax_Ab)]
其中Rmax_Ab代表抗FX抗体的捕获水平(RU)，Rmax_FXvar,Ab和Rmax_FXwt,Ab分别代表相同浓度(除了Y230A变体外均为5μM，Y230A变体的浓度为10μM)的FX变体和野生型与捕获的抗FX抗体的结合(RU)。结果在表10中示出。
表10-SPR分析的结果
来自mAb1-6723的单价变体与选择的FX变体结合的SPR分析的结果，所述FX变体覆盖对于mAb1-6723的表位残基。
对于mAb1-6723的热点残基
对于mAb1-6723的热点残基被定义为这样的位置，在该位置处，用丙氨酸置换野生型残基(或者对于位置118，用丝氨酸置换丙氨酸)将抗体的结合降低至相对于该抗体与野生型FX的结合的30％或更低(在5μM浓度的WT(或变异)desGLA-desEGF1-FX下)。
对于mAb1-6723(在实验上由其单价对应物mAb 4-6934代表)的热点残基：
R113、Y230、K420、D423、R424和K427
实施例15：FIX/FIXa上的热点残基的鉴定
为了确定对于抗FIX/FIXa抗体mAb0-1886、mAb0-1998和mAb1-1307与FIX之间的相互作用而言关键的残基(称为热点)，基于与相应Fab片段(分别为Fab7237、Fab7238和Fab7236)复合的FIXa的晶体结构选择了一组FIX变体。如以下所详述的，选择的FIX变体在哺乳动物细胞中瞬时表达，纯化，并使用表面等离子体共振(SPR)表征它们与mAb0-1886、mAb0-1998和mAb1-1307的单价变体的结合。
FIX突变体的生成
用编码人FIX的氨基酸残基1-461之后直接紧接六个组氨酸(6×His-标签，用于亲和纯化)的表达盒(uniprot P00740，除了根据UNIPROT编号的T194A突变外，对应于SEQ IDNO:1的T148A)构建适合于瞬时哺乳动物表达的DNA质粒。除了添加有C末端His标签外，使用该构建体产生的分泌的成熟FIX蛋白链与人FIX的A148等位基因形式相同(Anson等人,EMBOJ.19843:1053-1060，McGraw等人,Proc Natl Acad Sci USA.198582:2847-2851)。
使用该构建体作为模板，通过PCR引入选择的突变。对于表11中列出的每个单点突变，设计了含有所需氨基酸改变的正向引物和不含氨基酸突变的反向引物。这些引物在使用上述载体作为模板来扩增整个载体序列的标准PCR反应中使用。使用无连接的克隆，采用通过正向和反向引物引入的重叠序列，将得到的扩增DNA片段的末端连接到环状表达质粒中。
将环化的质粒转化到大肠杆菌细胞中，在选择性琼脂平板上生长以形成菌落，并且利用该菌落启动液体大肠杆菌培养。在大肠杆菌培养物过夜生长后，进行质粒制备并通过DNA测序鉴定突变体。
通过使用ExpiFectamineTM 293转染试剂盒(ThermoFisher Scientific，目录号A14525)和编码每种所需变体以及野生型FIX(对应于具有C-末端His-标签的SEQ ID NO:1)的质粒DNA转染在Expi293ExpressionTM培养基(ThermoFisher Scientific，目录号A1435101)中悬浮培养生长的expi293F细胞，进行重组蛋白质生产。在转染时加入维生素K至终浓度为5mg/mL。转染后第二天加入来自ExpiFectamineTM 293转染试剂盒的转染增强物1和2。转染后5天通过离心收获细胞培养物。
每个FIX变体上的C末端His标签用于在多孔机器人设置下的分批蛋白质纯化。简言之，将收获的细胞培养上清液调节至结合条件，与Ni Sepharose 6Fast Flow亲和纯化树脂(GE Healthcare，目录号17-5318-02，50μl沉降树脂/ml细胞培养基)混合，并在振摇下孵育20分钟。然后将树脂/上清液混合物转移到滤板上，并通过施加真空将液体抽吸通过该滤板。将残留在滤板中的树脂洗涤三次，然后在高咪唑缓冲液中洗脱。
使用用于检测的抗FIX抗体和用于标准曲线的高纯度重组野生型FIX，通过ELISA进行纯化的蛋白质溶液的浓度测定。
表11-生成的FIX突变体的列表
3)根据SEQ ID NO:1
4)EGF2和PD分别指第二表皮生长因子样和蛋白酶结构域
*标有星号的变体表现出非常低的表达水平，并且在结合研究中无法评估
FIX变体的热稳定性
为了测试FIX变体中氨基酸置换的引入是否导致去稳定化和不适当的折叠，确定变体的热解折叠转变的中点(Tm)。
将纯化的FIX变体加载到标准毛细管(Prometheus NT.48nanoDSF GradeStandard毛细管，Nanotemper Technologies GmbH,München)中，并插入Prometheus NT.48(Nanotemper Technologies GmbH,München)中。使用70％的激发强度，并且从20℃至90℃以1.5℃/min的加热斜率进行热解折叠。通过在280nm处激发并记录330nm和350nm处的发射来测量色氨酸荧光。可以从350nm和330nm处测量的荧光比率(F350/330)确定FIX变体的Tm(除了蛋白质浓度低于20μg/ml时以外，FIX N101D、H256A、L330A、S339A、G393I、Y404A和N406Q是这种情况)。在所有情况下，程序PR.ThermControl v2.0.4(NanoTemperTechnologies GmbH,München)可以通过确定F350/330解折叠曲线的一阶导数的最大值自动适配Tm。发现野生型FIX的Tm为51℃，变体的Tm在47至54℃的范围内，表明氨基酸置换没有引起重大的去稳定化。
SPR分析
使用表面等离子体共振(SPR)，通过经由C-末端His-标签捕获FIX变体，表征FIX变体与mAb0-1886、mAb0-1998和mAb1-1307的结合。为了避免与常规二价抗体相关的潜在亲合力效应，即确保1:1相互作用，mAb0-1886、mAb0-1998和mAb1-1307的单价变体——分别表示为mAb4-0673、mAb4-0004和mAb3-3279(如实施例7所述制备)——用作分析物。
SPR分析在Biacore 4000或Biacore T200仪器(Biacore AB,Uppsala,Sweden)上进行。对于在T200仪器上的实验，应用以下条件：在25℃的温度下进行测量。使用标准胺偶联化学法，将25μg/ml的抗His抗体(R&D Systems，目录号MAB050)固定在CM5传感器芯片上。以10μl/min的流速注入25nM的抗FIX变体1min，并经由其His标签被固定的抗His抗体捕获。随后，200nM(4倍连续稀释)、1600nM(3倍连续稀释)和2000nM(3倍连续稀释)的mAb4-0004、mAb3-3279和mAb4-0673分别以50μl/min的流速注入5min，以允许与捕获的FIX变体结合，然后进行10min的缓冲液注入，从而使单价抗FIX抗体解离。使用的运行缓冲液是20mM Tris，150mM NaCl，5mM CaCl2，0.05％Tween-20，1mg/ml BSA，pH 7.4。其也用于稀释抗FIX抗体和FIX样品。使用10mM甘氨酸pH 2.0实现芯片的再生。使用由制造商(Biacore AB,Uppsala,Sweden)提供的BiaEvaluation 4.1，根据1:1模型分析结合数据。Biacore 4000仪器使用类似的实验设置。
最初，使用Biacore 4000仪器，针对与所有三种单价抗体mAb4-0004、mAb3-3279和mAb4-0673的结合筛选表11中列出的所有FIX变体。如所预期的，抗体与在对应于其各自表位残基(如根据实施例6概述的距离标准所定义的)的位置处包含突变的FIX变体的结合受到不同程度的干扰。对于在不对应于其各自表位残基的位置处包含突变的FIX变体，未观察到对抗体结合的显著影响。特别是，在EGF2结构域中进行的置换对与任何抗体的结合均没有任何影响(数据未示出)。
使用Biacore T200仪器对定义为表位残基的残基(参见实施例6)进行更详细的结合分析。结果在表12中给出。
结合数据被报告为抗体与FIX变体的结合相对于该抗体与野生型FIX的结合的百分比，其根据下式计算：
结合(％)＝100％×[(Rmax_Ab,FIX_var)/(Rmax_FIXvar)]/[(Rmax_Ab,FIX_wt)/(Rmax_FIXwt)]
其中Rmax_FIXvar和Rmax_FIXwt分别代表FIX变体和野生型FIX的捕获水平(RU)，并且其中Rmax_Ab,FIX_var和Rmax_Ab,FIX_wt分别代表抗体与捕获的FIX变体和野生型FIX的结合(RU)。结果在表12中示出。
表12-SPR分析的结果
来自mAb3-3279、mAb4-0004和mAb4-0673(分别为mAb1-1307、mAb0-1998和mAb0-1886的单价变体)与所选FIX变体结合的SPR分析的结果，所述FIX变体覆盖对于mAb1-1307、mAb0-1998和mAb0-1886的表位残基。
1)根据SEQ ID NO:1的位置
2)100％×[(Rmax_Ab,FIX_var)/(Rmax_FIXvar)]/[(Rmax_Ab,FIX_wt)/(Rmax_FIXwt)]
热点残基mAb1-1307、mAb0-1998和mAb0-1886
对于mAb1-1307、mAb0-1998和mAb0-1886的热点残基被定义为这样的位置，在该位置处，用丙氨酸置换野生型残基将抗体的结合降低至相对于该抗体与野生型FX的结合的30％或更低。
对于mAb1-1307(在实验上由mAb3-3279代表)的热点残基：
H257、K293和N406
对于mAb0-1998(在实验上由mAb4-0004代表)的热点残基：
R338和K341
对于mAb0-1886(在实验上由mAb4-0673代表)的热点残基：
D332、R333、L337和R338
对于mAb0-1998和mAb0-1886，对结合贡献最大的残基是R338；在FIX中用丙氨酸置换R338(R338A)对抗体结合表现出最大的影响，相对于抗体与野生型FIX的结合，mAb0-1998和mAb0-1886的抗体结合分别大大降低至2％和3％。
实施例16：抗FIX(a)/FX(a)双特异性抗体在FXa生成试验中的活性
抗FIXa/FX双特异性抗体的促凝血活性基于它们在促凝血磷脂膜的存在下促进FIXa对FX的激活的能力来确定。测试的双特异性抗体(BiAb)在表13中列出，并且包括ACE910以供比较。
每种双特异性抗体的促凝血活性均被报告为在给定抗体浓度下相对于游离FIXa对FX的激活的刺激倍数。双特异性抗体在8种浓度(通过在测定缓冲液中的连续三倍稀释而制备)下如下测试：与125pM人血浆来源的FIXa(Haematologic Technologies Inc,USA)和500μM 25:75磷脂酰丝氨酸:磷脂酰胆碱磷脂预囊泡(Haematologic Technologies Inc,USA)在测定缓冲液(50mM HEPES，100mM NaCl，5mM CaCl2，0.1％(w/v)PEG8000，pH 7.3+1mg/ml BSA)中预孵育10min。然后通过加入人血浆来源的FX(Haematologic TechnologiesInc,USA)至25nM的浓度启动激活。在室温下激活15min后，通过加入25μl猝灭缓冲液(50mMHEPES，100mM NaCl，60mM EDTA，0.1％PEG8000，pH 7.3+1mg/ml BSA)猝灭反应(50μl)。通过添加25μl 2mM S-2765生色底物(Chromogenix,Sweden)并通过在酶标仪中在405nm处测量吸光度(ΔOD/min)测量生色底物转化来测定生成的FXa的量。类似地，游离FIXa对FX的激活在25nM的FIXa浓度和60分钟的反应时间下测定。
根据试验中存在的FIXa的浓度和反应时间对测得的活性进行归一化。通过将该数值除以在不存在抗体的情况下类似归一化的FXa生成速率，计算抗体在给定浓度下引起的刺激倍数。
总之，biAb刺激的计算可以描述如下：
BiAb刺激＝(AFIXa+biAb/([FIXa]试验×t反应))/AFIXa,norm
其中AFIXa+biAb是在双特异性抗体的存在下测得的活性，[FIXa]试验是该试验中的FIXa浓度，t反应是反应时间，而AFIXa,norm是游离FIXa的归一化活性。
表13列出了在测试的8种抗体浓度以及观察到最大刺激的浓度下对每种双特异性抗体测得的最大刺激。对于所有测试的双特异性抗体，发现最大刺激均高于对ACE910测得的最大刺激，其在0至15300nM的浓度间隔下测试。
表13-双特异性抗FIXa/FX抗体的最大刺激
实施例17：双特异性抗-FIX(a)/FX(a)抗体在人A型血友病贫血小板和富血小板模拟血浆中的凝血酶生成试验(TGT)中的活性
双特异性抗体mAb4-7761、mAb4-7762、mAb4-7789、mAb5-0057和mAb5-1409(参见表14)的促凝血活性根据Hemker等人(Pathophysiol Haemost Thromb,2002；32:249-253)描述的原理基于它们在促凝血合成磷脂膜或血小板的存在下促进凝血酶生成的能力来确定。包括ACE910以供比较。在A型血友病(HA)患者合并的贫血小板血浆(HA-PPP)和/或HA诱导的人富血小板血浆(HA-PRP)中的凝血酶生成试验(TGT)中测试每种抗体(测试化合物)。
表14-双特异性抗FIX(a)/FX(a)抗体
| BiAb抗体ID | Anti-FIX抗体ID(谱系) | Anti-FX抗体ID(谱系) |
| 4-7761 | 1-5743(0-1886) | 1-6738(1-2375) |
| 4-7762 | 1-6584(0-1886) | 1-6738(1-2375) |
| 4-7789 | 1-6584(0-1886) | 1-6463(1-2375) |
| 5-0057 | 1-8768(0-1998) | 1-6723(1-6723) |
| 5-1409 | 1-8768(0-1998) | 1-7503(1-6723) |
A型血友病诱导的人富血小板血浆(HA-PRP)
通过静脉穿刺从知情同意的健康供体中获得血液。将6倍体积的血液收集到1倍体积的酸性柠檬酸盐右旋糖(ACD；85mM柠檬酸钠，110mM右旋糖，和62.3mM柠檬酸，pH 4.9)中，最终pH 6.5，并在室温(RT)下以220g离心20min。收集富血小板血浆(PRP)，并用Medonic CA620血液分析仪(Boule Diagnostics AB,Sweden)测定血小板浓度。将含有红细胞的血浆部分在室温下以600g再离心10min。收集贫血小板血浆(PPP)，并用来将PRP稀释至300,000个血小板/μl。通过添加FVIII中和抗人FVIII抗体(绵羊抗人因子VIII-5mg，Haematologic Technologies,VT,USA)至终浓度为0.1mg/ml并在室温下以2rpm轻轻旋转30分钟来诱导HA条件。
凝血酶生成试验
在HA-PRP和HA-PPP(George King Bio-Medical Inc,KS,USA)中的凝血酶生成试验(TGT)使用96孔板荧光计(Fluoroscan Ascent FL,Thermolabsystems,Helsinki,Finland)通过标准校准自动凝血曲线法(thrombography)进行。反应混合物含有70μl HA-PRP(300,000个血小板/μl)或HA-PPP，10μl测试化合物稀释液(在20mM HEPES，140mMNaCl，pH 7.4，2％BSA中稀释)，20μl含有组织因子(TF)或凝血酶校准物(Thrombinoscope BV)的CAT试剂(PRP试剂；不含合成磷脂的TF，PPP试剂LOW；含合成磷脂的TF，1pM TF终浓度，Thrombinoscope BV,Maastricht,荷兰)，以及20μl含有荧光标记的凝血酶底物z-Gly-Gly-Arg-AMC(3mM)和CaCl2(90mM)的混合物(Thrombinoscope BV)。TGT在最多8种浓度的试验化合物(0.3、1.0、3、10、30、100、300和900nM，最终血浆浓度)或仅添加缓冲液(20mM HEPES，140mMNaCl，pH 7.4，2％BSA)(代表HA对照)下进行。在来自相同储备液的HA-PPP中或来自四个不同供体的血液中的至少三个独立实验中测试浓度范围。使用仅添加缓冲液(20mMHEPES，140mM NaCl，pH 7.4，2％BSA)的未处理的人PRP或CRYOcheckTM合并的正常人PPP血浆(Precision Biologic Inc.,Dartmouth,Canada)测量TGT中的正常对照水平。使TGT进行总共90分钟，并通过Thrombinoscope软件(Thrombinoscope BV)分析TGT参数峰值凝血酶高度(nM)。
图2/表15显示了在HA-PPP中测试的浓度下对每种双特异性抗体测得的峰值凝血酶生成速率。数据显示，所有测试化合物均使峰值凝血酶形成增加至高于在不存在抗体时观察到的水平，即表现出促凝血活性。另外，mAb4-7761、mAb4-7762、mAb4-7789、mAb5-0057和mAb5-1409在30nM与300nM之间的凝血酶生成水平高于对ACE910观察到的凝血酶生成水平，证明具有优异的效力。此外，mAb5-0057和mAb5-1409在300至900nM时的凝血酶生成水平高于用900nM ACE910观察到的凝血酶生成水平，证明这些化合物与ACE910相比具有更高的效力和功效。
图3/表16显示了在HA-PRP中测试的浓度下对mAb5-0057和mAb5-1409测得的峰值凝血酶生成水平。在这些条件下，与ACE910相比，mAb5-0057和mAb5-1409也表现出更好的效力和功效。
表15-双特异性抗体mAb4-7761、mAb4-7762、mAb4-7789、mAb5-0057、mAb5-1409和
ACE910的凝血酶生成试验(TGT)
人组织因子激活的A型血友病贫血小板血浆(PPP)中双特异性抗体mAb4-7761、mAb4-7762、mAb4-7789、mAb5-0057、mAb5-1409和ACE910的凝血酶生成试验(TGT)。在HA-PPP中至少三次独立实验中在每种测试化合物浓度下测量的平均峰值凝血酶生成水平±标准偏差。实验A-D是指如图2的图例中所述的独立实验。
表16-双特异性抗体mAb5-0057、mAb5-1409和ACE910的凝血酶生成试验(TGT)
双特异性抗体mAb5-0057、mAb5-1409和ACE910在人组织因子激活的A型血友病富血小板血浆(PRP)中的凝血酶生成试验(TGT)。来自HA-PRP中的四次独立实验的每种测试化合物浓度下的平均峰值凝血酶生成±标准偏差。
实施例18：单价单臂(OA)抗FIX/FIXa抗体在人A型血友病贫血小板血浆中的凝血酶生成试验(TGT)中的活性
单价单臂(OA)形式的mAb1-9016的促凝血活性根据Hemker等人(2002)Pathophysiol Haemost Thromb,32:249-253描述的原理基于其在促凝血磷脂膜的存在下促进凝血酶生成的能力来确定。包括单臂形式的224F3抗体(mAb1-1582)以供比较。使用96孔板荧光计(Fluoroscan Ascent FL,Thermolabsystems,Helsinki,Finland)，通过标准校准自动凝血曲线法(thrombography)，在A型血友病(HA)患者合并的贫血小板血浆(HA-PPP)(George King Bio-Medical Inc,KS,USA)中的凝血酶生成试验(TGT)中测试每种抗体(测试化合物)。反应混合物含有70μl HA-PPP，10μl测试化合物(在20mM HEPES，140mMNaCl，pH7.4，2％BSA中稀释)，含有活化的人血浆来源的因子XI(hFXIa，最终8.3mU/mL)(EnzymeResearch Laboratories,IN,USA)或凝血酶校准物(Thrombinoscope BV)的20μl PRP试剂(合成磷脂，Thrombinoscope BV,Maastricht,荷兰)，以及20μl含有荧光标记的凝血酶底物Z-Gly-Gly-Arg-AMC(3mM)和CaCl2(90mM)的混合物(Thrombinoscope BV)。TGT在五种浓度的试验化合物(30、100、300、600和900nM，最终血浆浓度)或仅添加缓冲液(20mM HEPES，140mM NaCl，pH 7.4，2％BSA)(代表HA对照)下进行。在来自相同储备液的HA-PPP中的两个独立实验中测试浓度范围。使TGT进行总共90分钟，并通过Thrombinoscope软件(Thrombinoscope BV)分析TGT参数峰值凝血酶高度(nM)。图4和表17显示/列出了在测试的浓度下对每种单价单臂抗体测得的峰值凝血酶生成速率。数据显示，mAb1-9016的OA抗体形式将峰值凝血酶形成增加至高于在不存在抗体时观察到的水平，即表现出促凝血活性。另外，由mAb1-9016的OA抗体形式诱导的凝血酶生成高于对224F3抗体(mAb1-1582)的单价OA形式观察到的凝血酶生成。
表17-在测试的浓度下对每种单价单臂抗体测得的峰值凝血酶生成速率。列出了
HA-PPP中两次独立实验的平均峰值凝血酶±标准偏差。
实施例19：通过等温滴定量热法(ITC)测定的结合亲和力
使用PEAQ-ITC量热计(Malvern，UK)，通过等温滴定量热法(ITC)测量分别对于抗FIX/FIXa和抗FX/FXa抗体与FIX/FIXa和FX/FXa结合的结合亲和力。使用25mM Tris，150mMNaCl，5mM CaCl2(Tris-缓冲液)在37℃和pH 7.4下进行实验。样品孔(200μl)含有FIX、FIXa、FX或FXa，并通过注射器注入抗FIX/FIXa和抗FX/FXa抗体。在测量之前，所有蛋白质都在Tris缓冲液中充分透析，以确保缓冲液条件匹配。热平衡步骤之后是60秒延迟，随后是初始0.2-μl抗体注入，然后以120s的间隔注入2.5μl抗体14次。搅拌速度保持在750rpm，参考功率保持恒定在5-10μcal/s。对与每次抗体注入相关的热量进行积分，并相对于配体与大分子的摩尔比作图。将得到的等温线拟合至单位点结合模型，以使用制造商提供的软件获得亲和力(KD)、化学计量(n)和相互作用的焓(ΔH)。实验一式两份或一式三份进行。
虽然本文已经说明和描述了本发明的某些特征，但是本领域普通技术人员现在将会想到许多修改、替换、改变和等同物。因此，应当理解，所附权利要求书旨在涵盖落入本发明真正精神内的所有这类修改和改变。
Claims (14)
1.能够刺激FIXa对FX的酶活性的多特异性抗体或其抗原结合片段，其包含能够与FIX(SEQ ID NO:1)和/或其活化形式(FIXa)结合的第一抗原结合位点，以及能够与FX(SEQ IDNO:2)和/或其活化形式(FXa)结合的第二抗原结合位点。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第一抗原结合位点能够结合包含FIX/FIXa的氨基酸残基R338的表位，并且
所述第二抗原结合位点能够结合在FX/FXa的EGF-2结构域和/或催化亚单位中。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第一抗原结合位点能够结合包含FIX/FIXa的氨基酸残基R338和K341的表位。
4.根据权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第一抗原结合位点能够结合包含FIX/FIXa的氨基酸残基L337、R338、S339、T340、K341和T343的表位。
5.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第一抗原结合位点能够结合包含FIX/FIXa的氨基酸残基D332、R333、L337和R338的表位，并且所述第二抗原结合位点能够结合在FX/FXa的EGF-2结构域和/或催化亚单位中。
6.根据权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第一抗原结合位点能够结合包含FIX/FIXa的氨基酸残基K301、D332、R333、A334、T335、R338和N346的表位。
7.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗原结合位点能够结合包含FX/FXa的氨基酸残基Y230、D423和K427的表位。
8.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗原结合位点能够结合包含FX/FXa的氨基酸残基H101、E103、R113、T116、L117、A118、T127、S227、E228、F229、Y230、E266、R287、P304、E305、L333、L419、K420、D423、R424、M426、K427和T428中的一个或多个残基的表位。
9.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与参考抗体竞争结合FIX/FIXa，其中所述参考抗体包含
a)由SEQ ID NO:15表示的重链可变域和由SEQ ID NO:16表示的轻链可变域，或者
b)由SEQ ID NO:17表示的重链可变域和由SEQ ID NO:18表示的轻链可变域，或者
c)由SEQ ID NO:19表示的重链可变域和由SEQ ID NO:20表示的轻链可变域。
10.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是双特异性抗体。
11.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含
a.由SEQ ID NO:177表示的抗FIX/FIXa抗体重链可变域的CDR序列和由SEQ ID NO:178表示的抗FIX/FIXa抗体轻链可变域的CDR序列，以及由SEQ ID NO:179表示的抗FX/FXa抗体重链可变域的CDR序列和由SEQ ID NO:180表示的抗FX/FXa抗体轻链可变域的CDR序列，
b.由SEQ ID NO:181表示的抗FIX/FIXa抗体重链可变域的CDR序列和由SEQ ID NO:182表示的抗FIX/FIXa抗体轻链可变域的CDR序列，以及由SEQ ID NO:183表示的抗FX/FXa抗体重链可变域的CDR序列和由SEQ ID NO:184表示的抗FX/FXa抗体轻链可变域的CDR序列，
c.由SEQ ID NO:187表示的抗FIX/FIXa抗体重链可变域的CDR序列和由SEQ ID NO:188表示的抗FIX/FIXa抗体轻链可变域的CDR序列，以及由SEQ ID NO:185表示的抗FX/FXa抗体重链可变域的CDR序列和由SEQ ID NO:186表示的抗FX/FXa抗体轻链可变域的CDR序列。
12.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其用于凝血病或凝血障碍的治疗方法中。
13.包含根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的药物组合物，其用于治疗凝血病或凝血障碍，如A型血友病或具有抑制物的A型血友病。
14.治疗患有凝血病或凝血障碍如A型血友病或具有抑制物的A型血友病的受试者的方法，其包括向所述受试者施用根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
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