CN103619883A - 凝血因子抑制剂的结合蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明涉及在体外和/或体内中和抗凝血剂的抗凝作用的抗原结合区、抗体、抗原结合抗体片段和抗体模拟物的鉴别和用途。本发明的抗体和功能片段以及抗体模拟物可用于特异性地逆转抗凝血剂例如FXa抑制剂的药理作用，用于治疗（解毒剂）和/或诊断目的。本发明还提供了编码上述分子的核酸序列、含所述核酸序列的载体、药物组合物和带有使用说明的试剂盒。

Description

凝血因子抑制剂的结合蛋白

技术领域

本发明涉及与凝血因子的治疗性抑制剂相互作用并且中和所述凝血因子的治疗性抑制剂的抗原结合区、抗体、抗原结合抗体片段和抗体模拟物的鉴别和用途。

本发明的抗体模拟物、抗体和功能片段可用于特异性地逆转（reverse）例如FXa抑制剂的药理作用，用于治疗（解毒剂）和/或诊断目的。本发明还提供了编码上述分子的核酸序列、含有所述核酸序列的载体、药物组合物和带有使用说明的试剂盒。

背景技术

对抗凝血药物的通常限制是与治疗有关的出血风险和在紧急情况下受限的快速逆转其活性的能力。虽然新出现的抗凝血剂利伐沙班（rivaroxaban）是一种具有被证实的耐受性和安全性的新药，但是获得可快速中和其作用的特异性试剂（解毒剂）在医学上是有利的。在此，本发明人描述了可快速逆转由FXa抑制剂（例如利伐沙班）诱导的抗凝作用从而起到选择性解毒剂的作用的新的特异性抗体、抗原结合抗体片段和抗体模拟物。

血栓栓塞性疾病（thromboembolic disorder）例如深部静脉血栓形成（DVT）、肺栓塞（PE）、中风和心肌梗死是与心血管疾病有关的发病和死亡的主要原因。多年以来，通过抗凝血药物如维生素K拮抗剂（VKA，例如华法林（warfarin））、普通肝素（unfractionated heparin，UFH）和低分子量肝素（LMWH）治疗和预防高风险患者中的血栓栓塞是得到广泛建立的医疗干预。然而，抗凝血剂的通常限制是与治疗有关的出血风险和在紧急情况下受限的快速逆转其活性的能力。对于典型的抗凝剂，可使用某些解毒剂，如硫酸鱼精蛋白（针对UFH和LMWH）和维生素K（针对VKA）。此外，可考将虑重组VIIa因子或血液制品作为非特异性的逆转剂（reversal agent）。然而，对于新出现的口服抗凝血剂（例如利伐沙班），没有可用的或处于临床（cinical）开发中的特异性的解毒剂。在未来的数年中，这些新的抗凝血剂会变得越来越重要，并且针对所述新抗凝血剂之一的特异性解毒剂的存在会在紧急情况中提供医疗优势。

虽然可使用常规抗凝血剂如UFH、LMWH和VKA，但是仍存在对具有可预测的药代动力学、更好的治疗窗口和方便的应用的改良治疗剂的强烈医疗需要。利伐沙班为一种新出现的可口服抗凝剂，其直接抑制凝血因子Xa（FXa）（Perzborn E.et al.,Nat.Rev.Drug Discov.2011,10(1):61-7）。FXa代表凝血级联（coagulation cascade）的关键酶，其通过从凝血酶原产生凝血酶而催化血块形成。利伐沙班（化学名：5-氯-N-[[(5S)-2-氧代-3[4-(3-氧代吗啉-4-基)苯基]-1,3-恶唑啉-5-基]甲基]噻吩-2-甲酰胺）具有436g/mol的分子量，剂量依赖性地抑制FXa（K_i为0.4nM）且其选择性是对其他生物学上相关色氨酸蛋白酶的选择性的10,000倍以上。其具有快速起效的作用（k_on为1.7×10/M-1s-1）并可逆结合（k_off为5×10-3s-1）。利伐沙班还抑制结合的凝血酶原酶（IC₅₀为2.1nM）和与FXa有关的凝结（IC₅₀为75nM），并在多种动物模型中表现出对静脉和动脉血栓形成的剂量依赖性的抗凝活性。在临床研究中，利伐沙班表现出良好的安全性和耐受性情况，并且在非急需施行（elective）的髋或膝关节置换手术之后可有效预防成人患者中的VTE。利伐沙班以商品名

出售，用于在非急需施行的髋或膝关节置换手术之后的成人患者中的VTE预防，并且其是目前为止被一直证明对于该适应症具有超过依诺肝素（enoxaparin）的优良效能的唯一新口服抗凝血剂。还在开发所述化合物用于慢性适应症，如用于预防高风险心房颤动患者中的中风。

除利伐沙班以外，存在多种处于临床开发的各个阶段的其他可口服的直接FXa抑制剂，包括阿哌沙班（apixaban）、依杜沙班（edoxaban）、贝曲西班（betrixaban）、达热沙班（darexaban）和TAK-442（Garcia,D.et al.,Blood2010;115(1):15-20）。此外，戊多糖磺达肝癸钠（Fondaparinux）——一种间接的（抗凝血酶依赖性的）母体FXa抑制剂——被批准用于预防和治疗VTE。另外一类新的抗凝血剂为直接凝血酶抑制剂（DTI），其结合凝血酶的活性位点从而阻断其纤维蛋白相互作用。然而，由于没有针对所有这些药物的特异性解毒剂，当给予任何抗凝血剂时，急诊手术或血管介入之前的出血风险和不能快速逆转抗凝作用仍是重要的问题。因此，提供特定的一对抗凝血剂和解毒剂会解决重要的未解决的医疗需求。

利伐沙班是一种具有被证实的耐受性和安全性的药物，也是一种具有相对短的半衰期的化合物。然而，取决于推定的临床出血状况的严重性，仅仅中止药物可能不足以逆转其抗凝作用。在由于严重出血事件（例如由创伤引起的）或者由于需要紧急侵入性操作（例如，急诊手术）而需要快速中和抗凝作用的少数紧急情况中，存在特异性解毒剂会是有利的。目前，如果出现危及生命的出血，可考虑给予重组VII因子，然而仅有有限的非-临床和临床数据（Levi,M.et al.,.N Engl J Med.2010;363(19):1791-800.）。可考虑的非特异性解毒剂为源自血液的（活化的）凝血酶原复合物浓缩物（aPCC，PCC）或新鲜的冷冻血浆。然而，重要的是，应注意到没有关于任何这些逆转策略的临床经验，并且这些介入保留了（inherit）医疗问题，例如血栓前（prothrombotic）风险、感染风险或作用的慢速起效（Romualdi et al.,Curr.Pharm.Des.2010;16(31):3478-82）。

最近，已报道了PRT064445的临床前数据，其为一种FXa抑制剂的非选择性解毒剂。该分子基于FXa蛋白的突变重组形式（version），该形式缺乏其原有的前凝血剂活性却仍能够结合不同类型的FXa活性位点抑制剂，从而中和它们的抗凝作用（WO2009/042962A2）。已经报道了所述化合物在临床前期用于逆转所有现有FXa抑制剂（小分子和抗凝血酶依赖性的）的抗凝作用。然而，这种非选择性解毒剂的缺点是其使用会导致所有FXa抑制剂的有效性的缺失，当对所治疗的患者的迅速抗凝作用是必需的时，这可能是有问题的。此外，不能排除对内源性FXa蛋白交叉特异性的抗药物抗体的开发。

因此，为了克服上述问题，凝血抑制剂例如含有式1的结构元件的FXa抑制剂（例如利伐沙班）的理想解毒剂应是高度特异性的，其允许根据需要使用不同的抑制剂或使用不同化合物类别的其他抑制剂进行进一步的后续治疗。其对所述药物的亲和力应低于μM范围以允许未结合的抑制剂的有效和持续的减少。此外，其应该快速起效并且应该对凝血级联没有任何固有影响。此外，短的半衰期可有利地允许快速再摄取药剂。此外，所述解毒剂应没有其他所述遗留的医疗问题如血栓前风险或感染风险。

解决办法是提供一种可中和抗凝血剂的抗凝活性的抗体或其抗原结合片段或抗体模拟物。

已经描述过抗体和抗体模拟物能够特异性结合分子量低于1000Da的小分子（也称为半抗原）。已经确认了通过经静脉给予的源自绵羊多克隆血清的抗体片段（Fab）结合并中和小分子化合物，例如用于治疗地高辛中毒（DigiFab，地高辛免疫Fab（羊））或者用作抗蛇毒素（antivenom）（CroFab，响尾蛇科多价免疫Fab（羊））。

最近，也已经报道了使用重组抗体技术产生半抗原特异性抗体（综述：Sheedy,C.et al.,Biotech Adv2007;25:333-52.）。基于包含多于～10¹⁰种不同抗体分子的高度多样化的噬菌体展示文库，可针对各类小分子分离具有高达亚摩尔亲和力的半抗体特异性结合剂（binder）（Vaughan et al,Nat.Biotech.1996;14(3):309-314）。然而，半抗原仍激发靶标，并且与高分子量抗原如蛋白质的抗体相比，抗半抗原的抗体经常具有更低的亲和力。这是因为它们小和疏水的性质，仅提供几个可与抗体结合位点相互作用的官能团（互补位）。此外，从展示文库分离半抗原特异性抗体受到以下阻碍：需要化学修饰所述分子以在“生物淘选”步骤的过程中固定所述靶标。

应该提到的是，半抗原特异性结合蛋白的概念最近已被延伸至工程化的配体结合蛋白（所谓的“抗体模拟物”）。在这方面，描述了异羟洋地黄毒苷配体-结合的工程化脂质运载蛋白（抗脂质运载蛋白（anticalin）），其在洋地黄中毒的时候适合作为地高辛解毒剂（Schlehuber S.and SkerraA.,Drug Discov.Today2005;10(1):23-33）。

本文提供了以高亲和力结合含有结构式1的FXa抑制剂的抗体、其抗原结合抗体片段，或其变体，或抗体模拟物。还提供了基于抗体、抗原结合抗体片段和抗体模拟物的疗法，所述疗法旨在逆转这些化合物的药理作用。还提供了基于抗体、抗原结合抗体片段和抗体模拟物的方法，所述方法旨在功能性中和血液样品中的这些FXa抑制剂用于诊断目的。

发明内容

本发明的目的是提供可中和凝血因子的治疗性抑制剂并因此可用于逆转其抗凝活性用于治疗和/或诊断目的的抗体、其抗原结合抗体片段或抗体模拟物。

本发明的另一目的是提供可结合含有式1中给出的结构元件的凝血因子Xa（FXa）治疗性抑制剂（例如利伐沙班）并因此可用于逆转其抗凝活性用于治疗和/或诊断目的的人抗体，或其抗原结合抗体片段，或抗体模拟物。

本发明基于这样的意外发现，即通过抗体噬菌体展示的方法，可鉴别特异性针对含一组式1的化合物并且不结合其他FXa抑制剂的抗体或其片段。因此，根据需要，用作特异性解毒剂的抗体会允许使用这些其他FXa抑制剂重新开始对所治疗的受试者的抗凝作用。

根据本发明的第一方面，可合成利伐沙班的衍生物，所述衍生物允许其基于生物素-链亲和素（streptavidin）相互作用而固定化在表面上。利伐沙班和其衍生物的固定化是从噬菌体文库选择抗体（噬菌体淘选）以及在ELISA方法（ELISA-format）中筛选和分析特异性抗体的必要条件。

根据本发明的第二方面，可鉴别亲和力K_D<500nM并且在用利伐沙班抑制的生物化学FXa-测定中半数最大有效浓度（EC₅₀）EC₅₀<2μM的抗体或抗体片段。

根据本发明的第三方面，可鉴别对含式1给出的结构元件的化合物特异性的抗体或其抗体片段，所述抗体或其抗体片段不与其他FXa抑制剂如阿哌沙班、依杜沙班或雷扎沙班（razaxaban）交叉反应。

本发明涉及一种通过给予接受抗凝血治疗的受试者有效量的抗体或其抗原结合片段或抗体模拟物而选择性地中和所述受试者中凝血抑制剂的作用的治疗方法。

本发明的一个实施方案涉及分离的抗体或其抗原结合片段，如表1中所示。

在另一方面中，将所述抗体，或其抗原结合抗体片段，或抗体模拟物与能够延长血浆半衰期（或循环半衰期）的试剂一起给予。在另一方面中，将所述抗体，或其抗原结合抗体片段，或抗体模拟物与其自身缀合或与其他部分（moieties）缀合以延长其血浆半衰期。

还提供了药物组合物，其含有所述抗体，其抗原结合片段，或抗体模拟物。

在另一方面中，本发明提供了用于当需要大量中和FXa抑制剂的抗凝活性时的，包含利伐沙班和表1所示的抗体或其抗原结合片段的试剂盒。

在另一个实施方案中，本发明提供了分离的原核和真核宿主细胞，所述原核和真核宿主细胞包含编码本发明的多肽的多核苷酸。

参考以下描述和权利要求书，可更好地理解本发明的这些和其他特征、方面和优点。

本发明的抗体可以为IgG（例如，IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄），而抗原结合抗体片段可以为例如Fab、Fab’、F(ab’)₂或scFv。因此，本发明的抗原结合抗体片段可以为，或者可以含有，以本文所描述的一种或多种方式起作用的抗原结合区。

本发明还涉及分离的核酸序列，所述核酸序列均可编码前述的特异性针对含有一组式1的化合物的抗体或其抗原结合片段。本发明的核酸适用于抗体或抗原结合抗体片段的重组生产。因此，本发明还涉及含有本发明核酸序列的载体和宿主细胞。

本发明的组合物可用于治疗、预防或诊断应用。因此，本发明包括含有本发明的抗体或其抗原结合片段以及可药用载体或赋形剂（excipient）的药物组合物。在一个相关的方面中，本发明提供了一种用于在不需要利伐沙班存在的情况中中和利伐沙班的方法。在一个优选实施方案中，上述情况为需要快速逆转患者中的抗凝作用的情况（例如，由于需要紧急的侵入性操作）。这种方法包括向有此需要的受试者给予有效量的本文所述的或本文所考虑的药物组合物。

本发明的抗体、其抗原结合片段或抗体模拟物可用于诊断方法以测定FXa抑制剂的存在情况和/或FXa抑制剂的量。

本发明还提供了使用抗体文库以分离这种文库中可特异性结合含有式1描述的结构元件的化合物的一个或多个成员的说明书。

附图说明

图1示出在生物化学FXa测定中Fab M18-G08-G-DKTHT功能性中和利伐沙班的结果（记载于实施例4）。为了评估所述Fab中和利伐沙班的功能效价，进行了生物化学FXa测定。将浓度不断增加的Fab与荧光FXa底物预混合，并加入至含有利伐沙班（0.6nM，IC₇₅）的FX（0.05nM）预混合溶液中。分析记录了50分钟的反应进程曲线，对于所述FabM18-G08-G-DKTHT对利伐沙班诱导的FXa抑制的逆转，EC₅₀为6nM。x轴：t（分钟），y轴：相对荧光单位；虚线：缓冲液；实心三角：Xa因子对照；实心正方形：Xa因子+0.6nM利伐沙班；

菱形：Xa因子+0.6nM利伐沙班+0.46nM Fab

横线：Xa因子+0.6nM利伐沙班+1.4nM Fab

十字：Xa因子+0.6nM利伐沙班+4.1nM Fab

空心正方形：Xa因子+0.6nM利伐沙班+12nM Fab

圆形：Xa因子+0.6nM利伐沙班+37nM Fab

星号：Xa因子+0.6nM利伐沙班+110nM Fab

空心三角形：Xa因子+0.6nM利伐沙班+330nM Fab

图2示出了描述各种浓度的利伐沙班与0.5μM FabM18-G08-G-DKTHT结合的Rosenthal-Scatchard图（记载于实施例7）。超滤后在M18-G08-G-DKTHT的存在下利伐沙班的未结合浓度（未结合的分数=fu）的测定使得可测定M18-G08-G-DKTHT对利伐沙班的K_D值。根据Rosenthal-Scatchard图的斜度计算出约0.48nM的K_D值。Y轴：（结合的分数）/（未结合的分数）；X轴：（结合的分数）*（利伐沙班的浓度[μM]）。

图3示出在没有（图3a）或存在0.1μM利伐沙班（图3b-d），含有或不含Fab M18-G08-G-DKTHT（0μM（图3b），0.09μM（图3c）和0.72μM（图3d））的情况下，人贫血小板血浆中凝血酶生成测定的结果（记载于实施例8）。可推断，M18-G08-G-DKTHT浓度依赖性地中和利伐沙班对人血浆中凝血酶生成的作用。

图4示出在没有（图4a）或者存在0.1μM SATI（图3b-d），含有或不含Fab M18-G08-G-DKTHT（0μM（图4b），0.09μM（图4c）和0.72μM（图4d））的情况下，人贫血小板血浆中凝血酶生成测定的结果（记载于实施例8）。可推断，M18-G08-G-DKTHT浓度依赖性地中和SATI对人血浆中凝血酶生成的作用（X轴：时间[分钟]；Y轴：凝血酶[nM]）。

图5示出在没有任何FXa抑制剂，含或不含Fab M18-G08-G-DKTHT（0μM（图5a），0.09μM（图5b）和0.72μM（图5c））的情况下，人贫血小板血浆中凝血酶生成测定的结果（记载于实施例8）。可推断，M18-G08-G-DKTHT本身对人血浆中的凝血酶生成没有作用（X轴：时间[分钟]；Y轴：凝血酶[nM]）。

图6示出在存在0.05μM利伐沙班，不含或含有浓度不断增加的FabM18-G08-G-DKTHT（0-1000nM）的情况下，基于血浆的FXa测定的结果（记载于实施例9）。可证明，M18-G08-G-DKTHT的不断增加的浓度有效地逆转了利伐沙班对人血浆中FXa的抑制作用。X轴：M18-G08-G-DKTHT[nM]；Y轴：FXa活性[%]；黑色柱：对照（无利伐沙班，无M18-G08-G-DKTHT）；灰色柱：：无M18-G08-G-DKTHT；方格柱：从左到右M18-G08-G-DKTHT浓度不断增加：0.01–0.1–1–10–100-1000。

图7示出分别在0.17（空心标记）和0.33μM（实心标记）的利伐沙班的存在下，人血浆中凝血酶原（PT）测定的结果（记载于实施例10）。可证明，M18-G08-G-DKTHT的不断增加的浓度有效地（potently）逆转了利伐沙班对人血浆中PT的抑制作用。（X轴：M18-G08-G-DKTHT的浓度[Log M]；Y轴：凝血酶原时间（prothrombin time）[秒]；数据代表最终的测定浓度，5个实验的平均值±sem）。

图8示出分别在0.4（空心标记）和0.8μM（实心标记）的利伐沙班的存在下，大鼠血浆中凝血酶原（PT）测定的结果（记载于实施例10中）。可证明，M18-G08-G-DKTHT的不断增加的浓度有效地（potently）逆转了利伐沙班对人血浆中PT的抑制作用。（X轴：M18-G08-G-DKTHT的浓度[Log M]；Y轴：凝血酶原时间[秒]；数据代表最终的测定浓度，5个实验的平均值±sem）。

图9示出了纯化的非还原（-）和还原的（+）Fab片段M18-G08-G-DKTHT的SDS-PAGE。纯化记载于实施例16中。LC=轻链，HC=重链，Fab=完整的Fab片段，最右侧泳道含有Precision AllBlue分子量标记（BioRad）。

图10示出在经口给予利伐沙班（在时间点0时）并从第1.5小时至第2.5小时输注M18-G08-G-DKTHT1小时（格子盒）之后离体测定大鼠血浆中PT的大鼠PK/PD研究的结果（记载于实施例17中）。可证明对PT值的快速而持久的中和（X轴：以小时表示的经口给予利伐沙班后的时间；Y轴：以秒表示的凝血酶原时间；数据代表5只动物的平均值±sem）。实心正方形：赋形剂（vehicle）对照；空心正方形：利伐沙班（1.5mg/kg）；实心三角形：利伐沙班（1.5mg/kg）+M18-G08-G-DKTHT（85mg/kg）。

图11示出经口给予1.5mg/kg利伐沙班并在给予利伐沙班之后的1.5小时开始输注85mg/kg M18-G08-G-DKTHT持续1小时之后，大鼠血浆中利伐沙班的未结合浓度/时间图（记载于实施例18中）。所述研究在有知觉（虚线）和麻醉的大鼠（点线）中均有进行。在对照大鼠（麻醉的）中仅给予利伐沙班（实线）。证明了在M18-G08-G-DKTHTA输注之后未结合利伐沙班的血浆浓度快速降低。对于一些样品，不能测定未结合利伐沙班的浓度，因为它们的值低于定量的下限（LLOQ；灰水平线）。X轴：以小时表示的时间；Y轴：以μg/L表示的未结合利伐沙班的浓度。

图12示出在麻醉的大鼠中M18-G08-G-DKTHT对由利伐沙班（1mg/kg，静脉注射）延长的累积尾部出血时间的作用（记载于实施例19）。可证明，等摩尔剂量为107.5mg/kg的M18-G08-G-DKTHT显著地将由利伐沙班延长的出血时间缩短至几乎正常值。水平线表示组中位值。P值来自Kruskal-Wallis检验，然后是Dunn’s多重比较。实心正方形：未处理的；实心圆：利伐沙班（1mg/kg）；空心圆：利伐沙班（1mg/kg）+M18-G08-G-DKTHT（107.5mg/kg）；Y轴：以秒表示的累积出血时间。

图13示出与利伐沙班复合的Fab M18-G08-G-DKTHT的卡通图示，利伐沙班以棍（stick）表示（记载于实施例21）。

图14示出Fab M18-G08-G-DKTHT与利伐沙班的结合和相互作用（记载于实施例21）。

图15示出竞争ELISA的结果（记载于实施例22）。将固定量的FabM18-G08-G-DKTHT与多种浓度的利伐沙班预孵育，并测定所述Fab与来自实施例1K的经包被的化合物的残余结合。X轴：以μM表示的利伐沙班的浓度；Y轴：OD₄₀₅信号。

图16示出在没有（图16a）或存在3μM阿哌沙班（图16b-d），含有或不含Fab M18-G08-G-DKTHT（0μM（图16b），1.43μM（图16c-d）和0.1μM利伐沙班（图16d））的情况下，人贫血小板血浆中凝血酶生成测定的结果（记载于实施例23中）。可以看出，M18-G08-G-DKTHT不影响阿哌沙班的抗凝作用（X轴：时间[分钟]；Y轴：凝血酶[nM]）。

图17示出在没有（图17a）或存在0.75μM达比加群（dabigatran）（图17b-d），含有或不含Fab M18-G08-G-DKTHT（0μM（图17b），0.72μM（图17c-d）和0.1μM利伐沙班（图17d））的情况下，人贫血小板血浆中凝血酶生成测定的结果（记载于实施例23中）。可观察到，M18-G08-G-DKTHT不影响达比加群的抗凝作用（X轴：时间[分钟]；Y轴：凝血酶[nM]）。

具体实施方式

本发明是基于以下发现：对FXa抑制剂特异性的或有高亲和力的并且可给予受试者治疗益处的抗体和抗体片段的发现，所述FXa抑制剂包括含有一组式1的化合物。本发明的抗体可以为人的、人源化的或嵌合的。本发明的抗体在以下实施例中进一步的说明，所述实施例不意欲以任何方式限制本发明所要求保护的范围。

定义

“人”抗体或其抗原结合片段在本文中被定义为是非嵌合的（例如，非“人源化的”）并且不来自（无论是整体还是部分）非人物种。人抗体或其抗原结合片段可源自人，或者可以为合成的人抗体。本文中“合成的人抗体”被定义为具有（全部或部分地）以计算机方法衍生自合成序列的序列的抗体，所述合成序列是基于对已知人抗体序列的分析。人抗体序列或其片段的计算机设计可通过以下方式实现：分析人抗体或抗体片段序列的数据库和利用由此获得的数据设计多肽序列。人抗体或其抗原结合片段的另一个实例是从人来源的抗体序列的文库（例如，基于采自人天然来源的抗体的这种文库）中分离的核酸所编码的抗体或抗原结合片段。人抗体的实例包括记载于et al.,Nat.Biotechnol.2000,18(8):853-856中的抗体。

“人源化抗体”或其人源化抗原结合片段在本文中被定义这样的抗体或抗体片段：（i）来源于非人来源（例如，携带异源免疫系统的转基因小鼠），该抗体基于人种系序列；（ii）其中非人抗体框架区的氨基酸被通过基因工程部分地调换为人氨基酸序列；或者（iii）CDR移植的，其中可变区的CDR来自非人来源，而所述可变区的一个或多个框架为人来源的，并且所述恒定区（如果有的话）是人来源的。

“嵌合抗体”或其抗原结合片段在本文中被定为其中所述可变区来源于非人来源并且一部分或全部恒定区来源于人来源的抗体或其抗原结合片段。

本文使用的术语“单克隆抗体”是指获自基本上同质的抗体群体的抗体，即，该群体包含各个抗体除了可以极少量存在的可能突变（例如天然突变）之外是相同的。因此，所述“单克隆”表明所述抗体的性质，即不是不相关（discrete）抗体的混合物。与通常包括针对不同决定簇（表位）的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体均针对抗原上的单独一个决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体制剂的优点在于它们通常不会被其他免疫球蛋白污染。所述术语“单克隆”不应被理解为需要通过任何特定的方法产生所述抗体。所述术语“单克隆抗体”具体地包括嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。

如本文所用，“特异性结合至…”的、是“对…是特异性”的或“特异性识别”目的抗原例如小分子半抗原（本文中为含结构式1的FXa抑制剂，例如利伐沙班）的抗体为这样的抗体，即以足够的亲和力结合所述抗原以使得所述抗体可用作治疗性试剂中和血浆样品中其靶标，并且除了这些含有式1中描述的结构元件的FXa抑制剂之外与其他FXa抑制剂无显著交叉反应。本文使用的术语“特异性识别”特定靶标、“特异性结合至”特定靶标或者是特定靶标“特异性的”，可以通过例如对抗原的单价K_D低于约10^-4M，或者低于约10^-5M，或者低于约10^-6M，或者低于约10^-7M，或者低于约10^-8M，或者低于约10^-9M，或者低于约10^-10M，或者低于约10^-11M，或者低于约10^-12M，或更低的抗体或其抗原结合片段来展现。如果抗体能够将抗原和一种或多种参考抗原区分开，那么这样的抗体“特异性结合至”所述抗原，是对所述抗原“特异性的”或者“特异性识别”所述抗原。在其最一般的形式中，“特异性结合”、“特异性结合至”、是“对…特异性的”或“特异性识别”是指按照例如以下方法之一测定的抗体区分目的抗原和不相关抗原的能力。这类方法包括，但不限于蛋白质印迹、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-测试以及肽扫描。例如，可进行标准ELISA测定。可以通过标准显色进行评分（例如，具有辣根过氧化物酶的二抗和具有过氧化氢的四甲基联苯胺）。通过例如在450nm下的光密度来将某些孔中的反应评分。典型背景（=阴性反应）可以为0.1OD；典型阳性反应可以为1OD。这意味着阳性/阴性的差异可以大于5倍、10倍、50倍，优选大于100倍。通常，通过使用不止单独一个参考抗原而是一组约3-5个不相关的抗原（例如奶粉、BSA、转铁蛋白等）来确定结合特异性。

“结合亲和力”是指分子的单个结合位点与其结合伴侣（bindingpartner）之间非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，如本文所用，“结合亲和力”是指固有的结合亲和力，其反映结合对（例如抗体和抗原）的成员之间1：1的相互作用。离解常数“K_D”通常用于描述分子（例如抗体）与其结合伴侣（例如抗原）之间的亲和力，即，配体结合特定蛋白的紧密程度。配体-蛋白亲和力受到所述两个分子之间非共价分子间相互作用的影响。亲和力可通过本领域中已知的常规方法测量，包括本文描述的这些。在一个实施方案中，本发明的“K_D”或“K_D值”通过依照实施例5使用表面等离子共振测定来测量，所述表面等离子共振测定使用BiacoreT100仪器（GE Healthcare Biacore,Inc.）。离解平衡常数（K_D）通过基于以下计算：基于通过使用Biacore Evaluation Software以一级1：1结合模型拟合传感图（sensogram）获得的缔合速率常数（k_on）和离解速率常数的比例。其他合适的设备为BIACORE(R)-2000、BIACORE(R)-3000（BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ）或ProteOn XPR36仪器（Bio-RadLaboratories,Inc.）。

在另一个实施方案中，本发明的“K_D”或“K_D值”通过依照实施例6使用有对照和分析软件的等温滴定量热仪（ITC）（Microcal/GE Healthcare,Freiburg,Germany）来测量。随着时间检测溶液中结合反应期间释放的热量，并通过使用分析软件分析热力学数据来估计K_D-值。有对照和分析软件的等温滴定量热仪（Microcal/GE Healthcare,Freiburg,Germany）依照实施例6。

在另一个实施方案中，本发明的“K_D”或“K_D值”通过以下方式测定：测量溶液中在固定量抗体或抗体片段的存在下抗原的未结合浓度。所述K_D值依照实施例7使用Rosenthal-Scatchard图来计算。在该方法中，X轴为结合配体的浓度，Y轴为结合配体的浓度除以未结合配体的浓度。可根据Rosenthal-Scatchard plot图估计K_D，此时K_D等于斜度的负倒数。

如本文所用，术语“抗体”意指免疫球蛋白分子，优选包含4条多肽链，通常通过二硫键相互连接的2条重（H）链和2条轻（L）链。每条重链包含重链可变区（本文缩写为VH）和重链恒定区。所述重链恒定区可包括例如3个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区（本文缩写为VL）和轻链恒定区。所述轻链恒定区包含1个结构域（CL）。所述VH和VL区可进一步细分为穿插在更保守的区域（称为框架区（FR））的高变区（称为互补决定区（CDR））。每个VH和VL通常包含3个CDR和最多达4个FR，所述CDR和FR从氨基末端至羧基末端以例如以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。

如本文所用，术语“互补决定区（CDR，例如CDR1、CDR2和CDR3）是指抗体可变区的氨基酸残基，其存在对于抗原结合来说是必需的。每个可变区通常具有3个被鉴别为CDR1、CDR2和CDR3的CDR区域。每个互补决定区可包含来自如Kabat所定义的“互补决定区”的氨基酸残基（例如，轻链可变区中的约残基24-34（L1）、50-56（L2）和89-97（L3）和重链可变区的31-35（H1）、50-65（H2）和95-102（H3）;（Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immulological Interest,5th Ed.Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD.1991)）和/或来自”高变环”的那些残基（例如，轻链可变区中的约残基26-32（L1）、50-52（L2）和91-96（L3）和重链可变区中的26-32（H1）、53-55（H2）和96-101（H3）（Chothia and Lesk;J Mol Biol196:901-917(1987)）。在一些实例中，互补决定区可包括来自根据Kabat定义的CDR区和来自高变环的氨基酸。

根据其重链恒定区的氨基酸序列，完整的抗体可被分配到不同的“类”。存在五大类完整抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些类中的若干还可进一步分为亚类（同种型），例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应不同类的抗体的重链恒定区分别被称为[α]、[δ]、[ε]、[γ]和[μ]。不同类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构象是公知的。本文使用的抗体为通常已知的抗体和其功能片段。

抗体/免疫球蛋白的“功能片段”或“抗原结合片段”在本文中被定义为保留抗原结合区的抗体/免疫球蛋白的片段（例如IgG的可变区）。抗体的“抗原结合区”通常存在于抗体的一个或多个高变区中，例如CDR1、-2和/或–3区；然而，可变“框架”区也可以在抗原结合中起重要作用，例如通过提供CDR的支架。优选地，所述“抗原结合区”至少包括可变轻链（VL）的氨基酸残基4-103和可变重（VH）链的氨基酸残基5-109，更优选VL的氨基酸残基3-107和VH的氨基酸残基4-111，并且特别优选完整的VL和VH链（VL的氨基酸第1-109位和VH的氨基酸第1-113位；编号根据WO97/08320进行）。

本发明的“功能片段”或“抗原结合抗体片段”包括Fab、Fab'、F(ab')₂、和Fv片段；双体；单域抗体（Dab）、线性抗体；单链抗体分子（scFv）；和由抗体片段形成的多特异性的（例如双或三-特异性的）抗体（C.A.KBorrebaeck,editor(1995)Antibody Engineering(Breakthroughs inMolecular Biology),Oxford University Press；R.Kontermann & S.Duebel,editors(2001)Antibody Engineering(Springer Laboratory Manual),Springer Verlag）。除了“多特异性的”或“多功能的”抗体以外的抗体被理解为具有各自相同的结合位点。可以将F(ab’)₂或Fab改造以最小化或完全除去发生在CH1和CL结构域之间的分子间二硫键相互作用。一类用于本发明的优选的抗原结合片段为Fab片段。

本发明的抗体和其抗原结合片段可来源于重组抗体文库，所述重组抗体文库基于已从大量健康志愿受试者的抗体中分离的氨基酸序列。使用

技术将全部的人CDR重组至新抗体分子中（et al.,Nat.Biotech.2000,18:853-856）。该独特的重组方法使得所述文库含有比人免疫系统可自然产生的抗体更多的抗体。

如本文所用，术语“表位”包括能够特异性结合至免疫球蛋白或T细胞受体的任何结构决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或糖侧链，或其组合组成，并且通常具有特定三维结构特征以及特定的电荷特征。如果通过本领域技术人员公知的任何方法证明一种抗体在竞争性结合测定中与第二种抗体竞争，则称两种抗体“结合相同表位”。

“分离的”抗体是已经被鉴别并且从表达它的细胞的组分中分离的抗体。所述细胞的污染组分是会干扰所述抗体的诊断或治疗用途的物质，可能包括酶、激素和其他蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，所述抗体被纯化至(1)通过罗氏蛋白定量法（the Lowry method）、UV-Vis光谱或通过SDS-毛细管凝胶电泳（例如，在Caliper LabChipGXII、GX90或Biorad Bioanalyzer设备上）测定的，高于95重量%的抗体，并且在更优选的实施方案中,高于99重量%；（2）纯化至足以获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个氨基酸的程度；或者(3)通过SDS在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或优选的银染纯化至同质。分离的天然抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为所述抗体的天然环境中的至少一种组分是不存在的。然而，通常情况下，分离的抗体会通过至少一个纯化步骤进行制备。

分别相对于参考多核苷酸或多肽序列的“序列同一性百分数”，被分别定义为（根据需要）比对候选序列和参考多核苷酸或多肽序列以及引入缺口以实现最大序列同一性百分数之后，分别与参考多核苷酸或多肽序列中核酸或氨基酸残基相同的候选序列中的核酸或氨基酸残基的百分数。保守置换不被认为是序列同一性的一部分。优选不带缺口（un-gapped）的比对。目的是确定氨基酸序列同一性百分数的比对可以以在本技术领域范围内的多种方式实现，例如，使用公开可用的计算机软件例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign（DNASTAR）软件。本领域技术人员可确定用于比对序列的合适参数，包括在要比较的序列全长上实现最大（maximal）对齐所需要的任何算法。

“含结构式1的FXa抑制剂”被定义为含有一组式1的化合物

其中，*为与所述化合物剩余部分的连接位点。

“含结构式2的FXa抑制剂2”被定义为含一组式2的化合物

其中

R¹为氢，R²为氢，R³为氢，

或者

R¹甲基，R²为氢，R³为甲基，

或者

R¹为氢，R²为氟，R³为氢，

并且

*为与所述化合物剩余部分的连接位点。

“中和”、“逆转”、“消除”或“正常化”凝血抑制剂的活性或者相似的短语是指抑制或阻断所述抑制剂的抗凝血功能。这种短语是指，在体外和/或体内，部分抑制或阻断所述功能，以及是指抑制或阻断所述抑制剂的大部分或全部活性。在一个优选的实施方案中，所述凝血抑制剂被基本上中和，意味着其直接或间接地抑制所述凝血抑制剂的能力减少至少约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85、90%、95%或100%。

“抗体模拟物”为Affibodies、Adnectins、Anticalins、DARPins、Avimers、Nanobodies（综述：Gebauer M.et al.,Curr.Opinion in Chem.Biol.2009;13:245-255;Nuttall S.D.et al.,Curr.Opinion inPharmacology 2008;8:608-617）和适体（Aptamers）（综述：Keefe AD.,et al.,Nat.Rev.Drug Discov.2010;9:537-550）。

本发明的抗体

本发明的抗体涉及适合在体外和/或体内中和凝血的治疗性抑制剂的抗凝活性的抗体和其功能片段，或抗体模拟物的鉴别和用途。在一个优选的实施方案中，在PT、aPTT、凝血酶生成或生物化学测定中测定体外抑制。在一个优选的实施方案中，在尾部出血实验中测定体内抑制。

另一个实施方案为本发明的抗体和其功能片段，或结合至凝血的治疗性抑制剂的抗体模拟物。

在一个优选的实施方案中，本发明的抗体和其功能片段或抗体模拟物在体外和/或体内结合至抗凝血剂，并中和所述抗凝血剂的抗凝活性。

在一个优选的实施方案中，本发明的抗体和其功能片段，或抗体模拟物在体外和/或体内结合抗凝血剂，并中和所述第一抗凝血剂的抗凝活性，而且不像中和所述第一抗凝血剂一样中和另一抗凝血剂。

在一个优选的实施方案中，本发明的抗体和其功能片段，或抗体模拟物在体外和/或体内特异性结合至抗凝血剂，并特异性中和所述第一抗凝血剂的抗凝活性，并且不像中和所述第一抗凝血剂一样中和另一抗凝血剂。

在另一个优选的实施方案中，所述抗凝血剂为小分子，优选地其分子量低于5000Da、低于2500Da和更优选低于1000Da。优选的抗凝血剂为FXa或凝血酶的抑制剂（达比加群（Sorbera et al.,Drugs of the Future2005,30(9):877-885以及其中所引用的文献）。

在另一个优选的实施方案中，FXa抑制剂为包含一组式1的化合物，阿哌沙班（参见WO2003/026652；实施例18）、贝曲西班（参见US专利No6,376,515和US6,835,739）、雷扎沙班（参见WO1998/057951；实施例34）、依杜沙班（参见US20050020645；实施例192）、奥米沙班（otamixaban）（Guertin et al.,Current Medicinal Chemistry2007,14,2471-2781以及其中所引用的文献）或YM-150。

在另一个优选的实施方案中，包含一组式1的化合物为包含一组式2的化合物。在另一个甚至优选的实施方案中，包含一组式2的化合物为利伐沙班、SATI（参见WO2008/155032（实施例38））和实施例1G的化合物。在一个甚至更优选的实施方案中，包含一组式2的化合物为利伐沙班。

在一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段或抗体模拟物具有低于500nM，优选低于250nM、低于100nM、低于50nM，或者更优选低于25nM的结合亲和力（K_D）。所述结合亲和力优选通过实施例7中记载的方法来测定。

在一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段或抗体模拟物中和所述抗凝血剂并且在用对应抗凝血剂抑制的生物化学测定中半数最大有效浓度（EC₅₀）为EC50<2μM、<1μM、<0.5μM或优选地<0.01μM。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段或抗体模拟物中和所述抗凝血剂，并且在用利伐沙班抑制的生物化学Fxa测定中半数最大有效浓度（EC₅₀）为EC50<2μM、<1μM、<0.5μM或优选地<0.01μM。

在一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段或抗体模拟物与表1中的抗体，优选与抗体M14-G07、M18-G08、M18-G08-G或M18-G08-G-DKTHT竞争结合至所述抗凝血剂。在另一个实施方案中，上述竞争抗体或其抗原结合片段与M18-G08-G-DKTHT竞争结合至利伐沙班。

在另一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与M18-G08-G-DKTHT竞争结合至利伐沙班，其中所述抗体或其抗原结合片段的结合是经由以下介导：a)所述轻链第99位氨基酸残基至利伐沙班氯噻唑基团的π-堆积（stacking），b)所述重链第104位氨基酸残基至利伐沙班氯噻吩基团的疏水性堆积，c)所述重链的第50位（氢键供体氨基酸）和第102位（在第102位的情况中，经过所述多肽链的主链酰胺基）氨基酸残基与利伐沙班的中央酰胺基的氢键键合，d)所述重链第102位氢键受体氨基酸残基与利伐沙班的噁唑基的羰基氧的氢键键合，和e)所述重链第33位氨基酸残基与利伐沙班苯环的π-堆积。

在另一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与M18-G08-G-DKTHT竞争结合至利伐沙班，其中所述轻链的第99位氨基酸残基选自Trp、Phe和Tyr。在另一个实施方案中，所述重链的第104位氨基酸残基为疏水性氨基酸，优选选自Ala、Val、Leu、Ile、Met和Phe。在另一个实施方案中，第50位氨基酸残基为氢键供体氨基酸，优选选自Ser、Thr、Tyr、Trp、His、Asn和Gln。在另一个实施方案中，所述重链的第102位氨基酸残基为氢键受体氨基酸，优选选自Ser、Thr、Tyr、Glu、Asp、Asn和Gln，在另一个实施方案中，所述重链的第33位氨基酸残基选自Trp、Phe和Tyr。

在另一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与M18-G08-G-DKTHT竞争结合至利伐沙班，

其中，所述轻链的第99位氨基酸残基选自Trp、Phe和Tyr，

所述重链的第104位氨基酸残基为疏水性氨基酸，选自Ala、Val、Leu、Ile、Met和Phe，所述重链的第102位氨基酸残基为氢键受体氨基酸，其选自Ser、Thr、Tyr、Glu、Asp、Asn和Gln。

在另一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与M18-G08-G-DKTHT竞争结合至利伐沙班，

其中，所述轻链的第99位氨基酸残基为Trp，

所述重链的第102位氨基酸残基为Thr或Asn，

所述重链的第104位氨基酸残基为Leu。

在另一个实施方案中，上述竞争抗体或其抗原结合片段与M18-G08-G-DKTHT竞争结合至利伐沙班，并且具有可变轻链序列和可变重链序列，所述可变轻链序列含有第35位Asn、第37位Tyr、第90位Gln、第99位Trp和第101位Phe（编号根据Fab M18-G08-G-DKTHT可变轻链的氨基酸位置），所述可变重链序列含有第31位上Ser、第33位Trp、第35位Ser、第47位Trp、第50位Ser、第99位Val、第100位Trp、第101位Arg、第102位Asn、第103位Tyr、第104位Leu（编号根据Fab M18-G08-G-DKTHT可变轻链的氨基酸位置）。

在另一个实施方案中，上述竞争抗体分别与M18-G08-G的Vh序列和Vl序列至少90%相同。

本发明的抗体、抗原结合抗体片段以及所述抗体和片段的变体包含轻链可变区和重链可变区。本发明考虑到的（contemplated）抗体或抗原结合抗体片段的变体为其中保留了所述抗体或抗原结合抗体片段的抗原结合活性的分子。

在整个文件中，提到了以下本发明的代表性抗体或其功能片段：M14-G07、M18-G08、M18-G08-G和M18-G08-G-DKTHT。代表性序列（SEQ ID NO）示于表1。

表1：抗体和其代表性序列。

在另一个优选实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含与表1示出的至少一个（优选对应的）CDR序列至少50%、55%、60%、70%、80%、90%或95%相同的重链或轻链CDR序列，或者本发明的抗体或其抗原结合片段包含分别与表1示出的VH或VL序列至少50%、60%、70%、80%、90%、92%或95%相同的可变重链或轻链序列。

在另一个优选实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链和/或轻链CDR序列，所述重链和/或轻链CDR序列分别与抗体M14-G07、M18-G08、M18-G08-G或M18-G08-G-DKTHT的至少一个（优选对应）CDR序列至少50%、55%、60%、70%、80%、90%或95%相同。

在另一个优选实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链和/或轻链CDR序列，所述重链和/或轻链CDR序列分别与抗体M14-G07、M18-G08、M18-G08-G或M18-G08-G-DKTHT的所述（优选对应）重链和/或轻链CDR序列至少50%、55%、60%、70%、80%、90%或95%相同。

在另一个优选实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含与抗体M14-G07的重链CDR2和-3序列至少50%、55%、60%、70%、80%、90%或95%相同的重链CDR2和-3序列，和与抗体M14-G07的轻链CDR1和-3序列至少50%、55%、60%、70%、80%、90%或95%相同的轻链CDR1和-3序列。在另一个优选实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含与抗体M18-08、M10-G08-G或M18-G08-G-DKTHT的重链CDR2和-3序列至少50%、55%、60%、70%、80%、90%或95%相同的重链CDR2和-3序列，和与抗体M18-08、M10-G08-G或M18-G08-G-DKTHT的轻链CDR1和-3序列至少至少50%、55%、60%、70%、80%、90%或95%相同的轻链CDR1和-3序列。

在另一个优选实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含可变重链序列，所述可变重链序列与表1或表3公开的VH序列，优选与抗体M14-G07、M18-G08、M18-G08-G或M18-G08-G-DKTHT的VH序列，至少50%、60%、70%、80%、90%、92%或95%相同。在另一个优选实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含可变轻链序列，所述可变轻链序列与表1或表2公开的VL序列，优选与抗体M14-G07、M18-G08、M18-G08-G或M18-G08-G-DKTHT的VL序列，至少50%、60%、70%、80%、90%、92%或95%相同。

在另一个优选实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含可变重链和轻链序列，所述可变重链和轻链序列分别与抗体M14-G07、M18-G08、M18-G08-G或M18-G08-G-DKTHT的VH和VL序列至少50%、60%、70%、80%、90%、92%或95%相同。

在另一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含符合表4和5中示出的M14-G07或M18-G08衍生的（优选对应的）CDR共有序列的重链和轻链CDR序列。另一个优选实施方案为本发明的抗体或其抗原结合片段，其包含符合由共有序列SEQ ID NO:497（CDR H1）、SEQ ID NO:222（CDR H2）和SEQ ID NO:498（CDR H3）所表示的对应重链CDR序列的重链CDR序列，和符合由共有序列SEQ ID NO:499（CDR L1）、SEQ ID NO:500（CDR L2）和SEQ ID NO:501（CDR L3）所表示的对应轻链CDR序列的轻链CDR序列；或者，其包含符合由共有序列SEQ ID NO:502（CDR H1）、SEQ ID NO:503（CDR H2）和SEQ ID NO:504（CDR H3）所表示的对应重链CDR序列的重链CDR序列，和符合由共有序列SEQ ID NO:505（CDR L1）、SEQ ID NO:506（CDR L2）和SEQ ID NO:507（CDR L3）所表示的对应轻链CDR序列的轻链CDR序列。

在另一个优选实施方案中，本发明的抗体或或抗原结合抗体片段包含至少一个（优选对应的）表1或表2和3公开的重链和/或轻链CDR序列，或（优选地）表1或表2和3示出的抗体的重链和/或轻链CDR序列。在另一个优选实施方案中，本发明的抗体或或抗原结合抗体片段包含至少一个，两个、三个、四个、五个或六个（优选对应的）表1或表2和3公开的重链和轻链CDR序列，或者（优选地）表1或表2和3示出的抗体的重链和轻链CDR序列。在另一个优选实施方案中，所述抗体或抗原结合抗体片段包含表1或表2和3示出的抗体的重链或轻链CDR1、CDR2或CDR3序列，表1或表2和3示出的抗体的重链或轻链CDR1和CDR2序列，表1或表2和3示出的抗体的重链或轻链CDR1和CDR3序列，表1或表2和3示出的抗体的重链或轻链CDR2和CDR3序列，表1或表2和3示出的抗体的重链或轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。在另一个优选实施方案中，本发明的抗体或或抗原结合抗体片段包含表1或表2和3示出的抗体的重链CDR序列CDR1和CDR2以及轻链CDR序列CDR1、CDR2、CDR3。在另一个优选实施方案中，所述抗体或抗原结合抗体片段包含表1或表2和3示出的抗体的重链和轻链CDR1、CDR2或CDR3序列，表1或表2和3示出的抗体的重链和轻链CDR1和CDR2序列，表1或表2和3示出的抗体的重链和轻链CDR1和CDR3序列，表1或表2和3示出的抗体的重链和轻链CDR2和CDR3序列，表1或表2和3示出的抗体的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。在另一个优选实施方案中，本发明的抗体或抗原结合抗体片段包含表1或表2和3示出的抗体的重链和轻链CDR序列。

在另一个优选实施方案中，本发明的抗体或抗原结合抗体片段包含表1或表2和3公开的VH和/或VL序列。在另一个优选实施方案中，所述抗体或抗原结合抗体片段包含表1或表2和3示出的抗体的VH和VL序列。

在另一个实施方案中，本发明的抗体或抗原抗体结合片段包含表9（M14-G07的变体）或表11（M18-G08的变体）中公开的VH和/或VL序列，示出了根据第2栏引入所述分子的重链和/或轻链中的单个和/或两个氨基酸置换。

在一个优选实施方案中，本发明的抗体或抗原结合抗体片段是单克隆的。在另一个优选实施方案中，本发明的抗体或抗原结合抗体片段是人的、人源化的或嵌合的。

在整个文件中，提到了以下本发明的优选抗体：“M14-G07”、“M18-G08”、“M18-G08-G”或“M18-G08-DKTHT”或“M18-G08-G-DKTHT”

M14-G07表示包含对应于SEQ ID NO:475（DNA）/SEQID NO:207（蛋白质）的可变重链区和对应于SEQ ID NO:476（DNA）/SEQ ID NO:208（蛋白质）的可变轻链区的抗体。

M18-G08表示包含对应于SEQ ID NO:485（DNA）/SEQID NO:217（蛋白质）的可变重链区和对应于SEQ ID NO:486（DNA）/SEQ ID NO:218（蛋白质）的可变轻链区的抗体。

M18-G08-G表示包含对应于SEQ ID NO:385（DNA）/SEQID NO:117（蛋白质）的可变重链区和对应于SEQ ID NO:386（DNA）/SEQ ID NO:118（蛋白质）的可变轻链区的抗体。

M18-G08-G-DKTHT表示包含对应于SEQ ID NO:491（DNA）/SEQ ID NO:489（蛋白质）的重链区和对应于SEQ IDNO:492（DNA）/SEQ ID NO:490（蛋白质）的轻链区的抗体。

M18-G08-DKTHT表示包含对应于SEQ ID NO:495（DNA）/SEQ ID NO:493（蛋白质）的重链区和对应于SEQ IDNO:496（DNA）/SEQ ID NO:494（蛋白质）的轻链区的抗体。

M018-G08-G-IgG1表示包含对应于SEQ ID NO:508（蛋白质）的重链区和对应于SEQ ID NO:509（蛋白质）的轻链区的IgG1抗体。

在一些实施方案中，分离了抗体、其抗原结合片段，或其衍生物或抗体模拟物或编码它们的核酸。分离的生物学组分（例如核酸分子或蛋白质例如抗体）是已基本上从所述组分天然存在的生物体的细胞中其他生物学组分（例如，其他的染色体和染色体外DNA和RNA、蛋白质和细胞器）中分离或纯化出来的生物学组分。已被“分离的”核酸和蛋白质包括包括通过标准的纯化方法（Sambrook et al.,1989（Sambrook,J.,Fritsch,E.F.andManiatis,T.(1989)Molecular Cloning:A laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,USA）和Robert K.Scopes eat al1994Protein Purification,-Principles and Practice,Springer Science and Business MediaLLC）纯化的核酸和蛋白质。该术语也包括通过宿主细胞中重组表达制备的核酸和蛋白，以及化学合成的核酸。

抗体产生

使用特别开发的工具和方法，将完全的人n-CoDeR抗体噬菌体展示文库用于分离对含结构式1的FXa抑制剂特异性的高亲和力的人单克隆抗体和其抗原结合片段。这些工具和方法包括特定的靶分子和其基于生物素-链亲和素相互作用至表面的固定化。作为靶分子的含结构式1的FXa抑制剂的固定化是从噬菌体文库选择抗体和其抗原结合片段（噬菌体淘选）以及在ELISA方法中筛选和分析特异性抗体的前提。

本发明的抗体和其抗原结合片段是通过噬菌体展示技术（PDT）中三种非常规方法的组合来开发的。首先，合成可基于生物素-链亲和素相互作用固定化至表面的含结构式1的FXa抑制剂（实施例1K和1L）。其次，将固定化在链亲和素微珠上的靶化合物（实施例1K和1L）用于在严格条件下进行的选择。用FITC-生物素进行的噬菌体文库的预吸附被包括在内以耗尽对所述生物素-接头部分特异性的结合物（binder）。再次，开发了允许对多轮淘选中获得的噬菌体输出（output）进行连续筛选的筛选方法。这些特定方法的组合使得可以分离独特的抗体“M16-D05”、“M14-G07”、“M15-B07”、“M25-E05”、“M18-A10”、“M16-A03”和“M18-G08”。

这些独特的抗体被以下方式进一步表征：ELISA测试和SPR分析（BIAcore）中以及使用例如利伐沙班作为FXa抑制剂的功能中和测定中对靶分子的结合亲和力。

产生了所述独特抗体“M14-G07”和“M18-G08”的变体，并对所述变体的在FXa测定中逆转利伐沙班作用的亲和力和/或功能性进行筛选。将所得的变体“M18-G08-G”再克隆，以非标签Fab“M18-G08-G-DKTHT”表达并如一些实施例中所述进行深度表征（in-depth characterized）。

用于获得本发明抗体和其功能性抗体片段或抗体模拟物的其他示例性方法：

依照与上文描述的相似方式，技术人员可通过文库筛选产生抗体模拟物。

除了使用展示文库之外，其他方法可用于获得本发明的抗体或其功能片段。例如，来自实施例1K和/或实施例1L的偶联载体蛋白的化合物可在非人动物（例如啮齿动物）中用作抗原。在一个实施方案中，所述非人动物包括至少一部分的人免疫球蛋白基因。例如，可用人Ig基因座的大片段改造小鼠抗体产生有缺陷的小鼠品系。使用杂交瘤技术，可产生并选择源于所述基因且具有所需特异性的抗原特异性单克隆抗体（Mab）。参见，例如XENOMOUSE^TM,Green et al.,1994,Nat.Gen.7:13-21；U.S.2003-0070185、公开于1996年10月31日的WO96134096和1996年4月29日提交的PCT申请No.PCTlUS96105928。

在另一个实施方案中，从非人动物获得单克隆抗体，然后对其进行修饰，例如，人源化或去免疫化（deimmunized）。Winter描述了可用于制备人源化抗体的CDR-移植法（UK专利申请GB2188638A，1987年3月26日提交；US专利No.5,225,539）。可用至少部分的非人CDR替换特定人抗体的所有CDR，或者仅用非人CDR替换所述CDR中的一些。仅需要替换人源化抗体结合至预定抗原所需的CDR数目。人源化抗体可通过用来自人Fv可变区的等价序列替换不直接参与抗原结合的Fv可变区序列来产生。Morrison,S.L.,1985,Science229:1202-1207、Oi et al.,1986,25BioTechniques4:214和Queen et al.US专利No.5,585,089、US5,693,761和US5,693,762提供了用于产生人源化抗体的一般方法。这些方法包括分离、操作和表达编码来自重链或轻链中至少一条的全部或部分免疫球蛋白Fv可变区的核酸序列。这种核酸的多种来源是可用的。例如，核酸可获自产生针对预定靶标的抗体的杂交瘤细胞，如上所述。然后，将编码所述人源化抗体或其片段的重组DNA克隆至合适的表达载体中。

肽变体

本发明的抗体或抗原结合片段不限于本文提供的具体肽序列。相反，本发明还包括这些多肽的变体。参考本公开内容和常规可用技术和参考文献，技术人员能够制备、测试和利用本文公开的所述抗体和其抗原结合片段的功能性变体，同时理解具有结合抗凝血剂能力的变体落在本发明的范围内。

变体可包括例如，与本文公开的肽序列相比，具有至少一个改变的互补决定区（CDR）（高变的）和/或框架（FR）（可变的）域/位置的抗体或其抗原结合片段。为了更好地说明这个概念，下文简要描述抗体结构。

抗体由两条肽链组成，每条链含有1个（轻链）或3个（重链）恒定结构域和1个可变区（VL、VH），后者在每种情况下均由4个FR区和3个间隔的CDR组成。所述抗原结合位点由一个或多个CDR形成，而FR区为所述CDR提供结构框架，并且因此在抗原结合中起重要作用。通过改变CDR或FR区中的一个或多个氨基酸残基，技术人员可常规地产生突变的或多样化的抗体序列，所述抗体序列可针对所述抗原进行筛选，用于例如筛选新的或改善的特性。

表2（VL）和3（VH）记载了本发明某些抗体的CDR和FR区，并且互相比较给定位置的氨基酸以及与对应共有序列比较给定位置的氨基酸。

表2：VL序列

表3：VH序列

表4：M14-G07衍生物的共有CDR序列

表5：M18-G08衍生物的共有CDR序列

本发明的另一个优选实施方案为其中依照表1所示选择CDR序列的抗体或其抗原结合片段

本发明的另一个优选实施方案为其中依照表1所示选择VH和VL序列的抗体或抗原结合片段。技术人员可使用表1、2和3中的数据设计本发明范围内的肽变体。优选通过改变一个或多个CDR区内的氨基酸来构建变体；变体还可以具有一个或多个改变的框架区。还可在框架区进行改变。例如，可改变肽FR结构域，其中与种系序列相比残基有偏差。

此外，变体可通过以下方式获得：将一个抗体用作起点以通过多样化所述抗体中的一个或多个氨基酸残基（优选一个或多个CDR中的氨基酸残基）进行优化，和通过对所得的抗体变体集合筛选具有改良特性的变体。特别优选的是多样化VL和/或VH的CDR3中的一个或多个氨基酸残基。多样化可通过利用三核苷酸诱变（TRIM）技术合成DNA分子集合来进行（

B.et al.,Nucl.Acids Res.1994,22:5600）。抗体或其抗原结合片段包括具有修饰/变化的分子，包括但不限于例如导致半衰期改变的修饰（例如，修饰Fc部分或连接其他分子例如PEG）。

保守性氨基酸变体

可以使得多肽变体保留本文所述的抗体肽序列的整体分子结构。考虑到各氨基酸的特性，技术人员会认识到一些合理取代。氨基酸取代，即“保守性取代”，可以例如在所涉及的残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性的基础上进行。

例如，（a）非极性（疏水性）氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；（b）极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬氨酸和谷氨酰胺；（c）正电荷（碱性）氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；（d）负电荷（酸性）氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。取代通常可以在(a)-(d)组内进行。此外，基于它们破坏α-螺旋的能力，甘氨酸和脯氨酸可以相互取代。相似地，某些氨基酸，例如丙氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸和赖氨酸更常见地存在于α-螺旋中，而缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和苏氨酸更常见地存在于β-折叠片中。甘氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺和脯氨酸常见地存在于转角（turn）中。一些优选的取代可以在下组中进行：(i)S和T；(ii)P和G；(iii)A、V、L和I。考虑到已知的遗传密码以及重组和合成DNA技术，技术人员可以容易地构建编码保守性氨基酸变体的DNA。

如本文所用，两条多肽序列之间的“序列同一性”表示所述序列之间相同的氨基酸的百分比。“序列同源性”表示相同的或代表保守性氨基酸取代的氨基酸的百分比。

本发明的DNA分子

本发明还涉及编码本发明的抗体或其抗原结合片段的DNA分子。这些序列包括但不限于表1所列出的那些DNA分子。

本发明的DNA分子不限于本文公开的序列，还包括其变体。本发明中的DNA变体可以参照它们在杂交中的物理特性来描述。技术人员会认识到通过利用核酸杂交技术，DNA可用于鉴别其互补物并且（因为DNA是双链的）其等同物或同系物。还会认识到杂交可以以低于100%互补性发生。然而，考虑到条件的适当选择，杂交可用于区分DNA序列，这基于它们与特定探针的结构相关性。对于这类条件的指导参见，Sambrook etal.,1989supra and Ausubel et al.,1995(Ausubel,F.M.,Brent,R.,Kingston,R.E.,Moore,D.D.,Sedman,J.G.,Smith,J.A.,&Struhl,K.eds.(1995).Current Protocols in Molecular Biology.New York:John Wileyand Sons）。

两条多核苷酸序列之间的结构相似性可以表示为这两个序列会彼此杂交的条件的“严格性”的函数。如本文所用，术语“严格性”是指条件不利于杂交的程度。严格条件非常不利于杂交，并且仅结构上最相关的分子会在这类条件下彼此杂交。相反地，非-严格条件有利于表现出较低结构相关性程度的分子的杂交。因此，杂交严格性与两条核酸序列的结构关系直接相关。以下关系可用于关联杂交与相关性（其中Tm为核酸双链体的解链温度）：

a.T_m=69.3+0.41(G+C)%

b.错配碱基对数目中每增加1%，双链体DNA的T_m降低1℃。

c.(T_m)_μ2-(T_m)_μ1=18.5log₁₀μ2/μ1

其中，μ1和μ2为两种溶液的离子强度。

杂交严格性是许多因素的函数,包括总DNA浓度、离子强度、温度、探针大小以及破坏氢键的物质的存在。促进杂交的因素包括高DNA浓度、高离子强度、低温、较长的探针大小以及不存在破坏氢键的物质。杂交通常在两个阶段中进行：“结合”阶段和“洗涤”阶段。

首先，在结合阶段中，探针在有利于杂交的条件下结合至所述靶。通常在该阶段通过改变温度来控制严格性。对于高严格性，除非使用短的寡核苷酸探针（＜20nt），温度通常为65℃-70℃。代表性杂交溶液包含6×SSC、0.5%SDS、5×登哈特溶液（Denhardt’s solution）和100μg的非-特异性载体DNA。参见Ausubel et al.,section2.9,supplement27(1994)。当然，许多不同但功能等同的缓冲条件是已知的。当相关性程度较低时，可选择较低的温度。低严格性结合温度为25℃-40℃。中等严格性为至少约40℃-低于约65℃。高严格性为至少约65℃。

其次，通过洗涤除去过量的探针。在这个阶段通常应用更严格的条件。因此，这个“洗涤”阶段在通过杂交确定相关性时最重要。洗涤溶液通常含有较低盐浓度。一种示例性中等严格性溶液含有2×SSC和0.1%SDS。高严格性洗涤溶液含有少于0.2×SSC的等同物（离子强度），优选严格溶液含有0.1×SSC。与各种严格性相关的温度与上文所讨论的关于“结合”的温度相同。洗涤溶液在洗涤期间也通常被更换多次。例如，典型的高严格性洗涤条件包括在55℃下洗涤2次，每次持续30分钟；以及在60℃下洗涤3次，每次持续15分钟。

本发明的实施方案为分离的核酸序列，其编码(i)本发明的抗体或抗原结合片段，表1示出的CDR序列，或(ii)表1示出的可变轻链和重链序列，或者(iii)含有这样的核酸序列，即编码本发明的抗体或抗原结合片段、表1示出的CDR序列或表1示出的可变轻链和重链序列。

功能等同的变体

本发明的范围内的另一类DNA变体可参考它们编码的产物来描述。这些功能等同的多核苷酸通过以下事实表征：由于所述遗传密码的简并性，它们编码表1中的相同肽序列。

据认为，本文提供的DNA分子的变体可以以若干种不同的方式构建。例如，它们可以构建为完全合成的DNA。有效合成在20至约150个核苷酸的范围内的寡核苷酸的方法被广泛应用。参见Ausubel et al.,section2.11,Supplement21(1993)。重叠寡核苷酸可以通过Khorana et al.,J.Mol.Biol.72:209-217(1971);see also Ausubel et al.,supra,Section8.2首先报道的方式合成和装配。合成的DNA优选地被设计为具有在所述基因的5'和3'末端改造的方便的限制性位点，以便于克隆至适当载体中。

如本文所示，产生变体的方法是从本文公开的DNA之一开始，然后进行定点突变。参见Ausubel et al.,supra,chapter 8,Supplement 37(1997)。在典型方法中，将靶DNA克隆至单-链DNA噬菌体载体中。分离单链DNA，并将其与含有所需核苷酸改变的寡核苷酸杂交。合成互补链，并且将双链噬菌体引入宿主中。一些所得的子代会含有所需的突变，这可以利用DNA测序来证实。此外，可增加所述子代噬菌体是所述突变体的概率的各种方法是可用的。这些方法对于本领域的技术人员是已知的，并且用于产生这类突变体的试剂盒是可商购的。

重组DNA构建体和表达

本发明还提供了包含本发明的一个或多个核苷酸序列的重组DNA构建体。本发明的重组构建体可与载体一起使用，例如质粒、噬粒、噬菌体或病毒载体，编码本发明的抗体或其抗原结合片段的DNA分子插入其中。

本文提供的抗体、抗原结合部分或其衍生物可通过在宿主细胞中重组表达编码轻链和重链或其部分的核酸序列来制备。为了重组表达抗体、抗原结合部分或其衍生物，可用携带编码轻链和/或重链或其部分的DNA片段的一个或多个重组表达载体转染宿主细胞，以使得所述轻链和重链在所述宿主细胞中表达。标准重组DNA方法学被用于制备和/或获得编码重链和轻链的核酸、将这些核酸纳入重组表达载体中并且将所述载体引入至宿主细胞中，例如Sambrook,Fritsch and Maniatis(eds.),Molecular Cloning;A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1989)、Ausubel,F.M.et al.(eds.)Current Protocols in Molecular Biology,GreenePublishing Associates,(1989)和Boss et al.的美国专利No.4,816,397中记载的那些。

此外，可将编码所述重链和/或轻链的可变区的核酸序列变换为例如编码全长抗体链、Fab片段或ScFv的核酸序列。编码VL-或VH-的DNA片段可被可操作地连接（以使得所述两个DNA片段编码的氨基酸序列都在框架中)至编码例如抗体恒定区或柔性接头的另一DNA片段。人重链和轻链恒定区的序列是本领域中已知的（参见例如，Kabat,E.A.,el al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242），包括这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增来获得。

为了产生编码ScFv的多核苷酸序列，可将编码VH-和VL-的核酸可操作连接至编码柔性接头的另一片段，以使得所述VH和VL序列可以被表达为连续的单链蛋白，且所述VL和VH区通过所述柔性接头连接在一起（参见例如，Bird et al.(1988)Science242:423-426;Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883；McCafferty et al.,Nature(1990)348:552-554）。

为了表达所述抗体、抗原结合部分或其衍生物，可使用标准重组DNA表达方法（参见，例如，Goeddel;Gene Expression Technology.Methods inEnzymology185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)）。例如，可将编码所需多肽的DNA插入至表达载体中，所述表达载体随后被转染至合适的宿主细胞中。合适的宿主细胞为原核细胞和真核细胞。原核宿主细胞的实例为例如细菌，真核宿主细胞的实例为酵母、昆虫或哺乳动物细胞。在一些实施方案中，将编码所述重链和轻链的DNA插入至不同载体中。在其他实施方案中，将编码所述重链和轻链的DNA插入至同一载体中。应理解，包括选择调节序列的表达载体的设计受到多种因素的影响，例如宿主细胞的选择、所需的蛋白质的表达水平以及表达是组成型的还是可诱导型的。

细菌表达

通过将编码所需蛋白的结构DNA序列连同合适的翻译起始和终止信号插入具有有功能的启动子的可操作阅读相（phase）来构建可用于细菌的可用表达载体。所述载体会包含一个或多个表型选择标记以及复制起点以确保维持所述载体，以及如果需要在宿主内提供扩增。用于转化的合适的原核宿主包括大肠杆菌（E.coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）以及假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属内的各个种。

细菌载体可以是例如基于噬菌体、质粒或噬粒的。这些载体可含有选择标记和细菌复制起点，其来源于可商购的质粒，通常包含公知的克隆载体pBR322（ATCC37017）的元件。转化合适的宿主菌株并使所述宿主菌株生长至适当细胞密度之后，通过适当的方法（例如，温度变化或化学诱导）将所选择的启动子去阻遏/诱导，并且将细胞培养额外的时间。通常通过离心收获细胞，通过物理或化学方法使细胞破裂，并且保留所得的粗提取物用于进一步纯化。

在细菌系统中，根据所表达的蛋白的目的用途，可有利地选择多种表达载体。例如，当要制备大量这样的蛋白用于生产抗体或用于筛选肽文库时，例如，可能需要指导易于纯化的融合蛋白的高水平表达的载体。本发明的抗体或其抗原结合片段或抗体模拟物包括天然纯化的产物、化学合成方法的产物和通过重组技术从原核宿主产生的产物，所述原核宿主包括，例如大肠杆菌（E.coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）以及假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属内的各种物种，优选大肠杆菌细胞。

哺乳动物表达和纯化

用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调节序列包括在哺乳动物细胞中指导高水平蛋白表达的病毒元件、例如源于巨细胞病毒（CMV）（例如CMV启动子/增强子）、猿猴病毒40（SV40）（例如SV40启动子/增强子）、腺病毒（例如腺病毒主要晚期启动子（AdMLP）和多瘤病毒的启动子和/或增强子。对病毒调节元件及其序列的进一步描述参见例如，Stinski的U.S.5,168,062、Bell et al.的U.S.4,510,245和Schaffner et al的U.S.4,968,615。重组表达载体还可以包括复制起点和选择标记（参见例如，Axel et al的U.S.4,399,216、4,634,665和U.S.5,179,017）。合适的选择标记包括赋予引入所述载体的宿主细胞对药物例如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性的基因。例如，二氢叶酸还原酶（DHFR）基因赋予对甲氨蝶呤的抗性，而neo基因赋予对G418的抗性。

将所述表达载体至宿主细胞中的转染可以利用标准技术例如电穿孔、磷酸钙沉淀和DEAE-葡聚糖、脂质转染或聚阳离子介导的转染来进行。

用于表达本文提供的抗体、抗原结合片段或其衍生物、或抗体模拟物的合适的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢（CHO细胞）（包括dhfr-CHO细胞，记载于Urlaub and Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216-4220中，使用DHFR选择标记，例如记载于R.J.Kaufmanand P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159:601-621中，NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。在一些实施方案中，设计表达载体，使得所表达的蛋白分泌至所述宿主细胞生长的培养基中。抗体的瞬时转染/表达可例如依照Durocher et al(2002)Nucl.Acids Res.Vol30e9的方案实现。抗体的稳定转染/表达可例如依照UCOE系统的方案（T.Benton et al.(2002)Cytotechnology38:43–46）实现。

所述抗体、抗原结合片段或其衍生物可使用标准蛋白质纯化方法从所述培养基中回收。

本发明的抗体或其抗原结合片段或抗体模拟物可通过公知方法从重组细胞培养物回收和纯化，所述已知方法包括，但不限于，硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、Protein A色谱法、Protein G色谱法、阴离子或阳林子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水作用色谱法、亲和色谱法、羟磷灰石色谱法以及凝集素色谱法。高效液相色谱法(“HPLC”)也可用于纯化。参见例如，Colligan,Current Protocols in Immunology,或CurrentProtocols in Protein Science,John Wiley & Sons,NY,N.Y.,(1997-2001)，例如第1、4、6、8、9、10章，各自以引用的方式全文纳入本文。

本发明的抗体或其抗原结合片段或抗体模拟物包括天然纯化的产物、化学合成方法的产物和通过重组技术从真核宿主产生的产物，所述真核宿主包括，例如酵母（例如毕赤酵母属（Pichia））、高等植物、昆虫和哺乳细胞，优选哺乳动物细胞。根据重组生产方法中所使用的宿主，本发明的抗体可以是糖基化的，或者可以是非糖基化的，优选糖基化的。这类方法记载于许多标准实验室手册中，例如上文的Sambrook，第17.37-17.42节；上文的Ausubel，第10、12、13、16、18和20章。

治疗方法

治疗方法包括向有需要的受试者给予治疗有效量的本发明的抗体或抗原结合片段或抗体模拟物。“治疗有效”量在本文定义为本发明的抗体、或抗原结合片段或抗体模拟物的量，其是足以作为单一剂量或根据多剂量方案，单独或联合其他试剂中和血浆中含式1结构的FXa抑制剂的量，这导致不利病症的减轻，而且所述量是毒理学上可耐受的。本发明的抗体或其抗原结合片段或抗体模拟物可以与已知药剂共同给予，并且在某些情况下，所述抗体或其抗原结合片段或抗体模拟物本身可以是经修饰的。例如，可以将抗体或其抗原结合片段或抗体模拟物缀合至或加入至聚乙二醇、载体蛋白、脂质体、包囊剂、磷脂膜或纳米颗粒以增加解毒剂的血浆半衰期。

本发明涉及通过向接受使用含式1结构的FXa抑制剂的抗凝治疗的受试者给予有效量的抗体或其抗原结合片段或抗体模拟物来选择性地中和所述受试者中所述FXa抑制剂的抗凝作用的治疗方法。应当考虑到，本发明的抗体或抗原结合片段或抗体模拟物可用于非紧急情况或紧急情况，以安全并特异性地中和所述FXa抑制剂的抗凝特性，获得大致正常化的凝血状态。这类非紧急或紧急情况是其中正常化的凝血是有利的情况，包括严重出血事件（例如，由创伤引起的）或者需要紧急侵入性操作（urgent invasive procedure）（例如，急诊手术）。本发明的抗体或抗原结合片段对血液动力学参数不具有固有（instrinsic）作用。在一个优选的实施方案中，所述FXa抑制剂为利伐沙班。

所述受试者可以为人或非人动物（例如，兔、大鼠、小鼠、狗、猴或其他低等灵长类）。

在一个实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段或抗体模拟物在给予过量的含式1结构的FXa抑制剂之后给予。

在另一个实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段或抗体模拟物在可能使得用含式1结构的FXa抑制剂治疗的受试者面临增加的出血风险的手术之前给予。

在另一个实施方案中，为了中和包含式1结构的FXa抑制剂对凝血的作用而用本发明的抗体或抗原结合片段或抗体模拟物治疗的受试者可通过服用不受所述解毒剂约束的FXa抑制剂而被快速地重新抗凝。

应当考虑到，有效量的本发明的抗体或抗原结合片段或抗体模拟物被给予至所述受试者。

在另一个实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段或抗体模拟物与具有抗血栓和/或抗纤维蛋白溶解活性的凝血剂组合给予。在一个实施方案中，所述凝血剂选自凝血因子、与所述凝血因子有关的多肽、重组凝血因子和它们的组合。在另一个实施方案中，所述凝血剂可选自化学吸附剂、止血剂、凝血酶、纤维蛋白胶、去氨加压素、冷沉淀物和新鲜冷冻血浆、凝血因子浓缩物、活化的或非活化的凝血酶原复合物浓缩物、FEIBA、血小板浓缩物和它们的组合。可用的凝血剂的更多实例可在引文Brooker M,Registry of Clotting Factor Concentrates,8^th Edition,World Federationof Hemophilia,2008中得到。

上文提到的疾病在人中已被充分地表征（well cahracterized），但是也以相似的病因学存在于其他动物（包括哺乳动物）中，并且可通过给予本发明的药物组合物的治疗。

为了治疗任一种上述疾病，按照本发明使用的药物组合物可以通过使用一种或多种生理学上可接受的载体或赋形剂以常规方式配制。本发明的抗体和抗原结合片段可通过任何合适的方法给予，其可以根据待治疗的疾病的类型而有所不同。可能的给药途径包括肠胃外（例如，肌肉内、静脉内、动脉内、腹腔内或皮下）、肺内和鼻内给药，并且如果需要，对于局部免疫抑制治疗采用病灶内给药。此外，本发明的抗体或其抗原结合片段可通过使用例如递减剂量的所述抗体或抗原结合片段的脉冲输注给予。优选地，所述给药是通过注射进行，最优选静脉内或皮下注射，这部分地取决于所述给药是短暂还是长期的。待给予的量取决于多种因素例如临床症状、个体的重量、是否给予其他药物。技术人员会认识到给药途径根据待治疗的疾病或病症而有所不同。

确定本发明所述抗体或其抗原结合片段或抗体模拟物的治疗有效量，主要取决于具体患者特征、给药途径以及待治疗的疾病的性质。一般性指导记载于例如国际协调会议的出版物中以及R_EMINGTON′SP_{HARMACEUTICAL} S_CIENCES,第27和28章，484-528页（18th ed.,AlfonsoR.Gennaro,Ed.,Easton,Pa.:Mack Pub.Co.,1990）中。更具体地，确定治疗有效量，取决于诸如药物的毒性和效能（efficacy）因素。毒性可使用本领域中公知的和上述参考文献中记载的方法测定。效能可利用相同的指导结合下文实施例中所述的方法测定。

诊断方法

本发明的另一方面为用于确定受试者中改变的凝血状态是否归因于所述受试者血液中存在含式1结构的FXa抑制剂的体外诊断方法，其中(a)体外凝血试验在存在本发明的抗体或抗原结合片段的情况下进行，(b)体外凝血试验在没有本发明的抗体或抗原结合片段的情况下进行，(c)比较步骤(a)和(b)中进行的测试的结果，(d)如果步骤(a)和(b)的结果是不同的，那么诊断改变的凝血状态归因于存在含式1结构的FXa抑制剂。优选的体外凝血试验为PT、aPTT或凝血酶生成试验。可快速获得该信息对于在诊断和治疗中计划进一步的措施非常重要，尤其是在紧急情况中。试验室试验（例如PTT）中延长的凝血时间可在例如狼疮抗凝物的存在下的观察到，其中针对细胞膜相关的磷脂和蛋白质的自身抗体干扰正常的凝血过程。然而，在体内狼疮抗凝物实际上为促血栓试剂（prothromboticagent），因为其通过与血小板膜磷脂相互作用和增加血小板的黏附和聚集而促进血栓的形成。与其他测定结合，上文描述的诊断试验可帮助检测狼疮抗凝物。

本发明的另一方面为用于确定用本发明的功能活性抗体或其抗原结合片段或抗体模拟物治疗的受试者血液中所述分子的量的体外诊断方法，所述方法利用来自实施例1K和/或1L的化合物作为捕获试剂。例如，在ELISA测定中，可将来自实施例1K和/或1L的化合物固定化至链亲和素包被的孔，并加入含有本发明的抗体或其抗原结合片段或抗体模拟物的样品。洗涤步骤之后，可用检测抗体检测所捕获的所述分子，并可通过将结果与使用已知量的抗体或其抗原结合片段或抗体模拟物的标准曲线比较而计算所述样品中物质的量。

本发明的另一方面为用于确定用含式1结构的FXa抑制剂治疗的受试者体液中所述抑制剂的量的体外诊断方法，所述方法利用来自实施例1K和/或1L的化合物以及本发明的抗体或其抗原结合片段或抗体模拟物作为ELISA试验的捕获试剂。结合的含式1结构的FXa抑制剂的量可根据通过加入经标记的抗独特型的抗体（anti-ideotypic antibody）产生的信号来估计，在存在所述抑制剂的情况下，所述抗独特型的抗体与本发明的抗体或其抗原结合片段或抗体模拟物的结合被阻断。

本发明的另一方面为用于确定用含式1结构的FXa抑制剂治疗的受试者体液中所述抑制剂的量的体外诊断方法，所述方法在竞争结合测定中利用来自实施例1K和/或1L的化合物以及本发明的抗体或其抗原结合片段或抗体模拟物。更详细地，用所述抑制剂处理的来自受试者的体液例如血浆可用固定量的本发明的抗体或其抗原结合片段或抗体模拟物预孵育。随后，本发明抗体与来自实施例1K和/或1L的固定化的化合物的剩余结合可在ELISA测定中评估。所述样品中所述抑制剂的量可通过比较结果和使用已知量抑制剂的标准曲线来计算。

在一个优选的实施方案中，体液为例如尿、血液、血浆、血清和唾液。在另一个优选的实施方案中，所述体液为血液。

本发明的另一个实施方案为诊断试剂盒，其包含连接至（tethered to）基质的抗凝血剂以及结合所述抗凝血剂的本发明的抗体或其抗原结合片段。所述连接可以是通过接头例如生物素接头。所述基质可以为固体基质，例如微量滴定板。在上述诊断试剂盒的一个优选实施方案中，所述抗凝血剂为利伐沙班。在上述诊断试剂盒的另一个优选实施方案中，所连接的抗凝血剂为实施例1K化合物和实施例1L化合物。在上述诊断试剂盒的另一个优选实施方案中，所述抗体为M18-G08、M18-G08-G或M18-G08-G-DKTHT或其抗原结合片段。最优选的试剂盒包含抗体M18-G08-G-DKTHT或其抗原结合片段以及实施例1K化合物。在另一个实施方案中，上述诊断试剂盒被用于诊断方法中以定量和/或定性地确定样品中的抗凝血剂（其中所述抗凝血剂对应于所述试剂盒的抗凝血剂），其包括以下步骤：(a)在允许所述抗体结合至所述抗凝血剂的条件下，形成上述试剂盒的抗体或其抗原结合片段的混合物，(b)在允许所述抗体结合至所述抗凝血剂条件下，将所述混合物与上述试剂盒的连接的抗凝血剂接触，(c)确定结合至所述连接的抗凝血剂的抗体或抗原结合片段的量。所述样品中所述抗凝血剂的量可通过比较结果和使用已知量抗凝血剂的标准曲线来计算。在一个优选的实施方案中，所述样品为体液。更优选包括在以下一组液体中的体液：尿、血液、血浆、血清和唾液。在一个优选的实施方案中，上述诊断方法用于确定利伐沙班。优选地，所述方法使用包含抗体M18-G08-G-DKTHT或其抗原结合片段以及实施例1K化合物的试剂盒。这类诊断方法的实例实施例22中描述的竞争性ELISA方法。

药物组合物和给药

本发明还涉及药物组合物，其可包含本发明的抗体和抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段是单独的或与至少一种其他试剂（例如稳定化合物）组合，所述药物组合物可以在任何无菌的生物相容性药物载体中给药，所述载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖和水。可将任何这些分子在药物组合物中单独或与其他试剂、药物或激素组合给予患者，在所述药物组合物中所述分子与赋形剂或可药用载体混合。在本发明的一个实施方案中，所述可药用载体在药学上是惰性的。

本发明还涉及药物组合物的给药。这种给药可经口或经肠胃外完成。肠胃外递送的方法包括体表、动脉内、肌肉内、皮下、髓内、鞘内、心室内、静脉内、腹腔内、子宫内或鼻内给药。除了活性成分以外，这些药物组合物可以含有合适的可药用载体，包括赋形剂和助剂，其有利于将所述活性化合物加工为在药学上可使用的制剂。制剂和给药技术的进一步细节可以在最新版本的Remington's Pharmaceutical Sciences（Ed.MaackPublishing Co,Easton,Pa.）中找到。

用于口服给药的药物组合物可使用本领域中熟知的可药用载体以适于口服给药的剂型配制。这类载体使得所述药物组合物可被配制为片剂、丸剂、锭剂、胶囊剂、液体、凝胶剂、糖浆剂、膏剂、悬液等，用于患者摄取。

用于口服使用的药物组合物可通过以下方式获得：将活性化合物与固体赋形剂组合，任选地研磨所得的混合物，根据需要加入合适的助剂之后，加工所述混合物的粒料以获得片剂或锭剂的片芯。合适的赋形剂是碳水化合物或蛋白质填充剂例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；来自玉米、小麦、稻、土豆或其他植物的淀粉；纤维素例如甲基，纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素钠；胶，包括阿拉伯胶和西黄蓍胶；以及蛋白质例如明胶和胶原。根据需要，可加入崩解剂或增溶剂，例如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、藻酸或它们的盐，例如藻酸钠。

锭剂片芯与合适的包衣（例如浓缩糖溶液）一起提供，其还可能含有阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液以及合适的有机溶剂或溶剂混合物。可向所述片剂或锭剂包衣中加入染料或色素，用于产品辨识或表征活性化合物的量，即剂量。

可口服使用的药物制剂包括由明胶制成的压入式（push-fit）胶囊，以及由明胶和包衣（例如甘油和山梨醇）制成的软的密封胶囊。压入式胶囊可含有与填充剂或粘合剂（例如乳糖或淀粉）、润滑剂（例如滑石或硬脂酸镁）和任选的稳定剂混合的的活性成分。在软胶囊中，可在有或没有稳定剂的情况下将活性化合物溶解或悬浮在合适的液体中，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。

用于肠胃外给药的药物制剂包括活性化合物的水溶液。为了注射，可以将本发明的药物组合物配制于水溶液中，优选生理学上相容的缓冲液例如汉克斯（Hank）溶液、林格氏（Ringer）溶液或生理缓冲盐水。水性注射悬液可含有增加该悬液的粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。此外，所述活性化合物的悬液可以制备为适当的油性注射悬液。合适的亲脂性溶剂或赋形剂（vehicles）包括脂肪油例如芝麻油，或者合成的脂肪酸酯例如油酸乙酯或甘油三酯，或者脂质体。任选地，所述悬液还可含有合适的稳定剂或增加所述化合物的溶解度以允许制备高度浓缩溶液的试剂。

为了局部或经鼻给药，适合待渗透的特定屏障的渗透剂可以被用于该制剂。这类渗透剂是本领域中已知的。

试剂盒

本发明还涉及药物包装和含一个或多个容器的试剂盒，所述容器装有上文提到的本发明组合物的一种或多种成分。与这类容器相关的可以是管理药物或生物制品的生产、使用或销售的政府机构所规定的形式的提示，其反映所述产品的生产、使用或销售机构被批准用于人类给药。

在另一个实施方案中，所述试剂盒可含有编码本发明的抗体或抗原结合片段的DNA序列。优选地，所述编码这些抗体的DNA序列在适用于转染至宿主细胞内并由宿主细胞表达的质粒中提供。所述质粒可含有启动子（通常为诱导型启动子）以调节所述DNA在宿主细胞中的表达。所述质粒还可含有适当的限制性位点以便于将其他DNA序列插入至所述质粒中以产生各种抗体。所述质粒还可含有多种其他元件以有利于所编码蛋白的克隆和表达。这类元件是本领域技术人员公知的，例如选择标记、起始密码子、终止密码子等。

制备和储存

本发明的药物组合物可以以本领域中已知的方式制备，例如通过常规的混合、溶解、造粒、锭剂制备、研磨（levigating）、乳化、包裹、包埋或冻干方法。

所述药物组合物可以盐的形式提供，可以用酸形成，所述酸包括但不限于盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等。盐更易溶于相应的游离碱形式的水性或其他质子性溶剂。在其他情况中，优选的制剂可以为在pH4.5-5.5下的1mM-50mM组氨酸、0.1%-2%蔗糖、2%-7%甘露醇中的冻干粉，其在使用之前与缓冲液组合。

在已经制备包含配制于可接受的载体中的本发明化合物的药物组合物之后，可以将它们放置在适当的容器中并贴上标签用于治疗所标明的病症。对于本发明的抗体和抗原结合片段的给药，这类标签会包括给药的量、频率和方法。

治疗有效剂量

适用于本发明的药物组合物包括其中包含有效量的活性成分以实现预期目的（即中和含式1结构的FXa抑制剂）的组合物。有效剂量的确定在本领域技术人员的能力之内。

对于任何化合物，治疗有效剂量最初可在体外凝血试验例如PT，或在动物模型（通常为小鼠、兔、狗或猪）中估计。动物模型还可用于获得所需的浓度范围和给药途径。然后这类信息可用于确定在人中给药的可用剂量和途径。

治疗有效剂量是指改善症状或病症的抗体或其抗原结合片段或抗体模拟物的量。这类化合物的治疗效果和毒性可通过在体外或实验动物中的标准药学方法来确定，例如ED₅₀（在群体的50%中治疗有效的剂量）和LD₅₀（对群体的50%致死的剂量）。治疗作用和毒性作用之间的剂量比为治疗指数，其可表示为比值ED₅₀/LD₅₀。表现出大的治疗指数的药物组合物是优选的。获自体外测定和动物研究的数据被用于配制人使用的剂量范围。这类化合物的剂量优选地在循环浓度的范围内，其包括很少或无毒性的ED50。根据所用的剂型、患者的敏感性和给药途径，剂量在该范围内变化。

当需要中和受试者血浆中存在的含式1结构的FXa抑制剂的作用时，可给予本发明的抗体或抗原结合片段或抗体模拟物一次或若干次。优选地，本发明的抗体或抗原结合片段在其以单一剂量给药时是足够的。

确切剂量由个体医师根据待治疗的患者来选择。调整剂量和给药以提供足够水平的活性部分或维持所需的作用。可以考虑的其他因素包括给予所述受试者的含式1结构的FXa抑制剂的种类（indentity）和/或量、抗体或其抗原结合片段的制剂（formulation）和/或给药方式；患者的年龄、重量和性别；饮食、给药时间和频率、药物组合、反应敏感性以及对治疗的耐受/应答。

根据给药途径，正常剂量可以在0.1至100,000毫克的总剂量内变化。具体递送剂量和方法的指导提供在文献中。参见U.S专利No.4,657,760；5,206,344；或5,225,212。对于多核苷酸，本领域的技术人员会使用与蛋白质或它们的抑制剂的制剂不同的制剂。相似地，多核苷酸或多肽的递送会是特定细胞、病症、部位等特异性的。放射性标记的抗体的优选特异性活性可以为0.1至10mCi/mg的蛋白（Riva et al.,Clin.CancerRes.5:3275-3280,1999;Ulaner et al.,2008Radiology246(3):895-902)。

本发明通过以下实施例进一步描述。提供实施例仅为了参考具体实施方案说明本发明。这些例证虽然说明本发明的某些特定方面，但是不意图限制或者限定所公开的本发明的范围。

所有实施例均利用标准技术进行，所述标准技术对于本领域技术人员来说是公知和常规的，除了当另有详细描述时。以下实施例的常规分子生物学技术可以依标准实验室手册进行，例如Sambrook et al.,MolecularCloning:A Laboratory Manual,2nd Ed.;Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989。

实施例

A）实施例

缩写：

aq.       水性溶液

cat.      催化的

d         天

DCI       直接化学电离（MS中的）

DMAP      4-二甲基氨基吡啶

DMF       二甲基甲酰胺

DMSO      二甲基亚砜

EDC       N'-(3-二甲氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺×

          HCl

EI        电子碰撞电离（MS中的）

ESI       电喷射离子化（MS中的）

Et        乙基

GC-MS     气相色谱-联用质谱

h         小时

HATU      O-(7-偶氮苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四

          甲基脲鎓六氟磷酸盐

HOBt      1H-1,2,3-苯并三唑-1-醇水合物

HPLC      高压高效液相色谱

conc.     浓缩的

LC-MS     液相色谱-联用质谱

Meth.     方法

min       分钟

MS        质谱

NMR       核磁共振谱

Rt        保留时间（HPLC中的）

RT        室温

TFA       三氟乙酸

THF       四氢呋喃

LC-MS方法：

方法1A：仪器：Micromass QuattroPremier和Waters UPLCAcquity；柱：Thermo Hypersil GOLD1.9μ50mm×1mm；流动相A：1l水+0.5ml50%强度的甲酸，流动相B：1l乙腈+0.5ml50%强度的甲酸；梯度：0.0分钟90%A—>0.1分钟90%A—>1.5分钟10%A—>2.2分钟10%A；流速：0.33ml/分钟；烘箱（oven）：50℃；UV检测：210nm。

方法2A：仪器：Micromass Quattro Micro MS和HPLC Agilentseries1100；柱：Thermo Hypersil GOLD 3μ20mm×4mm；流动相A：1l水+0.5ml50%强度的甲酸，流动相B：1l乙腈+0.5ml50%强度的甲酸；梯度：0.0分钟100%A—>3.0分钟10%A—>4.0分钟10%A—>4.01分钟100%A（流速2.5ml/分钟）—>5.00分钟100%A；烘箱：50℃；流速：2ml/分钟；UV检测：210nm。

方法3A：仪器：Waters ACQUITY SQD UPLC System；柱：WatersAcquity UPLC HSS T3 1.8μ50mm×1mm；流动相A：1l水+0.25ml99%强度的甲酸，流动相B：1l乙腈+0.25ml99%强度的甲酸；梯度：0.0分钟90%A—>1.2分钟5%A—>2.0分钟5%A；烘箱：50℃；流速：0.40ml/分钟；UV检测：210–400nm。

方法4A：仪器：Waters ZQ和HPLC Agilent Serie1100；UV DAD；柱：Thermo Hypersil GOLD3μ20mm×4mm；流动相A：1l水+0.5ml50%强度的甲酸，流动相B：1l乙腈+0.5ml50%强度的甲酸；梯度：0.0分钟100%A—>3.0分钟10%A—>4.0分钟10%A；烘箱：55℃；流速：2ml/分钟；UV检测：210nm。

对映异构体的制备分离：

方法1B：相：结合甲基丙烯-L-亮氨酸-叔-丁酰胺的球形乙烯基硅胶，670mm×40mm；流动相：乙酸乙酯；流速：80ml/分钟；UV检测：265nm。

方法2B：相：结合甲基丙烯-L-亮氨酸-双环丙基甲酰胺的球形乙烯基硅胶，670mm×40mm；流动相A：乙酸乙酯，流动相B：甲醇；梯度：0.0分钟100%A—>10.1分钟100%A—>13.1分钟100%B—>13.11分钟100%A—>21.0分钟100%A；流速：80ml/分钟；UV检测：265nm。

对映异构体的分析分离

方法1C：相：结合甲基丙烯-L-亮氨酸-双环丙基甲酰胺的球形乙烯基硅胶，250mm×4.6mm；流动相：乙酸乙酯；流速：2ml/分钟，UV检测：265nm。

原材料

实施例1A

N-({(5S)-3-[4-(2-烯丙基-3-氧代吗啉-4-基)苯基]-2-氧代-1,3-噁唑烷-5-基}甲基)-5-氯噻吩-2-甲酰胺[非对映异构体的混合物]

将10.9g（25.0mmol）5-氯-N-({(5S)-2-氧代-3-[4-(3-氧代-4-吗啉基)苯基]-1,3-噁唑烷-5-基}甲基)-2-噻吩甲酰胺（记载于WO01/047919）溶解于250ml THF中，在-78℃下缓慢加入62.5ml（10.5g，62.5mmol）的1N六甲基二硅叠氮化锂（lithium hexamethyldisilazide）-THF-溶液。30分钟后，逐滴加入2.4ml（4.4g，26.2mmol）3-碘代-2-丙烯。允许将所述反应混合物缓慢加热至室温，并在这个室温下搅拌16小时。然后加入饱和的氯化铵水溶液和乙酸乙酯。分离相并用乙酸乙酯萃取水相。将合并的有机萃取物用水洗涤，在硫酸钠上干燥，过滤并在减压下浓缩。将所得残渣溶解在二氯甲烷中，并在硅胶上通过柱色谱进行纯化（流动相：梯度乙酸乙酯/二氯甲烷2:1->乙酸乙酯）。产率：5.8g（理论值49%）。

LC-MS（方法3A）：Rt=0.97分钟；MS（ESIpos）：m/z=476[M+H]+。

实施例1B

N-({(5S)-3-[4-(2-烯丙基-3-氧代吗啉-4-基)苯基]-2-氧代-1,3-噁唑烷-5-基}甲基)-5-氯噻吩-2-甲酰胺[光学纯的非对映异构体2]

依照方法1B分离5.7g（12.0mmol）来自实施例1A的化合物的同分异构体，获得2.5g的实施例1B（第2个洗脱的化合物）。

LC-MS（方法3A）：Rt=0.95分钟；MS（ESIpos）：m/z=476[M+H]+。

HPLC（方法1C）：Rt=4.15分钟

实施例1C

5-氯-N-{[(5S)-3-{4-[2-(3-羟丙基)-3-氧代吗啉-4-基]苯基}-2-氧代-1,3-噁唑烷-5-基]甲基}噻吩-2-甲酰胺[光学纯的非对映异构体]

将2.5g（5.25mmol）来自实施例1B的化合物溶解于35ml THF中，在10至15℃下加入1ml（1.41g,11.6mmol）的0.5摩尔9-硼双环[3.3.1]壬烷的THF-溶液。将所述反应混合物加热至室温并在该温度下搅拌1.5h。在0至5℃下逐滴加入13.1ml（1.05g，26.3mmol）的2N氢氧化钠溶液。然后逐滴加入4.6ml36%的过氧化氢溶液，而水浴（bath）温度不超过30℃。30分钟后，加入乙酸乙酯和水。分离有机相。水相用乙酸乙酯萃取。将合并的有机萃取物用亚硫酸氢钠水溶液洗涤，在硫酸钠上干燥，过滤并在减压下浓缩。将所得残渣在30至35℃下与乙酸乙酯混合，过滤并用乙酸乙酯洗涤。将所得残渣在减压下干燥，使粗产物进一步反应而不进行进一步纯化。

LC-MS（方法3A）：Rt=0.82分钟；MS（ESIpos）：m/z=494[M+H]+。

实施例1D

4-[3-(4-{4-[(5S)-5-({[(5-氯-2-噻吩基)羰基]氨基}甲基)-2-氧代-1,3-噁唑烷-3-基]-苯基}-3-氧代吗啉-2-基)丙氧基]-4-氧代丁酸[光学纯的非对映异构体]

向300mg（0.61mmol）来自实施例1C的化合物,加入182mg（1.82mmol）琥珀酸酐、0.23ml（226mg，2.85mmol）吡啶和223mg（1.82mmol）DMAP并溶解在2ml DMF中。将所述反应混合物在室温下搅拌1小时。将所述反应混合物通过制备型HPLC进行纯化。产率：134mg（理论值37%）。

LC-MS（方法1A）：Rt=0.98分钟；MS（ESIpos）：m/z=594[M+H]+。

实施例1E

叔-丁基-(5-{[6-({5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基]戊酰基}-氨基)己酰基]氨基}苯基)氨基甲酸酯

将溶于30ml DMF中的500mg（1.40mmol）N-(+)-生物素基-6-氨基己酸、283mg（1.40mmol）叔-丁基-(5-氨基戊基)氨基甲酸酯、321mg（2.10mmol）HOBT、0.24ml（181mg，1.40mmol）N,N-二异丙基乙胺和322mg（1.68mmol）的悬液在室温下搅拌16小时。然后，加入另外的291mg（1.44ml）叔-丁基-(5-氨基戊基)氨基甲酸酯并将所述混合物在室温下再搅拌16小时。将所述反应混合物在减压下浓缩，并加入水和乙酸乙酯以及少量的二噁烷。水相用乙酸乙酯萃取数次。将合并的有机萃取物在硫酸钠上干燥，过滤并在减压下浓缩。粗产物通过制备型HPLC进行纯化。产率：100mg（理论值13%）。

LC-MS（方法4A）：Rt=1.71分钟；MS（ESIpos）：m/z=542[M+H]+。

实施例1F

N-(5-氨基戊基)-6-({5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基]-戊酰基}氨基)己酰胺氢氯化物

将100mg（0.19mmol）来自实施例1E的化合物溶解于2ml甲醇中，加入2ml二氯甲烷和2ml（2.0mmol）的溶于乙醚中的1N盐酸溶液。将所述混合物在室温下搅拌16小时，在减压下浓缩和干燥。产率：90mg（理论值98%）。

LC-MS（方法3A）：Rt=0.46分钟；MS（ESIpos）：m/z=442[M+H]+。

实施例1G

N-({(5S)-3-[4-(2-烯丙基-3-氧代吗啉-4-基)-2-氟苯基]-2-氧代-1,3-噁唑烷-5-基}甲基)-5-氯噻吩-2-甲酰胺[非对映异构体的混合物]

将10.0g（22.0mmol）5-氯-N-({(5S)-3-[2-氟-4-(3-氧代吗啉-4-基)苯基]-2氧代-1,3-噁唑烷-5-基}甲基)噻吩-2-甲酰胺（记载于WO2008/155034）溶解于220ml THF，在-78℃下缓慢加入26.4ml（4.42g，26.4mmol）的1N六甲基双硅叠氮化锂-THF-溶液。30分钟后，逐滴加入2.12ml（3.89g，23.1mmol）3-碘代-2-丙烯。允许将所述反应混合物缓慢加热至室温，并在这个室温下搅拌16小时。然后加入饱和的氯化铵水溶液和乙酸乙酯。分离相并用乙酸乙酯萃取水相。将合并的有机萃取物用水洗涤，在硫酸钠上干燥，过滤并在减压下浓缩。产率：3.8g（理论值35%）。

LC-MS（方法3A）：Rt=0.96分钟；MS（ESIpos）：m/z=494[M+H]+。

实施例1H

N-({(5S)-3-[4-(2-烯丙基-3-氧代吗啉-4-基)-2-氟苯基]-2-氧代-1,3-噁唑烷-5-基}甲基)-5-氯噻吩-2-甲酰胺[光学纯的非对映异构体1]

依照方法2B分离2.90g（5.87mmol）来自实施例1G的化合物的同分异构体，获得1.40g的实施例1H（第1个洗脱的化合物）。

LC-MS（方法2A）：Rt=2.02分钟；MS（ESIpos）：m/z=494[M+H]+。

HPLC（方法1C）：Rt=2.54分钟

实施例1I

5-氯-N-{[(5S)-3-{2-氟-4-[2-(3-羟丙基)-3-氧代吗啉-4-基]苯基}-2-氧代-1,3-噁唑烷-5-基]甲基}噻吩-2-甲酰胺[光学纯的非对映异构体]

将1.40g（2.83mmol）来自实施例1H的化合物溶解于15ml THF中，在10至15℃下加入12.5ml（0.76g,6.24mmol）的0.5摩尔9-硼双环[3.3.1]壬烷的THF-溶液。将所述反应混合物加热至室温并在该温度下搅拌1.5h。在0至5℃下逐滴加入7.1ml（0.57g，14.2mmol）的2N氢氧化钠溶液。然后逐滴加入2.5ml35%的过氧化氢溶液，而水浴（bath）温度不超过30℃。30分钟后，加入乙酸乙酯和水。分离有机相。水相用乙酸乙酯萃取。将合并的有机萃取物用亚硫酸氢钠水溶液洗涤，在硫酸钠上干燥，过滤并在减压下浓缩。将所得残渣在30至35℃下与乙酸乙酯混合，过滤并用乙酸乙酯洗涤。将所得残渣在减压下干燥，使粗产物进一步反应而不进行进一步纯化。

LC-MS（方法3A）：Rt=0.83分钟；MS（ESIpos）：m/z=512[M+H]+。

实施例1J

{4-[(5S)-5-({[(5-氯-2-噻吩基)羰基]氨基}甲基)-2-氧代-1,3-噁唑烷-3-基]-3-氟-苯基}-3-氧代吗啉-2-基)丙氧基]-4-氧代丁酸[光学纯的非对映异构体]

向300mg（0.59mmol）来自实施例1I的化合物，加入176mg（1.76mmol）琥珀酸酐、223μl（218mg，1.76mmol）吡啶和215mg（1.76mmol）N,N-4-二甲基氨基吡啶，并溶解在1ml DMF中。将所述反应混合物在室温下搅拌1小时。将所述反应混合物通过制备型HPLC进行纯化。产率：132mg（理论值37%）。

LC-MS（方法1A）：Rt=0.99分钟；MS（ESIpos）：m/z=612[M+H]+。

工作实施例(working examples)

实施例1K

3-(4-{4-[(5S)-5-({[(5-氯-2-噻吩基)羰基]氨基}甲基)-2-氧代-1,3-噁唑烷-3-基]-苯基}-3-氧代吗啉-2-基)丙基-4-氧代-4-[(5-{[6-({5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基]戊酰基}氨基)己酰基]氨基}戊基)氨基]丁酸酯

[光学纯的非对映异构体]

将24mg（0.05mmol）来自实施例1F的化合物和30mg（0.05mmol）来自实施例1D的化合物溶解于1ml DMF中，然后加入26μl（19mg，0.15mmol）N,N-二异丙基乙胺和29mg（0.08mmol）HATU。将所述混合物在室温下搅拌1小时，在减压下浓缩并通过制备型HPLC进行纯化。产率：9mg（理论值18%）。

LC-MS（方法3A）：Rt=0.81分钟；MS（ESIpos）：m/z=1017[M+H]+。

1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ＝9.05-8.90(m，1H)，7.86-7.76(m，1H)，7.72-7.66(m，3H)，7.55(d，2H)，7.37(d，2H)，7.19(d，1H)，6.47-6.28(m，1H)，4.90-4.77(m，1H)，4.36-4.26(m，1H)，4.25-3.99(m，6H)，3.95-3.79(m，3H)，3.65-3.52(m，3H)，3.14-3.05(m，1H)，3.03-2.96(m，6H)，2.82(dd，1H)，2.39-2.28(m，2H)，2.08-1.98(m，3H)，1.94-1.86(m，1H)，1.82-1.55(m，4H)，1.54-1.42(m，5H)，1.41-1.17(m，15H).

实施例1L

3-(4-{4-[(5S)-5-({[(5-氯-2-噻吩基)羰基]氨基}甲基)-2-氧代-1，3-噁唑烷-3-基]-3-氟苯基}-3-氧代吗啉-2-基)丙基-4-氧代-4-[(5-{[6-({5-[(3aS，4S，6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基]戊酰基}氨基)己酰基]氨基}戊基)氨基]丁酸酯[光学纯的非对映异构体]

将24mg（0.05mmol）来自实施例1F的化合物和31mg（0.05mmol）来自实施例1J的化合物溶解于1ml DMF中，然后加入26μl（19mg，0.15mmol）N,N-二异丙基乙胺和29mg（0.08mmol）HATU。将所述混合物在室温下搅拌1小时，在减压下浓缩并通过制备型HPLC进行纯化。产率：40mg（理论值73%）。

LC-MS（方法1A）：Rt=0.98分钟；MS（ESIpos）：m/z=1035[M+H]+。

1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ＝9.00-8.96(m，1H)，7.81(t，1H)，7.75-7.63(m，3H)，7.58-7.40(m，2H)，7.28(dd，1H)，7.21(d，1H)，6.46-6.31(m，2H)，4.93-4.82(m，1H)，4.36-4.27(m，1H)，4.27-4.18(m，1H)，4.15-4.05(m，3H)，4.05-3.99(m，2H)，3.95-3.84(m，2H)，3.81(dd，1H)，3.68-3.55(m，4H)，3.15-3.05(m，1H)，3.02-2.99(m，6H)，2.82(dd，1H)，2.38-2.26(m，2H)，2.10-1.98(m，4H)，1.96-1.55(m，4H)，1.49-1.42(m，4H)，1.41-1.30(m，6H)，1.26-1.12(m，4H).

结构和名称

利伐沙班

5-氯-N-({(5S)-2-氧代-3-[4-(3-氧代-4-吗啉基)苯基]-1，3-噁唑烷-5-基}-甲基)-2-噻吩甲酰胺

记载于WO01/047919(实施例44)

SATI

5-氯-N-{[(5S)-3-{4-[3-{2-[(反式-4-羟基环己基)氨基]乙基}-2-氧代嘧啶-1(2H)-基]-3，5-二甲基苯基}-2-氧代-1，3-噁唑烷-5-基]甲基}-噻吩-2-甲酰胺

记载于WO2008/155032(实施例38)中的SATI

实施例2：从n-CoDeR文库生成抗体

噬菌体筛选：

针对含一组式1的FXa抑制剂的人抗体或其抗原结合片段的分离是利用BioInvent International AB的天然Fab抗体文库n-CoDeR通过噬菌体展示技术来进行（Lund,Sweden;described in

et al.,Nat.Biotech.2000,18:853-856），所述Fab抗体文库为其中六个CDR全部被多样化的Fab文库。

本实施例中使用的标准缓冲液为：

1×PBS:       来自Sigma（D5652-50l）

PBST:         补充有0.05%Tween20（Sigma,P7949）

              的1×PBS

PBST-MP3%:    补充有3%milkpowder（Cell Signaling，

              9999）的PBST

简言之，通过在端至端旋转器上连续的进行预赋育来耗尽（depleted）Fab抗体文库的等分试样中不需要的结合物（binder），所述预孵育首先用链亲和素包被的Dynabeads M280（Invitrogen,11206D）孵育60分钟，然后用浓度为500nM的FITC-生物素（Sigma,B8889）孵育10分钟。随后，在1.5小时的孵育步骤期间，将150μl新鲜的链亲和素包被的微珠在筛选缓冲液PBST中预偶联至500nM实施例1K化合物或500nM实施例1L化合物，接着用PBST对所述微珠进行大量洗涤。然后，通过将经包被的微珠在端至端旋转器上在封闭缓冲液中孵育30分钟来封闭。将经包被和封闭的微珠用封闭缓冲液大量洗涤，然后与经封闭的且耗尽的Fab文库等分试样混合。在端至端旋转器上进行60分钟的孵育之后，将所述样品用封闭缓冲液洗涤3次，接着用PBST洗涤3次，在PBS中进行3个最后洗涤步骤。结合的噬菌体通过加入400μl胰蛋白酶溶液（在PBS中1mg/ml；Sigma，T1426）来洗脱。在室温下进行30分钟孵育之后，加入40μl抑肽酶（在PBS中2mg/ml；Sigma,A1153）以中止胰蛋白酶消化。

使洗脱的噬菌体增殖，按照前人所述（Cicortas Gunnarsson et al.,Protein Eng Des Sel2004;17(3):213-21）测定噬菌体滴度。简言之，保存所述洗脱溶液的等分试样用于滴定实验，同时将剩余的部分用于转化呈指数生长的大肠杆菌（E.coli）HB101′（来自Bioinvent）以制备在分别使用100nM和20nM靶分子的第二轮和第三轮筛选中使用的新噬菌体原料。对于每轮筛选，将输入和输出噬菌体在呈指数生长的大肠杆菌HB101′上进行滴定，并从第2轮和第3轮挑选克隆用于噬菌体ELISA中的分析。

酶联免疫吸附测定（ELISA）：

噬菌体ELISA:

使用噬菌体ELISA分析从不同轮筛选中选择的噬菌体的特异性。简言之，噬菌体表达是通过向100μl新鲜培养基(补充有100μg/ml氨苄青霉素、15μg/ml四环素和0.1%葡萄糖（Sigma，G8769）的LB培养基）加入10μl过夜培养物（在补充有100μg/ml氨苄青霉素（Sigma，A5354）和15μg/ml四环素（Sigma,T3383）的LB培养基中），并且在37℃下在96孔MTP中以250rpm振荡直到OD600达到0.5。随后，加入辅助噬菌体M13KO7（Invitrogen，420311），并将样品在37℃下再孵育15分钟，不进行振荡。加入IPTG(终浓度为0.25mM），将细胞在30℃下过夜孵育，同时以200rpm振荡。

将用链亲和素（Pierce，15500）预包被的96-孔ELISA-板在4℃下分别用1μg/ml来自实施例1K和1L的化合物包被过夜。第二天，将板用PBST洗涤3次，用封闭试剂处理并用PBST再洗涤3次。这样做之后，每孔转入来自噬菌体表达的50μl等分试样，并在室温下孵育1小时。用PBST洗涤3次之后，加入偶联HRP的抗M13的抗体（GE Healthcare,27-9421-01；在PBST中1:2500稀释）并在室温下孵育1小时。显色反应是通过加入50μl TMB（Invitrogen，2023）发生，并在5-15分钟之后通过加入50μl H₂SO₄（Merck,1120801000）中止。在酶标仪（Tecan）中，在450nM下记录比色反应。

通过ELISA筛选sFab：

为了生成可溶性的Fab片段（sFab），从第2轮和第3轮筛选中分离噬粒DNA，并依照供应商说明书用限制性内切酶EagI（Fermentas，FD0334）和EcoRI（NEB，R0101L）消化以除去基因III序列。将所得的片段重新连接，并使用标准方法将构建体转化至化学感受态大肠杆菌Top10中。挑选单个克隆，将其转移至含LB培养基（100μg/ml，0.1%葡萄糖）的96孔板中并在37℃下以250rpm振荡直到OD600达到0.5。这样做之后，通过加入IPTG（终浓度0.5mM）诱导sFab产生，在37℃下继续孵育过夜同时以200rpm振荡。第二天早上，向每孔加入BEL-缓冲液（24.7g/l硼酸；18.7g/l NaCl；1.49g/l EDTA pH8.0；2.5mg/ml溶菌酶（Roche）），并且除了使用偶联HRP的抗-hIgG（Fab-特异性）（Sigma；A0293）进行检测以外，基本上按照对噬菌体的描述在ELISA中分析50μl经处理的培养物中sFab与靶的结合。

实施例3：可溶性Fab筛选活性化合物（hit）的小规模生产

小规模地生产了独特的筛选活性化合物（hit）用于在表面等离子共振中的初步表征和在生物化学FXa活性测定中对利伐沙班的功能性中和。用各个大肠杆菌Top10克隆的预培养物接种50至10ml LB培养基（补充有0.1mg/ml氨苄青霉素和0.1%葡萄糖），所述克隆含有克隆至初始pBIF载体中的独特Fab序列却没有基因III序列。通过加入0.5mMIPTG（终浓度）诱导sFab的产生，并在30℃和250rpm振荡下，继续孵育过夜。

随后，通过离心收获细胞，并通过在4℃下在裂解缓冲液中孵育1小时进行温和裂解，所述裂解缓冲液含有20%蔗糖（w/v）、30mM TRIS、1mM EDTA、pH8.0、1mg/ml溶菌酶（Sigma L-6876）和2.5U/ml全能核酸酶（Benzonase，Sigma E1014）。然后将澄清的上清液用于捕获选择λ亲和基质（BAC0849.010）。用PBS洗涤所述基质之后，将结合的sFab用100mM甘氨酸/HCl（pH3）洗脱，并立即用1M HEPES缓冲液中和。随后，将样品用PBS透析，依照制造商说明书在His-Multi-Trap板（GE）上进行第二纯化步骤。将洗脱的sFab用PBS透析，并通过SDS-PAGE分析其蛋白质含量和纯度。

实施例4：生物化学Xa因子活性测定中利伐沙班的功能性中和

Xa因子活性被利伐沙班抑制至20-30%的残余FXa活性，分析了测试化合物（例如Fab片段）对该抑制的中和作用：

在测定缓冲液（50mM HEPES pH7.8、250mM NaCl、6mM CaCl₂,、0.01%Brij35、1mM谷胱甘肽、4mM EDTA、0.05%牛血清白蛋白）进行测试化合物的连续稀释（5μM至0.0007μM的典型浓度）。

将20μL所述稀释的测试化合物置于384孔微量滴定板（Greiner,Frickenhausen,Germany）中，然后加入10μL在测定缓冲液中稀释度为1:400的（250μM）FXa底物Pefafluor Xa（在DMSO中100mM,Loxo,Dossenheim,Germany）。所述酶促反应是通过加入20μL在含Xa因子抑制剂利伐沙班的测定缓冲液中的Xa因子（HTI,Essex Junction,VTUSA）稀释液启动。同时，启动无利伐沙班的对照反应。

在32℃下进行孵育的过程中，使用荧光微量滴定板酶标仪（reader）（例如Tecan Ultra Evolution,Tecan Group Ltd.,Switzerland;激发360nm，发射465nm）监测反应进程曲线。

选择FXa稀释度使得在对照反应中反应动力学是线性的，并且低于50%的底物被消耗（所述测定中的典型FXa终浓度：0.05nM）。选择利伐沙班的浓度使得与对照反应相比FXa活性被抑制70-80%（所述测定中典型的利伐沙班终浓度：0.6nM）。结果示于图1中。

EC₅₀值是通过绘制出所述测试化合物浓度与50分钟孵育时间之后Xa因子活性的百分比的曲线来确定。EC₅₀值被定义为逆转利伐沙班诱导的FXa抑制的50%的测试化合物的浓度。

实施例5：通过表面等离子共振（Biacore）确定亲和力

Fab片段的结合亲和力是通过在Biacore T100仪（GE HealthcareBiacore,Inc.）上进行的表面等离子共振分析来确定。将Fab片段在10mM乙酸钠中稀释至终浓度为10μg/ml，pH4.5，并通过胺偶合化学以3000-5000RU的水平固定化在CM5芯片（GE Healthcare Biacore,Inc.）上，分别用于流动池（flow cell）2、3和4。流动池1用作参比。将溶于HEPES-EP缓冲液（GE Healthcare Biacore,Inc.）中各种浓度的分析物、利伐沙班、来自实施例1G的化合物、SATI（记载于WO2008/155032（实施例38））、阿哌沙班（记载于WO2003/026652（实施例18））、依杜沙班（记载于WO2003/000680（实施例192）、US20050020645（实施例192））、雷扎沙班（记载于WO1998/057951（实施例34））（200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.12nM和1.56nM）分别以60μl/分钟的流速注射在固定化的Fab片段上3分钟，并允许进行10分钟解离。传感图是在在线（in-line）参比细胞校正以及随后的缓冲液样品差减之后生成。解离平衡常数（K_D）是基于缔合和解离速率常数的比例而计算，所述缔合和解离平衡常数是通过使用BiaEvaluation软件用一级1：1结合模型拟合传感图来获得。数据总结在表6和7中。

表6：

来自淘选/筛选的一些初始Fab-活性化合物(hit)和优化的变体M18-G08-G-DKTHT的表征：来自SPR-分析(Biacore)的固定化的Fab对利伐沙班的亲和力数据的总结，和在利伐沙班(0.6nM)的存在下生物化学FXa测定(0.05nM FXa)中Fab的半数最大有效浓度(以μM表示的EC₅₀)的总结。

Fab	KD(nM)	EC50(μM)
			M16-D05	＜500	＜1
M14-G07	＜50	＜0.5
			M15-B07	＜500	＜1
M25-E05	＜500	＜1
			M18-A10	＜500	＜1
M16-A03	＜500	＜2
			M18-G08	＜50	＜0.5
M18-G08-G-DKTHT	＜10	＜0.01

表7：

对所选择的用于结合至各种FXa抑制剂的Fab的表征：来自SPR分析(Biacore)的固定化的Fab对利伐沙班的亲和力数据(以nM表示的K_D)的总结。

n.b.：未结合

n.t.：未测试

实施例6：通过等温滴定量热法（ITC）确定亲和力

为了确定热力学参数，应用了具有对照和分析软件的VP-ITC等温滴定量热仪（Microcal/GE Healthcare,Freiburg,Germany）。本文中，温滴定量热法用于确定溶液中结合至利伐沙班的测试化合物（例如Fab片段）的缔合常数的阶数（order）。

将溶于DMSO中的10mM利伐沙班（Bayer Healthcare,Wuppertal,Germany）溶液以1：2000稀释在PBS缓冲液（pH7.4,Sigma,Taufkirchen,Germany）中。将所述溶液除气，并装填入样品池（1.4mL）。参比池用水装满。制备50μM溶于PBS缓冲液中的所述测试化合物的溶液。将所述测试化合物溶液中DMSO的浓度调整至所述样品池中的DMSO浓度。除气后，将所述测试化合物溶液抽入至所述仪器的注射器中。

在恒温（25℃）和提供连续混合的情况下，利用所述仪器的控制软件将所述测试化合物溶液注射至所述样品池中（参考功率：5μcal/s，12次注射（每次10μl），每次注射的持续时间为20s，每次注射之间的等待时间为300s）。随时间监测所述结合反应期间释放的热量，并使用分析软件分析数据。对于M18-G08-G-DKTHT，从滴定曲线估计出对利伐沙班的<1nM的K_D。

实施例7：测定Dulbecos PBS中Fab M18-G08-G-DKTHT对利伐沙班的K_D值

在M18-G08-G-DKTHT的存在下，利伐沙班的未结合浓度的测定允许测定溶液中Fab对利伐沙班的K_D值。所述K_D值是使用Rosenthal-Scatchard图计算（图2）。

在Dulbeccos PBS（DPBS）缓冲液中将浓度为0.214μM至0.583μM的利伐沙班与0.5μM Fab M18-G08-G-DKTHT在室温下孵育20分钟。然后将所述溶液加入至含有排阻尺寸（exclusion size）为30000Da的膜的超滤设备。将样品以100g离心3分钟。向50μL的超滤液和初始溶液掺入含有内标的150μL乙酸铵/乙腈（1/1v/v）溶液（pH3.0）。样品是使用API4000（AB Sciex）通过LC-MS/MS进行分析。fu（=未结合的分数）值依照关系fu（%）=滤液浓度/（初始溶液溶度*100）来计算，并依照前人描述（Schuhmacher J.et al.,J Pharm Sci.2004;93(4):816-30）针对与所述超滤设备的非特异性结合进行修正。从Rosenthal Scatchard图（Fig.2）的斜率计算出约0.5nM的K_D值。

实施例8：凝血酶生成测定中由Fab解毒剂引起的对利伐沙班或SATI作用的逆转:

依照Hemker进行的凝血酶生成测定允许研究化合物对凝血级联的动力学的作用。向人贫血小板血浆中加入组织因子和Ca²⁺以启动外源通路（extrinsic pathway），所生成的凝血酶的活性用特异性的荧光标记的底物（Bachem,I-1140（Z-Gly-Gly-Arg-AMC））确定。所述反应在37℃下在20mM Hepes、60mg/ml BSA、102mM CaCl₂（pH7.5）中进行。用于启动反应的试剂和凝血酶校正器均可商购自Thrombinoscope。测量是在配置有90/460nm滤色片组和分配器（dispenser）的Thermo ElectronFluorometer（Fluoroskan Ascent）中进行。所有的实验步骤均是依照制造商的说明书（Thrombinoscope）进行。当存在抑制剂（利伐沙班或SATI，0.1μM）和解毒剂时，在引发凝血酶生成以前，将它们与血浆在37℃下孵育5分钟。M18-G08-G-DKTHT浓度依赖性地中和利伐沙班和SATI的作用，分别如图3和4所示。图5证明了Fab M18-G08-G-DKTHT的不断增加的浓度本身不会改变凝血酶生成曲线（thrombogram），说明所示Fab对凝血没有固有影响。

实施例9：FXa活性测定中对血浆中的利伐沙班作用的逆转：

为了研究利伐沙班对血浆中FXa活性的抑制，和对其抑制作用的逆转，将含柠檬酸盐的人血浆（Octapharm）用在Hirudin中稀释的利伐沙班孵育，并在37℃下孵育3分钟。然后加入Fab，在37℃下孵育5分钟之后，通过加入溶于含0.1mM钙的缓冲液中的Russel's Viper Venom（RVV-X,Pentapharm,终浓度5mU/ml）启动FX活化。通过测量对特异性的荧光标记底物（Bachem,I-1100，浓度50μM）的切割来确定FXa活性，并使用SpectraFlourplus Reader（Tecan）在360/465nm下连续监测荧光。

在图6中，示出了利伐沙班对血浆中FXa活性的作用和FabM018-G08-G-DKTHT的不断增加的浓度对所述抑制作用的逆转。

实施例10：在体外利伐沙班对凝血酶原时间（PT）的作用的逆转

含柠檬酸盐的血液（0.11M柠檬酸钠/血液，1:9v/v）是通过静脉穿刺获自人供体或通过主动脉插管获自麻醉的Wistar大鼠（CharlesRiver），将所述含柠檬酸盐的血液以4000g离心15分钟以分离贫血小板血浆。将血浆样品与利伐沙班（浓度如图7和图8所示，溶解于DMSO，DMSO终浓度1%）混合并在室温下孵育10分钟。向所述血浆-利伐沙班混合物加入解毒剂并在室温下再孵育10分钟。依照制造商的说明书在AMAX200自动血凝计（Trinity Biotech）上用Recombiplastin（Instrumentation Laboratory）作为组织因子来源进行PT测定。最终测定体积的组成为1/3血浆和2/3PT试剂。针对由各个利伐沙班浓度引起的PT延长的半数最大中和所需的解毒剂浓度，计算了IC50。数据以5个试验的平均数±sem给出并代表最终测定浓度（表8以及图7和8）。

表8：在体外M18-G08-G-DKTHT对凝血酶原时间（PT）的作用

实施例11.抗体变体的克隆、表达和表达水平的量化

将两种结合利伐沙班的Fab M14-G07和M18-G08的重链和轻链亚克隆至pET28a细菌表达载体（Novagen/Merck Chemicals Ltd.,Nottingham,UK）中并转化至Top10F’细胞（Invitrogen GmbH,Karlsruhe,Germany）中，所述Fab M14-G07和M18-G08均在重链的C-末端携带c-myc-标签和六-组氨酸标签。突变是通过标准的基于寡核苷酸（oligo-based）的定点突变引入并通过DNA测序确认。

为了Fab抗体表达，将变体质粒转化至T7Express lysY/Iq大肠杆菌菌株（New England Biolabs,C3013）中，接种至含30μg/ml卡那霉素的LB培养基中的过夜培养物中，并在37℃下孵育18小时。表达培养物是通过将5%的过夜培养物转移至新鲜的含30μg/ml卡那霉素的LB培养基中来产生。6小时之后，加入1mM异丙基-b-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（Roth,2316.5）以诱导Fab表达，并将所述培养物在30℃下再孵育18小时。

为了量化表达水平，使用了ELISA方法。简言之，在4℃下将MTP平板（Nunc Maxisorp black,460518）用在包被缓冲液(Candor BioscienceGmbH,121500)中稀释的Fab特异性抗体（Sigma,I5260）孵育过夜，用PBST（磷酸盐缓冲盐水：137mM NaCl Merck1.06404.5000；2.7mM KClMerck1.04936.1000；10mM Na₂HPO₄Merck1.06586.2500、1.8mMKH₂PO₄Merck1.04871.5000；含0.05%Tween20Acros Organics，233360010）洗涤3次，用100%Smart Block（Candor Bioscience GmbH,113500）在4℃下封闭1小时，再次洗涤。将培养物稀释在溶于PBST中的10%Smart Block中，并在室温下与MTP平板结合1小时。用PBST洗涤之后，将捕获的Fab用偶联HRP（辣根过氧化物酶）的抗-myc的抗体（Bethyl Laboratories Inc.,A190-105P）孵育，洗涤并在黑暗中和在室温下用10μM Amplex Red底物（Invitrogen,A12222）孵育10至30分钟，然后进行荧光测量。依照通过纯化的Fab对照的系列稀释确定的动态范围，过滤测量的量化信号。

实施例12.使用基于ELISA的测定确定抗体变体的活性。

为了测定所述突变的抗体变体对来自实施例1K的化合物的活性，使用了平衡或解离受限的ELISA测定方法。简言之，将MTP平板（NuncMaxisorp black,460518）用4μg/ml在包被缓冲液（Candor BioscienceGmbH,121500）中稀释的链亲和素（Calbiochem,189730）包被，并在4摄氏度下过夜孵育。用PBST洗涤之后，将平板用溶于PBST中的100%Smart Block（Candor Bioscience GmbH,113500）在4℃下封闭1小时，重复洗涤步骤。将平板用不同浓度（0.3-200nM）的来自实施例1K的化合物在37℃下孵育1小时，用PBST洗涤，并且通过加入25μl的粗细菌培养物将抗体片段在室温下固定化1小时。用PBST洗涤之后，进行竞争步骤或立即检测。为了竞争，加入在溶于PBST中的10%Smart Block中稀释的300nM利伐沙班，并在室温下孵育1.5-3小时。为了检测残余的结合Fab，在室温下加入了在溶于PBST中的10%Smart Block中稀释的偶联HRP的抗λ的抗体（Sigma,A5175），持续1小时。洗涤之后，加入10μM Amplex Red（Invitrogen,A12222）并在室温下孵育10至30分钟，然后测量荧光信号。

实施例13.对FXa去抑制测定（FXa DIA）中变体性能的分析

为了确定野生型（wt）和突变的Fab变体对未修饰的利伐沙班的活性，进行了FXa活性的去抑制测定。简言之，在室温下将10μl粗细菌培养物在黑色低容量平板（Greiner,784076）中用1μl200nM利伐沙班和2μl FXa底物（Fluophen,Hyphen BioMed,329011）孵育1小时。然后，加入7μl在测定缓冲液（20mM Tris,Merck1.08382.2500；100mM NaCl,Merck1.06404.5000；2.5mM CaCl₂*2H₂O,Merck1.02382.1000；0.1%牛血清白蛋白,Sigma A4503；0.1%PEG8000，Sigma P2139）中稀释的28nM FXa（Haematologic Technologies Inc.,HCXA-0060），通过使用酶标仪（例如Tecan Infinite F500）测量440nm下的荧光信号来随时间记录酶活力。所述荧光信号被随着时间整合，并比较变体与野生型的比例。

实施例14.单个和多个氨基酸取代

表9提供了引入M14-G07（wt）重链和/或轻链的单个和/或两个氨基酸取代的若干实例。在没有竞争步骤的ELISA和FXa去抑制测定（FXaDIA）中以四次重复实验（in quadruples）分析所述变体的性能。在ELISA中，计算平均数并将其标准化（normalize）至各个平均表达水平。变体的总体性能是通过比较2-3次独立实验的变体与wt的比例来评估。平均比例大于wt+2×SD（所述比例的标准差）的变体被认为其结合亲和力是提高的，并用“++”标记，而比例低于wt-2×SD的变体被认为其结合亲和力是降低的，并用“-”标记。性能在两个阈值之间的所有变体用“+/-“标记。平均荧光计数低于阴性对照（非表达细胞）+3×SD的变体被认为是非结合的，用“--”标记，没有一个变体符合这个标准。在Fxa去抑制测定中，计算平均数，变体的总体性能是通过比较2-3次独立实验的变体与wt的比例来评估。平均比例大于wt+2×SD的变体被认为其结合亲和力是提高的，并用“++”标记，而比例低于wt-2×SD的变体被认为其结合亲和力是降低的或非结合的，用“--”标记。性能在两个阈值之间的所有变体用“+/-“标记。没有分析的变体用“nd”（未确定）标记。CDR依照Kabat限定。

表9：M14-G07内单个和两个氨基酸取代的分析

可变结构域位置	M14-G07突变	ELISA	FXa DIA
				FR1	HC_T28K	+/-	+/-
FR1	HC_T28R	+/-	+/-
				FR1	HC_G30S	+/-	Nd
CDR H1	HC_D31A	+/-	+/-
				CDR H1	HC_D31R	+/-	+/-
CDR H1	HC_D31S	+/-	Nd
				CDR H1	HC_A33G	+/-	+/-
CDR H1	HC_S35A	++	+/-
				CDR H1	HC_S35G	+/-	+/-
FR2	HC_S49G	+/-	+/-
				CDR H2	HC_G50A	-	Nd
CDR H2	HC_G53R	++	+/-
				CDR H2	HC_S57I	+/-	+/-
CDR H2	HC_S57K	+/-	+/-
				CDR H2	HC_S57M	+/-	+/-
CDR H2	HC_S57R	+/-	+/-
				CDR H2	HC_T58R	+/-	+/-
FR3	HC_A97Q	-	--
				FR3	HC_R98K	-	Nd
CDR H3	HC_E99Q	+/-	+/-

可变结构域位置	M14-G07突变	ELISA	FXa DIA
				CDR H3	HC_G100A	+/-	+/-
CDR H3	HC_G100S	+/-	++
				CDR H3	HC_G100V	-	+/-
CDR H3	HC_E101G	-	+/-
				CDR H3	HC_E101R	+/-	+/-
CDR H3	HC_E101S	+/-	+/-
				CDR H3	HC_T102D	+/-	+/-
CDR H3	HC_T102F	+/-	+/-
				CDR H3	HC_T102L	+/-	+/-
CDR H3	HC_T102R	+/-	+/-
				CDR H3	HC_G105Y	+/-	Nd
CDR H3	HC_L106F	-	Nd
				CDR H3	HC_V108A	+/-	+/-
CDR H3	HC_V108C	+/-	+/-
				CDR H3	HC_V108W	-	+/-
CDR H3	HC_V108Y	+/-	Nd
				FR4	HC_T118S	+/-	Nd
FR1	LC_Q1E	-	Nd
				CDR L1	LC_S23K	+/-	++
CDR L1	LC_S23T	+/-	+/-
				CDR L1	LC_S25N	+/-	+/-
CDR L1	LC_S25V	+/-	+/-
				CDR L1	LC_S26A	+/-	+/-
CDR L1	LC_S27A	+/-	+/-
				CDR L1	LC_S27R	+/-	+/-
CDR L1	LC_N28S	+/-	++
				CDR L1	LC_S31A	+/-	++
CDR L1	LC_N32F	+/-	+/-
				CDR L1	LC_N32G	+/-	+/-
CDR L1	LC_N32Y	++	++
				CDR L1	LC_Y33L	+/-	+/-
CDR L1	LC_V34G	-	+/-
				CDR L1	LC_V34S	+/-	+/-

可变结构域位置	M14-G07突变	ELISA	FXa DIA
				FR2	LC_L48V	+/-	+/-
FR2	LC_Y50V	+/-	+/-
				CDR L2	LC_D51R	-	Nd
CDR L2	LC_N53A	-	+/-
				CDR L2	LC_N53P	+/-	++
CDR L2	LC_N53R	++	+/-
				CDR L2	LC_N53S	+/-	++
CDR L2	LC_N53V	+/-	+/-
				CDR L2	LC_D54Q	+/-	Nd
CDR L2	LC_R55L	+/-	+/-
				CDR L2	LC_P56S	+/-	+/-
CDR L2	LC_S57W	++	+/-
				FR3	LC_G58E	++	+/-
CDR L3	LC_V90A	-	Nd
				CDR L3	LC_V90N	+/-	+/-
CDR L3	LC_D93E	+/-	++
				CDR L3	LC_D94C	++	+/-
CDR L3	LC_D94V	+/-	+/-
				CDR L3	LC_D94W	++	+/-
CDR L3	LC_S95V	+/-	+/-
				CDR L3	LC_L96G	+/-	+/-
CDR L3	LC_L96W	++	+/-
				CDR L3	LC_L96Y	+/-	+/-
CDR L3	LC_N97S	+/-	Nd
				CDR L3	LC_G98L	-	+/-
CDR L3	LC_G98T	-	Nd
				CDR L3	LC_H99K	-	+/-
CDR L3	LC H99P	-	Nd
				CDR L3	LC_H99T	+/-	+/-
CDR L3	LC_W100V	-	Nd
				CDR L3	LC_V101F	+/-	+/-
CDR L3	LC_V101P	+/-	+/-
				CDR L3	LC_V101W	+/-	++

可变结构域位置	M14-G07突变	ELISA	FXa DIA
				HC_FR1_LC_CDR L1	HC_A23T_LC_N32W	+/-	+/-
HC_FR3_HC_CDR H3	HC_A92S_HC_T102C	-	+/-
				HC_FR1_LC_CDR L3	HC_G10S_LC_G98A	-	+/-
HC_FR1_LC_CDR L2	HC_L11M_LC_S57Y	+/-	++
				HC_FR1_LC_CDR L1	HC_L5M_LC_S26L	-	+/-
HC_CDR H2_HC_CDR H2	HC_S57T_HC_T58V	+/-	+/-
				LC_CDR L1_LC_CDR L1	LC_S25G_LC_N32Y	++	+/-

表10中提供的是M14-G07抗体内组合的氨基酸取代的实例。虽然不是每一组合都提供在表10中，但是考虑到了所述抗利伐沙班的抗体可包含提供的修饰的任一组合。在没有竞争步骤的ELISA中，以四次重复实验分析所述变体的性能。计算平均数，如果用于包被的来自实施例1K的化合物的浓度低于10nm，那么减去链亲和素包被(无来自实施例1K的化合物)的平板上确定的平均背景信号，将信号标准化至各个平均表达水平。变体的整体性能是通过使用与wt相比2倍提高的参考变体比较2-3次独立实验的变体/参考比例来评估。平均比例大于参考+2×SD的变体用“+++”标记，而比例低于参考-2×SD的变体用“+/-“标记。性能在两个阈值之间的所有变体用“++”标记。比例低于0.5的变体用“-”标记，没有一个变体符合这个标准。CDR依照Kabat限定。

表10：M14-G07内多个氨基酸取代的实例

*为参考

表11提供的是引入M18-G08（wt）的重链和/或轻链中的单个和/或两个氨基酸取代的若干实例。在有竞争步骤的ELISA和FXa去抑制测定（FXa DIA）中以四次重复实验分析所述变体的性能。在ELISA中，计算平均数，变体的总体性能是通过比较1-3次独立实验的变体与wt的比例来评估。平均比例大于wt+2×SD（所述比例的标准差）的变体被认为其结合亲和力是提高的，并用“++”标记，而比例低于wt-2×SD的变体被认为其结合亲和力是降低的，并用“-”标记。性能在两个阈值之间的所有变体用“+/-“标记。平均荧光计数低于阴性对照（非表达细胞）+3×SD的变体被认为是非结合的，用“--”标记。在FXa去抑制测定中，计算平均数，变体的总体性能是通过比较2-3次独立实验的变体/wt比例来评估。平均比例大于wt+2×SD的变体被认为其结合亲和力是提高的，并用“++”标记，而比例低于wt-2×SD的变体被认为其结合亲和力是降低的或非结合的，用“--”标记。性能在两个阈值之间的所有变体用“+/-“标记。没有分析的变体用“nd”（未确定）标记。CDR依照Kabat限定。

表11：M18-G08内单个和两个氨基酸取代的分析

可变结构域位置	M18-G08突变	ELISA	FXa-DIA
				FR1	HC_G9S	++	++
FR1	HC_G26A	+/-	+/-
				FR1	HC_T28D	+/-	+/-
FR1	HC_S30E	+/-	+/-
				FR1	HC_S30G	+/-	+/-
FR1	HC_S30N	+/-	+/-
				FR1	HC_S30P	+/-	+/-
CDR H1	HC_N31D	+/-	+/-
				CDR H1	HC_N31H	+/-	+/-
CDR H1	HC_N31S	+/-	nd
				CDR H1	HC_A32E	+/-	+/-
CDR H1	HC_A32F	+/-	+/-
				CDR H1	HC_A32H	+/-	++
CDR H1	HC_A32S	+/-	+/-
				CDR H1	HC_A32Y	++	++
CDR H1	HC_M34I	-	Nd
				CDR H1	HC_S35A	+/-	+/-
CDR H1	HC_S35N	-	Nd
				FR2	HC_S49A	+/-	+/-
FR2	HC_S49G	+/-	+/-
				CDR H2	HC_I51V	+/-	+/-
CDR H2	HC_S52D	+/-	+/-
				CDR H2	HC_S52G	+/-	+/-
CDR H2	HC_S53I	+/-	+/-
				CDR H2	HC_S53T	+/-	+/-

可变结构域位置	M18-G08突变	E LISA	FXa-DIA
				CDR H2	HC_S54D	+/-	+/-
CDR H2	HC_S54E	++	+/-
				CDR H2	HC_S55D	+/-	+/-
CDR H2	HC_G56S	+/-	Nd
				CDR H2	HC_I58A	+/-	+/-
CDR H2	HC_I58R	+/-	++
				CDR H2	HC_I58S	+/-	+/-
CDR H2	HC_I58T	+/-	+/-
				CDR H2	HC_Y59F	+/-	+/-
CDR H2	HC_L64V	+/-	Nd
				FR3	HC_A97M	-	+/-
FR3	HC_R98M	+/-	+/-
				FR3	HC_R98S	-	++
FR3	HC_R98V	+/-	+/-
				CDR H3	HC_W100E	+/-	+/-
CDR H3	HC_W100M	+/-	+/-
				CDR H3	HC_R101E	+/-	+/-
CDR H3	HC_N102D	-	Nd
				CDR H3	HC_H103A	++	++
CDR H3	HC_H103C	+/-	+/-
				CDR H3	HC_H103N	+/-	++
CDR H3	HC_H103S	++	++
				CDR H3	HC_H103T	++	+/-
CDR H3	HC_H103Y	+/-	+/-
				CDR H3	HC_L104F	-	Nd
CDR H3	HC_D105K	+/-	+/-
				CDR H3	HC_D105S	+/-	+/-
CDR H3	HC_Y106D	+/-	+/-
				CDR H3	HC_Y106V	+/-	++
FR4	HC_W107I	+/-	+/-
				FR4	HC_W107V	+/-	+/-
FR4	HC_T116S	+/-	Nd
				FR1	LC_Q1E	+/-	Nd

可变结构域位置	M18-G08突变	ELISA	FXa-DIA
				FR1	LC_Q6H	+/-	+/-
CDR L1	LC_S23C	-	+/-
				CDR L1	LC_G24L	-	+/-
CDR L1	LC_S25G	+/-	+/-
				CDR L1	LC_S26G	+/-	+/-
CDR L1	LC_S26K	+/-	+/-
				CDR L1	LC_S26R	+/-	+/-
CDR L1	LC_S26V	-	+/-
				CDR L1	LC_D28N	+/-	Nd
CDR L1	LC_S31W	+/-	+/-
				CDR L1	LC_T33F	+/-	+/-
CDR L1	LC_T33K	++	++
				FR2	LC_Q38K	+/-	+/-
FR2	LC_L47I	+/-	+/-
				FR2	LC_L47K	+/-	++
FR2	LC_L47S	+/-	+/-
				FR2	LC_L47V	+/-	+/-
FR2	LC_I49G	+/-	+/-
				FR2	LC_I49L	+/-	+/-
FR2	LC_Y50W	+/-	+/-
				CDR L2	LC_D51S	+/-	++
CDR L2	LC_Q54V	+/-	+/-
				CDR L2	LC_R55A	+/-	+/-
CDR L2	LC_R55G	+/-	++
				CDR L2	LC_P56K	+/-	+/-
CDR L2	LC_P56R	+/-	+/-
				CDR L2	LC_S57R	+/-	+/-
FR3	LC_V59F	+/-	+/-
				FR3	LC_S77T	+/-	Nd
FR3	LC_R80Q	+/-	Nd
				FR3	LC_S81A	+/-	Nd
CDR L3	LC_Q90E	-	+/-
				CDR L3	LC_Q90V	-	+/-

可变结构域位置	M18-G08突变	ELISA	FXa-DIA
				CDR L3	LC_Q90W	-	+/-
CDR L3	LC_S91N	-	+/-
				CDR L3	LC_D93S	+/-	+/-
CDR L3	LC_S95C	-	+/-
				CDR L3	LC_S95E	+/-	+/-
CDR L3	LC_S95T	+/-	+/-
				CDR L3	LC_L96G	+/-	+/-
CDR L3	LC_S97G	+/-	+/-
				CDR L3	LC_S97V	+/-	+/-
CDR L3	LC_G98E	+/-	+/-
				CDR L3	LC W/99V	-	Nd
HC_FR1_LC_CDR L1	HC_G9V_LC_D51S	+/-	++
				HC_FR1_LC_CDR L1	HC_G10C_LC_Q54R	++	++
HC_FR1_HC_CDR H2	HC_L11M_HC_S54D	++	+/-
				HC_FR1_HC_CDR H2	HC_Q13K_HC_S53V	+/-	+/-
HC_FR1_LC_CDR L1	HC_S21T_LC_S25A	+/-	+/-
				H C_FR2_LC_CDR L3	HC_A40T_LC_L96S	+/-	+/-
HC_CDR H2_LC_FR4	HC_S53_HC_L112P	+/-	+/-
				HC_CDR H2_LC_FR1	HC_Q54W_LC_R17H	+/-	+/-

表12中提供的是M18-G08抗体内组合的氨基酸取代的一些实例。虽然不是每一组合都提供在表12中，但是考虑到了所述M18-G08抗利伐沙班的抗体可包含所提供的修饰的任一组合。在具有竞争步骤的ELISA中以四次重复实验分析所述变体的性能。计算平均数，如果用于包被的来自实施例1K的化合物的浓度低于10nm，那么减去链亲和素包被(无来自实施例1K的化合物)的平板上确定的平均背景信号，将信号标准化至各个平均表达水平。变体的整体性能是通过使用与wt相比10倍提高的参考变体比较2-3次独立实验的变体/参考比例来评估。对于没有进一步说明的变体，使用参考1(用“＊”标记)，对于用#标记的抗体，使用参考2(用“＊＊”标记)。平均比例大于参考+2×SD的变体用“+++”标记，而比例＜各个参考的0.1的变体用“+/-“标记，没有一个变体满足这个标准。性能在两个阈值之间的所有变体用“++”标记，CDR依照Kabat限定。

表12：M18-G08内多个氨基酸取代的实例

*参考1；**参考2；

#使用参考2分析的变体

实施例15.His标签的Fab片段的纯化：

在4℃下通过以9000rpm离心30分钟收获细胞，并保存在-20℃。使用两步纯化法从上清液纯化所述抗体片段。首先，将所述上清液用缓冲液A（50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，10mM咪唑pH8.0）重新缓冲（re-buffered）并浓缩，将100ml上样到5ml Ni-NTA superflow柱（Qiagen,1018142）。上样之后，将所述柱首先用20个柱体积的缓冲液A，然后用15个柱体积的4.3%缓冲液B（50mM NaH₂PO₄，300mMNaCl，250mM咪唑pH8.0）洗涤，用15个体积的缓冲液B洗脱。合并级分，依照制造商的说明书使用PD-10柱（GE Healthcare,17-0851-01）将缓冲液变换为PBS。在第二纯化步骤中，将所述Ni-NTA纯化的抗体与捕获选择λ亲和基质（BAC0849.010）孵育。在4℃下孵育过夜之后，将所述基质上样至柱中，用5个体积的PBS，5个体积的500mM精氨酸、100mM NaH₂PO₄、100mM NaCl（pH6.0），和再次5个体积的PBS洗涤。用6个体积的100mM甘氨酸（pH3.0）和3个体积的100mM甘氨酸（pH2.0）将抗体洗脱至总体积的1/15的1M HEPES（pH7.5）中以中和所述洗脱物。最后，将洗脱物在4℃下用PBS过夜透析。纯化的抗体用SDS-PAGE和质谱进行分析。

实施例16：在大肠杆菌和HEK293中产生无标签的Fab片段：

表达构建体的克隆

常规的克隆工作依照Sambrook et al.（Molecular Cloning ColdSpring Harbor,1989）进行。为了从大肠杆菌分离质粒DNA（小量制备），使用了Qiagen-tips（Qiagen）。用于转化的宿主生物为大肠杆菌菌株DH5α（invitrogen）。依照制造商的方案（Qiagen）利用Qiagen凝胶提取试剂盒从琼脂糖凝胶中提取DNA片段。用于PCR和测序反应的寡核苷酸购自metabion，合成基因（针对酿酒酵母密码子使用进行了优化）购自Geneart。对于PCR实验，依照制造商的方案使用了购自Merck的KOD聚合酶。所有的载体构建体通过外部测序确认（eurofins）。

大肠杆菌表达载体pMC11和pMC14：

将M18-G08-DKTHT和M18-G08-G-DKTHT从pET28a再克隆至基于pUC的大肠杆菌表达载体（分别为pMC14和pMC11）中（在pLAC启动子控制下），这是通过分别扩增轻链（LC）和重链（HC）序列，然后使用所述基于pUC的载体的独特限制性位点来完成的。

编码序列的5’和3’侧的额外寡核苷酸包括用于将LC和HC框内亚克隆至基于pUC的大肠杆菌表达载体的限制性内切酶识别位点。

LC序列的扩增是使用带有NheI限制性位点的正向引物和反向引物进行，所述正向引物结合至pelB前导区（leader），所述反向引物与所述LC序列的3’端配对。限制性酶切是使用NheI/XhoI进行。进行了至经NheI/XhoI消化的基于pUC的载体中的后续连接。所连接的DNA的转化是在大肠杆菌DH5α(invitrogen)中进行。

HC序列的扩增是使用正向引物(带有NheI限制位点)和反向引物进行，所述正向引物结合至pelB前导区，所述反向引物与所述LC序列的3’端配对并带有编码末端5个氨基酸DKTHT的额外核苷酸和其后的SacII限制性位点。限制性酶切是使用NheI/SacII进行。进行了至经NheI/SacII消化的基于pUC的载体中的后续连接。所连接的DNA的转化在大肠杆菌DH5α(invitrogen)中进行。

编码M18-G08-DKTHT的LC的基因的蛋白质序列如下：

QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSDIGSNTVNWYQQLPGTAPKLLIYDNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

编码M18-G08-DKTHT的HC的基因的蛋白质序列如下：

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMSWVRQAPGKGLEWVSSISSSSGYIYYADSLKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVWRNHLDYWGQGTLVTVTSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT

编码M18-G08-G-DKTHT的LC的基因的蛋白质序列如下：

QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWYQQLPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

编码M18-G08-G-DKTHT的HC的基因的蛋白质序列如下：

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVWRNYLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT

哺乳动物表达载体pMC19和pMC32：

质粒pMC19(编码M18-G08-G-DKTHT)和pMC32(编码M18-G08-DKTHT)的编码序列以合成基因的形式购自Geneart(针对哺乳动物密码子使用进行了优化)。编码序列5’和3’侧的另外寡核苷酸包括用于将各个序列框内亚克隆至单个标准哺乳动物表达载体中并且在pCMV5启动子控制下的限制性识别位点。

HEK293 6E细胞中的Fab表达

一些Fab片段是使用瞬时转染的HEK293 6E细胞通过哺乳动物细胞培养来产生。如上所述，将重链和轻链均克隆至单个载体系统并且在CMV5启动子控制下。利用F17培养基(Invitrogen，货号：05-0092DK)(在转染24小时之后补充0.5％胰蛋白胨TN1(Organotechnie，货号：19553)和1％FCS超低IgG(Invitrogen，货号：16250))，表达规模为20L波浪袋(wave bag)中10L培养基。将细胞在5％CO₂、37℃、18次摇摆(rock)/分钟(角度为8°)下培养6天。表达水平为约120mg/L。细胞通过离心(Sorvall RC12BP，30分钟，4℃，4000rpm)收获。丢弃细胞。将含Fab片段的上清液通过0.2μm无菌滤器(Sartorius Sartopore2XLG，货号：5445307G8--00)过滤。

大肠杆菌BL21中的Fab表达：

Fab片段还可以在基于上述表达构建体的大肠杆菌系统中表达。将补充有10g/L葡萄糖-一水合物(Sigma，货号：G5767)和100mg/L羧苄青霉素(AppliChem，货号：A1491,0010)的200ml2×YT培养基(Difco2×YT培养基：Becton Dickinson(BD)，货号：244020)用1000μl以例如pMC11转化的大肠杆菌BL21的冷冻培养物接种，并以250rpm在37℃下孵育16小时。该种子菌株被用于接种20L补充有1g/L葡萄糖-一水合物、100mg/L羧苄青霉素和0.1ml/L聚乙二醇P2000(BASF)的2×YT培养基。在30℃、35次摇摆/分钟，角度9°和充气速率0.52L空气/分钟下，将所述生产培养物在Sartorius Cultibag上的50L波浪袋中孵育。当OD600为0.5-0.6时，由0.75mM IPTG诱导Fab片段的表达。再孵育20小时之后，通过离心（Sorvall RC12BP，1小时，4℃，4000rpm）收获所述培养物。将所述生物质在-20℃下冷冻。将所述上清液通过0.2μm无菌滤器（Sartorius Sartopore 2 XLG，货号：5445307G8--00）过滤，并利用具有Sartorius Slice cassettes Hydrosart10k的MilliporePellicon-Mini-Holder以Millipore Pro Flux M12错流过滤（cross flowfiltration）浓缩。所使用的参数：入口压力：2bar；出口压力1.5bar，压差：0.5bar，在50秒内产生开始的100ml滤液。

将100g大肠杆菌片状沉淀物重悬于320ml的30mM Tris/HCl（pH8.0）+200g/L蔗糖+6片无EDTA的蛋白酶抑制剂（Roche）+25U/ml全能核酸酶（Sigma E1014）+1mg/ml溶菌酶（Sigma）中，并在4℃下孵育2小时。使用装入40KPSI压力头（工作压力36,1KPSI）的TS细胞破碎系统（Constant Systems,Ltd.）将细胞破碎2轮，细胞温度10℃;进料溶液和流过液（flow-through）都保持在4℃。通过在4℃下以35,000×g离心35分钟除去细胞碎片。将澄清的上清液（=粗提取物）无菌过滤并保存在-20℃，用于进一步处理。

无标签的Fab的纯化

本发明的Fab片段是使用2步纯化法从无菌过滤HEK2936E或大肠杆菌上清液，或从无菌过滤的大肠杆菌粗提取物（如上文所述产生）纯化。使用了“λ选择”亲和柱（BAC）作为捕获步骤。对于10L的细胞上清液或大肠杆菌培养物，使用40ml的λ选择树脂。所有的其他纯化步骤在20℃下进行并且所有后续步骤使用的流速为6ml/分钟。将所述柱在5个柱体积（=CV）的PBS（pH7.4）中平衡。所述样品用1M NaOH溶液将pH调至pH7.4并应用于所述柱。然后用10CV的PBS（pH7.4）进行洗涤。将Fab片段用3CV的50mM乙酸钠、500mM NaCl（pH3.5）洗脱。洗脱合并液（elution pool）用2.5M Tris将pH调至pH7.0，无菌过滤并使用超滤设备（Amicon Ulta10kDa,Millipore UFC901008）浓缩至17.8mg。将所述样品应用到在PBS（pH7.4）中平衡的35/500Superdex75分子筛柱（GE Healthcare）。将所述柱以3ml/ml的流速洗脱2CV，将收集6ml的级分。将含Fab片段的级分合并，并通过SDS PAGE（4-12%NuPage,Invitrogen）进行分析。如图9所示，M18-G08-G-DKTHT的制品是>98%纯的，并且轻链=LC和重链=HC以相同的量存在。

实施例17：活体外凝血酶原时间（PT）（大鼠PD/PK）

通过经口强饲法以溶解于EtOH-PEG-水（10-50-40%，5ml/kg）中的1.5mg/kg的剂量向雄性Wistar大鼠（Charles River）给予利伐沙班。异氟烷麻醉是在经口给药之后～75分钟时进行，以植入用于Fab解毒剂输注的静脉（颈静脉）导管和用于血液采样的动脉（颈动脉）导管。经口给予利伐沙班之后90分钟时，开始在1小时内以85mg/kg的剂量（在PBS中，给药体积15ml/kg/h）输注Fab M18-G08-G-DKTHT。凝血酶原时间和血浆浓度如实施例10中所述确定。利伐沙班诱导的PT延长的标准化示于图10中。该实验环境下未结合的利伐沙班的血浆浓度的时间进程记载于实施例18。

实施例18：大鼠中由Fab解毒剂引起的未结合利伐沙班浓度的降低

为了研究Fab解毒剂对利伐沙班药代动力学的体内作用，在有知觉和麻醉的大鼠中确定了共同给予Fab M18-G08-G-DKTHT之后大鼠中利伐沙班的未结合浓度（按照实施例17中描述的方案）。因为只有未结合的药物浓度会推动药理学作用，所以未结合浓度是药理学作用的一个很好的预报因子。为了确定所述未结合浓度，将血浆样品用DPBS（1/1v/v）稀释，然后加入至含有排阻体积为30,000Da的膜的超滤设备中。将样品以1200g离心2分钟。将25μL的超滤液用DPBS（1/1v/v）稀释，然后加入至含有排阻体积为30000Da的膜的超滤设备中。将样品以1200g离心2分钟。将25μL超滤液用25μL DPBS稀释，并掺入150μL含有内标的乙酸铵/乙腈（1/1v/v）溶液（pH6.8）。将血浆样品掺入300μL乙腈，并在4℃下以2000g离心10分钟。所述样品通过使用API4000（ABSciex）的LC-MS/MS进行分析。Fu值依照关系fu(%)=滤液浓度/血浆样品浓度*100计算，并针对于所述超滤设备的非特异性结合进行修正，血浆稀释度如前所述（Schuhmacher J.et al.,J Pharm Sci.2004;93(4):816-30）。

图11示出了经口给予1.5mg/kg利伐沙班和在给予利伐沙班之后第1.5小时开始输注85mg/kg Fab M18-G08-G-DKTHT（持续1小时）之后，大鼠血浆中未结合利伐沙班的浓度/时间图。显示出了输注Fab之后利伐沙班的未结合血浆浓度的快速降低。对于一些样品，不能确定利伐沙班的未结合浓度，因为它们低于定量的下限（LLOQ）

实施例19：大鼠中的出血时间

在大鼠尾部横切模型中研究了Fab M18-G08-G-DKTHT干扰由利伐沙班引起的出血延长的可能性。将动物（雄性Wistar大鼠，CharlesRiver）用仲丁硫巴比妥（180mg/kg，腹腔注射）麻醉，以植入用于药物给药和血液采样的静脉（颈静脉）和动脉（颈动脉）导管。在静脉推注给予1mg/kg利伐沙班（在EtOH-PEG-水中，10-50-40%，3ml/kg）之后5分钟，通过在邻近尾末梢2-3mm的距离处横切尾部起始出血。将出血的尾部浸入0.9%37℃盐水中以观察和记忆出血事件。起始出血之后1分钟，开始以剂量107,5mg/kg（在PBS中，1.33ml/kg/分钟）输注FabM18-G08-G-DKTHT10分钟。由不知道进行何种处理的观察者持续30分钟记录出血并评分（0=无出血，1=最小、2=轻度、3=中等、4=最大出血）。所述评分在30秒间隔内获得。在30分钟，评分4出血的情况下，用获得的1800秒的最大值来计算累计出血时间。在未处理、利伐沙班以及利伐沙班+Fab解毒剂组中，每组5只动物的中值出血时间分别为195、1425和368秒（图12）。

实施例20：Fab M18-G08-G-DKTHT–利伐沙班复合体的结晶和X射线结构测定

结晶

将含Fab M18-G08-G-DKTHT的蛋白质浓缩至10mM Hepes（pH7.0）中的30mg/ml。结晶之前，将蛋白质溶液与三倍摩尔过量的溶解于50mM DMSO中的利伐沙班混合并在冰上孵育1小时。使用沉滴法，将含Fab M18-G08-G-DKTHT和利伐沙班的蛋白质构建体的共晶（co-crystal）在20℃下生长，并通过混合等体积的蛋白质溶液和作为沉淀剂的孔溶液（well solution）（100mM TRIS（pH7.0），20%PEG4000，2M NaCl）来进行结晶。晶体在一天之后出现并在14天之后生长至其终体积。

数据收集和处理

将晶体在液氮中速冻，而不使用冷冻缓冲液。晶体的数据在MARCCD检测器上在光束线BL14.1,BESSY同步加速器（Berlin）上收集。将数据编入索引并与XDS（Kabsch,W.(2010)Acta Cryst.D66,125-132）整合，将其准备用于用POINTLESS变换（scale），并用SCALA变换（P.R.Evans,(2005)Acta Cryst.D62,72-82）。晶体被衍射至最高达

并且在不对称单位中，具有晶胞常数为a=120.4的立方空间群P23以及一个Fab M18-G08-G-DKTHT-利伐沙班复合体。

结构测定和精化

利伐沙班和单克隆抗体Fab M18-G08-G-DKTHT的共-结构是通过使用BALBES（F.Long,A.Vagin,P.Young and G.N.Murshudov(2008)Acta Cryst.D64,125-132），用pdb编码1rzf作为搜索模型，进行分子置换来解析。使用COOT反复多轮建模（P.Emsley et al.(2010)Acta Cryst.D66:486-501）和使用REFMAC5.5（G.N.Murshudov et al.(1997)ActaCryst.D53,240-255）的最大似然算法，完成所述模型。数据集和精化统计总结在表13中。

表13：Fab M18-G08-G-DKTHT-利伐沙班复合体的数据集和精化统计

^a括号中的值是针对高分辨率的壳层

^bR_merge＝∑hkl|I_hkl-<I_hkl>|/∑hkl<I_hkl>其中I_hkl为反射hkl的强度hkl，<I_hkl>为多次观察结果的平均强度

^cR _cryst＝∑|F_obs-F_calc|/∑F_obs其中F_obs和F_calc分别为观察和计算的结构因子振幅

^d5％测试集

^eRMSD，用于理想的立体化学的参数集的均方根偏差

实施例21：基于X射线结构的表位定位

Fab M18-G08-G-DKTHT和利伐沙班的复合体(图13)以每不对称单位1个复合体拷贝的形式结晶。Fab M18-G08-G-DKTHT的残基与利伐沙班接触(互补位)。两种方法被用于确定利伐沙班与FabM18-G08-G-DKTHT的结合表位，并列于表14a和b中。

方法1：埋入的表面是用程序AREAIMOL(P.J.Briggs(2000)CCP4Newsletter No.38)和用结合和未结合利伐沙班计算时显现出总面积差异的残基来分析(表14a)。

方法2：为了进行计算，向Fab M18-G08-G-DKTHT的所有氨基酸以及利伐沙班中加入氢原子。然后，使用程序Discovery Studio，Version3.1(Accelrys Software Inc.，2005-11)计算晶体结构中结合的利伐沙班的

环境中的残基(表14b)。

源于两种计算的所有残基均已被认为与利伐沙班接触。

表14a：使用方法1时与利伐沙班接触的Fab M18-G08-G-DKTHT的残基。

表14：使用方法2计算出来的与利伐沙班接触的Fab M18-G08-G-DKTHT的残基。列出了所有的距离（以

表示）。

总而言之，Fab M18-G08-G-DKTHT通过以下残基识别利伐沙班：

轻链：

Asn35[L-CDR1]、Tyr37、Gln90[L-CDR3]、Trp99[L-CDR3]、Phe101

重链：

Ser31[H-CDR1]、Trp33[H-CDR1]、Ser35[H-CDR1]、Trp47、Ser50[H-CDR2]、Val99[H-CDR3]、Trp100[H-CDR3]、Arg101[H-CDR3]、Asn102[H-CDR3]、Tyr103[H-CDR3]、Leu104[H-CDR3]

利伐沙班的氯噻吩基团经π-堆积与Trp99（L-CDR3）相互作用，经疏水性堆积与Leu104（H-CDR3）相互作用。利伐沙班的中央酰胺为氢键合至Ser50（H-CDR2)）和Asn102（H-CDR3）的侧链。利伐沙班的噁唑的羰基氧氢键合至Asn102（H-CDR3）的主链酰胺。所描述的所有相互作用可转移至式1。

利伐沙班的苯环经π-堆叠与Trp33（H-CDR1）相互作用。这些相互作用可转移至式2。

图13示出与利伐沙班复合的Fab M18-G08-G-DKTHT的卡通图示，利伐沙班以棍表示。图14示出Fab M18-G08-G-DKTHT与利伐沙班的结合和相互作用。

实施例22：通过竞争性ELISA测定和量化利伐沙班含量

PBST:          补充有0.05%Tween20（Sigma,P7949）

               的1×PBS

PBST-MP3%:    补充有3%奶粉（Cell Signaling,9999）

               的PBST

为了测定给定样品中利伐沙班的含量，建立了竞争性ELISA。简言之，将用链亲和素预包被的MTP平板（Greiner,No.655990）在室温下用100nM来自实施例1K的化合物孵育1小时。用PBST洗涤之后，将平板用PBST-MP3%在室温下封闭1小时，并重复洗涤步骤。对于竞争步骤，将在PBS中系列稀释的含不同量的利伐沙班的样品与终浓度为2.5μg/ml的Fab M18-G08-G-DKTHT混合，并在RT下孵育1小时，然后转移至预处理的孔中。孵育和用PBST洗涤之后，用偶联HRP的抗-hIgG（Fab-特异性的）（Sigma;A0293）进行残余的结合Fab的检测。显色反应通过加入100μl TMB（Invitrogen，2023）发生，并在5-15分钟之后通过加入100μl H₂SO₄（0.25M；Merck,1120801000）中止。在酶标仪（Tecan）中，在450nM下记录比色反应。

如图15所示，可检测到信号的剂量依赖型的减少。

实施例23：在Fab解毒剂的存在下凝血酶生成测定中阿哌沙班和达比加群的活性：

基本上如实施例8所述进行凝血酶生成测定。实验分别在3μM阿哌沙班（图16）或0.75μM达比加群（图17）的存在下进行。无论是单独加入Fab解毒剂（终浓分别为1.43μM和0.72μM）还是与利伐沙班（终浓度为=0.1μM）一起加入Fab解毒剂，都没有检测到对凝血酶生成的作用。

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WO97/08320

Claims (41)

1.一种在体外和/或体内中和抗凝血剂的抗凝活性的分离的抗体或其抗原结合片段或抗体模拟物。

2.一种结合抗凝血剂的分离的抗体或其抗原结合片段或抗体模拟物。

3.一种结合抗凝血剂并在体外和/或体内中和所述抗凝血剂的抗凝活性的分离的抗体或其抗原结合片段或抗体模拟物。

4.前述权利要求任一项的分离的抗体或其抗原结合片段或抗体模拟物，其中所述抗凝血剂具有小于5000Da的分子量。

5.前述权利要求任一项的分离的抗体或其抗原结合片段或抗体模拟物，其中所述抗凝血剂为因子Xa抑制剂或凝血酶抑制剂。

6.前述权利要求任一项的分离的抗体或其抗原结合片段或抗体模拟物，其中所述FXa抑制剂为含一组式1的化合物、阿哌沙班、贝曲西班、雷扎沙班、依杜沙班、奥米沙班或YM-150或者其中所述凝血酶抑制剂为达比加群。

7.前述权利要求任一项的分离的抗体或其抗原结合片段或抗体模拟物，其中所述抗凝血剂为利伐沙班。

8.前述权利要求任一项的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体序列包含表1中抗体的可变重链CDR序列和可变轻链CDR序列。

9.前述权利要求任一项的抗体或抗原结合片段，包含

由SEQ ID NO:263–265表示的可变重链CDR序列和由SEQ IDNO:266–268表示的可变轻链CDR序列，或者

由SEQ ID NO:251–253表示的可变重链CDR序列和由SEQ IDNO:254–256表示的可变轻链CDR序列，或者

由SEQ ID NO:221–223表示的可变重链CDR序列和由SEQ IDNO:224–226表示的可变轻链CDR序列。

10.前述权利要求任一项的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体序列包含表1示出的抗体的可变重链序列和可变轻链序列。

11.前述权利要求任一项的抗体或抗原结合片段，包含

由SEQ ID NO:489表示的重链片段序列和由SEQ ID NO:490表示的轻链序列，或者

由SEQ ID NO:217表示的可变重链序列和由SEQ ID NO:218表示的可变轻链序列，或者

由SEQ ID NO:117表示的可变重链序列和由SEQ ID NO:118表示的可变轻链序列，或者

由SEQ ID NO:207表示的可变重链序列和由SEQ ID NO:208表示的可变轻链序列，或者

由SEQ ID NO:493表示的重链片段序列和由SEQ ID NO:494表示的轻链序列。

12.前述权利要求任一项的分离的抗体或其抗原结合片段或抗体模拟物，其中所述抗体或抗体模拟物与权利要求8-11中的抗体或抗原结合片段竞争结合。

13.权利要求12的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段的氨基酸序列与表1中示出的至少一个CDR序列至少50%、55%、60%70%、80%、90或95%相同，或者与表1示出的至少一个VH或VL序列至少50%、60%、70%、80%、90%、92%或95%相同。

14.权利要求12-13任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段的氨基酸序列与M18-G08-G的至少一个CDR序列至少50%、55%、60%70%、80%、90或95%相同，或者与M18-G08-G的VH或VL序列至少50%、60%、70%、80%、90%、92%或95%相同。

15.权利要求12-14任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含至少一个重链CDR序列和/或至少一个轻链CDR序列，所述重链CDR序列符合共有序列SEQ ID NO:497或SEQID NO:502（CDR H1）、SEQ ID NO:222或SEQ ID NO:503（CDRH2），或者SEQ ID NO:498或SEQ ID NO:504（CDR H3），，所述轻链CDR序列符合共有序列SEQ ID NO:499或SEQ ID NO:505（CDR L1）、SEQ ID NO:500或SEQ ID NO:506（CDR L2），或者SEQ ID NO:501或SEQ ID NO:507（CDR L3）。

16.权利要求12-15任一项的抗体或抗原结合片段，

a.其中，所述抗体或其抗原结合片段包含符合SEQ ID NO:497（CDR H1）、SEQ ID NO:222（CDR H2）和SEQ ID NO:498（CDR H3）的重链CDR序列，和符合SEQ ID NO:499（CDRL1）、SEQ ID NO:500（CDR L2）和SEQ ID NO:501（CDRL3）的轻链CDR序列，或者

b.其中所述抗体或其抗原结合片段包含符合SEQ ID NO:502（CDR H1）、SEQ ID NO:503（CDR H2）和SEQ ID NO:504（CDR H3）的重链CDR序列，和符合SEQ ID NO:505（CDRL1）、SEQ ID NO:506（CDR L2）和SEQ ID NO:507（CDRL3）的轻链CDR序列。

17.权利要求12-16的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段包含表1示出的至少一个CDR序列或者至少一个可变重链或轻链序列。

18.前述权利要求任一项的抗原结合片段，其中所述片段为Fab片段。

19.前述权利要求任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或片段是单克隆的。

20.前述权利要求任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或片段为人的、人源化的或嵌合的。

21.一种分离的多核苷酸序列，其编码权利要求1-20的抗体或其抗原结合片段或抗体模拟物。

22.一种载体，其包含权利要求20的多核苷酸。

23.一种宿主细胞，其包含权利要求21的多核苷酸序列或权利要求22的载体。

24.权利要求23的宿主细胞，其中所述宿主细胞为真核细胞或原核细胞。

25.权利要求24的宿主细胞，其中所述宿主细胞为酵母或大肠杆菌细胞。

26.一种通过以下方式来产生权利要求1-20的抗体或其抗原结合片段或抗体模拟物的方法，即培养权利要求24所述的宿主细胞和分离所述抗体或片段或抗体模拟物。

27.一种药物组合物，其包含权利要求1-20的抗体或其抗原结合片段，或者抗体模拟物。

28.一种药物组合物，其包含权利要求7-20抗体或其抗原结合片段，或者抗体模拟物。

29.权利要求1-20的分离的抗体或其抗原结合片段或抗体模拟物用作药物。

30.权利要求1-20的分离的抗体或其抗原结合片段或抗体模拟物用作用于使由所述抗凝血剂诱导的抗凝状态正常化的药物。

31.权利要求1-20的分离的抗体或其抗原结合片段或抗体模拟物用作用于使由所述FXa抑制剂诱导的抗凝状态正常化的药物。

32.权利要求1-20的分离的抗体或其抗原结合片段或抗体模拟物用作用于使由含一组式1的化合物诱导的抗凝状态正常化的药物。

33.权利要求7-20的分离的抗体或其抗原结合片段或抗体模拟物用作用于使由利伐沙班诱导的抗凝状态正常化的药物。

34.一种治疗方法，其使用权利要求27的药物组合物使由抗凝血剂诱导的抗凝状态正常化。

35.一种治疗方法，其使用权利要求27的药物组合物使由FXa抑制剂诱导的抗凝状态正常化。

36.一种治疗方法，其使用权利要求27的药物组合物使由含一组式1的化合物诱导的抗凝状态正常化。

37.一种治疗方法，其使用权利要求28的药物组合物使由利伐沙班诱导的抗凝状态正常化。

38.实施例1K或实施例1L的化合物。

39.权利要求38的化合物用于分离或检测抗体或其抗原结合片段或抗体模拟物的用途。

40.一种诊断试剂盒，其包含权利要求38的化合物和/或权利要求1-20的抗体或其抗原结合片段。

41.权利要求1-20的分离的抗体或其抗原结合片段或抗体模拟物用作用于在体外和/或体内诊断测定法中定性和/或定量确定抗凝血剂的诊断试剂。

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