JP2024506020A - サルベコウイルス結合剤 - Google Patents

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Abstract

本発明は、複数クレードのサルベコウイルスに結合し、サルベコウイルス感染を強力に中和し、特に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１感染、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を中和する薬剤に関する。薬剤は、サルベコウイルスＡＣＥ２－ＲＢＤ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）の固有のエピトープに結合するが、ＡＣＥ２の、ＲＢＤとの結合を阻害しない。これらの薬剤の適用および使用は、本発明のさらなる部分である。

Description

本発明は、複数クレードのサルベコウイルスに結合し、サルベコウイルス感染を強力に中和し、特に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１感染、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を中和し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株感染の中和を含む薬剤に関する。薬剤は、サルベコウイルスＡＣＥ２－ＲＢＤ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）の固有のエピトープに結合するが、ＡＣＥ２の、ＲＢＤとの結合を阻害しない。これらの薬剤の適用および使用は、本発明のさらなる部分である。
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、世界中に急速に拡散し、壊滅的な帰結をもたらした疾患であるＣＯＶＩＤ－１９の原因作用物質である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染は、無症状性であり、大半は、軽症～中等症を呈する。しかし、患者のうちの約１０％では、ＣＯＶＩＤ－１９は、呼吸困難および低酸素状態により特徴付けられる、より重度の段階へと進行し、さらに、長期にわたる集中治療を要求することが多く、ある割合の患者では、死を引き起こす急性呼吸逼迫状態へと進行することもある。「ＣＯＶＩＤ罹患後症」は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが、もはや検出されなくなってもなお長期にわたる、ＣＯＶＩＤ－１９感染の影響をさらに指す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する自然免疫認識により誘発され、おそらくまた、無効の免疫応答に由来する抗体との免疫複合体によっても誘発される、進行中の炎症は、重度疾患の進行に寄与する可能性が最も高い。
ＣＯＶＩＤ－１９（２０１９－ｎＣｏＶウイルス、またはＷＵＨＡＮ－Ｃｏｌｏｎａウイルス、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス）を引き起こす新型コロナウイルス（ＣｏＶ）の、約３０，０００ヌクレオチドのゲノムは、記録的短期間で解明された（ｈｔｔｐ：／／ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ．ｏｒｇ／ｔ／ｎｏｖｅｌ－２０１９－ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ－ｇｅｎｏｍｅ／３１９（２０２０年１月１９日のアクセスを参照されたい）。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１により引き起こされる、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）と同様に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ヒト細胞への侵入のための受容体として、アンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）を使用する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＡＣＥ２に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１より高度のアフィニティーで結合する。
予防ワクチン（中和抗体のｉｎ ｖｉｖｏにおけるワクチン誘導性作出である能動免疫療法）は、パンデミックのコントロールにおける基盤となることが期待される。この間、米国および欧州連合の規制機関は、例えば、ＣＯＶＩＤ－１９の処置のための、ＲＮＡベースのワクチンを承認した。これらのワクチンの欠点は、極低温（－７０℃または－２０℃）における保管である。より適切な状況下で保管されうる、他の予防ワクチン、例えば、操作アデノウイルスに基づく、他の予防ワクチンも開発中である。
予防ワクチンによりもたらされる保護は、不十分でありうる。実際、コロナウイルスに対する免疫は、短命の場合があり、とりわけ、老齢者は、ワクチン接種を受けても、それほど効率的に保護されない傾向がある。他方、既往の免疫応答（自然感染によるのであれ、予防ワクチンによるのであれ）を回避する、新たなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株の出現は、保護を損ないうる（例えば、Ｗｅｉｓｂｌｕｍら、２０２０、ｅＬｉｆｅ、２０２０、９：ｅ６１３１２）。よって、下気道内における、（さらなる）ウイルス複製を抑制するか、なおまたは防止する治療選択肢は、ＣＯＶＩＤ－１９に罹患または再罹患した患者（老齢患者または他の患者）のレスキューにおいて、重要な役割を見出す可能性が高い。しかし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を既に患う患者のための、このような治療選択肢は、依然として、極めて限定されている。
特定の種類の治療法は、潜在的に、中和抗体、すなわち、受動抗体療法／免疫療法に依拠する（免疫グロブリンの、全身循環から、気管支肺胞腔への放出は、下気道内の炎症に起因して強化されるので、中和抗体の全身投与が適する）。Ｒｕｊａｓら、２０２０（ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．１０．１５．３４１６３６）は、それについて、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）、またはＥｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＥＭＤＢ）における登録項目が利用可能である、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質（Ｓ）に結合する抗体についての優れた概観を提示し、一部の新たな抗体を提示しており、それらの一部（抗体４６および５２）の結合性部位は、ＲＢＭ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｔｉｆ）から、わずかに遠ざかるようにシフトしており、潜在的に、スパイクタンパク質を不安定化させている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶのＳ－ドメインに対する抗体の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する交差反応性については、Ｂａｔｅｓら、２０２１（Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ、３４：１０８７３７）により記載されている。ＶＨＨ７２など、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の両方に対する、単一ドメイン抗体／Ｎａｎｏｂｏｄｙフォーマットの中和剤については、Ｗｒａｐｐら、２０２０（Ｃｅｌｌ、１８４：１００４～１０１５）により報告されている。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和することが可能である、Ｎａｎｏｂｏｄｙなど、他の複数の単一ドメイン抗体について記載されている。例えば、Ｘｉａｎｇら、２０２０（Ｓｃｉｅｎｃｅ、３７０：１４７９～１４８４）は、各群が、異なるエピトープに結合し、これらのうちの２つの群が、ＲＢＤとの結合について、ヒトＡＣＥ－２と競合することが可能であり（エピトープＩおよびＩＩ）、２つの群が、ＲＢＤへの結合について、ＡＣＥ－２と競合せず、ＲＢＤのうちの、２つまたは３つが、アップコンフォメーション（エピトープＩＩＩおよびＩＶ）にある場合に限り、三量体スパイクタンパク質と結合することが可能である、Ｎａｎｏｂｏｄｙの４つの群について開示しており（これらのうち、エピトープＩに結合するＮｂ２０およびＮｂ２１は、スパイクタンパク質内に、Ｅ４８４Ｋ突然変異が存在する場合に、中和効力を喪失することが後に報告されており、Ｎｂ３４およびＮｂ９５（それぞれ、エピトープＩＩＩおよびＩＶに結合する）は、「クラスＩＩ Ｎｂ」として割り当てられ、最も重要なことは、Ｎｂ３４およびＮｂ９５がまた、ＡＣＥ２への結合を、ｎＭ単位の低濃度で遮断することが可能であるとも報告されたことである）（Ｓｕｎら、２０２１、ＢｉｏＲｘｉｖ、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２１．０３．０９．４３４５９２）；Ｓｕｎら、２０２１（ＢｉｏＲｘｉｖ、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２１．０３．０９．４３４５９２）は、さらなるＮａｎｏｂｏｄｙである、Ｎｂ１７およびＮｂ３６について報告しており；Ｓｃｈｏｏｆら、２０２０（Ｓｃｉｅｎｃｅ、３７０：１４７３～１４７９）は、スパイクタンパク質－ＡＣＥ２相互作用を破壊し、不活性コンフォメーションにあるスパイクタンパク質に結合する、Ｎａｎｏｂｏｄｙについて開示しており；Ｈｕｏら、２０２０（Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２７：８４６～８５４）；およびＨａｎｋｅら、２０２０（Ｎａｔ Ｃｏｍｍ、１１：４４２０）は、ＲＢＤ－ＡＣＥ２相互作用を遮断することが可能である、さらなるＮａｎｏｂｏｄｙについて開示しており；Ｗｕら、２０２０（Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ、２７：８９１）は、Ｄ群が、中和性であり、Ｅ群が、中程度に中和性であり、Ｄ群およびＥ群が、ＲＢＤと、ＡＣＥ２との間の結合について競合的ではないとされ、Ｄ群が、スパイク三量体界面上のクリプトエピトープをターゲティングし、抗体ＣＲ３０２２（後者は、非中和モノクローナル抗体である）と競合する、Ｎａｎｏｂｏｄｙの５つの群（Ａ群抗体は、ＲＢＤへの結合について、ＡＣＥ２と競合したが、効率的に中和しなかった）について記載しており；Ｄｏｎｇら、２０２０（Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ ＆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ、９：０３４～１０３６）は、ＲＢＤ－ＡＣＥ２相互作用を遮断することが可能なＮａｎｏｂｏｄｙについて記載している。Ｗｕら、２０２１（ＢｉｏＲｘｉｖ ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２１．０２．０８．４２９２７５）は、一連の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和Ｎａｎｏｂｏｄｙについて報告しているが、ＲＢＤ－ＡＣＥ－２相互作用に対する、これらの効果は、知られておらず、そうでなければ、ＣＤＲ配列により規定されており；これらの著者は、二特異的Ｎａｎｏｂｏｄｙフォーマットが、鼻腔内投与の状況で、効力を増大させるという事実に焦点を当てている。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスについて、多くの変異体が同定されており（２０３３４６例のｈＣｏＶ－１９ゲノム内における、２６８４４の単一突然変異：ｈｔｔｐｓ：／／ｕｓｅｒｓ．ｍａｔｈ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ｕｓｅｒｓ／ｗｅｉｇ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２＿Ｍｕｔａｔｉｏｎ＿Ｔｒａｃｋｅｒ．ｈｔｍｌを参照されたい；ＲＢＤ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）内における、少なくとも２８の、異なるアミノ酸変異：ｈｔｔｐｓ：／／ｃｏｖｉｄｃｇ．ｏｒｇ／？ｔａｂ＝ｌｏｃａｔｉｏｎを参照されたい；アクセス年月日：２０２１年２月１２日）、これらの一部は、元のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株より、感染性が大きいと考えられ、全ての予防ワクチンが、このような変異体に対する保護をもたらさない場合もある。モノクローナル抗体カシリビマブ、およびイムデビマブ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）、およびバムラニビマブ（Ｌｉｌｌｙ）は、米国ＦＤＡから、緊急時使用認可を受けた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株である、Ｂ．１．３５１（南アフリカ；ＲＢＤ内変異株である、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙを含む）、およびＢ．１．１．２４８（ブラジル；ＲＢＤ内変異株である、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、およびＮ５０１Ｙを含む）は、ごく最近、カシリビマブに対して、部分的に耐性であり、バムラニビマブ（Ｈｏｆｆｍａｎｎら、２０２１、ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２１．０２．１１．４３０７８７）に対して、完全に耐性であることが報告されたが、これは、さらなる治療選択肢に対する必要を、十分に裏付けている。
一態様では、本発明は、ＳＰＲＢＤ（サルベコウイルススパイクタンパク質受容体結合ドメイン（ｓａｒｂｅｃｏｖｉｒｕｓ ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ））に結合し、それら自体が、ＳＰＲＢＤに結合している場合に、アンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）の、ＳＰＲＢＤへの結合を可能とし、少なくとも、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１を中和し、ある特定の実施形態では、配列番号３０において規定された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸Ｔｈｒ３９３（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９３）、Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、Ｖａｌ３９５、またはＴｙｒ３９６のうちの、少なくとも１つ；および配列番号３０において規定された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸Ｌｙｓ４６２（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ａｒｇ４６２）、Ｐｈｅ４６４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｔｙｒ４６４）、Ｇｌｕ４６５（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｇｌｙ４６５）、Ａｒｇ４６６、またはＡｒｇ３５７（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｌｙｓ３５７）のうちの、少なくとも１つに結合することを特徴とするサルベコウイルス結合剤に関する。他の実施形態では、これらの結合剤は、配列番号３０において規定された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、Ｔｙｒ３９６、Ｐｈｅ４６４、Ｓｅｒ５１４、Ｇｌｕ５１６、およびＡｒｇ３５５のうちの、少なくとも１つ、または優先順位が増大する順に、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つに結合し；任意選択で、アミノ酸Ａｒｇ３５７（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｌｙｓ３５７）、および／またはＬｙｓ４６２（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ａｒｇ４６２）、および／またはＧｌｕ４６５（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｇｌｙ４６５）、および／またはＡｒｇ４６６、および／またはＬｅｕ５１８にさらに結合する。
さらなる態様は、上記で記載された、サルベコウイルス結合剤のうちの１つまたは複数が、直接、またはリンカーを介して融合され、好ましくは、Ｆｃドメインを介して融合された多価サルベコウイルス結合剤または多特異性サルベコウイルス結合剤に関する。
さらなる態様では、本発明は、本明細書で記載される、ＩＳＶＤ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）、またはその機能的部分を含む、サルベコウイルス結合剤をコードする単離核酸のほか；このような核酸を含む組換えベクターに関する。
本発明はまた、上記で記載された、サルベコウイルス結合剤、多価サルベコウイルス結合剤もしくは多特異性サルベコウイルス結合剤、単離核酸、および／または組換えベクターを含む医薬組成物にも関する。
本発明はまた、サルベコウイルス感染の処置における使用のための医薬としての使用、または対象の受動免疫化における使用のための医薬としての使用のための、上記で記載された、サルベコウイルス結合剤、多価サルベコウイルス結合剤もしくは多特異性サルベコウイルス結合剤、単離核酸、および／または組換えベクターならびに、このようなサルベコウイルス結合剤、多価サルベコウイルス結合剤もしくは多特異性サルベコウイルス結合剤、単離核酸、および／または組換えベクターを含む医薬組成物にも関する。特に、受動免疫化における使用の場合に、対象は、サルベコウイルス感染を有する場合もあり、サルベコウイルス感染を有さない場合もある。
本発明はまた、サルベコウイルス感染の診断における使用のための、上記で記載された、サルベコウイルス結合剤、および／または多価サルベコウイルス結合剤もしくは多特異性サルベコウイルス結合剤にも関する。
本発明はまた、診断用キットの製造における使用のための、上記で記載された、サルベコウイルス結合剤、多価サルベコウイルス結合剤もしくは多特異性サルベコウイルス結合剤、単離核酸、および／または組換えベクターにも関する。
上記のうちのいずれかでは、サルベコウイルス結合剤は、特に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２でありうる。
記載される図面は、概略図であるに過ぎず、非限定的である。図面では、要素の一部のサイズは、例示的な目的で、誇張され、縮尺通りに描示されない場合がある。
結合について、ＶＨＨ７２と競合せずに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤに結合するＶＨＨを含有するペリプラズム抽出物の同定を示す図である。（Ａ）ＥＬＩＳＡプレートを直接コーティングした（ｘ軸）か、またはＥＬＩＳＡプレートをコーティングしたＶＨＨ７２－Ｆｃにより捕捉された（ｙ軸）、一価ＲＢＤ－ＳＤ１－ｍｏｎｏｈｕＦｃへの、ＶＨＨの結合である。ドットプロットは、あらゆるＰＥについて、両方のＥＬＩＳＡ解析によるＯＤ（４５０ｎｍ）値を示す。点線は、４例のＰＢＳ試料について得られた２×平均ＯＤ（４５０ｎｍ）値を表す。ＶＨＨを含有するＰＥ試料（ＰＥ＿ＶＨＨ３．４２、ＰＥ＿ＶＨＨ３．１１７、ＰＥ＿ＶＨＨ３．９２、ＰＥ＿ＶＨＨ３．９４、およびＰＥ＿ＶＨＨ３．１８０）を除き、ＶＨＨ３．４２ファミリーに属する個別のＰＥ試料を、グレーダイアモンドとして示す。（Ｂ）Ｋａｂａｔ番号付けに従う、アミノ酸残基の番号付けによる、ＶＨＨ３．４２ファミリーのＶＨＨのアライメントである。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を、配列の枠囲いにより指し示す。 ＶＨＨ３．４２ファミリーのＶＨＨを含有するペリプラズム抽出物が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクに結合し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＶＳＶ偽型およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ１スパイクＶＳＶ偽型を中和することを示す図である。ＥＬＩＳＡにより調べられた、ＰＥ＿ＶＨＨ３．１１７およびＰＥ＿ＶＨＨ３．４２の系列希釈液の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質への結合である。ＰＥ＿ＶＨＨ５０（ＶＨＨ７２と類縁である、あらかじめ単離されたＶＨＨを含有する）、およびＰＥ＿ＶＨＨ３．９６（ＰＥ－ＥＬＩＳＡスクリーンにおいて、結合をもたらさなかったＶＨＨ）を、それぞれ、陽性対照および陰性対照として使用した。 ＶＨＨ３．４２ファミリーのＶＨＨを含有するペリプラズム抽出物が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクに結合し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＶＳＶ偽型およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ１スパイクＶＳＶ偽型を中和することを示す図である。ＶＨＨ３．４２（ＰＥ３＿４２＝ＶＨＨ３－４２のＰＥなど）ファミリーのＶＨＨは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクにより偽型化されたＶＳＶ－ΔＧウイルスを中和する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクにより偽型化されたＶＳＶ－ΔＧを、等量の、８、４０、または２００倍希釈ＰＥと混合した。３７℃で、３０分間にわたるインキュベーションの後、これらの混合物を、９６ウェルプレート内において、コンフルエンシー未満で増殖させたＶｅｒｏ Ｅ６細胞に感染させるのに使用した。感染の１６時間後、ルシフェラーゼ活性を測定した。ＰＢＳ、ＶＨＨ７２（１ｍｇ／ｍｌにおけるＶＨＨ７２＿ｈ１＿Ｓ５６Ａ）、ＶＨＨ５０（１ｍｇ／ｍｌ）を、対照として使用した。グラフは、その表示の最終希釈率における、各ＰＥまたは精製ＶＨＨについてのルシフェラーゼ値（ｃｐｓ）を示す。 ＶＨＨ３．４２ファミリーのＶＨＨを含有するペリプラズム抽出物が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクに結合し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＶＳＶ偽型およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ１スパイクＶＳＶ偽型を中和することを示す図である。ＶＨＨ３．４２ファミリーのＶＨＨは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１スパイクにより偽型化されたＶＳＶ－ΔＧウイルスを中和する。ルシフェラーゼおよびＧＦＰ発現カセットを含有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１スパイクにより偽型化されたＶＳＶ－ΔＧを、等量の、１００または１０００倍希釈ＰＥと混合して、それぞれ、１／２００（「２００」）、または１／２０００（「２０００」）の最終希釈液を得た。３７℃で、３０分間にわたるインキュベーションの後、これらの混合物を、９６ウェルプレート内において、コンフルエンシー未満で増殖させたＶｅｒｏ Ｅ６細胞に感染させるのに使用した。感染の１６時間後、ルシフェラーゼ活性を測定した。ＰＢＳ、ＰＥ＿ＶＨＨ３．１２（「ＰＥ３＿１２」；図１示されたＰＥ－ＥＬＩＳＡスクリーンにおいて、結合をもたらさなかったＶＨＨ）、ＶＨＨ７２（１ｍｇ／ｍｌにおけるＶＨＨ７２＿ｈ１＿Ｓ５６Ａ）、ＶＨＨ５０（１ｍｇ／ｍｌ）、または非感染（ＮＩ）細胞を、対照として使用した。グラフは、その表示の最終希釈率における、各ＰＥ抽出物または精製ＶＨＨについてのルシフェラーゼ値（ｃｐｓ）を示す。 精製ＶＨＨについてのＳＤＳ ＰＡＧＥ解析を示す図である。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞（Ａ）、またはＷＫ６ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ｂ）により産生された、表示の精製ＶＨＨについての、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに続く、クーマシー染色である。 ＶＨＨ３．４２およびＶＨＨ３．１１７が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤおよびスパイクタンパク質、ならびにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１スパイクタンパク質に結合することを示す図である。精製ＶＨＨ３．４２およびＶＨＨ３．１１７の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ－ｍｕＦｃ）への結合である。ＶＨＨ７２およびＧＦＰをターゲティングする対照ＶＨＨ（ｃｔｒｌ ＶＨＨ）を、それぞれ、陽性対照および陰性対照として使用した。ＢＳＡの結合を、対照として調べたが、ＢＳＡに結合している被験ＶＨＨは、対照として調べなかった（図示しない）。 ＶＨＨ３．４２およびＶＨＨ３．１１７が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤおよびスパイクタンパク質、ならびにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１スパイクタンパク質に結合することを示す図である。精製ＶＨＨ３．４２およびＶＨＨ３．１１７の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質への結合である。ＶＨＨ７２およびＧＦＰをターゲティングする対照ＶＨＨ（ｃｔｒｌ ＶＨＨ）を、それぞれ、陽性対照および陰性対照として使用した。ＢＳＡの結合を、対照として調べたが、ＢＳＡに結合している被験ＶＨＨは、対照として調べなかった（図示しない）。 ＶＨＨ３．４２およびＶＨＨ３．１１７が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤおよびスパイクタンパク質、ならびにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１スパイクタンパク質に結合することを示す図である。精製ＶＨＨ３．４２およびＶＨＨ３．１１７の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１のスパイクタンパク質への結合である。ＶＨＨ７２およびＧＦＰをターゲティングする対照ＶＨＨ（ｃｔｒｌ ＶＨＨ）を、それぞれ、陽性対照および陰性対照として使用した。ＢＳＡの結合を、対照として調べたが、ＢＳＡに結合している被験ＶＨＨは、対照として調べなかった（図示しない）。 ＲＢＤに結合する、ＶＨＨ３．１１７の反応速度を示す図である。単一濃度（２００ｎＭ）におけるＢＬＩにより測定された、ＶＨＨ３．１１７（「ＶＨＨ３＿１１７」）、ＶＨＨ３．４２（「ＶＨＨ３＿０４２」）、およびＶＨＨ７２＿ｈ１＿Ｓ５６Ａ（「ＶＨＨ７２」）の、ＡＨＣ（ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ ｃａｐｔｕｒｅ）バイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）上に固定化された、単量体ヒトＦｃ融合ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２＿ＲＢＤ－ＳＤ１に対するオフ速度の比較である。各グラフは、二連の測定のうちの１つを示す。 ＲＢＤに結合する、ＶＨＨ３．１１７の反応速度を示す図である。１００～３．１３ｎＭの濃度（２倍の希釈系列）で反復された、ＶＨＨ３．１１７の、ＡＨＣ（ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ ｃａｐｔｕｒｅ）バイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）上に固定化された、単量体ヒトＦｃ融合ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２＿ＲＢＤ－ＳＤ１に対する結合反応速度である。 ＲＢＤに結合する、ＶＨＨ３．１１７の反応速度を示す図である。５０～３．１３ｎＭの濃度（２倍の希釈系列）で反復された、ＶＨＨ３．８９の、ＡＨＣ（ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ ｃａｐｔｕｒｅ）バイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）上に固定化された、単量体ヒトＦｃ融合ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２＿ＲＢＤ－ＳＤ１に対する結合反応速度である。 ＶＨＨ３．４２およびＶＨＨ３．１１７が、ＲＢＤへの結合について、ＶＨＨ７２と競合しないことを示す図である。（Ａ）ＶＨＨ３．４２およびＶＨＨ３．１１７は、ＶＨＨ７２－Ｆｃに捕捉された、単量体ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤに結合しうる。グラフは、０．５μｇ／ｍｌにおける、ＶＨＨ、およびＶＨＨに結合する、関連しないＧＦＰ（ＧＢＰ）の、コーティングＶＨＨ７２－Ｆｃにより捕捉されたＲＢＤへの平均（ｎ＝２＋変動）結合（４５０ｎｍにおけるＯＤ）を示す。１０μｇ／ｍｌにおけるＰＢＳおよびＶＨＨ７２＿ｈ１＿Ｓ５６Ａ（「ＶＨＨ７２」）は、参照として組み入れた。（Ｂ）このＢＬＩ競合実験では、ＶＨＨ７２－Ｆｃを、抗ヒトＦｃバイオセンサーチップにロードし、その後、飽和が達成されるまで、マウスＩｇＧ２ａ Ｆｃ融合ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ＳＤ１（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を含有する溶液へと浸漬した。次に、チップを、ＶＨＨ７２＿ｈ１＿Ｓ５６Ａ（「ＶＨＨ７２」）、ＶＨＨ３．４２（「ＶＨＨ３＿４２」）、ＶＨＨ３．１１７（「ＶＨＨ３＿１１７」）を含有する溶液、またはＶＨＨを含有しない溶液（「緩衝液」）へと浸漬した。ＲＢＤへの結合について、ＶＨＨ７２（ＶＨＨ７２自体など）と競合するＶＨＨは、捕捉されたＲＢＤ－ｍｕＦｃを、ＶＨＨ７２－Ｆｃコーティングチップから移動させるので、時間経過にわたり、ＢＬＩシグナルを低下させるであろう。ＶＨＨ３．４２およびＶＨＨ３．１７２は、ＶＨＨ７２－Ｆｃにより捕捉されたＲＢＤに結合する結果として、ＢＬＩシグナルの増大をもたらす。グラフは、チップを、表示のＶＨＨを含有する溶液中に浸漬した時点からの、時間経過にわたるＢＬＩシグナルを示す。 ＶＨＨ３．４２、ＶＨＨ３．１１７、およびＶＨＨ３．９２が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質により偽型化されたＶＳＶ－Ｇを中和することを示す図である。（Ａ）精製されたＶＨＨ３．４２（「ＶＨＨ３，４２」）、ＶＨＨ３．１１７（「ＶＨＨ３，１１７」）、およびＶＨＨ３．７２＿ｈ１＿Ｓ５６Ａ（「ＶＨＨ７２」）による、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽型ＶＳＶ（ＶＳＶ－ＧスパイクＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の中和である。グラフは、各々が、その希釈系列の最低のＧＦＰ蛍光強度値、および最高のＧＦＰ蛍光強度値に対して正規化された、三連希釈系列のＧＦＰ蛍光強度（ｎ＝３±ＳＥＭ）を示す。（Ｂ）ＶＨＨ３．９２およびＶＨＨ３．１１７による、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽型ＶＳＶ（ＶＳＶ－ＤＧスパイクＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の中和である。グラフは、各々が、その希釈系列の最低のＧＦＰ蛍光強度値、および最高のＧＦＰ蛍光強度値に対して正規化された、三連希釈系列のＧＦＰ蛍光強度（ｎ＝４±ＳＥＭ）を示す。 ＶＨＨ３．４２およびＶＨＨ３．１１７が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１スパイクタンパク質により偽型化されたＶＳＶ－Ｇを中和することを示す図である。ＶＨＨ３．４２、ＶＨＨ３．１１７およびＶＨＨ７２＿ｈ１＿Ｓ５６Ａ（「ＶＨＨ７２」）による、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１スパイク偽型ＶＳＶ（ＶＳＶ－ＧスパイクＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１）の中和である。グラフは、各々が、その希釈系列の最低のＧＦＰ蛍光強度値、および最高のＧＦＰ蛍光強度値に対して正規化された、二連希釈系列の平均値ＧＦＰ蛍光強度（ｎ＝２±変動）を示す。 ＶＨＨ３．４２、ＶＨＨ３．９２、およびＶＨＨ３．１１７が、ＲＢＤの、組換えＡＣＥ２への結合に干渉しないことを示す図である。グラフは、ＶＨＨ３．４２、ＶＨＨ３．４２、およびＶＨＨ３．１１７の希釈系列の存在下で、ビオチニル化ＲＢＤの、組換えＡＣＥ２への結合時に検出される、ＡｌｐｈａＬＩＳＡシグナルを示す。関連しないタンパク質をターゲティングする対照ＶＨＨを、陰性対照（ｃｔｒｌ ＶＨＨ）として使用した。いずれもが、ＲＢＤの、ＡＣＥ２への結合を防止する、ＶＨＨ７２＿ｈ１＿Ｓ５６Ａ（「ＶＨＨ７２」）、および類縁のＶＨＨ３．１１５を、陽性対照として使用した。 ＶＨＨ３．４２、ＶＨＨ３．９２、およびＶＨＨ３．１１７が、ＲＢＤの、ＡＣＥ－２への結合を妨げないことを示す図である。ＶＨＨ３．４２、ＶＨＨ３．９２、およびＶＨＨ３．１１７は、ＲＢＤの、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞への結合を妨げない。ＡＣＥ２を内因的に発現するＶｅｒｏ Ｅ６細胞に結合するＲＢＤ－Ｆｃであり；ＶＨＨ３．４２またはＶＨＨ３．１１７（各々、１ｕｇ／ｍｌにおける）と共に、プレインキュベートされたＲＢＤ（０．４ｕｇ／ｍｌ）の、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞への結合についてのフローサイトメトリー解析である。対照として、ＲＢＤで処置されないＶｅｒｏ Ｅ６細胞（ＲＢＤなし）、およびＰＢＳまたは関連しない対照ＧＦＰをターゲティングするＶＨＨ（ｃｔｒｌ ＶＨＨ）と共にプレインキュベートされ、ＲＢＤ－ｍｕＦｃで染色されたＶｅｒｏ Ｅ６細胞を使用した。ＶＨＨ７２＿ｈ１＿Ｓ５６Ａを、参照として使用した。バーは、ＶＨＨ１つ当たり単一の解析を表す。対照である、ＰＢＳおよびＲＢＤなしを、二連で調べた。ＲＢＤ－ｍｕＦｃへの結合は、ＡＦ６４７コンジュゲート抗マウスＩｇＧ抗体により検出した。 ＶＨＨ３．４２、ＶＨＨ３．９２、およびＶＨＨ３．１１７が、ＲＢＤの、ＡＣＥ－２への結合を妨げないことを示す図である。ＶＨＨ３．４２、ＶＨＨ３．９２、およびＶＨＨ３．１１７は、ＲＢＤの、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞への結合を妨げない。ＶＨＨ３．９２またはＶＨＨ３．１１７の希釈系列と共に、プレインキュベートされたＲＢＤ（０．４ｕｇ／ｍｌ）の、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞への結合についてのフローサイトメトリー解析である。対照として、ＲＢＤで処置されないＶｅｒｏ Ｅ６細胞（ＲＢＤなし）、およびＰＢＳまたは関連しない対照ＧＦＰをターゲティングするＶＨＨ（ｃｔｒｌ ＶＨＨ）と共にプレインキュベートされ、ＲＢＤ－ｍｕＦｃで染色されたＶｅｒｏ Ｅ６細胞を使用した。ＶＨＨ３．１１５（ＶＨＨ７２と類縁であるＶＨＨ）を、参照として使用した。ＲＢＤ－ｍｕＦｃへの結合は、ＡＦ６４７コンジュゲート抗マウスＩｇＧ抗体により検出した。グラフは、ＲＢＤ－ｍｕＦｃ陽性Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞％（ｎ＝１）を示す。 ＶＨＨ３．４２、ＶＨＨ３．９２、およびＶＨＨ３．１１７が、ＲＢＤの、ＡＣＥ－２への結合を妨げないことを示す図である。ＶＨＨ３．４２、ＶＨＨ３．９２、およびＶＨＨ３．１１７は、ＲＢＤの、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞への結合を妨げない。ＶＨＨ３．１１７は、ヒトＦｃへと融合されたヒトＡＣＥ２の、それらの表面においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤを発現する酵母細胞への結合を妨げない。ＶＨＨ７２またはＶＨＨ３．１１７（１０、１、０．１、０．０１、または０ｕｇ／ｍｌにおいて）と共にプレインキュベートされたＡＣＥ２－Ｆｃの結合を示すヒストグラムである。ＡＣＥ２－Ｆｃの結合は、ＡＦ５９４コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体を使用して検出した。 ＶＨＨ３．４２ファミリーのＶＨＨが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤへの結合について、ＣＲ３０２２、Ｓ３０９、およびＣＢ６と競合しないことを示す図である。ＶＨＨ３．１７７は、ＲＢＤへの結合について、Ｓ３０９およびＣＲ３０２２と競合しない。グラフは、ＥＬＩＳＡプレート上に直接コーティングされたか、またはコーティングされたＳ３０９およびＣＲ３０２２により捕捉された、ＶＨＨ７２＿ｈ１＿Ｓ５６Ａ（「ＶＨＨ７２」、上パネル）、またはＶＨＨ３．１１７（下パネル）の希釈系列の、一価ヒトＦｃ（ＲＢＤ－ＳＤ１－ｍｏｎｏＦｃ）へと融合されたＲＢＤ－ＳＤ１への結合（４５０ｎｍにおけるＯＤ）を示す。ＲＳＶ Ｆタンパク質に対して方向付けられた抗体パリビズマブにより捕捉されたＲＢＤを、陰性対照として使用した。 ＶＨＨ３．４２ファミリーのＶＨＨが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤへの結合について、ＣＲ３０２２、Ｓ３０９、およびＣＢ６と競合しないことを示す図である。ＶＨＨ３．９２は、ＲＢＤへの結合について、ＣＢ６、Ｓ３０９およびＣＲ３０２２と競合しない。グラフは、ＥＬＩＳＡプレート上に直接コーティングされたか、またはコーティングされたＣＢ６、ＶＨＨ７２－Ｆｃ Ｓ３０９、およびＣＲ３０２２により捕捉された、ＶＨＨ３．９２希釈系列の、一価ヒトＦｃ（ＲＢＤ－ＳＤ１－ｍｏｎｏＦｃ）へと融合されたＲＢＤ－ＳＤ１への結合（４５０ｎｍにおけるＯＤ）を示す。ＲＳＶ Ｆタンパク質に対して方向付けられた抗体コーティングパリビズマブ、およびコーティングＶＨＨ３．１１７により捕捉されたＲＢＤを、対照として使用した。 ＶＨＨ３．４２ファミリーのＶＨＨが、ＣＲ３０２２、Ｓ３０９、およびＣＢ６のエピトープから隔たっており、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１との間で保存されたエピトープに結合することを示す図である。３つのパネルは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ単独（左）、またはＣＢ６、ＣＲ３０２２、およびＳ３０９と複合体化されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ（中）、またはＶＨＨ７２と複合体化されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ（右）についての表面表示を示す。 ＶＨＨ３．４２ファミリーのＶＨＨが、ＣＲ３０２２、Ｓ３０９、およびＣＢ６のエピトープから隔たっており、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１との間で保存されたエピトープに結合することを示す図である。さらに、その長軸に沿って回転させられた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ単独についての表面表示を、ＣＢ６、ＣＲ３０２２、およびＳ３０９と複合体化されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤの、同じ回転と併せて示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１内のアミノ酸と同一である、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤアミノ酸を、ライトグレーで示し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１内のアミノ酸と異なる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤアミノ酸を、ダークグレーで示す。矢印は、表示の抗体によっても、ＡＣＥ２によってもふさがれておらず（図示しない）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との間で保存された部位を指し示す。この部位は、本明細書で同定されるＶＨＨの結合性部位（ｓｉｔｅｄ）を保有すると推定される。 ＶＨＨ３．４２、ＶＨＨ３．９２、およびＶＨＨ３．１１７が、多様な範囲にわたるサルベコウイルスのＲＢＤを認識することを示す図である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１近縁（クレード１ａ）サルベコウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２近縁（クレード１ｂ）サルベコウイルス、ならびにクレード２およびクレード３のコウモリＳＡＲＳ関連サルベコウイルスのＲＢＤに基づくクラドグラム（ＵＰＧＭＡ法）である。 ＶＨＨ３．４２、ＶＨＨ３．９２、およびＶＨＨ３．１１７が、多様な範囲にわたるサルベコウイルスのＲＢＤを認識することを示す図である。ＶＨＨの、表示のサルベコウイルスのＲＢＤを提示するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞への結合についてのフローサイトメトリー解析である。グラフは、被験ＲＢＤ変異体について、ＲＢＤを発現する細胞（ＦＩＴＣコンジュゲート抗ｍｙｃタグ抗体陽性）に結合しているＶＨＨを検出するのに使用される、ＡＦ６４７コンジュゲート抗マウスＩｇＧ抗体のＭＦＩの、ＲＢＤを発現しない細胞（ＦＩＴＣコンジュゲート抗ｍｙｃタグ抗体陰性）のＭＦＩに対する比を示す。ＧＦＰをターゲティングするＶＨＨ（ＧＢＰ）を、陰性対照として使用し、抗体およびＶＨＨ７２＿ｈ１＿Ｓ５６Ａを、参照として使用した。全てのＶＨＨは、１０ｕｇ／ｍｌで調べた。 ＶＨＨ３．１１７が、多様な範囲にわたる、クレード１、クレード２、およびクレード３のサルベコウイルスのＲＢＤを認識することを示す図である。（Ａ）１００（Ｘ軸上のデータ点ごとの左バー）、１（Ｘ軸上のデータ点ごとの中バー）、および０．０１μｇ／ｍｌ（Ｘ軸上のデータ点ごとの右バー）における、ＶＨＨ３．１１７の、表示のＲＢＤへの結合についてのフローサイトメトリー解析である。（Ｂ）ＰＢＳを、陰性対照として使用し、ＶＨＨ７２＿ｈ１＿Ｓ５６Ａ（「ＶＨＨ７２」）を、参照として使用した。グラフは、表示のＲＢＤ変異体について、ＲＢＤを発現するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞（ＦＩＴＣコンジュゲート抗ｍｙｃタグ抗体陽性）に結合しているＶＨＨを検出するのに使用される、ＡＦ６４７コンジュゲート抗マウスＩｇＧ抗体のＭＦＩの、ＲＢＤを発現しない細胞（ＦＩＴＣコンジュゲート抗ｍｙｃタグ抗体陰性）のＭＦＩに対する比を示す。 ＤＭＳ（ｄｅｅｐ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ）により同定された、ＶＨＨ３．１１７エピトープについての概括を示す図である。２つの独立のライブラリーを使用して、ＤＭＳ（ｄｅｅｐ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ）により同定された、変化が、ＶＨＨ７２＿ｈ１＿Ｓ５６Ａ（「ＶＨＨ７２回避」）およびＶＨＨ３．１１７（「ＶＨＨ３．１１７回避」）への結合に、有意に影響を及ぼしうる、ＲＢＤのアミノ酸位置の表示である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤのアミノ酸配列を、上下の行に示す。上の行では、突然変異が、ＶＨＨ７２＿ｈ１＿Ｓ５６Ａからの回避を結果としてもたらすアミノ酸位置に、下線を付し、これを、太字とする。下の行では、突然変異が、ＶＨＨ３．１１７からの回避を結果としてもたらすアミノ酸位置に、下線を付し、これを、太字とする。 ＤＭＳ（ｄｅｅｐ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ）により同定された、ＶＨＨ３．１１７エピトープについての概括を示す図である。左上パネル：ＤＭＳ（ｄｅｅｐ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ）により同定された変化が、ＶＨＨ３．１１７への結合の低減と関連するアミノ酸位置を伴う、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤについての表面表示（ライトグレー）を、ダークグレーで指し示す。右上パネル：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤについてのカートゥーン表示（ライトグレー）である。ある特定の置換が、ＶＨＨ３．１１７への結合の低減と関連し、表面に露出されたアミノ酸位置を、暗い赤で指し示し、カートゥーン表示において棒として示す。左上パネルおよび右上パネル：置換が、ＶＨＨ３．１１７への結合からの回避と関連するが、表面へと曝露されない、アミノ酸位置を指し示す。左下カートゥーンは、Ｃ３３６～Ｃ３６１およびＣ３９１～Ｃ５２５におけるジスルフィド結合を示す。右下パネルは、Ｙ３６５およびＦ３９２の芳香族側鎖が、ＲＢＤコアへと、内向きに配向していることを例示する。 ＤＭＳ（ｄｅｅｐ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ）により同定された、ＶＨＨ３．１１７エピトープについての概括を示す図である。ＤＭＳ（ｄｅｅｐ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ）により同定され、表示の通り、その長軸または短軸に沿って回転させられた表面表示により表された、変化が、ＶＨＨ３．１１７への結合に、有意に影響を及ぼしうる、ＲＢＤのアミノ酸位置の表示である。 同定されたＶＨＨ３．１１７エピトープの位置が、Ｓ３０９、ＣＲ３０２２、およびＣＢ６が結合しているＲＢＤに結合するＶＨＨ３．１１７の能力、ならびにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ウイルスを交差中和する、その能力と符合することを示す図である。左パネル：Ｓ３０９ ＦａｂおよびＣＲ３０２２ Ｆａｂ（ダークグレー）と複合体化したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ（ライトグレー）についての表面表示である。ＶＨＨ３．１１７結合性部位の部分である残基を、ＲＢＤ内に、黒で指し示す。右パネル：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２内と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１内とで同一である、黒で着色された、アミノ酸を伴う、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤについての表面表示であり、ＶＨＨ３．１１７の結合性部位が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１との間で保存されていることを指し示す。 同定されたＶＨＨ３．１１７エピトープの位置が、Ｓ３０９、ＣＲ３０２２、およびＣＢ６が結合しているＲＢＤに結合するＶＨＨ３．１１７の能力、ならびにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ウイルスを交差中和する、その能力と符合することを示す図である。ＶＨＨ３．１１７結合性部位は、クレード１、クレード２、およびクレード３のサルベコウイルスの間で保存されている。ＶＨＨ３．１１７への結合について調べられた、サルベコウイルスＲＢＤのアミノ酸配列のアライメントを示す。置換が、ＶＨＨ３．１１７への結合からの回避と関連し、表面に露出されたアミノ酸位置を、太字で指し示す。置換が、ＶＨＨ３．１１７への結合からの回避と関連するが、表面に曝露されない、ＶＨＨ３．１１７結合性部位近傍のアミノ酸位置に、下線を付し、これを、太字とする。各被験サルベコウイルスＲＢＤについて、ＶＨＨ３．１１７結合性部位内にあるが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質内の、それぞれの位置におけるアミノ酸と同一ではないアミノ酸を、太字で指し示す。アライメント上方の番号は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質内のアミノ酸の位置を指し示す。 同定されたＶＨＨ３．１１７エピトープの位置が、Ｓ３０９、ＣＲ３０２２、およびＣＢ６が結合しているＲＢＤに結合するＶＨＨ３．１１７の能力、ならびにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ウイルスを交差中和する、その能力と符合することを示す図である。ＶＨＨ３．１１７結合性部位は、ＧＩＳＡＩＤ（Ｇｌｏｂａｌ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ ｏｎ Ｓｈａｒｉｎｇ Ａｖｉａｎ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｄａｔａ）データベース内の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ配列の間で、高度に保存されている。保存を示す、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤについての表面表示（白）である。白～黒の勾配は、保存が最高度～最低度である位置を表す。新興ＶＯＣ（ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ ｃｏｎｃｅｒｎ）内で置換されたアミノ酸（Ｋ４１７、Ｌ４５２、Ｅ４８４、およびＮ５０１）、またはＶＯＩ（ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）内で置換されたアミノ酸（Ｓ４７７）のほか、Ｎ４３９において置換されたアミノ酸を、矢印で指し示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤのアミノ酸配列（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１分離株のスパイクタンパク質アミノ酸位置３３３～５１６）を、解析された、４４０，７６９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム（２０２１年２月１２日に、ＧＩＳＡＩＤ（Ｇｌｏｂａｌ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ ｏｎ Ｓｈａｒｉｎｇ Ａｖｉａｎ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｄａｔａ）において利用可能）内で、少なくとも１回検出され、各残基の上方に描示される、全てのミスセンス突然変異と共に示す。変異体を、各位置において、観察された例数により表される頻度に従い、垂直方向に順序づける。新興ＶＯＣ（ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ ｃｏｎｃｅｒｎ）内で置換されたアミノ酸（Ｋ４１７、Ｌ４５２、Ｅ４８４、およびＮ５０１）、またはＶＯＩ（ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）内で置換されたアミノ酸（Ｓ４７７）を、アステリスクで指し示す。高頻度で置換される、Ｎ４３９位もまた指し示す。置換が、ＤＭＳ（ｄｅｅｐ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ）により決定された、ＶＨＨ３．１１７への結合の喪失と関連したアミノ酸を、枠囲いで指し示す。 同定されたＶＨＨ３．１１７エピトープの位置が、Ｓ３０９、ＣＲ３０２２、およびＣＢ６が結合しているＲＢＤに結合するＶＨＨ３．１１７の能力、ならびにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ウイルスを交差中和する、その能力と符合することを示す図である。ＶＨＨ３．１１７結合性部位は、ＧＩＳＡＩＤ（Ｇｌｏｂａｌ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ ｏｎ Ｓｈａｒｉｎｇ Ａｖｉａｎ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｄａｔａ）データベース内の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ配列の間で、高度に保存されている。保存を示す、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤについての表面表示（白）である。白～黒の勾配は、保存が最高度～最低度である位置を表す。新興ＶＯＣ（ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ ｃｏｎｃｅｒｎ）内で置換されたアミノ酸（Ｋ４１７、Ｌ４５２、Ｅ４８４、およびＮ５０１）、またはＶＯＩ（ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）内で置換されたアミノ酸（Ｓ４７７）のほか、Ｎ４３９において置換されたアミノ酸を、矢印で指し示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤのアミノ酸配列（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１分離株のスパイクタンパク質アミノ酸位置３３３～５１６）を、解析された、４４０，７６９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム（２０２１年２月１２日に、ＧＩＳＡＩＤ（Ｇｌｏｂａｌ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ ｏｎ Ｓｈａｒｉｎｇ Ａｖｉａｎ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｄａｔａ）において利用可能）内で、少なくとも１回検出され、各残基の上方に描示される、全てのミスセンス突然変異と共に示す。変異体を、各位置において、観察された例数により表される頻度に従い、垂直方向に順序づける。新興ＶＯＣ（ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ ｃｏｎｃｅｒｎ）内で置換されたアミノ酸（Ｋ４１７、Ｌ４５２、Ｅ４８４、およびＮ５０１）、またはＶＯＩ（ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）内で置換されたアミノ酸（Ｓ４７７）を、アステリスクで指し示す。高頻度で置換される、Ｎ４３９位もまた指し示す。置換が、ＤＭＳ（ｄｅｅｐ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ）により決定された、ＶＨＨ３．１１７への結合の喪失と関連したアミノ酸を、枠囲いで指し示す。 同定されたＶＨＨ３．１１７エピトープの位置が、Ｓ３０９、ＣＲ３０２２、およびＣＢ６が結合しているＲＢＤに結合するＶＨＨ３．１１７の能力、ならびにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ウイルスを交差中和する、その能力と符合することを示す図である。ＶＨＨ３．１１７エピトープは、無傷スパイクタンパク質上において、アクセス可能ではない。ＶＨＨ３．１１７結合性部位は、ダウンコンフォメーションまたはアップコンフォメーションにあるＲＢＤ上において、アクセス可能ではない。１つのＲＢＤが、アップコンフォメーションにあり、２つのＲＢＤが、ダウンコンフォメーションにある、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク三量体を示す（ＰＤＢ：６ＶＳＢ、白）。ＶＨＨ３．１１７結合性領域を、ダークグレーでマークし、アップ位置にあるＲＢＤを指し示す、１つの矢印と、ダウン位置にあるＲＢＤのうちの１つを指し示す、別の矢印とにより指し示す。挿入図：アップコンフォメーションにあるＲＢＤ上の、ＶＨＨ３．１１７結合性部位が、隣接するスパイクプロトマーのＮ末端ドメインにより、部分的にふさがれている。 結合している抗体ＣＢ６およびｍＡｂ５２の表示を伴う、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤについての表面表示を示す図である。ＲＢＤ内のＶＨＨ３．１１７結合性領域を、ライトグレーで、かつ、矢印により指し示す。 Ｎａｎｏｂｏｄｙである、ｎｂ３４およびｎｂ９５のエピトープ（Ｘｉａｎｇら、２０２０、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３７０：１４７９～１４８４；Ｓｕｎら、２０２１、ＢｉｏＲｘｉｖ、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２１．０３．０９．４３４５９２）のほか、ＶＨＨ３．１１７のエピトープの表示を伴う、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤについての表面表示を示す図である。エピトープ領域は、アステリスクでマークする。 異なるファミリーに由来するＶＨＨによる、ＶＨＨ７２の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤへの結合の、用量依存的阻害を示す図である。 ａｖｉタグ付けビオチニル化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ（最終濃度を、０．５ｎＭとする）、およびＦｌａｇタグ付けＶＨＨ７２ ｈ１ Ｓ５６Ａ（０．６ｎＭ）による、競合Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎである。同じ（スーパー）ファミリーに属するＶＨＨを、枠囲いで指し示す。 異なるファミリーに由来するＶＨＨによる、ＡＣＥ－２の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤへの結合の、用量依存的阻害を示す図である。 ａｖｉタグ付けビオチニル化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ（最終濃度を、１ｎＭとする）、およびヒトＡＣＥ－２－ｍＦｃ（０．２ｎＭ）による、競合Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎである。同じ（スーパー）ファミリーに属するＶＨＨを、枠囲いで指し示す。 ＶＨＨ３．８９は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤへの結合について、ＶＨＨ７２、Ｓ３０９、またはＣＢ６と競合しないが、ＶＨＨ３．１１７と競合する。（Ａ）ＶＨＨ３．８９の、十分に特徴付けられた抗体があらかじめ結合しているＲＢＤへの結合を示す図である。グラフは、ＥＬＩＳＡプレート上に直接コーティングされたか、またはコーティングされたＳ３０９、ＣＢ６、Ｄ７２－５３、およびＶＨＨ３．１１７（ＨＡタグを伴わない）により捕捉された、ＶＨＨ３．１１７（左パネル）、またはＶＨＨ３．８９（右パネル）と類縁であるＶＨＨ３．９２の希釈系列の、一価ヒトＦｃ（ＲＢＤ－ＳＤ１－ｍｏｎｏＦｃ）へと融合されたＲＢＤ－ＳＤ１への平均結合（４５０ｎｍにおけるＯＤ）および変動（ｎ＝２）を示す。ＲＳＶ Ｆタンパク質に対して方向付けられた抗体パリビズマブ（Ｓｙｎａｇｉｓ）により捕捉されたＲＢＤを、陰性対照として使用した。ＨＡタグ付けされた、ＶＨＨ３．９２およびＶＨＨ３．８９への結合は、抗ＨＡタグ抗体により検出した。（Ｂ）メッシュとして示される、Ｓ３０９、ＣＢ６、およびＶＨＨ７２により捕捉された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤについての表面表示である。ＲＢＤ表面の、黒および白の着色は、それぞれ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との間で、異なるか、または同一であるアミノ酸を指し示す。（Ｃ）ＶＨＨ３．１１７は、ＲＢＤの側面における凹状部位に結合する。ＲＢＤ表面表示における黒の着色は、ＲＢＤ突然変異体についての酵母表面提示に基づき、ＤＭＳ（ｄｅｅｐ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ）により決定される、置換が、ＶＨＨ３．１１７への結合の低減と関連するアミノ酸位置を指し示す。 ＶＨＨ３．８９が、ＲＢＤの、ＡＣＥ－２への結合を妨げないことを示す図である。ＶＨＨ３．８９またはＶＨＨ３．１１７の希釈系列と共にプレインキュベートされた、ＲＢＤ－ｍｕＦｃの、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞への結合（０．４ｕｇ／ｍｌ）についてのフローサイトメトリー解析を示す図である。ＲＢＤで処置されないＶｅｒｏ Ｅ６細胞（ＲＢＤなし）、およびＰＢＳまたは関連しない対照ＧＦＰをターゲティングするＶＨＨ（ｃｔｒｌ ＶＨＨ）と共にプレインキュベートされ、ＲＢＤ－ｍｕＦｃで染色されたＶｅｒｏ Ｅ６細胞を、対照として使用した。ＶＨＨ７２と類縁であり、ＲＢＤの、ＡＣＥ２への結合を遮断することが公知のＶＨＨである、ＶＨＨ３．１１５を、対照として使用した。ＲＢＤ－ｍｕＦｃへの結合は、ＡＦ６４７コンジュゲート抗マウスＩｇＧ抗体により検出した。グラフは、ＲＢＤ－ｍｕＦｃ（ＡＦ６４７のＭＦＩ）の、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞への結合（ｎ＝１）を示す。 ＶＨＨ３．８９が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１スパイクにより偽型化されたＶＳＶ－ΔＧを中和することを示す図である。（Ａ）ＶＨＨ３．８９は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクにより偽型化されたＶＳＶ－ｄｅｌＧを中和する。精製されたＶＨＨ３．８９、ＶＨＨ３．１１７、およびＶＨＨ３．９２、およびＶＨＨ３．８３による、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽型ＶＳＶ（ＶＳＶ－ΔＧスパイクＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の中和である。グラフは、各々が、各希釈系列中に含まれた、非感染試料、および感染ＰＢＳ処置試料に対して正規化された、四連希釈系列のＧＦＰ蛍光強度（ｎ＝４±ＳＥＭ）を示す。ＧＦＰに結合するＶＨＨである、ＧＢＰを、陰性対照として使用した。（Ｂ）ＶＨＨ３．８９は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１スパイクにより偽型化されたＶＳＶ－ｄｅｌＧを中和する。ＶＨＨ３．８９、ＶＨＨ３．１１７、ＶＨＨ３．９２、またはＶＨＨ３．８３を含有するＥ．ｃｏｌｉペリプラズム粗抽出物による、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１偽型ＶＳＶ（ＶＳＶ－ΔＧスパイクＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の中和である。グラフは、非感染試料、および感染ＰＢＳ処置試料に対して正規化された、ＧＦＰ蛍光強度値を示す。ＶＨＨに結合するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含有しない、ペリプラズム抽出物（ＰＥ対照）を、陰性対照として使用した。 ＶＨＨ３．８９が、多様な範囲にわたるサルベコウイルスのＲＢＤを認識することを示す図である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１近縁（クレード１ａ）サルベコウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２近縁（クレード１ｂ）サルベコウイルス、ならびにクレード２およびクレード３のコウモリＳＡＲＳ関連サルベコウイルスのＲＢＤに基づくクラドグラム（ＵＰＧＭＡ法）である。矢印は、ＲＢＤが、結合解析に組み入れられたウイルスを指し示す。 ＶＨＨ３．８９が、多様な範囲にわたるサルベコウイルスのＲＢＤを認識することを示す図である。被験サルベコウイルス間のアミノ酸保存度を提示する、赤（保存度が最高度である）～青（保存度が最低度である）で着色された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤについての表面表示である。保存解析および視覚化は、Ｓｃｏｐ３Ｄ（Ｖｅｒｍｅｉｒｅら、２０１５、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、１５（８）：１４４８～５２）、およびＰｙＭｏｌ（ＤｅＬａｎｏ、２００２）により行った。 ＶＨＨ３．８９が、多様な範囲にわたるサルベコウイルスのＲＢＤを認識することを示す図である。ＶＨＨ３．１１７およびＶＨＨ３．８９の希釈系列の、それらの表面における、表示のサルベコウイルスのＲＢＤを提示するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞への結合についてのフローサイトメトリー解析である。グラフは、被験ＲＢＤ変異体について、ＲＢＤを発現する細胞（ＦＩＴＣコンジュゲート抗ｍｙｃタグ抗体陽性）に結合しているＶＨＨを検出するのに使用される、ＡＦ６４７コンジュゲート抗マウスＩｇＧ抗体のＭＦＩの、ＲＢＤを発現しない細胞（ＦＩＴＣコンジュゲート抗ｍｙｃタグ抗体陰性）のＭＦＩに対する比を示す。 ＶＨＨ３．８９が、多様な範囲にわたるサルベコウイルスのＲＢＤを認識することを示す図である。ＶＨＨ３．８９は、酵母細胞ＥＬＩＳＡにおいて、クレード１および２全てのサルベコウイルスのＲＢＤに効率的に結合する。グラフは、ＶＨＨ３．８９およびＶＨＨ３．１１７の希釈系列の、それらの表面において、表示のサルベコウイルスのＲＢＤを発現するコーティング酵母細胞への結合（４５０ｎｍにおけるＯＤ）を示す。 ＶＨＨ３．１１７のヒト化変異体を示す図である。ＣＤＲは、ＡｂＭアノテーションに従い指し示し、アミノ酸配列の配列順番号付けを提示する。Ｘは、任意のアミノ酸、好ましくは、各々独立に、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、またはＶａｌである。 ＶＨＨ３．８９のヒト化変異体を示す図である。ＣＤＲは、ＡｂＭアノテーションに従い指し示し、アミノ酸配列の配列順番号付けを提示する。Ｘは、任意のアミノ酸、好ましくは、各々独立に、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、またはＶａｌである。 一価のＶＨＨ３．１１７およびＶＨＨ３．８９は、多様なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株を、強力に中和することを示す図である。表示の抗体または一価ＶＨＨの希釈系列を、元のＷｕｈａｎ（ＷＴ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株のＲＢＤ突然変異を含有するスパイクタンパク質により偽型化され、その後、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞に感染することが可能とされた、ＶＳＶｄｅｌＧウイルス粒子と共にインキュベートした。グラフは、希釈系列のＧＦＰ蛍光強度（ＶＨＨ３．１１７について、Ｎ＝３±ＳＤとし、ＶＨＨ３．８９、Ｓ３０９、ＣＢ６、およびパリビズマブについて、Ｎ＝１とする）を示し、各々を、この希釈系列の最高のＧＦＰ蛍光強度値、および感染モック処置細胞の最高のＧＦＰ蛍光強度値に対して正規化した。 一価のＶＨＨ３．１１７およびＶＨＨ３．８９は、多様なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株を、強力に中和することを示す図である。表示の抗体または一価ＶＨＨの希釈系列を、アルファＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株のＲＢＤ突然変異を含有するスパイクタンパク質により偽型化され、その後、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞に感染することが可能とされた、ＶＳＶｄｅｌＧウイルス粒子と共にインキュベートした。グラフは、希釈系列のＧＦＰ蛍光強度（ＶＨＨ３．１１７について、Ｎ＝３±ＳＤとし、ＶＨＨ３．８９、Ｓ３０９、ＣＢ６、およびパリビズマブについて、Ｎ＝１とする）を示し、各々を、この希釈系列の最高のＧＦＰ蛍光強度値、および感染モック処置細胞の最高のＧＦＰ蛍光強度値に対して正規化した。 一価のＶＨＨ３．１１７およびＶＨＨ３．８９は、多様なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株を、強力に中和することを示す図である。表示の抗体または一価ＶＨＨの希釈系列を、アルファ＋Ｅ４８４ＫＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株のＲＢＤ突然変異を含有するスパイクタンパク質により偽型化され、その後、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞に感染することが可能とされた、ＶＳＶｄｅｌＧウイルス粒子と共にインキュベートした。グラフは、希釈系列のＧＦＰ蛍光強度（ＶＨＨ３．１１７について、Ｎ＝３±ＳＤとし、ＶＨＨ３．８９、Ｓ３０９、ＣＢ６、およびパリビズマブについて、Ｎ＝１とする）を示し、各々を、この希釈系列の最高のＧＦＰ蛍光強度値、および感染モック処置細胞の最高のＧＦＰ蛍光強度値に対して正規化した。 一価のＶＨＨ３．１１７およびＶＨＨ３．８９は、多様なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株を、強力に中和することを示す図である。表示の抗体または一価ＶＨＨの希釈系列を、ベータＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株のＲＢＤ突然変異を含有するスパイクタンパク質により偽型化され、その後、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞に感染することが可能とされた、ＶＳＶｄｅｌＧウイルス粒子と共にインキュベートした。グラフは、希釈系列のＧＦＰ蛍光強度（ＶＨＨ３．１１７について、Ｎ＝３±ＳＤとし、ＶＨＨ３．８９、Ｓ３０９、ＣＢ６、およびパリビズマブについて、Ｎ＝１とする）を示し、各々を、この希釈系列の最高のＧＦＰ蛍光強度値、および感染モック処置細胞の最高のＧＦＰ蛍光強度値に対して正規化した。 一価のＶＨＨ３．１１７およびＶＨＨ３．８９は、多様なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株を、強力に中和することを示す図である。表示の抗体または一価ＶＨＨの希釈系列を、ベータ＋Ｐ３４８Ｌ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株のＲＢＤ突然変異を含有するスパイクタンパク質により偽型化され、その後、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞に感染することが可能とされた、ＶＳＶｄｅｌＧウイルス粒子と共にインキュベートした。グラフは、希釈系列のＧＦＰ蛍光強度（ＶＨＨ３．１１７について、Ｎ＝３±ＳＤとし、ＶＨＨ３．８９、Ｓ３０９、ＣＢ６、およびパリビズマブについて、Ｎ＝１とする）を示し、各々を、この希釈系列の最高のＧＦＰ蛍光強度値、および感染モック処置細胞の最高のＧＦＰ蛍光強度値に対して正規化した。 一価のＶＨＨ３．１１７およびＶＨＨ３．８９は、多様なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株を、強力に中和することを示す図である。表示の抗体または一価ＶＨＨの希釈系列を、カッパＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株のＲＢＤ突然変異を含有するスパイクタンパク質により偽型化され、その後、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞に感染することが可能とされた、ＶＳＶｄｅｌＧウイルス粒子と共にインキュベートした。グラフは、希釈系列のＧＦＰ蛍光強度（ＶＨＨ３．１１７について、Ｎ＝３±ＳＤとし、ＶＨＨ３．８９、Ｓ３０９、ＣＢ６、およびパリビズマブについて、Ｎ＝１とする）を示し、各々を、この希釈系列の最高のＧＦＰ蛍光強度値、および感染モック処置細胞の最高のＧＦＰ蛍光強度値に対して正規化した。 一価のＶＨＨ３．１１７およびＶＨＨ３．８９は、多様なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株を、強力に中和することを示す図である。表示の抗体または一価ＶＨＨの希釈系列を、デルタＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株のＲＢＤ突然変異を含有するスパイクタンパク質により偽型化され、その後、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞に感染することが可能とされた、ＶＳＶｄｅｌＧウイルス粒子と共にインキュベートした。グラフは、希釈系列のＧＦＰ蛍光強度（ＶＨＨ３．１１７について、Ｎ＝３±ＳＤとし、ＶＨＨ３．８９、Ｓ３０９、ＣＢ６、およびパリビズマブについて、Ｎ＝１とする）を示し、各々を、この希釈系列の最高のＧＦＰ蛍光強度値、および感染モック処置細胞の最高のＧＦＰ蛍光強度値に対して正規化した。 一価のＶＨＨ３．１１７およびＶＨＨ３．８９は、多様なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株を、強力に中和することを示す図である。表示の抗体または一価ＶＨＨの希釈系列を、イプシロンＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株のＲＢＤ突然変異を含有するスパイクタンパク質により偽型化され、その後、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞に感染することが可能とされた、ＶＳＶｄｅｌＧウイルス粒子と共にインキュベートした。グラフは、希釈系列のＧＦＰ蛍光強度（ＶＨＨ３．１１７について、Ｎ＝３±ＳＤとし、ＶＨＨ３．８９、Ｓ３０９、ＣＢ６、およびパリビズマブについて、Ｎ＝１とする）を示し、各々を、この希釈系列の最高のＧＦＰ蛍光強度値、および感染モック処置細胞の最高のＧＦＰ蛍光強度値に対して正規化した。 ＶＨＨ３．１１７－ＦｃおよびＶＨＨ３．８９－Ｆｃが、クレード１、クレード２、およびクレード３のサルベコウイルスのＲＢＤを認識することを示す図である。グラフは、ＶＨＨ３．１１７－Ｆｃの希釈系列の、それらの表面において、表示のサルベコウイルスのＲＢＤを発現するコーティング酵母細胞への結合（４５０ｎｍにおけるＯＤ）を示す。上パネルが、クレード１サルベコウイルスのＲＢＤを提示する酵母細胞への結合を示すのに対し、下パネルは、表示のクレード２サルベコウイルス、およびクレード３のサルベコウイルスである、ＢＭ４８－３１のＲＢＤを提示する酵母細胞への結合を示す。ＲＢＤを発現しない酵母細胞（空）を、陰性対照として使用した。各ＶＨＨ－Ｆｃおよびパリビズマブについて、これらの酵母細胞への結合曲線を、左パネルおよび右パネルの両方に、参照として示す。 ＶＨＨ３．１１７－ＦｃおよびＶＨＨ３．８９－Ｆｃが、クレード１、クレード２、およびクレード３のサルベコウイルスのＲＢＤを認識することを示す図である。グラフは、ＶＨＨ３．８９－Ｆｃの希釈系列の、それらの表面において、表示のサルベコウイルスのＲＢＤを発現するコーティング酵母細胞への結合（４５０ｎｍにおけるＯＤ）を示す。上パネルが、クレード１サルベコウイルスのＲＢＤを提示する酵母細胞への結合を示すのに対し、下パネルは、表示のクレード２サルベコウイルス、およびクレード３のサルベコウイルスである、ＢＭ４８－３１のＲＢＤを提示する酵母細胞への結合を示す。ＲＢＤを発現しない酵母細胞（空）を、陰性対照として使用した。各ＶＨＨ－Ｆｃおよびパリビズマブについて、これらの酵母細胞への結合曲線を、左パネルおよび右パネルの両方に、参照として示す。 ＶＨＨ３．１１７－ＦｃおよびＶＨＨ３．８９－Ｆｃが、クレード１、クレード２、およびクレード３のサルベコウイルスのＲＢＤを認識することを示す図である。グラフは、パリビズマブの希釈系列の、それらの表面において、表示のサルベコウイルスのＲＢＤを発現するコーティング酵母細胞への結合（４５０ｎｍにおけるＯＤ）を示す。上パネルが、クレード１サルベコウイルスのＲＢＤを提示する酵母細胞への結合を示すのに対し、下パネルは、表示のクレード２サルベコウイルス、およびクレード３のサルベコウイルスである、ＢＭ４８－３１のＲＢＤを提示する酵母細胞への結合を示す。ＲＢＤを発現しない酵母細胞（空）を、陰性対照として使用した。各ＶＨＨ－Ｆｃおよびパリビズマブについて、これらの酵母細胞への結合曲線を、左パネルおよび右パネルの両方に、参照として示す。 ＶＨＨ３．１１７－Ｆｃが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＷＴおよびオミクロン変異株の、組換え安定化スパイクタンパク質への結合を示す図である。パリビズマブ、Ｓ３０９、およびＶＨＨ３．１１７の、Ｗｕｈａｎ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの組換えＨｅｘａＰｒｏ安定化スパイクタンパク質（スパイク６Ｐ）（Ａ）、Ｗｕｈａｎ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＢＡ．１オミクロン変異株の組換えＨｅｘａＰｒｏ安定化スパイクタンパク質（スパイク６Ｐ）（Ｂ）、およびＢＳＡ（Ｃ）への結合についてのＥＬＩＳＡ解析である。グラフは、表示の抗体について、４５０におけるＯＤ（ＶＨＨ３．１１７－Ｆｃについて、Ｎ＝２＋ＳＤとし、パリビズマブおよびＳ３０９について、Ｎ＝１とする）を示す。 ＢＬＩにより測定された、ＶＨＨ－Ｆｃ構築物の、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ ＷＴおよびオミクロン変異株のＲＢＤおよびスパイクタンパク質に対する結合反応速度を示す図である。１００～６．２５ｎＭ（２倍の希釈系列）の濃度における、ＶＨＨ３．１１７－Ｆｃの、ＡＨＣ（ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ ｃａｐｔｕｒｅ）バイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）上に固定化された、一価ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２＿ＲＢＤ－Ｈｉｓに対する結合反応速度である。グレーの実線は、二重参照控除データを表し、点線は、グローバル１：１結合モデルへの当てはめを表す。 ＢＬＩにより測定された、ＶＨＨ－Ｆｃ構築物の、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ ＷＴおよびオミクロン変異株のＲＢＤおよびスパイクタンパク質に対する結合反応速度を示す図である。１００～６．２５ｎＭ（２倍の希釈系列）の濃度における、ＶＨＨ７２－Ｓ５６Ａ－Ｆｃの、ＡＨＣ（ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ ｃａｐｔｕｒｅ）バイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）上に固定化された、一価ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＢＡ．１／Ｏｍｉｃｒｏｎ＿ＲＢＤ－Ｈｉｓに対する結合反応速度である。グレーの実線は、二重参照控除データを表し、点線は、グローバル１：１結合モデルへの当てはめを表す。３つの顕著に異なるＢＬＩ解析についての代表的実験を示す。反応速度パラメータは、三連実験の平均である。 ＢＬＩにより測定された、ＶＨＨ－Ｆｃ構築物の、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ ＷＴおよびオミクロン変異株のＲＢＤおよびスパイクタンパク質に対する結合反応速度を示す図である。１００～６．２５ｎＭ（２倍の希釈系列）の濃度における、ＶＨＨ３．８９－Ｆｃの、ＡＨＣ（ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ ｃａｐｔｕｒｅ）バイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）上に固定化された、一価ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＢＡ．１／Ｏｍｉｃｒｏｎ＿ＲＢＤ－Ｈｉｓに対する結合反応速度である。グレーの実線は、二重参照控除データを表し、点線は、グローバル１：１結合モデルへの当てはめを表す。３つの顕著に異なるＢＬＩ解析についての代表的実験を示す。反応速度パラメータは、三連実験の平均である。 ＢＬＩにより測定された、ＶＨＨ－Ｆｃ構築物の、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ ＷＴおよびオミクロン変異株のＲＢＤおよびスパイクタンパク質に対する結合反応速度を示す図である。１００～６．２５ｎＭ（２倍の希釈系列）の濃度における、ＶＨＨ３．１１７－Ｆｃの、ＡＨＣ（ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ ｃａｐｔｕｒｅ）バイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）上に固定化された、一価ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＢＡ．１／Ｏｍｉｃｒｏｎ＿ＲＢＤ－Ｈｉｓに対する結合反応速度である。グレーの実線は、二重参照控除データを表し、点線は、グローバル１：１結合モデルへの当てはめを表す。３つの顕著に異なるＢＬＩ解析についての代表的実験を示す。反応速度パラメータは、三連実験の平均である。 ＢＬＩにより測定された、ＶＨＨ－Ｆｃ構築物の、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ ＷＴおよびオミクロン変異株のＲＢＤおよびスパイクタンパク質に対する結合反応速度を示す図である。単一濃度（２００ｎＭ）における、ＶＨＨ３．８９－ＦｃおよびＶＨＨ３．１１７－Ｆｃの、ＡＨＣ（ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ ｃａｐｔｕｒｅ）バイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）上に固定化された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＷＴスパイク６Ｐに対する結合反応速度である。３つの顕著に異なる、二連のＢＬＩ解析についての代表的実験を示す。結合モデルは、２：３（固定化二価ＶＨＨ－Ｆｃ、三量体解析物）相互作用に当てはめられなかった。ＷＴスパイク６Ｐについて観察されたシグナルの差違は、スパイク濃縮のために使用された方法の変動（ＷＴは、自社内で作製／定量されたが、オミクロン株は、Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製である）により引き起こされた可能性が高い。 ＢＬＩにより測定された、ＶＨＨ－Ｆｃ構築物の、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ ＷＴおよびオミクロン変異株のＲＢＤおよびスパイクタンパク質に対する結合反応速度を示す図である。単一濃度（２００ｎＭ）における、ＶＨＨ３．８９－ＦｃおよびＶＨＨ３．１１７－Ｆｃの、ＡＨＣ（ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ ｃａｐｔｕｒｅ）バイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）上に固定化された、一価ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＢＡ．１／オミクロンスパイク６Ｐに対する結合反応速度である。３つの顕著に異なる、二連のＢＬＩ解析についての代表的実験を示す。結合モデルは、２：３（固定化二価ＶＨＨ－Ｆｃ、三量体解析物）相互作用に当てはめられなかった。オミクロンスパイク６Ｐについて観察されたシグナルの差違は、スパイク濃縮のために使用された方法の変動（ＷＴは、自社内で作製／定量されたが、オミクロン株は、Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製である）により引き起こされた可能性が高い。 ＶＨＨ３．１１７－ＦｃおよびＶＨＨ３．９２－Ｆｃが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質により偽型化されたＶＳＶウイルスを中和することを示す図である。ＶＨＨ３．１１７－Ｆｃの希釈系列およびＶＨＨ３．９２－Ｆｃを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質により偽型化され、その後、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞に感染することが可能とされた、ＶＳＶｄｅｌＧウイルス粒子と共にインキュベートした。グラフは、各々が、各希釈系列中に含まれた、非感染対照細胞、および感染非処置対照細胞の、ＧＦＰ蛍光強度値に対して正規化された、ＶＨＨ－Ｆｃの希釈系列の平均値ＧＦＰ蛍光強度（Ｎ＝３±ＳＤ）を示す。 ＶＨＨ３．１１７－Ｆｃが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のデルタ変異株およびガンマ変異株を中和することを示す図である。ＶＨＨ３．１１７－ＦｃおよびＶＨＨ３．９２－Ｆｃは、ＷＴ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質（上パネル）、またはデルタ変異株内に存在するＲＢＤ突然変異を含有するスパイクタンパク質（下パネル）により偽型化されたＶＳＶｄｅｌＧウイルス粒子を中和する。グラフは、各々が、各希釈系列中に含まれた、非感染対照細胞、および感染非処置対照細胞の、ＧＦＰ蛍光強度値に対して正規化された、ＶＨＨ－Ｆｃの希釈系列の平均値ＧＦＰ蛍光強度（Ｎ＝３±ＳＥＭ）を示す。 ＶＨＨ３．１１７－Ｆｃが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のデルタ変異株およびガンマ変異株を中和することを示す図である。ＶＨＨ３．１１７－Ｆｃは、ＷＴ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質（上パネル）、またはガンマ変異株内に存在するＲＢＤ突然変異を含有するスパイクタンパク質（下パネル）により偽型化されたＶＳＶｄｅｌＧウイルス粒子を中和する。グラフは、各々が、各希釈系列中に含まれた、非感染対照細胞のＧＦＰ蛍光強度値、および最低濃度で処置された細胞のＧＦＰ蛍光強度値に対して正規化された、ＶＨＨ－Ｆｃの希釈系列の平均値ＧＦＰ蛍光強度（ＶＨＨ３．１１７－ＦｃおよびＣＢについて、Ｎ＝２±ＳＤとし、パリビズマブについて、Ｎ＝１とする）を示す。 ＶＨＨ３．１１７－Ｆｃが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オミクロンＢＡ．１変異株を中和しうることを示す図である。ＶＨＨ３．１１７－Ｆｃの希釈系列、Ｓ３０９、およびパリビズマブを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ６１４Ｇスパイクタンパク質変異体により偽型化され、その後、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞に感染することが可能とされた、ＶＳＶｄｅｌＧウイルス粒子と共にインキュベートした。グラフは、各々が、各希釈系列中に含まれた、非感染対照細胞、および感染非処置対照細胞の、ＧＦＰ蛍光強度値に対して正規化された、ＶＨＨ－Ｆｃの希釈系列の平均値ＧＦＰ蛍光強度（Ｎ＝２±ＳＤ）を示す。 ＶＨＨ３．１１７－Ｆｃが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オミクロンＢＡ．１変異株を中和しうることを示す図である。ＶＨＨ３．１１７－Ｆｃの希釈系列、Ｓ３０９、およびパリビズマブを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オミクロンＢＡ．１変異株スパイクタンパク質により偽型化され、その後、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞に感染することが可能とされた、ＶＳＶｄｅｌＧウイルス粒子と共にインキュベートした。グラフは、各々が、各希釈系列中に含まれた、非感染対照細胞、および感染非処置対照細胞の、ＧＦＰ蛍光強度値に対して正規化された、ＶＨＨ－Ｆｃの希釈系列の平均値ＧＦＰ蛍光強度（Ｎ＝２±ＳＤ）を示す。 ＶＨＨ３．１１７－Ｆｃが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１を中和しうることを示す図である。ＶＨＨ３．１１７－ＦｃおよびＳ３０９の希釈系列を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（Ａ）、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１スパイクタンパク質（Ｂ）により偽型化され、その後、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞に感染することが可能とされた、ＶＳＶｄｅｌＧウイルス粒子と共にインキュベートした。グラフは、各々が、各希釈系列中に含まれた、非感染対照細胞、および感染非処置対照細胞の、ＧＦＰ蛍光強度値に対して正規化された、ＶＨＨ－Ｆｃの希釈系列の平均値ＧＦＰ蛍光強度（ＶＳＶｄｅｌＧ－スパイクＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２について、Ｎ＝２±ＳＤとし、ＶＳＶｄｅｌＧ－スパイクＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１について、Ｎ＝３±ＳＤとする）を示す。 ＶＨＨ３．１１７－Ｆｃが、ヒトＴＭＰＲＳＳ２を安定的に発現するＶｅｒｏ Ｅ６細胞上において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクにより偽型化されたＶＳＶｄｅｌＧウイルス粒子を中和することを示す図である。ＶＨＨ３．１１７－Ｆｃの希釈系列を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質により偽型化され、その後、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞、またはＶｅｒｏ Ｅ６ ＴＭＰＲＳＳ２細胞に感染することが可能とされた、ＶＳＶｄｅｌＧウイルス粒子と共にインキュベートした。グラフは、各々が、各希釈系列中に含まれた、非感染対照細胞、および感染非処置対照細胞の、ＧＦＰ蛍光強度値に対して正規化された、ＶＨＨ－Ｆｃの希釈系列の平均値ＧＦＰ蛍光強度（Ｎ＝３±ＳＥＭ）を示す。 ＶＨＨ３．１１７－Ｆｃが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含有する、複製コンピテントＶＳＶウイルスを中和することが可能であることを示す図である。ＶＨＨ３．１１７、ＶＨＨ３．８９、またはＶＨＨ３．１１７－Ｆｃの希釈系列を、Ｋｏｅｎｉｇら（Ｋｏｅｎｉｇら（２０２１）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３７１：ｅａｂｅ６２３０）により記載されている、複製コンピテントＶＳＶ Ｓ１－１ａ ＷＴ ＶＳＶウイルスと共にインキュベートし、２日間にわたり、Ｖｅｒｏ Ｅ６に感染することを可能とした。グラフは、各々が、各希釈系列中に含まれた、非感染対照細胞、および感染非処置対照細胞の、ＧＦＰ蛍光強度値に対して正規化された、ＶＨＨ－Ｆｃの希釈系列の平均値ＧＦＰ蛍光強度（ＶＨＨ３．１１７およびＶＨＨ３．８９について、Ｎ＝３±ＳＥＭとし、ＶＨＨ３．１１７－Ｆｃについて、Ｎ＝２±ＳＤとする）を示す。 ＶＨＨ３．１１７およびＶＨＨ３．８９－Ｆｃが、スパイクＳ１サブユニットの未成熟排出を誘導することを示す図である。（Ａ）ＶＨＨ７２－ＦｃおよびＶＨＨ３．１１７は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を発現する細胞からの、Ｓ１部の排出を誘導する。（Ｂ）ＶＨＨ３．８９－Ｆｃは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を発現する細胞からの、Ｓ１部の排出を誘導する。表示のＶＨＨ構築物または抗体と共に、３０分間にわたりインキュベートされた、増殖培地、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を発現するＲａｊｉ細胞（Ｒａｊｉスパイク）、またはこれを発現しないＲａｊｉ細胞（Ｒａｊｉ）の細胞溶解物についての、抗Ｓ１ウェスタンブロット解析を示す。ブロット右側の下方および上方における三角は、それぞれ、スパイクタンパク質の、フーリン媒介切断の後において作出されたＳ１スパイクサブユニット、および切断されなかった細胞内スパイクタンパク質を指し示す。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＲＢＤへの結合を介して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和しうる、ＶＨＨ３．８９ファミリーメンバーである、ＶＨＨ３．１８３の同定を示す図である。ＶＨＨ３．８９（ＰＥ＿８９）およびＶＨＨ３．１８３（ＰＥ＿１８３）を発現するＥ ｃｏｌｉ細胞のペリプラズム抽出物（ＰＥ）中に存在するＶＨＨは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質およびＲＢＤに結合する。グラフは、ＥＬＩＳＡにより調べられた、ＢＳＡ、ＲＢＤ、およびスパイクタンパク質の、ＰＥ＿１２、ＰＥ＿８９、およびＰＥ＿１８３への結合（４５０ｎｍにおけるＯＤ）を示す。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＲＢＤへの結合を介して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和しうる、ＶＨＨ３．８９ファミリーメンバーである、ＶＨＨ３．１８３の同定を示す図である。ＶＨＨ３．８９（ＰＥ＿８９）およびＶＨＨ３．１８３（ＰＥ＿１８３）を発現するＥ ｃｏｌｉ細胞のペリプラズム抽出物中に存在するＶＨＨは、ＶＳＶｄｅｌＧスパイク偽型ウイルスを中和することが可能である。グラフは、１６、８０、および４００倍に希釈されたＰＥ＿１２、ＰＥ＿８９、およびＰＥ＿１８３と共にプレインキュベートされた、ルシフェラーゼ－ＧＦＰを発現させるＶＳＶｄｅｌＧスパイク偽型ウイルスを感染させられた細胞のルシフェラーゼシグナルを示す。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＲＢＤへの結合を介して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和しうる、ＶＨＨ３．８９ファミリーメンバーである、ＶＨＨ３．１８３の同定を示す図である。ＶＨＨ３．８９およびＶＨＨ３．１８３のアミノ酸配列のアライメントである。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＲＢＤへの結合を介して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和しうる、ＶＨＨ３．８９ファミリーメンバーである、ＶＨＨ３．１８３の同定を示す図である。ＷＫ６ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞により産生された、表示の精製ＶＨＨについての、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに続く、クーマシー染色である。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＲＢＤへの結合を介して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和しうる、ＶＨＨ３．８９ファミリーメンバーである、ＶＨＨ３．１８３の同定を示す図である。精製ＶＨＨ３．１８３は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクにより偽型化されたＶＳＶｄｅｌＧウイルス粒子を中和しうることを示す図である。ＶＨＨ３．１８３およびＶＨＨ３．８９の希釈系列を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質により偽型化され、その後、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞に感染することが可能とされた、ＶＳＶｄｅｌＧウイルス粒子と共にインキュベートした。グラフは、各々が、各希釈系列中に含まれた、非感染対照細胞、および感染非処置対照細胞の、ＧＦＰ蛍光強度値に対して正規化された、ＶＨＨの希釈系列のＧＦＰ蛍光強度を示す。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＲＢＤへの結合を介して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和しうる、ＶＨＨ３．８９ファミリーメンバーである、ＶＨＨ３．１８３の同定を示す図である。ＢＬＩにより測定された、ＡＨＣ（ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ ｃａｐｔｕｒｅ）バイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）上に固定化された、単量体ヒトＦｃ融合ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２＿ＲＢＤ－ＳＤ１に結合する、単一濃度（２００ｎＭ）における、一価ＶＨＨ３．８９および一価ＶＨＨ３．１８３のオフ速度である。黒の実線（ＶＨＨ３．８９）およびグレーの実線（ＶＨＨ３．１８３）は、二重参照控除データを表し、点線は、三連データの、グローバル１：１結合モデルへの当てはめを表す。 ＤＭＳ（ｄｅｅｐ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ）による、突然変異させられた場合に、ＶＨＨ３．１１７およびＶＨＨ３．８９への結合を喪失しうる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤのアミノ酸位置の決定を示す図である。ＶＨＨ３．１１７により得られ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤの全長（「部位」軸上に指し示されたアミノ酸位置）にわたりプロットされた、ＤＭＳ（ｄｅｅｐ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ）シグナル（回避％として表される）である。 ＤＭＳ（ｄｅｅｐ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ）による、突然変異させられた場合に、ＶＨＨ３．１１７およびＶＨＨ３．８９への結合を喪失しうる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤのアミノ酸位置の決定を示す図である。ＶＨＨ３．８９により得られ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤの全長（「部位」軸上に指し示されたアミノ酸位置）にわたりプロットされた、ＤＭＳ（ｄｅｅｐ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ）シグナル（回避％として表される）である。 ＤＭＳ（ｄｅｅｐ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ）による、突然変異させられた場合に、ＶＨＨ３．１１７およびＶＨＨ３．８９への結合を喪失しうる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤのアミノ酸位置の決定を示す図である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤのアミノ酸配列（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１分離株のスパイクタンパク質アミノ酸位置３３６～５２５）を示し、ＤＭＳ（ｄｅｅｐ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ）により決定される、置換が、ＶＨＨ３．１１７への結合の喪失と関連したアミノ酸を、ボックス内に指し示す。 ＤＭＳ（ｄｅｅｐ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ）による、突然変異させられた場合に、ＶＨＨ３．１１７およびＶＨＨ３．８９への結合を喪失しうる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤのアミノ酸位置の決定を示す図である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤのアミノ酸配列（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１分離株のスパイクタンパク質アミノ酸位置３３６～５２５）を示し、ＤＭＳ（ｄｅｅｐ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ）により決定される、置換が、ＶＨＨ３．８３への結合の喪失と関連したアミノ酸を、ボックス内に指し示す。 ＶＨＨ３．８９およびＶＨＨ３．１１７の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＳＣ２）スパイクタンパク質のＲＢＤへの結合方式を示す図である。左列、中列、および右列は、ＳＣ２ ＲＢＤ（左列）、ならびに正面図（上行）、および右への９０度回転図（中行）、または左への９０度回転図（下行）に示された、ＶＨＨ３．８９（中列）、またはＶＨＨ３．１１７（右列）との、その複合体を示す。ＶＨＨと複合体化したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の複合体は、ｃｒｙｏＥＭにより決定され（図４０を参照されたい）、ライトグレー（ＳＣ２ ＲＢＤ）、ダークグレー（ＶＨＨ３．８９）、またはミディアムグレー（ＶＨＨ３．１１７）で着色された、溶媒アクセス可能表面として示される。ＤＭＳ（ｄｅｅｐ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ）により、ＳＣ２ ＲＢＤ表面上において、ＶＨＨ３．８９、および／またはＶＨＨ３．１１７への結合についての回避突然変異として同定された残基（図３８）を、スティック表示で示し、記号表示し、ダークグレーで強調し；ｃｒｙｏ－ＥＭ実験により、ＶＨＨ３．８９ファミリーメンバー、およびＶＨＨ３．１１７ファミリーメンバーの結合剤への結合のための最小限の共通コア（または「エピトープコア」；残基である、Ｒ３５５、Ｎ３９４、Ｙ３９６、Ｙ４６４、Ｓ５１４、およびＥ５１６を含む）を形成する残基として提起された残基を、スティック表示で示し、黒で着色し、記号表示し、枠囲いにより強調する。エピトープコアは、約３００Å２を取り囲む、連続表面領域を形成する。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に結合しているＶＨＨ３．８９およびＶＨＨ３．１１７の、ｃｒｙｏ－ＥＭによる再構成を示す図である。側面図（左）および上面図（中）に示される、ＶＨＨ３．１１７（上；分解能を３Åとする）、またはＶＨＨ３．８９（下；分解能を３．１Åとする）と複合体化した、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（ＳＣ２）についての静電ポテンシャルマップである。右図に、表面表示により示され、ＲＢＤ１～３およびＮＴＤ１～３と記号表示された、３つのＳＣ２プロトマーの、ＲＢＤ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）およびＮ末端ドメインを伴う、ＳＣ２－ＶＨＨ複合体の、精密ｃｒｙｏ－ＥＭ構造を示す。ＳＣ２－ＶＨＨ３．１１７複合体内では、プロトマーの各々の中のＲＢＤドメインは、コンフォメーション的に同様のアップ位置にあり、各々、単一のＶＨＨ３．１１７が結合している。ＳＣ２－ＶＨＨ３．８９複合体内では、３つのＲＢＤドメインは、全て、アップ位置にあるが、ＳＣ２コアに対して、異なる角度にある。２つのＶＨＨ３．８９コピーは、１つのコピーが、ＳＣ２プロトマー１のＲＢＤ（ＲＢＤ－１と記号表示される）に結合しており、第２のコピーが、ＳＣ２プロトマー２のＲＢＤ（ＲＢＤ－２）に結合している。ＲＢＤ－３は、ｃｒｙｏ－ＥＭマップ内では、規定不十分であり、コンフォメーション上の大きな柔軟性を指し示す。この実験に基づき、ＶＨＨ３．１１７およびＶＨＨ３．８９は、大部分が、残基である、Ｒ３５５、Ｎ３９４、Ｙ３９６、Ｙ４６４、Ｓ５１４、およびＥ５１６を含み、アポＳＣ２タンパク質のＲＢＤダウンコンフォメーションにおいて遮蔽されている共通エピトープに結合することが提起される。 ＶＨＨ３．８９と、ＶＨＨ３．１１７とが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質上の、大部分において重複するエピトープをターゲティングすることを示す図である。ＶＨＨ３．８９およびＶＨＨ３．１１７のエピトープと比べた、溶媒アクセス可能表面、および正面図として示された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ（残基３３０～５３０）の構造である。ＤＭＳ（ｄｅｅｐ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ）により、ＳＣ２ ＲＢＤ表面上において、ＶＨＨ３．８９、および／またはＶＨＨ３．１１７への結合についての回避突然変異として同定された残基（図３８）を、スティック表示で示し、記号表示し、ダークグレーで強調し；本明細書で、ｃｒｙｏ－ＥＭ実験により、ＶＨＨ３．８９ファミリーメンバー、およびＶＨＨ３．１１７ファミリーメンバーの結合剤への結合のための最小限の共通コア（または「エピトープコア」；残基である、Ｒ３５５、Ｎ３９４、Ｙ３９６、Ｙ４６４、Ｓ５１４、およびＥ５１６を含む）を形成する残基として提起された残基を、スティック表示で示し、黒で着色し、記号表示し、枠囲いにより強調する。エピトープコアは、約３００Å２を取り囲む、連続表面領域を形成する。ＶＨＨ３．８９の、ＳＣ２ ＲＢＤのエピトープコアへの結合は、－２．３キロカロリー／モルのギブス自由エネルギー計算値（ＰＤＢｅ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ Ｅｕｒｏｐｅ）ＰＩＳＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ）により決定される）により、約２９０Å２の表面の包埋を結果としてもたらす。 本明細書で使用される、ＶＨＨ３．１１７およびＶＨＨ３．８９のアミノ酸配列、ならびに異なるＣＤＲアノテーションの例示を示す図である。ＶＨＨ３．１１７およびＶＨＨ３．８９の配列に対応する、グレーで表示されたボックス内における、ＭａｃＣａｌｌｕｍ、ＡｂＭ、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｋａｂａｔ、およびＩＭＧＴに従うＣＤＲアノテーションである。 図３９に提示されたｃｒｙｏＥＭ構造内で観察される、ＶＨＨ３．８９と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤとの間の結合界面についての詳細図である。ＶＨＨ３．８９のコアエピトープ残基を、太いスティック表示で指し示し、対応付けて記号表示し、次いで、矢印により指し示す。これらのコアエピトープ残基と接触する、ＶＨＨ３．８９の残基もまた、対応付けて記号表示し、次いで、矢印により指し示す。ＶＨＨ３．８９アミノ酸側鎖原子と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤアミノ酸側鎖原子との間の距離の測定は、ＰｙＭＯＬにより行い、測定された接触部を、点線で指し示し、測定された距離を、オングストローム単位で指し示す。これらの接触部の全ては、４オングストロームを下回る。測定の状況をよりよく視覚化するために、２つ異なる角度からの界面を図示する。
本発明は、特定の実施形態に関して、ある特定の図面を参照しながら記載されるが、本発明は、これらに限定されず、特許請求の範囲だけにより限定される。特許請求の範囲における、任意の参照記号は、範囲の限定としてはみなされないものとする。当然ながら、必ずしも、全ての態様または利点が、本発明の、任意の特定の実施形態に従い達成されうるわけではないことが理解されるものとする。したがって、例えば、当業者は、本発明が、必ずしも、本明細書で、教示または示唆されうる、他の態様または利点を達成するわけではないが、本明細書で教示される、１つの利点または利点群を達成または最適化する形で、実施または実行されうることを認識するであろう。本発明は、その特色および利点と併せて、付属の図面と共に読まれる場合の、以下の「発明を実施するための形態」を参照することにより、最も良く理解されうる。本発明の態様および利点は、本明細書の以下で記載される実施形態（複数可）から明らかとなり、これらを参照して解明されるであろう。本明細書を通した、「一実施形態」または「ある実施形態」への言及は、実施形態との関連で記載される、特定の特色、構造、または特徴が、本発明の、少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書を通した、多様な箇所における、「一実施形態では」または「ある実施形態では」という語句の出現は、必ずしも、全てが、同じ実施形態に言及するわけではないが、その場合もある。同様に、本発明の例示的実施形態についての記載において、本発明の多様な特色が、場合によって、本開示を簡素化し、本発明の多様な態様のうちの１つまたは複数の理解の一助となることを目的として、単一の実施形態、図、またはこれらについての記載に、併せて群分けされることを理解されたい。しかし、開示のこの方法は、特許請求される発明が、各請求項で、明示的に列挙された特色より多くの特色を要求することの意図を反映するものとして解釈されるわけではない。
本発明へと至る研究は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ウイルス、およびＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２コロナウイルスなどの、サルベコウイルスのスパイクタンパク質内に存在する、ＲＢＤ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）上のエピトープと、特異的に相互作用する結合剤を同定した。薬剤と、スパイクタンパク質との結合は、ＲＢＤの、ＡＣＥ－２との結合を阻害せずに、サルベコウイルスの感染能の中和を結果としてもたらす。本明細書で記載される結合剤は、Ｓ１部の排出を誘導し、この結果として、未成熟スパイクの惹起を誘導し、いかなる理論に束縛されることも望まずに述べると、このようにして、サルベコウイルスが、感染過程または宿主細胞への侵入過程を完遂することを不可能としうる。エピトープの特徴付けにおいて、本結合剤は、複数クレードのサルベコウイルスのＲＢＤ内で極めて保存的であるＲＢＤアミノ酸と相互作用することが見出されたが、これは、エピトープが安定的であり、高頻度の突然変異性変化を受けないことを指し示す。このようなサルベコウイルス中和剤は、それらの一部が、より強い感染力を有し、かつ／またはより重度の疾患症状を引き起こし（若齢者における重度の疾患症状を含む）、かつ／または現在のところ利用可能である全体的に未だ限定数にとどまるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２処置選択肢に追加されるべき必要なツールである既存のワクチンおよび／もしくは診断検査の一部を回避する複数の新興ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株を念頭に置く。本明細書で同定される結合剤のほか、それらの適用については、本明細書の下記で、より詳細に記載される。しかし、まず、サルベコウイルスについて、今少しの背景が提示される。
サルベコウイルス／Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ
Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科は、その名称が、ウイルス表面上に存在し、ビリオンに、王冠様の形状を与える、大型のスパイクタンパク質分子に由来する。Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ（Ｃｏｒｏｎｏｖｉｒｉｄａｅ）科は、４つの属：Ａｌｐｈａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ属、Ｂｅｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ属、Ｇａｍｍａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ属、およびＤｅｌｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ属を含む。コロナウイルスは、広範な動物、多種多様な脊椎動物種、およびヒトに感染する、エンベロープが大型である、プラス鎖ＲＮＡウイルスの、多様なファミリーを表す。コロナウイルスのスパイク（Ｓ）タンパク質は、宿主の受容体への結合、および後続する、ウイルスと、宿主細胞膜との融合に不可欠であり、宿主細胞の細胞質中への、ウイルスのヌクレオカプシドの放出を、効果的に結果としてもたらす（Ｌｅｔｋｏら、２０２０、Ｎａｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５：５６２～５６９）。人畜共通由来であると推定される、４つのコロナウイルス：ＨＣｏＶ－ＮＬ６３およびＨＣｏＶ－２２９Ｅ（αコロナウイルス）およびＨＣｏＶ－ＯＣ４３およびＨＣｏＶ－ＨＫＵ１（βコロナウイルス）は、ヒトにおける、風土病性ウイルスである。加えて、２０００年以来、βコロナウイルスにより引き起こされる、重度呼吸器疾患のエピソードが、３例生じている。２００２年に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１により引き起こされる、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）は、人畜共通由来（中間種としてのハクビシンを介する、コウモリ）から出現し、２００４年に消滅した（Ｄｒｏｓｔｅｎら、２００３、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、３４８：１９６７～１９７６）。８０００例を超えるＳＡＲＳ症例は、死亡率が、約１０％であることが報告された。２０１２年には、アラビア半島で、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）が出現した。ＭＥＲＳは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶにより引き起こされ、２５００例を超える症例において確認されており、症例の致死率は、３４％である（ｄｅ Ｇｒｏｏｔら、２０１３、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｖｉｒｏｌ、８７：７７９０～７７９２）。２０１９年末に、新型βコロナウイルスにより引き起こされ、今日では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１との、その遺伝子的関係を踏まえ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２として公知である、第３の人畜共通ヒトコロナウイルスが、重症市中肺炎の症例と共に、武漢（中国）市内で出現したことが報告された（Ｃｈｅｎら、２０２０、Ｌａｎｃｅｔ、ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ０１４０－６７３６（２０）３０２１１－７）。重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）感染、および中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）感染と同様に、患者は、発熱、呼吸困難、および、最も重度の症例では、両側肺浸潤を含む、ウイルス性肺炎の症状を呈した（Ｇｒａｌｉｎｓｋｉら、２０２０、Ｖｉｒｕｓｅｓ、１２：１３５）。重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、ＣＯＶＩＤ－１９の原因作用物質である（Ｚｈｕら、２０２０、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、３８２：７２７～７３３）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染は、無症状性の場合もあり、軽症～中等症を呈する場合もある。しかし、患者のうちの約１０％では、ＣＯＶＩＤ－１９は、呼吸困難および低酸素状態により特徴付けられる、より重度の段階へと進行し、さらに、長期にわたる集中治療を要求することが多く、ある割合の患者では、死を引き起こす、急性呼吸逼迫状態へと進行することもある。「ＣＯＶＩＤ罹患後症」は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが、もはや検出されなくなってもなお長期にわたる、ＣＯＶＩＤ－１９感染の影響をさらに指す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する自然免疫認識により誘発され、おそらくまた、無効の免疫応答に由来する抗体との免疫複合体によっても誘発される（Ｓｈｒｏｃｋら、２０２０、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３７０（６５２０）：ｅａｂｄ４２５０）、進行中の炎症は、重度疾患の進行に寄与する可能性が最も高い。
入手可能な、最初のゲノム配列は、新規のヒト病原体ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅのうちの、ＳＡＲＳウイルスと同じ亜属である、Ｓａｒｂｅｃｏｖｉｒｕｓ亜属に配置した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ（系統Ｂ）およびＭＥＲＳ－ＣｏＶ（系統Ｃ）と同じＢｅｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ属に属するが、ゲノム解析が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶとの間で、より大きな類似性を明らかにしたことは、系統Ｂのメンバーとしての、その分類（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ）を裏書きする。ベータコロナウイルスの中でも、このウイルスは、病原性および伝染性を増大させることが公知である、顕著に異なる特色である、多塩基性切断部位の固有の組合せにより特徴付けられる。キクガシラコウモリである、Ｒｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓ ａｆｆｉｎｉｓから採取された、コウモリサルベコウイルスである、コウモリＣｏＶ ＲａＴＧ１３は、ほぼ全てのゲノム領域内で、約９６％のゲノム配列同一性（およびスパイクタンパク質のＲＢＤ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）内における、９３％を超える類似性）により、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と共に、クラスター化することが報告されており；別の哺乳動物種は、中間宿主として作用する場合がある。疑わしい中間宿主の１つである、マレーセンザンコウは、アンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）受容体への結合を促進すると考えられる突然変異を含有し、９７％のアミノ酸配列類似性を裏付ける、ＲＢＤ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）内で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との、高度の類似性を示すコロナウイルスを保有する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のいずれも、アンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）を、ヒト細胞上の受容体として使用する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＡＣＥ２に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１より高度のアフィニティーで結合する（Ｗｒａｐｐら、２０２０、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３６７、１２６０～１２６３）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶと、例えば、Ａｂｄｅｌｒａｈｍａｎら、２０２０（Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１１：５５２９０９）において概括されている、いくつかのＳＡＲＳ関連コロナウイルス（ＳＡＲＳｒ－ＣｏＶ）とから分化する。
ＣＯＶＩＤ－１９パンデミックに対処する中で、ワクチンおよび受動抗体免疫療法が、それぞれ、予防的防止および治療的介入のために開発されつつある。下気道内のウイルス複製を防止または抑制する中和分子による受動抗体免疫療法の、ＣＯＶＩＤ－１９患者における治療的介入としての適用は、患者データにより裏書きされると考えられる。実際、患者による、十分な力価の中和抗体の早期発生は、重度疾患への進行の回避と相関し（Ｌｕｃａｓら、２０２０、ｍｅｄＲｘｉｖｄｏｉ：１０．１１０１／２０２０．１２．１８．２０２４８３３１）、組換え中和抗体、または高力価の回復期血漿中に存在する中和抗体の早期投与は、重度疾患を回避しうる（Ｗｅｉｎｒｅｉｃｈら、２０２０、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、ｄｏｉ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ２０３５００２；Ｃｈｅｎら、２０２０、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、ｄｏｉ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ２０２９８４９；Ｌｉｂｓｔｅｒら、２０２１、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、ｄｏｉ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ２０３３７００）。受動免疫療法との関連で、古典的抗体は、通例、このような抗体の、循環への、ＦｃＲｎ媒介性再循環（Ｐｙｚｉｋら、２０１９、Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１０：１５４０）により付与される、半減期延長の利点を有するＩｇＧ Ｆｃ部分を含む。現在のところ、このような古典的抗体が、ＣＯＶＩＤ－１９における炎症性疾患を悪化させることは、明らかでない。しかし、例えば、ＩｇＧ Ｆｃ－ＬＡＬＡ突然変異またはＩｇＧ Ｆｃ－ＬＡＬＡＰＧ突然変異（Ｗｉｎｅｓら、２０００、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６４：５３１３～５３１８；Ｓｃｈｌｏｔｈａｕｅｒら、２０１６、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ、２９：４５７～４６６）を導入することにより、抗体Ｆｃドメインから、エフェクター機能を除去するように操作することは、賢明でありうる。
シリアハムスター（Ｍｅｓｏｃｒｉｃｅｔｕｓ ａｕｒａｔｕｓ）が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ誘導性の病原性、および肺疾患を重篤化させる免疫応答の関与について研究するための小動物モデルとして提起されている。これらの前臨床モデルとしての優越性は、ＣＯＶＩＤ－１９患者を処置するための、新たな抗ウイルス剤または免疫調節剤の治療利益に根拠を与え、これについて評価するために、現在関心の対象となっている。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、構造タンパク質として、スパイク（Ｓ）タンパク質、エンベロープ（Ｅ）タンパク質、膜（Ｍ）タンパク質、およびヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質を含有する。さらに、１６の非構造タンパク質（ｎｓｐ１～１６）が、区別され、宿主防御の複製および修飾に関与している。Ｎｓｐ１２タンパク質は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）に対応する。
本発明で、とりわけ目的となるのは、タンパク質ウイルス表面から突出し、ウイルスに、王冠様の外見を与える、ホモ二量体を形成する、膜貫通型糖タンパク質である、スパイクタンパク質またはＳタンパク質である。スパイクタンパク質は、２つのサブユニット：Ｓ１およびＳ２を有する。Ｓ１サブユニットは、Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）、ＲＢＤ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）（上記で指し示された通り、ＲＢＤは、ヒトＡＣＥ－２に結合する）、ならびにサブドメイン１および２（ＳＤ１、ＳＤ２）を含む。Ｓ２サブユニットは、ウイルスの膜と、宿主細胞との融合に関与し、複数のドメイン：Ｓ２’プロテアーゼ切断部位（融合のために要求される、宿主プロテアーゼによる切断）、融合ペプチド（ＦＰ）、ヘプタッドリピート１（ＨＲ１）ドメイン、中央ヘリックス（ＣＨ）ドメイン、コネクタードメイン（ＣＤ）、ヘプタッドリピート２（ＨＲ２）ドメイン、膜貫通型（ＴＭ）ドメイン、および細胞質テール（ＣＴ）ドメインを含む（Ｗａｎｇら、２０２０、Ｆｒｏｎｔ Ｃｅｌｌ Ｉｎｆｅｃｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１０：５８７２６９）。融合前コンフォメーションにおいて、生合成時に、Ｓ１－Ｓ２間フーリン切断部位で切断される、Ｓ１と、Ｓ２とは、互いとの非共有結合的結合を維持する（これは、Ｓ１と、Ｓ２とが、非切断状態を維持するＳＡＲＳ－ＣｏＶと異なる）。Ｓタンパク質の閉鎖状態（ＰＤＢ：６ＶＸＸ）では、三量体内の、３つのＲＢＤドメインが、三量体から突出しないのに対し、開放状態（ＰＤＢ：６ＶＹＢ）、または「アップ」コンフォメーションでは、ＲＢＤのうちの１つが、三量体から突出する。断面が三角形である、Ｓ三量体の細胞外ドメインは、長さが、約１６０オングストロームであり、Ｓ１ドメインは、Ｖ字型を取る。プロトマー１つ当たり、２２のＮ結合型グリコシル化部位のうちの１６は、グリコシル化されると考えられる（Ｗａｌｌｓら、２０２０、Ｃｅｌｌ、１８０：２８１～２９２）。
ＲＢＤドメイン（Ｓ１ドメインのアミノ酸４３８～５０６）は、５本の逆平行鎖により形成される、コアベータ－シート領域を含有する。逆平行鎖のうちの２本の間に、ＡＣＥ２に結合する残基の大半を含有する、拡張構造（２本の短いベータ鎖、２本のアルファヘリックス、およびループにより形成される）を形成する、ＲＢＭ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｔｉｆ）が挿入される（Ｌａｎら、２０２０、Ｎａｔｕｒｅ、５８１：２１５～２２０）。
Ｓａｒｓ－Ｃｏｖ－２スパイクタンパク質配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＱＨＱ８２４６４、変化形である、ＱＨＱ８２４６４．１の下に見出すことができ／これと、またはこれに対応し；本明細書ではまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２表面糖タンパク質としても規定され、配列番号３０としても規定される。本明細書では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質ＲＢＤドメイン領域（また、スパイクＲＢＤ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）としても規定される；ｐｆａｍ０９４０８）は、配列番号３０のアミノ酸３３０～５８３、および本明細書の下記で描示される配列（配列番号３２）と／に対応するか；または、代替的に、配列番号３０のアミノ酸３３０～５１８、および本明細書の下記で描示される配列（配列番号３３）と／に対応する：
または
Ｓａｒｓ－Ｃｏｖ－１スパイクタンパク質配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＰ＿８２８８５１．１の下に見出すことができ／これと、またはこれに対応し；本明細書ではまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ Ｅ２糖タンパク質前駆体としても規定され、配列番号３１としても規定される。本明細書では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１スパイクタンパク質ＲＢＤドメイン領域は、本明細書の下記で描示される、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクＲＢＤ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）と／に対応する領域（配列番号３４）である配列番号３１のアミノ酸残基３１８～５６９と／に対応するか；または、代替的に、配列番号３１のアミノ酸３２０～５０２、および本明細書の下記で描示される配列（配列番号３５）と／に対応する：：
または
本明細書で互換的に使用される、「アンジオテンシン転換酵素２」、「ＡＣＥ２」、または「ＡＣＥ－２」とは、ジペプチジルカルボキシジペプチダーゼのファミリーに属し、場合によって、ＥＣ：３．４．１７．２３としても分類される哺乳動物タンパク質を指す。ヒトＡＣＥ２遺伝子のゲノム位置は、Ｘ染色体：１５，５６１，０３３～１５，６０２，１５８（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８；マイナス鎖）上、または、代替的に、Ｘ染色体：１５，５７９，１５６～１５，６２０，２７１（ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９；マイナス鎖）上である。ＡＣＥ２は、少なくともヒトコロナウイルスである、ＳＡＲＳ－ＣｏＶおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ならびにＮＬ６３／ＨＣｏＶ－ＮＬ６３（また、ニューヘイブンコロナウイルスとしても公知である）に対する受容体として作用する。ヒトＡＣＥ２タンパク質のＵｎｉＰｒｏｔＫＢ識別子：Ｑ９ＢＹＦ１である。アイソフォーム１（識別子：Ｑ９ＢＹＦ１－１）が、カノニカルｉ配列として選び出されている。ヒトＡＣＥ２遺伝子の参照ＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＣ＿００００２３．１１における配列である。ヒトＡＣＥ２の参照ｍＲＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ＿００１３７１４１５．１およびＮＭ＿０２１８０４．３における配列である。
結合剤／サルベコウイルス結合剤
一態様では、本発明に従う結合剤またはサルベコウイルス結合剤（互換的に使用されうる）は、任意の個別の機能／実施形態または、本明細書の下記で記載され、カッコ内の任意番号「（ｎ）」が与えられる、任意の番号の個別の機能／実施形態の、任意の組合せにより、機能的に記載されうる。これらの個別の機能の、数字の順序は、ランダムであり、個別の機能に対する優先を付与せず；同様に、このランダムの数字の順序は、２つまたはこれを超える、個別の機能の組合せに対する優先も付与しない。さらに、任意のこのような組合せは、本明細書における結合剤またはサルベコウイルス結合剤が、これらの個別の機能の各々を果たすのと同様に、恣意的であるとは考えられないものとする。
このように、結合剤は、（１）サルベコウイルスを中和、阻害、遮断、もしくは抑制することが可能であり、特に、（２）サルベコウイルスによる感染、もしくはサルベコウイルスの感染性能を中和、阻害、遮断、もしくは抑制することが可能であり、かつ／または（３）サルベコウイルスの複製を中和、阻害、遮断、もしくは抑制することが可能である薬剤である。例えば、本明細書で同定される結合剤と、サルベコウイルススパイクタンパク質との相互作用（結合、特異的結合）は、本明細書で記載されるか、または当技術分野で公知である、任意のアッセイにおいて決定される場合など、サルベコウイルスの感染能（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｃａｐａｃｉｔｙ）または感染性能（ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ ｃａｐａｃｉｔｙ）の中和を結果としてもたらす。
本明細書で記載される結合剤の別の機能は、これらの薬剤が、（４）サルベコウイルスのスパイクタンパク質に結合するか、またはこれに特異的に結合することが可能であることである。特に、これらの薬剤は、（５）サルベコウイルススパイクタンパク質内、特に、多くの異なるサルベコウイルスのスパイクタンパク質内の、ＲＢＤドメインもしくはＲＢＤモチーフ、またはＲＢＤドメインもしくはＲＢＤモチーフの部分、より特定すると、サルベコウイルススパイクタンパク質内の、ＲＢＤドメインもしくはＲＢＤモチーフ、またはＲＢＤドメインもしくはＲＢＤモチーフの部分内の、高度に保存されたエピトープに結合するか、またはこれに特異的に結合することが可能である。さらに、特に、これらの薬剤は、（６）サルベコウイルスのスパイクタンパク質の、部分的に開放型のコンフォメーションに結合するか、もしくはこれに特異的に結合することが可能であり；代替的に、これらの薬剤は、（７）サルベコウイルスのスパイクタンパク質の、閉鎖型のコンフォメーションに結合することが可能でないか、または、さらに、代替的に、（８）サルベコウイルスのスパイクタンパク質の、完全に開放型のコンフォメーションに結合することが可能でない。さらに、特に、これらの薬剤は、（９）部分的に開放型のコンフォメーションにある、すなわち、スパイクタンパク質のＮ末端ドメインが、結合剤の、サルベコウイルスのＲＢＤドメインへの結合を妨げないコンフォメーションにある、ＲＢＤドメイン上の部位において、サルベコウイルスのスパイクタンパク質に結合するか、またはこれに特異的に結合することが可能である。現在のところ、本発明に従う結合剤が、サルベコウイルス感染を、どのようにして中和、阻害、遮断、もしくは抑制するのかは、完全に明らかではない。本発明の結合剤は、（７７）Ｓ１部の排出を誘導することが可能である。結果として、結合剤は、未成熟スパイクの惹起を誘導することが可能あり、このようにして、サルベコウイルスが、感染過程または宿主細胞への侵入過程を完遂することを不可能としうる。いかなる理論に束縛されることも望まずに述べると、これらの結合剤の、ＲＢＤとの相互作用（結合、特異的結合）は、スパイク三量体の不安定化を結果としてもたらし、Ｓ１部の排出、および未成熟スパイクの惹起を促進しうる。代替的に、かつ、再び、いかなる理論に束縛されることも望まずに述べると、これらの結合剤の、ＲＢＤとの相互作用（結合）は、スパイクタンパク質を、サルベコウイルスが、感染過程または宿主細胞への侵入過程を完遂することを不可能とするコンフォメーションにロックするか、または凍結しうる。代替的に、かつ、再び、いかなる理論に束縛されることも望まずに述べると、これらの結合剤の、ＲＢＤとの相互作用（結合、特異的結合）は、スパイクタンパク質の不安定化を結果としてもたらすことが可能であり、サルベコウイルスが、感染過程または宿主細胞への侵入過程を完遂することを不可能とする。それらの作用機構から独立に、本発明に従う結合剤は、サルベコウイルス感染を、効率的に／効果的に中和する。
さらに、本明細書で記載される結合剤の機能は、これらの薬剤が、（１０）結合剤が、それら自体、サルベコウイルスＲＢＤに結合している場合に、サルベコウイルスＲＢＤの、ＡＣＥ２との結合を遮断または防止せず、したがって、サルベコウイルスＲＢＤの、ＡＣＥ２との結合を可能とする（代替的に、結合剤自体が、ＡＣＥ２が結合しているサルベコウイルスＲＢＤに結合しうる）か、または（１１）サルベコウイルスＲＢＤへの結合について、ＡＣＥ２と競合しない（したがって、結合剤が、それら自体、サルベコウイルスＲＢＤに結合している場合に、ＡＣＥ２と、サルベコウイルスＲＢＤとの結合を可能とする（代替的に、結合剤自体は、ＡＣＥ２が結合しているサルベコウイルスＲＢＤに結合しうる））か、または（１２）ＡＣＥ２との結合について、サルベコウイルスＲＢＤと競合しない（したがって、結合剤が、それら自体、サルベコウイルスＲＢＤに結合している場合に、サルベコウイルスＲＢＤと、ＡＣＥ２との結合を可能とする（代替的に、結合剤自体は、ＡＣＥ２が結合しているサルベコウイルスＲＢＤに結合しうる））ことである。したがって、結合剤は、ＡＣＥ２の、ＲＢＤへの結合の遮断と異なる方式を介して、サルベコウイルス、具体的に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルスの感染を中和することが可能である。
本明細書で記載される結合剤の、さらなる機能的特徴は、これらの薬剤が、全て、サルベコウイルスのスパイクタンパク質（またはその中のＲＢＤドメイン）への結合または特異的結合について、（１３）公知の免疫グロブリンである、ＣＲ３０２２と競合せず（ｔｅｒ Ｍｅｕｌｅｎら、２００６、ＰＬｏＳ Ｍｅｄ、３：ｅ２３７；Ｔｉａｎら、２０２０、Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ ＆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ、９：３８２～３８５）、かつ／または（１４）公知の免疫グロブリンである、ＶＨＨ７２と競合せず（Ｗｒａｐｐら、２０２０、Ｃｅｌｌ、１８４：１００４～１０５）、かつ／または（１５）公知の免疫グロブリンである、ＣＢ６と競合せず（Ｓｈｉら、２０２０、Ｎａｔｕｒｅ、５８４：１２０～１２４）、かつ／または（１６）公知の免疫グロブリンである、Ｓ３０９と競合しない（Ｐｉｎｔｏら、２０２０、Ｎａｔｕｒｅ、５８３：２９０～２９５）ことである（これは、本明細書で記載される結合剤が、免疫グロブリンである、ＣＲ３０２２、ＶＨＨ７２、ＣＢ６、またはＳ３０９のうちのいずれかの、スパイクタンパク質／ＲＢＤへの結合パターンと比較して、異なるスパイクタンパク質／ＲＢＤへの結合パターンにより特徴付けられることを指し示す）。代替的に、これらの結合剤は、これらの結合剤が、それら自体、サルベコウイルスＲＢＤに結合している場合に、ＣＲ３０２２、ＶＨＨ７２、ＣＢ６、またはＳ３０９の、サルベコウイルスのＲＢＤまたはスパイクタンパク質への結合を可能とする。代替的に、結合剤自体は、ＣＲ３０２２、ＶＨＨ７２、ＣＢ６、またはＳ３０９が結合しているサルベコウイルスＲＢＤに結合しうる。
本明細書で記載される結合剤の、さらなる機能的特徴は、これらの薬剤が、（１７）免疫グロブリンである、ｍＡｂ５２またはＦａｂ５２が結合するエピトープ（Ｒｕｊａｓら、２０２０、Ｂｉｏｒｘｉｖ、２０２０．１０．１５．３４１６３６ｖ１）と異なる、サルベコウイルスのスパイクタンパク質内もしくはＲＢＤ内のエピトープに結合するか、もしくはこれに特異的に結合し；かつ／または（１８）免疫グロブリンである、ｎｂ３４が結合するエピトープ（Ｘｉａｎｇら、２０２０、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３７０：１４７９～１４８４）と異なる、サルベコウイルスのスパイクタンパク質内もしくはＲＢＤ内のエピトープに結合するか、もしくはこれに特異的に結合し；かつ／または（１９）免疫グロブリンである、ｎｂ９５が結合するエピトープ（Ｘｉａｎｇら、２０２０、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３７０：１４７９～１４８４）と異なる、サルベコウイルスのスパイクタンパク質内もしくはＲＢＤ内のエピトープに結合するか、もしくはこれに特異的に結合し；かつ／または（２０）免疫グロブリンである、ｎ３０８８、および／またはｎ３１３０が結合するエピトープ（Ｗｕら、２０２０、Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ、２７：８９１～８９８）と異なる、サルベコウイルスのスパイクタンパク質内もしくはＲＢＤ内のエピトープに結合するか、もしくはこれに特異的に結合し；かつ／または（２１）免疫グロブリンである、ｎ３０８６、および／またはｎ３１１３が結合するエピトープ（Ｗｕら、２０２０、Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ、２７：８９１～８９８）と異なる、サルベコウイルスのスパイクタンパク質内またはＲＢＤ内のエピトープに結合するか、またはこれに特異的に結合することである。
本明細書で記載される結合剤の、さらなる機能的特徴は、これらの薬剤が、（２２）多くのサルベコウイルスのスパイクタンパク質内またはＲＢＤ内に保存されたエピトープに結合するか、またはこれに特異的に結合することである。特に、エピトープは、サルベコウイルスの、異なるクレードの間で保存される。特に、エピトープは、クレード１．Ａ、クレード１．Ｂ、クレード２、およびクレード３のサルベコウイルスの間で保存される。
本明細書で記載される結合剤の、さらなる機能的特徴は、これらの薬剤が、（２３）偽型ウイルス中和アッセイにおいて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１を、１０μｇ／ｍＬまたはこれ未満のＩＣ５０、例えば５μｇ／ｍＬまたはこれ未満のＩＣ５０など、例えば２．５μｇ／ｍＬまたはこれ未満のＩＣ５０など、または例えば１μｇ／ｍＬまたはこれ未満のＩＣ５０などで中和することである。特に、偽型ウイルス中和アッセイは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１のスパイクタンパク質を含有する、偽型ＶＳＶ－ｄｅｌＧウイルスに基づく（表２を参照されたい）。
本明細書で記載される結合剤の、なおさらなる機能的特徴は、これらの薬剤が、（７８）偽型ウイルス中和アッセイにおいて、本明細書でさらに規定されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株を、１０μｇ／ｍＬまたはこれ未満のＩＣ５０、例えば５μｇ／ｍＬまたはこれ未満のＩＣ５０など、例えば２．５μｇ／ｍＬまたはこれ未満のＩＣ５０など、または例えば１μｇ／ｍＬまたはこれ未満のＩＣ５０などで中和することである。特に、偽型ウイルス中和アッセイは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株のスパイクタンパク質と関連するＲＢＤ突然変異を含有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質を含有する、偽型ＶＳＶ－ｄｅｌＧウイルスに基づく。特に、本明細書で記載される結合剤は、Ｎ４３９、Ｋ４１７、Ｓ４７７、Ｌ４５２、Ｔ４７８、Ｅ４８４、Ｐ３８４、Ｎ５０１、および／またはＤ６１４位におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株（配列番号３０において規定された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクアミノ酸配列と比べた）を中和しうる。より特定すると、本明細書で記載される結合剤は、Ｎ５０１Ｙ変異株（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アルファ変異株）など、Ｎ５０１位における突然変異を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株；Ｎ５０１Ｙ変異株およびＥ４８４Ｋ変異株（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アルファ＋Ｅ４８４Ｋ変異株）など、Ｎ５０１およびＥ４８４位における突然変異を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株；Ｋ４１７Ｎ変異株、Ｅ４８４Ｋ変異株、およびＮ５０１Ｙ変異株（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ベータ変異株）など、Ｋ４１７、Ｅ４８４、およびＮ５０１位における突然変異を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株；Ｐ３８４Ｌ変異株、Ｋ４１７Ｎ変異株、Ｅ４８４Ｋ変異株、およびＮ５０１Ｙ変異株（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ベータ＋Ｐ３８４Ｌ変異株）など、Ｐ３８４、Ｋ４１７、Ｅ４８４、およびＮ５０１位における突然変異を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株；Ｌ４５２Ｒ変異株およびＥ４８４Ｑ変異株（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２カッパ変異株）など、Ｌ４５２およびＥ４８４位における突然変異を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株；Ｌ４５２Ｒ変異株およびＴ４７８Ｋ変異株（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２デルタ変異株）など、Ｌ４５２およびＴ４７８位における突然変異を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株；Ｌ４５２Ｒ変異株（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２イプシロン変異株）など、Ｌ４５２位における突然変異を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株；Ｋ４１７Ｔ変異株（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ガンマ変異株）など、Ｋ４１７位における突然変異を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株；ならびにＤ６１４Ｇ変異株（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オミクロン変異株またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＢＡ．１変異株）など、Ｄ６１４位における突然変異を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株からなる群から選択されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株のうちの、１つまたは複数、好ましくは、全てを中和しうる。なおより特定すると、本明細書で記載される結合剤は、偽型ウイルス中和アッセイにおいて、１０μｇ／ｍＬまたはこれ未満のＩＣ５０、例えば５μｇ／ｍＬまたはこれ未満のＩＣ５０など、例えば２．５μｇ／ｍＬまたはこれ未満のＩＣ５０など、または例えば１μｇ／ｍＬまたはこれ未満のＩＣ５０などで、（７９）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アルファ変異株を中和し、（８０）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アルファ＋Ｅ４８４Ｋ変異株を中和し、（８１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ベータ変異株を中和し、（８２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ベータ＋Ｐ３８４Ｌ変異株を中和し、（８３）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２カッパ変異株を中和し、（８４）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２デルタ変異株を中和し、（８５）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２イプシロン変異株を中和し、（８６）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ガンマ変異株を中和し、かつ／または（８７）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オミクロン変異株、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＢＡ．１変異株を中和することを、さらに特徴とする。
ある特定の実施形態では、（８８）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（配列番号３０）に結合するか、もしくはこれらに特異的に結合するか、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＲＢＤ（配列番号３２または３３）に結合するか、もしくはこれらに特異的に結合する結合剤が開示される。特に、薬剤は、（８９）薬剤の任意の部分が、アミノ酸Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、もしくはＴｙｒ３９６のうちの、少なくとも１つから、４オングストローム以内に近接するように、結合するか、もしくはこれらに特異的に結合し；かつ／または、特に、これらの薬剤は、（９０）薬剤の任意の部分が、アミノ酸Ｐｈｅ４６４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｔｙｒ４６４）から４オングストローム以内に近接するように、結合するか、もしくはこれらに特異的に結合し；かつ／または、特に、これらの薬剤は、（９１）薬剤の任意の部分が、アミノ酸Ｓｅｒ５１４もしくはＧｌｕ５１６のうちの、少なくとも１つから、４オングストローム以内に近接するように、結合するか、もしくはこれらに特異的に結合し；かつ／または、特に、これらの薬剤は、（９２）薬剤の任意の部分が、アミノ酸Ａｒｇ３５５から４オングストローム以内に近接するように、結合するか、もしくはこれらに特異的に結合する。ある特定の実施形態では、薬剤は、（９３）薬剤の任意の部分が、アミノ酸Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、Ｔｙｒ３９６、Ｐｈｅ４６４、Ｓｅｒ５１４、Ｇｌｕ５１６、およびＡｒｇ３５５のうちの、少なくとも１つから、４オングストローム以内に近接するように、結合するか、もしくはこれらに特異的に結合する。ある特定の実施形態では、薬剤は、（９４）薬剤の部分が、アミノ酸Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、Ｔｙｒ３９６、Ｐｈｅ４６４、Ｓｅｒ５１４、Ｇｌｕ５１６、およびＡｒｇ３５５のうちの、少なくとも２つから、４オングストローム以内に近接するように、結合するか、もしくはこれらに特異的に結合する。ある特定の実施形態では、薬剤は、（９５）薬剤の部分が、アミノ酸Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、Ｔｙｒ３９６、Ｐｈｅ４６４、Ｓｅｒ５１４、Ｇｌｕ５１６、およびＡｒｇ３５５のうちの、少なくとも３つから、４オングストローム以内に近接するように、結合するか、もしくはこれらに特異的に結合する。ある特定の実施形態では、薬剤は、（９５）薬剤の部分が、アミノ酸Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、Ｔｙｒ３９６、Ｐｈｅ４６４、Ｓｅｒ５１４、Ｇｌｕ５１６、およびＡｒｇ３５５のうちの、少なくとも４つから、４オングストローム以内に近接するように、結合するか、もしくはこれらに特異的に結合する。ある特定の実施形態では、薬剤は、（９６）薬剤の部分が、アミノ酸Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、Ｔｙｒ３９６、Ｐｈｅ４６４、Ｓｅｒ５１４、Ｇｌｕ５１６、およびＡｒｇ３５５のうちの、少なくとも５つから、４オングストローム以内に近接するように、結合するか、もしくはこれらに特異的に結合する。ある特定の実施形態では、薬剤は、（９７）薬剤の部分が、アミノ酸Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、Ｔｙｒ３９６、Ｐｈｅ４６４、Ｓｅｒ５１４、Ｇｌｕ５１６、およびＡｒｇ３５５のうち６つ全てから４オングストローム以内に近接するように、結合するか、もしくはこれらに特異的に結合する。
ある特定の実施形態では、薬剤は、（９８）アミノ酸Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、またはＴｙｒ３９６のうちの、少なくとも１つに結合するか、もしくはこれらに特異的に結合し；かつ／または、特に、これらの薬剤は、（９９）Ｐｈｅ４６４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｔｙｒ４６４）に結合するか、もしくはこれらに特異的に結合し；かつ／または、特に、これらの薬剤は、（１００）アミノ酸Ｓｅｒ５１４またはＧｌｕ５１６のうちの、少なくとも１つに結合するか、もしくはこれらに特異的に結合し；かつ／または、特に、これらの薬剤は、（１０１）Ａｒｇ３５５に結合するか、もしくはこれらに特異的に結合する。ある特定の実施形態では、薬剤は、（１０２）アミノ酸Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、Ｔｙｒ３９６、Ｐｈｅ４６４、Ｓｅｒ５１４、Ｇｌｕ５１６、およびＡｒｇ３５５のうちの、少なくとも１つに結合するか、またはこれらに特異的に結合する。ある特定の実施形態では、薬剤は、（１０３）アミノ酸Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、Ｔｙｒ３９６、Ｐｈｅ４６４、Ｓｅｒ５１４、Ｇｌｕ５１６、およびＡｒｇ３５５のうちの、少なくとも２つに結合するか、またはこれらに特異的に結合する。ある特定の実施形態では、薬剤は、（１０４）アミノ酸Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、Ｔｙｒ３９６、Ｐｈｅ４６４、Ｓｅｒ５１４、Ｇｌｕ５１６、およびＡｒｇ３５５のうちの、少なくとも３つに結合するか、またはこれらに特異的に結合する。ある特定の実施形態では、薬剤は、（１０５）アミノ酸Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、Ｔｙｒ３９６、Ｐｈｅ４６４、Ｓｅｒ５１４、Ｇｌｕ５１６、およびＡｒｇ３５５のうちの、少なくとも４つに結合するか、またはこれらに特異的に結合する。ある特定の実施形態では、薬剤は、（１０６）アミノ酸Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、Ｔｙｒ３９６、Ｐｈｅ４６４、Ｓｅｒ５１４、Ｇｌｕ５１６、およびＡｒｇ３５５のうちの、少なくとも５つに結合するか、またはこれらに特異的に結合する。ある特定の実施形態では、薬剤は、（１０７）アミノ酸Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、Ｔｙｒ３９６、Ｐｈｅ４６４、Ｓｅｒ５１４、Ｇｌｕ５１６、およびＡｒｇ３５５の６つ全てに結合するか、またはこれらに特異的に結合する。ある特定の実施形態では、薬剤は、（１０８）薬剤の部分が、少なくとも、Ｔｙｒ３９６、Ｓｅｒ５１４、およびＧｌｕ５１６から、４オングストローム以内に近接するように、結合するか、またはこれらに特異的に結合する。ある特定の実施形態では、薬剤は、（１０９）少なくとも、Ｔｙｒ３９６、Ｓｅｒ５１４、およびＧｌｕ５１６に結合するか、またはこれらに特異的に結合する。ある特定の実施形態では、薬剤は、（１１０）薬剤の部分が、少なくとも、Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、Ｔｙｒ３９６、Ｓｅｒ５１４、およびＧｌｕ５１６から、４オングストローム以内に近接するように、結合するか、またはこれらに特異的に結合する。ある特定の実施形態では、薬剤は、（１１１）少なくとも、Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、Ｔｙｒ３９６、Ｓｅｒ５１４、およびＧｌｕ５１６に結合するか、またはこれらに特異的に結合する。ある特定の実施形態では、薬剤は、（１１２）薬剤の部分が、少なくとも、Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、Ｔｙｒ３９６、Ｐｈｅ４６４、Ｓｅｒ５１４、およびＧｌｕ５１６から、４オングストローム以内に近接するように、結合するか、またはこれらに特異的に結合する。ある特定の実施形態では、薬剤は、（１１３）少なくとも、Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、Ｔｙｒ３９６、Ｐｈｅ４６４、Ｓｅｒ５１４、およびＧｌｕ５１６に結合するか、またはこれらに特異的に結合する。
任意選択で、前出の薬剤のうちのいずれかは、（１１５）アミノ酸Ａｒｇ３５７（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｌｙｓ３５７）、および／またはＬｙｓ４６２（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ａｒｇ４６２）、および／またはＧｌｕ４６５（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｇｌｙ４６５）、および／またはＡｒｇ４６６、および／またはＬｅｕ５１８のうちの、少なくとも２つ、または優先順位が増大する順に、少なくとも３つ、または４つ全てにさらに結合するか、またはこれらに特異的に結合するなど、（１１４）アミノ酸Ａｒｇ３５７（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｌｙｓ３５７）、および／またはＬｙｓ４６２（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ａｒｇ４６２）、および／またはＧｌｕ４６５（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｇｌｙ４６５）、および／またはＡｒｇ４６６、および／またはＬｅｕ５１８にさらに結合するか、またはこれらに特異的に結合する。任意選択で、前出の薬剤のうちのいずれかは、（１１６）サルベコウイルススパイクタンパク質に結合するか、もしくはこれらに特異的に結合し、この場合、Ｃｙｓ３３６（サルベコウイルスクレードの間で保存されている）は、分子内ジスルフィド架橋を形成し；かつ／または（１１７）サルベコウイルススパイクタンパク質に結合するか、もしくはこれらに特異的に結合し、この場合、Ｃｙｓ３９１（サルベコウイルスクレードの間で保存されている）は、分子内ジスルフィド架橋を形成し；特に、（１１８）Ｃｙｓ３３６は、Ｃｙｓ３６１（サルベコウイルスクレードの間で保存されている）と共に、分子内ジスルフィド架橋を形成することが可能であり、かつ／または（１１９）Ｃｙｓ３９１は、Ｃｙｓ５２５（サルベコウイルスクレードの間で保存されている）と共に、分子内ジスルフィド架橋を形成しうる。任意選択で、これらの薬剤は、（１２０）サルベコウイルススパイクタンパク質に結合するか、もしくはこれらに特異的に結合し、この場合、アミノ酸３６５は、チロシン（Ｔｙｒ３６５；サルベコウイルスクレードの間で保存されている）であり、かつ／または（１２１）サルベコウイルススパイクタンパク質に結合するか、もしくはこれらに特異的に結合し、この場合、アミノ酸３９２は、フェニルアラニン（Ｐｈｅ３９２；サルベコウイルスクレードの間で保存されている）であり、かつ／または（１２２）サルベコウイルススパイクタンパク質に結合するか、もしくはこれらに特異的に結合し、この場合、アミノ酸３９３は、トレオニン（Ｔｈｒ３９３；または、一部のサルベコウイルスでは、代替的に、Ｓｅｒ３９３）であり、かつ／または（１２３）サルベコウイルススパイクタンパク質に結合するか、もしくはこれらに特異的に結合し、この場合、アミノ酸３９５は、バリン（Ｖａｌ３９５；または、一部のサルベコウイルスでは、代替的に、Ｓｅｒ３９３）であり、かつ／または（１２４）サルベコウイルススパイクタンパク質に結合するか、もしくはこれらに特異的に結合し、この場合、アミノ酸５１８は、ロイシン（Ｌｅｕ５１８）である。本明細書の上記で言及された、アミノ酸およびアミノ酸の番号付けは、配列番号３０において規定された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質と比べた／これに対応するアミノ酸およびアミノ酸の番号付けであり；他のサルベコウイルスのスパイクタンパク質内、またはＲＢＤドメイン内の、対応するアミノ酸は、例えば、図１６Ｂ）に描示された、複数のアミノ酸配列をアライメントすることにより、容易に決定されうる。
ある特定の実施形態では、（１２５）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（配列番号３０）に結合するか、もしくはこれらに特異的に結合するか、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＲＢＤ（配列番号３２または３３）に結合するか、もしくはこれらに特異的に結合する結合剤が開示される。特に、薬剤は、（１２６）結合するか、またはこれらに特異的に結合し、これにより、Ｒ３５５、Ｎ３９４、Ｙ３９６、Ｆ４６４、Ｓ５１４、およびＥ５１６により包囲されて規定される、ＲＢＤ表面積のうちの少なくとも２５％、少なくとも３３％、少なくとも５０％、または少なくとも７５％を覆う結合界面（例えば、ＰＤＢｅ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ Ｅｕｒｏｐｅ）ＰＩＳＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ）により決定される）が作出される。接触を受けるＲＢＤ表面積は、任意選択で、立体的に、これらの残基の間に介在する表面積を含むように計算されうる。
本発明に従う結合剤の、上記で列挙された機能的特徴は、一般に、例えば、本明細書で記載される実施例で利用された方法、または本明細書の上記で引用された刊行物、および他の刊行物の一部に記載された方法により決定されうる。サルベコウイルススパイクタンパク質エピトープまたはサルベコウイルスＲＢＤドメインエピトープの決定は、例えば、結合競合実験（本明細書の実施例、または本明細書の上記で引用された刊行物の多くにおいて概括される、結合競合実験など）により実施される場合もあり、例えば、突然変異解析（本明細書の実施例で概括される、突然変異解析など）により実施される場合もあり、例えば、三次元レベルにおける相互作用を決定する、任意の手段であって、コンピュータによるモデル化（本明細書で概括される、コンピュータによるモデル化など）を含む手段により実施される場合もある。
具体的一実施形態では、本明細書の上記で記載された、結合剤またはサルベコウイルス結合剤の機能的特徴の一部は、このような薬剤を、例えば、ＳＰＲＢＤ（サルベコウイルススパイクタンパク質受容体結合ドメイン（ｓａｒｂｅｃｏｖｉｒｕｓ ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ））に結合し、アンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）の、ＳＰＲＢＤへの結合を遮断せず、少なくとも、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１を中和し、特に、少なくとも、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、および本明細書で記載される、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１を中和し、ＳＰＲＢＤへの結合について、抗体ＣＲ３０２２と競合しないと特徴付けるように組み合わされる。このような薬剤は、偽型ウイルス中和アッセイにおいて、１０μｇ／ｍＬまたはこれ未満のＩＣ５０により、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株、および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１を中和すること；および／または抗体ＶＨＨ７２、Ｓ３０９、およびＣＢ６と競合しないこと；および／またはＳ１部の排出を誘導することにより、さらに特徴付けられうる。
本明細書で記載される結合剤の、さらなる機能的特徴は、これらの薬剤が、（２４）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（配列番号３０）に結合するか、もしくはこれらに特異的に結合するか、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＲＢＤ（配列番号３２または３３）に結合するか、もしくはこれらに特異的に結合することである。特に、これらの薬剤は、（２５）アミノ酸Ｔｈｒ３９３（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９３）、Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、Ｖａｌ３９５、またはＴｙｒ３９６のうちの、少なくとも１つに、結合するか、もしくはこれらに特異的に結合し；かつ／または、特に、これらの薬剤は、（２６）アミノ酸Ｌｙｓ４６２（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ａｒｇ４６２）、Ｐｈｅ４６４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｔｙｒ４６４）、Ｇｌｕ４６５（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｇｌｙ４６５）、またはＡｒｇ４６６のうちの、少なくとも１つに、結合するか、もしくはこれらに特異的に結合し；かつ／または、特に、これらの薬剤は、（２７）アミノ酸Ｓｅｒ５１４、Ｇｌｕ５１６、またはＬｅｕ５１８のうちの、少なくとも１つに、結合するか、もしくはこれらに特異的に結合し；かつ／または、特に、これらの薬剤は、（２８）アミノ酸Ａｒｇ３５７（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｌｙｓ３５７）に、結合するか、もしくはこれに特異的に結合する。特に、これらの薬剤は、（２９）（２５）～（２８）に列挙されたアミノ酸のうちの、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、または全てに結合するか、またはこれらに特異的に結合する。任意選択で、これらの薬剤は、（３０）サルベコウイルススパイクタンパク質に結合するか、もしくはこれらに特異的に結合し、この場合、Ｃｙｓ３３６（サルベコウイルスクレードの間で保存されている；図１６Ｂを参照されたい）は、分子内ジスルフィド架橋を形成し；かつ／または、（３１）サルベコウイルススパイクタンパク質に結合するか、もしくはこれらに特異的に結合し、この場合、Ｃｙｓ３９１（サルベコウイルスクレードの間で保存されている；図１６Ｂを参照されたい）は、分子内ジスルフィド架橋を形成し；特に、（３２）Ｃｙｓ３３６は、Ｃｙｓ３６１（サルベコウイルスクレードの間で保存されている；図１６Ｂを参照されたい）と共に、分子内ジスルフィド架橋を形成することが可能であり、かつ／または（３３）Ｃｙｓ３９１は、Ｃｙｓ５２５（サルベコウイルスクレードの間で保存されている；図１６Ｂを参照されたい）と共に、分子内ジスルフィド架橋を形成しうる。任意選択で、これらの薬剤は、（３４）サルベコウイルススパイクタンパク質に結合するか、もしくはこれらに特異的に結合し、この場合、アミノ酸３６５は、チロシン（Ｔｙｒ３６５；サルベコウイルスクレードの間で保存されている；図１６Ｂを参照されたい）であり、かつ／または（３５）サルベコウイルススパイクタンパク質に結合するか、もしくはこれらに特異的に結合し、この場合、アミノ酸３９２は、フェニルアラニン（Ｐｈｅ３９２；サルベコウイルスクレードの間で保存されている；図１６Ｂを参照されたい）である。本明細書の上記で言及された、アミノ酸およびアミノ酸の番号付けは、配列番号３０において規定された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質と比べた／これに対応するアミノ酸およびアミノ酸の番号付けであり；他のサルベコウイルスのスパイクタンパク質内、またはＲＢＤドメイン内の、対応するアミノ酸は、例えば、図１６Ｂ）に描示された、複数のアミノ酸配列をアライメントすることにより、容易に決定されうる。
複数のさらに個別の実施形態では、本明細書で同定される結合剤は、
（３６）アミノ酸Ｔｈｒ３９３（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９３）、Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、Ｖａｌ３９５、もしくはＴｙｒ３９６のうちの、少なくとも１つに結合するか、もしくはこれらに特異的に結合し；アミノ酸Ｌｙｓ４６２（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ａｒｇ４６２）、Ｐｈｅ４６４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｔｙｒ４６４）、Ｇｌｕ４６５（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｇｌｙ４６５）、もしくはＡｒｇ４６６のうちの、少なくとも１つに（さらに）結合するか、もしくはこれらに（さらに）特異的に結合するか；または
（３７）アミノ酸Ｔｈｒ３９３（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９３）、Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、Ｖａｌ３９５、もしくはＴｙｒ３９６のうちの、少なくとも１つに結合するか、もしくはこれらに特異的に結合し；アミノ酸Ｓｅｒ５１４、Ｇｌｕ５１６、もしくはＬｅｕ５１８のうちの、少なくとも１つに（さらに）結合するか、もしくはこれらに（さらに）特異的に結合するか；または
（３８）アミノ酸Ｔｈｒ３９３（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９３）、Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、Ｖａｌ３９５、もしくはＴｙｒ３９６のうちの、少なくとも１つに結合するか、もしくはこれらに特異的に結合し；アミノ酸Ａｒｇ３５７に（さらに）結合するか、もしくはこれに（さらに）特異的に結合するか；または
（３９）アミノ酸Ｌｙｓ４６２（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ａｒｇ４６２）、Ｐｈｅ４６４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｔｙｒ４６４）、Ｇｌｕ４６５（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｇｌｙ４６５）、もしくはＡｒｇ４６６のうちの、少なくとも１つに結合するか、もしくはこれらに特異的に結合し；アミノ酸Ｓｅｒ５１４、Ｇｌｕ５１６、もしくはＬｅｕ５１８のうちの、少なくとも１つに（さらに）結合するか、もしくはこれらに（さらに）特異的に結合するか；または
（４０）アミノ酸Ｌｙｓ４６２（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ａｒｇ４６２）、Ｐｈｅ４６４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｔｙｒ４６４）、Ｇｌｕ４６５（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｇｌｙ４６５）、もしくはＡｒｇ４６６のうちの、少なくとも１つに結合するか、もしくはこれらに特異的に結合し；アミノ酸Ａｒｇ３５７に（さらに）結合するか、もしくはこれに（さらに）特異的に結合するか；または
（４１）アミノ酸Ｓｅｒ５１４、Ｇｌｕ５１６、もしくはＬｅｕ５１８のうちの、少なくとも１つに結合するか、もしくはこれらに特異的に結合し；アミノ酸Ａｒｇ３５７に（さらに）結合するか、もしくはこれに（さらに）特異的に結合するか；または
（４２）アミノ酸Ｔｈｒ３９３（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９３）、Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、Ｖａｌ３９５、もしくはＴｙｒ３９６のうちの、少なくとも１つに結合するか、もしくはこれらに特異的に結合し；アミノ酸Ｌｙｓ４６２（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ａｒｇ４６２）、Ｐｈｅ４６４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｔｙｒ４６４）、Ｇｌｕ４６５（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｇｌｙ４６５）、もしくはＡｒｇ４６６のうちの、少なくとも１つに（さらに）結合するか、もしくはこれらに（さらに）特異的に結合し；アミノ酸Ｓｅｒ５１４、Ｇｌｕ５１６、もしくはＬｅｕ５１８のうちの、少なくとも１つに（さらに）結合するか、もしくはこれらに（さらに）特異的に結合するか；または
（４３）アミノ酸Ｔｈｒ３９３（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９３）、Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、Ｖａｌ３９５、もしくはＴｙｒ３９６のうちの、少なくとも１つに結合するか、もしくはこれらに特異的に結合し；アミノ酸Ｌｙｓ４６２（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ａｒｇ４６２）、Ｐｈｅ４６４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｔｙｒ４６４）、Ｇｌｕ４６５（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｇｌｙ４６５）、もしくはＡｒｇ４６６のうちの、少なくとも１つに（さらに）結合するか、もしくはこれらに（さらに）特異的に結合し；アミノ酸Ａｒｇ３５７に（さらに）結合するか、もしくはこれに（さらに）特異的に結合するか；または
（４４）アミノ酸Ｔｈｒ３９３（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９３）、Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、Ｖａｌ３９５、もしくはＴｙｒ３９６のうちの、少なくとも１つに結合するか、もしくはこれらに特異的に結合し；アミノ酸Ｓｅｒ５１４、Ｇｌｕ５１６、もしくはＬｅｕ５１８のうちの、少なくとも１つに（さらに）結合するか、もしくはこれらに（さらに）特異的に結合し；アミノ酸Ａｒｇ３５７に（さらに）結合するか、もしくはこれに（さらに）特異的に結合するか；または
（４５）アミノ酸Ｌｙｓ４６２（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ａｒｇ４６２）、Ｐｈｅ４６４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｔｙｒ４６４）、Ｇｌｕ４６５（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｇｌｙ４６５）、もしくはＡｒｇ４６６のうちの、少なくとも１つに結合するか、もしくはこれらに特異的に結合し；アミノ酸Ｓｅｒ５１４、Ｇｌｕ５１６、もしくはＬｅｕ５１８のうちの、少なくとも１つに（さらに）結合するか、もしくはこれらに（さらに）特異的に結合し；アミノ酸Ａｒｇ３５７に（さらに）結合するか、もしくはこれに（さらに）特異的に結合するか；または
（４６）アミノ酸Ｔｈｒ３９３（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９３）、Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、Ｖａｌ３９５、もしくはＴｙｒ３９６のうちの、少なくとも１つに結合するか、もしくはこれらに特異的に結合し；アミノ酸Ｌｙｓ４６２（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ａｒｇ４６２）、Ｐｈｅ４６４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｔｙｒ４６４）、Ｇｌｕ４６５（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｇｌｙ４６５）、もしくはＡｒｇ４６６のうちの、少なくとも１つに（さらに）結合するか、もしくはこれらに（さらに）特異的に結合し；アミノ酸Ｓｅｒ５１４、Ｇｌｕ５１６、もしくはＬｅｕ５１８のうちの、少なくとも１つに（さらに）結合するか、もしくはこれらに（さらに）特異的に結合し；アミノ酸Ａｒｇ３５７に（さらに）結合するか、もしくはこれに（さらに）特異的に結合するか；または
（４７）アミノ酸Ｔｈｒ３９３（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９３）、Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、Ｖａｌ３９５、Ｔｙｒ３９６、Ｌｙｓ４６２（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ａｒｇ４６２）、Ｐｈｅ４６４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｔｙｒ４６４）、Ｇｌｕ４６５（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｇｌｙ４６５）、Ａｒｇ４６６、Ｓｅｒ５１４、Ｇｌｕ５１６、またはＬｅｕ５１８、およびＡｒｇ３５７に結合するか、またはこれらに特異的に結合する。
本明細書の上記で言及された、アミノ酸およびアミノ酸の番号付けは、配列番号３０において規定された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質と比べた／これに対応するアミノ酸およびアミノ酸の番号付けであり；他のサルベコウイルスのスパイクタンパク質内、またはＲＢＤドメイン内の、対応するアミノ酸は、例えば、図１６Ｂ）に描示された、複数のアミノ酸配列をアライメントすることにより、容易に決定されうる。
アミノ酸Ｔｈｒ３９３（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９３）、Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、Ｖａｌ３９５、またはＴｙｒ３９６のうちの、少なくとも１つへの結合または特異的結合については、本明細書の以下の（４８）～（５８）において、さらに説明される。特に、これらの薬剤は、
（４８）少なくとも、アミノ酸Ｔｈｒ３９３（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９３）、およびＡｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）に結合するか、もしくはこれらに特異的に結合することなど；
（４９）少なくとも、アミノ酸Ｔｈｒ３９３（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９３）、およびＶａｌ３９５に結合するか、もしくはこれらに特異的に結合することなど；
（５０）少なくとも、アミノ酸Ｔｈｒ３９３（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９３）、およびＴｙｒ３９６に結合するか、もしくはこれらに特異的に結合することなど；
（５１）少なくとも、アミノ酸Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、およびＶａｌ３９５に結合するか、もしくはこれらに特異的に結合することなど；
（５２）少なくとも、アミノ酸Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、およびＴｙｒ３９６に結合するか、もしくはこれらに特異的に結合することなど；
（５３）少なくとも、アミノ酸Ｖａｌ３９５、およびＴｙｒ３９６に結合するか、もしくはこれらに特異的に結合することなど；
（５４）少なくとも、アミノ酸Ｔｈｒ３９３（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９３）、Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、およびＶａｌ３９５に結合するか、もしくはこれらに特異的に結合することなど；
（５５）少なくとも、アミノ酸Ｔｈｒ３９３（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９３）、Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、およびＴｙｒ３９６に結合するか、もしくはこれらに特異的に結合することなど；
（５６）少なくとも、アミノ酸Ｔｈｒ３９３（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９３）、Ｖａｌ３９５、およびＴｙｒ３９６に結合するか、もしくはこれらに特異的に結合することなど；
（５７）少なくとも、アミノ酸Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、Ｖａｌ３９５、およびＴｙｒ３９６に結合するか、もしくはこれらに特異的に結合することなど；または
（５８）少なくとも、アミノ酸Ｔｈｒ３９３（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９３）、Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、Ｖａｌ３９５、およびＴｙｒ３９６に結合するか、もしくはこれらに特異的に結合することなど；
（２５）アミノ酸Ｔｈｒ３９３（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９３）、Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、Ｖａｌ３９５、またはＴｙｒ３９６のうちの、少なくとも１つに結合するか、またはこれらに特異的に結合し；
本明細書の上記で言及された、アミノ酸およびアミノ酸の番号付けは、配列番号３０において規定された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質と比べた／これに対応するアミノ酸およびアミノ酸の番号付けであり；他のサルベコウイルスのスパイクタンパク質内、またはＲＢＤドメイン内の、対応するアミノ酸は、例えば、図１６Ｂ）に描示された、複数のアミノ酸配列をアライメントすることにより、容易に決定されうる。
アミノ酸Ｌｙｓ４６２、Ｐｈｅ４６４、Ｇｌｕ４６５、またはＡｒｇ４６６のうちの、少なくとも１つへの結合または特異的結合については、本明細書の以下の（５９）～（６９）において、さらに説明される。特に、これらの薬剤は、
（５９）少なくとも、アミノ酸Ｌｙｓ４６２（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ａｒｇ４６２）、およびＰｈｅ４６４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｔｙｒ４６４）に結合するか、もしくはこれらに特異的に結合することなど；
（６０）少なくとも、アミノ酸Ｌｙｓ４６２（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ａｒｇ４６２）、およびＧｌｕ４６５（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｇｌｙ４６５）に結合するか、もしくはこれらに特異的に結合することなど；
（６１）少なくとも、アミノ酸Ｌｙｓ４６２（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ａｒｇ４６２）、およびＡｒｇ４６６に結合するか、もしくはこれらに特異的に結合することなど；
（６２）少なくとも、アミノ酸Ｐｈｅ４６４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｔｙｒ４６４）、およびＧｌｕ４６５（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｇｌｙ４６５）に結合するか、もしくはこれらに特異的に結合することなど；
（６３）少なくとも、アミノ酸Ｐｈｅ４６４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｔｙｒ４６４）、およびＡｒｇ４６６に結合するか、もしくはこれらに特異的に結合することなど；
（６４）少なくとも、アミノ酸Ｇｌｕ４６５（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｇｌｙ４６５）、およびＡｒｇ４６６に結合するか、もしくはこれらに特異的に結合することなど；
（６５）少なくとも、アミノ酸Ｌｙｓ４６２（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ａｒｇ４６２）、Ｐｈｅ４６４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｔｙｒ４６４）、およびＧｌｕ４６５に結合するか、もしくはこれらに特異的に結合することなど；
（６６）少なくとも、アミノ酸Ｌｙｓ４６２（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ａｒｇ４６２）、Ｐｈｅ４６４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｔｙｒ４６４）、およびＡｒｇ４６６に結合するか、もしくはこれらに特異的に結合することなど；
（６７）少なくとも、アミノ酸Ｌｙｓ４６２（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ａｒｇ４６２）、Ｇｌｕ４６５（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｇｌｙ４６５）、およびＡｒｇ４６６に結合するか、もしくはこれらに特異的に結合することなど；
（６８）少なくとも、アミノ酸Ｐｈｅ４６４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｔｙｒ４６４）、Ｇｌｕ４６５（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｇｌｙ４６５）、およびＡｒｇ４６６に結合するか、もしくはこれらに特異的に結合することなど；または
（６９）少なくとも、アミノ酸Ｌｙｓ４６２（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ａｒｇ４６２）、Ｐｈｅ４６４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｔｙｒ４６４）、Ｇｌｕ４６５（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｇｌｙ４６５）、およびＡｒｇ４６６に結合するか、もしくはこれらに特異的に結合することなど；
（２６）アミノ酸Ｌｙｓ４６２（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ａｒｇ４６２）、Ｐｈｅ４６４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｔｙｒ４６４）、Ｇｌｕ４６５（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｇｌｙ４６５）、またはＡｒｇ４６６のうちの、少なくとも１つに結合するか、またはこれらに特異的に結合し；
本明細書の上記で言及された、アミノ酸およびアミノ酸の番号付けは、配列番号３０において規定された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質と比べた／これに対応するアミノ酸およびアミノ酸の番号付けであり；他のサルベコウイルスのスパイクタンパク質内、またはＲＢＤドメイン内の、対応するアミノ酸は、例えば、図１６Ｂ）に描示された、複数のアミノ酸配列をアライメントすることにより、容易に決定されうる。
アミノ酸Ｓｅｒ５１４、Ｇｌｕ５１６、またはＬｅｕ５１８のうちの、少なくとも１つへの結合または特異的結合については、本明細書の以下の（７０）～（７３）において、さらに説明される。特に、これらの薬剤は、
（７０）少なくとも、アミノ酸Ｓｅｒ５１４およびＧｌｕ５１６に結合するか、もしくはこれらに特異的に結合することなど；
（７１）少なくとも、アミノ酸Ｓｅｒ５１４、およびＬｅｕ５１８に結合するか、もしくはこれらに特異的に結合することなど；
（７２）少なくとも、アミノ酸Ｇｌｕ５１６、およびＬｅｕ５１８に結合するか、もしくはこれらに特異的に結合することなど；または
（７３）少なくとも、アミノ酸Ｓｅｒ５１４、Ｇｌｕ５１６、およびＬｅｕ５１８に結合するか、もしくはこれらに特異的に結合することなど；
（２７）アミノ酸Ｓｅｒ５１４、Ｇｌｕ５１６、またはＬｅｕ５１８のうちの、少なくとも１つに結合するか、またはこれらに特異的に結合し；
本明細書の上記で言及された、アミノ酸およびアミノ酸の番号付けは、配列番号３０において規定された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質と比べた／これに対応するアミノ酸およびアミノ酸の番号付けであり；他のサルベコウイルスのスパイクタンパク質内、またはＲＢＤドメイン内の、対応するアミノ酸は、例えば、図１６Ｂ）に描示された、複数のアミノ酸配列をアライメントすることにより、容易に決定されうる。
特定の一実施形態では、サルベコウイルス結合剤は、ＳＰＲＢＤ（サルベコウイルススパイクタンパク質受容体結合ドメイン（ｓａｒｂｅｃｏｖｉｒｕｓ ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ））に結合し、サルベコウイルス結合剤自体が、ＳＰＲＢＤに結合している場合に、アンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）の、ＳＰＲＢＤへの結合を可能とし、少なくとも、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１を中和し、特に、少なくとも、本明細書で記載される、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株である、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１を中和し、配列番号３０において規定された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸Ｔｈｒ３９３（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９３）、Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、Ｖａｌ３９５、またはＴｙｒ３９６のうちの、少なくとも１つに結合することにおいて規定されうる／このことを特徴としうる。このような薬剤は、Ｓ１部の排出を誘導することにより、さらに特徴付けられうる。
本明細書で記載される結合剤またはパートナーの、サルベコウイルススパイクタンパク質、またはその中のＲＢＤドメインとの相互作用は、構造モデルから導出されうる。特に、相互作用は、結合パートナーの原子（例えば、アミノ酸、またはアミノ酸側鎖、またはアミノ酸水素）と、サルベコウイルススパイクタンパク質、またはその中のＲＢＤドメインの原子（例えば、アミノ酸、またはアミノ酸側鎖、またはアミノ酸水素）との間の分子間距離との関係で記載されうる。ＦａｓｔＣｏｎｔａｃｔ（Ｃｈａｍｐら、２００７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、３５：Ｗ５５６～Ｗ５６０）など、複合体の結合自由エネルギーが推定されるアルゴリズムが存在する。ＦａｓｔＣｏｎｔａｃｔアルゴリズムでは、脱溶媒和相互作用の範囲は、例えば、６オングストローム（ポテンシャルは、５～７オングストロームの間で、ゼロまで下がる）に適合させられる場合もあり、９オングストローム（ポテンシャルは、８～１０オングストロームの間で、ゼロまで下がる）に適合させられる場合もあり；静電エネルギーおよびファンデルワールスエネルギーは、ＦａｓｔＣｏｎｔａｃｔアルゴリズムにより使用される、他の成分である。
したがって、（７４）本明細書で記載される結合剤またはパートナーの、サルベコウイルススパイクタンパク質、またはその中のＲＢＤドメインとの相互作用は、２つの原子の間の距離が、例えば、１オングストローム（Å）～１０Åの間、１Å～９Åの間、１Å～８Åの間、１Å～７Åの間、１Å～６Åの間、１Å～５Åの間、１Å～４Åの間、１Å～３Åの間、１Å～２Åの間であり、構造が分解されたときの分解能に依存する場合に、結合パートナーの原子と、サルベコウイルススパイクタンパク質、またはその中のＲＢＤドメインの原子との間の相互作用（本明細書の上記で記載された）を、真の相互作用と規定することにより、構造モデルから導出されうる。代替的に、サルベコウイルススパイクタンパク質、またはその中のＲＢＤドメインの残基は、結合剤またはパートナーの残基と「接触し」、本明細書では、このような「接触」は、距離を４Åもしくはこれ未満、５Åもしくはこれ未満、６Åもしくはこれ未満、７Åもしくはこれ未満、８Åもしくはこれ未満、９Åもしくはこれ未満、または１０Åもしくはこれ未満とする、残基の間の（分子間）接触として規定されうる。
特に、（７５）結合剤またはパートナーは、本明細書で記載されるＩＳＶＤ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）の、１つもしくは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）であるか、もしくはこれらを含むか、または本明細書で記載される、１つもしくは複数のＩＳＶＤを含み、本明細書の上記で詳細に記載された、サルベコウイルススパイクタンパク質の部分またはＲＢＤドメイン（ＩＳＶＤのエピトープ）に結合する。このように、本明細書で記載されるＩＳＶＤのアミノ酸（またはその部分）は、サルベコウイルススパイクタンパク質／ＲＢＤドメインのアミノ酸（またはその部分）と接触するか、またはこれらと相互作用し、この場合、接触距離または相互作用距離は、１オングストローム（Å）～１０Åの間、１Å～９Åの間、１Å～８Åの間、１Å～７Åの間、１Å～６Åの間、１Å～５Åの間、１Å～４Åの間、１Å～３Åの間、１Å～２Åの間であるか；または４Åもしくはこれ未満、５Åもしくはこれ未満、６Åもしくはこれ未満、７Åもしくはこれ未満、８Åもしくはこれ未満、９Åもしくはこれ未満、または１０Åもしくはこれ未満であり、距離の下限は、決定された構造の分解能により規定される。
特に、（７６）結合剤またはパートナーの部分（本明細書で記載されたＣＤＲおよび／またはＩＳＶＤのアミノ酸（またはその部分）など）は、
アミノ酸Ｔｈｒ３９３（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９３）、Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、Ｖａｌ３９５、もしくはＴｙｒ３９６のうちの、少なくとも１つ；および／またはアミノ酸Ｌｙｓ４６２（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ａｒｇ４６２）、Ｐｈｅ４６４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｔｙｒ４６４）、Ｇｌｕ４６５（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｇｌｙ４６５）、もしくはＡｒｇ４６６のうちの、少なくとも１つ；および／またはアミノ酸Ｓｅｒ５１４、Ｇｌｕ５１６、もしくはＬｅｕ５１８のうちの、少なくとも１つ；および／またはアミノ酸Ａｒｇ３５７（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｌｙｓ３５７）（本明細書の上記で言及された、アミノ酸およびアミノ酸の番号付けは、配列番号３０において規定された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質と比べた／これに対応するアミノ酸およびアミノ酸の番号付けであり；他のサルベコウイルスのスパイクタンパク質内、またはＲＢＤドメイン内の、対応するアミノ酸は、例えば、図１６Ｂに描示された、複数のアミノ酸配列をアライメントすることにより、容易に決定されうる）と；または
配列番号３０において規定された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、Ｔｙｒ３９６、Ｐｈｅ４６４、Ｓｅｒ５１４、Ｇｌｕ５１６、およびＡｒｇ３５５のうちの、少なくとも１つ；任意選択で、さらに、アミノ酸Ａｒｇ３５７（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｌｙｓ３５７）、および／もしくはＬｙｓ４６２（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ａｒｇ４６２）、および／もしくはＧｌｕ４６５（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｇｌｙ４６５）、および／もしくはＡｒｇ４６６、および／もしくはＬｅｕ５１８と、
１オングストローム（Å）～１０Åの間、１Å～９Åの間、１Å～８Åの間、１Å～７Åの間、１Å～６Åの間、１Å～５Åの間、１Å～４Åの間、１Å～３Åの間、１Å～２Åの間；または４Åもしくはこれ未満、５Åもしくはこれ未満、６Åもしくはこれ未満、７Åもしくはこれ未満、８Åもしくはこれ未満、９Åもしくはこれ未満、または１０Åもしくはこれ未満の距離で接触するか、または相互作用する。
別の態様では、本発明に従う結合剤は、ポリペプチド性結合剤（すなわち、ペプチド性部分、ポリペプチド性部分、もしくはタンパク質性部分を含む結合剤、またはペプチド、ポリペプチド、タンパク質、もしくはタンパク質ドメインを含む結合剤）、またはポリペプチド結合剤（すなわち、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である結合剤）として、構造的に規定される。より特定すると、本発明に従う結合剤は、本明細書の下記で規定される、ＩＳＶＤ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）のうちのいずれかに含まれる、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、ポリペプチド性結合剤またはポリペプチド結合剤として、構造的に規定されうる。より特定すると、一実施形態では、本発明に従う結合剤は、本明細書の下記で規定される、ＩＳＶＤ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）に含まれる、少なくともＣＤＲ３を含む、ポリペプチド性結合剤またはポリペプチド結合剤として、構造的に規定されうる。別の実施形態では、本発明に従う結合剤は、本明細書の下記で規定される、ＩＳＶＤ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）に含まれる、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のうちの、少なくとも２つ（例えば、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２）、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の３つ全てを含む、ポリペプチド性結合剤またはポリペプチド結合剤として、構造的に規定されうる。より特定すると、このようなＣＤＲは、本明細書の下記で描示される通り、ＶＨＨ３．１１７（配列番号１により規定された／に明示された）、ＶＨＨ３．９２（配列番号２により規定された／に明示された）、ＶＨＨ３．９４（配列番号３により規定された／に明示された）、ＶＨＨ３．４２（配列番号４により規定された／に明示された）、またはＶＨＨ３．１８０（配列番号５により規定された／に明示された）のうちのいずれかの中に含まれる：
他の実施形態では、このようなＣＤＲは、本明細書の下記で描示される通り、ＶＨＨ３．８９（配列番号５３により規定された／に明示された）、ＶＨＨ３＿１８３（配列番号５４により規定された／に明示された）、またはＶＨＨ３Ｃ＿８０（配列番号５５により規定された／に明示された）のうちのいずれかの中に含まれうる：
本明細書で概括および規定される通り（定義および図４２を参照されたい）、これらのタンパク質配列内のＣＤＲおよびフレームワーク領域（ＦＲ）の画定を含む、免疫グロブリンタンパク質配列内のアミノ酸の番号付けのために、多くのシステムまたは方法（Ｋａｂａｔ、ＭａｃＣａｌｌｕｍ、ＩＭＧＴ、ＡｂＭ、Ｃｈｏｔｈｉａ）が存在する。これらのシステムまたは方法は、当業者に公知であるので、当業者は、これらのシステムまたは方法を、不要な労力を伴わずに、任意の免疫グロブリンタンパク質配列に適用しうる。したがって、本明細書で記載される、結合剤またはサルベコウイルス結合剤は、例えば、配列番号１～５または５３～５５のうちのいずれかに存在し、Ｋａｂａｔ、ＭａｃＣａｌｌｕｍ、ＩＭＧＴ、ＡｂＭ、またはＣｈｏｔｈｉａに従いアノテーションされる（図４２中の、ＶＨＨ３．１１７およびＶＨＨ３．８９について例示される）相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むことを特徴としうる。
非限定例としてだけ述べると、ＶＨＨ３．１１７、ＶＨＨ３．９２、ＶＨＨ３．９４、ＶＨＨ３．４２、またはＶＨＨ３．１８０のうちのいずれかに含まれるＣＤＲは、Ｋａｂａｔに従い、またはＫａｂａｔシステムもしくはＫａｂａｔ法に従い決定された。複数の実施形態では、例として、Ｋａｂａｔ法を利用することにより、本発明のＩＳＶＤに含まれるＣＤＲは、
ＣＤＲ１：ＩＸＤＭＧ［配列中、２位におけるＸ（Ｘａａ）は、Ｓ（Ｓｅｒ、セリン）、またはＮ（Ａｓｎ、アスパラギン）である］（配列番号６）（より特定すると、ＣＤＲ１は、ＩＳＤＭＧ（配列番号９；ＶＨＨ３．１１７、ＶＨＨ３．９２、ＶＨＨ３．９４およびＶＨＨ３．１８０内に含まれる）、またはＩＮＤＭＧ（配列番号１０；ＶＨＨ３．４２内に含まれる）として規定されうる）；
ＣＤＲ２：ＴＩＴＫＸＧＸＴＮＹＡＸＳＸＸＧ［配列中、５位におけるＸ（Ｘａａ）は、Ｔ（Ｔｈｒ、トレオニン）、またはＳ（Ｓｅｒ、セリン）であり、７位におけるＸ（Ｘａａ）は、Ｓ（Ｓｅｒ、セリン）、またはＮ（Ａｓｎ、アスパラギン）であり、１２位におけるＸ（Ｘａａ）は、Ｄ（Ａｓｐ、アスパラギン酸）、またはＮ（Ａｓｎ、アスパラギン）であり、１４位におけるＸ（Ｘａａ）は、Ａ（Ａｌａ、アラニン）、またはＶ（Ｖａｌ、バリン）であり、１５位におけるＸ（Ｘａａ）は、Ｑ（Ｇｌｎ、グルタミン）、またはＫ（Ｌｙｓ、リシン）である］（配列番号７）（より特定すると、ＣＤＲ２は、ＴＩＴＫＴＧＳＴＮＹＡＤＳＡＱＧ（配列番号１１；ＶＨＨ３．１１７およびＶＨＨ３．１８０内に含まれる）、ＴＩＴＫＴＧＮＴＮＹＡＤＳＡＱＧ（配列番号１２；ＶＨＨ３．９２内に含まれる）、ＴＩＴＫＳＧＳＴＮＹＡＮＳＡＱＧ（配列番号１３；ＶＨＨ３．９４内に含まれる）、またはＴＩＴＫＴＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１４；ＶＨＨ３．４２内に含まれる）として規定されうる）；
ＣＤＲ３：ＷＬＸＹＧＭＧＰＤＹＹＧＭＥ［配列中、３位におけるＸ（Ｘａａ）は、Ｐ（Ｐｒｏ、プロリン）、またはＬ（Ｌｅｕ、ロイシン）である］（配列番号８）（より特定すると、ＣＤＲ３は、ＷＬＰＹＧＭＧＰＤＹＹＧＭＥ（配列番号１５；ＶＨＨ３．１１７、ＶＨＨ３．９２、ＶＨＨ３．９４およびＶＨＨ３．４２内に含まれる）、またはＷＬＬＹＧＭＧＰＤＹＹＧＭＥ（配列番号１６；ＶＨＨ３．１８０内に含まれる）として規定されうる）
と規定されうる。
より特定すると、本発明のポリペプチド性（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｉｃ）結合剤またはポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）結合剤は、以下の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットのうちの１つを含む結合剤として規定される場合があり、この場合、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔに従い、
・配列番号６により規定された／これにおいて明示されたＣＤＲ１、配列番号７により規定された／これにおいて明示されたＣＤＲ２、および配列番号８により規定された／これにおいて明示されたＣＤＲ３；または
・配列番号９により規定された／これにおいて明示されたＣＤＲ１、配列番号１１により規定された／これにおいて明示されたＣＤＲ２、および配列番号１５により規定された／これにおいて明示されたＣＤＲ３；または
・配列番号９により規定された／これにおいて明示されたＣＤＲ１、配列番号１２により規定された／これにおいて明示されたＣＤＲ２、および配列番号１５により規定された／これにおいて明示されたＣＤＲ３；または
・配列番号９により規定された／これにおいて明示されたＣＤＲ１、配列番号１３により規定された／これにおいて明示されたＣＤＲ２、および配列番号１５により規定された／これにおいて明示されたＣＤＲ３；または
・配列番号１０により規定された／これにおいて明示されたＣＤＲ１、配列番号１４により規定された／これにおいて明示されたＣＤＲ２、および配列番号１５により規定された／これにおいて明示されたＣＤＲ３；または
・配列番号９により規定された／これにおいて明示されたＣＤＲ１、配列番号１１により規定された／これにおいて明示されたＣＤＲ２、および配列番号１６により規定された／これにおいて明示されたＣＤＲ３
と規定される。
さらなる非限定例としてだけ述べると、ＶＨＨ３．８９、ＶＨＨ３＿１８３、またはＶＨＨ３Ｃ＿８０のうちのいずれかに含まれるＣＤＲは、Ｋａｂａｔに従い、またはＫａｂａｔシステムもしくはＫａｂａｔ法に従い決定された。代替的実施形態では、例として、Ｋａｂａｔ法を利用することにより、本発明のＩＳＶＤに含まれるＣＤＲは、
ＣＤＲ１：ＸＹＸＸＧ［配列中、１位におけるＸ（Ｘａａ）は、ＤまたはＹであり、３位におけるＸ（Ｘａａ）は、ＤまたはＡであり、４位におけるＸ（Ｘａａ）は、ＶまたはＩである］（配列番号７６）（より特定すると、ＣＤＲ１は、ＹＹＡＩＧ（配列番号６９；ＶＨＨ３．８９およびＶＨＨ３＿１８３内に含まれる）、またはＤＹＤＶＧ（配列番号７０；ＶＨＨ３Ｃ＿８０内に含まれる）として規定されうる）；
ＣＤＲ２：ＲＩＸＳＳＤＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ［配列中、３位におけるＸ（Ｘａａ）は、ＤまたはＥである］（配列番号７７）（より特定すると、ＣＤＲ２は、ＲＩＤＳＳＤＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７１；ＶＨＨ３．８９およびＶＨＨ３Ｃ＿８０内に含まれる）、ＲＩＥＳＳＤＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７２；ＶＨＨ３＿１８３内に含まれる）として規定されうる）；
ＣＤＲ３：ＤＰＩＩＸＧＸＸＷＹＷＴ［配列中、５位におけるＸ（Ｘａａ）は、ＲまたはＱであり、７位におけるＸ（Ｘａａ）は、Ｒ、Ｓ、またはＨであり、８位におけるＸ（Ｘａａ）は、ＮまたはＳである］（配列番号７８）（より特定すると、ＣＤＲ３は、ＤＰＩＩＱＧＲＮＷＹＷＴ（配列番号７３；ＶＨＨ３．８９内に含まれる）、またはＤＰＩＩＱＧＳＳＷＹＷＴ（配列番号７４；ＶＨＨ３＿１８３内に含まれる）、またはＤＰＩＩＲＧＨＮＷＹＷＴ（配列番号７５；ＶＨＨ３Ｃ＿８０内に含まれる）として規定されうる）
と規定されうる。
より特定すると、本発明のポリペプチド性結合剤またはポリペプチド結合剤は、以下の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットのうちの１つを含む結合剤として規定される場合があり、この場合、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔに従い、
・配列番号７６により規定された／これにおいて明示されたＣＤＲ１、配列番号７７により規定された／これにおいて明示されたＣＤＲ２、および配列番号７８により規定された／これにおいて明示されたＣＤＲ３；または
・配列番号６９により規定された／これにおいて明示されたＣＤＲ１、配列番号７１により規定された／これにおいて明示されたＣＤＲ２、および配列番号７３により規定された／これにおいて明示されたＣＤＲ３（ＶＨＨ３．８９内に存在するＣＤＲに対応する）；または
・配列番号６９により規定された／これにおいて明示されたＣＤＲ１、配列番号７２により規定された／これにおいて明示されたＣＤＲ２、および配列番号７４により規定された／これにおいて明示されたＣＤＲ３（ＶＨＨ３＿１８３内に存在するＣＤＲに対応する）；または
・配列番号７０により規定された／これにおいて明示されたＣＤＲ１、配列番号７１により規定された／これにおいて明示されたＣＤＲ２、および配列番号７５により規定された／これにおいて明示されたＣＤＲ３（ＶＨＨ３Ｃ＿８０内に存在するＣＤＲに対応する
と規定される。
さらなる態様では、本発明に従うポリペプチド性結合剤またはポリペプチド結合剤は、本明細書の上記で規定されたＩＳＶＤのうちのいずれかに含まれた、１つまたは複数のフレームワーク領域（ＦＲ）を含みうる。より特定すると、このような結合剤は、本明細書の上記で規定されたＩＳＶＤのうちのいずれかに含まれた、ＦＲ１領域、ＦＲ２領域、ＦＲ３領域、またはＦＲ４領域を含みうる。より特定すると、このような結合剤は、本明細書の上記で規定されたＩＳＶＤのうちのいずれかに含まれた、ＦＲ１領域およびＦＲ２領域、ＦＲ１領域およびＦＲ３領域、ＦＲ１領域およびＦＲ４領域、ＦＲ２領域およびＦＲ３領域、ＦＲ２領域およびＦＲ４領域、ＦＲ３領域およびＦＲ４領域、ＦＲ１領域、ＦＲ２領域、およびＦＲ３領域、ＦＲ１領域、ＦＲ２領域、およびＦＲ４領域、ＦＲ２領域、ＦＲ３領域、およびＦＲ４領域、またはＦＲ１領域、ＦＲ３領域、およびＦＲ４領域を含みうる。一実施形態では、このような結合剤は、本明細書の上記で規定されたＩＳＶＤのうちのいずれかに含まれた、ＦＲ１領域、またはＦＲ４領域、またはＦＲ２領域、およびＦＲ３領域を含む。
本明細書の上記で概括および規定された通り、これらのタンパク質配列内のＦＲの画定を含む、免疫グロブリンタンパク質配列内のアミノ酸の番号付けのために、多くのシステムまたは方法（Ｋａｂａｔ、ＭａｃＣａｌｌｕｍ、ＩＭＧＴ、ＡｂＭ、またはＣｈｏｔｈｉａ）が存在する。これらのシステムまたは方法は、当業者に公知であるので、当業者は、これらのシステムまたは方法を、不要な労力を伴わずに、任意の免疫グロブリンタンパク質配列に適用しうる。
非限定例としてだけ述べると、ＶＨＨ３．１１７、ＶＨＨ３．９２、ＶＨＨ３．９４、ＶＨＨ３．４２、またはＶＨＨ３．１８０のうちのいずれかに含まれるＦＲは、Ｋａｂａｔに従い、またはＫａｂａｔシステムもしくはＫａｂａｔ法に従い決定された。複数の実施形態では、例として、Ｋａｂａｔ法を利用することにより、本発明のＩＳＶＤに含まれるＦＲは、
ＦＲ１：ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＸＶＱＸＧＸＳＬＸＬＸＣＡＡＳＧＸＡＶＳ［配列中、１１位におけるＸ（Ｘａａ）は、Ｌ（Ｌｅｕ、ロイシン）、またはＳ（Ｓｅｒ、セリン）であり、１４位におけるＸ（Ｘａａ）は、Ｐ（Ｐｒｏ、プロリン）、またはＡ（Ａｌａ、アラニン）であり、１６位におけるＸ（Ｘａａ）は、Ｇ（Ｇｌｙ、グリシン）、またはＲ（Ａｒｇ、アルギニン）であり、１９位におけるＸ（Ｘａａ）は、Ｒ（Ａｒｇ、アルギニン）、またはＴ（Ｔｈｒ、トレオニン）であり、２１位におけるＸ（Ｘａａ）は、Ｓ（Ｓｅｒ、セリン）、またはＮ（Ａｓｎ、アスパラギン）であり、２７位におけるＸ（Ｘａａ）は、Ｋ（Ｌｙｓ、リシン）、またはＳ（Ｓｅｒ、セリン）である］（配列番号１７）（より特定すると、ＦＲ１は、ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＫＡＶＳ（配列番号２１；ＶＨＨ３．１１７、ＶＨＨ３．９２、およびＶＨＨ３．９４内に含まれる）、ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＳＡＶＳ（配列番号２２；ＶＨＨ３．４２内に含まれる）、またはＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＲＳＬＴＬＮＣＡＡＳＧＫＡＶＳ（配列番号２３；ＶＨＨ３．１８０内に含まれる）として規定されうる）；
ＦＲ２：ＷＹＲＱＰＰＧＫＱＲＥＬＶＡ（配列番号１８；ＶＨＨ３．１１７、ＶＨＨ３．９２、ＶＨＨ３．９４、ＶＨＨ３．４２およびＶＨＨ３．１８０内に含まれる）；
ＦＲ３：ＲＦＴＩＳＲＤＮＸＫＸＡＶＹＬＥＭＸＳＬＫＰＥＤＴＡＸＹＹＣＮＡ［配列中、９位におけるＸ（Ｘａａ）は、Ｔ（Ｔｈｒ、トレオニン）、またはＡ（Ａｌａ、アラニン）であり、１１位におけるＸ（Ｘａａ）は、Ｓ（Ｓｅｒ、セリン）、またはＮ（Ａｓｎ、アスパラギン）であり、１８位におけるＸ（Ｘａａ）は、Ｋ（Ｌｙｓ、リシン）、Ａ（Ａｌａ、アラニン）、またはＮ（Ａｓｎ、アスパラギン）であり、２７位におけるＸ（Ｘａａ）は、Ｖ（Ｖａｌ、バリン）、またはＴ（Ｔｈｒ、トレオニン）である］（配列番号１９）（より特定すると、ＦＲ３は、ＲＦＴＩＳＲＤＮＴＫＳＡＶＹＬＥＭＫＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡ（配列番号２４；ＶＨＨ３．１１７内に含まれる）、ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＳＡＶＹＬＥＭＡＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡ（配列番号２５；ＶＨＨ３．９２内に含まれる）、ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＳＡＶＹＬＥＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡ（配列番号２６；ＶＨＨ３．９４およびＶＨＨ３．１８０内に含まれる）、またはＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＡＶＹＬＥＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＴＹＹＣＮＡ（配列番号２７；ＶＨＨ３．４２内に含まれる）として規定されうる）；
ＦＲ４：ＬＷＧＸＧＴＱＶＴＶＳＳ［配列中、４位におけるＸ（Ｘａａ）は、Ｋ（Ｌｙｓ、リシン）、またはＥ（Ｇｌｕ、グルタミン）である］（配列番号２０）（より特定すると、ＦＲ４は、ＬＷＧＫＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号２８；ＶＨＨ３．１１７、ＶＨＨ３．９２およびＶＨＨ３．４２内に含まれる）、またはＬＷＧＥＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号２９；ＶＨＨ３．９４およびＶＨＨ３．１８０内に含まれる）として規定されうる）
と規定されうる。
より特定すると、本発明のポリペプチド性結合剤またはポリペプチド結合剤は、配列番号２１～２３により規定される配列から選択されるＦＲ１のアミノ酸配列、配列番号１８により規定されるＦＲ２のアミノ酸配列、配列番号２４～２７により規定される配列から選択されるＦＲ３のアミノ酸配列、および配列番号２８または２９により規定される配列から選択されるＦＲ４のアミノ酸配列の組合せと、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を、併せて有する、フレームワーク領域である、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４のセットを含む結合剤として規定されうる。これは、ＦＲ配列対（すなわち、配列番号２１～２３のうちの１つを伴う、変異体ＦＲ１；配列番号１８を伴う、変異体ＦＲ２；配列番号２４～２７のうちの１つを伴う、変異体ＦＲ３；および配列番号２８または２９のうちの１つを伴う、変異体ＦＲ４）についての、４つの個別のアミノ酸アライメントにおいて、アミノ酸のうちの、全てを併せた、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％が、同一であることなどと理解されるものとする。
より特定すると、本発明のポリペプチド性結合剤またはポリペプチド結合剤は、以下のフレームワーク領域（ＦＲ）のセットのうちの１つを含む結合剤として規定される場合があり、この場合、ＦＲは、Ｋａｂａｔに従い、
・配列番号１７により規定された／これにおいて明示されたＦＲ１、配列番号１８により規定された／これにおいて明示されたＦＲ２、配列番号１９により規定された／これにおいて明示されたＦＲ３、および配列番号２０により規定された／これにおいて明示されたＦＲ４；または
・配列番号２１により規定された／これにおいて明示されたＦＲ１、配列番号１８により規定された／これにおいて明示されたＦＲ２、配列番号２４により規定された／これにおいて明示されたＦＲ３、および配列番号２８により規定された／これにおいて明示されたＦＲ４；または
・配列番号２１により規定された／これにおいて明示されたＦＲ１、配列番号１８により規定された／これにおいて明示されたＦＲ２、配列番号２５により規定された／これにおいて明示されたＦＲ３、および配列番号２８により規定された／これにおいて明示されたＦＲ４；または
・配列番号２１により規定された／これにおいて明示されたＦＲ１、配列番号１８により規定された／これにおいて明示されたＦＲ２、配列番号２６により規定された／これにおいて明示されたＦＲ３、および配列番号２８により規定された／これにおいて明示されたＦＲ４；または
・配列番号２２により規定された／これにおいて明示されたＦＲ１、配列番号１８により規定された／これにおいて明示されたＦＲ２、配列番号２７により規定された／これにおいて明示されたＦＲ３、および配列番号２８により規定された／これにおいて明示されたＦＲ４；または
・配列番号２３により規定された／これにおいて明示されたＦＲ１、配列番号１８により規定された／これにおいて明示されたＦＲ２、配列番号２６により規定された／これにおいて明示されたＦＲ３、および配列番号２９により規定された／これにおいて明示されたＦＲ４
と規定される。
さらなる非限定例としてだけ述べると、ＶＨＨ３．８９、ＶＨＨ３＿１８３およびＶＨＨ３Ｃ＿８０のうちのいずれかに含まれるＦＲは、Ｋａｂａｔに従い、またはＫａｂａｔシステムもしくはＫａｂａｔ法に従い決定された。代替的実施形態では、例として、Ｋａｂａｔ法を利用することにより、本発明のＩＳＶＤに含まれるＦＲは、
ＦＲ１：ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＸＶＱＰＧＸＳＬＲＬＳＣＸＸＳＧＸＴＬＤ［配列中、１１位におけるＸ（Ｘａａ）は、ＳまたはＬであり、１６位におけるＸ（Ｘａａ）は、ＥまたはＧであり、２３位におけるＸ（Ｘａａ）は、ＡまたはＶであり、２４位におけるＸ（Ｘａａ）は、ＧまたはＡであり、２７位におけるＸ（Ｘａａ）は、Ｈ、またはＦである］（配列番号８２）（より特定すると、ＦＲ１は、ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＬＤ（配列番号７９；ＶＨＨ３．８９内に含まれる）、またはＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＳＶＱＰＧＥＳＬＲＬＳＣＶＧＳＧＨＴＬＤ（配列番号８１；ＶＨＨ３Ｃ＿８０に含まれるとして規定されうる。代替的に、ＦＲ１は、ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＬＤ（配列番号８０；ＶＨＨ３．１８３内に含まれる）により提示される）；
ＦＲ２：ＷＦＲＸＸＰＧＫＥＲＥＸＬＳ（配列番号８６）［配列中、４位におけるＸ（Ｘａａ）は、ＱまたはＥであり、５位におけるＸ（Ｘａａ）は、ＡまたはＶであり、１２位におけるＸ（Ｘａａ）は、ＧまたはＶである］（より特定すると、ＦＲ２は、ＷＦＲＥＶＰＧＫＥＲＥＧＬＳ（配列番号８３；ＶＨＨ３．８９内に含まれる）、またはＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＬＳ（配列番号８４；ＶＨＨ３＿１８３内に含まれる）、またはＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＶＬＳ（配列番号８５；ＶＨＨ３Ｃ＿８０内に含まれる）として規定されうる）；
ＦＲ３：ＲＦＴＩＳＲＤＮＴＫＮＸＶＹＬＱＭＮＸＬＫＰＥＤＴＡＸＹＹＣＡＴ［配列中、１２位におけるＸ（Ｘａａ）は、ＩまたはＴであり、１９位におけるＸ（Ｘａａ）は、Ｍ、ＮまたはＳであり、２７位におけるＸ（Ｘａａ）は、ＶまたはＡである］（配列番号９０）（より特定すると、ＦＲ３は、ＲＦＴＩＳＲＤＮＴＫＮＩＶＹＬＱＭＮＮＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴ（配列番号８７；ＶＨＨ３．８９内に含まれる）、ＲＦＴＩＳＲＤＮＴＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴ（配列番号８８；ＶＨＨ３＿１８３内に含まれる）、またはＲＦＴＩＳＲＤＮＴＫＮＩＶＹＬＱＭＮＭＬＫＰＥＤＴＡＡＹＹＣＡＴ（配列番号８９；ＶＨＨ３Ｃ＿８０内に含まれる）として規定されうる）；
ＦＲ４：ＸＷＸＱＸＴＸＸＴＶＳＳ［配列中、１位におけるＸ（Ｘａａ）は、ＳまたはＧであり、３および５位におけるＸ（Ｘａａ）は、ＧまたはＳであり、７位におけるＸ（Ｘａａ）は、ＱまたはＨであり、８位におけるＸ（Ｘａａ）は、ＶまたはＩである］（配列番号９４）（より特定すると、ＦＲ４は、ＧＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号９１；ＶＨＨ３．８９内に含まれる）、またはＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号９２；ＶＨＨ３＿１８３内に含まれる）、またはＧＷＳＱＳＴＨＩＴＶＳＳ（配列番号９３；ＶＨＨ３Ｃ＿８０内に含まれる）として規定されうる）
と規定されうる。
より特定すると、本発明のポリペプチド性結合剤またはポリペプチド結合剤は、配列番号７９～８２により規定される配列から選択されるＦＲ１のアミノ酸配列、配列番号８３～８６により規定される配列から選択されるＦＲ２のアミノ酸配列、配列番号８７～９０により規定される配列から選択されるＦＲ３のアミノ酸配列、および配列番号９１～９４により規定される配列から選択されるＦＲ４のアミノ酸配列の組合せと、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を、併せて有する、フレームワーク領域である、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４のセットを含む結合剤として規定されうる。これは、ＦＲ配列対（すなわち、配列番号７９～８２のうちの１つを伴う、変異体ＦＲ１；配列番号８３～８６のうちの１つを伴う、変異体ＦＲ２；配列番号８７～９０のうちの１つを伴う、変異体ＦＲ３；および配列番号９１～９４のうちの１つを伴う、変異体ＦＲ４）についての、４つの個別のアミノ酸アライメントにおいて、アミノ酸のうちの、全てを併せた、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％が、同一であることなどと理解されるものとする。
より特定すると、本発明のポリペプチド性結合剤またはポリペプチド結合剤は、以下のフレームワーク領域（ＦＲ）のセットのうちの１つを含む結合剤として規定される場合があり、この場合、ＦＲは、Ｋａｂａｔに従い、
・配列番号７９により規定された／これにおいて明示されたＦＲ１、配列番号８３により規定された／これにおいて明示されたＦＲ２、配列番号８７により規定された／これにおいて明示されたＦＲ３、および配列番号９１により規定された／これにおいて明示されたＦＲ４；または
・配列番号８０により規定された／これにおいて明示されたＦＲ１、配列番号８４により規定された／これにおいて明示されたＦＲ２、配列番号８８により規定された／これにおいて明示されたＦＲ３、および配列番号９２により規定された／これにおいて明示されたＦＲ４；または
・配列番号８１により規定された／これにおいて明示されたＦＲ１、配列番号８５により規定された／これにおいて明示されたＦＲ２、配列番号８９により規定された／これにおいて明示されたＦＲ３、および配列番号９３により規定された／これにおいて明示されたＦＲ４
と規定される。
特定の一実施形態では、本発明のポリペプチド性結合剤またはポリペプチド結合剤は、全長ＩＳＶＤ、すなわち、配列番号１、２、３、４、または５のうちのいずれかにより規定されるか、またはこれにおいて明示された全長ＩＳＶＤとして規定される場合もあり、配列番号１、２、３、４、または５のうちのいずれかにより規定されるか、またはこれにおいて明示されたＩＳＶＤのうちのいずれかを含む、ポリペプチド性結合剤またはポリペプチド結合剤として規定される場合もある。別の特定の実施形態では、本発明のポリペプチド性結合剤またはポリペプチド結合剤は、全長ＩＳＶＤ、すなわち、配列番号５３、５４、または５５のうちのいずれかにより規定されるか、またはこれにおいて明示された全長ＩＳＶＤとして規定される場合もあり、配列番号５３、５４、または５５のうちのいずれかにより規定されるか、またはこれにおいて明示されたＩＳＶＤのうちのいずれかを含む、ポリペプチド性結合剤またはポリペプチド結合剤として規定される場合もある。
さらなる実施形態では、前記ポリペプチド性結合剤またはポリペプチド結合剤は、配列番号１、２、３、４、または５のうちのいずれかにより個別に規定されるか、またはこれにおいて個別に明示された、１つまたは複数のＩＳＶＤを含む場合もあり、配列番号１～５の群から選択される、１つまたは複数のＩＳＶＤを含む場合もある。さらなる実施形態では、前記ポリペプチド性結合剤またはポリペプチド結合剤は、配列番号５３、５４、または５５のうちのいずれかにより個別に規定されるか、またはこれにおいて個別に明示された、１つまたは複数のＩＳＶＤを含む場合もあり、配列番号５３、５４、または５５の群から選択される、１つまたは複数のＩＳＶＤを含む場合もある。
さらなる実施形態では、前記ポリペプチド性結合剤またはポリペプチド結合剤は、配列番号１～５の群から選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％の同一性、または配列番号１～５の群から選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも９５％の同一性を伴う、１つまたは複数のアミノ酸配列を含む。特に、このような非同一性またはばらつきは、ＦＲアミノ酸残基内の、非同一性またはばらつきに限定される。特に、このような非同一性またはばらつきは、例えば、配列番号５７～６１により規定されたＩＳＶＤのうちのいずれか１つであるが、これらに限定されない、ヒト化変異体など、配列番号１、２、３、４、または５のうちのいずれかにより規定されるか、またはこれにおいて明示されたＩＳＶＤのヒト化変異体を得るように導入されうる。特に、このようなヒト化変異体は、元のＩＳＶＤの機能的オーソログであり、この場合、機能的特色は、本明細書の上記で広範にわたり概括された、機能的特色（１）～（１２６）のうちの１つまたは複数である。
さらなる実施形態では、前記ポリペプチド性結合剤またはポリペプチド結合剤は、配列番号５３、５４、または５５の群から選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも９０％の同一性、または配列番号５３、５４、または５５の群から選択されるアミノ酸配列に対する、少なくとも９５％の同一性を伴う、１つまたは複数のアミノ酸配列を含み、特に、このような非同一性またはばらつきは、ＦＲアミノ酸残基内の、非同一性またはばらつきに限定される。特に、このような非同一性またはばらつきは、例えば、配列番号５６であるが、これらに限定されない、ヒト化変異体など、配列番号５３、５４、または５５のうちのいずれかにより規定されるか、またはこれにおいて明示されたＩＳＶＤのヒト化変異体を得るように導入されうる。特に、このようなヒト化変異体は、元のＩＳＶＤの機能的オーソログであり、この場合、機能的特色は、本明細書の上記で広範にわたり概括された、機能的特色（１）～（１２６）のうちの１つまたは複数である。
別の実施形態は、１つまたは複数のＩＳＶＤ（または本明細書で記載される変異体もしくはそのヒト化形態）を含む、前記ポリペプチド性結合剤またはポリペプチド結合剤に関し、少なくとも１つまたは複数のＩＳＶＤ（または本明細書で記載される変異体もしくはそのヒト化形態）は、Ｆｃドメインと結合または融合されるが、この場合、Ｆｃドメインとは、Ｆｃ受容体と呼ばれる細胞表面受容体、および補体系の一部のタンパク質と相互作用することが公知であるテール領域である、抗体の結晶化可能領域（Ｆｃ領域）を意味する。前記Ｆｃドメインは、抗体の２つの重鎖の、第２の定常ドメインおよび第３の定常ドメインに由来する、２つの同一なタンパク質断片から構成される。全ての常套的抗体は、Ｆｃドメインを含むので、Ｆｃドメイン融合体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＤ抗体Ｆｃ領域、なおより具体的には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４に由来するか、またはこれらの変異体としてのＦｃドメインを含みうる。ＩＳＶＤ融合構築物を作出するように、ＩｇＧ２のヒンジ領域が、ヒトＩｇＧ１のヒンジで置きかえられる場合もあり、この逆の場合もある。本明細書で同定されるＩＳＶＤを、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２のＦｃドメインへと融合するのに使用される、さらなるリンカーは、（Ｇ４Ｓ）２－３を含む。加えて、Ｍ２５７Ｙ／Ｓ２５９Ｔ／Ｔ２６１Ｅ（また、ＹＴＥとしても公知である）、またはＬＳ変異体（Ｍ４２８Ｌの、Ｎ４３４Ｓとの組合せ）など、公知の半減期延長を伴うＦｃ変異体も、使用されうる。これらの突然変異は、常套的抗体のＦｃドメインの、新生児受容体（ＦｃＲｎ）への結合を増大させる。
特定のさらなる実施形態では、１つまたは複数のＩＳＶＤ（または本明細書で記載される変異体もしくはそのヒト化形態）を含む、本発明のポリペプチド性結合剤またはポリペプチド結合剤は、「多価」形態または「多特異性」形態にあり、化学的に、または組換えＤＮＡ法により、２つまたはこれを超える、同一であるか、または変異体である、一価ＩＳＶＤ（または本明細書で記載される変異体もしくはそのヒト化形態）を、一体に結合させることにより形成される。前記多価形態は、直接、またはリンカーを介して、またはＦｃドメインコード配列による融合を介して、構成単位を接続することにより形成されうる。多価構築物の非限定例は、「二価」構築物、「三価」構築物、「四価」構築物などを含む。多価構築物内に含まれるＩＳＶＤ（または本明細書で記載される変異体もしくはそのヒト化形態は、同一の場合もあり、異なる場合もある。別の特定の実施形態では、本発明のＩＳＶＤ（または本明細書で記載される変異体もしくはそのヒト化形態）は、「多特異性」形態にあり、それらのうちの少なくとも１つの特異性が異なる、２つまたはこれを超えるＩＳＶＤを、一体に結合させることにより形成される。多特異的構築物の非限定例は、「二特異的」構築物、「三特異的」構築物、「四特異的」構築物などを含む。これをさらに例示するために、本発明の、任意の多価または多特異的（本明細書で規定される）ＩＳＶＤは、２つまたはこれを超える異なる抗原に対して、例えば、コロナＲＢＤに対して方向付けられ、１つのＩＳＶＤは、半減期延長ＩＳＶＤとして、血清アルブミンまたはＳｐＡに対して方向付けられうる。本発明の多価ＩＳＶＤまたは多特異的ＩＳＶＤはまた、アビディティーの増大、および／または所望のコロナＲＢＤとの相互作用についての選択性の改善、および／またはこのような多価ＩＳＶＤもしくは多特異的ＩＳＶＤ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）の使用により得られうる、他の任意の所望の特性、もしくは所望の特性の組合せも有しうる（またはこれらのために、操作および／または選択されうる）。
別の実施形態では、本発明は、本発明に従うＩＳＶＤ（または本明細書で記載される変異体もしくはそのヒト化形態）のうちのいずれかを、一価形態、多価形態、または多特異的形態で含む、ポリペプチド性結合剤またはポリペプチド結合剤を提供する。したがって、本明細書では、本明細書で記載されるＩＳＶＤ（または本明細書で記載される変異体もしくはそのヒト化形態）、またはその部分を含む、一価ポリペプチド性結合剤、多価ポリペプチド性結合剤、もしくは多特異的ポリペプチド性結合剤、または一価ポリペプチド結合剤、多価ポリペプチド結合剤、もしくは多特異的ポリペプチド結合剤が、非限定例として含まれる。
特に、本明細書で記載される、単一のＩＳＶＤ（または変異体もしくはそのヒト化形態）は、配列番号６３～６５のうちのいずれかにおいて規定される構築物など、そのＣ末端において、ＩｇＧ Ｆｃドメインへと融合される結果として、二価フォーマットのサルベコウイルス結合剤をもたらす場合があり、この場合、前記ＩＳＶＤ（または本明細書で記載される変異体もしくはそのヒト化形態）のうちの２つは、ＩｇＧ Ｆｃ部分のヒンジ領域内のジスルフィド架橋を介して、重鎖だけによる抗体型分子を形成する。前記そのヒト化形態は、ＩｇＧ配列内の、置換の中でも、Ｃ末端におけるリシンの欠失、ヒンジ領域内における変更または切断、本明細書で記載される、ＬＡＬＡ突然変異またはＬＡＬＡＰＧ突然変異など、当技術分野で公知のＩｇＧヒト化変異体を含むがこれらに限定されない。
他の本発明に従う結合剤は、配列番号１～５もしくは配列番号５３～５５のうちのいずれかにより規定されるか、またはこれにおいて明示されたＩＳＶＤのうちのいずれかが結合する同じエピトープに結合する、任意の化合物もしくは分子、またはサルベコウイルススパイクタンパク質もしくはその部分（本明細書の上記で記載された）への結合について、配列番号１～５もしくは配列番号５３～５５の群から選択されるアミノ酸配列により規定されたＩＳＶＤと競合する、任意の化合物もしくは分子である。「競合的」とは、前記競合的結合剤の存在下で、配列番号１～５もしくは配列番号５３～５５の群から選択されるアミノ酸配列により規定されたＩＳＶＤの、サルベコウイルススパイクタンパク質またはその部分、特に、配列番号３２または配列番号３３において描示された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ、または配列番号３４または配列番号３５において描示された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ ＲＢＤへの結合は、強度が、少なくとも３０％、または、少なくとも５０％、または、好ましくは、少なくとも８０％低減されることを意味する。より具体的に述べると、前記競合的結合剤は、サルベコウイルススパイクタンパク質上のエピトープであって、アミノ酸Ｔｈｒ３９３（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９３）、Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、Ｖａｌ３９５、もしくはＴｙｒ３９６のうちの、少なくとも１つを含み；かつ／またはアミノ酸Ｌｙｓ４６２（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ａｒｇ４６２）、Ｐｈｅ４６４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｔｙｒ４６４）、Ｇｌｕ４６５（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｇｌｙ４６５）、もしくはＡｒｇ４６６のうちの、少なくとも１つを伴い；かつ／またはアミノ酸Ｓｅｒ５１４、Ｇｌｕ５１６、もしくはＬｅｕ５１８のうちの、少なくとも１つを伴い；かつ／またはアミノ酸Ａｒｇ３５７（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｌｙｓ３５７）を伴い；言及された、アミノ酸およびアミノ酸の番号付けが、配列番号３０において規定された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質と比べた／これに対応するアミノ酸およびアミノ酸の番号付けであり；他のサルベコウイルスのスパイクタンパク質内、またはＲＢＤドメイン内の、対応するアミノ酸が、例えば、図１６Ｂ）に描示された、複数のアミノ酸配列をアライメントすることにより、容易に決定されうるエピトープに特異的に結合する。特に、このような他の結合剤は、本明細書の上記で広範にわたり概括された、機能的特色（１）～（１２６）のうちの１つまたは複数を理想的に保持する。
このように、一態様では、本発明は、サルベコウイルススパイクタンパク質、特に、サルベコウイルススパイクタンパク質内の、サルベコウイルスＲＢＤドメインに結合し、サルベコウイルススパイクタンパク質、特に、サルベコウイルススパイクタンパク質内の、サルベコウイルスＲＢＤドメインへの結合について、本明細書で記載されるＩＳＶＤ、またはその機能的部分と競合する化合物（目的の化合物）についてスクリーニングする方法に関する。このような方法は、一般に、以下のステップ：
・化合物または化合物のプールを用意するステップ；
・化合物または化合物のプールを、本明細書で記載されるＩＳＶＤ、またはその機能的部分の非存在下で、サルベコウイルスＲＢＤドメインと接触させるステップ；
・化合物または化合物のプールを、本明細書で記載されるＩＳＶＤ、またはその機能的部分の存在下で、サルベコウイルスＲＢＤドメインと接触させるステップ；
・化合物もしくは化合物のプールが、サルベコウイルスＲＢＤに結合しているＩＳＶＤ、もしくはその機能的部分の量を低減することが可能であるのかどうかについて測定、評価、決定、アッセイするステップ；またはＩＳＶＤ、もしくはその機能的部分が、サルベコウイルスＲＢＤに結合している化合物もしくは化合物のプールの量を低減することが可能であるのかどうかについて測定、評価、決定、アッセイするステップ；
・サルベコウイルスＲＢＤに結合しているＩＳＶＤ、もしくはその機能的部分の量が、化合物の存在下で低減される場合に、化合物を、サルベコウイルスＲＢＤへの結合についての、ＩＳＶＤ、もしくはその機能的部分の競合剤として同定するステップ；またはサルベコウイルスＲＢＤに結合しているＩＳＶＤ、もしくはその機能的部分の量が、化合物の存在下で低減される場合に、１つまたは複数の化合物を、サルベコウイルスＲＢＤへの結合についての、ＩＳＶＤ、もしくはその機能的部分の競合剤として含む、化合物のプールを同定するステップ；またはサルベコウイルスＲＢＤに結合している化合物の量が、ＩＳＶＤ、もしくはその機能的部分の存在下で低減される場合に、化合物を、サルベコウイルスＲＢＤへの結合についての、ＩＳＶＤ、もしくはその機能的部分の競合剤として同定するステップ；またはサルベコウイルスＲＢＤに結合している化合物もしくは化合物のプールの量が、ＩＳＶＤ、もしくはその機能的部分の存在下で低減される場合に、１つまたは複数の化合物を、サルベコウイルスＲＢＤへの結合についての、ＩＳＶＤ、もしくはその機能的部分の競合剤として含む、化合物のプールを同定するステップ
のうちの１つまたは複数を含む。
さらに別の態様では、本発明は、本明細書で同定される、ポリペプチド性サルベコウイルス結合剤、またはポリペプチドサルベコウイルス結合剤のポリペプチド部分をコードするコード配列などのヌクレオチド配列を含む、単離核酸、（単離）キメラ遺伝子構築物、発現カセット、組換えベクター（発現ベクターまたはクローニングベクターなど）などの核酸分子を提供する。
本発明のさらなる一態様は、本明細書で記載されるＩＳＶＤまたはその部分など、ポリペプチド性サルベコウイルス結合剤、もしくはポリペプチドサルベコウイルス結合剤、またはこれらの部分を含む宿主細胞をもたらす。したがって、宿主細胞は、前記ポリペプチド結合剤をコードする核酸分子を含みうる。宿主細胞は、原核細胞の場合もあり、真核細胞の場合もある。宿主細胞はまた、本発明のポリペプチド結合剤をコードする核酸分子である、単離ＤＮＡ分子を含有するように遺伝子修飾された細胞を伴う、組換え宿主細胞でもありうる。前記ＩＳＶＤを作製するのに使用されうる、代表的宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、および動物細胞を含むがこれらに限定されない。本発明の結合剤の作製に適する細菌宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属種細胞、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属種細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属種細胞、Ｅｒｗｉｎｉａ属種細胞、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属種細胞、Ｓｅｒｒａｔｉａ属種細胞、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属種細胞、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ属種細胞を含む。本発明による使用に適する、酵母宿主細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属（例えば、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、Ｙａｒｏｗｉａ属、Ｓｃｈｗａｎｉｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属などの中の種を含む。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、およびＫ．ｌａｃｔｉｓは、最も一般に使用される酵母宿主であり、好都合な真菌宿主である。本発明による使用に適する、動物宿主細胞は、昆虫細胞および哺乳動物細胞（最大限に特定すると、チャイニーズハムスター（例えば、ＣＨＯ）、およびＨｅＬａ細胞などのヒト細胞系に由来する）を含む。例示的な昆虫細胞系は、Ｓｆ９細胞、バキュロウイルス－昆虫細胞系を含むがこれらに限定されない（例えば、Ｊａｒｖｉｓ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３１０巻、１号、２００３年５月２５日、１～７頁を再検討されたい）。代替的に、宿主細胞はまた、トランスジェニック動物の場合もあり、植物の場合もある。
本発明のさらなる態様は、結合剤（またはサルベコウイルス結合剤）、および／またはこれをコードする核酸、および／または本明細書で記載される核酸を含む組換えベクターを含む医薬または医薬組成物に関する。特に、医薬組成物は、薬学的に許容される組成物であり；特定の実施形態では、このような組成物は、（薬学的に）適するかまたは許容される担体、希釈剤、安定化剤などをさらに含む。
本発明のさらなる態様は、薬または医薬としての使用のための、本明細書で記載される結合剤、これをコードする核酸、または本明細書で記載される結合剤、これをコードする核酸、および／もしくはこのような核酸を含む組換えベクターを含む医薬組成物に関する。代替的に、薬または医薬の製造における、本明細書で記載される結合剤、もしくはこれをコードする核酸の使用、または本明細書で記載される結合剤、これをコードする核酸、および／もしくはこのような核酸を含む組換えベクターを含む医薬組成物の使用が想定される。特に、本明細書で記載される結合剤、もしくはこれをコードする核酸、または本明細書で記載される結合剤、これをコードする核酸、および／もしくはこのような核酸を含む組換えベクターを含む医薬もしくは医薬組成物は、受動免疫化における使用のためのもの、または、医薬もしくは医薬組成物、サルベコウイルス感染を伴う対象の処置における使用のためのもの、または、医薬もしくは医薬組成物、サルベコウイルスによる対象への感染の防止における使用のためのもの、または、医薬もしくは医薬組成物、あるいはサルベコウイルスによる感染からの対象の保護における使用のためのものである。受動免疫化における使用のためのものである場合、対象は、サルベコウイルスによる感染を有する（治療的受動免疫化）場合もあり、サルベコウイルスによる感染を有さない（予防的受動免疫化）場合もある。
本発明のさらなる態様は、サルベコウイルスによる感染を患う／これを有する／これに罹患した対象を処置するための方法であって、本明細書で記載される結合剤、またはこれをコードする核酸を、対象へと投与するステップを含むか、または本明細書で記載される結合剤、またはこれをコードする核酸を含む医薬または医薬組成物を、対象へと投与するステップを含む方法に関する。
本発明のさらなる態様は、サルベコウイルスによる感染からの対象の保護、またはサルベコウイルスによる対象への感染の防止のための方法であって、本明細書で記載される結合剤、またはこれをコードする核酸を、感染前の対象へと投与するステップを含むか、または本明細書で記載される結合剤、またはこれをコードする核酸を含む医薬または医薬組成物を、感染前の対象へと投与するステップを含む方法に関する。
特に、上記医学的態様では、サルベコウイルスは、コロナウイルス、より特定すると、人畜共通コロナウイルス、なおより特定すると、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、なおより特定すると、Ｎ４３９、Ｋ４１７、Ｓ４７７、Ｌ４５２、Ｔ４７８、Ｅ４８４、Ｐ３８４、Ｎ５０１、および／またはＤ６１４位における変異株（配列番号３０において規定された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクアミノ酸配列と比べた）、より特定すると、Ｎ５０１Ｙ変異株（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アルファ変異株）など、Ｎ５０１位における変異株、Ｎ５０１Ｙ変異株およびＥ４８４Ｋ変異株（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アルファ＋Ｅ４８４Ｋ変異株）など、Ｎ５０１およびＥ４８４位における変異株、Ｋ４１７Ｎ変異株、Ｅ４８４Ｋ変異株、およびＮ５０１Ｙ変異株（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ベータ変異株）など、Ｋ４１７、Ｅ４８４、およびＮ５０１位における変異株、Ｐ３８４Ｌ変異株、Ｋ４１７Ｎ変異株、Ｅ４８４Ｋ変異株、およびＮ５０１Ｙ変異株（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ベータ＋Ｐ３８４Ｌ変異株）など、Ｐ３８４、Ｋ４１７、Ｅ４８４、およびＮ５０１位における変異株、Ｌ４５２Ｒ変異株およびＥ４８４Ｑ変異株（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２カッパ変異株）など、Ｌ４５２およびＥ４８４位における変異株、Ｌ４５２Ｒ変異株およびＴ４７８Ｋ変異株（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２デルタ変異株）など、Ｌ４５２およびＴ４７８位における変異株、Ｌ４５２Ｒ変異株（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２イプシロン変異株）など、Ｌ４５２位における変異株、Ｋ４１７Ｔ変異株（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ガンマ変異株）など、Ｋ４１７位における変異株、またはＤ６１４Ｇ変異株（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オミクロン変異株またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＢＡ．１変異株）など、Ｄ６１４位における変異株などのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株である。特に、処置は、サルベコウイルス感染に罹患した対象の受動免疫化を指す。特に、サルベコウイルスによる感染の防止は、例えば、重度の疾患症状を、最も発症し易いことが公知である対象が、感染を全体的に防止するか、または重度の疾患症状の発症もしくは発生を防止するなど、本明細書で記載される結合剤、またはこれをコードする核酸により、予防的に処置されうる（防止的免疫化または予防的免疫化）、流行状態またはパンデミック状態の場合に有用である。防止的効果または予防的効果を達成するために、本明細書で記載される結合剤、またはこれをコードする核酸は、対象へと、１週間または２週間の間隔など、複数回にわたり投与されることが必要な場合があり；間隔は、結合剤または核酸の薬物動態挙動または薬物動態特徴（半減期）により指示される。さらに特定すると、対象は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株などのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１による感染に対して感受性であるヒト対象など、サルベコウイルスによる感染に感受性である哺乳動物である。
さらに、特に、上記の医学的態様では、本明細書で記載される結合剤をコードする核酸は、例えば、遺伝子治療状況で使用される場合もあり、ＲＮＡワクチン接種状況で使用される場合もある。
さらに、具体的実施形態は、本明細書で記載される結合剤の単回投与用量が投与され、単回投与用量が、０．５ｍｇ／ｋｇ～２５ｍｇ／ｋｇの範囲にある、予防的処置に関する。代替的に、結合剤による治療的処置も想定され、この場合、０．５ｍｇ／ｋｇ～２５ｍｇ／ｋｇの範囲の単回投与用量が想定される。予防的状況および治療的状況のいずれにおいても、複数回投与用量が投与される必要な場合があり、後続する２回にわたる投与間の時間間隔は、対象の循環中における、結合剤の半減期により決定される。
さらに、特に、上記の医学的態様では、結合剤、核酸、または医薬組成物は、対象へと、静脈内注射、皮下注射、または鼻腔内送達を介して投与される場合もあり、代替的に、吸入または肺内送達を介して投与される場合もある。
さらに、特に、上記の医学的態様では、治療有効量の結合剤、核酸、または医薬組成物は、それを必要とする対象へと投与され；このような治療有効量の投与は、サルベコウイルスによる感染の阻害もしくは防止をもたらし、かつ／またはサルベコウイルスによる感染の治癒をもたらす。
本発明のさらなる態様は、サルベコウイルス感染の診断における使用のためであるか、診断剤としての使用のためであるか、またはｉｎ ｖｉｔｒｏにおける診断剤もしくは診断用キットなどの、診断剤もしくは診断用キットの製造における使用のためである、本明細書で記載される結合剤に関する。代替的に、本明細書で記載される結合剤の、診断剤／ｉｎ ｖｉｔｒｏ診断剤の製造における使用が想定される。特に、本明細書で記載される結合剤は、サルベコウイルス感染により感染していることが疑われる対象などの対象から得られた試料などの試料中のサルベコウイルスの存在（または非存在）の検出における使用のためである。本明細書で記載される結合剤もしくはサルベコウイルス結合剤をコードする核酸、またはこのような核酸を含む組換えベクターもまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける診断剤もしくは診断用キットなどの、診断剤もしくは診断用キットの製造において使用されるか、またはこの製造における使用のためでありうる。
本発明のさらなる態様は、サルベコウイルス感染により感染していることが疑われる対象などの対象から得られた試料などの試料中のサルベコウイルスを検出するための方法に関する。このような方法は、通例、試料を得るステップ、試料を、本明細書で記載される結合剤と接触させるステップ、および結合剤の、サルベコウイルスとの結合を検出するか、これを決定するか、これについて評価するか、これについてアッセイするか、これを同定するか、またはこれを測定するステップを含む。
特に、上記の診断的態様では、サルベコウイルスは、コロナウイルス、より特定すると、人畜共通コロナウイルス、なおより特定すると、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株などのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１である。さらに特定すると、対象は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株などのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１による感染に対して感受性であるヒト対象など、サルベコウイルスによる感染に感受性である哺乳動物である。
さらに特定すると、上記診断的態様では、本明細書で記載される結合剤は、これへと融合されるか、これへと結合されるか、これへとカップリングされるか、これへと連結されるか、これへと複合体化されるか、またはこれへとキレート化される検出用部分を含む。「検出用部分」は、一般に、十分な刺激があると、シグナルを発するか、もしくはシグナルを発することが可能である部分、またはさらなる分子（例えば、標識化抗体により、特異的に認識される、アフィニティータグなどのタグ）との結合または相互作用を介する検出が可能であるか、または任意の手段により（好ましくは、検出が、ｉｎ ｖｉｖｏ／ヒト体内においてなされる場合、非侵襲的手段により）検出可能である部分を指す。さらに、検出用部分は、コンピュータ化された画像構成を可能とする場合があり、このように、検出用部分は、イメージング剤と呼ばれうる。検出用部分は、蛍光放出体、リン光放出体、陽電子放出体、放射線放出体などを含むが、放出体に限定されず、このように、部分はまた、酵素（基質を、測定可能に転換することが可能な酵素）および分子タグも含む。放射線放出体／放射性標識の例は、６８Ｇａ、１１０ｍＩｎ、１８Ｆ、４５Ｔｉ、４４Ｓｃ、４７Ｓｃ、６１Ｃｕ、６０Ｃｕ、６２Ｃｕ、６６Ｇａ、６４Ｃｕ、５５Ｃａ、７２Ａｓ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、１２５Ｉ、７４Ｂｒ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、７８Ｂｒ、１１１Ｉｎ、１１４ｍＩｎ、１１４Ｉｎ、９９ｍＴｃ、１１Ｃ、３２Ｃｌ、３３Ｃｌ、３４Ｃｌ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１７７Ｌｕ、９９Ｔｃ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２２５Ａｃ、１５３Ｓｍ、および６７Ｇａを含む。蛍光放出体は、シアニン色素（例えば、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５）、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、クマリン、インドレニンベースの色素、ベンゾインドレニンベースの色素、フェノキサジン、ＢＯＤＩＰＹ色素、ローダミン、Ｓｉ－ローダミン、Ａｌｅｘａ色素、およびこれらのいずれかの誘導体を含む。キチン結合性タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合性タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリ（Ｈｉｓ）（例えば、６×ＨｉｓまたはＨｉｓ６）、ビオチン、または、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ（登録商標）、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ ＩＩ（登録商標）およびＴｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ（登録商標）などのストレプトアビジンなどのアフィニティータグ；チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）およびＳＵＭＯなどの可溶化タグ；ＦＬＡＧタグなどのクロマトグラフィータグ；Ｖ５タグ、ｍｙｃタグ、およびＨＡタグなどのエピトープタグ；蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰなど）などの、蛍光標識または蛍光タグ（すなわち、蛍光色素／フルオロフォア）；ルシフェラーゼ、生物発光化合物、または化学発光化合物（ルミナール、イソルミノール、芳香族（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、シュウ酸エステル、ジオキセタン、またはＧＦＰ、およびこれらの類似体など）などの発光標識または発光タグ；リン光発光標識；金属キレート剤；および（他の）酵素標識（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、またはグルコースオキシダーゼ）が、特に、好ましい。
本明細書で記載され、検出用部分を含む結合剤は、例えば、特異的標識の選出に依存して、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ、またはｉｎ ｓｉｔｕアッセイ（ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡ、および他の「サンドイッチアッセイ」など、それ自体公知のイムノアッセイを含む）のほか、ｉｎ ｖｉｖｏイメージングを目的として使用されうる。具体的実施形態は、ウイルス、または前記ウイルスのスパイクタンパク質の検出のための、任意選択で、標識化形態にある、結合剤の使用を開示し、この場合、前記ウイルスは、ウイルスである、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２、ＧＤ－Ｐａｎｇｏｌｉｎ、ＲａＴＧ１３、ＷＩＶ１、ＬＹＲａ１１、ＲｓＳＨＣ０１４、Ｒｓ７３２７、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、Ｒｓ４２３１、Ｒｓ４０８４、Ｒｐ３、ＨＫＵ３－１、またはＢＭ４８－３１など、クレード１ａ、クレード１ｂ、クレード２、および／またはクレード３のコウモリＳＡＲＳ関連サルベコウイルスの群から選択される。
本発明の、別の代替的態様では、任意選択で、標識を伴う、本明細書で記載される結合剤のうちのいずれか、または前記薬剤をコードする核酸分子のうちのいずれか、または本明細書で記載される組成物もしくはベクターのうちのいずれかはまた、診断剤として使用される場合もあり、本明細書で記載される、コロナウイルスの検出において使用される場合もある。診断法は、当業者に公知であり、対象に由来する生物学的試料を伴いうる。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法も、本明細書で記載される結合剤を使用する、ウイルスタンパク質またはウイルス粒子の検出のための範囲内にありうる。最後に、任意選択で、標識化された、本明細書で記載される結合剤はまた、ｉｎ ｖｉｖｏイメージングにおける使用にも適しうる。
本発明のさらなる態様は、本明細書で記載される結合剤、またはこれをコードする核酸を含むキット、または本明細書で記載される結合剤、またはこれをコードする核酸を含む医薬組成物に関する。
このようなキットは、ある量の、本明細書で記載される結合剤、またはこれをコードする核酸を含み、例えば、意図される適応（サルベコウイルス感染の予防的処置または治療的処置）、および潜在的な副作用についての情報を含む、治療用小冊子またはパッケージ小冊子などの、例えば、キット添付文書をさらに含む、容器またはバイアル（薬学的に許容される容器またはバイアルなど、任意の適切な容器またはバイアル）を含む医薬キットまたは薬剤キットを含む。医薬キットまたは薬剤キットは、例えば、本明細書で記載される結合剤、またはこれをコードする核酸を、対象へと投与するためのシリンジをさらに含みうる。
このようなキットは、検出用部分を含む結合剤など、ある量の、本明細書で記載される結合剤を含む、容器またはバイアル（薬学的に許容される容器またはバイアルなど、任意の適切な容器またはバイアル）を含む、診断用キットを含む。このような診断用キットは、例えば、検出用部分を検出するための、１つもしくは複数の試薬、および／または、例えば、試料中のサルベコウイルスの検出のために、前記結合剤を、どのように使用するのかについての指示書をさらに含みうる。
結晶複合体
本発明の別の態様は、本明細書で記載されるサルベコウイルスおよびＲＢＤ結合剤を含む複合体に関する。一実施形態では、前記複合体は、結晶形態の複合体である。結晶は、前記複合体内の相互作用についての、原子的詳細を、本明細書で記載される結合剤の、サルベコウイルスＲＢＤドメインとの界面の、鍵となる特色を再現する分子をデザインするための分子鋳型として使用することを可能とする。コンピュータによるドッキングおよび薬理作用団の構築における、近年の発展に照らして、タンパク質間界面を模倣しうる、小型化合物の単離は、現実的な戦略となりつつある。
別の実施形態は、本明細書で記載される結合剤、特に、本明細書の上記で広範に記載された、（１）～（１２６）からなる群から選択される機能的特色のうちの１つまたは複数を伴う結合剤を同定するか、デザインするか、またはこれらについてスクリーニングするコンピュータ支援法および／またはコンピュータ法であって、１つまたは複数のステップ：
ｉ．適切なコンピュータプログラムへと、配列番号１～５もしくは配列番号５３～５５から選択されるアミノ酸配列により規定された／これらに明示されたＩＳＶＤの結合性部位を含むか、またはこのようなＩＳＶＤの機能的断片の結合性部位を含む、三次元（３Ｄ）構造を規定するパラメータを導入するステップ；
ｉｉ．被験化合物の三次元構造を生成するか、これを創出するか、もしくはモデル化する（ｉ．で使用されたプログラムと同じ、適切なコンピュータプログラム、または他の適切なコンピュータプログラムにおいて）か、またはこれをインポートする（ｉ．で使用されたプログラムと同じ、適切なコンピュータプログラム、または他の適切なコンピュータプログラムにおいて）ステップであって；特に、このような被験化合物が、ｉ．で導入された三次元構造に結合することが疑われる化合物であるステップ；
ｉｉｉ．ｉ．で導入された三次元構造と、ｉｉ．で生成されるか、創出されるか、モデル化されるか、またはインポートされた、被験化合物の三次元構造とを、（コンピュータにより）重ね合わせるステップ（またはこれらの、コンピュータ支援型重合せのステップ）であって；特に、重ね合わせる工程が、２つの三次元構造の間で、エネルギー的に最も好適なフィッティングが得られるまでの工程など、反復工程であるステップ；および
ｉｖ．前記被験化合物モデルが、空間的、かつ、化学的に、三次元結合性部位（ｉ．において導入された）にフィッティングするのかどうかについて、（コンピュータにより）評価し、これを決定し、これについて査定するステップ（またはコンピュータ支援型の評価、決定、査定のステップ）であって；特に、三次元結合性部位の、本明細書で記載されるＩＳＶＤ、またはその機能的部分との空間的相互作用および化学的相互作用とのフィッティングの比較を含みうるステップ
を含むコンピュータ支援法および／またはコンピュータ法に関する。
特に、前記被験化合物は、（１）Ｉｇテール化融合ペプチド、ならびにＤ－立体配置アミノ酸および／またはＬ－立体配置アミノ酸から作製された、ランダムペプチドライブラリーおよびコンビナトリアル化学反応誘導型分子ライブラリーのメンバーを含む、可溶性ペプチドなどのペプチド；（２）ホスホペプチド（例えば、ランダムホスホペプチドライブラリーおよび部分変性指向型ホスホペプチドライブラリーのメンバー；（３）ＩＶＤ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）、または抗体（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗イディオタイプ抗体、キメラ抗体、および単鎖抗体、Ｎａｎｏｂｏｄｙ、イントラボディー、アフィボディーのほか、抗体の、Ｆａｂ断片、（Ｆａｂ）２断片、Ｆａｂ発現ライブラリー、およびエピトープ結合性断片）；（４）アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、アルファボディー、アフィチン、ナノフィチン、アンチカリン、モノボディー、およびリポカリンなどであるがこれらに制約されない、免疫グロブリン以外の結合性タンパク質；（５）核酸ベースのアプタマー；（６）有機低分子および無機低分子；ならびに（７）二環式ペプチド（また、Ｂｉｃｙｃｌｅｓ（登録商標）としても公知である）などのポリペプチド化合物からなる群から選択される。
本明細書では、本明細書で記載される、前記結合性部位はまた、本発明のエピトープとも称される。さらに、本明細書におけるエピトープとは、サルベコウイルススパイクタンパク質のＲＢＤ内の特異的残基、すなわち、サルベコウイルススパイクタンパク質上のエピトープであって、アミノ酸Ｔｈｒ３９３（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９３）、Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、Ｖａｌ３９５、もしくはＴｙｒ３９６のうちの、少なくとも１つを含み；かつ／またはアミノ酸Ｌｙｓ４６２（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ａｒｇ４６２）、Ｐｈｅ４６４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｔｙｒ４６４）、Ｇｌｕ４６５（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｇｌｙ４６５）、もしくはＡｒｇ４６６のうちの、少なくとも１つを伴い；かつ／またはアミノ酸Ｓｅｒ５１４、Ｇｌｕ５１６、もしくはＬｅｕ５１８のうちの、少なくとも１つを伴い；かつ／またはアミノ酸Ａｒｇ３５７（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｌｙｓ３５７）を伴い；言及された、アミノ酸およびアミノ酸の番号付けが、配列番号３０において規定された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質と比べた／これに対応するアミノ酸およびアミノ酸の番号付けであり；他のサルベコウイルスのスパイクタンパク質内、またはＲＢＤドメイン内の、対応するアミノ酸が、例えば、図１６Ｂ）に描示された、複数のアミノ酸配列をアライメントすることにより、容易に決定されうるエピトープを指す。特に、このような他の結合剤は、本明細書の上記で広範にわたり概括された、機能的特色（１）～（１２６）のうちの１つまたは複数を理想的に保持する。特に、コンピュータにより決定される空間的フィッティングおよび化学的フィッティングなどの、空間的フィッティングおよび化学的フィッティングは、被験化合物の、三次元結合性部位（ｉ．において導入される）との接触点に基づき決定され；このような接触点は、互いと「接触した」残基である。特に、このような接触距離は、本明細書の上記の、機能的特色（７４）～（７６）において概括されている。
合理的薬物デザイン
様々な公知のモデル化法を使用して、本明細書の上記で記載された結晶構造は、（被験）化合物の、サルベコウイルス、特に、サルベコウイルスＲＢＤとの相互作用について査定するか；または本明細書で記載されるＩＳＶＤ、もしくはその機能的部分の、サルベコウイルスＲＢＤとの相互作用を模倣する、新規の化合物のデザインについて査定するための三次元モデルを作製するのに使用されうる。本明細書で使用される、「モデル化」という用語は、原子構造情報および相互作用モデルに基づく、分子構造、および／または分子機能についての定量的解析および定性的解析を含む。「モデル化」という用語は、常套的な、数理ベースの分子動力学モデルおよびエネルギー最小化モデル、インタラクティブコンピュータグラフィックモデル、改変分子機構モデル、距離幾何学ベースおよび他の構造ベースの拘束モデルを含む。分子モデル化法は、三次元モデルの範囲を導出し、化学的実体との結合性部位など、結合性部位の構造について調べるために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤドメインなど、サルベコウイルスＲＢＤの原子座標へと適用されうる。
これらの技法はまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤドメイン、またはサルベコウイルス（感染）の中和をモジュレートしうる、本明細書で開示される、ＩＳＶＤもしくはその機能的部分に結合することが可能である、小型の化学的実体、および大型の化学的実体についてスクリーンするか、またはこれらをデザインするのにも使用されうる。このようなスクリーンは、三次元固体スクリーニングシステムを利用する場合もあり、コンピュータスクリーニングシステムを利用する場合もある。このようなモデル化法は、ＲＢＤドメイン内で同定された結合性部位またはポケットとの、立体化学的相補性を保有する化学的実体をデザインまたは選択するモデル化法である。「立体化学的相補性」とは、目的の化合物が、ＲＢＤドメインへの結合についての自由エネルギーの正味の低減をもたらすように、ＲＢＤドメインとの、十分な数の、エネルギー的に好適な接触部をもたらすことを意味する。「立体化学的類似性」とは、目的の化合物が、決定された座標セットにより明示される、ＲＢＤドメインと、ほぼ同じ数の、エネルギー的に好適な接触部をもたらすことを意味する。立体化学的相補性とは、決定された座標セットにより列挙される受容体部位の溝状部を裏打ちする部位内表面残基にマッチする分子の特徴である。この文脈における「マッチする」とは、同定された部分が、例えば、部位内の分子の溶媒和を促進する、水素結合または非共有結合的ファンデルワールス相互作用およびクーロン相互作用（表面または残基との）を介して、結合性部位における分子の保持が、エネルギー的に好適となる形で、表面残基と相互作用することを意味する。立体化学的相補性は、化合物が、結合性部位に対して、１０－４Ｍ未満、より好ましくは、１０－５Ｍ未満であり、より好ましくは、１０－６ＭのＫｄを有するような立体化学的相補性であることが好ましい。最大限に特定した実施形態では、Ｋｄ値は、１０－８Ｍ未満であり、より特定すると、１０－９Ｍ未満である。
ＲＢＤ結合性ドメインの構造または部分構造との立体化学的相補性を保有する化学的実体を同定するのに、多数の方法が使用されうる。例えば、工程は、コンピュータ読取り型記憶メディアから生成される、決定された座標セットに基づく、コンピュータスクリーン上の、ＲＢＤドメイン内における、選択された結合性部位についての、目視による精査により開始されうる。代替的に、次いで、選択された断片または化学的実体は、様々な配向性で配置される場合もあり、選択された結合性部位内でドッキングされる場合もある。当技術分野では、モデル化ソフトウェアが周知であり、利用可能である。このモデル化工程には、利用可能な、標準的分子機構力場による、エネルギーの最小化が後続しうる。適切な化学的実体または断片が選択されたら、これらは、単一の化合物へとアセンブルされうる。一実施形態では、アセンブリーは、ＲＢＤ結合性部位内の、選択された結合性部位または結合性ポケットについての原子座標との関連でコンピュータスクリーン上に提示された、三次元画像上における、断片の、互いとの関係に対する、目視による精査により進められうる。これには、典型的に、利用可能なソフトウェアを使用して、またはコンピュータ支援方式の、手作業によるモデル構築が後続しうる。代替的に、標準的な化学幾何学を使用して、断片は、さらなる原子へと接続されうる。上記で記載された、化学的実体についての査定過程は、化合物の場合と同様に実施されうる。
化学構造についてのデータベースは、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ Ｄａｔａ Ｃｅｎｔｒｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｕ．Ｋ．）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｌｔｄ．（Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ、Ｃａｌｉｆ．）、Ｔｒｉｐｏｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ Ｓｅｒｖｉｃｅ（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、Ｏｈｉｏ）、Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ（Ｓｙｍｙｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、Ｄｅｒｗｅｎｔ Ｗｏｒｌｄ Ｄｒｕｇ Ｉｎｄｅｘ（ＷＤＩ）、ＢｉｏＢｙｔｅＭａｓｔｅｒＦｉｌｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＮＣＩ）、Ｍｅｄｃｈｅｍ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＢｉｏＢｙｔｅ Ｃｏｒｐ．）、ＺＩＮＣ ｄｏｃｋｉｎｇ ｄａｔａｂａｓｅ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ ａｎｄ Ｉｒｗｉｎ、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｍｏｄｅｌ、２０１５）、およびＭａｙｂｒｉｄｇｅ社カタログを含む、多数の情報源から入手可能である。上記方法により、目的の実体または化合物が、デザインまたは選択されたら、コンピュータによる査定を介して、この実体または化合物が、ＲＢＤドメインまたは結合性部位に結合しうる効率について調べられ、最適化されうる。効果的な、サルベコウイルスＲＢＤ結合性化合物は、好ましくは、その結合状態と、自由状態との間で、比較的小さなエネルギー差を裏付けなければならない（すなわち、結合による変形エネルギーが小さいこと）。したがって、最も効率的なＲＢＤ結合性化合物は、好ましくは、結合による変形エネルギーが、１モル当たり約１０キロカロリーを超えない、特に、１モル当たり７キロカロリーを超えないようにデザインされるものとする。ＲＢＤ結合性化合物は、例えば、全結合エネルギーが同様である、１つを超えるコンフォメーションにあるＲＢＤドメインであるがこれらに限定されないＲＢＤドメインと相互作用しうる。これらの場合、結合による変形エネルギーは、自由化合物のエネルギーと、化合物がタンパク質に結合する場合に観察されるコンフォメーションの平均エネルギーとの間の差であると理解される。さらに、ＲＢＤドメインに結合する化合物としてデザインされたまたは選択された化合物は、その結合状態において、好ましくは、標的タンパク質との汎発性静電相互作用を欠くように、コンピュータによりさらに最適化されうる。
サルベコウイルスＲＢＤドメイン結合性化合物が、上記で記載した通りに、最適に選択またはデザインされたら、次いで、その結合特性を改善または修飾するように、その原子または側鎖基の一部において、置換が施されうる。一般に、初期の置換は、保存的である、すなわち、置換基は、元の群と、ほぼ同じサイズ、形状、疎水性、および電荷を有するであろう。好ましい保存的置換は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｄａｙｈｏｆｆら、「Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」、５、３４５～３５２頁（１９７８年版および増補版）において許容される、点突然変異について規定された基準を満たす、保存的置換である。保存的置換の例は、以下の群：（ａ）バリン、グリシン；（ｂ）グリシン、アラニン；（ｃ）バリン、イソロイシン、ロイシン；（ｄ）アスパラギン酸、グルタミン酸；（ｅ）アスパラギン、グルタミン；（ｆ）セリン、トレオニン；（ｇ）リシン、アルギニン、メチオニン；および（ｈ）フェニルアラニン、チロシンを含むがこれに限定されない置換である。当然ながら、コンフォメーションを変更する、当技術分野で公知の構成要素は、回避されるべきことを理解されたい。次いで、このような置換化合物は、上記で記載された、同じコンピュータ法により、ＲＢＤドメインへのフィッティングの効率について解析されうる。
当技術分野では、化合物の変形エネルギーおよび静電相互作用を査定するための、特殊なコンピュータソフトウェアが利用可能である。スクリーニング／デザイン法は、ハードウェア内に実装される場合もあり、ソフトウェア内に実装される場合もあり、両方の組合せの場合もある。しかし、好ましくは、方法は、各々が、プロセッサー、データ記憶システム（揮発性メモリおよび非揮発性メモリ、ならびに／または記憶エレメントを含む）、少なくとも１つの入力デバイス、および少なくとも１つの出力デバイスを含む、プログラム型コンピュータ上で実行されるか、または作動するコンピュータプログラム内に実装される。上記で記載された機能を果たし、出力情報を生成するように、プログラムコードが、入力データへと適用される。出力情報は、公知の方式で、１つまたは複数の出力デバイスへと適用される。コンピュータは、例えば、パーソナルコンピュータの場合もあり、マイクロコンピュータの場合もあり、常套的デザインのワークステーションの場合もある。各プログラムは、好ましくは、コンピュータシステムと通信するように、高レベルの手続き型プログラミング言語内、またはオブジェクト指向プログラミング言語内に実装される。しかし、プログラムは、所望の場合、アセンブリー言語内またはマシン言語内に実装される場合もある。いずれの場合にも、言語は、コンパイラ型言語またはインタープリタ型言語でありうる。このような各コンピュータプログラムは、好ましくは、本明細書で記載される手順を実施するように、記憶メディアまたは記憶デバイスが、コンピュータにより読み取られる場合に、コンピュータを構成し、作動させるために、一般目的または特殊目的のプログラム型コンピュータにより読み取られる、記憶メディア上または記憶デバイス（例えば、ＲＯＭまたは磁気ディスケット）上に保存される。システムはまた、このように構成された記憶メディアが、本明細書で記載された機能を実施するように、特殊な方式および所定の方式で、コンピュータを作動させる場合に、コンピュータプログラムにより構成されるコンピュータ－読取り型記憶メディアとして実装されるとも考えられうる。
化合物、被験化合物、目的の化合物
本明細書で使用される、「化合物」または「被験化合物」または「候補化合物」または「薬物候補化合物」または「目的の化合物」または「他の結合剤」という用語は、本明細書で記載される、ＩＳＶＤ（またはＩＳＶＤを含む化合物）、またはその機能的部分と異なり、スクリーニングアッセイまたは薬物発見アッセイなどのアッセイにおいて調べられる場合もあり、とりわけ、本明細書で記載される、サルベコウイルス（感染）に結合し、これを中和することが可能な化合物を同定するための方法において調べられる場合もある、任意の天然に存在する分子または合成分子について記載する。このように、これらの化合物は、有機化合物および無機化合物を含む。化合物は、低分子、化学物質、ペプチド、抗体、または抗体の活性断片でありうる。
本発明の化合物は、コンピュータによるスクリーニング法を使用してデザインまたは同定される化合物、および上記で記載されたウェットラボスクリーニング法などのウェットラボスクリーニング法を使用してデザインまたは同定される化合物の両方を含む。サルベコウイルスに結合し、これを中和することが可能である、このような化合物は、本明細書で提示される、サルベコウイルスＲＢＤの、ＩＳＶＤまたはその機能的断片との複合体の三次元構造に対応する原子座標の使用に基づくスクリーニング法を使用して作製されうる。本発明の方法を使用して同定またはデザインされる、候補化合物および／または化合物は、合成化合物または天然に存在する化合物である、任意の適切な化合物でありうる。一実施形態では、本発明の方法により、選択またはデザインされる、合成化合物は、好ましくは、約５０００、４０００、３０００、２０００、１０００以下、または、より好ましくは、約５００ダルトン未満の分子量を有する。別の実施形態では、このような合成化合物は、ポリペプチド、タンパク質、もしくはペプチドであるか、またはポリペプチド性化合物（部分的に、ポリペプチド、タンパク質、またはペプチドを含む）である。本発明の化合物は、好ましくは、生理学的条件下で、可溶性である。このような化合物は、タンパク質との構造的相互作用、特に、水素結合に必要な官能基を含む場合があり、典型的に、少なくとも、アミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基、またはカルボキシル基、好ましくは、官能化学基のうちの、少なくとも２つを含む。化合物は、１つまたは複数の官能基で置換された、環構造もしくは複素環構造、および／または芳香族構造もしくはポリ芳香族構造を含みうる。化合物はまた、ペプチド、単糖、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造的類似体、またはこれらの組合せを含む生体分子も含みうる。化合物は、例えば、（１）Ｉｇテール化融合ペプチド、ならびにＤ－立体配置アミノ酸および／またはＬ－立体配置アミノ酸から作製された、ランダムペプチドライブラリーおよびコンビナトリアル化学反応誘導型分子ライブラリーのメンバーを含む、可溶性ペプチドなどのペプチド；（２）ホスホペプチド（例えば、ランダムホスホペプチドライブラリーおよび部分変性指向型ホスホペプチドライブラリーのメンバー）；（３）ＩＶＤ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）、または抗体（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗イディオタイプ抗体、キメラ抗体、および単鎖抗体、Ｎａｎｏｂｏｄｙ、イントラボディー、アフィボディーのほか、抗体の、Ｆａｂ断片、（Ｆａｂ）２断片、Ｆａｂ発現ライブラリー、およびエピトープ結合性断片）；（４）アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、アルファボディー、アフィチン、ナノフィチン、アンチカリン、モノボディー、およびリポカリンなどであるがこれらに制約されない、免疫グロブリン以外の結合性タンパク質；（５）核酸ベースのアプタマー；（６）有機低分子および無機低分子；ならびに（７）二環式ペプチド（また、Ｂｉｃｙｃｌｅｓ（登録商標）としても公知である）などのポリペプチド化合物を含みうる。
合成化合物ライブラリーは、例えば、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｔｉｎｔａｇｅｌ、Ｃｏｒｎｗａｌｌ、ＵＫ）、ＡＭＲＩ（Ｂｕｄａｐｅｓｔ、Ｈｕｎｇａｒｙ）、およびＣｈｅｍＤｉｖ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、Ｓｐｅｃｓ（Ｄｅｌｆｔ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、ＺＩＮＣ１５（Ｕｎｉｖ．ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から市販されている。加えて、多種多様な有機化合物および生体分子の、ランダム合成および指向性合成のために、ランダム化オリゴヌクレオチドの発現を含む、多数の手段が利用可能である。代替的に、細菌抽出物、真菌抽出物、植物抽出物、および動物抽出物の形態の天然化合物ライブラリーは、たやすく作製されうる。加えて、天然化合物ライブラリーまたは合成化合物ライブラリーおよび化合物は、常套的な化学的手段、物理的手段、および生化学的手段を介して、たやすく改変され、コンビナトリアルライブラリーを作製するのに使用されうる。加えて、当技術分野では、コンビナトリアルライブラリーを産生する、多数の方法であって、生物学的ライブラリー、空間アドレス可能並行型固相または液相ライブラリーを伴う方法；デコンボリューションを要求する、合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」型ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィーによる選択を使用する、合成ライブラリー法を含む方法が公知である。化合物はまた、断片ベースの薬物デザインにより作出されたリード化合物から合成されうる化合物であって、このようなスクリーン断片を、本発明によりもたらされた結晶へと浸漬するか、または共結晶化させ、次いで、これらをＸ線下に置き、回折データを得ることにより、このような化学的断片の結合が評価される化合物も含む。例えば、これらの断片が結合し、次いで、このような断片が、合成化学反応により、大型の化合物へとアセンブルされ、サルベコウイルスＲＢＤに対するアフィニティーを増大させうる、サルベコウイルスＲＢＤ構造内の位置を決定するように、当業者により、差分フーリエ法が、たやすく適用される。さらに、本発明の方法を使用して同定またはデザインされる化合物は、ペプチドの場合もあり、その模倣体の場合もある。単離された、本発明のペプチドまたは模倣体は、コンフォメーション拘束分子の場合もあり、代替的に、例えば、非拘束ペプチド配列など、コンフォメーション的に拘束されていない分子の場合もある。「コンフォメーション拘束分子」という用語は、コンフォメーション拘束ペプチド、ならびにコンフォメーション拘束ペプチドの類似体および誘導体を意味する。加えて、アミノ酸は、対応するＤアミノ酸またはＮメチルアミノ酸など、様々な非コードアミノ酸または修飾アミノ酸で置きかえられうる。他の修飾は、官能基である、ヒドロキシル、チオール、アミノ、およびカルボキシルの、化学的類似基による置換を含む。ペプチドおよびその模倣体に関して述べると、他の非天然のアミノ酸または化学的アミノ酸類似体／誘導体の、さらに他の例も、置換または付加として導入されうる。ペプチド模倣体もまた、使用されうる。ペプチド模倣体とは、ペプチドの生体活性を模倣するが、化学的性質においては、もはやペプチド性ではない分子である。厳密な定義によれば、ペプチド模倣体は、ペプチド結合（すなわち、アミノ酸の間のアミド結合）を、もはや含有しない分子である。しかし、ペプチド模倣体という用語は、場合によって、シュードペプチド、セミペプチド、およびペプドイドなど、天然では、もはや完全にペプチド性ではない分子について記載するのにも使用される。完全にペプチドでないのであれ、部分的にペプチドでないのであれ、本発明における使用のためのペプチド模倣体は、ペプチド模倣体が基づくペプチドの中における、活性基の三次元配置に酷似する、反応性化学部分の空間的配置をもたらす。
例えば、ペプチドまたはペプチド模倣体は、本明細書で記載されるエピトープの三次元構造を模倣するようにデザインされ；おそらく、コンフォメーションエピトープを、対象の免疫系へと提示する人工抗原として用いられて、免疫原またはワクチンとして用いられうる。代替的に、任意選択で、適切な足場構造内に提示された前記ペプチド（これらの一部は、本明細書の上記における可能な化合物のリストに含まれた）を含む、新規のワクチンを作製するように、本発明のＩＳＶＤに特異的に結合する人工ペプチド抗原分子についてスクリーニングするスクリーニング法も開示される。
典型的に、この同様の活性部位幾何学の結果として、ペプチド模倣体は、生体系に対して、ペプチドの生体活性と同様の効果を及ぼす。場合によって、ペプチドは、一般に、２つの所望されない特性：（１）低度のバイオアベイラビリティ；および（２）短い作用持続時間を呈するため、ペプチド自体ではなく、所与のペプチドの模倣体を使用することの利点が存在する。懸案の分子は、経口において活性であり、かつ、作用時間を延長するのに十分な程度に小型であるので、ペプチド模倣体は、これらの２つの大きな障害に対する、明白な迂回路をもたらす。また、ペプチド模倣体は、ペプチドのための非経口投与と比較して、経口投与されうるので、ペプチド模倣体と関連して、費用も大幅に軽減され、患者の服薬遵守も改善される。さらに、ペプチド模倣体は、一般に、ペプチドより廉価に作製される。当然ながら、当業者は、ペプチド模倣体のデザインが、本発明の方法を使用して、デザインまたは同定される、若干の構造的変更または化学構造の補正を要求しうることを認識するであろう。
医薬組成物
さらなる態様は、本明細書で提示される、前記結合剤、または核酸分子、または組換えベクターを含み、任意選択で、担体、希釈剤、アジュバント、または賦形剤を含む医薬組成物をもたらす。「担体」または「アジュバント」、特に、「薬学的に許容される担体」または「薬学的に許容されるアジュバント」とは、それら自体、組成物を施される個体に対して、有害な抗体の産生を誘導したり、保護を誘発したりしない、任意の適切な担体またはアジュバントである。「薬学的に許容される」とは、生物学的に、または他の点で、所望されない材料ではない材料を意味するが、すなわち、材料は、所望されない生物学的効果を引き起こしたり、それが含有される医薬組成物の他の成分のうちのいずれかと、有害な形で相互作用したりせずに、化合物と共に、個体へと投与されうる。薬学的に許容される担体は、好ましくは、担体に帰せられうる副作用が、有効成分の有益な効果を損なわないように、有効成分の有効な活性と合致する濃度において、患者に対して、比較的非毒性かつ無害である担体である。好ましくは、薬学的に許容される担体またはアジュバントは、抗原により誘発される免疫応答を増強する。適切な担体またはアジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔｉａ）は、典型的に、以下の非網羅的リスト：タンパク質、ポリ糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、および不活性のウイルス粒子など、緩徐に代謝される、大型の高分子に含まれる化合物のうちの１つまたは複数を含む。本明細書で使用される、「賦形剤」という用語は、医薬組成物中に存在することが可能であり、有効成分ではないが、例えば、有効成分に対して、長期にわたる安定性、または治療的増強に寄与しうる（薬物吸収を容易とするか、粘性を低減するか、または可溶性を増強することなどにより）、全ての物質を含むこと意図される。賦形剤は、塩、結合剤（例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、トレハロース、ソルビトール、マンニトール）、滑沢剤、増粘剤、界面活性剤、保存剤、乳化剤、緩衝物質、安定化剤、芳香剤、または着色剤を含む。特に、「薬学的に許容される媒体」などの「希釈剤」は、水、食塩水、生理食塩液、グリセロール、エタノールなどの媒体を含む。保湿剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質、保存剤などの補助物質は、このような媒体に含まれうる。薬学的に有効量の、本発明のポリペプチドまたはコンジュゲート、および薬学的に許容される担体は、好ましくは、処置される特定の状態に対して、結果をもたらすか、または影響を及ぼす量である。治療のために、本発明の医薬組成物は、標準的技法に従い、任意の患者へと投与されうる。投与は、経口投与、非経口投与、局所投与、経鼻投与、眼内投与、髄腔内投与、脳室内投与、舌下投与、直腸内投与、膣内投与などを含む、任意の適切な方式による投与でありうる。ナノテクノロジーおよびエアゾールおよび吸入剤など、さらに他の製剤法もまた、本発明の範囲内にある。投与量および投与頻度は、患者の年齢、性別、および状態、他の薬物の併用投与、禁忌および医師により考慮に入れられる他のパラメータに依存するであろう。本発明の医薬組成物は、保管のために凍結乾燥させられ、使用の前に、適切な担体中で再構成されうる。凍結乾燥物または液体として調製される場合、生理学的に許容される担体、賦形剤、安定化剤が、本発明の医薬組成物へと添加される必要がある（「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、２２版、Ａｌｌｅｎ，Ｌｏｙｄ Ｖ，Ｊｒ．編（２０１２）。リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝剤；ビタミンＣなどの抗酸化剤、小型のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ＰＶＰなどの親水性ポリマー、酢酸アミノ、グルタミン酸、アスパラギン、アルギニン、リシンなどのアミノ酸；グリコース、二糖、およびグルコース、マンノース、またはデキストリンなど、他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、マンニトール、ソルビトールなどの糖アルコール；Ｎａ＋などの対イオン、および／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）、もしくはＰＥＧなどの界面活性剤を含む、担体、賦形剤、および安定化剤の投与量および濃度は、対象（ヒト、マウス、および他の哺乳動物）に対して、安全であるものとする。本発明の医薬組成物を含有する調製物は、注射の前に滅菌化されるものとする。この手順は、凍結乾燥および再構成の前または後に、滅菌濾過膜を使用してなされうる。医薬組成物は、ゴム製止栓付きの静注液ボトルなど、滅菌アクセスポートを伴う容器内またはバイアル内にパッケージングされる場合もあり（医薬組成物は、液体として存在しうる）；容器またはバイアルが、液体の医薬組成物で充填され、その後、凍結乾燥させられるか、または乾燥させられる場合もあり；ＰＦＳ（ｐｒｅ－ｆｉｌｌｅｄ ｓｙｒｉｎｇｅ）内にパッケージングされる場合もある。
本明細書の上記におけるサルベコウイルスに言及する場合、一実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が意図される。
本発明は、特に、下記の番号つき言明において明示される、１つまたは複数の態様および実施形態のうちのいずれか１つ、またはこれらの任意の組合せを含む、態様および実施形態により捕捉される：
（１）ＳＰＲＢＤ（サルベコウイルススパイクタンパク質受容体結合ドメイン（ｓａｒｂｅｃｏｖｉｒｕｓ ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ））に結合し、サルベコウイルス結合剤自体が、ＳＰＲＢＤに結合している場合に、アンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）の、ＳＰＲＢＤへの結合を可能とし、少なくとも、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１を中和し、配列番号３０において規定された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸Ｔｈｒ３９３（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９３）、Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、Ｖａｌ３９５、またはＴｙｒ３９６のうちの、少なくとも１つに結合することを特徴とするサルベコウイルス結合剤。
（２）偽型ウイルス中和アッセイにおいて、１０μｇ／ｍＬまたはこれ未満のＩＣ５０で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１を中和する、（１）に記載のサルベコウイルス結合剤。
（３）サルベコウイルス結合剤自体が、ＳＰＲＢＤに結合している場合に、抗体ＶＨＨ７２、Ｓ３０９、またはＣＢ６の、ＳＰＲＢＤへの結合を、さらに可能とする、（１）に記載のサルベコウイルス結合剤。
（４）配列番号３０において規定された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸Ｓｅｒ５１４、Ｇｌｕ５１６、またはＬｅｕ５１８のうちの、少なくとも１つに、さらに結合する、（１）～（３）のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤。
（５）配列番号３０において規定された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸Ｌｙｓ４６２（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ａｒｇ４６２）、Ｐｈｅ４６４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｔｙｒ４６４）、Ｇｌｕ４６５（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｇｌｙ４６５）、Ａｒｇ４６６またはＡｒｇ３５７（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｌｙｓ３５７）のうちの、少なくとも１つに、さらに結合する、（１）～（４）のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤。
（６）ＩＳＶＤ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）、またはその機能的部分を含む、（１）～（５）のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤。
（７）配列番号１～５のうちのいずれかに存在し、Ｋａｂａｔ、ＭａｃＣａｌｌｕｍ、ＩＭＧＴ、ＡｂＭ、ａＨｏ、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｇｅｌｆａｎｄ、またはＨｏｎｅｇｇｅｒに従いアノテーションされる相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むことを特徴とする、（１）～（６）のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤。
（８）ＣＤＲ１が、配列番号６により規定され、ＣＤＲ２が、配列番号７により規定され、ＣＤＲ３が、配列番号８により規定され、アノテーションが、Ｋａｂａｔに従う、（７）に記載のサルベコウイルス結合剤。
（９）ＣＤＲ１が、配列番号９または１０により規定される配列から選択され、ＣＤＲ２が、配列番号１１～１４により規定される配列から選択され、ＣＤＲ３が、配列番号１５または１６により規定される配列から選択される、（８）に記載のサルベコウイルス結合剤。
（１０）配列番号１７により規定されるフレームワーク領域１（ＦＲ１）、配列番号１８により規定されるＦＲ２、配列番号１９により規定されるＦＲ３、および配列番号２０により規定されるＦＲ４；または
配列番号２１～２３により規定される配列から選択されるＦＲ１、配列番号１８により規定されるＦＲ２、配列番号２４～２７により規定される配列から選択されるＦＲ３、および配列番号２８または２９により規定される配列から選択されるＦＲ４；または
併せて、配列番号２１～２３により規定される配列から選択されるＦＲ１、配列番号１８により規定されるＦＲ２、配列番号２４～２７により規定される配列から選択されるＦＲ３、および配列番号２８または２９により規定される配列から選択されるＦＲ４の組合せに対する、少なくとも９０％のアミノ酸同一性（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）を有するアミノ酸配列を有する、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４の領域
をさらに含む、（７）～（９）のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤。
（１１）配列番号１～５のうちのいずれかにより規定されるか、または配列番号１～５のうちのいずれかに対する、少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有する、任意のアミノ酸配列により規定されるＩＳＶＤ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）を含むか、またはこれらからなり、同一でないアミノ酸が、１つまたは複数のＦＲ内に配置された、（７）～（１０）のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤。
（１２）（６）～（１１）のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤をコードする単離核酸。
（１３）（１２）に記載の核酸を含む組換えベクター。
（１４）（１）～（１１）のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤、（１２）に記載の単離核酸、および／または（１３）に記載の組換えベクターを含む医薬組成物。
（１５）医薬としての使用のための、（１）～（１１）のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤、（１２）に記載の単離核酸、（１３）に記載の組換えベクター、または（１４）に記載の医薬組成物。
（１６）サルベコウイルス感染の処置における使用のための、（１）～（１１）のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤、（１２）に記載の単離核酸、（１３）に記載の組換えベクター、または（１４）に記載の医薬組成物。
（１７）対象の受動免疫化における使用のための、（１）～（１１）のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤、（１２）に記載の単離核酸、（１３）に記載の組換えベクター、または（１４）に記載の医薬組成物。
（１８）対象が、サルベコウイルス感染を有するか、または対象が、サルベコウイルス感染を有さない、（１７）に記載の使用のための、サルベコウイルス結合剤、単離核酸、組換えベクター、または医薬組成物。
（１９）サルベコウイルス感染の診断における使用のための、（１）～（１１）のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤。
（２０）診断用キットの製造における使用のための、（１）～（１１）のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤、（１２）に記載の単離核酸、または（１３）に記載の組換えベクター。
（２１）サルベコウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、（１）～（２０）のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤。
（１’）ＳＰＲＢＤ（サルベコウイルススパイクタンパク質受容体結合ドメイン（ｓａｒｂｅｃｏｖｉｒｕｓ ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ））に結合し、サルベコウイルス結合剤自体が、ＳＰＲＢＤに結合している場合に、アンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）の、ＳＰＲＢＤへの結合を可能とし、少なくとも、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１を中和し、
・配列番号３０において規定された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸Ｔｈｒ３９３（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９３）、Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、Ｖａｌ３９５、またはＴｙｒ３９６のうちの、少なくとも１つ；および
・配列番号３０において規定された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸Ｌｙｓ４６２（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ａｒｇ４６２）、Ｐｈｅ４６４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｔｙｒ４６４）、Ｇｌｕ４６５（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｇｌｙ４６５）、Ａｒｇ４６６、またはＡｒｇ３５７（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｌｙｓ３５７）のうちの、少なくとも１つ
に結合することを特徴とするサルベコウイルス結合剤。
（２’）少なくとも、アミノ酸Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、およびＴｙｒ３９６に結合する、（１’）に記載のサルベコウイルス結合剤。
（３’）配列番号３０において規定された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸Ｌｙｓ４６２（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ａｒｇ４６２）、Ｐｈｅ４６４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｔｙｒ４６４）、Ｇｌｕ４６５（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｇｌｙ４６５）、またはＡｒｇ４６６のうちの、少なくとも１つに結合する、（１’）または（２’）に記載のサルベコウイルス結合剤。
（４’）配列番号３０において規定された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸Ｓｅｒ５１４、Ｇｌｕ５１６、またはＬｅｕ５１８のうちの、少なくとも１つに、さらに結合する、（１’）～（３’）のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤。
（５’）少なくとも、アミノ酸Ｓｅｒ５１４およびＧｌｕ５１６に結合する、（４’）に記載のサルベコウイルス結合剤。
（６’）配列番号３０において規定された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸Ａｒｇ３５５に、さらに結合する、（１’）～（５’）のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤。
（７’）ＳＰＲＢＤ（サルベコウイルススパイクタンパク質受容体結合ドメイン（ｓａｒｂｅｃｏｖｉｒｕｓ ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ））に結合し、サルベコウイルス結合剤自体が、ＳＰＲＢＤに結合している場合に、アンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）の、ＳＰＲＢＤへの結合を可能とし、少なくとも、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１を中和し、配列番号３０において規定された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、Ｔｙｒ３９６、Ｐｈｅ４６４、Ｓｅｒ５１４、Ｇｌｕ５１６、およびＡｒｇ３５５のうちの、少なくとも１つ、または優先順位が増大する順に、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つに結合し；
任意選択で、アミノ酸Ａｒｇ３５７（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｌｙｓ３５７）、および／またはＬｙｓ４６２（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ａｒｇ４６２）、および／またはＧｌｕ４６５（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｇｌｙ４６５）、および／またはＡｒｇ４６６、および／またはＬｅｕ５１８にさらに結合する
ことを特徴とするサルベコウイルス結合剤。
（８’）配列番号３０において規定された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の、Ｎ４３９、Ｋ４１７、Ｓ４７７、Ｌ４５２、Ｔ４７８、Ｅ４８４、Ｐ３８４、Ｎ５０１、および／またはＤ６１４位において、突然変異を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株を中和する、（１’）～（７’）のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤。
（９’）偽型ウイルス中和アッセイにおいて、１０μｇ／ｍＬまたはこれ未満のＩＣ５０で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株、および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１を中和する、（１’）～（８’）のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤。
（１０’）Ｓ１部の排出を誘導する、（１’）～（９’）のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤。
（１１’）サルベコウイルス結合剤自体が、ＳＰＲＢＤに結合している場合に、抗体ＶＨＨ７２、Ｓ３０９、またはＣＢ６の、ＳＰＲＢＤへの結合を、さらに可能とする、（１’）～（１０’）のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤。
（１２’）ＩＳＶＤ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）、またはその機能的部分を含む、（１’）～（１１’）のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤。
（１３’）配列番号１～５、または配列番号５３～５５のうちのいずれかに存在し、Ｋａｂａｔ、ＭａｃＣａｌｌｕｍ、ＩＭＧＴ、ＡｂＭ、またはＣｈｏｔｈｉａに従いアノテーションされる相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むことを特徴とする、（１’）～（１２’）のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤。
（１４’）ＣＤＲ１が、配列番号６により規定され、ＣＤＲ２が、配列番号７により規定され、ＣＤＲ３が、配列番号８により規定され、アノテーションが、Ｋａｂａｔに従う、（１３’）に記載のサルベコウイルス結合剤。
（１５’）ＣＤＲ１が、配列番号９または１０により規定される配列から選択され、ＣＤＲ２が、配列番号１１～１４により規定される配列から選択され、ＣＤＲ３が、配列番号１５または１６により規定される配列から選択される、（１４’）に記載のサルベコウイルス結合剤。
（１６’）配列番号１７により規定されるフレームワーク領域１（ＦＲ１）、配列番号１８により規定されるＦＲ２、配列番号１９により規定されるＦＲ３、および配列番号２０により規定されるＦＲ４；または
配列番号２１～２３により規定される配列から選択されるＦＲ１、配列番号１８により規定されるＦＲ２、配列番号２４～２７により規定される配列から選択されるＦＲ３、および配列番号２８または２９により規定される配列から選択されるＦＲ４；または
併せて、配列番号２１～２３により規定される配列から選択されるＦＲ１、配列番号１８により規定されるＦＲ２、配列番号２４～２７により規定される配列から選択されるＦＲ３、および配列番号２８または２９により規定される配列から選択されるＦＲ４の組合せに対する、少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を有する、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４の領域
をさらに含む、（１３’）～（１５’）のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤。
（１７’）配列番号１～５のうちのいずれかにより規定されるか、または配列番号１～５のうちのいずれかに対する、少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有する、任意のアミノ酸配列により規定されるＩＳＶＤ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）を含むか、またはこれらからなり、同一でないアミノ酸が、１つまたは複数のＦＲ内に配置された、（１３’）～（１６’）のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤。
（１８’）ＣＤＲ１が、配列番号７６により規定され、ＣＤＲ２が、配列番号７７により規定され、ＣＤＲ３が、配列番号７８により規定され、アノテーションが、Ｋａｂａｔに従う、（１３’）に記載のサルベコウイルス結合剤。
（１９’）ＣＤＲ１が、配列番号６９または７０により規定される配列から選択され、ＣＤＲ２が、配列番号７１または８２により規定される配列から選択され、ＣＤＲ３が、配列番号７３～７５により規定される配列から選択される、（１８’）に記載のサルベコウイルス結合剤。
（２０’）配列番号８２により規定されるフレームワーク領域１（ＦＲ１）、配列番号８６により規定されるＦＲ２、配列番号９０により規定されるＦＲ３、および配列番号９４により規定されるＦＲ４；または
配列番号７９～８１により規定される配列から選択されるＦＲ１、配列番号８３～８５により規定される配列から選択されるＦＲ２、配列番号８７～８９により規定される配列から選択されるＦＲ３、および配列番号９１～９３により規定される配列から選択されるＦＲ４；または
併せて、配列番号１９～８１により規定される配列から選択されるＦＲ１、配列番号８３～８５により規定される配列から選択されるＦＲ２、配列番号８７～８９により規定される配列から選択されるＦＲ３、および配列番号９１～９３により規定される配列から選択されるＦＲ４の組合せに対する、少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を有する、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４の領域
をさらに含む、（１８’）または（１９’）に記載のサルベコウイルス結合剤。
（２１’）配列番号５３～５５のうちのいずれかにより規定されるか、または配列番号５３～５５のうちのいずれかに対する、少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有する、任意のアミノ酸配列により規定されるＩＳＶＤ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）を含むか、またはこれらからなり、同一でないアミノ酸が、１つまたは複数のＦＲ内に配置された、（１８’）～（２０’）のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤。
（２２’）（１’）～（２１’）のいずれか一項に記載の結合剤のうちの１つまたは複数が、直接、またはリンカーを介して融合され、好ましくは、Ｆｃドメインを介して融合された多価サルベコウイルス結合剤または多特異性サルベコウイルス結合剤。
（２３’）（１２’）～（２１’）のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤をコードする単離核酸。
（２４’）（２３’）に記載の核酸を含む組換えベクター。
（２５’）（１’）～（２１’）のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤、（２２’）に記載の多価サルベコウイルス結合剤または多特異性サルベコウイルス結合剤、（２３’）に記載の単離核酸、および／または（２４’）に記載の組換えベクターを含む医薬組成物。
（２６’）医薬としての使用のための、（１’）～（２１’）のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤、（２２’）に記載の多価サルベコウイルス結合剤または多特異性サルベコウイルス結合剤、（２３’）に記載の単離核酸、（２４’）に記載の組換えベクター、または（２５’）に記載の医薬組成物。
（２７’）サルベコウイルス感染の処置における使用のための、（１’）～（２１’）のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤、（２２’）に記載の多価サルベコウイルス結合剤または多特異性サルベコウイルス結合剤、（２３’）に記載の単離核酸、（２４’）に記載の組換えベクター、または（２５’）に記載の医薬組成物。
（２８’）対象の受動免疫化における使用のための、（１’）～（２１’）のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤、（２２’）に記載の多価サルベコウイルス結合剤または多特異性サルベコウイルス結合剤、（２３’）に記載の単離核酸、（２４’）に記載の組換えベクター、または（２５’）に記載の医薬組成物。
（２９’）対象が、サルベコウイルス感染を有するか、または対象が、サルベコウイルス感染を有さない、（２８’）に記載の使用のための、サルベコウイルス結合剤、単離核酸、組換えベクター、または医薬組成物。
（３０’）サルベコウイルス感染の診断における使用のための、（１’）～（２１’）のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤、または（２２’）に記載の多価サルベコウイルス結合剤もしくは多特異性サルベコウイルス結合剤。
（３１’）診断用キットの製造における使用のための、（１’）～（２１’）のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤、（２２’）に記載の多価サルベコウイルス結合剤もしくは多特異性サルベコウイルス結合剤、（２３’）に記載の単離核酸、または（２４’）に記載の組換えベクター。
（３２’）サルベコウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、（１’）～（３１’）のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤。
定義
以下の用語または定義は、本発明の理解の一助となるためだけに提示される。
単数形の名詞に言及して、不定冠詞または定冠詞、例えば、「ある（ａ）」または「ある（ａｎ）」、「その」が使用される場合、具体的に、別のことが言明されているのでない限り、これは、この名詞の複数形を含む。
本明細書で、「～を含むこと」という用語が使用される場合、それは、他の要素またはステップを除外しない。したがって、「～を含むこと」という用語は、限定的である、「なること」または「～からなること」という用語を包含するが、これらより広義である。例えば、「Ａを含むこと」は、「Ａからなること」、「ＡおよびＢからなること」、「Ａ、Ｂ、Ｃからなること」などを意味する場合があり；この場合、「ＡおよびＢを含むこと」とは、「ＡおよびＢからなること」、「Ａ、Ｂ、Ｃからなること」などを意味しうる。
さらに、本明細書では、「第１の」、「第２の」、「第３の」などの用語は、同様の要素を識別するために使用され、必ずしも、逐次的順序または経時的順序について記載するものではない。このように使用される用語は、適切な状況下で、互換的であり、本明細書で記載される、本発明の実施形態は、本明細書で記載または例示される順序以外の順序における運用も可能であることが理解されるものとする。
具体的に規定されない限りにおいて、本明細書で使用される、全ての用語は、本発明の技術分野の当業者にとっての意味と同じ意味を有する。医療従事者は、特に、当技術分野の定義および用語について、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、４版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｓｖｉｅｗ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０１２）；およびＡｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０１６）へと方向付けられる。そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される、全ての技術用語および学術用語は、当業者（例えば、分子生物学、生化学、構造生物学、および／または数理生物学における）により一般に理解される意味と、同じ意味を有する。
本明細書で使用される、「核酸（複数可）」または「核酸分子（複数可）」とは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指し；併せて、「ヌクレオチド配列」、「ＤＮＡ配列」、または「ＲＮＡ配列」を結果としてもたらす／形成する、ヌクレオチドの連続直鎖状配置を指す。この用語は、分子の一次構造だけを指す。したがって、この用語は、二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡのほか、二本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＲＮＡも含む。この用語はまた、公知の種類の修飾、例えば、メチル化による修飾、「キャップ」による修飾、および天然に存在するヌクレオチドのうちの１つまたは複数の、類似体による置換による修飾も含む。核酸への修飾は、１つまたは複数のレベル：リン酸結合修飾（例えば、ホスホジエステル結合、ホスホルアミデート結合、またはホスホロチオエート結合のうちの１つまたは複数の導入）、糖修飾（例えば、ＬＮＡ（ロックト核酸）、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシ－エチル、２’－フルオロ、Ｓ拘束エチル、またはトリシクロ－ＤＮＡのうちの１つまたは複数の導入、および／または非リボース修飾（例えば、ホスホロジアミデートモルホリノまたはペプチド核酸のうちの１つまたは複数の導入）において導入されうる。
「核酸構築物」とは、天然では、一体で見出されず、したがって、天然において見出されないヌクレオチド配列（非天然ヌクレオチド配列）を有する、１つまたは複数の機能的な単位を含むように構築された、核酸分子を意味する。例は、非天然の核酸配列を含む、環状ＤＮＡ分子、直鎖状ＤＮＡ分子、二重鎖ＤＮＡ分子、染色体外ＤＮＡ分子（プラスミド）、コスミド（ラムダファージに由来するＣＯＳ配列を含有するプラスミド）、ウイルスゲノムなどを含む。
「コード配列」とは、適切な（遺伝子）調節配列の制御下に置かれた場合に、ｍＲＮＡへと転写され、かつ／またはポリペプチドへと翻訳される、ヌクレオチド配列である。コード配列の境界は、５’末端における翻訳開始コドンと、３’末端における翻訳終止コドンとにより決定される。コード配列が、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、組換えヌクレオチド配列、またはゲノムＤＮＡを含みうるがこれらに限定されない一方、イントロンは、ある特定の状況下でもまた存在しうる。
「キメラ遺伝子」または「キメラ構築物」または「キメラ遺伝子構築物」とは、調節的核酸配列が、目的の核酸の転写または発現を調節することが可能であるよう、（遺伝子）プロモーターまたは調節的核酸配列が、ＲＮＡ（例えば、コード配列、ｓｈＲＮＡなど）をコードする、目的の核酸配列に、作動可能に、もしくは作動的に連結されるか、またはこれと関連するように連結された、組換え核酸配列を、互換的に意味する。天然では、キメラ遺伝子内の、調節的核酸配列と、目的の核酸配列との、作動可能な連結、または作動的連結は、見出されない。
「発現カセット」は、（遺伝子）プロモーターに作動可能に連結された、目的の遺伝子／コード配列の発現を方向付けることが可能である、任意の核酸構築物を含む。発現カセットは、一般に、好ましくは、（転写方向において、５’から３’へと）：（遺伝子）プロモーター領域、転写開始領域を含む終結配列を伴う目的のポリヌクレオチド配列、ならびにＲＮＡポリメラーゼのための停止シグナルおよびポリアデニル化シグナルを含むＤＮＡ構築物であり；これらの全ての要素が、作動可能に、または作動的に連結されていることとは、細胞を形質転換した場合に、これらの領域の全てが、原核（例えば、細菌）細胞、または真核（例えば、哺乳動物の、酵母、昆虫、真菌、植物、藻類）細胞などの細胞内において、作動すること（発現されること）が可能であるべきことを意味する。好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼ結合性部位を含む、転写開始領域を含むプロモーター領域、およびポリアデニル化シグナルは、それが、細胞内において、機能的である限りにおいて、形質転換される細胞に天然の場合もあり、代替的供給源に由来する場合もあり、合成の場合もある。このような発現カセットは、例えば、「ベクター」内または「発現ベクター」内（直鎖状核酸内または環状核酸内、プラスミド内、コスミド内、ウイルスベクター内、ファージミド内など）で構築されうる。
本明細書で使用される、「ベクター」、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、「組換えベクター」、または「遺伝子導入ベクター」という用語は、連結された、別の核酸分子を保有することが可能な核酸分子を指すことが意図される。より特定すると、前記ベクターは、任意の適切な種類を含むが、例えば、プラスミドベクター、コスミドベクター、ラムダファージなどのファージベクター、ウイルスベクター、なおより特定すると、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクター、もしくはバキュロウイルスベクター、または細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、もしくはＰ１人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体ベクターに限定されない、当業者に公知である、任意のベクターを含みうる。
前記ベクターは、クローニングベクターまたは発現ベクターのほか、ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはアデノウイルスベクターなどの送達媒体を含みうる。発現ベクターは、プラスミドのほか、ウイルスベクターを含み、一般に、所望のコード配列と、作動可能に連結されたコード配列の、特定の宿主生物（例えば、細菌、酵母、植物、昆虫、または哺乳動物）、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系における発現に必要である、適切なＤＮＡ配列とを含有する。クローニングベクターは、一般に、所望される、ある特定のＤＮＡ断片を操作し、増幅するのに使用され、所望のＤＮＡ断片の発現に必要とされる、機能的配列を欠く場合がある。当技術分野では、細胞へのトランスフェクションにおける使用のための、発現ベクターの構築もまた周知であるので、標準的技法を介して達せられうる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ、およびＭａｎｉａｔｉｓ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９；「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」、１０９～１２８頁、Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、Ｃｌｉｆｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）；およびＡｍｂｉｏｎ社、１９９８年版カタログ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘ．）を参照されたい。
本明細書で記載される結合剤をコードする、核酸、ベクターなどは、治療的状況において利用されうる。このような核酸、ベクターなどは、遺伝子治療またはＲＮＡワクチン接種を介して投与されうる。本明細書で使用される、「遺伝子治療」とは、対象への、発現される核酸、または発現可能な核酸の投与により実施される治療を指す。このような適用のために、本明細書で記載される、核酸分子またはベクターは、細胞内における、結合剤の産生を可能とする。当技術分野では、遺伝子治療のための方法の、大きなセットが利用可能であり、例えば、（アデノ随伴）ウイルス媒介性遺伝子サイレンシング、またはウイルス媒介性遺伝子治療を含む（例えば、ＵＳ２００４００２３３９０；Ｍｅｎｄｅｌｌら、２０１７、Ｎ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ、３７７：１７１３～１７２２）。当業者には、多数の送達法が周知であり、ウイルス送達システム、ＤＮＡプラスミドのマイクロインジェクション、ネイキッド核酸のバイオリスティック法、リポソームまたは人工エキソソームの使用、ナノ粒子内または脂質内または脂質を含む粒子内に製剤化された、核酸またはベクターの投与を含むがこれらに限定されない。個別の患者への投与によるｉｎ ｖｉｖｏ送達は、典型的に、全身投与（例えば、静脈内注入、腹腔内注入、または脳内注射；例えば、Ｍｅｎｄｅｌｌら、２０１７、Ｎ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ、３７７：１７１３～１７２２）によりなされる。「ＲＮＡワクチン」または「メッセンジャーＲＮＡワクチン」または「ｍＲＮＡワクチン」は、目的の抗原（または複数の抗原）をコードする、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、または合成（ｍ）ＲＮＡに依拠する。ＲＮＡワクチンの投与、またはＲＮＡワクチンによるワクチン接種は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、ＲＮＡワクチンが投与される対象の細胞による、目的の抗原（または複数の抗原）の産生を結果としてもたらす。その後、対象の免疫系は、この抗原（複数可）に対する、免疫応答を惹起することができる。
本明細書では、「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」という用語は、アミノ酸残基のポリマー、ならびにその変異体および合成類似体を指し；併せて、「アミノ酸配列」または「タンパク質配列」を結果としてもたらす／形成する、アミノ酸の連続直鎖状配置を指すように、互換的に使用される。「ペプチド」はまた、例えば、酵素（例えば、トリプシン）消化の後における、その元のタンパク質に由来する、部分的アミノ酸配列も指す場合がある。これらの用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマーのほか、１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的類似体など、天然に存在しない合成アミノ酸アミノ酸ポリマーに適用される。官能基もしくはタンパク質の共有結合的付加（グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ユビキチン化、メチル化、脂質化、およびニトロシル化など）、またはタンパク質分解性プロセシングなど、１つまたは複数の翻訳後修飾を含むタンパク質もまた含まれる。アミノ酸の配列および修飾に基づき、ポリペプチドの原子量もしくは分子量、または重量は、（キロ）ダルトン（ｋＤａ）単位で表される。さらに、タンパク質の修飾は、ＨｉｓタグまたはＳｏｒｔａｇなど、タグの付加を含む。Ｓｏｒｔａｇ化（ソルターゼ媒介性ペプチド転移；Ｐｏｐｐら、２００７、Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ、３：７０７～７０８）により、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２を中和する、マルチアームＰＥＧ Ｎａｎｏｂｏｄｙが構築された（Ｍｏｌｉｎｅａｒ－Ｍｏｒｒｏら、２０２０、Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、１０：１６６１）。
「タンパク質ドメイン」とは、タンパク質内またはこの部分内の、顕著に異なる機能的単位および／または構造的単位である。通例、タンパク質ドメインは、特定の機能または相互作用の一因となり、タンパク質の全体的（生物学的）役割に寄与する。ドメインは、様々な生物学的文脈において存在する場合があり、この場合、同様のドメインが、異なるタンパク質内に、同様の機能または異なる機能と共に見出されうる。タンパク質ドメインは、例えば、多数の分子内システイン（例えば、システインノットタンパク質）により空間的に限定された場合、剛性の三次元構造を有する場合もあり、例えば、リガンド結合の存在もしくは非存在、または、例えば、翻訳後修飾の存在もしくは非存在に応じて、異なる三次元コンフォメーションを帯びる場合もあり、より規定が低度であり、可塑性が大きな三次元構造を有する場合もある。
本明細書では、アミノ酸は、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（「Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｙｍｂｏｌｉｓｍ ｆｏｒ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３８：９～３７（１９８４））において規定されまた、提示もされ；以下：アラニン（ＡまたはＡｌａ）、システイン（ＣまたはＣｙｓ）、アスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）、グルタミン酸（ＥまたはＧｌｕ）、フェニルアラニン（ＦまたはＰｈｅ）、グリシン（ＧまたはＧｌｙ）、ヒスチジン（ＨまたはＨｉｓ）、イソロイシン（ＩまたはＩｌｅ）、リシン（ＫまたはＬｙｓ）、ロイシン（ＬまたはＬｅｕ）、メチオニン（ＭまたはＭｅｔ）、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）、プロリン（ＰまたはＰｒｏ）、グルタミン（ＱまたはＧｌｎ）、アルギニン（ＲまたはＡｒｇ）、セリン（ＳまたはＳｅｒ）、トレオニン（ＴまたはＴｈｒ）、バリン（ＶまたはＶａｌ）、トリプトファン（ＷまたはＴｒｐ）、およびチロシン（ＹまたはＴｙｒ）の通りである、それらの３文字コード命名法または１文字コード命名法により提示される。
「単離された」または「精製された」とは、それが、その天然状態において、通常伴う成分を、実質的に、または本質的に含まない材料を意味する。例えば、「単離ポリペプチド」または「精製ポリペプチド」とは、単離または精製される、目的のポリペプチドを含む、分子の混合物から、任意の適切な手段により単離または精製されたポリペプチドを指す。単離または精製された、目的のポリペプチドは、例えば、免疫グロブリン、抗体、またはＮａｎｏｂｏｄｙの場合があり、混合物は、免疫グロブリン、抗体、もしくはＮａｎｏｂｏｄｙを産生する細胞内、および／または免疫グロブリン、抗体、もしくはＮａｎｏｂｏｄｙが分泌される培養培地中（細胞により分泌される他の分子と併せて分泌される可能性が高い）に存在する、混合物または分子でありうる。単離タンパク質または単離ペプチドは、化学的タンパク質合成により作出される場合もあり、組換え作製により作出される場合もあり、複合試料からの精製により作出される場合もある。同様の説明は、「単離核酸」または「単離核酸分子」へと適用される。
一態様では、本明細書で使用され、本明細書では、「～へと接続された」、「～へとコンジュゲートされた」、「～へとライゲーションされた」と互換的に使用される、「～へと融合された」という用語は、例えば、組換えＤＮＡ技術による「遺伝子融合」のほか、２つの核酸分子の間の、安定的な共有結合的連結を結果としてもたらす、「化学的コンジュゲーションおよび／または酵素的コンジュゲーション」を指す。同じことは、「～内に挿入された」という用語にも当てはまり、この場合、２つの配列を、遺伝子的に、酵素的に、または化学的に、融合するか、またはライゲーションすることにより、１つの核酸の断片が、第２の核酸分子内に挿入されうる。ペプチドまたはポリペプチドもまた、ペプチド結合を介するか、または１つのペプチドの、第２のペプチド内のアミノ酸の側鎖への連結を介するなどして、互いと融合されるか、または接続されうる。
「野生型」または「天然」という用語は、天然に存在する供給源から単離された遺伝子または遺伝子産物を指す。野生型遺伝子は、集団内において、最も高頻度で観察されるため、遺伝子または遺伝子産物の「正常」または「野生型」形態に任意にデザインされるものである。これに対し、「改変」、「突然変異体」、「操作」、または「変異体」という用語は、野生型遺伝子または野生型遺伝子産物と比較した場合に、配列内の修飾（置換、突然変異、または変異など）、翻訳後修飾、および／または生物学的特性もしくは機能的特性の修飾（すなわち、特徴の変更）を提示する、遺伝子または遺伝子産物を指す。天然に存在する突然変異体または変異体は、単離される場合があり；これらは、野生型遺伝子または野生型遺伝子産物と比較した場合に、特徴が変更されているという事実により同定されることが留意される。特徴の変更は、配列レベルだけにおいて存在する場合もあり、加えて、生物学的特性および／または機能的特性の変更を、野生型遺伝子または野生型遺伝子産物と比較された、突然変異体または変異体へと付与する場合もある。タンパク質内またはポリペプチド内に、保存的アミノ酸置換が導入されうることが理解されるが、この場合、このような置換は、タンパク質の活性に対して、本質的影響または実質的影響を及ぼさない。目的のタンパク質の、１つまたは複数の「相同体」は、目的の非修飾（例えば、天然、野生型）タンパク質と比べて、アミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を有し、それ／それらが由来する非修飾タンパク質と、本質的に同様であるか、または実質的に同様の生物学的活性および機能的活性を有するタンパク質を包含する。
本明細書で使用される、「配列同一性百分率」は、比較ウィンドウにわたって、２つの最適にアライメントされた（アミノ酸または核酸）配列を比較し、両方の配列において、同一なアミノ酸残基またはヌクレオチド塩基が生じる位置の数を決定して、マッチした位置の数をもたらし、マッチした位置の数を、比較ウィンドウ内の位置の総数（すなわち、ウィンドウのサイズ）により除し、これに１００を乗じて、（アミノ酸または核酸の）配列同一性の百分率をもたらすことにより計算される。
「分子複合体」または「複合体」という用語は、例えば、別のタンパク質または化学的実体でありうる、少なくとも１つの他の分子と会合した分子を指す。「～と会合した」という用語とは、分子複合体の２つの実体（のうちの一部または部分）の間の近接の状態を指す。会合は、非共有結合的会合の場合（この場合、並置は、水素結合またはファンデルワールス相互作用または静電相互作用により、エネルギー的に優先される）もあり、共有結合的会合の場合もある。「化学的実体」という用語は、化合物、少なくとも２つの化合物の複合体、およびこのような化合物または複合体の断片を指す。化学的実体は、例えば、リガンド、基質、リン酸、ヌクレオチド、アゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤、抗体、単一ドメイン抗体、薬物、ペプチド、ペプチド模倣体、タンパク質、または化合物でありうる。
本明細書で使用される、「結晶」という用語は、平面が、明確な角度で交差し、構成要素である化学分子種の規則的構造（内的構造など）が存在する構造（三次元（３Ｄ）固体凝集物など）を意味する。「結晶」という用語は、特に、実験的に調製された結晶など、固体物理学的結晶形態を指す。本明細書で使用される、「共結晶」という用語は、固有の特性を有する、固有の結晶構造を形成する、２つまたはこれを超える成分からなる構造を指し、この場合、構成要素は、原子の場合もあり、イオンの場合もあり、分子の場合もある。本出願の文脈では、コロナウイルスのＳタンパク質のＲＢＤドメインと、本明細書で記載される、結合剤／ＩＳＶＤ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）とを含む共結晶は、本明細書で記載される結合剤／ＩＳＶＤと複合体化したＲＢＤドメインの結晶と同義である。「結晶化溶液」という用語は、結晶化を促進する溶液であって、緩衝液、１つもしくは複数の塩、沈殿剤、１つもしくは複数のデタージェント、糖、もしくは有機化合物、ランタニドイオン、ポリイオン化合物、安定化剤、またはこのような薬剤のうちの、２つもしくはこれを超える薬剤の組合せなど、少なくとも１つの薬剤を含む溶液を指す。
「適切な条件」という用語は、とりわけ、温度、移動、他の成分、および／または「緩衝液条件（複数可）」などの環境因子を指し、この場合、「緩衝液条件」とは、具体的に、分子が存在する、溶液の組成を指す。組成は、最適のアッセイ性能を得るように、当業者が適切性を熟知している、ｐＨ緩衝物質、水、食塩水、生理食塩液、グリセロール、保存剤などの緩衝液および／または溶質を含む。本明細書で使用される、「適切な条件」とはまた、例えば、Ｎｂが、ＲＢＤに結合することを目的とする場合、適切な結合条件も指す場合があろう。本明細書で使用される、「適切な条件」とはまた、構造解析が、目的として期待される場合に、代替的に、適切な条件を意味しうる、適切な結晶化条件またはｃｒｙｏ－ＥＭ条件も指す場合があろう。適切な条件は、熱安定性アッセイが実施されうる場合の、緩衝液条件にもさらに関しうる。
「結合性ポケット」または「結合性部位」という用語は、その形状および電荷の結果として、別の化学的実体、化合物、タンパク質、ペプチド、抗体、単一ドメイン抗体、またはＩＳＶＤと会合する（上記参照）分子または分子複合体の領域を指す。抗体類縁分子について、本明細書では、「エピトープ」または「コンフォメーションエピトープ」という用語もまた、互換的に使用され、免疫グロブリン（またはその部分）、抗体、またはＩＳＶＤが結合する、タンパク質の結合性ポケットまたは結合性部位を指す。「ポケット」という用語は、クレフト、チャネル、または部位を含むがこれらに限定されない。コロナウイルスのＲＢＤドメインは、例えば、ＡＣＥ－２、ならびに多くの異なる中和抗体および非中和抗体、またはＮａｎｏｂｏｄｙに対する、結合性ポケットまたは結合性部位を含む。「結合性ポケット／部位の部分」という用語は、結合性ポケット、結合性部位、またはエピトープを規定するアミノ酸残基の全てに満たないアミノ酸残基を指す。例えば、結合性ポケットの部分を構成する残基の原子座標は、結合性ポケットの化学的環境を規定するために特異的な場合もあり、これらの残基と相互作用しうる分子の断片のデザインにおいて有用な場合もある。例えば、残基の部分は、それら自体、リガンドへの結合に（直接）関与する、鍵となる残基の場合もあり；リガンドが、鍵となる残基に結合するために、結合性ポケットの三次元コンパートメントを規定するが、リガンドへの結合に、必ずしも直接関与しない残基の場合もある。アミノ酸などの残基は、アミノ酸配列などの一次配列において、連続的な場合もあり、非連続的な場合もある。
「～に結合すること」とは、直接的なものであれ、間接的なものであれ、任意の相互作用を意味する。直接的相互作用は、２つの結合パートナーの間の接触（例えば、物理的接触または化学的接触）を含意する。間接的相互作用は、相互作用パートナーが、２つを超える分子の複合体内において相互作用する、任意の相互作用を意味する。相互作用は、完全に間接的でありうる（例えば、２つの分子は、１つまたは複数の架橋分子を一助として、同じ複合体の部分であるが、架橋分子の非存在下では、結合しない）。相互作用は、部分的に直接的であるか、または部分的に間接的な場合もある：２つの相互作用パートナーの間に、なおも直接的な接触が存在するが、このような接触は、例えば、安定的ではなく、１つまたは複数の、さらなる分子との相互作用により安定化される。
「結合の特異性」または「結合特異性」または「～に特異的に結合すること」とは、分子Ａが、ある特定の濃度（例えば、目的のタンパク質または過程を、阻害または中和するのに十分な濃度）において、目的の標的（例えば、タンパク質）に、他の標的（目的でない標的）に結合する、可能なアフィニティー（結合する場合に）より高度のアフィニティー（例えば、少なくとも２倍、５倍、または、少なくとも１０倍のアフィニティー、例えば、少なくとも２０、５０、もしくは１００倍、またはこれを超えるアフィニティー）で結合する状況を指す。特異的結合は、排他的結合を意味しない。しかし、特異的結合は、結合剤が、それらの標的のうちの１つまたは少数に対するアフィニティーまたは優先性を、ある程度増大させていることを意味する。結合の排他性とは、結合剤が、目的の標的だけに結合する状況を指す。
本明細書で使用される、「アフィニティー」という用語は、一般に、１つの分子（例えば、リガンド、化学物質、タンパク質、またはペプチド）が、単一分子単量体による平衡を、２つの分子の（特異的）（非共有結合的）結合により形成される複合体による平衡へとシフトさせるように、別の分子（例えば、（標的）タンパク質またはペプチド）に結合する程度を指す。非共有結合的相互作用、または２つまたはこれを超える結合パートナーの間の結合は、ファンデルワールス相互作用、水素結合、および塩架橋などの相互作用を伴いうる。
「結合剤」は、少なくとも１つの他の分子に結合することが可能な分子に関し、この場合、前記結合は、好ましくは、規定された結合性部位、ポケット、またはエピトープなどに対する、特異的結合である。結合剤は、任意の性質または種類の結合剤であることが可能であり、その由来に依存しない。結合剤は、化学合成される場合もあり、天然に存在する場合もあり、組換えにより作製される（かつ、任意選択で、精製される）場合もあるほか、デザインされ、合成により作製される（かつ、任意選択で、精製される）場合もある。よって、前記結合剤は、低分子、化学物質、ペプチド、ポリペプチド、抗体、または、とりわけ、ペプチド模倣体、抗体模倣体、活性断片、化学的誘導体など、これらのいずれかの任意の誘導体でありうる。結合剤の機能的断片、または結合剤の機能的部分とは、この結合剤と、機能的に同等である、この結合剤の断片または部分を指す。特に、本明細書で記載される結合剤の、このような機能的断片または機能的部分は、理想的に、本明細書の上記で、広範に概括された、この結合剤の機能的特色（１）～（１２６）のうちの１つまたは複数を保持する。抗体の、周知の機能的断片は、例えば、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ断片などである。
本明細書で使用される、「エピトープ」とは、コロナウイルスＲＢＤドメイン、より特定すると、２０１９－ｎＣｏＶ ＲＢＤドメインなどの標的分子上において、結合性部位または結合性ポケットを構成する、ポリペプチドの抗原決定基を指す。エピトープは、エピトープに固有である、空間コンフォメーション（直鎖状エピトープまたはコンフォメーションエピトープ）内の、３つのアミノ酸を含みうるであろう。一般に、エピトープは、少なくとも４つ、５つ、６つ、７つのアミノ酸からなり、より通例では、少なくとも８つ、９つ、または１０のアミノ酸からなる。
「直鎖状エピトープ」とは、天然において、直鎖状であるか、または直鎖状（ポリ）ペプチドにより模倣されうるエピトープであり、タンパク質内またはポリペプチド内に含有される、（連続）アミノ酸の連なりが、エピトープを形成することを指し示す。直鎖状エピトープを同定する、一般的方式は、目的のタンパク質またはポリペプチドであり、結合剤に対するエピトープを含有することが公知であるタンパク質またはポリペプチドを、重複ペプチド（通例、化学合成される）のセットに分割し、これらの全てを、結合剤との結合について調べる、ペプチド走査である。重複ペプチドのセットのうち、結合剤に結合するペプチド（複数可）から、エピトープの位置を導出することができる。重複ペプチドのセットのうち、いずれのペプチド（複数可）も、結合剤と結合しない場合、エピトープは、直鎖状エピトープではなく、単純な直鎖状ペプチドでは模倣されえない、コンフォメーションエピトープである可能性が高い。
本明細書で使用される、「コンフォメーションエピトープ」は、フォールディングしたポリペプチドの三次元コンフォメーションに固有な空間コンフォメーション内のアミノ酸を含むエピトープを指す。一般に、コンフォメーションエピトープは、直鎖状配列内において不連続であるが、タンパク質のフォールディング構造内において一体となるアミノ酸からなる。しかし、コンフォメーションエピトープはまた、フォールディングしたポリペプチドの三次元コンフォメーションに固有な（かつ、直鎖状ペプチドなど、変性状態において存在しない）コンフォメーションを取る、アミノ酸の直鎖状配列からなる場合もある。タンパク質複合体内において、コンフォメーションエピトープは、１つまたは複数のポリペプチドの直鎖状配列内において不連続であるが、フォールディングの異なるポリペプチドがフォールディングし、それらが固有の四次構造において会合すると、一体となるアミノ酸からなる。同様に、この場合、コンフォメーションエピトープはまた、一体となり、四次構造に固有のコンフォメーションを取る、１つまたは複数のポリペプチドの、アミノ酸の直鎖状配列からなる場合もある。タンパク質の「コンフォメーション」または「コンフォメーション状態」という用語は、一般に、タンパク質が、任意の瞬間に取りうる、ある範囲の構造を指す。当業者は、コンフォメーションまたはコンフォメーション状態の決定基が、タンパク質のアミノ酸配列（修飾アミノ酸を含む）に反映される、タンパク質の一次構造およびタンパク質を取り巻く環境を含むことを認識するであろう。タンパク質のコンフォメーションまたはコンフォメーション状態はまた、タンパク質の二次構造（例えば、とりわけ、αヘリックス、βシート）、三次構造（例えば、ポリペプチド鎖の三次元フォールディング）、および四次構造（例えば、ポリペプチド鎖の、他のタンパク質サブユニットとの相互作用）などの構造的特色にも関する。とりわけ、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、ニトロシル化、メチル化、アセチル化、脂質化、リガンド結合、硫酸（スルホン）化、または疎水性基の接合など、ポリペプチド鎖に対する、翻訳後修飾および他の修飾は、タンパク質のコンフォメーションに影響を与えうる。さらに、とりわけ、周囲溶液のｐＨ、塩濃度、イオン強度、および浸透圧、ならびに他のタンパク質および補因子との相互作用などの環境因子も、タンパク質のコンフォメーションに影響を及ぼしうる。タンパク質のコンフォメーション状態、またはタンパク質内のアミノ酸の空間的コンフォメーションは、方法の中でも、活性または別の分子への結合についての機能アッセイにより決定される場合もあり、Ｘ線結晶構造解析、（多次元）核磁気共鳴（ＮＭＲ）、スピン標識化、またはｃｒｙｏ－ＥＭなど、物理的方法により決定される場合もある。タンパク質のコンフォメーションおよびコンフォメーション状態の一般的な議論については、ＣａｎｔｏｒおよびＳｃｈｉｍｍｅｌ、「Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｉ部：「Ｔｈｅ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９８０；ならびにＣｒｅｉｇｈｔｏｎ、「Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９３が参照される。
「抗体」という用語は、抗原に特異的に結合する、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、または免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインを含む分子を指す。「抗体」は、さらに、天然供給源または組換え供給源に由来する、無傷の免疫グロブリンである場合があり、無傷の免疫グロブリンの免疫反応性部分でありうる。「活性の抗体断片」という用語は、それ自体、抗原決定基またはエピトープに対する高アフィニティーを有し、このような特異性の一因となる、１つまたは複数のＣＤＲを含有する、任意の抗体または抗体様構造の部分を指す。非限定例は、免疫グロブリンドメイン、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、ｓｃＦｖ、重鎖－軽鎖二量体、ＩＳＶＤ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（またはＶＨＨ抗体）、ドメイン抗体、および完全軽鎖または完全重鎖などの単鎖構造を含む。
本明細書で使用される、「抗体断片」および「活性抗体断片」という用語は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスなど、サルベコウイルスのスパイクタンパク質内に存在する、スパイクタンパク質またはＲＢＤドメインに特異的に結合することが可能な、免疫グロブリンドメインまたは抗原結合性ドメインを含むタンパク質を指す。抗体は、典型的に、免疫グロブリン分子の四量体である。「免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン」または、より具体的に、「ＩＶＤ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）」（「ＩＶＤ」と略記される）という用語は、当技術分野および本明細書の下記で、それぞれ、「フレームワーク領域１」または「ＦＲ１」；「フレームワーク領域２」または「ＦＲ２」；「フレームワーク領域３」または「ＦＲ３」および「フレームワーク領域４」または「ＦＲ４」と称される、４つの「フレームワーク領域」であって、当技術分野および本明細書の下記で、それぞれ、「相補性決定領域１」または「ＣＤＲ１」；「相補性決定領域２」または「ＣＤＲ２」および「相補性決定領域３」または「ＣＤＲ３」と称される、３つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」により中断されるフレームワーク領域から本質的になる免疫グロブリンドメインを意味する。したがって、ＩＶＤ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）の一般構造または配列は、以下：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の通りに指し示されうる。抗原結合性部位またはエピトープ結合性部位を保有することにより、抗体へと、抗原に対する特異性を付与するのは、ＩＶＤ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）であり、特に、その中のＣＤＲ、なおより特定すると、その中のＣＤＲ３である。典型的に、常套的免疫グロブリンでは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とが相互作用して、抗原結合性部位を形成する。この場合に、ＶＨおよびＶＬのいずれの相補性決定領域（ＣＤＲ）も、抗原結合性部位に寄与する（が、必ずしも対等にではない）、すなわち、合計６つのＣＤＲが、抗原結合性部位の形成に関与するであろう。上記の定義を念頭に置くと、常套的４鎖抗体（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ分子など；当技術分野で公知である）、またはこのような常套的４鎖抗体に由来する、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド連結されたＦｖ断片などのＦｖ断片、もしくはｓｃＦｖ断片、もしくはダイアボディー（全てが、当技術分野で公知である）の抗原結合性ドメインは、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインなど、（会合した）免疫グロブリンドメインの対により、すなわち、一体となって、それぞれの抗原のエピトープに結合する、免疫グロブリンドメインのＶＨ－ＶＬ対により、抗原のそれぞれのエピトープに結合する。本明細書で使用される、「ＩＳＶＤ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）」（または「ＩＳＶＤ」）とは、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４のフォーマットに従う、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）、および３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むアミノ酸配列を伴うタンパク質を指す。
本発明の「免疫グロブリンドメイン」とは、「単一可変ドメイン」という用語と同義である、「ＩＳＶＤ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）」（「ＩＳＶＤ」と略記される）を指し、抗原結合性部位が、単一の免疫グロブリンドメイン上に存在し、これにより形成される分子を規定する。これは、ＩＳＶＤ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）を、２つの免疫グロブリンドメイン、特に、２つの可変ドメインが、相互作用して、抗原結合性部位を形成する、「常套的」免疫グロブリンまたはこれらの断片と区別する。ＩＳＶＤ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）の結合性部位は、単一のＶＨ／ＶＨＨドメインまたはＶＬドメインにより形成される。よって、ＩＳＶＤ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）の抗原結合性部位は、３つ以下のＣＤＲにより形成される。このように、単一可変ドメインは、単一の抗原結合性単位（すなわち、単一の抗原結合性ドメインが、別の可変ドメインと相互作用して、機能的抗原結合性単位を形成する必要がないように、単一可変ドメインから本質的になる、機能的抗原結合性単位）を形成することが可能である限りにおいて、軽鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＬ配列）またはその適切な断片の場合もあり、重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＨ配列またはＶＨＨ配列）またはその適切な断片の場合もある。本発明の一実施形態では、ＩＳＶＤ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）は、重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＨ配列）であり；より具体的には、ＩＳＶＤ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）は、常套的４鎖抗体に由来する、重鎖可変ドメイン配列の場合もあり、重鎖抗体に由来する、重鎖可変ドメイン配列の場合もある。例えば、ＩＳＶＤ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）は、（単一）ドメイン抗体（または（単一）ドメイン抗体としての使用に適するアミノ酸配列）の場合もあり、「ｄＡｂ」（またはｄＡｂとしての使用に適するアミノ酸配列）の場合もあり、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（本明細書で規定される通りであり、ＶＨＨを含むがこれに限定されない）の場合もあり；他の単一可変ドメイン、またはそれらのいずれか１つの、任意の適切な断片の場合もある。特に、ＩＳＶＤ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）は、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（本明細書で規定される）またはその適切な断片でありうる。注：Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、およびＮａｎｏｃｌｏｎｅ（登録商標）とは、Ａｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．（Ｓａｎｏｆｉ Ｃｏｍｐａｎｙ）の登録商標である。Ｎａｎｏｂｏｄｙの一般的記載については、下記のさらなる記載のほか、例えば、ＷＯ２００８／０２００７９において記載されている先行技術など、本明細書で引用される先行技術が参照される。ＶＨＨ、ＶＨＨドメイン、ＶＨＨ抗体断片、およびＶＨＨ抗体としてもまた公知の「ＶＨＨドメイン」は、元来、「重鎖抗体」（すなわち、「軽鎖を欠いた抗体」；Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ、３６３：４４６～４４８）の、抗原結合性免疫グロブリン（Ｉｇ）（可変）ドメインとして記載されている。「ＶＨＨドメイン」という用語は、これらの可変ドメインを、常套的４鎖抗体内に存在する重鎖可変ドメイン（本明細書で、「ＶＨドメイン」と称される）、および常套的４鎖抗体内に存在する軽鎖可変ドメイン（本明細書で、「ＶＬドメイン」と称される）と識別するために選び出されている。ＶＨＨおよびＮａｎｏｂｏｄｙのさらなる記載については、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ、２００１による総説論文（Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、７４：２７７～３０２）のほか、一般的背景技術として言及される、以下の特許出願：ＷＯ９４／０４６７８、ＷＯ９５／０４０７９、ＷＯ９６／３４１０３、ＷＯ９４／２５５９１、ＷＯ９９／３７６８１、ＷＯ００／４０９６８、ＷＯ００／４３５０７、ＷＯ００／６５０５７、ＷＯ０１／４０３１０、ＷＯ０１／４４３０１、ＥＰ １１３４２３１、ＷＯ０２／４８１９３、ＷＯ９７／４９８０５、ＷＯ０１／２１８１７、ＷＯ０３／０３５６９４、ＷＯ０３／０５４０１６、ＷＯ０３／０５５５２７、ＷＯ０３／０５０５３１、ＷＯ０１／９０１９０、ＷＯ０３／０２５０２０（＝ＥＰ １４３３７９３）、ＷＯ０４／０４１８６７、ＷＯ０４／０４１８６２、ＷＯ０４／０４１８６５、ＷＯ０４／０４１８６３、ＷＯ０４／０６２５５１、ＷＯ０５／０４４８５８、ＷＯ０６／４０１５３、ＷＯ０６／０７９３７２、ＷＯ０６／１２２７８６、ＷＯ０６／１２２７８７、およびＷＯ０６／１２２８２５が参照される。これらの参考文献において記載される通り、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（特に、ＶＨＨ配列および部分ヒト化Ｎａｎｏｂｏｄｙ）は、特に、フレームワーク配列のうちの１つまたは複数における、１つまたは複数の「ホールマーク残基」の存在により特徴付けられうる。任意のＩＶＤのアミノ酸残基の番号付けのために、異なる番号付けスキームが適用されうる。例えば、番号付けは、ラクダ科動物に由来するＶＨＨドメインへと適用されている通り、ＨｏｎｅｇｇｅｒおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、２００１（Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、３０９：６５７～７０）により与えられる、全ての重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のためのＡＨｏ番号付けスキームに従い実施されうる。当技術分野では、同様の方式で、ＶＨＨドメインへもまた適用されうる、ＶＨドメインのアミノ酸残基を番号付けするための、代替的方法が公知である。例えば、ＦＲ配列およびＣＤＲ配列の画定は、ＲｉｅｃｈｍａｎｎおよびＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ、１９９９（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２３１：２５～３８）により、ラクダ科動物に由来するＶＨＨドメインへと適用された、Ｋａｂａｔ番号付けシステムを使用することによりなされうる。ＣＤＲの各々におけるアミノ酸残基の総数は、変動する場合があり、Ｋａｂａｔ番号付けにより指し示されるアミノ酸残基の総数に対応しない場合がある（すなわち、Ｋａｂａｔ番号付けに従う、１つまたは複数の位置が、実際の配列内で占有されない場合もあり、実際の配列が、Ｋａｂａｔ番号付けにより可能とされる数を超えるアミノ酸残基を含有する場合もある）ことに留意されたい（ＶＨドメインおよびＶＨＨドメインについて、当技術分野で周知の通り）。これは、一般に、Ｋａｂａｔに従う番号付けが、実際の配列内のアミノ酸残基の実際の番号付けに対応する場合もあり、これに対応しない場合もあることを意味する。ＶＨドメイン内およびＶＨＨドメイン内のアミノ酸残基の総数は、通例、１１０～１２０の範囲にあり、１１２～１１５の間であることが多い。しかし、小型の配列および長型の配列もまた、本明細書で記載される目的に適しうることに留意されたい。
抗体／免疫グロブリン配列内のＣＤＲ領域の決定は、一般に、適用されるアルゴリズム／方法：Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔら、１９９１、５版、ＮＩＨ刊行物９１－３２４２）、Ｃｈｏｔｈｉａ（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、１９８７、Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１９６：９０１～１７）、ＩＭＧＴ（ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）番号付けスキーム；例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．Ｕｋ／ａｂｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ＃ｋａｂａｔｎｕｍ ａｎｄ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ／Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ／ＩＭＧＴｎｕｍｂｅｒｉｎｇ．ｈｔｍｌ；ＬｅＦｒａｎｃ、２０１４、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、５：１～２２を参照されたい）に依存する。ＣＤＲ領域の決定はまた、ＭａｃＣａｌｌｕｍら、１９９６（Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２６２：７３２～７４５）において記載されている、接触解析および結合性部位トポグラフィーに基づく指定など、他の方法に従ってもなされうる。または、代替的に、ＣＤＲのアノテーションは、ＡｂＭ（ＡｂＭは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌにおいて記載されている、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｔｄ．製の抗体モデル化パッケージである）に従ってもなされうる。異なる方法を、同じ抗体／免疫グロブリン配列に適用することは、異なるＣＤＲアミノ酸配列をもたらす場合があり、この場合、差違は、抗体／免疫グロブリン／ＩＶＤ配列内における、ＣＤＲ配列の長さおよび／または画定に存在しうる。したがって、本明細書で記載されるＩＳＶＤ結合剤のＣＤＲは、本明細書で特徴付けられる単一可変ドメイン抗体内に存在するＣＤＲ配列として記載されうる。代替的に、これらのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けスキームもしくはＫａｂａｔ番号付け法、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキームもしくはＣｈｏｔｈｉａ番号付け法、ａＨｏ番号付けスキームもしくはａＨｏ番号付け法、ＭａｃＣａｌｌｕｍら、１９９６による番号付けスキームもしくは番号付け法、ＡｂＭ番号付けスキームもしくはＡｂＭ番号付け法、またはＩＭＧＴ番号付けスキームもしくはＩＭＧＴ番号付け法に従うなど、周知の方法に従い決定または画定される、単一可変ドメイン抗体（本明細書で記載される）内に存在するＣＤＲ配列として記載されうる。
ＶＨＨまたはＮｂは、アミノ酸配列に従い、異なるファミリーに分類されるか、なおまたはＢ細胞成熟時に、同じ前駆細胞に由来する、クローン的に類縁の配列をクラスター化するように、スーパーファミリーに分類されることが多い（Ｄｅｓｃｈａｇｈｔら、２０１７、Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ、８：４２０）。この分類は、ＮｂのＣＤＲ配列に基づくことが多く、この場合、例えば、各Ｎｂ（またはＶＨＨ）ファミリーは、ＣＤＲ３領域の配列同一性閾値を伴う、（クローン的）類縁配列のクラスターとして規定される。したがって、本明細書で規定される、単一のＶＨＨファミリー内では、ＣＤＲ３配列は、アミノ酸組成が、同一であるか、または極めて類似する配列であり、好ましくは、ＣＤＲ３配列内における、少なくとも８０％の同一性、または少なくとも８５％の同一性、または少なくとも９０％の同一性を伴い、この結果として、同じ結合性部位に結合し、機能的効果など、同じ効果を有する、同じファミリーのＮｂをもたらす。
ドメイン抗体およびＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）（ＶＨＨドメインを含む）などのＩＳＶＤ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）は、ヒト化にかけられうる、すなわち、最近縁のヒト生殖細胞系列配列との配列同一性の程度を増大させるように、ヒト化にかけられうる。特に、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）（ＶＨＨドメインを含む）などのヒト化ＩＳＶＤ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）は、ヒト化置換（本明細書で、さらに規定される）である、かつ／またはこれに対応する、少なくとも１つのアミノ酸残基（および、特に、少なくとも１つのフレームワーク残基）が存在する、ＩＳＶＤ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）でありうる。潜在的に有用なヒト化置換は、天然に存在するＶＨＨ配列のフレームワーク領域の配列を、１つまたは複数の近縁のヒトＶＨ配列の、対応するフレームワーク配列と比較することにより確認することができ、その後、このようにして決定された、潜在的に有用なヒト化置換（またはその組合せ）のうちの１つまたは複数を、前記ＶＨＨ配列へと導入することができ（本明細書で、さらに記載される通り、それ自体公知である、任意の方式で）、結果として得られるヒト化ＶＨＨ配列を、標的に対するアフィニティー、安定性、発現の容易さおよびレベル、ならびに／または他の所望の特性について調べることができる。このようにして、限定的な程度の試行錯誤により、他の適切なヒト化置換（または適切なその組合せ）も、当業者により決定されうる。既に記載されている内容に基づき、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）（ＶＨＨドメインを含む）など、ＩＳＶＤ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）（のフレームワーク領域）はまた、部分的にヒト化される場合もあり、完全にヒト化される場合もある。
ヒト化ＩＳＶＤ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）、特に、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）は、対応する天然に存在するＶＨＨドメインと比較して、免疫原性の低減など、いくつかの利点を有しうる。ヒト化とは、ヒト患者における投与時に、免疫原性が、微小であるか、または非存在であるように、突然変異させられることを意味する。ヒト化置換は、結果として得られるヒト化アミノ酸配列、および／またはヒト化ＶＨＨが、抗原結合能など、親（非ヒト化）ＶＨＨの好適な特性を、なおも保持するように選び出されるものとする。本明細書で提示される記載に基づき、当業者は、一方における、ヒト化置換によりもたらされる好適な特性と、他方における、天然に存在するＶＨＨドメインの好適な特性との間における、所望のまたは適切な均衡を最適化するか、またはこれを達成するヒト化置換、またはヒト化置換の適切な組合せを選択することが可能であろう。このような方法は、当業者により公知である。ヒトコンセンサス配列は、ヒト化のための標的配列として使用されうるが、当技術分野では、他の手段もまた公知である。１つの代替法は、例えば、ＩＧＨＶ３対立遺伝子のアライメントであるが、これらに限定されないアライメントなど、当業者が、多数のヒト生殖細胞系列対立遺伝子をアライメントし、標的配列内のヒト化に適する残基の同定のために、前記アライメントを使用する方法を含む。標的配列と最も相同な、ヒト生殖細胞系列対立遺伝子のサブセットもまた、適切なヒト化残基を同定するための出発点としてアライメントされうる。代替的に、ＶＨＨは、ヒト対立遺伝子内において、その最近縁の相同体を同定するように解析され、ヒト化構築物のデザインのために使用される。Ｃａｍｅｌｉｄａｅ ＶＨＨへと適用されるヒト化法はまた、単独または組合せにおける、特異的アミノ酸の置きかえを含む方法によっても実施されうる。前記置き換えは、文献、公知のヒト化の取組みのほか、天然のＶＨＨ配列と比較した、ヒトコンセンサス配列、または目的のＶＨＨ配列に最も類似するヒト対立遺伝子から公知の内容に基づき選択されうる。ＷＯ０８／０２００７９の表Ａ－５～Ａ－８に与えられた、ＶＨＨのエントロピーおよびＶＨＨの可変性についてのデータから見られうる通り、フレームワーク領域内の、一部のアミノ酸残基は、ヒトと、Ｃａｍｅｌｉｄａｅとの間で、他の動物との間より良好に保存されている。一般に、その最広義における本発明は、それに限定されないが、好ましくは、保存度が小さい位置に、任意の置換、欠失、または挿入が施される。一般にまた、アミノ酸置換は、アミノ酸の欠失または挿入より好ましい。例えば、Ｃａｍｅｌｉｄａｅ単一ドメイン抗体のヒト様クラスは、典型的に、ヒト由来であるか、または他の種に由来する、常套的抗体内に見出される、疎水性のＦＲ２残基を含有するが、二重鎖抗体に由来するＶＨ内に存在する、保存的トリプトファン残基を置換する、１０３位における、他の置換により、この親水性の喪失を補償する。このように、これらの２つクラスに属するペプチドは、ヒトＶＨフレームワーク領域に対する、高度のアミノ酸配列相同性を示し、前記ペプチドは、これに由来する望ましくない免疫応答の見込みを伴わず、さらなるヒト化の負荷を伴わずに、直接、ヒトへと投与されうる。実際、一部のＣａｍｅｌｉｄａｅ ＶＨＨ配列は、ヒトＶＨフレームワーク領域に対する、高度の配列相同性を提示し、ひいては前記ＶＨＨは、これに由来する免疫応答の見込みを伴わず、さらなるヒト化の負荷または必要を伴わずに、直接、患者へと投与されうる。
既存の抗体への結合が低減されたポリペプチド（例えば、ＷＯ２０１２／１７５７４１およびＷＯ２０１５／１７３３２５が参照される）を作出するように、ヒト化の間に、例えば、位置：１１、１３、１４、１５、４０、４１、４２、８２、８２ａ、８２ｂ、８３、８４、８５、８７、８８、８９、１０３、または１０８のうちの少なくとも１つにおいて、適切な突然変異、特に、置換が導入される場合がある。本発明のアミノ酸配列および／またはＶＨＨは、１つもしくは複数のホールマーク残基（下記で規定される）、または１つもしくは複数の他のフレームワーク残基（すなわち、非ホールマーク残基）、あるいはこれらの任意の適切な組合せなど、任意のフレームワーク残基（複数可）において、適切にヒト化されうる。本発明のアミノ酸配列、ＶＨＨ、またはポリペプチドを発現させるのに使用される宿主生物に応じて、このような欠失および／または置換はまた、当業者の能力の範囲内にある通り、翻訳後修飾のための１つまたは複数の部位（１つまたは複数のグリコシル化部位など）が除去されるような方式でもデザインされうる。代替的に、置換または挿入は、例えば、部位特異的ＰＥＧ化を可能とする、官能基の接合のための、１つまたは複数の部位（本明細書において記載される）を導入するようにもデザインされうる。
場合によって、３７、４４、４５、および／または４７位における、親水性特徴を伴う、典型的なＣａｍｅｌｉｄａｅホールマーク残基のうちの、少なくとも１つは置きかえられる（ＷＯ２００８／０２００７９の表Ａ－０３を参照されたい）。ヒト化の別の例は、１、５、１１、１４、１６、および／または２８位などのＦＲ１；７３、７４、７５、７６、７８、７９、８２ｂ、８３、８４、９３、および／または９４位などのＦＲ３；ならびに１０ １０３、１０４、１０８、および／または１１１位などのＦＲ４（ＷＯ２００８／０２００７９の表Ａ－０５～Ａ０８を参照されたい；全ての番号付けは、Ｋａｂａｔ法に従う）内の残基の置換を含む。ヒト化は、典型的に、ＦＲ内の置換のみに関し、ＣＤＲ内の置換に関しない。これが、ＣＤＲは標的に対する結合アフィニティーおよび／または効力に影響を与えうる／与えるはずだからである。
本明細書で使用される、「治療活性剤」とは、疾患の処置の文脈（本明細書で、さらに記載される）では、治療的効果（すなわち、治癒的または予防的効果）を有するか、または有しうる、任意の分子を意味する。好ましくは、治療活性剤は、毒素、または細胞傷害薬、またはプロドラッグを細胞傷害薬へと転換することが可能な酵素、または放射性核種、または細胞傷害性細胞などの細胞傷害剤の場合もあり、非細胞傷害剤の場合もある、疾患修飾剤である。なおより好ましくは、治療活性剤は、疾患に対して、治癒的効果を及ぼす。本発明の結合剤、または組成物、または医薬組成物は、ＳＡＲＳコロナウイルスなどのコロナウイルス感染に感染した患者、またはＣＯＶＩＤ－１９を患う患者の処置において、有益である場合に、治療活性剤として作用しうる。結合剤は、本明細書で記載される、サルベコウイルス結合性ＩＳＶＤの変異体を含む薬剤、好ましくは、ＲＢＤの、同じ結合性領域に結合する、改善型変異体を含み、より好ましくは、そのヒト化変異体を含み、対象へと投与されると有利である、さらなる官能基を含有する場合もあり、これにカップリングされる場合もある。このような官能基、およびこれらを導入するための技法の例は、当業者に明らかであり、一般に、当技術分野で言及される、全ての官能基および技法のほか、それ自体、医薬タンパク質の改変のために公知であり、特に、抗体または抗体断片の改変のために公知である、官能基および技法を含むことが可能であり、これらについては、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、１６版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ（１９８０）が参照される。このような官能基は、例えば、ＩＳＶＤまたは活性の抗体断片へと、直接（例えば、共有結合的に）連結される場合もあり、任意選択で、これもまた、当業者に明らかとなる、適切なリンカーまたはスペーサーを介して連結される場合もある。医薬のタンパク質の半減期を延長し、かつ／または免疫原性を低減するために、最も広く使用される技法のうちの１つは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、またはその誘導体（メトキシポリ（エチレングリコール）またはｍＰＥＧなど）など、適切な、薬学的に許容されるポリマーの接合を含む。例えば、この目的で、ＰＥＧは、本発明のＩＳＶＤ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）内で天然に存在するシステイン残基へと接合される場合があり、本発明のＩＳＶＤ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）が、ＰＥＧの接合のための、１つまたは複数のシステイン残基を適切に導入するように、改変される場合もあり、ＰＥＧの接合のための、１つまたは複数のシステイン残基を含むアミノ酸配列が、本発明のＩＳＶＤまたは活性の抗体断片の、Ｎ末端および／またはＣ末端へと融合される場合もあり、全ては、それ自体、当業者に公知である、タンパク質操作法を使用する。別の、通例では、それほど好ましくない改変は、通例、抗体または活性抗体断片を発現させるために使用される宿主細胞に依存する、共翻訳修飾および／または翻訳後修飾の一部としての、Ｎ結合型グリコシル化またはＯ結合型グリコシル化を含む。結合性ドメインの半減期を延長するための、別の技法は、二官能性ドメインまたは二特異性ドメイン（例えば、一方は、コロナウイルスの標的ＲＢＤに対する、ＩＳＶＤまたは活性抗体断片であり、一方は、アルブミンなどの血清タンパク質、またはサーファクタントプロテインＡ（ＳｐＡ）（肺内に豊富に存在し、半減期を延長する一助となる、表面タンパク質である）に対する））への操作、または抗体断片、特に、ＩＳＶＤ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）の、ペプチド（例えば、アルブミンなどの血清タンパク質に対するペプチド）との融合への操作を含みうる。さらに別の例では、本発明の変異体ＩＳＶＤは、ＩｇＡ Ｆｃドメイン、または、例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、ＩｇＧ２ Ｆｃドメイン、またはＩｇＧ４ ＦｃドメインなどのＩｇＧ Ｆｃドメインなどの免疫グロブリンＦｃドメインへと融合されうる。例は、実験節に、さらに示され、また、配列表にも描示される。
本明細書で使用される、「化合物」または「被験化合物」または「候補化合物」または「薬物候補化合物」という用語は、デザインされるか、同定されるか、スクリーニングされるか、または作出され、スクリーニングアッセイまたは薬物発見アッセイなどのアッセイにおいて調べられる場合もあり、とりわけ、コロナウイルス、とりわけ、２０１９年のコロナウイルス感染を中和することが可能な化合物を同定するための方法において調べられる場合もある、任意の天然に存在する分子または合成分子について記載する。このように、これらの化合物は、有機化合物および無機化合物を含む。ハイスループットを目的として、十分な範囲にわたる多様性をもたらす、コンビナトリアルライブラリーまたはランダム化ライブラリーなどの被験化合物ライブラリーが使用されうる。例は、天然化合物ライブラリー、アロステリック化合物ライブラリー、ペプチドライブラリー、抗体断片ライブラリー、合成化合物ライブラリー、断片ベースのライブラリー、ファージディスプレイライブラリーなどを含むがこれらに限定されない。このような化合物はまた、結合剤とも称される場合があり；本明細書で言及される通り、これらは、低分子量（例えば、＜９００Ｄａまたは＜５００Ｄａ）有機化合物を指す、「低分子」でありうる。化合物または結合剤はまた、低分子量により特徴付けられる、化学物質、ポリヌクレオチド、脂質、またはホルモン類似体も含む。他の生体高分子である、被験有機化合物は、約２～約４０アミノ酸を含む、小型のペプチドまたはペプチド様分子（ペプチド模倣体）、および抗体、抗体模倣体、抗体断片、または抗体コンジュゲートなど、約４０～約５００アミノ酸を含む、大型のポリペプチドを含む。
本明細書において使用される、「～を決定すること」、「～を測定すること」、「～について評価すること」、「～を同定すること」、「～をスクリーニングすること」、および「～についてアッセイすること」という用語は、互換的に使用され、定量的決定および定性的決定の両方を含む。本明細書で使用される、「同様」は、「相似」、「類似」、「同等」、「対応する」、および「～様」または「～と似た」と互換的であり、同じであるか、もしくは共通の特徴を有し、かつ／または定量的な形で、同等な結果、すなわち、変動が、最大で２０％、１０％、より好ましくは５％、または、なおより好ましくは１％、またはこれ未満である結果を示すことが意図される。
本明細書で互換的に使用される、「対象」、「個体」、または「患者」という用語は、脊椎動物、特に、診断、治療、または予防が所望される、ヒトおよび他の哺乳動物の両方を含む、任意の哺乳動物など、任意の生物、例えば、齧歯動物、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ、ラマ、ブタ、または非ヒト霊長動物（例えば、サル）などの動物に関する。齧歯動物は、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、またはチンチラでありうる。一実施形態では、対象は、ヒト、ラット、または非ヒト霊長動物である。好ましくは、対象は、ヒトである。一実施形態では、対象は、疾患または障害、特に、本明細書で開示される疾患または障害を伴うか、またはこれを有することが疑われ、本明細書ではまた、「患者」または「対象」とも名指される対象である。しかし、上述の用語は、症状が存在することを含意しないことが理解されるであろう。
「処置」または「～を処置すること」または「～を処置する」という用語は、互換的に使用される場合があり、徴候、症状、障害、状態、または疾患の進行または重症度を、緩徐化するか、中断させるか、停止させるか、コントロールするか、止めるか、軽減するか、阻害するか、または反転させるが、必ずしも、疾患に関連する、全ての徴候、症状、状態、または障害の、完全な消失を伴うわけではない、治療的介入により規定されうる。したがって、治療的処置は、疾病を防止するのではなく、疾病を処置するか、または患者の健康を改善するようにデザインされる。処置はまた、疾患が生じることを防止するようにデザインされ、使用される、投薬または処置に関する、予防的処置も指す場合がある。
本明細書では、本開示に従う、方法、試料、およびバイオマーカー産物について、特定の実施形態、具体的構成のほか、素材、および／または分子が論じられたが、本発明の範囲から逸脱しない限りにおいて、形態および詳細における、多様な変化または改変が施されうることが理解されるものとする。以下の例は、特定の実施形態を、よりよく例示するために提示されるものであり、本出願を限定するものとして考えられるべきではない。本出願は、特許請求の範囲だけにより限定される。
実施例１
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤへの結合について、ＶＨＨ７２と競合しない、中和ＶＨＨの単離
ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－１／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２交差反応性ＶＨＨを得るために、組換え融合前安定化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１および同ＭＥＲＳスパイクタンパク質であらかじめ免疫化されたラマを、その融合前コンフォメーションにおいて安定化された組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（Ｗｒａｐｐら、２０２０、Ｃｅｌｌ、１８１：１４３６～１４４１；Ｗｒａｐｐら、２０２０、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３６７：１２６０～１２６３）で、３回にわたり、加えて免疫化した。免疫化の後、末梢血リンパ球を、ラマから単離し、ＶＨＨ提示ファージミド免疫ライブラリーを構築した。二価頭尾融合ＶＨＨ７２の存在下または非存在下で、固定化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクまたは固定化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤを使用する、異なるパニング戦略（Ｗｒａｐｐら、２０２０、Ｃｅｌｌ、１８１：１４３６～１４４１）を使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク特異的ＶＨＨを選択した。パニングの後で得られた、個別のファージミドクローンから、ペリプラズム抽出物（ＰＥ）を調製し、ＥＬＩＳＡにより、これらの抽出物中のＶＨＨの、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクおよびＲＢＤ－ＳＤ１－Ｆｃへの結合を査定した。被験ＰＥの大部分について、ＶＨＨの、ＲＢＤへの結合を裏付けることができた。注目すべきことに、スパイクタンパク質に結合する、全てのＶＨＨがまた、ＲＢＤ－ＳＤ１－Ｆｃにも結合することは、選択されたスパイク結合性ＶＨＨのいずれもが、ＲＢＤ－ＳＤ１以外の部位では、スパイクに結合しないことを例示する。これは、表１に列挙されるＶＨＨをもたらした。
Figure 2024506020000007
ウイルス回避を克服するか、または結合特異性の幅を広げるための、１つの戦略は、非重複エピトープをターゲティングするか、または単一のＲＢＤへの結合について競合しない、２つのＶＨＨを組み合わせることである。ＲＢＤへの結合について、ＶＨＨ７２と競合しないＶＨＨを同定するために、直接コーティングしたＲＢＤ、またはＥＬＩＳＡプレートのウェルをあらかじめコーティングしたＶＨＨ７２－Ｆｃにより捕捉された、一価ＲＢＤを使用して、ＥＬＩＳＡを実施した。図１Ａは、直接コーティングしたＲＢＤに強力に結合する、少数のＶＨＨだけがまた、ＶＨＨ７２－Ｆｃにより捕捉されたＲＢＤにも結合することを例示する（ＶＨＨ３．ｘについてのＯＤ＞２×対照試料についてのＯＤにより規定される）。ＶＨＨ７２－Ｆｃ捕捉された一価ＲＢＤに、最も強力に結合しえた、５つのＶＨＨ中、４つ（ＶＨＨ３．４２、ＶＨＨ３．９２、ＶＨＨ３．９４、およびＶＨＨ３．１１７）は、高度に類似するアミノ酸配列を有し、アミノ酸配列が、図１Ｂに描示される、同じＶＨＨファミリー（ＶＨＨ３．４２ファミリー）に属し；さらなるファミリーメンバーである、ＶＨＨ３．１８０のアミノ酸配列もまた、図２Ｂに描示される。ＶＨＨ３．４２ファミリーメンバーを含有するＰＥを、ＲＢＤ（ＲＢＤ－ＳＤ１－ｈｕ ｍｏｎｏＦｃ）への結合についても、さらに調べた。図２Ａは、ＶＨＨ３．１１７（ＰＥ＿１１７）およびＶＨＨ３．４２（ＰＥ＿４２）を含有するＰＥ抽出物が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤに強力に結合しうるＶＨＨを含有することを示す。初期ＰＥ－ＥＬＩＳＡスクリーンで、結合が観察されなかった、ＶＨＨ－７２（ＶＨＨ５０）またはＶＨＨ（ＰＥ＿９６）と類縁のＶＨＨを含有する、対照ＰＥ抽出物については、はるかに低度の結合が観察された。ＶＨＨ３．４２ファミリーメンバーが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を中和しうるのかどうかについて調べるために、異なる希釈率の、対応するＰＥを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質を含有する、偽型ＶＳＶ－ｄｅｌＧを使用する中和アッセイにおいて調べた。全てのＶＨＨ３．４２ファミリーメンバーは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１のスパイクタンパク質を含有する、偽型ＶＳＶ－ｄｅｌＧを中和することができた（図２Ｃ）。ＶＨＨ３．１８０を除く、全てのＶＨＨ３．４２ファミリーメンバーは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質を含有する、偽型ＶＳＶ－ｄｅｌＧを中和しえた（図２Ｂ）が；ＶＨＨ３．１８０が例外であることは、ペリプラズム抽出物（ＰＥ）について調べたという事実に起因しえた。ここでもまた、初期ＰＥ－ＥＬＩＳＡスクリーンで、結合が観察されなかった、ＶＨＨ５０またはＶＨＨ（ＰＥ３＿１２）を、対照として組み入れたほか、緩衝液（ＰＢＳ）だけも、対照として組み入れた。
実施例２
選択されたＶＨＨの産生および精製
ＶＨＨ３．４２およびＶＨＨ３．１１７を、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ内の産生について選択し、次いで、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ用の発現ベクターに再クローニングした。産生されたＶＨＨは、Ｃ末端ＧＳリンカーに続いて、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーによる精製のために使用されるＨＡ－Ｈｉｓタグ（タグは、インフレームの終止コドンを指し示した）を含有する。精製ＶＨＨを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびクーマシー染色により調べた（図３Ａ）。ＶＨＨ３．４２およびＶＨＨ３．１１７は、１４．６ｋＤａ近傍の、予測分子量に泳動した。ＶＨＨ３．９２は、（バイオパニングによるＰＥ抽出物の調製のために使用される、ＴＧ１細胞とは対照的に）ＶＨＨ－ＨＡ－ＨＩＳタグと、ｐ３ファージタンパク質との間におけるインフレームのタグである、アンバー終止コドンを抑制しない、ＷＫ６ Ｅ．ｃｏｌｉ株内で産生された。この目的で、選択されたＶＨＨ３．９３ファージミドクローン内に存在する、ＶＨＨコードｐＭＥＣベクターを、精製し、ＷＫ６細胞を形質転換するのに使用した。産生の後、ＶＨＨを、ペリプラズムから抽出し、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析は、精製ＶＨＨ３．９２（Ｃ末端のＨＡタグおよびＨＩＳタグを含有する）が、１５．５ｋＤａの予測分子量に泳動することを例示した（図３Ｂ）。
実施例３
ＶＨＨ３．４２およびＶＨＨ３．１１７は、ＶＨＨ７２エピトープから隔たった部位において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１の、ＲＢＤおよびスパイクタンパク質に結合する
精製ＶＨＨ３．４２、ＶＨＨ３．９２、およびＶＨＨ３．１１７の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤおよびスパイクタンパク質、ならびにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１スパイクタンパク質への結合は、ＥＬＩＳＡにより調べられる通りであった。図４Ａおよび４Ｂは、ＶＨＨ３．４２およびＶＨＨ３．１１７が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤおよびスパイクタンパク質に、ＶＨＨ７２（ＶＨＨ７２＿ｈ１＿Ｓ５６Ａ；Ｓｃｈｅｐｅｎｓら、２０２１、ＢｉｏＲｘｉｖｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２１．０３．０８．４３３４４９における、ｈｕｍＶＨＨ＿Ｓ５６Ａ）より高度のアフィニティーで結合することを例示する。加えて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のいずれについても、ＶＨＨ３．１１７は、ＶＨＨ３．４２より、わずかに効率的に結合する（図４Ａおよび４Ｂ）。ＶＨＨ３．４２およびＶＨＨ３．１１７のいずれもまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１スパイクに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質について測定された、同等のアフィニティーで結合する（図４Ｃ）。予測される通り、ＶＨＨ７２＿ｈ１＿Ｓ５６Ａ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１による免疫化の後で単離された）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１スパイクに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクより、わずかに高度のアフィニティーで結合する（Ｗｒａｐｐら、２０２０、Ｃｅｌｌ、１８１：１４３６～１４４１）。
ＶＨＨの、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤへの結合はまた、一価ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ－ヒトＦｃを、抗ヒトＦｃバイオセンサー（ＡＭＣ ＦｏｒｔｅＢｉｏ）上に、３０ｎＭで固定化した、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）によっても調べた。これは、ＶＨＨ３．４２およびＶＨＨ３．１１７が、ＲＢＤに、ＶＨＨ７２より、大幅に緩徐なオフ速度で結合することを明らかにした（図５Ａ；各ＶＨＨを、２００ｎＭとする）。ＶＨＨ３．１１７のオフ速度が、ＶＨＨ３．４２のオフ速度より、わずかに緩徐であったことは、ＥＬＩＳＡデータと符合する。ＶＨＨ３．１１７の、１００～３．１３ｎＭにわたる、２倍の希釈系列、およびＶＨＨ３．８９の、５０～３．１３ｎＭにわたる、２倍の希釈系列について、同じＢＬＩ設定を使用して、結合反応速度を決定した。図５Ｂおよび５Ｃは、ＶＨＨ３．１１７およびＶＨＨ３．８９が、単量体ＲＢＤに、それぞれ、４．４５×１０－１０Ｍおよび２．９２×１０－１０ＭのＫＤで結合することを例示する。
ＶＨＨ３．４２およびＶＨＨ３．１１７が、ＲＢＤへの結合について、ＶＨＨ７２と競合するのかどうかについて調べるために、単量体ＲＢＤ（ＲＢＤ－ＳＤ１－Ａｖｉ（ビオチニル化Ａｖｉタグ）を、ＶＨＨ７２－Ｓ５６Ａ－Ｆｃ（Ｄ７２－２３＝ｈｕｍＶＨＨ＿Ｓ５６Ａ／ＬＡＬＡＰＧ－Ｆｃ；Ｓｃｈｅｐｅｎｓら、２０２１、ＢｉｏＲｘｉｖ ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２１．０３．０８．４３３４４９）；これは、ＶＨＨ７２が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ ＲＢＤおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤに対する、そのアフィニティーを増大させる、ＣＤＲ２内のＳ５６Ａ置換を有する、ＶＨＨ７２－ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ融合体である）でコーティングされた、ＥＬＩＳＡプレート上に捕捉した（図６Ａ）。ＰＥが、ＲＢＤへの結合について、ＶＨＨ７２との競合を提示した、ＶＨＨ７２およびいくつかのＶＨＨを、対照として組み入れた。ＶＨＨ７２および対照ＶＨＨ（図示しない）と対照的に、ＶＨＨ３．４２およびＶＨＨ３．１１７は、ＶＨＨ７２－Ｓ５６Ａ－Ｆｃにより固定化された、単量体ＲＢＤに結合することが可能であった（図６Ａ）。ＶＨＨ７２－Ｓ５６Ａ－Ｆｃを、抗ヒトＦｃバイオセンサー（ＡＨＣ、ＦｏｒｔｅＢｉｏ）上に固定化し、ＲＢＤ－ｍｕＦｃの、固定化ＶＨＨ７２－Ｓ５６Ａ－Ｆｃへの結合を可能とするように、ＲＢＤ－ｍｕＦｃで前処理した、ＢＬＩにより、同様の競合実験を実施した。その後、このバイオセンサーを、１μＭのＶＨＨ７２－Ｓ５６Ａ－Ｆｃ、ＶＨＨ３．４２、ＶＨＨ３．１１７、または緩衝液だけを含有する溶液へと適用した。予測される通り、ＶＨＨ７２－ｈｕＦｃ／ＲＢＤ－ｍｕＦｃでプローブ処理されたバイオセンサーの、ＶＨＨ７２含有溶液への適用が、ＢＬＩ応答シグナルを低減したことは、ＲＢＤ－Ｆｃの、バイオセンサーからの放出を指し示す。これは、ＶＨＨ７２が、ＲＢＤへの結合について、ＶＨＨ７２－Ｓ５６Ａ－－Ｆｃと競合する（これを置換する）ことを確認する。ＶＨＨ７２－ｈｕＦｃ／ＲＢＤ－ｍｕＦｃでプローブ処理されたバイオセンサーの、ＶＨＨ３．４２またはＶＨＨ３．１１７を含有する溶液への適用が、ＢＬＩ応答シグナルの、明らかな増強を結果としてもたらしたことは、これと好対照をなす（図６Ｂ）。これは、ＶＨＨ３．１１７およびＶＨＨ３．４２が、ＶＨＨ７２エピトープから隔たった部位において、ＲＢＤに結合しうることを例示する。
実施例４
ＶＨＨ３．４２、ＶＨＨ３．１１７は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１を中和する
精製されたＶＨＨ３．４２、ＶＨＨ３．１１７、およびＶＨＨ３．９２の中和活性について調べるために、本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１のスパイクタンパク質を含有する、偽型ＶＳＶ－ｄｅｌＧを使用して、中和アッセイを実施した。図７Ａおよび７Ｂ、ならびに表２は、ＶＨＨ３．４２、ＶＨＨ３．１１７、およびＶＨＨ３．９２が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質を含有する、偽型ＶＳＶ－ｄｅｌＧを中和することが可能であり、これが、ＶＨＨ７２＿ｈ１＿Ｓ５６Ａより、約６倍効率的でありうることを例示する。本発明者らはまた、ＶＨＨ３．４２およびＶＨＨ３．１１７がまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１も中和しうるのかどうかについても調べた。図８および表２は、ＶＨＨ３．４２およびＶＨＨ３．１１７のいずれもが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１スパイクにより偽型化されたＶＳＶ－ｄｅｌＧを、強力に中和しうることを例示する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のいずれについても、ＶＨＨ３．１１７の中和活性は、ＶＨＨ３．４２より、わずかに高度であった。
Figure 2024506020000008
実施例５
ＶＨＨ３．４２、ＶＨＨ３．１１７、およびＶＨ３．９２は、ＲＢＤの、その受容体である、ＡＣＥ２への結合を妨げない
報告されている大半のモノクローナル抗体およびＶＨＨは、ＲＢＤの、その受容体である、ＡＣＥ２への結合を防止することにより中和する。ＶＨＨ７２は、そのＲＢＭ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｔｉｆ）の外側で、ＲＢＤに結合するが、立体障害により、ＲＢＤが、ＡＣＥ２に結合することを妨げる（Ｗｒａｐｐら、２０２０、Ｃｅｌｌ、１８１：１４３６～１４４１）。本明細書で同定される中和ＶＨＨが、ＲＢＤの、ＡＣＥ２への結合を阻害することが可能であるのかどうかについて調べるために、本発明者らは、ＡｌｐｈａＬＩＳＡにより、これらのＶＨＨの、組換えＲＢＤの、組換えＡＣＥ２タンパク質との相互作用に対する影響について調べた。ＶＨＨの系列希釈液（最終濃度を、９０ｎＭ～０．０４ｎＭの間の範囲とする）を、アッセイ緩衝液（０．５％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳ）中で作製し、白色低結合性３８４ウェル８８マイクロ滴定プレート（平底、Ｇｒｅｉｎｅｒ；型番：７８１９０４）内で、Ａｖｉタグ（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；型番：ＳＰＤ－Ｃ８２Ｅ９）（最終濃度：１ｎＭ）を介してビオチニル化された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤと混合した。組換えヒトＡＣＥ－２－Ｆｃ（最終濃度０．２ｎＭ）を、混合物へと添加した。室温で、１時間にわたるインキュベーションの後、ドナービーズおよびアクセプタービーズを、０．０２５ｍＬの最終容量中に、各々、２０μｇ／ｍＬの最終濃度まで添加した。ＲＢＤを、ストレプトアビジンコーティングＡｌｐｈａ Ｄｏｎｏｒビーズ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ；型番：６７６０００２）上に捕捉した。ヒトＡＣＥ－２－ｍＦｃタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ；型番：１０１０８－Ｈ０５Ｈ）を、抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的）アクセプタービーズ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ；型番：ＡＬ１０５Ｃ）上に捕捉した。混合されたビーズを、暗所内、室温で、さらに１時間にわたりインキュベートした。ビーズ間の相互作用について、Ｅｎｓｉｇｈｔ測定器上、６８０ｎｍにおける照射、および６１５ｎｍにおける読取りの後で評価した。ＶＨＨ７２および類縁のＶＨＨ３．１１５と対照的に、本明細書で同定される、ＶＨＨ３．４２、ＶＨＨ３．１１７、およびＶＨＨ３．９２のいずれも、それらのそれぞれの中和ＩＣ５０を十分に上回る用量（５４．８ｎＭ、１３．７ｎＭ、および１３．５５ｎＭ）においてもなお、ＲＢＤ／ＡＣＥ２相互作用に干渉しえなかった（図１０）。
本明細書で同定されるＶＨＨがまた、細胞表面で発現されるＡＣＥ２への、ＲＢＤの結合を阻害することも不可能であるのかどうかについて調べるために、本発明者らは、マウスＦｃへと融合された二価ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤの、Ｖｅｒｏ細胞への結合を決定した（図９）。図１０Ａおよび１０Ｂは、ＶＨＨ３．４２、ＶＨＨ３．１１７、およびＶＨＨ３．９２が、それらのそれぞれの中和ＩＣ５０を十分に上回る濃度においてもなお、二価ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤの、ＶｅｒｏＥ６細胞との相互作用を妨げえなかったことを例示する（表２）。これは、これらのＶＨＨが、標的細胞への、ＲＢＤ媒介ウイルス接合を妨げない、代替的機構を介して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ感染を中和することを指し示す。
次に、本発明者らは、ＶＨＨ３．４２ファミリーのＶＨＨがまた、組換えＡＣＥ２の細胞表面発現ＲＢＤへの結合にも干渉できないのかどうかについて調べた。したがって、本発明者らは、ＶＨＨ７２またはＶＨＨ３．１１７が、マウスＦｃへと融合された組換えＡＣＥ２の、酵母細胞の表面において発現されたＲＢＤへの結合を防止しうるのかどうかについて調べた（図１０Ｃ）。予測される通り、ＶＨＨ７２（ＶＨＨ７２＿ｈ１＿Ｓ５６Ａ）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤを、それらの細胞表面において発現する酵母細胞への、組換えＡＣＥ２－Ｆｃの結合を阻害することができた。これに対し、ＶＨＨ３．１１７は、この阻害ができなかった。
まとめると、これらのデータは、本明細書で同定されるＶＨＨが、ＡＣＥ２、すなわち、標的細胞の表面において発現されたカノニカルのサルベコウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２など）受容体への、ＲＢＤの結合を妨げられないことを一貫して裏付ける。これは、これらのＶＨＨが、代替的機構を介して、サルベコウイルス感染を中和することを指し示す。
実施例６
ＶＨＨ３．４２ファミリーメンバーは、ＶＨＨ７２、ＣＢ６、ＣＲ３０２２、およびＳ３０９のエピトープから隔たったエピトープに結合する
本明細書で同定されるＶＨＨファミリーが、ＲＢＤへの結合について、ＶＨＨ７２またはＡＣＥ２と競合しないことの観察は、これらのＶＨＨが、ＶＨＨ７２およびＲＢＭ（ＲＢＤ内の（サブ）ドメインである、ＲＢＭ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｔｉｆ））から隔たったエピトープに結合することを例示する。これらのＶＨＨのエピトープを、さらに狭めるために、本発明者らは、ＥＬＩＳＡプレートのウェルをコーティングする、多様な抗体により固定化された、一価ＲＢＤ（ＲＢＤ－ＳＤ１－ｍｏｎｏｈｕＦｃ）への、ＶＨＨ７２およびＶＨＨ３．１１７の結合について調べた。図１１Ａおよび１６Ａは、Ｓ３０９（ＶＨＨ７２の接触領域の反対側の部位において、ＲＢＤコアに結合する）、またはＣＲ３０２２（ＶＨＨ７２のエピトープと、大部分において重複するが、ＲＢＤの下側へと伸びるエピトープに結合する）の結合が、ＶＨＨ３．１１７の結合（Ｐｉｎｔｏら、２０２０、Ｎａｔｕｒｅ、５８３：２９０～２９５；Ｙｕａｎら、２０２０、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３６９：１１１９～１１２３）に干渉しないことを例示する。予測される通り、ＶＨＨ７２の結合は、ＣＲ３０２２により妨げられた。別個の実験では、本発明者らは、コーティングされた、ＣＢ６（ＲＢＭに結合するヒトモノクローナル抗体）、Ｓ３０９、ＶＨＨ７２－Ｆｃ、またはＶＨＨ３．１１７（Ｓｈｉら、２０２０、Ｎａｔｕｒｅ、５８４：１２０～１２４）により、ＥＬＩＳＡプレートのウェル上に固定化された一価ＲＢＤへの、ＶＨＨ３．９２の結合について調べた。ＶＨＨ３．９２の、ＲＢＤへの結合は、Ｓ３０９およびＶＨＨ７２－Ｆｃの影響を受けなかったが、ＶＨＨ３．１１７により妨げられた（図１１Ｂ）。加えて、ＶＨＨ３．９２の、ＲＢＤへの結合は、ＣＢ６の影響も受けなかった（図１１Ｂ）。ＶＨＨ３．１１７と、類縁のＶＨＨとが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に交差結合し、これらを交差中和する能力を考慮に入れると、これらのデータは、ＲＢＤ上の少数の部位だけが、これらのＶＨＨにより認識されることを強く指し示す。とりわけ、ＲＢＤの、ＶＨＨ７２およびＳ３０９への結合性部位と反対側の側面は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との間で保存され、上記で記載されたモノクローナル抗体によりふさがれない。したがって、ＶＨＨ３．１１７、および類縁のＶＨＨの結合性部位は、この領域内に位置する可能性が最も高い（図１２を参照されたい）。
本明細書で同定されるＶＨＨファミリーのエピトープを、さらに画定し、他のサルベコウイルスＲＢＤとの、それらの交差反応に対する潜在的可能性を規定するために、本発明者らは、多様なサルベコウイルスのＲＢＤへの、それらの結合について調べた。この目的で、これらのＶＨＨの、クレード１．Ａ（ＷＩＶ１）、クレード１．Ｂ（ＧＤ－ｐａｎｇｏｌｉｎ）、クレード２（ＨＫＵ３およびＺＣＸ２１）、およびクレード３（ＢＭ４８－３１）の代表的サルベコウイルス（図１３Ａ）のＲＢＤを発現する酵母細胞への結合について、フローサイトメトリーで調べた。ＧＢＰ（ＧＦＰ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）である、対照ＶＨＨを除く、全ての被験ＶＨＨ（１０μｇ／ｍｌにおける）が、それらの表面において、クレード１．Ａ（ＷＩＶ１）およびクレード１．Ｂ（ＧＤ－ｐａｎｇｏｌｉｎ）のＲＢＤを発現する酵母細胞に結合することは、ＥＬＩＳＡにおける、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１のスパイクタンパク質への結合と符合する（図１３Ｂ）。加えて、ＶＨＨ３．１１７、ＶＨＨ３．４２、およびＶＨＨ３．９２は、クレード２の２つのブランチを表す、ＨＫＵ３およびＺＸＣ２１のＲＢＤに結合することが可能である。さらに、ＶＨＨ３．４２、ＶＨＨ３．９２、および、これらより低度においてであるが、ＶＨＨ３．１１７はまた、クレード３のサルベコウイルスである、ＢＭ４８－３１のＲＢＤにも結合する（図１３Ｂ）。別個の実験では、より広範にわたるクレード１、２、および３のサルベコウイルスへの、ＶＨＨ３．１１７の結合について調べた。図１４Ａは、ＶＨＨ３．１１７が、全ての被験ＲＢＤ変異体への結合が可能であり、ＶＨＨ７２と比較して、より多くのＲＢＤ変異体に結合することを例示する（図１４Ｂ）。これらの観察は、ＶＨＨ３．１１７が、被験ＲＢＤ変異体の間で、高度に保存されたＲＢＤ領域をターゲティングするという仮説と符合する。
実施例７
ＤＭＳ（ｄｅｅｐ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ）による、ＲＢＤ上の、ＶＨＨ３．１１７の結合性部位の決定
ＲＢＤ上の、本明細書で同定されるＶＨＨの結合性部位を決定するために、本発明者らは、ＤＭＳ（ｄｅｅｐ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ）を実施した。類縁のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ ＲＢＤと複合体化した結晶構造が入手可能である、ＶＨＨ７２（ＶＨＨ７２＿ｈ１＿Ｓ５６Ａ）を、参照として組み入れた（Ｗｒａｐｐら、２０２０、Ｃｅｌｌ、１８１：１４３６～１４４１；Ｓｃｈｅｐｅｎｓら、ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２１．０３．０８．４３３４４９）。本発明者らは、Ｓｔａｒｒら、２０２０（Ｃｅｌｌ、１８２：１２９５～１３１０）により記載される通りに開発された、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞により、独立に作出され、各々が、固有のバーコードおよびｍｙｃタグで標識された、特定の単一のＲＢＤ変異体を発現する、２つのライブラリーからなる、酵母ディスプレイプラットフォームを使用した。このように、この手法は、ＤＭＳ（ｄｅｅｐ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ）が、所与の表現型（本発明者らの場合では、ＶＨＨ３．１１７への結合）についての、ＲＢＤ内の、任意のアミノ酸残基の関与をピンポイントで示すことを可能とする。ＲＢＤ変異体の２つのライブラリーは、各位置が、他の全てのアミノ酸へと置換された、ＲＢＤ変異体の包括的コレクションを作出するように、ＰＣＲベースの突然変異誘発により作出した。ＲＢＤ変異体は、平均で、２．７のアミノ酸置換を含有する。機能的ＲＢＤ変異体だけを保持するために、ＦＡＣＳにより、酵母ＲＢＤディスプレイライブラリーを、組換えＡＣＥ２に結合する、それらの能力についてあらかじめ分取した（データは示さない）。被験ＶＨＨに対するアフィニティーが低減されたＲＢＤ変異体を発現する酵母細胞を、高感度で同定するために、本発明者らは、各ＶＨＨについて、結合が、飽和をわずかに下回る濃度を規定した。まず、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤを発現する酵母細胞を、ＶＨＨの希釈系列で染色することにより、被験ＶＨＨの各々について、この濃度を決定した。この手法を使用して、本発明者らは、ＶＨＨ７２＿ｈ１＿Ｓ５６Ａ（ＶＨＨ７２）についての、４００ｎｇ／ｍｌ、およびＶＨＨ３．１１７についての、１００ｎｇ／ｍｌを選択した。「飽和をわずかに下回る」同等濃度に到達する濃度の、この差違は、ＶＨＨ３．１１７の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤに対する、ＶＨＨ７２と比較した、高度のアフィニティーを反映する。被験ＶＨＨに対するアフィニティーが低減されたＲＢＤ変異体を発現する酵母細胞を同定するために、あらかじめ分取されたライブラリーを、ＶＨＨおよび抗ｍｙｃタグ抗体で染色した。低度のＶＨＨ染色を提示する、ＲＢＤ発現細胞を分取し、増殖させ、それらのそれぞれのバーコードについての、次世代シーケンシングのために使用した。ＶＨＨへの結合に著明に関与するＲＢＤアミノ酸を同定するために、分取集団内でエンリッチされた置換を、Ｇｒｅａｎｅｙら、２０２１（Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ、２９：４４～５７）により記載される通りに決定した。
図１５Ａおよび１６Ｃは、２つの被験ＶＨＨについて、置換が、ＶＨＨへの結合の低減を結果としてもたらす、ＲＢＤ内の位置についての全体的なプロファイルを示す。ＶＨＨ３．１１７と、ＶＨＨ７２＿ｈ１＿Ｓ５６Ａとは、極めて顕著に異なるＲＢＤへの結合プロファイルを有することが明らかである。Ｇｒｅａｎｅｙら、２０２１（前出）により確立された、回避プロファイル解析は、Ａ３６３、Ｙ３６５、Ｓ３６６ Ｙ３６９、Ｎ３７０、Ｓ３７１、Ｆ３７４、Ｓ３７５、Ｔ３７６、Ｋ３７８、Ｐ３８４、およびＹ５０８を、ＶＨＨ７２＿ｈ１＿Ｓ５６Ａへの結合に関与する（２つのライブラリーの平均に基づく）アミノ酸位置として同定した。ＶＨＨ３．１１７について、回避プロファイル解析は、Ｃ３３６、Ｒ３５７、Ｙ３６５、Ｃ３９１、Ｆ３９２、Ｔ３９３、Ｎ３９４、Ｖ３９５、Ｙ３９６、Ｋ４６２、Ｆ４６４、Ｅ４６５、Ｒ４６６、Ｓ５１４、Ｅ５１６、およびＬ５１８を、ＲＢＤへの結合について重要なものとして同定した（図１５Ａおよび１５Ｂ）。Ｃ３３６、Ｙ３６５、Ｃ３９１、およびＦ３９２を除き、これらのアミノ酸は全て、ＲＢＤに対して側面に位置し、上記で記載された実験に基づき、ＶＨＨ３．１１７結合性部位を表す可能性が高い、クレフト近傍に群発する。この結合性部位はまた、ＶＨＨが、突出するタンパク質表面ではなく、クレフトに結合する、全般的優先性とも一致する。Ｃ３３６およびＣ３９１が、それぞれ、Ｃ３６１およびＣ５２５と共に、ＲＢＤの全体的安定性に対して、極めて重要である可能性が高い、ジスルフィド架橋を形成することは、なぜ、これらの残基が、ＤＭＳ（ｄｅｅｐ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ）により同定されたのかを説明する（図１５Ｂ）。Ｙ３６５およびＦ３９２は、ＶＨＨ３．１１７への結合表面である可能性が高い表面の近傍に位置し、ＲＢＤコアの内側へと配向している（図１５Ｂ）。よって、これらの位置における突然変異は、ＶＨＨ３．１１７の結合に対して、アロステリック効果を及ぼしうる。ＤＭＳ（ｄｅｅｐ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ）は、Ｙ３６５がまた、ＶＨＨ７２の結合にも重要であることを明らかにした。Ｙ３６５は、ＲＢＤコア内の、ＶＨＨ３．１１７結合性領域の反対側の部位に位置する。同様に、Ｙ３６５は、ＶＨＨ７２により認識される、ＲＢＤ表面に位置せず、ＶＨＨ３．１１７結合性領域と、ＶＨＨ７２結合性領域との間の、内側のＲＢＤコアへと配向している。これは、Ｙ３６５が、ＲＢＤコアの全体的コンフォメーションに重要であることを指し示す。重要なことは、同定されたＶＨＨ３．１１７結合性部位が、ＶＨＨ３．１１７が、ＲＢＤへの結合について、ＡＣＥ２、Ｓ３０９、ＶＨＨ７２、ＣＲ３０２２、およびＣＢ６と競合しないという、本発明者らの知見（図１６Ａ中の、Ｓ３０９およびＣＲ３０２２について例示される）と一致し、クレード１、クレー２、およびクレード３のサルベコウイルス（図１６Ｂ中に例示される、アミノ酸の保存）のＲＢＤに結合する、その能力と一致し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とに対する、その交差中和活性と一致することである。ゲノム配列が、ＧＩＳＡＩＤ（Ｇｌｏｂａｌ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ ｏｎ Ｓｈａｒｉｎｇ Ａｖｉａｎ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｄａｔａ）へと提出された、循環ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス間の、ＲＢＤの表面における、アミノ酸変動についての解析は、ＤＭＳ（ｄｅｅｐ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ）により同定されるＶＨＨ３．１１７結合性領域が、これらの変動の、ＲＢＤ表面への投影により例示される通り、高度に保存されていることを明らかにした（図１６Ｃ）。
本明細書で同定されるＶＨＨの、ＲＢＤへの結合は、標的細胞の表面におけるＡＣＥ２への、ＲＢＤの結合に干渉しない。結果として、これらのＶＨＨは、例えば、Ｓ３０９およびｍＮｂ６－ｔｒｉについて記載されている（Ｐｉｎｔｏら、２０２０、Ｎａｔｕｒｅ、５８３：２９０～２９５；Ｓｃｈｏｏｆら、２０２０、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３７０：１４７３～１４７９）通り、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクを、その不活性の閉鎖型コンフォメーションへとロックすることにより、代替的機構を介して、感染を防止する。ＶＨＨ３．１１７と類縁のＶＨＨが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１を中和しうる機構に対する洞察を得るために、本発明者らは、１つのＲＢＤが、アップコンフォメーションにある、スパイク三量体（ｔｒｉｍｅｒ）上のＶＨＨ３．１１７結合性部位を表示した。これは、ＶＨＨ３．１１７部位が、ダウンコンフォメーションにあるＲＢＤ上で、ほぼ完全にふさがれていることを明らかにする。さらに、アップコンフォメーションにあるＲＢＤ上では、ＶＨＨ３．１１７結合性部位は、第２のスパイクプロトマーのＮ末端ドメインにより、大部分がＲＢＤのダウンコンフォメーションされている（図１６Ｄ）。これは、ＶＨＨ３．１１７、および類縁のＶＨＨが、ＲＢＤの、そのダウンコンフォメーションへのロックすることを伴うのではなく、スパイクのコンフォメーションおよび／または機能の全体的な干渉による機構を介して中和することを裏付ける。
実施例８
ＡＣＥ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＲＢＤ、およびｍＡｂ５２の理論的相互作用
Ｒｕｊａｓら、２０２０（Ｂｉｏｒｘｉｖ、２０２０．１０．１５．３４１６３６ｖ１）の図４Ａから、ｍＡｂ５２は、ＡＣＥ－２と、ＲＢＤとの間の結合に干渉すると考えられる。この図は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤへの結合についての、一方において、抗体４６および５２の間（「部位１」を規定する）における交差競合と、他方において、抗体２９８、８２、３２４、２３６、および８０の間（「部位２」を規定する）における交差競合とを指し示す。この同じ図は、「部位１」結合性抗体ならびに「部位２」結合性抗体の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤへの結合についての、ＡＣＥ－２との競合をさらに指し示す。同様の結論は、Ｒｕｊａｓら、２０２０の図Ｓ５からも引き出すことができる。
さらに、抗体５２の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＲＢＤおよび／またはＡＣＥ－２との接触点（Ｒｕｊａｓら、２０２０、Ｂｉｏｒｘｉｖ、２０２０．１０．１５．３４１６３６ｖ１）を、理論的に決定するために、入手可能な構造を、コンピュータにより三次元モデル化した。結果として得られる理論的相互作用を、図１７に指し示す。ここから、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１のＲＢＤ内では、ｍＡｂ５２への結合に重要である、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ ＲＢＤ内のアミノ酸７つのうちの４つが異なるので、ｍＡｂ５２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１のＲＢＤに結合する／これを中和する可能性が低いと考えられる。最後に、ｍＡｂ５２は、ＲＢＤアミノ酸４８４（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の南アフリカ株、ブラジル株、および英国株における既知の変異）および４５２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の新興カリフォルニア株において既知の変異）に結合すると考えられる。ｍＡｂ５２の、ＲＢＤアミノ酸４８４および４５２との相互作用は、Ｒｕｊａｓら、２０２０（前出）により確認された。
実施例９
ＶＨＨ－１１７およびｍＡｂ５２のエピトープ
実施例７で概括された通り、ＶＨＨ３．１１７エピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤアミノ酸Ａｒｇ３５７、Ｔｈｒ３９３、Ａｓｎ３９４、Ｖａｌ３９５、Ｔｙｒ３９６、Ｌｙｓ４６２、Ｐｈｅ４６４、Ｇｌｕ４６５、Ａｒｇ４６６、Ｓｅｒ５１４、Ｇｌｕ５１６、および／またはＬｅｕ５１８（Ｃｙｓ３３６、Ｔｙｒ３６５、Ｃｙｓ３９１、Ｐｈｅ３９２は、ＲＢＤを、ＶＨＨ－１１７により認識されるコンフォメーションに保つのに重要である）のうちの１つまたは複数を含む。全体として、ＶＨＨ３．１１７は、新興ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株（南アフリカ／ブラジル株：Ｌｙｓ４１７、Ｇｌｕ４８４、Ａｓｎ５０１における変異；カリフォルニア株：Ｌｅｕ４５２における変異；英国株：Ｇｌｕ４８４における変異）において変異しやすいことが公知である、ＲＢＤアミノ酸に結合しない。これは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤアミノ酸Ａｒｇ３４６、Ｔｙｒ３５１、Ａｌａ３５２、Ａｓｎ３５４、Ａｒｇ３５５、Ｌｙｓ３５６、Ａｒｇ３５７、Ｔｙｒ４４９、Ａｓｎ４５０、Ｌｅｕ４５２、Ｌｙｓ４６２、Ｇｌｕ４６５、Ａｒｇ４６６、Ａｓｐ４６７、Ｉｌｅ４６８、Ｓｅｒ４６９、Ｔｈｒ４７０、Ｇｌｕ４７１、Ｉｌｅ４７２、Ａｓｎ４８１、Ｇｌｙ４８２、Ｖａｌ４８３、Ｇｌｕ４８４、Ｐｈｅ４９０、Ｌｅｕ４９２、および／またはＧｌｎ４９３（Ｒｕｊａｓら、２０２０、Ｂｉｏｒｘｉｖ、２０２０．１０．１５．３４１６３６ｖ１）のうちの１つまたは複数を含むｍＡｂ５２エピトープと対照的である。いずれのリストからも、ＶＨＨ３．１１７エピトープと、ｍＡｂ５２エピトープとは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤアミノ酸Ｌｙｓ４６２、Ｇｌｕ４６５、および／またはＡｒｇ４６６のうちの１つまたは複数だけにおいて、潜在的に重複すると考えられる。したがって、ＶＨＨ３．１１７のエピトープは、位置（限定的な潜在的重複）、および潜在的機能（ＶＨＨ－１１７が、上記で列挙されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株を中和しうる可能性が高いのに対し、ｍＡｂ５２については、疑問の余地があり；ＶＨＨ３．１１７が、ＡＣＥ２への結合を遮断することが可能ではないのに対し、ｍＡｂ５２は、これが可能である）のいずれにおいても、ｍＡｂ５２のエピトープと、実質的に異なる。
実施例１０
ＶＨＨ－１１７、Ｎｂ３４、Ｎｂ９５、Ｎｂ１０５、Ｎｂ１７、およびＮｂ３６のエピトープ、およびスパイクタンパク質への結合
Ｘｉａｎｇら、２０２０（Ｓｃｉｅｎｃｅ、３７０：１４７９～１４８４）は、ＲＢＤへの結合について、ＡＣＥ－２と競合せず、ＲＢＤのうちの、２つまたは３つが、アップコンフォメーション（Ｎａｎｏｂｏｄｙ ３４またはＮｂ３４により表される、エピトープＩＩＩ；およびＮａｎｏｂｏｄｙ ９５またはＮｂ９５により表される、エピトープＩＶ）にある場合に限り、三量体スパイク（Ｓ）タンパク質と結合することが可能である、２つの群について開示している。しかし、その後、Ｎｂ３４およびＮｂ９５のほか、さらなるメンバーである、Ｎｂ１０５は、ＡＣＥ２への結合を、ｎＭ単位の低濃度で遮断することが可能であり、Ｎｂ９５は、ＲＢＤ突然変異体である、Ｅ４８４Ｋ、Ｙ４５３Ｆ、およびＮ４３９Ｋ（ＶＨＨ３．１７エピトープの部分ではない残基）への、その結合を、大部分において喪失することが報告された（Ｓｕｎら、２０２１、ＢｉｏＲｘｉｖ、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２１．０３．０９．４３４５９２）。本明細書の図１８に示される通り、Ｘｉａｎｇら、２０２０の補足図１２中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤの三次元構造内に描示された、Ｎｂ３４およびＮｂ９５のエピトープの位置を再掲し、同様の三次元構造上のＶＨＨ３．１１７のエピトープ位置と比較した。この比較は、Ｎｂ３４エピトープと、ＶＨＨ３．１１７エピトープとの間には、重複が存在するが、Ｎｂ９５と、ＶＨＨ３．１１７との間では、これらの重複が、部分的であるのみであることを明らかにする。これは、Ｎｂ３４およびＮｂ９５が、Ｓタンパク質に結合するために、ＲＢＤのうちの、２つまたは３つが、アップコンフォメーションにあることを要求する（Ｘｉａｎｇら、２０２０）のに対し、ＶＨＨ３．１１７の、Ｓタンパク質への結合は、ＲＢＤのうちの１つまたは複数が、アップコンフォメーションにある場合であっても、Ｎ末端ドメイン（複数可）により妨げられるという事実により、さらに裏書きされる。したがって、ＶＨＨ３．１１７と、ＲＢＤまたはスパイクタンパク質との間の正確な相互作用は、未だ完全には理解されていないが、それにもかかわらず、ＳＡＲＳウイルスの中和を結果としてもたらす。
Ｎｂ１７およびＮｂ３６の一部の特徴は、Ｓｕｎら、２０２１（ＢｉｏＲｘｉｖ ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２１．０３．０９．４３４５９２）により決定されている。ＶＨＨ３．１１７と対照的に、ｎｂ１７は、３つのＲＢＤ全てが、アップコンフォメーションにある、三量体ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に結合する。Ｎｂ１７のエピトープと、Ｎｂ３６のエピトープとは、部分的に重複することが報告されている。Ｎｂ１７について、エピトープを形成することが報告された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤアミノ酸（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質と比べた番号付け）は、アミノ酸３４５～３５６、４４８～４５５、４６６～４７２、および４８２～４８４であり、アミノ酸４６８および４７０は、極めて重要であり；Ｎｂ３６について、これらは、アミノ酸３５３～３６０および４６４～４６９である。ＶＨＨ３．１１７は、これらのＮｂのうちのいずれかのエピトープと、部分的に重複するだけであり、これらのｎｂのうちのいずれも、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤアミノ酸３９３～３９６、５１４、５１６、および５１８に接触しない。
実施例１１
ＶＨＨ－１１７、抗体ｎ３０８８／ｎ３１３０、およびｎ３０８６／ｎ３１１３
Ｗｕら、２０２０（Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ、２７：８９１～８９８）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質への結合について、ＡＣＥ－２と競合しない、Ｄ群抗体ｎ３０８８およびｎ３１３０、ならびにＥ群抗体ｎ３０８６およびｎ３１１３について開示する。いずれの抗体群も、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽型ウイルス感染の中和において、中程度に強力であるにとどまり、報告されたＩＣ５０値は、高値側において、ｎ３０８８について、３．３ｍｇ／ｍＬ；ｎ３１３０について、３．７ｍｇ／ｍＬ；ｎ３０８６について、２６．６ｍｇ／ｍＬ；およびｎ３１１３について、１８．９ｍｇ／ｍＬである。本明細書では、異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽型ウイルス感染中和アッセイが使用されたが、ＶＨＨ３．１１７、ＶＨＨ３．４２、およびＶＨＨ３．９２の全ては、１μｇ／ｍＬを下回るＩＣ５０値で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を中和する。
ＶＨＨ３．１１７と対照的に、Ｗｕら、２０２０によるＤ群抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質への結合について、抗体ＣＲ３０２２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ ＲＢＤおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤの両方に結合する、ヒトモノクローナル抗体；ｔｅｒ Ｍｅｕｌｅｎら、２００６、ＰＬｏＳ Ｍｅｄ、３：ｅ２３７；Ｔｉａｎら、２０２０、Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ ＆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ、９：３８２～３８５）と競合するので、ＶＨＨ－１１７およびＤ群抗体の、異なるエピトープへの結合を指し示す。これは、ＲＢＤのアミノ酸Ｄ４２８、Ｆ４２９、またはＥ５１６が、アラニンで置換された場合に、Ｄ群抗体の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質への結合が失われるという事実により、さらに、裏書きされる（ＶＨＨ３．１１７について実施されたＤＭＳ（ｄｅｅｐ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ）は、残基である、Ｄ４２８、Ｆ４２９、またはＥ５１６を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ ＲＢＤ上における、ＶＨＨ３．１１７エピトープの部分として含意しなかった）。
Ｅ群抗体の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質への結合は、ＲＢＤが、アミノ酸置換である、Ｎ３５４ＤおよびＤ３６４Ｙを含む場合には失われるが、ＲＢＤが、アミノ酸置換である、Ｖ３６７Ｆ（ＶＨＨ３．１１７について実施されたＤＭＳ（ｄｅｅｐ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ）は、残基である、Ｎ３５４、Ｄ３６４またはＶ３６７を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ ＲＢＤ上における、ＶＨＨ－１１７エピトープの部分として含意しなかった）を含む場合には失われない。これは、ＶＨＨ３．１１７およびＥ群抗体の、異なるエピトープへの結合を指し示す。
最後に、抗体ｎ３０８８／ｎ３１３０、およびｎ３０８６／ｎ３１１３のＣＤＲ３配列は、Ｗｕら、２０２０（同文献中の表Ｓ３）により提示されている。本発明の抗体（配列番号８）、および抗体ｎ３０８８／ｎ３１３０、およびｎ３０８６／ｎ３１１３のＣＤＲ３配列のＣＤＲ３配列を、下記に列挙するが、ここから、これらのＣＤＲ３配列の間では、全体的に、類似性が低度であるか、または類似性が見られないと結論づけることができる。
実施例１２
ＡｌｐｈａＬＩＳＡ免疫アッセイによる、ＶＨＨ７２の、スパイクタンパク質のＲＢＤへの結合の阻害
ＶＨＨが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤへの結合について、ＶＨＨ７２と競合する能力について、競合Ａｌｐｈａ（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ａｓｓａｙ）ＬＩＳＡにおいて評価した。
異なるＶＨＨファミリーを表す、選択されたクローンを、精製一価タンパク質としての、さらなる特徴付けのための、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ内またはＥ．ｃｏｌｉ内の産生のために再クローニングした。一価ＶＨＨは、それぞれ、Ｃ末端Ｈｉｓ６タグ、またはＣ末端ＨＡ－Ｈｉｓ６タグを含有した。精製は、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して行った。
抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＨＨ、および関連しない対照ＶＨＨ（最終濃度を、９０ｎＭ～０．０４ｎＭの間の範囲とする）の系列希釈液を、アッセイ緩衝液（０．５％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳ）中で作製した。その後、ＶＨＨを、白色低結合性３８４ウェルマイクロ滴定プレート（平底、Ｇｒｅｉｎｅｒ；型番：７８１９０４）内で、ＶＨＨ７２－ｈ１（Ｓ６５Ａ）－Ｆｌａｇ３－Ｈｉｓ６（最終濃度：０．６ｎＭ）、およびＡｖｉタグ（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；型番：ＳＰＤ－Ｃ８２Ｅ９）（最終濃度：０．５ｎＭ）を介してビオチニル化された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤタンパク質と混合した。室温で、１時間にわたるインキュベーションの後、ドナービーズおよびアクセプタービーズを、０．０２５ｍＬの最終容量中に、各々、２０μｇ／ｍＬの最終濃度まで添加した。ビオチニル化ＲＢＤを、ストレプトアビジンコーティングＡｌｐｈａ Ｄｏｎｏｒビーズ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ；型番：６７６０００２）上に捕捉し、暗所内、室温で、１時間にわたるインキュベーションにおいて、ＶＨＨ７２＿ｈ１（Ｓ５６Ａ）－Ｆｌａｇ３－Ｈｉｓ６を、抗Ｆｌａｇ ＡｌｐｈａＬＩＳＡアクセプタービーズ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ；型番：ＡＬ１１２Ｃ）上に捕捉した。ビーズ上に捕捉された、ＶＨＨ７２と、ＲＢＤとの結合は、Ｅｎｓｉｇｈｔ測定器上、６８０ｎｍにおける照射、および６１５ｎｍにおける読取りの後で評価される、一方のビーズから、他方のビーズへのエネルギー移動をもたらす。
結果を、図１９に示す。結果は、スーパーファミリーの部分である、７つのＶＨＨ（ファミリーである、Ｆ－３６／５５／２９／３８／１４９）、およびＶＨＨ３．８３（ファミリー８３）が、ＶＨＨ７２の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤタンパク質への相互作用を完全に遮断することを指し示すことから、これらが、ＶＨＨ７２と、少なくとも重複するか、またはこれと同じエピトープに結合することを指し示す。ＶＨＨ３．１５１、ＶＨＨＢＤ９、ＶＨＨ３．３９、ＶＨＨ３．８９、およびＶＨＨ３．１４１を含む、他の多数のＶＨＨファミリーは、ＶＨＨ７２の非競合剤であることから、これらが、ＶＨＨ７２と異なるエピトープに結合することを指し示す。
実施例１３
ＡｌｐｈａＬＩＳＡイムノアッセイによる、ＡＣＥ－２／ＲＢＤ相互作用の阻害
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤタンパク質の、ＡＣＥ－２受容体との相互作用の、用量依存的阻害について、競合ＡｌｐｈａＬＩＳＡにおいて評価した。
異なるＶＨＨファミリーを表す、選択されたクローンを、精製一価タンパク質としての、さらなる特徴付けのための、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ内またはＥ．ｃｏｌｉ内の産生のために再クローニングした。一価ＶＨＨは、それぞれ、Ｃ末端Ｈｉｓ６タグ、またはＣ末端ＨＡ－Ｈｉｓ６タグを含有した。精製は、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して行った。
ＶＨＨの系列希釈液（最終濃度を、９０ｎＭ～０．０４ｎＭの間の範囲とする）を、アッセイ緩衝液（０．５％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳ）中で作製し、白色低結合性３８４ウェルマイクロ滴定プレート（平底、Ｇｒｅｉｎｅｒ；型番：７８１９０４）内で、Ａｖｉタグ（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；型番：ＳＰＤ－Ｃ８２Ｅ９）（最終濃度：１ｎＭ）を介してビオチニル化された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤと混合した。組換えヒトＡＣＥ－２－Ｆｃ（最終濃度０．２ｎＭ）を、混合物へと添加した。室温で、１時間にわたるインキュベーションの後、ドナービーズおよびアクセプタービーズを、０．０２５ｍＬの最終容量中に、各々、２０μｇ／ｍＬの最終濃度まで添加した。ＲＢＤを、ストレプトアビジンコーティングＡｌｐｈａ Ｄｏｎｏｒビーズ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ；型番：６７６０００２）上に捕捉した。ヒトＡＣＥ－２－ｍＦｃタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ；型番：１０１０８－Ｈ０５Ｈ）を、暗所内、室温で、１時間にわたる、さらなるインキュベーションにおいて、抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的）アクセプタービーズ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ；型番：ＡＬ１０５Ｃ）上に捕捉した。ビーズ間の相互作用について、Ｅｎｓｉｇｈｔ測定器上、６８０ｎｍにおける照射、および６１５ｎｍにおける読取りの後で評価した。結果を、図２０に示す。ＶＨＨ７２と競合した、全てのＶＨＨはまた、ヒトＡＣＥ２の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤタンパク質との相互作用も遮断する。
結論として述べると、競合アッセイの結果は、ファミリーである、Ｆ－８３、Ｆ－３６、Ｆ－５５、Ｆ－２９、Ｆ－３８、およびＦ－１４９から精製されたＶＨＨが、ＶＨＨ７２と同じエピトープに結合し、ＶＨＨ７２ファミリーメンバーと同様に、ＡＣＥ－２による結合と競合することを確認する。
実施例１４
ＶＨＨ３．８９ファミリーの、ＶＨＨ３．１１７エピトープに対する結合剤としての同定
ＶＨＨ３．８９（配列番号５３）は、既に報告されている（ＰＣＴ／ＥＰ２０２１／０５２８８５）通りに同定されたが、本明細書では、このＮｂのうち、ＶＨＨ３＿１８３およびＶＨＨ３Ｃ＿８０（それぞれ、配列番号５４および５５に描示されている）に対応する、いくつかのさらなるファミリーメンバーを明らかにした。
かつての解析は、ＶＨＨ３．１１７に次いで、ＶＨＨ３．８９もまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤへの結合について、ＶＨＨ７２と競合しないことを明らかにした（図１９を参照されたい）。これを確認し、さらに、ＶＨＨ３．８９の結合性部位を特徴付けるために、ＥＬＩＳＡプレートを、直接コーティングしたか、またはコーティングされたモノクローナル抗体Ｓ３０９、ＣＢ６、またはＶＨＨ３．１１７、またはヒトＩｇＧ１ Ｆｃへと融合されたＶＨＨ７２－Ｓ５６Ａ（Ｄ７２－５３＝ＶＨＨ７２＿ｈ１＿Ｅ１Ｄ＿Ｓ５６Ａ－（Ｇ４Ｓ）２－ｈＩｇＧ１ｈｉｎｇｅ＿ＥＰＫＳＣｄｅｌ－ｈＩｇＧ１＿ＬＡＬＡ＿Ｋｄｅｌ）により捕捉された、一価ＲＢＤへの、このＶＨＨの結合について調べた（Ｐｉｎｔｏら、Ｎａｔｕｒｅ、２０２０；Ｓｈｉら、Ｎａｔｕｒｅ、２０２０）。図２１Ａは、ＶＨＨ３．８９が、ＶＨＨ３．１１７のファミリーに属するＶＨＨである、ＶＨＨ３．９２と全く同様に、Ｓ３０９、ＣＢ６、およびＤ７２－５３と競合しないが、ＶＨＨ３．１１７と競合することを裏付ける。これは、ＶＨＨ３．８９の結合性部位が、ＶＨＨ３．１１７およびＶＨＨ３．９２の結合性部位と重複することを裏付ける（図２１）。
ＶＨＨ３．１１７の、ＲＢＤ上の結合性部位は、ＡＣＥ２結合性領域から隔たっており、結果として、ＶＨＨ３．１１７、および類縁のＶＨＨは、ＲＢＤの、ＡＣＥ２への結合を妨げることができない（実施例５および７を参照されたい）。ＡｌｐｈａＬＩＳＡを使用して、本発明者らは、かつて、ＶＨＨ３．８９もまた、溶液中における、ＲＢＤの、組換えＡＣＥ２への結合に干渉しないことを裏付けた（実施例１３および図２０を参照されたい）。ＶＨＨ３．８９がまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤの、標的細胞の表面上における、ヒト受容体への結合も妨げられないことを確認するために、本発明者らは、ＶＨＨ３．８９と共にプレインキュベートされたＲＢＤ－ｍｕＦｃの、Ｖｅｒｏ Ｅ６標的細胞への結合について調べた。ＶＨＨ７２と類縁であり、ＲＢＤの、ＡＣＥ２への結合を妨げることが公知である、ＶＨＨ３．１１７およびＶＨＨ３．１１５を、対照として使用した。図２２は、ＶＨＨ３．１１７と全く同様に、ＶＨＨ３．８９も、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクにより偽型化されたＶＳＶ－ｄｅｌＧの中和のための、そのＥＣ５０（下記および図２３を参照されたい）を上回る濃度において、ＲＢＤの、ＡＣＥ２を発現するＶｅｒｏ Ｅ６細胞への結合を妨げられないことを示す。
ＶＨＨ３．１１７と同様に、ＶＨＨ３．８９も、ＲＢＤの、ＡＣＥ２への結合を遮断することが可能でないにもかかわらず、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和しうるのかどうかについて調べるために、本発明者らは、ＶＨＨ３．８９が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク偽型ＶＳＶ－ｄｅｌＧを中和しうるのかどうかについて調べた。ＧＦＰターゲティングＶＨＨ（ＧＢＰ）を、陰性対照として使用し、ＶＨＨ３．１１７およびＶＨＨ３．９２を、参照として使用し、ＶＨＨ７２エピトープに結合するが、ＲＢＤの、ＡＣＥ２への結合に干渉しない、ＶＨＨ３．８３を、陽性対照（ＰＣＴ／ＥＰ２０２１／０５２８８５）として使用した。図２３Ａは、ＶＨＨ３．８９が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクにより偽型化されたＶＳＶ－ｄｅｌ Ｇを、ＶＨＨ３．１１７およびＶＨＨ３．９２と同等のＥＣ５０で中和することを例示する。加えて、ＶＨＨ３．８９、ＶＨＨ３．８３、ＶＨＨ３．１１７、またはＶＨＨ３．９２を含有するＰＥ抽出物もまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１スパイク偽型ＶＳＶ－ｄｅｌＧを中和することが可能であった（図２３Ｂ）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１のＲＢＤとの間の変動を考慮に入れると、この交差中和活性は、ＶＨＨ３．１１７と、ＶＨＨ３．９２とが、高度に類似するエピトープに結合することを裏書きする（図２１Ｂおよび２１Ｃ）。
かつての解析は、ＶＨＨ３．１１７が、クレード１およびクレード２のサルベコウイルスのＲＢＤに、強力に結合することが可能であり、アフィニティーは低減されるが、クレード３のサルベコウイルスである、ＢＭ４８－３１のＲＢＤにも結合することを明らかにした（実施例６、図１３および１４を参照されたい）。ＶＨＨ３．８９が、ＲＢＤの、ＶＨＨ３．１１７の結合性部位と高度に類似する部位に結合する場合、ＶＨＨ３．８９は、クレード１および２のＲＢＤに結合することが可能であり、より低度において、クレード３のサルベコウイルスのＲＢＤに結合することが可能であるはずである。これについて調べるために、本発明者らは、フローサイトメトリー解析により、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤ（クレード１．Ｂ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１（クレード１．Ａ）、ＨＫＵ３（クレード１）、Ｒｆ１（クレード３）、およびＢＭ４８－３１（クレード３）を発現する酵母細胞への、ＶＨＨ３．８９の結合について調べた（図２４Ａ～２４Ｃ）。ＶＨＨ３．１１７およびＶＨＨ３．８９は、いずれも、クレード１および２のサルベコウイルスのＲＢＤに強力に結合することが可能であり、顕著に低度において、クレード３ウイルスである、ＢＭ４８－３１のＲＢＤに結合することが可能であった。加えて、酵母細胞ＥＬＩＳＡにより調べたところ、ＶＨＨ３．１１７およびＶＨＨ３．８９の両方による、強力な結合はまた、クレード１および２のウイルスの、より広範なシリーズについても観察された（図２４Ｄ）。クレード１、クレード２、およびクレード３のサルベコウイルスの間で保存的である、ＲＢＤ上の少数の部位を考慮に入れると、これらの結果は、ＶＨＨ３．８９が、ＶＨＨ３．１１７の結合性部位と高度に類似するエピトープを認識することについて、強力な根拠を示す。
実施例１５
ＶＨＨ３．１１７エピトープ結合剤のヒト化
当業者は、当技術分野で公知である、ヒト化のための方法および技法について承知しており、多数のヒト化置換を指向するための知見を手元に有する。特に、ＶＨＨ配列のヒト化、および化学的不均一性への傾向の低減は、ヒト免疫グロブリンＧ重鎖可変ドメイン生殖細胞系列３（ＩＧＨｖ３）のコンセンサス配列、またはＬ．ＭｉｔｃｈｅｌｌおよびＬ．Ｊ．Ｃｏｌｗｅｌｌ（２０１８、Ｐｒｏｔｅｉｎ、８６：６９７～７０６）に記載されている、その多型変異のアライメントに基づき；この解析は、配列比較、および典型的なラクダ科動物ＶＨＨフレームワークの三次元構造（例えば、ＶＨＨ７２の三次元構造；ＰＤＢ登録番号：６ＷＡＱによりアクセス可能である）内の、全ての残基位置の照合の両方により実施される。４３～４７位における、ラクダ科動物極性セクオン（例えば、ＫＥＲＥＧ（配列番号６７）；連続番号付け）は、保存的である（古典的重鎖／軽鎖抗体内では、これは、ＫＧＬＥＷ（配列番号６８）であり、重鎖／軽鎖相互作用帯域を含む）。フレームワークおよびＣＤＲを、問題となる可能性がある残基／セクオン（例えば、ＮＸＴグリカンセクオン、メチオニン、アスパラギンの脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、潜在的なフーリン切断部位）についてについて解析し、必要であり、かつ、ＶＨＨの結合アフィニティーに、大きな影響を及ぼさずに可能であるとみなされる場合は補正する。ラクダ科動物ＶＨＨ配列のヒト化に好ましい、位置および残基については、本明細書の上記に記載されている。
本発明者らは、本明細書で記載される結合剤のヒト化変異体を作製するための洞察および構築物を、さらに提供する。
ＶＨＨ３．１１７などのＶＨＨ３．１１７エピトープ結合剤について、ヒト化変化形は、置換である、Ｑ１Ｄ、Ｑ５Ｖ、Ｋ８３Ｒ、およびＱ１０８Ｌ（Ｋａｂａｔ番号付けに従う）を伴う変異体を構成しうる。
図２５Ａに示される通り、ＶＨＨ３．１１７のヒト化のために、以下の置換（図２５Ａに示されたアライメントにおいて提示される、連続番号付けを使用する）が提起される。
（１）フレームワーク１：Ｑ１を、Ｅへとヒト化するか、またはＱ１を、Ｄへと置換する（Ｎ末端ピログルタミン酸の形成についての可能性を消失させるために）か、Ｑ５を、Ｖへとヒト化する；
（２）フレームワーク３：６４～６５位のＡＱを、ＶＫへとヒト化し、７７～７８位のＳＡを、ＮＴへとヒト化し、Ｅ８２を、Ｑへとヒト化し、Ｋ８４を、Ｎへとヒト化し、Ｋ８７を、Ｒへとヒト化する；
（３）ＣＤＲ３：酸化に対して、潜在的に高感受性である、２つのメチオニン残基を含有する。メチオニン残基の一方または両方が、アラニンへと突然変異させられた、ＶＨＨ３．１１７の変化形を作製して、ＶＨＨ３．１１７の、その抗原（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク、または類縁のウイルスに由来する、これらのタンパク質のオーソログ）への結合が、これらの突然変異の影響を受けるのかどうかについて調べることができる。続いて、または、代替的に、残基の一方または両方を、好ましくは、別の疎水性酸、最も好ましくは、イソロイシンまたはロイシンへと突然変異させ、結果として得られるタンパク質変異体を、結果として得られる、ＶＨＨ３．１１７の変異体の、その抗原への結合について調べることができる。図２５Ａ中の「Ｘ」は、他の任意のアミノ酸、好ましくは、各々、独立に、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、またはＶａｌを表す。
（４）末端フレームワーク：Ｋ１１６を、Ｑへとヒト化し、Ｑ１１９を、Ｌへとヒト化する。
次いで、適合型ｈｕｍＶＨＨ３．１１７タンパク質変異体（最も好ましくは、上記で明示された突然変異の全てを組み込み、いずれのメチオニン残基も、イソロイシンへと置換された）の、その抗原（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク、または類縁のウイルスに由来する、これらのタンパク質のオーソログ）への結合について、天然ＶＨＨ３．１１７タンパク質と比較して評価する。
当業者には、他の実施形態では、上記突然変異のサブセットだけを含有するタンパク質変異体を作製し、抗原への結合について評価しうることが明らかであろう。
上記突然変異のサブセットだけを含有する、このような変異体の例を、図２５Ａに示す。これらの例のうちの１つにおいて、分子の等電点を、さらなるデザインパラメータとして考慮し、ＣＤＲ３内の、２つのＭｅｔ残基が、例えば、ＩｌｅまたはＬｅｕへと突然変異させられうる、適合型ＶＨＨ３．１１７配列である、「ｂｅｔｗ１」（Ｅ８２は、ヒト化されている）の等電点を低下させることが予測される、負帯電残基を保持するように、Ｅ８２を保持する（Ｅは、この位置において生じる場合があり、また、ヒトＩＧＶＨ配列内でも生じる場合がある）。
代替的に、ＶＨＨ３．１１７の特徴付けのために、多数のヒト化変異体が想定され、以下の位置（Ｋａｂａｔ番号付けに従う）における５つの残基が、ヒト化置換のための、最も卓越した候補残基である：Ｑ１。ピログルタミン酸を回避するように、これをＤで置換するが、Ｎ末端置換は、エピトープ領域に近接するので、ＶＨＨ３．１１７の結合特性に影響を及ぼしうる。したがって、結合ポテンシャルを確認するように、このような変異体についてのさらなる詳細解析が要求されうる；加えて、Ｑ５の、Ｖによる置きかえ、Ｋ８４の、Ｎによる置きかえ、Ｋ８７の、Ｒによる置き換え、およびＱ１０８の、Ｌによる置き換えが、本明細書で想定される。
とりわけ、ＶＨＨ３．１１７（配列番号１）の、元のラマベースの配列について、その開発可能性のために、適正なヒト化変異体を得るために、ＣＤＲ３内の２つのメチオニン残基を置換することが、要件でありうる。しかし、その結合能を喪失したり、これに影響を及ぼしたりしないように、注意を払うべきであるので、逐次的置換法が推奨される。
さらに、さらなる残基は、適正なヒト化変異体を得るための置換であって、フレームワーク２内の３９位におけるプロリンの、例えば、アラニンによる置換、例えば、それぞれ、ＶＫ、ＮＴまたはＮＡ、およびＱで置きかえられる）、６４～６５位におけるＡ－Ｑ、および７７～７８位におけるＳ－Ａのほか、フレームワーク３内のＥ８２、ならびに１０８位におけるＫの、Ｑによる置換を含む置換を要求しうる（Ｋａｂａｔ番号付けに従う）。
ＶＨＨ３．１１７のヒト化に加えて、ＶＨＨ３．９２、ＶＨＨ３．９４、ＶＨＨ３．４２、およびＶＨＨ３．１８０（配列番号２～５に提示されている）を含むファミリーメンバー内でも、同様の置換が想定されうる。
とりわけ、フレームワーク残基が、より「ヒト様」であることが公知である残基で置換されうるのに対し、ＣＤＲ残基は、好ましくは、維持される。とりわけ、ＶＨＨ３．１１７ファミリーメンバーに対するヒト化の場合、ＣＤＲ１についての配列番号６、ＣＤＲ２についての配列番号７、およびＣＤＲ３についての配列番号８において提示されたＣＤＲ配列は、やはり、本明細書で提示された通りであり、ヒト化変異体は、フレームワーク残基、好ましくは、特定のＶＨＨについて、本明細書で列挙される、ＦＲ残基位置のうちの１つまたは複数における置換だけで異なり、ヒト化されたＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、またはＦＲ４の、元のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、またはＦＲ４の配列と比較した、少なくとも９０％の同一性を伴う。
本明細書の実施例１３で記載されたＶＨＨ３．８９ファミリーもまた、当技術分野で典型的に検討されるヒト化置換と同様のヒト化について検討されうる。
特に、図２５Ｂに示される通り、ＶＨＨ３．８９（配列番号５３）の、ヒト化ＶＨＨ３．８９変異体（配列番号５６）へのヒト化のために、以下の置換（配列番号５３に提示された連続番号付けを使用する）が提起される：
（１）フレームワーク１：Ｑ１を、Ｅへとヒト化するか、またはＱ１を、Ｄへと置換する（Ｎ末端ピログルタミン酸の形成についての可能性を消失させるために）か、Ｑ５を、Ｖへとヒト化する；
（２）フレームワーク２：３９～４０位のＥＶを、ＱＡへとヒト化する；
（３）フレームワーク３：Ｔ７５を、Ａへとヒト化し、Ｎ８５を、Ｓへとヒト化する；
（４）末端フレームワーク：Ｑ１１９を、Ｌへとヒト化する。
次いで、適合型ｈｕｍＶＨＨ３．８９タンパク質の、その抗原（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク、または類縁のウイルスに由来する、これらのタンパク質のオーソログ）への結合について、天然ＶＨＨ３．８９タンパク質と比較して評価する。
当業者には、他の実施形態では、上記突然変異のサブセットだけを含有するタンパク質変異体を作製し、抗原への結合について評価しうることが明らかであろう。
代替的に、ヒト様配列と最近縁である、ＣＤＲおよびＦＲの、元の配列を組み合わせるように、ＶＨＨ３．８９ファミリーの、異なるファミリーメンバーに基づき、「キメラ」ＶＨＨを構成する、ヒト化変異体についても検討することができる。例えば、他のファミリーメンバーと比較して、ＣＤＲ１内に二重欠失を有する、ＶＨＨ３．８９のＣＤＲ１を、ＶＨＨ３．８３のＦＲと組み合わせる。
提起された、前記ヒト化変異体の発現および精製は、本明細書で開示され、当業者に公知である、クローニング、発現、および産生のための方法に従い行うことができる。最も適切なヒト化変異体を選択するための解析は、ヒト化ＶＨＨの、特異的結合能の、ＲＢＤへの結合、そのアフィニティー、およびその中和ポテンシャルについて、元のＶＨＨと比較した検証を含む（がこれらに限定されない）。
実施例１６
一価のＶＨＨ３．１１７およびＶＨＨ３．８９は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株を、強力に中和する
ＶＨＨ３．１１７およびＶＨＨ３．８９が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＶＯＣ（ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ ｃｏｎｃｅｒｎ）およびＶＯＩ（ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）を中和しうるのかどうかについて調べるために、これらの変異株と関連するＲＢＤ突然変異を含有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクにより装飾された、偽型ＶＳＶ－ｄｅｌＧウイルスを作出した。以下の変異株について、ＲＢＤ内の突然変異は、アルファ変異株についてのＮ５０１Ｙ、アルファ＋Ｅ４８４Ｋ変異株についてのＮ５０１Ｙ＋Ｅ４８４Ｋ、ベータ変異株についてのＫ４１７Ｎ＋Ｅ４８４Ｋ＋Ｎ５０１Ｙ、ベータ＋Ｐ３８４Ｌ変異株についてのＫ４１７Ｎ＋Ｅ４８４Ｋ＋Ｎ５０１Ｙ＋Ｐ３８４Ｌ、カッパ変異株についてのＬ４５２Ｒ＋Ｅ４８４Ｑ、デルタ変異株についてのＬ４５２Ｒ＋Ｔ４７８Ｋ、およびイプシロン変異株についてのＬ４５２Ｒである。ＶＨＨ３．１１７およびＶＨＨ３．８９の、元のＷＴ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、アルファ変異株、アルファ＋Ｅ４８４Ｋ変異株、ベータ変異株、ベータ＋Ｐ３８４Ｌ変異株、カッパ変異株、デルタ変異株、およびイプシロン変異株に対する中和活性について、上記で記載された偽型ＶＳＶウイルスを使用する、偽型ウイルス中和アッセイにおいて調べた。十分に記載されている中和モノクローナル抗体Ｓ３０９およびＣＢ６、ならびにＲＳＶ特異的モノクローナル抗体パリビズマブを、対照として使用した。図２６は、一価のＶＨＨ３．１１７およびＶＨＨ３．８９、ならびにＳ３０９が、全ての被験変異ウイルスに対して、強力な中和活性を保持するのに対して、ＣＢ６は、ベータ変異株およびベータ＋Ｐ３８４Ｌ変異株に対して有効でなかったことを例示する。
実施例１７
ＶＨＨ３．１１７－Ｆｃ、ＶＨＨ３．８９－Ｆｃ、およびＶＨＨ３．９２－Ｆｃの作製および精製
ＶＨＨ３．１１７－Ｆｃ、ＶＨＨ３．８９－Ｆｃ、ＶＨＨ３．９２－Ｆｃ、およびＶＨＨ７２－Ｆｃのコード配列は、ｇＢｌｏｃｋとして合成し、哺乳動物細胞内のタンパク質産生のための発現ベクターへとクローニングした。タンパク質産生のためのＥｘｐｉＣＨＯ－ＳＴＭ細胞に、プラスミドを、一過性にトランスフェクトした。ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラムを使用する、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより、分泌されたＶＨＨ－Ｆｃタンパク質を、増殖培地から精製した。精製されたＶＨＨ１１７－ＦｃおよびＶＨＨ３．８９－Ｆｃの質量および品質を、無傷質量分析およびペプチド質量分析により解析した。無傷タンパク質の質量分析のために、タンパク質を、まず、還元し、次いで、逆相液体クロマトグラフィーにより分離し、最後に、Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計で解析し；ペプチド質量分析のために、タンパク質を還元し、アルキル化し、トリプシンで切断し、この後、ペプチドを、Ｃ１８カラム上で分離し、Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計により、オンラインで測定した。ペプチドマッピングは、トリプシン消化（ｄｉｇｅｓｔ）の後で期待される、ＶＨＨ１１７－Ｆｃについて、８１．９％、およびＶＨＨ８９－Ｆｃについて、８０．４％の配列カバレッジを結果としてもたらした（データは示さない）。まとめると、無傷ＭＳおよびペプチドマッピングは、タンパク質の分子構造を確認した。無傷タンパク質の、主要な実験質量は、タンパク質の理論質量と合致し、２分子間のジスルフィド結合をなおも有し、Ａ２Ｇ０Ｆ型Ｎ－グリコシル化を保有する。無傷ＭＳおよびペプチドマッピングにより、稀少なグリコシル化型、例えば、Ｍａｎ５分子種も見出された（データは示さない）。ＶＨＨ３．９２－Ｆｃについては、ＭＳ解析を実施しなかったが、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析の後におけるクーマシー染色は、精製に成功したＶＨＨ３．９２－Ｆｃが、無傷であり、予測されるサイズで泳動することを確認した（データは示さない）。
ＶＨＨ３．１１７－Ｆｃ、ＶＨＨ３．８９－Ｆｃ、ＶＨＨ３．９２－Ｆｃ、およびＶＨＨ７２－Ｆｃのアミノ酸配列は、本明細書の下記で描示される通りである：
実施例１８
ＶＨＨ３．１１７－ＦｃおよびＶＨＨ３．８９－Ｆｃは、クレード１、クレード２、およびクレード３のサルベコウイルスのＲＢＤを認識する
かつて、本発明者らは、一価のＶＨＨ３．１１７およびＶＨＨ３．８９が、クレード１およびクレード２のサルベコウイルスのＲＢＤに、たやすく結合しうるが、クレード３のサルベコウイルスである、ＢＭ４８－３１のＲＢＤにはたやすくは結合しえないことを裏付けた（図２４）。ＶＨＨ３．１１７およびＶＨＨ３．８９のＦｃ融合体（ＶＨＨ３．１１７－ＦｃおよびＶＨＨ３．８９－Ｆｃ）の、サルベコウイルスのＲＢＤへの結合について調べるために、本発明者らは、多様なサルベコウイルスのＲＢＤを発現するコーティング酵母細胞に基づき、ＥＬＩＳＡを実施した。図２７は、それらの一価対応物とは対照的に、ＶＨＨ３．１１７－ＦｃおよびＶＨＨ３．８９－Ｆｃが、クレード１およびクレード２のＲＢＤに次いで、クレード３のサルベコウイルスである、ＢＭ４８－３１のＲＢＤを提示する酵母細胞にもまた結合しえたことを示す。ＲＢＤを提示しない酵母細胞への結合は、観察されなかった。これらのデータは、ＶＨＨ３．１１７－ＦｃおよびＶＨＨ３．８９－Ｆｃが、汎サルベコウイルス特異性を有することを裏付ける。
実施例１９
ＶＨＨ３．１７７－ＦｃおよびＶＨＨ３．８９－Ｆｃは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＷＴおよびオミクロン変異株のＲＢＤおよびスパイクタンパク質に結合する
サルベコウイルスを中和することが可能であるために、ＲＢＤ特異的ＶＨＨ－Ｆｃ構築物は、スパイクタンパク質内のＲＢＤに結合しなければならない。したがって、本発明者らは、自社製の組換え安定化スパイクＨｅｘａＰｒｏ（スパイク６Ｐ）タンパク質を使用するＥＬＩＳＡにより、ＶＨＨ３．１１７－Ｆｃの、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質への結合について調べた。このタンパク質は、Ａｄｄｇｅｎｅから得られるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＨｅｘａＰｒｏ発現プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号：１５４７５４；Ｈｓｉｅｈら（２０２０）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３６９（６５１０）：１５０１～１５０５）を使用して作製した。
新興のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オミクロン変異株は、ＲＢＤ内に、記載されている、多くのＲＢＤ特異的中和抗体（Ｌｉｕら（２０２１）、Ｎａｔｕｒｅ）の回避を可能とする、複数の突然変異を保有する。ＶＨＨ３．１１７－Ｆｃの、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オミクロン変異株のスパイクへの結合は、ＥＬＩＳＡにおいて、組換え安定化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＢＡ．１スパイクＨｅｘａＰｒｏタンパク質（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；ＳＰＮ－Ｃ５２Ｈｚ）を使用して、ＥＬＩＳＡにより調べた。Ｓ３０９およびＶＨＨ３．１１７のいずれも、元の（Ｗｕｈａｎ）およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オミクロン変異株のいずれのスパイクタンパク質にも結合しうる（図２８）。
ＶＨＨ－Ｆｃ構築物の、元の（Ｗｕｈａｎ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オミクロン変異株のＲＢＤへの結合はまた、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）によっても調べた。
ＶＨＨ３．１１７－ＦｃまたはＶＨＨ３．８９－Ｆｃを、ＶＨＨを、表面へと提示するように、Ｆｃを介して、ＡＨＣ（ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ ｃａｐｔｕｒｅ）バイオセンサー（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）上に固定化した。Ｈｉｓタグ付け一価ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ（図２９Ａ）、またはＨｉｓタグ付け一価ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＢＡ．１／オミクロンＲＢＤ－Ｈｉｓ（図２９Ｃ、２９Ｄ）の２倍希釈系列の、反応速度緩衝液中における会合（１２０秒間）および解離（４８０秒間）を測定した。結合反応速度解析の間に、再生緩衝液（１０ｍＭのグリシン、ｐＨ１．７）への、２０秒間ずつ、３回にわたる曝露により、バイオセンサーを再生させた。データを、二重参照控除し、Ｏｃｔｅｔ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ９．０（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）により、互いに対してアライメントした。ＶＨＨ３．１１７－Ｆｃ内に組み込まれたＶＨＨは、１：１結合モデルにおいて、元の（Ｗｕｈａｎ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株ＲＢＤに、ナノモル単位の低アフィニティーで結合することを裏付けた（図２９Ａ）。ＶＨＨ３．８９－Ｆｃ内およびＶＨＨ３．１１７－Ｆｃ内に組み込まれたＶＨＨが、１：１結合モデルにおいて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オミクロン変異株ＲＢＤ－Ｈｉｓに、ナノモル未満のアフィニティーで結合したのに対し（図２９Ｃ、２９Ｄ）、ＶＨＨ７２－Ｓ５６Ａ＿Ｆｃ内に組み込まれたＶＨＨは、オミクロンＲＢＤ－Ｈｉｓに、１０－７Ｍのアフィニティーで結合することを裏付けた（図２９Ｂ）。
同様に、ＶＨＨ－Ｆｃの文脈における、ＶＨＨ３．１１７およびＶＨＨ３．８９の、元のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｗｕｈａｎ、ＷＴ）株スパイク６Ｐ、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オミクロン変異株スパイク６Ｐに対するアフィニティーを、ＢＬＩにより解析した。ＶＨＨ３．１１７＿ＦｃおよびＶＨＨ３．８９＿Ｆｃを、ＶＨＨを、表面へと提示するように、Ｆｃを介して、ＡＨＣ（ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ ｃａｐｔｕｒｅ）バイオセンサー（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）上に固定化した。２００ｎＭのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＢＡ．１／オミクロンスパイク６Ｐ、またはＷＴスパイク６Ｐの、反応速度緩衝液中における会合（４２０秒間）および解離（４８０秒間）を測定した。結合反応速度解析の間に、再生緩衝液（１０ｍＭのグリシン、ｐＨ１．７）への、２０秒間ずつ、３回にわたる曝露により、バイオセンサーを再生させた。データを、二重参照控除し、Ｏｃｔｅｔ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ９．０（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）により、互いに対してアライメントした。ＶＨＨ３．８９－Ｆｃ内に組み込まれたＶＨＨと、ＶＨＨ３．１１７－Ｆｃ内に組み込まれたＶＨＨとは、スパイク６Ｐ（オミクロンまたはＷＴ）に、同様のアフィニティー（同様の曲線形状）で結合した（図２９Ｅ、２９Ｆ）。
実施例２０
ＶＨＨ３．１１７－ＦｃおよびＶＨＨ３．９２－Ｆｃは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質により偽型化されたＶＳＶウイルスを中和する
ＶＨＨ３．１１７、およびそのファミリーメンバーである、ＶＨＨ３．９２のＦｃ融合体が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を中和しうるのかどうかについて調べるために、本発明者らは、ＶＨＨ３．１１７－ＦｃおよびＶＨＨ３．９２－Ｆｃが、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞上において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質を提示する、偽型ＶＳＶ－ｄｅｌＧウイルス（ＶＳＶｄｅｌＧ－スパイク）の感染をコントロールしうるのかどうかについて調べた。ＶＨ３．１１７－ＦｃおよびＶＨＨ３．９２－Ｆｃは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質により偽型化された、ＶＳＶｄｅｌＧウイルスを中和した（図３０）。
実施例２１
ＶＨＨ３．１１７－Ｆｃは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のデルタ変異株およびガンマ変異株を中和しうる
ＶＨＨ３．１１７、およびそのファミリーメンバーである、ＶＨＨ３．９２のＦｃ融合体がまた、元のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｗｕｈａｎ変異株に次いで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のデルタ変異株およびガンマ変異株も中和しうるのかどうかについて調べるために、本発明者らは、ＶＨ３．１１７－ＦｃおよびＶＨＨ３．９２－Ｆｃが、デルタ変異株またはガンマ変異株のＲＢＤ突然変異を含有するスパイクタンパク質により偽型化された、ＶＳＶ－ｄｅｌＧウイルスの感染をコントロールしうるのかどうかについて調べた。
デルタ変異株のＲＢＤ突然変異は、ＶＨ３．１１７－ＦｃおよびＶＨＨ３．９２－Ｆｃによる中和を凌駕できなかった（図３１Ａ）。
別個の実験では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ガンマ変異株のＲＢＤ突然変異を含有するスパイクタンパク質を提示する、偽型ＶＳＶｄｅｌＧ粒子に対する、ＶＨＨ３．１１７－Ｆｃの中和活性について調べた。ＲＢＭ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｔｉｆ）、およびガンマ変異株において、Ｔから置換された、Ｋ４１７をターゲティングする中和抗体ＣＢ６を、対照として使用した。ＶＨＨ３．１１７－Ｆｃは、元のＷｕｈａｎ変異株のスパイクタンパク質またはガンマ変異株のＲＢＤ突然変異を含有するスパイクタンパク質を保有するＶＳＶｄｅｌＧウイルス粒子を、強力に中和することができた（図３１Ｂ）。ＶＨＨ３．１１７－Ｆｃとは対照的に、ＣＢ６は、ガンマ変異株のＲＢＤ突然変異を含有するスパイクタンパク質により偽型化されたＶＳＶｄｅｌＧを中和することができなかった。
実施例２２
ＶＨＨ３．１１７－Ｆｃは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オミクロンＢＡ．１変異株を中和しうる
ＥＬＩＳＡおよびＢＬＩを使用して、本発明者らは、ＶＨＨ３．１１７－Ｆｃが、ＲＢＤ内の、複数の突然変異にもかかわらず、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オミクロン変異株のスパイクタンパク質を、たやすく認識しうることを裏付けた（図２８Ｂおよび２９Ｄ）。ＶＨＨ３．１１７－Ｆｃがまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オミクロン変異株も中和しうるのかどうかについて調べるために、本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ６１４Ｇ変異株またはＳＡＲＳ－ＣｏＶオミクロンＢＡ．１変異株のスパイクタンパク質を発現させる、偽型ＶＳＶｄｅｌＧウイルス粒子を使用して、中和アッセイを実施した。対照として、本発明者らは、オミクロンＢＡ．１変異株に対する中和活性を、大部分保持することが示されたモノクローナル抗体Ｓ３０９を使用した。ＶＨＨ３．１１７－ＦｃおよびＳ３０９は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ６１４Ｇ変異株またはＳＡＲＳ－ＣｏＶオミクロンＢＡ．１変異株のスパイクタンパク質により偽型化されたＶＳＶｄｅｌＧウイルス粒子を中和した（図３２）。
実施例２３
ＶＨＨ３．１１７－Ｆｃは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１を中和しうる
ＲＢＤのＲＢＭ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｔｉｆ）と対照的に、ＶＨＨ３．１１７結合性部位は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との間で、保存が良好である。これは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１を含む、広範にわたるサルベコウイルスのＲＢＤに結合する、ＶＨＨ３．１１７－Ｆｃの能力により例示される（図２６）。ＶＨＨ３．１１７のＦｃ融合体がまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１も中和しうるのかどうかについて調べるために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１スパイクタンパク質により装飾された、偽型ＶＳＶｄｅｌＧウイルス粒子を使用して、中和アッセイを実施した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１感染患者から単離され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の両方を中和しうるモノクローナル抗体Ｓ３０９を、対照として使用した。図３３は、Ｓ３０９およびＶＨＨ３．１１７－Ｆｃが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１スパイクタンパク質の両方で装飾されたＶＳＶｄｅｌＧウイルス粒子を、強力に中和したことを例示する。
実施例２４
ＶＨＨ３．１１７－Ｆｃは、ヒトＴＭＰＲＳＳ２を安定的に発現するＶｅｒｏ Ｅ６細胞上において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクにより偽型化されたＶＳＶｄｅｌＧウイルス粒子を中和する
ＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルスの侵入は、融合を可能とする融合ペプチドの上流において、Ｓ２’部位を切断する、カテプシンによる、スパイクタンパク質の、タンパク質分解性活性化の後、エンドソーム内において生じうる。代替的に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルスはまた、膜貫通型プロテアーゼである、ＴＭＰＲＳＳ２による、スパイクのタンパク質分解性活性化の後、細胞表面においても侵入しうる（Ｈｏｆｆｍａｎｎら（２０２０）、Ｃｅｌｌ、１８１：２７１～２８０）。Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞は、検出不能レベルの、内因性ＴＭＰＲＳＳ２を発現するが、カテプシン依存性経路を介するウイルスの侵入を可能とする（Ｂｅｒｔｒａｍら（２０１０）、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．、８４：１００１６～１００２５、ＪＶ、２０１０；Ｈｏｆｆｍａｎｎら、２０２０）。ＶＨＨ３．１１７－Ｆｃがまた、ＴＭＰＲＳＳ２を介するウイルス感染も遮断しうるのかどうかについて調べるために、ヒトＴＭＰＲＳＳ２を安定的に発現するＶｅｒｏ Ｅ６細胞（ＮＩＢＩＯＨＮ；ＪＣＲＢ１８１９）（Ｍａｔｓｕｙａｍａら（２０２０）、ＰＮＡＳ、１１７：７００１～７００３）を使用して、偽型ウイルス中和アッセイを実施した。図３４は、ＶＨＨ３．１１７－Ｆｃが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を発現させる、偽型ＶＳＶｄｅｌＧウイルス粒子を中和したことを裏付ける。
実施例２５
ＶＨＨ３．１１７－Ｆｃは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含有する、複製コンピテントＶＳＶウイルスを中和することが可能である
次に、本発明者らは、Ｋｏｅｎｉｇら（Ｋｏｅｎｉｇら（２０２１）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３７１：ｅａｂｅ６２３０）により記載されている、Ｓ１－１ａ ＷＴ ＶＳＶウイルスを使用することにより、ＶＨＨ３．８９、ＶＨＨ３．１７７、およびＶＨＨ３．１１７－Ｆｃが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含有する、複製コンピテントＶＳＶウイルスを中和しうるのかどうかについて調べた。図３５は、ＶＨＨ３．８９、ＶＨＨ３．１１７およびＶＨＨ３．１１７－Ｆｃが、スパイクを発現させる、複製コンピテントＶＳＶウイルスを、強力に中和したことを例示する。
実施例２６
ＶＨＨ３．１１７およびＶＨＨ３．８９－Ｆｃは、スパイクＳ１サブユニットの未成熟排出を誘導する
ＲＢＤをターゲティングする中和抗体またはＮａｎｏｂｏｄｙの大部分は、ＲＢＭへの直接的な結合により（例えば、ＣＢ６）、または立体障害により（例えば、ＶＨＨ７２）、ＲＢＤの、その受容体である、ＡＣＥ２への結合を防止することにより中和する（Ｗｒａｐｐら（２０２０）、Ｃｅｌｌ、１８１：１００４～１０１５、ｅ１５）。さらに、ＡＣＥ２への結合を遮断する抗体は、Ｓ１部の排出を誘導し、これにより、未成熟スパイクを惹起することが可能である（Ｗｅｃら（２０２０）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３６９：７３１～７３６）。本発明者らは、ＶＨＨ３．８９およびＶＨＨ３．１１７が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和するが、ＲＢＤの、ＡＣＥ２への結合を遮断しないことを裏付けた（図２２）。中和の代替的機構として述べると、抗体は、Ｓ１部の排出を誘導し、結果として、未成熟スパイクの惹起を誘導しうるであろう。ＶＨＨ３．１１７およびＶＨＨ３．８９－Ｆｃが、Ｓ１部の排出を誘導しうるのかどうかについて調べるために、本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を発現する細胞を、これらの抗体と共にインキュベートし、ポリクローナルＳ１特異的抗血清を使用するウェスタンブロット法により、Ｓ１部の、増殖培地への排出を検出した。ＡＣＥ２遮断抗体ＣＢ６およびＶＨＨ７２－Ｆｃを、陽性対照として組み入れた（Ｓｃｈｅｐｅｎｓら（２０２１）、Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．、１３）。ＡＣＥ２への結合を遮断せず、Ｓ１部の排出を誘導しないことが示されていた非中和抗体ＣＲ３０２２を、陰性対照として組み入れた（Ｗｅｃら（２０２０））。加えて、本発明者らはまた、ＡＣＥ２への結合を遮断しない中和抗体Ｓ３０９も組み入れた（Ｔｏｒｔｏｒｉｃｉら（２０２１）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３７０：９５０～９５７）。予測される通り、ＡＣＥ２の、ＲＢＤへの結合を遮断しうる抗体（ＣＢ６およびＶＨＨ７２－Ｆｃ）は、ＰＢＳで処置された細胞と比較した、増殖培地中のＳ１サブユニットの蓄積（上清）、および細胞画分中の残存物の低減により観察される通り、細胞表面から、増殖培地への、Ｓ１部の排出を誘導した（図３６Ａ）。ＡＣＥ２の、ＲＢＤへの結合を遮断できない、２つの常套的抗体Ｓ３０９およびＣＲ３０２２はまた、スパイク発現細胞からの、Ｓ１部の排出も誘導しなかった（図３６）。Ｓ３０９およびＣＲ３０２２と好対照であり、ＡＣＥ２の、ＲＢＤへの結合を遮断することが可能でないにもかかわらず、ＶＨＨ３．１１７およびＶＨＨ３．８９－Ｆｃは、Ｓ１部の排出を誘導した（図３６）。いかなる理論に束縛されることも望まずに述べると、これらのＶＨＨにより誘導された、Ｓ１部の排出についての可能な説明は、これらのＶＨＨの共通結合性領域が、スパイク三量体内に、高度にふさがれていることである。このように、これらのＶＨＨの結合は、天然のスパイク三量体の不安定化を結果としてもたらし、Ｓ１部の排出、および未成熟スパイクの惹起を、結果として促進しうるであろう。
実施例２７
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＲＢＤへの結合を介して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和しうる、ＶＨＨ３．８９ファミリーメンバーである、ＶＨＨ３．１８３の同定
ＶＨＨ３．１８３は、ＶＨＨ３．８９もまた由来するスクリーンにおいて単離された。それぞれ、ＶＨＨ３．８９（ＰＥ＿８９）およびＶＨＨ３．１８３（ＰＥ＿１８３）を発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞の粗ペリプラズム抽出物中に存在するＶＨＨは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクおよびＲＢＤに結合することが可能であり（図３７Ａ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質により偽型化されたＶＳＶｄｅｌＧウイルス粒子を中和することができた（図３７Ｂ）。配列解析は、ＶＨＨ３．１８３が、ＶＨＨ３．８９と高度に類縁であり、ＣＤＲ１内における、２つのアミノ酸欠失、ＣＤＲ２内およびＣＤＲ３内における、それぞれ、１つおよび３つのアミノ酸置換（ｓｕｂｓｔａｔｉｏｎ）、ならびにフレームワーク領域２内およびフレームワーク領域３内における、少数の置換を含有することを明らかにした（図３７Ｃ）。ＶＨＨ３．８９と同様に、ＶＨＨ３．１８３は、ＷＫ６ Ｅ ｃｏｌｉ細胞内で産生され、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーにより、ペリプラズム抽出物から精製された。ＰＢＳへの緩衝液交換の後、得られたＶＨＨを定量し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより解析した（図３７Ｄ）。偽型ウイルス中和アッセイにより、ＶＨＨ３．１８３の中和活性について調べた。ＶＨＨ３．８９と同様に、ＶＨＨ３．１８３は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質により偽型化されたＶＳＶｄｅｌＧウイルス粒子を中和した（図３７Ｅ）。バイオレイヤー干渉法は、一価ＶＨＨ３．１８３の、ＡＨＣ（ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ ｃａｐｔｕｒｅ）バイオセンサー上に固定化された単量体ヒトＦｃ融合ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２＿ＲＢＤ－ＳＤ１に対するアフィニティーを、１．４×１０－３秒－１の解離速度により裏付けた（図３７Ｆ）。
実施例２８
ＤＭＳ（ｄｅｅｐ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ）による、突然変異させられた場合に、ＶＨＨ３．１１７およびＶＨＨ３．８９への結合を喪失しうる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤのアミノ酸位置の決定
ＲＢＤの全長にわたりプロットされた、ＤＭＳ（ｄｅｅｐ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ）シグナルの比較は、ＶＨＨ３．８９およびＶＨＨ３．１１７により得られたプロファイルが、高度に類似していることを示す（図３８Ａ～３８Ｂ）ことから、これらの２つのＶＨＨファミリーが、高度に類似する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤのアミノ酸位置のセット内の突然変異により、それらの結合において、機能的影響を受けることを裏付ける。
同定されたアミノ酸位置の大部分は、ＲＢＤの全体的なフォールディングの完全性に重要である、ジスルフィド結合に影響を及ぼす突然変異を凌駕して、これらのＶＨＨの、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質との複合体についての、対応するｃｒｙｏＥＭ決定構造の精査時に、これらのＶＨＨの、ＲＢＤとの直接的な結合性接触領域の部分を、効果的に形成することが見出された（図３９）ことから、ＶＨＨ３．８９およびＶＨＨ３．１１７の両方についての、コアの結合性接触部が、図３８Ｃ～３８Ｄにおいて枠囲いされた位置を含むことを描出することが可能となる。残りの位置は、より周縁的な接触部であるか、またはコアの接触帯域の、局所的なアロステリックモジュレーターであると考えられる。
実施例２９
ＶＨＨ３．８９およびＶＨＨ３．１１７と複合体化した、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質三量体の、ｃｒｙｏ－ＥＭによる再構成
スパイクタンパク質－ＶＨＨ複合体の構造決定のために、ＶＨＨ３．８９またはＶＨＨ３．１１７を、Ｗｕｈａｎ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの、組換えＨｅｘａＰｒｏ安定化スパイクタンパク質（スパイク６Ｐ）に対する、１．３倍のモル過剰量で添加した。０．７２ｍｇ／ｍｌのＳＣ２－ＶＨＨ複合体３ｍｌを、Ｒ２．１ Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌグリッド上に置いてから、グリッドを、液体エタンへと浸漬することにより、瞬時凍結させた。ＣｒｙｏＥＭデータは、Ｇａｔａｎ Ｋ３直接型電子検出器を装備した、ＪＥＯＬ ｃｒｙｏＡＲＭ３００電子顕微鏡上で収集した。Ｒｅｌｉｏｎ３を使用して、単粒子を加工する結果として、名目的分解能を、３．１Åとして、ＶＨＨ３．１１７複合体およびＶＨＨ３．８９複合体についての、三次元静電ポテンシャルマップをもたらした。ＣｒｙｏＥＭによるクーロンポテンシャルマップは、ＶＨＨ剤に対応する、明確なボリューム像を示した。ＳＣ２－ＶＨＨ３．１１７複合体について、ＳＣ２三量体内の、３つのＲＢＤドメイン全ては、直立コンフォメーションで見出され、各々は、ＶＨＨ３．１１７の単一のコピーを結合させている（図４０）。ＳＣ２－ＶＨＨ３．８９複合体について、ＳＣ２三量体の、３つのＲＢＤドメイン全ては、直立コンフォメーションで見出されるが、ＳＣ２プロトマー３のＲＢＤについての局所マップ密度が低度であることは、このＲＢＤ内の、大きなコンフォメーション柔軟性を指し示す（図４０）。ＳＣ２プロトマー１およびプロトマー２のＲＢＤは、各々、ＶＨＨ３．８９のコピーを結合させている。
材料および方法
Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉによるＶＨＨの産生
Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ内の、小スケールにおけるＶＨＨの産生については、（Ｗｒａｐｐら、２０２０、Ｃｅｌｌ、前出）において記載されている。Ｅ．ｃｏｌｉ内における、ＶＨＨの産生のために、目的のＶＨＨを含有するｐＭＥＣＳベクターで、ＷＫ６細胞（非抑制性Ｅ．ｃｏｌｉ株）を形質転換し、アンピシリンを含有するＬＢプレート上に播種した。翌日、クローンを採取し、１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリンと、１％のブドウ糖とを含有する、２ｍＬのＬＢ中、３７℃で、２００ｒｐｍで振盪しながら、一晩にわたり増殖させた。この前培養物１ｍｌを使用して、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、２ｍＭのＭｇＣｌ２、および０．１％のブドウ糖を補充した、２５ｍｌのＴＢ（ｔｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈ）に接種し、０．６～０．９のＯＤ６００に到達するまで、３７℃で振盪（２００～２５０ｒｐｍ）しながら、インキュベートした。ＶＨＨの産生は、１ｍＭの最終濃度までの、ＩＰＴＧの添加により誘導した。これらの誘導培養物を、２００ｒｐｍで振盪しながら、２８℃で、一晩にわたりインキュベートした。産生されたＶＨＨは、ペリプラズムから抽出し、Ｗｒａｐｐらにおいて記載されている通りに精製した。略述すると、Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ＶＨＨを、溶液から精製した。５００ｍＭのイミダゾールを使用する溶出の後で、Ｖｉｖａｓｐｉｎカラム（５ｋＤａのカットオフ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により、ＶＨＨを含有するフロースルー画分を、ＰＢＳと緩衝液交換した。精製ＶＨＨを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびクーマシー染色および無傷質量分析により解析した。
酵素免疫測定アッセイ
マイクロ滴定プレート（ｔｙｐｅ ＩＩ、Ｆ９６ Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｃ）のウェルを、１００ｎｇの組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ Ｓ－２Ｐタンパク質（フォルドンを伴う）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ Ｓ－２Ｐタンパク質（フォルドンを伴う）、マウスＦｃタグ付けＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、またはＢＳＡにより、４℃で、一晩にわたりコーティングした。コーティングされたプレートを、ＰＢＳ中に、５％の脱脂粉乳でブロッキングした。ＶＨＨの希釈系列を、ウェルへと添加した。結合は、プレートを、ＨＲＰコンジュゲートヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥ Ｈｅｌｔｈｃａｒｅ）、またはＨＲＰコンジュゲートウサギ抗ラクダ科動物ＶＨＨ抗体（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）と組み合わされた、マウス抗ＨＡ（１２ＣＡ５、Ｓｉｇｍａ）と共に、逐次的にインキュベートすることにより検出した。洗浄の後、５０μＬのＴＭＢ基質（テトラメチルベンジジン、ＢＤ ＯｐｔＥＴＡ）を、プレートへと添加し、５０μＬの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を添加することにより、反応を停止させた。４５０ｎＭにおける吸光度は、ｉＭａｒｋ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ Ｒａｄ）により測定した。非線形回帰を使用して、曲線への当てはめを実施した（Ｇｒａｐｈｐａｄ ８．０）。
ＶＨＨの、ＶＨＨ７２－Ｆｃ、またはヒトモノクローナル抗体Ｓ３０９、ＣＢ６、ＣＲ３０２２、もしくはパリビズマブにより捕捉された一価ＲＢＤへの結合を調べる競合アッセイのために、ＥＬＩＳＡプレートを、４℃、ＰＢＳ中に、５０ｎｇのＶＨＨ７２－Ｆｃ、またはヒトモノクローナル抗体で、１６時間にわたりコーティングした。ＰＢＳで洗浄し、次いで、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳで洗浄した後、ウェルを、室温、５％の脱脂粉乳を含有するＰＢＳで、１時間にわたりブロッキングし、２０ｎｇの単量体ＲＢＤ（自社製のＲＢＤ－ＳＤ１－Ａｖｉ）を、ウェルへと添加し、室温で、１時間にわたりインキュベートした。その後、０．５ｕｇ／ｍｌのＶＨＨを、ウェルへと添加し、室温で、１時間にわたりインキュベートした。ＰＢＳによる、２回にわたる洗浄、および２％の脱脂粉乳および０．０５％のｔｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳによる、３回にわたる洗浄の後、マウス抗ＨＩＳタグ抗体（Ｂｉｏｒａｄ）、およびＨＲＰコンジュゲートヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥ Ｈｅｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、結合しているＶＨＨを検出した。
バイオレイヤー干渉法
Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６システム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）上の、バイオレイヤー干渉法を介して、ＶＨＨ変異体の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤに対する結合反応速度について評価した。一価ＶＨＨ変異体の、ＲＢＤに対するアフィニティーを測定するために、１５μｇ／ｍｌの単量体ヒトＦｃ融合ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２＿ＲＢＤ－ＳＤ１（Ｗｒａｐｐら、２０２０、前出）を、ＡＨＣ（ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ ｃａｐｔｕｒｅ）バイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）上に固定化して、０．３５～０．５ｎｍの信号へと曝露した。二連の２００ｎＭ ＶＨＨの会合（１２０秒間）および解離（４８０秒間）を、反応速度緩衝液中で測定した。解析の間に、再生緩衝液（１０ｍＭのグリシン、ｐＨ１．７）への、２０秒間ずつ、３回にわたる曝露により、バイオセンサーを再生させた。データを、二重参照控除し、Ｏｃｔｅｔ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ９．０（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）により、互いに対してアライメントした。オフ速度（ｋｄｉｓ）を、１：１モデルに当てはめた。
Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６システム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）上の、バイオレイヤー干渉法を介して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤへの結合についての、ＶＨＨ変異体間の競合を評価した。二価ＶＨＨ７２－ｈＦｃ（５０ｎＭ）を、ＡＨＣ（ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ ｃａｐｔｕｒｅ）バイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）上に固定化するのに続き、抗原ＲＢＤ－ＳＤ１＿ｍＦｃ（２００ｎＭ）を、飽和するまで捕捉した。次いで、１μＭのＶＨＨ変異体（３２０～４００ｎｍにおける吸光度スペクトルから外挿された濁度プロファイルを控除した後で、Ｔｒｉｎｅａｎ ＤｒｏｐＳｅｎｓｅ ｍａｃｈｉｎｅ、Ｌｕｎａｔｉｃ ｃｈｉｐにより計算されたタンパク質濃度）との競合を、６００秒間にわたり測定した。解析の間に、再生緩衝液（１０ｍＭのグリシン、ｐＨ１．７）への、２０秒間ずつ、３回にわたる曝露により、バイオセンサーを再生させた。データを、二重参照控除し、Ｏｃｔｅｔ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ９．０（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）により、互いに対してアライメントした。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの表面上に提示された、サルベコウイルスＲＢＤに結合する抗体についての、フローサイトメトリー解析
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２相同体のセットのＲＢＤをコードする、ｐＥＴｃｏｎ酵母表面提示発現ベクターに基づく、プラスミドのプールは、Ｊｅｓｓｅ Ｂｌｏｏｍ博士により恵与された（Ｓｔａｒｒら、２０２０、Ｃｅｌｌ、１８２：１２９５～１３１０）。１０ｎｇスケールの電気穿孔により、このプールで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０細胞を形質転換し、カルベニシリンを補充した、低塩濃度ＬＢ寒天プレートへと播種した。単一クローンを選択し、カルベニシリンを補充した、低塩濃度液体ＬＢ中で増殖させ、少量調製した。選択されたプラスミドを、全ＲＢＤコード配列をカバレッジするプライマーにより、サンガーシーケンシングし、あらゆる所望のＲＢＤ相同体が、配列検証単一クローンとしてピックアップされるまで、工程を反復した。加えて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＲＢＤのコード配列を、酵母コドン最適化ｇＢｌｏｃｋとして注文し、ギブソンアセンブリーにより、ｐＥＴｃｏｎベクターへとクローニングした。プラスミドで、Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換し、プラスミドを少量調製し、上記で記載した通りに、配列を検証した。ＧｉｅｔｚおよびＳｃｈｉｅｓｔｌ（Ｇｉｅｔｚら、２００７、Ｎａｔｕｒｅ、Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、２：１～８および３１～４１）によるプロトコールに従い、選択されたｐＥＴｃｏｎ ＲＢＤプラスミドのＤＮＡで、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＢＹ１００株を形質転換し、酵母ドロップアウト培地（ＳＤ寒天－トリプトファン－ウラシル）上に播種した。単一クローンを選択し、コロニーＰＣＲにより、適正なインサート長について検証した。各ＲＢＤ相同体の単一クローンを選択し、１０ｍｌの液体抑制培地（ＳＲａｆ－ウラシル－トリプトファン）中、２８℃で、一晩にわたり増殖させた。次いで、これらの前培養物を、５０ｍｌの液体誘導培地（ＳＲａｆ／Ｇａｌ－ウラシル－トリプトファン）へと、１ｍｌ当たりのＯＤ６００を０．６７として希釈し戻し、１６時間にわたり増殖させてから採取した。ＰＢＳ中における洗浄の後、細胞を、１％のＰＦＡ中で固定し、ＰＢＳで、２回にわたり洗浄し、１％のＢＳＡでブロッキングし、異なる濃度のＶＨＨで染色した。抗体の結合は、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ６３３コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して検出した。表面に提示されたｍｙｃタグ付けＲＢＤの発現は、ＦＩＴＣコンジュゲートニワトリ抗ｍｙｃ抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｔｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｉｎｃ．）を使用して検出した。０．５％のＢＳＡを含有するＰＢＳによる、３回にわたる洗浄に続き、ＢＤ ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用するフローサイトメトリーにより、細胞を解析した。結合は、ＲＢＤ＋（ＦＩＴＣ＋）細胞のＡＦ６４７ ＭＦＩの、ＲＢＤ－（ＦＩＴＣ－細胞）のＡＦ６４７ ＭＦＩに対する比として計算した。
Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞上における、ＲＢＤ競合アッセイ
最終濃度を、０．４μｇ／ｍＬとして、マウスＩｇＧ Ｆｃ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）へと融合されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤを、１ｕｇ／ｍｌの一価ＶＨＨと共にインキュベートし、室温で、２０分間にわたりインキュベートするのに続き、氷上で、１０分間にわたる、さらなるインキュベーションを行った。コンフルエンシー未満で増殖させたＶｅｒｏＥ６細胞を、細胞解離緩衝液（Ｓｉｇｍａ）により解離させ、トリプシン処理にかけた。ＰＢＳで、１回の洗浄の後、細胞を、氷上、ＰＢＳ中に１％のＢＳＡでブロッキングした。残る、全てのステップもまた、氷上で実施した。ＲＢＤ、およびＶＨＨまたはＶＨＨ－Ｆｃ融合体を含有する混合物を、細胞へと添加し、１時間にわたりインキュベートした。その後、細胞を、０．５％のＢＳＡを含有するＰＢＳで、３回にわたり洗浄し、ＡＦ６４７コンジュゲートロバ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、１時間にわたり染色した。０．５％のＢＳＡを含有するＰＢＳによる、３回にわたる、さらなる洗浄に続き、ＢＤ ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用するフローサイトメトリーにより、細胞を解析した。
ＣｏＶ偽型ウイルス中和アッセイ
複製欠損ＶＳＶ偽型ウイルスを作出するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ ＳまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓをトランスフェクトされた、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ｅＧＦＰおよびホタルルシフェラーゼ発現カセットを含有する、複製欠損ＶＳＶベクター（ＢｅｒｇｅｒおよびＺｉｍｍｅｒ、２０１１、ＰｌｏＳ Ｏｎｅ、６：ｅ２５８５８）を接種した。３７℃で、１時間にわたるインキュベーションの後、接種物を除去し、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、抗ＶＳＶ Ｇ ｍＡｂ（ＡＴＣＣ）を補充した培地中で、１６時間にわたりインキュベートした。次いで、偽型粒子を採取し、遠心分離により清澄化させた（Ｗｒａｐｐら、２０２０、Ｃｅｌｌ、１８１：１００４～１０１５）。ＶＳＶ偽型中和実験のために、偽型ウイルスを、３７℃で、３０分間にわたり、異なる希釈率の、精製ＶＨＨ、またはＧＦＰ結合性タンパク質（ＧＢＰ：ＧＦＰに特異的なＶＨＨ）と共にインキュベートした。その後、インキュベートされた偽型ウイルスを、コンフルエンシー未満の、単層ＶｅｒｏＥ６細胞へと添加した。１６時間後、細胞を、ＰＢＳで、１回洗浄し、受動溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、細胞溶解物を調製した。形質導入効率は、Ｔｅｃａｎ ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００ ｐｒｏプレートリーダーを使用して、細胞溶解物中のＧＦＰ蛍光を測定することにより定量した。キャプション中に表示の通り、ＧＦＰ蛍光は、非感染細胞およびＰＢＳで処理された感染細胞のＧＦＰ蛍光、または各希釈系列の最低ＧＦＰ蛍光値および最高ＧＦＰ蛍光値を使用して正規化した。代替的に、感染は、ＰｒｏｍｅｇａルシフェラーゼアッセイシステムおよびＧｌｏＭａｘマイクロプレートルミノメーター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ルシフェラーゼ活性を測定することにより定量した。ＩＣ５０は、ｌｏｇ（阻害剤）対応答（４パラメータ）の、非線形回帰曲線への当てはめにより計算した。
ＡＣＥ２／ＲＢＤ相互作用について調べるための、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ
ＶＨＨの系列希釈液（最終濃度を、９０ｎＭ～０．０４ｎＭの間の範囲とする）を、アッセイ緩衝液（０．５％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳ）中で作製し、白色低結合性３８４ウェルマイクロ滴定プレート（平底、Ｇｒｅｉｎｅｒ；型番：７８１９０４）内で、Ａｖｉタグ（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；型番：ＳＰＤ－Ｃ８２Ｅ９）（最終濃度：１ｎＭ）を介してビオチニル化された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤと混合した。組換えヒトＡＣＥ－２－Ｆｃ（最終濃度０．２ｎＭ）を、混合物へと添加した。室温で、１時間にわたるインキュベーションの後、ドナービーズおよびアクセプタービーズを、０．０２５ｍＬの最終容量中に、各々、２０μｇ／ｍＬの最終濃度まで添加した。ＲＢＤを、ストレプトアビジンコーティングＡｌｐｈａ Ｄｏｎｏｒビーズ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ；型番：６７６０００２）上に捕捉した。ヒトＡＣＥ－２－ｍＦｃタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ；型番：１０１０８－Ｈ０５Ｈ）を、暗所内、室温で、１時間にわたる、さらなるインキュベーションにおいて、抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的）アクセプタービーズ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ；型番：ＡＬ１０５Ｃ）上に捕捉した。ビーズ間の相互作用について、Ｅｎｓｉｇｈｔ測定器上、６８０ｎｍにおける照射、および６１５ｎｍにおける読取りの後で評価した。
ＤＭＳ（ｄｅｅｐ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ）
ＤＭＳ（ｄｅｅｐ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ ＲＢＤライブラリーによる、Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換：ｐＥＴｃｏｎベクター内で独立に作出された、２つのＤＭＳ（ｄｅｅｐ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ ＲＢＤライブラリーの、プラスミド少量調製物は、Ｊｅｓｓｅ Ｂｌｏｏｍ博士により恵与された（Ｓｔａｒｒら、２０２０、Ｃｅｌｌ、１８２、１２９５～１３１０、ｅ２０）。電気穿孔を介して、これらの少量調製物１０ｎｇで、Ｅ．ｃｏｌｉのＴＯＰ１０株を形質転換し、ＳＯＣ培地中、３７℃で、１時間にわたり回収することを可能とした。形質転換混合物を分割し、カルベニシリンを補充した、低塩濃度ＬＢ培地を含有する、２４．５ｃｍｘ２４．５ｃｍの、大型バイオアッセイ用ディッシュ１０枚の上に、プレート１枚当たりの予測密度を、クローン１００，０００個として播種した。一晩にわたる増殖の後、全てのコロニーを、プレートからスクレーピングし、カルベニシリンを補充した、３００ｍｌの低塩濃度ＬＢへと、再懸濁させた。培養物を、２時間半にわたり増殖させてから、ペレット化させた。細胞ペレットを、滅菌超純水で、１回洗浄し、製造元の指示書に従い、ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｇｉｇａ ｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を介して、プラスミドを、抽出した。
ＤＭＳ（ｄｅｅｐ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ ＲＢＤライブラリーによる、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの形質転換：ＧｉｅｔｚおよびＳｃｈｉｅｓｔｌ（Ｇｉｅｔｚら、２００７、Ｎａｔｕｒｅ、Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、２：１～８および３１～４１）による、大スケールプロトコールに従い、結果として得られるプラスミド少量調製物１０μｇで、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＢＹ１００株を形質転換した。形質転換体は、１００ｍｌの液体酵母ドロップアウト培地（ＳＤ－トリプトファン－ウラシル）中で、１６時間にわたり選択した。次いで、培養物を、１００ｍＬの未使用ＳＤ－トリプトファン－ウラシルへと、１×ＯＤ６００で希釈し戻し、さらに９時間にわたり、継代培養した。その後、培養物を、１５％のグリセロール中に細胞１×１０８個のアリコート中で瞬時凍結させ、－８０℃で保管した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＷＴ ＲＢＤの、クローニングおよび形質転換：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＲＢＤのコード配列を、酵母コドン最適化ｇＢｌｏｃｋとして注文し、ギブソンアセンブリーにより、ｐＥＴｃｏｎベクターへとクローニングした。同様に、クローニング混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０細胞へと電気穿孔し、製造元の指示書に従い、Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を介して、プラスミドを抽出した。プラスミドを、全ＲＢＤコード配列をカバレッジするプライマーにより、サンガーシーケンシングした。最後に、ＧｉｅｔｚおよびＳｃｈｉｅｓｔｌ（Ｇｉｅｔｚら、２００７、Ｎａｔｕｒｅ、Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、２：１～８および３１～４１）による、小スケールプロトコールに従い、プラスミドで、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＢＹ１００株を形質転換した。形質転換体は、酵母コロニーＰＣＲを介して選択した。
ＡＣＥ２についての、ＤＭＳ（ｄｅｅｐ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ ＲＢＤライブラリーの前分取：各ライブラリーのアリコート１つずつを融解させ、１０ｍｌの液体抑制培地（ＳＲａｆ－ウラシル－トリプトファン）中、２８℃で、一晩にわたり増殖させた。加えて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に由来するＷＴ ＲＢＤを発現させる、ｐＥＴｃｏｎプラスミドを含有する、対照ＥＢＹ１００株を、１０ｍｌの液体抑制培地中に接種し、２８℃で、一晩にわたり増殖させた。次いで、これらの前培養物を、５０ｍｌの液体誘導培地（ＳＲａｆ／Ｇａｌ－ウラシル－トリプトファン）へと、１ｍｌ当たりのＯＤ６００を０．６７として希釈し戻し、１６時間にわたり増殖させてから採取した。
細胞ペレットを、洗浄緩衝液（緩衝液５０ｍｌ当たり、１倍濃度のＰＢＳ＋１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．２＋Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＥＤＴＡ－ｆｒｅｅ ｔａｂｌｅｔ（Ｒｏｃｈｅ）１錠）で、３回にわたり洗浄し、１ｍｌ当たりのＯＤ６００を８として、染色緩衝液（洗浄緩衝液＋０．５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン）中に９．０９ｎＭのｈＡＣＥ２－ｍｕＦｃ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）により、回転ホイール上、４℃で、１時間にわたり染色した。細胞を、染色緩衝液で、３回にわたり洗浄し、１：１００の抗ｃｍｙｃ－ＦＩＴＣ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｔｓ Ｌａｂ）、１：１０００の抗マウスＩｇＧ－ＡＦ５６８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、および１：２００のＬ／Ｄ ｅＦｌｕｏｒ５０６（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、回転ホイール上、４℃で、１時間にわたり染色した。細胞を、染色緩衝液で、３回にわたり洗浄し、３５μｍの細胞ストレーナー上で濾過してから、ＦＡＣＳＭｅｌｏｄｙ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で分取した。ＡＣＥ２＋細胞を捕捉する選択ゲートは、コンペンセーションの後、非染色対照および単一染色対照のうち、最大で０．１％の細胞が、バックグラウンドを上回って現れるように設定した。ライブラリー１つ当たり、約２５０万個のＡＣＥ２＋細胞を、各々、２倍濃度のＹＰＡＤ＋１％のＢＳＡでコーティングされた、５ｍｌポリプロピレンチューブ内に回収した。
分取された細胞は、２８℃で、７２時間にわたり、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を伴う、液体ＳＤ－トリプトファン－ウラシル培地中に回収し、１５％のグリセロール中のＯＤ６００を９単位とするアリコート中、－８０℃で瞬時凍結させた。
ＡＣＥ２分取ＤＭＳ（ｄｅｅｐ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ ＲＢＤライブラリー上における、Ｎａｎｏｂｏｄｙ回避突然変異体の分取：各ライブラリーの、ＡＣＥ２分取アリコート１つずつを融解させ、１０ｍｌの液体抑制培地（ＳＲａｆ－ウラシル－トリプトファン）中、２８℃で、一晩にわたり増殖させた。加えて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に由来するＷＴ ＲＢＤを発現させる、ｐＥＴｃｏｎプラスミドを含有する、対照ＥＢＹ１００株を、１０ｍｌの液体抑制培地中に接種し、２８℃で、一晩にわたり増殖させた。次いで、これらの前培養物を、５０ｍｌの液体誘導培地（ＳＲａｆ／Ｇａｌ－－ウラシル－トリプトファン）へと、１ｍｌ当たりのＯＤ６００を０．６７として希釈し戻し、１６時間にわたり増殖させてから採取した。
細胞ペレットを、洗浄緩衝液（作製したてで、滅菌濾過された緩衝液５０ｍｌ当たり、１倍濃度のＰＢＳ＋１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．２＋Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＥＤＴＡ－ｆｒｅｅ ｔａｂｌｅｔ（Ｒｏｃｈｅ）１錠）で、３回にわたり洗浄し、１ｍｌ当たりのＯＤ６００を８として、染色緩衝液（洗浄緩衝液＋０．５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン）中に染色されたＮａｎｏｂｏｄｙごとの特異的濃度により、回転ホイール上、４℃で、１時間にわたり染色した。とりわけ、本発明者らは、ＶＨＨ７２ｈ１ Ｓ５６Ａについて、４００ｎｇ／ｍｌで、ＶＨＨ３．１１７（エピトープマップ）について、１００ｎｇ／ｍｌで染色し、ＶＨＨ８９（エピトープマップ）について、１０ｎｇ／ｍｌで染色した。予備実験では、これらの濃度は、非突然変異ＲＢＤを提示する酵母細胞に対する最大半量（５０％）の結合を結果としてもたらすと決定した。単量体構築物のための染色プロトコールは、以下の通りである：細胞を、染色緩衝液で、３回にわたり洗浄し、１：２０００のマウス抗Ｈｉｓ（Ｂｉｏｒａｄ）により、回転ホイール上、４℃で、１時間３０分にわたり染色した。細胞を、染色緩衝液で、３回にわたり洗浄し、１：１００の抗ｃｍｙｃ－ＦＩＴＣ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｔｓ Ｌａｂ）、１：１０００の抗マウスＩｇＧ－ＡＦ５６８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、および１：２００のＬ／Ｄ ｅＦｌｕｏｒ５０６（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、回転ホイール上、４℃で、１時間にわたり染色した。染色の後、細胞を、染色緩衝液で、３回にわたり洗浄し、３５μｍの細胞ストレーナー上で濾過してから、ＦＡＣＳＭｅｌｏｄｙ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で分取した。ゲーティングは、コンペンセーションの後、完全染色ＷＴ ＲＢＤ対照のうち、最大で０．１％の細胞が、選択ゲート内に現れるように選び出した。ライブラリー１つ当たり、１５０，０００～３５０，０００個の間、または３０，０００～２００，０００個の間（実施例２８）の回避細胞を、各々、２倍濃度のＹＰＡＤ＋１％のＢＳＡでコーティングされた、５ｍｌポリプロピレンチューブ内に回収した。
分取された細胞は、２８℃で、１６時間にわたり、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充された、液体ＳＤ－トリプトファン－ウラシル培地中に回収した。
Ｎａｎｏｂｏｄｙ回避分取ＤＭＳ（ｄｅｅｐ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ ＲＢＤライブラリーに対する、ＤＮＡ抽出およびＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシング：製造元の指示書に従い、Ｚｙｍｏｐｒｅｐ ｙｅａｓｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ＩＩキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用するが、Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ酵素を伴うインキュベーションを延長（２時間）し、Ｚｙｍｏｌｙａｓｅによるインキュベーションの後に、液体窒素中の凍結－融解サイクルを追加することを例外として、分取された細胞から、プラスミドを抽出した。
試料インデックス、および残りのＩｌｌｕｍｉｎａアダプター配列を付加するように、ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲｅａｄｙＭｉｘを使用して、抽出されたプラスミドに対して、ＮＥＢＮｅｘｔ ＵＤＩプライマーを使用するＰＣＲ（２０サイクル）を実施した。ＰＣＲ試料を、ＣｌｅａｎＮＧＳ磁気ビーズ（ＣｌｅａｎＮＡ）を使用して、１回精製し、ＡＭＰｕｒｅ磁気ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、１回精製した。０．１倍濃度のＴＥ緩衝液１５μｌ中で、断片を溶出させた。Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ＮＧＳキット（ＤＮＦ－４７４、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を、１２－ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）上で使用して、サイズ分布について評価した。ＮｏｖａＳｅｑ ６０００上で、ＶＩＢ Ｎｕｃｌｅｏｍｉｃｓ Ｃｏｒｅ（Ｌｅｕｖｅｎ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）により、１００ｂｐの単一末端シーケンシングを実施した。
突然変異の回避プロファイルを使用する、シーケンシングデータの解析、およびエピトープの計算
ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｊｂｌｏｏｍｌａｂ／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ＿ＭＡＰ＿Ｃｒｏｗｅ＿ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓにおいて入手可能なコードを、補正を施して使用して、Ｇｒｅａｎｅｙら、２０２１（Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ、２９：４４～５７）により記載されている通りに、ディープシーケンシングリードを加工した。略述すると、ｄｍｓ変異体パッケージ（０．８．６）を使用して、ヌクレオチドバーコード、およびそれらの対応する突然変異をカウントした。各バーコードについての回避比率は、回避変異体についての、エンリッチメント前におけるリードの比率により除された、エンリッチメント後におけるリードの比率として規定した。公表されたデータ（Ｓｔａｒｒら、２０２０、Ｃｅｌｌ、１８２：１２９５～１３１０）に基づき、信頼できない程度に低値のカウントを除外し、十分なＲＢＤの発現、およびＡＣＥ２への結合を伴う変異体を保持するように、結果として得られる変異体をフィルタリングする。いくつかの突然変異を伴う変異体について、グローバルエピスタシスモデルにより、個別の突然変異の影響を推定し、少なくとも１つの単一突然変異体において観察されず、全体でも、２つの変異体において観察されない突然変異を除外した。結果として得られる回避測定値は、二連の実験の間における相関が良好であったので、ライブラリーにわたる平均を、さらなる解析のために使用した。各Ｎａｎｏｂｏｄｙについて、最も顕著な回避部位を決定するために、所与のＮａｎｏｂｏｄｙについて、全ての位置にわたり、回避部位総数が、＞１０×［全ての部位にわたる中央値］であり、また、回避部位総数の最大値の少なくとも１０％でもある、ＲＢＤ位置を同定した。
Ｓ１部排出アッセイ
抗体またはＶＨＨを、１０μｇ／ｍｌの最終濃度で、スパイクを発現しないか、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクを発現するＲａｊｉ細胞１００万個へと添加した。抗体－細胞混合物を、３７℃および５％のＣＯ２で、３０分間または１時間にわたりインキュベートした。インキュベーションの後、細胞を、遠心分離によりペレット化させ、上清を、新鮮なチューブへと移し、細胞ペレットを、ＲＩＰＡ溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、０．１％のＳＤＳ、１％のＮＰ－４０）により溶解させた。上清と、溶解物との２０μｌの試料を、８％のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で分離し、ニトロセルロース膜へとエレクトロブロッティングした。膜を、４％の脱脂粉乳によりブロッキングし、ウサギ抗ＳＡＲＳ－Ｓ１抗体（１／１０００、Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、４０５９１－Ｔ６２）に続き、抗ウサギＩｇＧ－ＨＲＰ（１／２０００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＮＡ９３４Ｖ）により染色し、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して現像した。
ＣＨＯ細胞内における、ＶＨＨ－Ｆｃタンパク質の産生
合成遺伝子のクローニング：全ての遺伝子は、ＩＤＴにおいてｇＢｌｏｃｋとして合成を注文した。着荷したら、ｇＢｌｏｃｋを、超純水中に、２０ｎｇ／μＬの濃度で可溶化させた。ＮＥＢＮｅｘｔ－ｄＡ－ｔａｉｌｉｎｇ ｍｏｄｕｌｅ（ＮＥＢ）を使用して、ｇＢｌｏｃｋをＡテール付加し、ＣｌｅａｎＰＣＲ磁気ビーズ（ＣｌｅａｎＮＡ）を使用して、これを精製し、ｐｃＤＮＡ３．４－ＴＯＰＯベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）内に挿入した。陽性クローンのＯＲＦを、全シーケンシングし、ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ Ｘｔｒａ Ｍｉｄｉキット（Ｍａｃｈｅｒｙ－Ｎａｇｅｌ）を使用して、選択されたクローンのｐＤＮＡを調製した。
ＣＨＯへのトランスフェクション、およびタンパク質の精製プロトコール：製造元のプロトコールに従い、ＶＨＨ－Ｆｃタンパク質を、ＥｘｐｉＣＨＯ－ＳＴＭ細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）内で発現させた。略述すると、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ試薬を使用して、３７℃および８％のＣＯ２で増殖させた、１ｍＬ当たりの細胞６×１０６個の培養物２５ｍＬに、２０μｇのｐｃＤＮＡ３．３－ＶＨＨ７２－ＦｃプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションの１日後、１５０μＬのＥｘｐｉＣＨＯ（商標）エンハンサー、および４ｍＬのＥｘｐｉＣＨＯ（商標）フィードを、細胞へと添加し、培養物を、３２℃および５％のＣＯ２で、さらにインキュベートした。トランスフェクション後５日目に、細胞を、再度フィードした。細胞の生存率が、７５％を下回ったら、速やかに、産生物を回収した。ＶＨＨ－Ｆｃタンパク質を精製するために、上清を、５ｍＬのＭＡｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。非結合タンパク質を、マッキルベイン緩衝液ｐＨ７．２で洗い流し、マッキルベイン緩衝液ｐＨ３を使用して、結合しているタンパク質を溶出させた。溶出の直後、３０％（ｖ／ｖ）の飽和Ｎａ３ＰＯ４緩衝液を使用して、タンパク質含有画分を中和した。次に、これらの画分をプールし、ＰＢＳ ｐＨ７．４との緩衝液交換のために、ＨｉＰｒｅｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラム上にロードした。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの表面上に提示された、サルベコウイルスＲＢＤに結合する抗体について調べるための、酵母細胞ＥＬＩＳＡ：クレード１、クレード２、およびクレード３の、多様なサルベコウイルスのＲＢＤを発現する、固定酵母細胞を、上記で記載した通りに調製し、ＰＢＳ中で、ＥＬＩＳＡプレート（ｔｙｐｅ ＩＩ、Ｆ９６ Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｃ）をコーティングして、約１０～２０％のコンフルエンシーを得た。ＰＢＳで、２回にわたる洗浄の後、細胞を、室温、３％のＨ２Ｏ２で、１５分間にわたり処理して、酵母ペルオキシダーゼを不活化させた。その後、プレートを、ＰＢＳで、３回にわたり洗浄し、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳで、１回洗浄した。２％のＢＳＡによる、１時間にわたるブロッキングの後、ＶＨＨ－Ｆｃタンパク質またはＨＡタグ付けＶＨＨの系列希釈液を、０．５％のＢＳＡおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳ中で調製し、細胞へと添加し、９０分間にわたりインキュベートすることを可能とした。ＰＢＳによる、２回にわたる洗浄、および０．５％のＢＳＡおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳによる、３回にわたる洗浄の後、マウス抗ＨＡタグ抗体（１２ＣＡ５、Ｓｉｇｍａ）、およびＨＲＰコンジュゲートヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥ Ｈｅｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、結合しているＶＨＨを検出した。結合しているＶＨＨ－Ｆｃは、ＨＲＰコンジュゲートウサギ抗ヒトＩｇＧ血清（Ｓｉｇｍａ、Ａ８７９２）を使用して検出した。洗浄の後、５０μＬのＴＭＢ基質（テトラメチルベンジジン、ＢＤ ＯｐｔＥＴＡ）を、プレートへと添加し、５０μＬの１ＭのＨ２ＳＯ４を添加することにより、反応を停止させた。４５０ｎＭにおける吸光度は、ｉＭａｒｋ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ Ｒａｄ）により測定した。非線形回帰を使用して、曲線への当てはめを実施した（Ｇｒａｐｈｐａｄ ８．０）。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株の、ＲＢＤ突然変異を含有するスパイクタンパク質を発現させる、ＶＳＶｄｅｌＧ偽型ウイルス粒子を作製するための、スパイクタンパク質発現ベクターの作出
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株のＲＢＤ突然変異を含有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のための、ｐＣＧ１発現ベクターは、製造元の指示書（Ａｌｉｇｅｎｔ）に従い、適切なプライマーを使用する、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ突然変異誘発を介して、特異的ＲＢＤ突然変異を逐次的に導入することにより、ｐｃＧ１－ＳＡＲＳ－２－Ｓｄｅｌ１８ベクターから作出した。オミクロンＢＡ．１変異株のための、ｐＣＧ１－ＳＡＲＳ－２－Ｓｄｅｌ１８発現ベクターのために、（Ａ６７Ｖ、Δ６９～７０、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４３～１４５、Ｎ２１１Ｉ、Δ２１２、ｉｎｓ２１５ＥＰＥ、Ｇ３３９Ｄ、Ｓ３７１Ｌ、Ｓ３７３Ｐ、Ｓ３７５Ｆ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｇ４４６Ｓ、Ｓ４７７Ｎ、Ｔ４７８Ｋ、Ｅ４８４Ａ、Ｑ４９３Ｒ、Ｇ４９６Ｓ、Ｑ４９８Ｒ、Ｎ５０１Ｙ、Ｙ５０５Ｈ、Ｔ５４７Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｎ６７９Ｋ、Ｐ６８１Ｈ、Ｎ７６４Ｋ、Ｄ７９６Ｙ、Ｎ８５６Ｋ、Ｑ９５４Ｈ、Ｎ９６９Ｋ、Ｌ９８１Ｆ）により規定される、ＢＡ．１突然変異と、これらを挟む、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩの制限部位とを含有するコドン最適化スパイクタンパク質ヌクレオチド配列を、Ｇｅｎｅａｒｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に注文し、ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ断片として、ｐＣＧ１ベクター内にクローニングした。シーケンシングの後、Ｑｉａｇｅｎ ｐｌａｓｍｉｄキットを使用して、適正なスパイクコード配列を含有するクローンを調製した。使用の前に、調製されたｐＣＧ１ベクターのスパイクコード配列を、サンガーシーケンシングにより確認した。
タンパク質についての質量分析
無傷ＶＨＨ－Ｆｃタンパク質（１０μｇ）を、まず、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ；１０ｍＭ）により、３７℃で、３０分間にわたり還元し、この後で、還元されたタンパク質を、ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＸＬ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）へとオンライン接続された、Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＨＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｒｅｍｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上で分離した。略述すると、約８μｇのタンパク質を、Ｚｏｒｂａｘ ３００ＳＢ－Ｃ１８カラム（５μｍ、３００Å、内径×全長：１×２５０ｍｍ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上に注入し、１００μｌ／分の流量で、３０分間にわたり、溶媒Ｂについて、５％～８０％の勾配（溶媒Ａ：水中に、０．１％のギ酸、および０．０５％のトリフルオロ酢酸；溶媒Ｂ：アセトニトリル中に、０．１％のギ酸、および０．０５％のトリフルオロ酢酸）を使用して分離した。カラム温度は、６０℃に維持した。溶出タンパク質を、以下のパラメータ：スプレー電圧を、４．２ｋＶとし、表面誘起解離を、３０Ｖとし、キャピラリー温度を、３２５℃とし、キャピラリー電圧を、３５Ｖとし、ステルスガス流量を、７（任意単位）とするパラメータを使用する、ＥＳＩ供給源を伴う、質量分析計内に、直接スプレーした。質量分析計は、プロファイルモードにおける分解能を、１００，０００とし（ｍ／ｚを４００としたとき）、質量範囲を、６００～４０００ｍ／ｚとする、Ｏｒｂｉｔｒａｐ解析器を使用して、ＭＳ１モードで作動させた。Ｘｔｒａｃｔデコンボリューションアルゴリズムを使用する、ＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒ（商標）３．０ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、結果として得られるＭＳスペクトルをデコンボリューションした（同位体分解スペクトル）。デコンボリューションされたスペクトルを、手作業でアノテーションした。
質量分析によるペプチドマッピング
ＶＨＨ－Ｆｃタンパク質（１５μｇ）を、５０ｍＭの重炭酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ８．５）で、１００μｌの容量まで希釈した。まず、ジチオトレイトール（ＤＴＴ；５ｍＭ）により、５５℃で、３０分間にわたり、タンパク質のジスルフィド結合を還元し、ヨードアセトアミド（ＩＡＡ；１０ｍＭ）により、室温（暗所内）で、１５分間にわたりアルキル化した。次いで、タンパク質を、ＬｙｓＣエンドプロテイナーゼ（０．２５μｇ；ＮＥＢ）により、３７℃で、４時間にわたり消化するのに続き、シーケンシンググレードのトリプシン（０．３μｇ；Ｐｒｏｍｅｇａ）により、３７℃で、１６時間にわたり消化した。消化の後、トリフルオロ酢酸を、１％の最終濃度まで添加した。ＬＣ－ＭＳ解析の前に、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）Ｃ１８ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、試料を脱塩した。まず、スピンカラムを、５０％のアセトニトリル（２倍濃度）４００μｌにより活性化させ、５％のアセトニトリル（２倍濃度）中に０．５％のトリフルオロ酢酸により平衡化させ、この後、試料を、Ｃ１８樹脂の上に、ゆっくりと添加した。各試料のフロースルーを、同じスピンカラム上に、４回にわたり再適用して、ペプチドの、樹脂への結合を最大化させた。５％のアセトニトリル（２倍濃度）中に０．５％のトリフルオロ酢酸２００μｌによる、樹脂の洗浄の後、７０％のアセトニトリル２０μｌにより、ペプチドを、２回にわたり溶出させた。脱塩ペプチド試料を、乾燥させ、２％のアセトニトリル中に、０．１％のトリフルオロ酢酸５０μｌ中で再懸濁させた。
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ解析のために、５μｌの脱塩ペプチド試料を、自社製のＣ１８カラム（ＲｅｐｒｏｓｉｌＰｕｒ Ｃ１８（Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ）、５μｍ、内径×全長：０．２５×２００ｍｍ）上に注入し、３μｌ／分の流量で、３０分間にわたり、溶媒Ｂについて、０％～７０％の勾配（溶媒Ａ：水中に、０．１％のギ酸、および０．０５％のトリフルオロ酢酸；溶媒Ｂ：７０％のアセトニトリル中に、０．１％のギ酸、および０．０５％のトリフルオロ酢酸）を使用して分離した。カラム温度は、４０℃に維持した。溶出タンパク質を、以下のパラメータ：スプレー電圧を、４．２ｋＶとし、キャピラリー温度を、２７５℃とし、キャピラリー電圧を、３５Ｖとし、ステルスガス流量を、５（任意単位）とするパラメータを使用する、ＥＳＩ供給源を伴う、ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＸＬ質量分析計内に、直接スプレーした。質量分析計は、各ＭＳスキャンにおいて、３つの最も豊富なイオンについて、ＭＳサーベイスキャンと、ＭＳ／ＭＳフラグメンテーションスキャンとを、自動的に切り替える、データ依存モードで作動させた。各ＭＳスキャン（ｍ／ｚを、２５０～３０００とする）に続き、所定の基準（最小シグナルを、５０００カウントとし、割り当てられなかった前駆体、および単一の電荷前駆体を除外する）を満たす、最大で、３段のＭＳ／ＭＳスキャン（単離域を、３Ｄａとし、ＣＩＤ衝突エネルギーを、３５％とし、活性化時間を、３０ミリ秒とする）を行った。前駆体イオンを、３０秒間の時間枠内における、２回にわたる選択後の、６０秒間にわたるＭＳ／ＭＳ選択から除外した。
結果として得られるＭＳ／ＭＳスペクトルを、ＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒ（商標）３．０ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により解析し、適切なタンパク質配列へとマッピングした。ペプチドを同定するために、以下のパラメータ：７０００Ｄａの最大ペプチド質量、５ｐｐｍの質量精度、および０．８０の最小信頼性を使用した。システインのカルバミドメチル化を、固定修飾として設定した。アスパラギンおよびグルタミンの脱アミド化、Ｎ末端グルタミンによるピログルタミン酸の形成、リシンの糖化、ならびにメチオニンおよびトリプトファンの酸化を、可変修飾として設定した。グリコシル化修飾の検索を可能とした（ＣＨＯ特異的）。ペプチド１つ当たりの可変修飾の最大数を、３に設定した。
ｃｒｙｏＥＭによる、ＳＣ２－ＶＨＨ３．８９複合体およびＳＣ２－ＶＨＨ３．１１７複合体の構造決定
試料の調製およびデータの収集：スパイクタンパク質－ＶＨＨ複合体の構造決定のために、ＶＨＨ３．８９またはＶＨＨ３．１１７を、１．３倍のモル過剰量で、Ｗｕｈａｎ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの、組換えＨｅｘａＰｒｏ安定化スパイクタンパク質（スパイク６Ｐ）へと添加した。ＥＬＭＯグロー放電システム（Ｃｏｒｄｕａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内、１１ｍＡおよび０．３ミリバールで、１分間にわたり、Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌ Ｒ．２．１ Ｃｕ４００ ｈｏｌｅｙ ｃａｒｂｏｎグリッドにグロー放電した。
ＣＰ３ ｃｒｙｏｐｌｕｎｇｅｒ（Ｇａｔａｎ）を使用して、ｃｒｙｏ－ＥＭ試料を調製した。０．７２ｍｇ／ｍｌのスパイク６Ｐ－ＶＨＨ複合体２μｌを、グリッド上に適用し、９５％の相対周囲湿度で、両側から、ワットマンＮｏ．２濾紙により、２秒間にわたりブロッティングし、液体エタン中、－１７６℃でプランジ凍結させ、液体窒素中で保管してから、データ収集を行った。
名目拡大率を、６０，０００とし、対応する較正ピクセルサイズを、０．７６Åとし、カウンティングモードで作動させられる、Ｇａｔａｎ Ｋ３直接型電子検出器を使用してｃｒｙｏ－ＥＭ画像を、ＪＥＯＬ ＣｒｙｏＡＲＭ ３００顕微鏡上で回収した。データ収集のために、１フレーム当たり１．０６ｅ－×Å－２の電子線量で、３．１１２秒間にわたる露出を、６０フレームへと線量分割した。焦点ぼけは、－０．９～－２．２μｍの間で変動した。このようにして、１２９１５および１５６６３枚のゼロ損失顕微鏡写真を、スパイク６Ｐ－ＶＨＨ３．８９複合体およびスパイク６Ｐ－ＶＨＨ３．１１７複合体のそれぞれについて記録した。
ＥＭ画像のプロセシング：線量分割動画を、ＲＥＬＩＯＮ ４．０ Ｂｅｔａにインポートし、ＲＥＬＩＯＮにより独自に（ＣＰＵベースで）実装されたＵＣＳＦ ｍｏｔｉｏｎｃｏｒ２プログラムを使用して、モーション補正した。ＣＴＦＦＩＮＤ－４．１．１４を使用して、ＣＴＦ（ｃｏｎｔｒａｓｔ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）パラメータを推定した。自動ピッキングのための参照画像は、ＬｏＧベースの自動ピッキングに続き、二次元分類を使用して、顕微鏡写真１０００枚のサブセットをピッキングすることにより作成した。これらの参照画像を、全データセットに対する、テンプレートベースのピッキングのために使用する結果として、切出しサイズを５７６ピクセルとして抽出され、１４４ピクセルへとビニングされた、スパイク６Ｐ－ＶＨＨ３．８９複合体およびスパイク６Ｐ－ＶＨＨ３．１１７複合体のそれぞれについて、粒子１８９４３３６個および６７７７０９８個のピッキングをもたらした。連続３ラウンドにわたる二次元分類を実施して、粒子スタックをクリーニングする結果として、スパイク６Ｐ－ＶＨＨ３．８９複合体およびスパイク６Ｐ－ＶＨＨ３．１１７複合体のそれぞれについて、クリーニングされた粒子スタック内の残りの粒子３９８２６４個および２３９９１８個をもたらした。これらの残りの粒子を再抽出し、２８８ピクセルへとビニングし、６つの初期３Ｄモデルを作成した。各複合体について、最も良好に３Ｄクラスに属する粒子を、ビニングせずに再抽出し、３サイクルにわたる、連続的三次元自動リファインメント、ＣＴＦリファインメント、およびアライメントを伴わない分類にかけた。スパイク６Ｐ－ＶＨＨ３．８９複合体について、分類の最終ラウンド、および三次元自動リファインメントに続くポストプロセシングの後に、粒子２２２２５８個が残る結果として、０．１４３のＦＳＣ（Ｆｏｕｒｉｅｒ ｓｈｅｌｌ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）基準に従い、名目分解能を３．１Åとするマップをもたらした。スパイク６Ｐ－ＶＨＨ３．１１７複合体について、分類の最終ラウンド、および三次元自動リファインメントに続くポストプロセシングの後に、粒子１８３８５７個が残る結果として、分解能を３．１Åとするマップをもたらした。

Claims (32)

  1. サルベコウイルススパイクタンパク質受容体結合ドメイン（ＳＰＲＢＤ）に結合し、サルベコウイルス結合剤自体が、ＳＰＲＢＤに結合している場合に、アンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）の、ＳＰＲＢＤへの結合を可能とし、少なくとも、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１を中和し、
    ・配列番号３０において規定された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸Ｔｈｒ３９３（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９３）、Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、Ｖａｌ３９５、またはＴｙｒ３９６のうちの、少なくとも１つ；および
    ・配列番号３０において規定された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸Ｌｙｓ４６２（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ａｒｇ４６２）、Ｐｈｅ４６４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｔｙｒ４６４）、Ｇｌｕ４６５（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｇｌｙ４６５）、Ａｒｇ４６６、またはＡｒｇ３５７（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｌｙｓ３５７）のうちの、少なくとも１つ
    に結合することを特徴とするサルベコウイルス結合剤。
  2. 少なくとも、アミノ酸Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、およびＴｙｒ３９６に結合する、請求項１に記載のサルベコウイルス結合剤。
  3. 配列番号３０において規定された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸Ｌｙｓ４６２（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ａｒｇ４６２）、Ｐｈｅ４６４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｔｙｒ４６４）、Ｇｌｕ４６５（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｇｌｙ４６５）、またはＡｒｇ４６６のうちの、少なくとも１つに結合する、請求項１または２に記載のサルベコウイルス結合剤。
  4. 配列番号３０において規定された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸Ｓｅｒ５１４、Ｇｌｕ５１６、またはＬｅｕ５１８のうちの、少なくとも１つにさらに結合する、請求項１～３のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤。
  5. 少なくとも、アミノ酸Ｓｅｒ５１４およびＧｌｕ５１６に結合する、請求項４に記載のサルベコウイルス結合剤。
  6. 配列番号３０において規定された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸Ａｒｇ３５５に、さらに結合する、請求項１～５のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤。
  7. サルベコウイルススパイクタンパク質受容体結合ドメイン（ＳＰＲＢＤ）に結合し、サルベコウイルス結合剤自体が、ＳＰＲＢＤに結合している場合に、アンジオテンシン転換酵素２（ＡＣＥ２）の、ＳＰＲＢＤへの結合を可能とし、少なくとも、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１を中和し、配列番号３０において規定された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のアミノ酸Ａｓｎ３９４（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｓｅｒ３９４）、Ｔｙｒ３９６、Ｐｈｅ４６４、Ｓｅｒ５１４、Ｇｌｕ５１６、およびＡｒｇ３５５のうちの、少なくとも１つ、または優先順位が増大する順に、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つに結合し；
    任意選択で、アミノ酸Ａｒｇ３５７（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｌｙｓ３５７）、および／またはＬｙｓ４６２（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ａｒｇ４６２）、および／またはＧｌｕ４６５（または、代替的に、一部のサルベコウイルスでは、Ｇｌｙ４６５）、および／またはＡｒｇ４６６、および／またはＬｅｕ５１８にさらに結合する
    ことを特徴とするサルベコウイルス結合剤。
  8. 配列番号３０において規定された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の、Ｎ４３９、Ｋ４１７、Ｓ４７７、Ｌ４５２、Ｔ４７８、Ｅ４８４、Ｐ３８４、Ｎ５０１、および／またはＤ６１４位において、突然変異を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株を中和する、請求項１～７のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤。
  9. 偽型ウイルス中和アッセイにおいて、１０μｇ／ｍＬまたはこれ未満のＩＣ５０で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株、および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１を中和する、請求項１～８のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤。
  10. Ｓ１部の排出を誘導する、請求項１～９のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤。
  11. サルベコウイルス結合剤自体が、ＳＰＲＢＤに結合している場合に、抗体ＶＨＨ７２、Ｓ３０９、またはＣＢ６の、ＳＰＲＢＤへの結合を、さらに可能とする、請求項１～１０のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤。
  12. ＩＳＶＤ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）、またはその機能的部分を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤。
  13. 配列番号１～５、または配列番号５３～５５のうちのいずれかに存在し、Ｋａｂａｔ、ＭａｃＣａｌｌｕｍ、ＩＭＧＴ、ＡｂＭ、またはＣｈｏｔｈｉａに従いアノテーションされる相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むことを特徴とする、請求項１～１２のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤。
  14. ＣＤＲ１が、配列番号６により規定され、ＣＤＲ２が、配列番号７により規定され、ＣＤＲ３が、配列番号８により規定され、アノテーションが、Ｋａｂａｔに従う、請求項１３に記載のサルベコウイルス結合剤。
  15. ＣＤＲ１が、配列番号９または１０により規定される配列から選択され、ＣＤＲ２が、配列番号１１～１４により規定される配列から選択され、ＣＤＲ３が、配列番号１５または１６により規定される配列から選択される、請求項１４に記載のサルベコウイルス結合剤。
  16. 配列番号１７により規定されるフレームワーク領域１（ＦＲ１）、配列番号１８により規定されるＦＲ２、配列番号１９により規定されるＦＲ３、および配列番号２０により規定されるＦＲ４；または
    配列番号２１～２３により規定される配列から選択されるＦＲ１、配列番号１８により規定されるＦＲ２、配列番号２４～２７により規定される配列から選択されるＦＲ３、および配列番号２８または２９により規定される配列から選択されるＦＲ４；または
    併せて、配列番号２１～２３により規定される配列から選択されるＦＲ１、配列番号１８により規定されるＦＲ２、配列番号２４～２７により規定される配列から選択されるＦＲ３、および配列番号２８または２９により規定される配列から選択されるＦＲ４の組合せに対する、少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を有する、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４の領域
    をさらに含む、
    請求項１３～１５のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤。
  17. 配列番号１～５のうちのいずれかにより規定されるか、または配列番号１～５のうちのいずれかに対する、少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有する、任意のアミノ酸配列により規定されるＩＳＶＤ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）を含むか、またはこれらからなり、同一でないアミノ酸が、１つまたは複数のＦＲ内に配置された、請求項１３～１６のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤。
  18. ＣＤＲ１が、配列番号７６により規定され、ＣＤＲ２が、配列番号７７により規定され、ＣＤＲ３が、配列番号７８により規定され、アノテーションが、Ｋａｂａｔに従う、請求項１３に記載のサルベコウイルス結合剤。
  19. ＣＤＲ１が、配列番号６９または７０により規定される配列から選択され、ＣＤＲ２が、配列番号７１または８２により規定される配列から選択され、ＣＤＲ３が、配列番号７３～７５により規定される配列から選択される、請求項１８に記載のサルベコウイルス結合剤。
  20. 配列番号８２により規定されるフレームワーク領域１（ＦＲ１）、配列番号８６により規定されるＦＲ２、配列番号９０により規定されるＦＲ３、および配列番号９４により規定されるＦＲ４；または
    配列番号７９～８１により規定される配列から選択されるＦＲ１、配列番号８３～８５により規定される配列から選択されるＦＲ２、配列番号８７～８９により規定される配列から選択されるＦＲ３、および配列番号９１～９３により規定される配列から選択されるＦＲ４；または
    併せて、配列番号１９～８１により規定される配列から選択されるＦＲ１、配列番号８３～８５により規定される配列から選択されるＦＲ２、配列番号８７～８９により規定される配列から選択されるＦＲ３、および配列番号９１～９３により規定される配列から選択されるＦＲ４の組合せに対する、少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を有する、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４の領域
    をさらに含む、
    請求項１８または１９に記載のサルベコウイルス結合剤。
  21. 配列番号５３～５５のうちのいずれかにより規定されるか、または配列番号５３～５５のうちのいずれかに対する、少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有する、任意のアミノ酸配列により規定されるＩＳＶＤ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）を含むか、またはこれらからなり、同一でないアミノ酸が、１つまたは複数のＦＲ内に配置された、請求項１８～２０のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤。
  22. 請求項１～２１のいずれか一項に記載の結合剤のうちの１つまたは複数が、直接、またはリンカーを介して融合され、好ましくは、Ｆｃドメインを介して融合された多価サルベコウイルス結合剤または多特異性サルベコウイルス結合剤。
  23. 請求項１２～２１のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤をコードする単離核酸。
  24. 請求項２３に記載の核酸を含む組換えベクター。
  25. 請求項１～２１のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤、請求項２２に記載の多価サルベコウイルス結合剤もしくは多特異性サルベコウイルス結合剤、請求項２３に記載の単離核酸、および／または請求項２４に記載の組換えベクターを含む医薬組成物。
  26. 医薬としての使用のための、請求項１～２１のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤、請求項２２に記載の多価サルベコウイルス結合剤もしくは多特異性サルベコウイルス結合剤、請求項２３に記載の単離核酸、請求項２４に記載の組換えベクター、または請求項２５に記載の医薬組成物。
  27. サルベコウイルス感染の処置における使用のための、請求項１～２１のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤、請求項２２に記載の多価サルベコウイルス結合剤もしくは多特異性サルベコウイルス結合剤、請求項２３に記載の単離核酸、請求項２４に記載の組換えベクター、または請求項２５に記載の医薬組成物。
  28. 対象の受動免疫化における使用のための、請求項１～２１のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤、請求項２２に記載の多価サルベコウイルス結合剤もしくは多特異性サルベコウイルス結合剤、請求項２３に記載の単離核酸、請求項２４に記載の組換えベクター、または請求項２５に記載の医薬組成物。
  29. 対象が、サルベコウイルス感染を有するか、または対象が、サルベコウイルス感染を有さない、請求項２８に記載の使用のための、サルベコウイルス結合剤、単離核酸、組換えベクター、または医薬組成物。
  30. サルベコウイルス感染の診断における使用のための、請求項１～２１のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤、または請求項２２に記載の多価サルベコウイルス結合剤もしくは多特異性サルベコウイルス結合剤。
  31. 診断用キットの製造における使用のための、請求項１～２１のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤、請求項２２に記載の多価サルベコウイルス結合剤もしくは多特異性サルベコウイルス結合剤、請求項２３に記載の単離核酸、または請求項２４に記載の組換えベクター。
  32. サルベコウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、請求項１～３１のいずれか一項に記載のサルベコウイルス結合剤。
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