JP2014511378A - Pcsk9アンタゴニスト - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、全目的のために参照により組み込んだ2011年2月11日出願の米国特許仮出願第61/442,126号の優先権の利益を主張する。
本発明は、PCSK9に対する抗体アンタゴニストに関する。
低密度リポタンパク質受容体(LDL−R)は、血流中の低密度リポタンパク質(LDL)のクリアランスを介してアテローム性動脈硬化および高コレステロール血症を防止する。LDL−Rは、プロタンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン9a型(「PCSK9」)により翻訳後のレベルが調節される。最近、PCSK9のノックアウトがマウスにおいて報告された。これらのマウスは、血漿コレステロールレベルにおいて約50%の低下を示し、血漿コレステロール低下においてスタチンに対する高い感受性を示した(Rashid Sら (2005) Proc Natl Acad Sci 102:5374-5379。ヒトの遺伝子データはまた、LDLホメオスタシスにおけるPCSK9の役割をサポートする。おそらくPCSK9の「機能損失」突然変異と考えられる2つの変異が最近同定された。これらの突然変異を有する個体は、LDL−Cの血漿レベルにおいて約40%の低下を有し、このことは冠動脈心疾患において約50〜90%の減少となることを意味している。考え合わせると、これらの試験は、PCSK9のインヒビターがLDL−Cの血漿濃度およびPCSK9により媒介される他の疾患状態を軽減するために有益であり、効率を高めるために、例えば、コレステロールを低下させるために有用である第2の薬剤と共投与することができることを示す。
本発明は、プロタンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン9型(PCSK9)(例えば、配列番号43)に結合し、その機能をアンタゴナイズする抗体および、例えば、PCSK9により媒介される疾患状態を処置するためにこのような抗体を使用するための方法を提供する。
a)ヒト重鎖V−セグメント、重鎖相補性決定領域3(CDR3)および重鎖フレームワーク領域4(FR4)を含む重鎖可変領域;ならびに、
b)ヒト軽鎖V−セグメント、軽鎖CDR3および軽鎖FR4を含む軽鎖可変領域を含み、
i)重鎖CDR3可変領域がアミノ酸配列ITTEGGFAY(配列番号:17)を含み;そして、
ii)軽鎖CDR3可変領域がアミノ酸配列QQSNYWPLT(配列番号:24)を含む。
i)重鎖V−セグメントのCDR1は、配列番号:15のアミノ酸配列を含み;
ii)重鎖V−セグメントのCDR2は、配列番号:16のアミノ酸配列を含み;
iii)軽鎖V−セグメントのCDR1は、配列番号:20のアミノ酸配列を含み;そして、
iv)軽鎖V−セグメントのCDR2は、配列番号:23のアミノ酸配列を含む。
i)重鎖V−セグメントのCDR1は配列番号:14を含み;
ii)重鎖V−セグメントのCDR2は配列番号:16を含み;
iii)重鎖CDR3は配列番号:17を含み;
iv)軽鎖V−セグメントのCDR1は配列番号:19を含み;
v)軽鎖V−セグメントのCDR2は配列番号:22を含み;そして
vi)軽鎖CDR3は配列番号:24を含む。
「抗体」は、免疫グロブリンファミリーのポリペプチドまたは非共有的に、可逆的に、かつ特異的な様式で対応する抗原に結合することができる免疫グロブリンのフラグメントを含むポリペプチドを示す。典型的な抗体構造単位は、テトラマーを含む。それぞれのテトラマーは、2つの同一の対のポリペプチド鎖から構成され、それぞれの対は、ジスルフィド結合を介して接続される1つの「軽」鎖(約25kD)および1つの「重」鎖(約50−70kD)を有する。認識される免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμ定常領域遺伝子ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖は、κまたはλのいずれかに分類される。重鎖は、γ、μ、α、δまたはεに分類され、これらは、順に、それぞれ、免疫グロブリンクラス、IgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEを定義する。それぞれの鎖のN末端は、抗原認識に主に関与する約100から110またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を定義する。可変軽鎖(VL)および可変重鎖(VH)なる用語は、それぞれ、軽鎖および重鎖のこれらの領域を示す。本出願において使用されるとき、「抗体」は、特に、例えば、PCSK9に対して、特定の結合性を有する抗体およびそのフラグメントの変種全てを包含する。したがって、全長抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体(ScFv)、Fab、Fab’および同じ結合特異性を有するこれらのフラグメントの多量体バージョン(例えば、F(ab’)2)は、この概念の範囲内である。
1)アラニン(A)、グリシン(G);
2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
4)アルギニン(R)、リジン(K);
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);
7)セリン(S)、スレオニン(T);および
8)システイン(C)、メチオニン(M)(例えば、Creighton, Proteins (1984)参照)。
I.イントロダクション
本発明の抗体および抗原結合分子は、プロタンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン9a型(「PCSK9」)に特異的に結合する。本発明の抗PCSK9抗体および抗原結合分子は、PCSK9の触媒ドメインに結合し、PCSK9/低比重リポタンパク質受容体(LDL−R)複合体を破壊させ、それにより、細胞性LDL−RおよびLDLの更新(update)のPCSK9媒介下方調節を防止する。特に、抗PCSK9抗体および抗原結合分子は、PCSK9の触媒ドメインに位置するPCSK9の残基159−182内のエピトープ、例えば、アミノ酸配列ERITPPRYRADEYQPPDGGSLVE(配列番号:42)内のエピトープに結合する。本発明の抗PCSK9抗体および抗原結合分子は、PCSK9と低密度脂質受容体(LDLR)との相互作用を防止、低下および/または阻害し、LDL−RのPCSK9媒介分解を防止、低下および/または阻害し、それにより低比重リポタンパク質コレステロール(LDL−C)の取り込み増加を促進する、PCSK9のアンタゴニストである。抗PCSK9抗体および抗原結合分子の、例えば、脂質異常症、高コレステロール血症、トリグリセリド血症および他のPCSK9媒介病的状態に罹患している対象の処置における使用が見出される。
抗PCSK9抗体フラグメントは、当分野で知られている任意の手段、限定はしないが、例えば、組換え発現、化学合成および抗体テトラマーの酵素消化により生産することができ、完全長モノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマまたは組換え生産により得ることができる。組換え発現は、当分野で知られている任意の適当な宿主細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞など由来である。存在するとき、抗PCSK9抗体の定常領域は、任意の型またはサブタイプであり得、適当なとき、本発明の方法により処置される対象の種(例えば、ヒト、非ヒト霊長類または他の哺乳動物、例えば、農業用哺乳動物(例えば、ウマ、ヒツジ、ウシ、ブタ、ラクダ)、家庭用哺乳動物(例えば、イヌ、ネコ)または齧歯動物(例えば、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ)由来から選択され得る。いくつかの態様において、抗PCSK9抗体は、ヒト化またはHumaneeredTMされる。いくつかの態様において、定常領域アイソタイプは、IgG、例えば、IgG1である。いくつかの態様において、ヒトIgG1定常領域は、細胞または補体のC1成分上のFc受容体(FcR)、例えば、FcガンマR1のようなエフェクターリガンドに対する結合親和性を低下させるように変異される。例えば、米国特許第5,624,821号参照。このような突然変異を含む抗体は、抗体依存性細胞毒性(ADCC)または補体依存性細胞毒性(CDC)の低下または欠如をもたらす。いくつかの態様において、IgG1定常領域のアミノ酸残基L234およびL235は、Ala234およびAla235に置換される。重鎖定常領域における残基の番号付けは、EUインデックスの番号付けである(Kabatら (1983) “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” U.S. Dept. Health and Human Services参照)。例えば、Woodleら Transplantation (1999) 68(5):608-616; Xuら Cell Immunol (2000) 200(1):16-26;およびHezarehら J Virol 75(24):12161-8も参照。
i)重鎖CDR3は、アミノ酸配列ITTEGGFAY(配列番号:17)を含み;そして、
ii)軽鎖CDR3可変領域は、アミノ酸配列QQSNYWPLT(配列番号:24)を含む。
アンタゴニスト抗体は、抗PCSK9抗体を作製し、次に、PCSK9媒介事象、例えば、LDLRに結合すること、LDLRの分解を促進することを減少または阻害する能力について、それぞれの抗体を試験することにより同定することができる。アッセイは、インビトロまたはインビボで行うことができる。典型的な抗体は、PCSK9に結合し、PCSK9がLDLRと複合体を形成することを妨げ、LDLRのPCSK9媒介分解を減少または阻害する。
本発明は、薬学的に許容される担体と共に製剤化された本発明の抗PCSK9抗体または抗原結合分子を含む医薬組成物を提供する。組成物は、さらに、所定の障害を処理または予防するために適当である他の治療剤を含む。薬学的担体は、組成物を増強もしくは安定化するか、または組成物の調製を容易にする。薬学的に許容される担体は、生理学的に適合性である溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを含む。
A.抗PCSK9抗体での処置に対する対象状態
本発明の抗PCSK9アンタゴニスト抗体および抗原結合分子は、PCSK9の活性または過剰活性が介在するあらゆる病的状態の処置における用途が見出される。
医師または獣医は、医薬組成物において使用される本発明の抗体の投与を、所望の治療効果をなし遂げるために必要であるレベルよりも少ないレベルで開始し、所望の効果がなし遂げられるまで用量を徐々に増加させることができる。一般的に、本発明の組成物の有効用量は、多数の異なる因子、例えば、処置される特定の疾患または状態、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトまたは動物であるか、他の投与される薬物、および処置が予防または治療であるかに依存して変化する。処置用量は、安全性および有効性を最適化するように用量設定する必要がある。抗体での投与において、用量は、約0.0001から100mg/kg、さらに通常、0.01から5mg/kg宿主体重の範囲である。例えば、投与は、1mg/kg体重または10mg/kg体重、または1−10mg/kgの範囲内であり得る。投与は、毎日、毎週、2週間毎、毎月または、必要なとき、または望ましいとき、それより多く、または少なくであり得る。典型的な処置レジメンは、週1回、2週間に1回または月1回または3から6ヵ月に1回の投与を必要とする。
PCSK9抗体アンタゴニストは、コレステロール、例えば、LDL−C、非HDL−Cおよび総コレステロールを低下させる、および/またはHDL−Cを上昇させるために有益であることが知られている薬剤と組み合わせて使用することができる。
本発明の医薬組成物は、キットにおいて提供することができる。1つの態様において、本発明のキットは、本明細書に記載されている本発明の抗PCSK9アンタゴニスト抗体または抗原結合分子を含む。抗PCSK9抗体または抗原結合分子は、一定のまたは様々な用量において提供することができる。
以下の実施例は、説明するために提供するが、本発明を限定しない。
要約
PCSK9に対する機能性抗体アンタゴニストを作製するために試験を行った。タンパク質のHisタグ型に結合することができる抗体を分泌する多数のハイブリドーマを同定した。ハイブリドーマからの抗体を、これらの細胞のLDLコレステロールを取り込む増加した能力をもたらすHepG2細胞上のLDL受容体のPCSK9媒介分解を阻害する能力により測定される機能性アンタゴニスト活性について評価した。強力な機能性マウス抗ヒトPCSK9 IgG1−カッパモノクローナル抗体を同定し、MAB1と称した。
抗原および他のタンパク質
ヒトPCSK9タンパク質を分泌する安定な発現細胞系を、HEK293 FreestyleTM細胞(Invitrogen, Carlsbad, Ca)のトランスフェクションにより産生した。簡潔には、BioCoatフラスコ(Becton Dickinson)上に接着様式において、FreestyleTM培地(Invitrogen)プラス10%のウシ胎仔血清中で培養された細胞を、リポフェクタミン 2000TMトランスフェクション試薬およびメリチン(mellittin)シグナル配列を特徴とする組換えプラスミド、成熟Pcsk9 cDNA(aa31−692)および配列のC−末端のhis6タグ(E.Hampton、GNF、NPL 010051によってクローニング)を使用してトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、陽性トランスフェクタントの選択を、100μg/mLのZeocinを培養培地に添加することにより開始した。4週間後、Pcsk9−生産細胞の4つの安定な細胞プールが現れた。最も産生が多いプール4を、FreestyleTM培地中で無血清懸濁条件に適応させ、次に、10−20L生産容量の規模でWaveTMバイオリアクターを使用して大規模生産のためにスケールアップした。
ハイブリドーマを作製し、融合後10日間、ハイブリドーマプレートをPcsk9特異的抗体の存在についてスクリーニングした。ELISAスクリーニングのため、Maxisorp 384−ウェルプレート(Nunc #464718)を、50μLのPcsk9(PBSで15ng/ウェルに希釈)でコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。残存するタンパク質を吸引し、ウェルをPBS中の1%のBSAでブロックした。室温で30分間インキュベーション後、ウェルをPBS+0.05% Tween(PBST)で4回洗浄した。15μLのハイブリドーマ上清をELISAプレートに移した。PLNを取り出す時に得た15μLのマウス血清を、PBSで1:1000希釈し、陽性コントロールとして加えた。PBST。50μLの二次抗体(ヤギ抗マウスIgG−HRP(Jackson Immuno Research #115-035-071)、PBSで1:5000希釈)を、ELISAプレート上の全てのウェルに加えた。室温で1時間インキュベーション後、プレートをPBSTで8回洗浄した。25μLのTMB(KPL #50−76−05)を加え、室温で30分インキュベーション後、プレートを605nmの吸光度で読んだ。陽性ウェルからの細胞を、24−ウェルプレートにHT培地(DMEM+20%のFBS、Pen/Strep/Glu、1xNEAA、1xHT、0.5xHFCS)中で拡大した。
MAB1を含む上清を、プロテインG(Upstate # 16-266 (Billerica, MA))を使用して精製した。上清を負荷する前に、樹脂を10カラム容量のPBSで平衡化した。サンプルの結合後、カラムを10カラム容量のPBSで洗浄し、次に、抗体を5カラム容量の0.1Mのグリシン、pH2.0で溶離した。カラム画分を、1/10の容量のTris HCl、pH9.0で即座に中和した。OD280の画分を測定し、陽性画分をプールし、PBS、pH7.2対して一晩透析した。
Pcsk9の連続希釈物を作製し、抗体をそれぞれの抗原濃度に加え、100pMの抗体定常濃度に達した。100μL/ウェルのそれぞれの希釈物混合物を、96−ウェルポリプロピレンマイクロタイタープレート(Greiner)にデュプリケートで分配した。該プレートを密閉し、室温で一晩インキュベートした。96−ウェル標準結合マイクロタイタープレート(Meso Scale Discovery)を、PBSで希釈された25μLの1μg/mLのPcsk9でコーティングした。該プレートを密閉し、4℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、抗原被覆標準結合マイクロタイタープレートを、ウェルあたり200μLのPBS/0.05%(w/v)Tween 20で3回洗浄した。次に、プレートを150μL/ウェルのPBS/5%(w/v)BSAでブロックし、室温で1時間震盪しながらインキュベートした。洗浄工程を繰り返し、ポリプロピレンマイクロタイタープレートからの25μL/ウェルの抗体−抗原調製物を、抗原被覆標準結合プレートに移した。標準結合プレートを、室温で60分間震盪しながらインキュベートした。3回さらなる洗浄工程後、PBS/1%(w/v)BSA/0.05%(w/v)Tween20バッファーにおいて希釈された25μLの1μg/mLのSulfo−タグ−標識ヤギ抗マウス検出抗体(R32AC-5, Meso Scale Discovery)を、それぞれのウェルに加え、室温で1時間震盪しながらインキュベートした。プレートを3回洗浄後、150μLの2X Read Buffer(R92TC-1, Meso Scale Discovery)をそれぞれのウェルに移した。電気化学発光シグナルを発生させ、Sector Imager 6000(Meso Scale Discovery)により検出した。電気化学発光データを、プリズムソフトウェア(prism software)および以下の式を使用して、エクスポートおよび処理した:
TR−FRETアッセイを、浅い384−ウェル白色プレート(Perkin Elmer, 6008280)において実施した。hPcsk9−AF(10.7nM)を、15μLのアッセイバッファー(20mMのHEPES、pH7.2、150mMのNaCl、1mMのCaCl2、0.1% v/v Tween 20および0.1% w/v BSA)中で、標識していないhPcsk9タンパク質およびMAB1、MAB2またはMAB3抗体の連続希釈物と、室温で30分間インキュベートした。次に、hPcsk9および予めインキュベートした抗体複合体へのアッセイバッファー中の5μLのhLDL−R−Eu(4nM)の添加、ならびに室温で90分間インキュベートした。これらの標識タンパク質の最終濃度は、8nMのhPcsk9−AFおよび1nMのhLDL−R−Euであった。TR−FRETシグナルを、330nm励起および665nm放出にてEnVision 2100 マルチラベルリーダー(Perkin Elmer)で測定した。データを、以下の式:[(665nm値x10,000)/(615nm値)]を使用して正規化値に変換した。パーセント阻害は、以下の式:100−[(処理サンプルの正規化値/未処理サンプルの平均正規化値)x100]で計算した。パーセント阻害用量応答曲線は、Prism version 5を使用して、式、Y=最小(Bottom)+(最大(Top)−最小(Bottom))/(1+10^((LogIC50−X)*HillSlope))でプロットした(GraphPad Prism Software)。
HepG2細胞をトリプシン処理し、1% v/v コラーゲンで予めコーティングされた平底96−ウェルプレート(Corning, 3595)において100μLの培養培地にウェルあたり6x104個の細胞で播種し、次に、37℃で5% CO2で24時間インキュベートした。一般的に、細胞を、hPcsk9タンパク質およびMAB1、MAB2またはMAB3抗体のいずれかを含む100μLの無血清培地で処理した。処理後、培地を捨て、細胞を100μLのPBSで洗浄した。細胞を回収するために、100μLのVersine(Biowhittaker, 17-771E)を加え、37℃で5% CO2で1時間インキュベートし、次に、100μLのFACSバッファーを加えた。細胞を、V−底96−ウェルプレート(Corning, 3894)に移し、1200rpmで5分間遠心し、細胞をペレットにした。細胞上の非特異的結合部位をブロックするために、FACSバッファー中の50μLの100μg/mLの正常ウサギIgG(MP biomedicals, 55944)およびマウスIgG(Sigma, I5381)をそれぞれのウェルに加え、氷中で30分間インキュベートした。細胞を1200rpmで5分間遠心し、プレートをたたくことにより、バッファーを除去した。細胞を標識するために、FACSバッファー中の10μLのウサギ抗−hLDL−R−Alexa 647 IgG(5μg/mL)および10μLのマウス抗−トランスフェリン−R−フィコエリトリン(PE)IgG(2μg/mL)(CD71, Becton Dickinson Biosciences, 624048)標識抗体をそれぞれのウェルに加え、氷中で60分間インキュベートした。細胞を1200rpmで5分間遠心し、プレートをたたくことにより、バッファーを除去した。結合していない抗体を、ウェルあたり200μLのFACSバッファーで細胞を2回洗浄することにより、除去した。細胞を、PBS中の1%パラホルムアルデヒドで固定し、生存細胞をゲーティングし(5000)、BD LSR IIフローサイトメーターおよびFACSDIVAソフトウェア(Becton Dickinson)を使用して分析した。PE蛍光の中央値は、488nmの励起および575nmの放出で測定した。Alexa647蛍光の中央値は、488nmの励起および633nmの放出で測定した。特注のウサギ抗hLDL−RポリクローナルIgG583を、HepG2細胞上の表面hLDL−RのFACS検出のために、Covance(Denver, PA, USA)により特別生産した。ウサギ抗hLDL−R IgG583は、正常ウサギIgGと比較して、HepG2細胞の表面上のhLDL−Rの検出について約7倍のウインドウを示した。HepG2細胞の表面上のLDL−Rに対する抗hLDL−R IgG583の特異性を決定するために、該IgGの結合に対する競合相手としてhLDL−Rタンパク質を使用して実験を行った。HepG2細胞に対する抗hLDL−R IgG583の平均培地蛍光における用量依存的増加が、hLDL−Rタンパク質の濃度増加につれて観察した。これは、FACSにより測定されるとき、抗hLDL−R IgG 583がHepG2細胞の表面上のLDL−Rを特異的に認識することを証明する。HepG2細胞の表面上のLDL−RのFACS定量化のために、その後の試験は、直接標識した抗hLDL−R−583−Alexa 647 IgGを使用した。
HepG2細胞をトリプシン処理し、平底96−ウェルプレート(Corning、3595、1%のv/v コラーゲンで予めコーティングされている)において100μLの培養培地中でウェルあたり6x104個の細胞で播種し、次に、37℃で5%CO2で24時間インキュベートした。特に記載がない限り、細胞を、hPcsk9タンパク質およびMAB1、MAB2またはMAB3抗体を含む100μLの無血清培地で処理した。処理後、それぞれのウェルに、無血清培地中の20μLの30μg/mLの3,3’−ジオクタデシルインドカルボシアニン−標識低密度リポタンパク質(DiI−LDL)(Intracell、RP−077−175)を与え、37℃で5%CO2で2時間インキュベートした。プレートをたたくことにより培地を除去し、細胞を100μLのリン酸緩衝生理食塩水(カルシウムまたはマグネシウムなしのPBS、Invitrogen、14190−144)で洗浄した。プレートをたたくことによりPBSを除去し、100μLの0.25%トリプシン−EDTAをそれぞれのウェルに加え、37℃で5%CO2で5分間インキュベートした。100μLのFACSバッファー(5%のFBS、2mMのEDTAおよび0.2%のアジ化ナトリウムを含むPBS)をそれぞれのウェルに加え、細胞を1200rpmで5分間遠心分離によりペレット化した。プレートをたたくことにより培地を廃棄し、ウェルあたりPBS中の50μLの1%パラホルムアルデヒド(Elwctron Microscopy Sciences, 15710)の添加により細胞を固定した。生存細胞をゲーティングし、BD LSR IIフローサイトメーターおよびFACSDIVAソフトウェア(Becton Dickinson)を使用して分析した。DiI−LDL蛍光の中央値を488nmの励起および575nmの放出で測定し、5000個の細胞を分析した。棒グラフを、Microsoft Excel 2002(Microsoft Corporation)を使用して作成した。活性化のパーセントは以下のとおりに計算した、%活性化=[1−(X÷A)]x100、式中、X=サンプルウェルから読んだ培地蛍光、およびA=hPcsk9処理のみでのウェルから読んだ培地蛍光。
抗ヒトPCSK9モノクローナル抗体の作製
B細胞を、Pcsk9タンパク質で免疫化した動物の一次リンパ節から回収した。ハイブリドーマを、標準PEG媒介融合を使用して作製した。得られた融合物をELISAによりアッセイし、ヒトPCSK9に陽性結合物を同定し、増殖させ、上清を作製した。強力な機能性マウス抗ヒトPCSK9 IgG1−カッパモノクローナル抗体を同定し、MAB1と称した。
MAB1特異性を、一連の他のタンパク質への結合をELISAにおいて評価することにより試験した。6つの他のタンパク質へのMAB1の結合を、Pcsk9−HISへの結合と比較した。これは、Pcsk9への結合が特異的であり、該抗体がHISタグに結合しないことを示す。
Pcsk9のカニクイザルホモログへのMAB1の結合を決定した。このアッセイにおいて、カニクイザルHIS−タグ付きPcsk9を発現する細胞由来の上清を、Ni捕捉プレートと共に利用し、材料を精製する必要性を回避した。ヒトPCSK9を希釈し、また、そのHIS−タグを介して捕捉した。MAB1は、ヒトおよびカニクイザルPcsk9の両方に結合することができる。
ヒトPCSK9タンパク質を認識するマウス抗体MAB1を、溶液平衡滴定(SET)を使用することにより、その結合親和性について分析した。MAB1は、組換えヒトPCSK9にナノモル以下の親和性(Kd=270pM)で高親和性で結合することが見出された。
TR−FRETアッセイを、抗−hPcsk9抗体MAB1がhPcsk9−AFおよびhLDL−R−Eu標識タンパク質間の相互作用を破壊させることができるか否かを決定するために使用した。アッセイがhLDL−R−EuおよびhPcsk9−AF標識タンパク質の相互作用により産生されるTR−FRETシグナルの破壊を検出することができることを証明するために、非標識hPcsk9タンパク質またはEGF−Aペプチドを評価した。非標識hPcsk9の濃度を増加させると、hLDL−R−Euへの結合に対してhPcsk9−AFと競合し、TR−FRETシグナルの減少を引き起こした。EGF−Aペプチドは、2.5μMのIC50で、hLDL−R−EuおよびhPcsk9−AF間の相互作用を破壊した。MAB1は、IC50=77nMで、hPcsk9−EuおよびhLDL−R−AF間のTR−FRETシグナルを破壊した。
LDL−RへのPcsk9結合は、LDL−R分解を引き起こすことが示されており、これを、HepG2細胞および組換えヒトPCSK9を使用して確認した。MAB1がPcsk9に結合し、該効果をブロックする能力を決定した。MAB1は、外因性hPcsk9で処理したHepG2細胞における該効果を阻害し、細胞表面LDL−Rの増加を引き起こした。
LDL−RのPcsk9分解の阻害は、HepG2細胞がLDL−Cを内在化する能力を回復させる。MAB1は、外因性hPcsk9で処理されたHepG2細胞でのPCSK9媒介LDL−R分解を防止し、194nMのEC50でDiI−LDL−摂取取り込みを増加させた。
要約
本実施例は、ヒト生殖細胞系列抗体とより良い配列相同性を有するように、マウスモノクローナルPCSK9アンタゴニスト抗体MAB1を操作することによるヒト抗体MAB2およびMAB3の作製を示す。MAB2およびMAB3は、親マウス抗体のエピトープ特異性、親和性およびカニクイザルマカクザルPCSK9交差反応性を保持する。MAB2およびMAB3は、元のマウス抗体よりもヒト生殖細胞系列配列とより高い相同性を有し、したがって、ヒト免疫系によりより良い耐性であるはずである。
マウスV−領域のクローニング
マウスモノクローナルMAB1のV−領域DNAを、標準方法を使用して、ハイブリドーマ細胞系から単離されたRNAからRT−PCRにより増幅した。ハイブリドーマcDNA由来の重鎖可変領域のPCR増幅のために成功裏に使用されたプライマーは、VH8(5’−GTCCCTGCATATGTCYT−3’;配列番号:50)(Chardes Tら 1999)およびHC定常部(5’−GCGTCTAGAAYCTCCACACACAGGRRCCAGTGGATAGAC−3’;配列番号:51)であった。ハイブリドーマcDNA由来の軽(カッパ)鎖可変領域のPCR増幅のために成功裏に使用されたプライマーは、Vκ23(5’−CTGGAYTYCAGCCTCCAGA−3’;配列番号:52)(Chardes Tら 1999)およびLC定常部(5’−GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGG−3’;配列番号:53)であった。増幅された重鎖および軽鎖可変領域をシーケンシングした。次に、PCRを使用して、V−遺伝子を増幅し、クローニングのために制限酵素部位をKaloBiosベクターに組み込んだ:NcoI(5’)およびNheI(3’)でVhをKB1292−Hisに(C−末端フレキシブルな(flexible)リンカーおよびCH1上のアミノ酸配列AAGASHHHHHH(配列番号:54)の6−His(配列番号:45)タグをコードするKB1292の修飾バージョン);NcoI(5’)およびBsiWI(3’)でVkをKB1296に。次に、BssHIIおよびClaIでの制限消化およびライゲーションにより、これらの別々の重鎖および軽鎖ベクターを、単一の二シストロン性KaloBios Fab 発現ベクターに混合した。Fabフラグメントを、該ベクターから大腸菌において発現させた。該FabをPCSK9−抗原結合について試験し、参照Fab SR101−B1と称した。
Fabフラグメントを、KaloBios発現ベクターを使用して大腸菌からの分泌により発現させた。細胞を、2xYT培地で〜0.6のOD600にまで増殖させた。IPTGを100μMまで加え、33℃で4時間振盪することにより、発現を誘導した。アセンブルされたFabを、浸透圧溶解によるペリプラズム画分および標準方法にしたがうNi−NTAカラム(HisTrap HP columns; GE Healthcare catalog #17-5247-01)を使用するアフィニティークロマトグラフィーによる精製から得た。Fabを500mMのイミダゾールを含むバッファーに溶離し、カルシウムおよびマグネシウムを含まないPBS pH7.4で徹底的に透析した。
ライブラリーを、KaloBiosヒトライブラリー配列、親マウス配列およびBSDを含むユニークなCDR3−FR4領域を結合させることにより構築した。BSDを含むヒト生殖細胞系列J−セグメント配列および最適化された参照Fab EJS005由来のCDR3を、重複PCRを使用してヒトV−セグメントライブラリーに結合させた。KaloBiosヒトカセットライブラリーは、CDR領域における元のマウスVhおよびVk’に最も近いヒト生殖細胞系列配列に基づいた。元のマウスMAB1 Vhは、ヒト生殖細胞系列配列Vh2−70に最も近く、Vh2サブグループメンバー(KB1412)を含むKaloBiosライブラリーを、Vhカセットライブラリーを作製することにおいて使用した。同様に、MAB1 VkがVk1 O2ヒト生殖細胞系列配列に最も近いため、Vk1サブグループメンバー(KB1419およびKB1420)を含む2つのKaloBios ヒトV−セグメントライブラリーの混合物を、Vkカセットライブラリーを作製することにおいて使用した。これらのカセットライブラリーを、重複PCRによって、親マウス可変領域から完全V−セグメントへの配列に結合させた。2つの型のカセットをブリッジPCRにより構築した:FR1、CDR1およびFR2の最初の部分においてヒト配列を含むフロントエンドカセットを、鋳型として上記Vh2ライブラリーの混合物(KB1412)またはVk1ライブラリーの混合物(KB1419およびKB1420)から増幅した。FR2の最後の部分、CDR2およびFR3においてヒト配列を含むミドルカセットを、上記完全ヒトVhまたはVk領域ライブラリーを鋳型として使用して増幅した。Vhカセットは、アミノ酸位置45−49(Kabat番号付け)でFR2において重複する共通配列を有し;Vkカセットは、アミノ酸残基42−47(Kabat番号付け)でFR2において重複する共通配列を有した。このようにして、フロントエンドおよびミドルヒトカセットライブラリーを、ヒトV−重鎖2およびV−カッパ1アイソタイプに対するPCRにより構築した。それぞれのVhカセットライブラリーを、NcoI(5’)およびKpnI(3’)で、ベクターKB1292−Hisにクローニングし;それぞれのVkカセットライブラリーを、NcoI(5’)およびHindIII(3’)で、ベクターKB1296−B(FR4に加えられたサイレントHindIII部位を有するKaloBiosベクターKB1296の修飾されたバージョン)にクローニングした。次に、得られたVhまたはVkプラスミドライブラリーを、BssHIIおよびClaIでの消化、次にライゲーションにより、参照Fab JG024由来の相補的鎖と混合し(例えば、Vhフロントエンドライブラリーを、最適化された参照Vkベクターと混合し)、完全Fabを発現するジシストロニック(dicistronic)ベクターのライブラリーを作製した。
組換えヒトまたはカニクイザルマカクザルPCSK9−His6抗原を、全てのELISAアッセイにおいて使用した。一般的に、PBS pH7.4にて希釈されたPCSK9−His6抗原を、4℃で一晩インキュベーションにより300ng/ウェルで、96−ウェルマイクロタイタープレートに結合させた。プレートを、PBS中で3%のBSAの溶液で37℃で1時間ブロックし、次に、PBSTで1回濯いだ。次に、Fabを含有する誘導細胞培地または希釈された精製Fab(50μL)を、それぞれのウェルに加えた。37℃で1時間インキュベート後、プレートをPBSTで3回濯いだ。PBS(50μL)にて1:5000希釈された抗−ヒト−カッパ鎖HRP抱合体(Sigma #A7164)をそれぞれのウェルに加え、プレートを室温で45分間インキュベートした。プレートをPBSTで3回洗浄し、次に、100μLのSureBlue TMB基質(KPL #52−00−03)をそれぞれのウェルに加え、プレートを室温で〜10分間インキュベートした。プレートを分光光度計にて650nmで読んだ。
Fabフラグメントのhumaneeredライブラリーのスクリーニングを、1μg/mLでPCSK9−His6でコーティングされているニトロセルロースフィルターを使用して、本質的に(米国特許公開第2005/0255552および2006/0134098号)記載されているとおりに実施した。抗原コーティングフィルターに結合したFabを、PBSTにて1:5000に希釈したアルカリホスファターゼ結合抗ヒトカッパ軽鎖抗体(Sigma #A3813)を使用して検出し、ブロットを、アルカリホスファターゼに対するDuoLux化学発光基質(Vector Laboratories #SK-6605)発色させた。
C−末端にAvi−(部位特異的ビオチン化のため)およびHis6−タグを有するPCSK9(PCSK9−Avi−His6)を、pRS5a/PCSK9プラスミドC−末端His6(配列番号:45)タグを有するPCSK9 Uniprot Accession Q8NBP7のアミノ酸31−692を発現する)におけるPCSK9およびHis6タグをコードする遺伝子間に、EcoRI制限酵素認識部位を挿入することにより作製した。Aviタグ(アミノ酸配列:GGGLNDIFEAQKIEWHE;配列番号:55)をコードし、EcoRIオーバーハングが隣接するオリゴヌクレオチドを、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(Invitrogen)でリン酸化し、アニーリングし、次に、新たに挿入されたEcoRI部位を使用してpRS5a/PCSK9にライゲートした。Aviタグを含むクローンを、配列分析により確認した。PCSK9−Avi−His6の発現を293 Freestyle Expression System(Invitrogen)で行い、分泌された組換えタンパク質をNi−NTA樹脂(QIAGEN)を使用して精製した。精製後、PCSK9−Avi−His6タンパク質を、10mMのTris pH8.0、50mMのNaClに対して透析した。タンパク質を、製造業者のプロトコールにしたがって、ビオチン−タンパク質リガーゼ(Avidity)でインビトロにてビオチン化した。完了後、反応物をPBS pH7.2に対して透析し、ビオチン化を、HRP結合ストレプトアビジンでプローブするウェスタンブロットにより確認した。
Fully HumaneeredTMMAB2およびMAB3抗体(サイレントIgG1カッパ)を、製造業者のプロトコールにしたがって293fectinトランスフェクション試薬(Invitrogen #51-0031)を使用して、293 Freestyle細胞へのベクターpJG04(重鎖)およびpJG10(軽鎖)の共トランスフェクションにより生産した。抗体を、5mLのHiTrap Protein A HPカラム(GE Healthcare #17-0403-03)を使用して、293 Freestyle細胞上清から精製された。抗体をIgG溶離バッファー(Pierce #21004)を使用して溶離し、透析によりPBSにバッファー交換した。Protein A アフィニティークロマトグラフィーを、AKTAFPLC液体クロマトグラフィー系(GE Healthcare)にて行った。
PCSK9上のエピトープ結合に対する元のマウス抗体MAB1とそのHumaneeredTM誘導体MAB2およびMAB3間の競合は、ForteBio Octet QK系およびビオチン化PCSK9−Avi−His6でコーティングされたStreptavidin High Binding Biosensorsを使用してアッセイした。次に、4つの異なる抗体、マウスMAB1、完全ヒトMAB2、完全ヒトMAB3またはhumaneered抗−PCSK−9抗体NVP−LGT209(MAB1と異なるエピトープを有することが知られている)を、飽和になるまで、別々のPCSK9被覆センサーに結合させた。次に、第1の抗体がMAB1結合をブロックすることができるか否かを決定するために、全てのセンサーをMAB1マウス抗体を含むウェルに浸漬した。
マウスおよび参照V−領域アミノ酸配列
MAB1を発現するハイブリドーマ細胞からのRT−PCR産物をシーケンシングし、該配列は、ThermoElectron LTQ−Orbitrap Mass Spectrometerを使用して、タンパク質レベルでほとんど(95%以上)確認された。次に、MAB1の重鎖および軽鎖可変領域をKaloBiosベクターにクローニングし、参照Fab SR101−B1を作製した。参照Fab(SR101−B1)に加えて、最適化された参照Fab、JG024を構築した。SR101−B1におけるいくつかのフレームワークアミノ酸残基を、JG024におけるヒト生殖細胞系列に変化させた。
FR1およびFR3中の最適化された参照Fab J EJS005に組み込まれたヒト生殖細胞系列残基は、ヒトV−セグメントレパートリーを増幅するために使用されたPCRプライマーにより特定されたものであり、したがって、humaneeredV−領域ライブラリーの全てのメンバーに存在する。最適化された参照Fabを、ヒト生殖細胞系列への変化のいずれかがFab結合の特性を変化させるか否かを評価するために構築した。精製されたFabを使用する希釈ELISAにより、組換えPCSK9抗原に対するSR101B−1およびEJS005の親和性は、実験ノイズ内であると思われ、EJS005におけるアミノ酸変化は耐性があることを示す。
Vh2またはVk1サブグループに限定された重鎖および軽鎖フロントエンドおよびミドルカセットライブラリーを作製し、CLBAによりスクリーニングした。Vhにおいて、PCSK9抗原への結合を支持するフロントエンドカセットはコロニーリフト結合アッセイにより同定されたが、Vhミドルカセットは同定されなかった。Vkにおいても、フロントエンドカセットのみがコロニーリフトにより同定された。それぞれのフロントエンドライブラリーからの多数の結合物が、Fab含有細胞上清におけるELISAアッセイで再確認され、濃度標準化親和性ELISAによりさらに順位付けされた。
次に、6つのヒトFabの結合速度を、ForteBio Octetシステムを使用して、参照Fab JG024の速度と比較した(数値データは表1に要約した)。
表1.PCSK9に対する完全HumaneeredTMFabの親和性
SETアッセイを使用して、ヒトPCSK9に対するMAB2およびMAB3抗体の結合親和性はそれぞれ、表2に示されているとおり、260および300pMであると決定された。これは、溶液中の抗体およびPCSK9間の高親和性相互作用を示唆する。
表2.MAB2およびMAB3の結合速度
親マウス抗体MAB1の抗原特異性が最終HumaneeredTMIgGs、MAB2およびMAB3において保持されているか否かを試験するために、ヒトおよびマウス抗原(ならびにヒトPCSK9)の一群に対する抗体の結合を、ELISAアッセイにおいて試験した。このアッセイの結果(図4A−B)は、MAB2およびMAB3が、マウス抗体MAB1と同様に、PCSK9に対する高い特異性を保持することを示す。
MAB2およびMAB3を、ヒトおよびカニクイザルマカクザル(cyno)Pcsk9に対する特異的結合について評価した。ELISAアッセイは、親マウス抗体MAB1のように、HumaneeredTM抗体MAB2およびMAB3が、同様の様式で、ヒトおよびcynoPcsk9の両方に結合することができることを示す(図5A−C)。
親マウス抗体MAB1のエピトープ特異性が最終HumaneeredTM抗体MAB2およびMAB3において保持されているか否かを試験するために、ForteBio Octetシステムを使用する競合アッセイを開発した。HumaneeredTM抗体MAB2およびMAB3が親マウス抗体MAB1の結合をブロックし、HumaneeredTM抗体が元のマウス抗体のエピトープ特異性を保持することを示す。抗体の負荷の順番を交換し、すなわち、MAB1を最初に、次にHumaneeredTM抗体を結合させたとき、同様の結果を得た。
最終HumaneeredTMIgG MAB2およびMAB3の可変領域アミノ酸配列をそれぞれ、図2および3に示す;CDRは下線を引かれ、太字である。ヌクレオチド配列は配列表に含まれている。
表3.ヒト生殖細胞系列配列に対するMAB2およびMAB3の同一性パーセント
Claims (44)
- プロタンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン9型(PCSK9)に結合する抗体であって、PCSK9と低比重リポタンパク質受容体(LDLR)との相互作用をブロックし、LDLRのPCSK9媒介分解を阻害し、
a)ヒト重鎖V−セグメント、重鎖相補性決定領域3(CDR3)および重鎖フレームワーク領域4(FR4)を含む重鎖可変領域;ならびに
b)ヒト軽鎖Vセグメント、軽鎖CDR3および軽鎖FR4を含む軽鎖可変領域を含み、
i)重鎖CDR3可変領域がアミノ酸配列ITTEGGFAY(配列番号:17)を含み;そして
ii)軽鎖CDR3可変領域がアミノ酸配列QQSNYWPLT(配列番号:24)を含む、
抗体。 - 約500pM以下の平衡解離定数(KD)でヒトPCSK9に結合する、請求項1に記載の抗体。
- 重鎖V−セグメントが配列番号:27と少なくとも85%配列同一性を有し、軽鎖V−セグメントが配列番号:28と少なくとも85%配列同一性を有する、請求項1に記載の抗体。
- 重鎖V−セグメントが配列番号:25および配列番号:26からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも85%配列同一性を有し、軽鎖V−セグメントが配列番号:28と少なくとも85%配列同一性を有する、請求項1に記載の抗体。
- 重鎖FR4がヒト生殖細胞系列FR4である、請求項1に記載の抗体。
- 重鎖FR4が配列番号:35である、請求項5に記載の抗体。
- 軽鎖FR4がヒト生殖細胞系列FR4である、請求項1に記載の抗体。
- 軽鎖FR4が配列番号:39である、請求項7に記載の抗体。
- 重鎖V−セグメントおよび軽鎖V−セグメントがそれぞれ、相補性決定領域1(CDR1)および相補性決定領域2(CDR2)を含み、
i)重鎖V−セグメントのCDR1が配列番号:15のアミノ酸配列を含み;
ii)重鎖V−セグメントのCDR2が配列番号:16のアミノ酸配列を含み;
iii)軽鎖V−セグメントのCDR1が配列番号:20のアミノ酸配列を含み;そして
iv)軽鎖V−セグメントのCDR2が配列番号:23のアミノ酸配列を含む、
請求項1に記載の抗体。 - i)重鎖V−セグメントのCDR1が配列番号:14を含み;
ii)重鎖V−セグメントのCDR2が配列番号:16を含み;
iii)重鎖CDR3が配列番号:17のアミノ酸配列を含み;
iv)軽鎖V−セグメントのCDR1が配列番号:19を含み;
v)軽鎖V−セグメントのCDR2が配列番号:22を含み;そして
vi)軽鎖CDR3が配列番号:24を含む、
請求項9に記載の抗体。 - 重鎖可変領域が配列番号:40の可変領域と少なくとも90%アミノ酸配列同一性を有し、軽鎖可変領域が配列番号:41の可変領域と少なくとも90%アミノ酸配列同一性を有する、請求項1に記載の抗体。
- 重鎖可変領域が配列番号:40の可変領域と少なくとも95%アミノ酸配列同一性を有し、軽鎖可変領域が配列番号:41の可変領域と少なくとも95%アミノ酸配列同一性を有する、請求項1に記載の抗体。
- 配列番号:40を含む重鎖および配列番号:41を含む軽鎖を含む、請求項1に記載の抗体。
- 重鎖可変領域が配列番号:5および配列番号:9からなる群から選択される可変領域と少なくとも90%アミノ酸配列同一性を有し、軽鎖可変領域が配列番号:7および配列番号:11からなる群から選択される可変領域と少なくとも90%アミノ酸配列同一性を有する、請求項1に記載の抗体。
- 重鎖可変領域が配列番号:5および配列番号:9からなる群から選択される可変領域と少なくとも95%アミノ酸配列同一性を有し、軽鎖可変領域が配列番号:7および配列番号:11からなる群から選択される可変領域と少なくとも95%アミノ酸配列同一性を有する、請求項1に記載の抗体。
- 重鎖可変領域が配列番号:5および配列番号:9からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号:7および配列番号:11からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の抗体。
- FAb’フラグメントである、請求項1に記載の抗体。
- IgGである、請求項1に記載の抗体。
- 一本鎖抗体(scFv)である、請求項1に記載の抗体。
- ヒト定常領域を含む、請求項1に記載の抗体。
- 担体タンパク質に連結している、請求項1に記載の抗体。
- PEG化されている、請求項1に記載の抗体。
- 請求項1−22のいずれかに記載の抗体および生理学的に適合できる賦形剤を含む組成物。
- 個体における低比重リポタンパク質コレステロール(LDL−C)レベルを低下させる第2の薬剤をさらに含む、請求項23に記載の組成物。
- 第2の薬剤がスタチンである、請求項24に記載の組成物。
- スタチンが、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチンおよびシンバスタチンからなる群から選択される、請求項25に記載の組成物。
- 第2の薬剤が、フィブラート、ナイアシンおよびそのアナログ、コレステロール吸収阻害剤、胆汁酸封鎖剤、甲状腺ホルモン模倣物、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質(MTP)阻害剤、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(DGAT)阻害剤、PCSK9を標的とする阻害性核酸およびapoB100を標的とする阻害性核酸からなる群から選択される、請求項24に記載の組成物。
- 必要とする個体におけるLDL−Cを低下させる方法であって、治療有効量の請求項1に記載の抗体を個体に投与し、それにより、個体におけるLDL−Cを低下させることを含む方法。
- 個体がスタチン治療に対して低応答性または耐性である、請求項28に記載の方法。
- 個体がスタチン治療に不耐性である、請求項28に記載の方法。
- 個体が少なくとも約100mg/dLのベースラインLDL−Cレベルを有する、請求項28に記載の方法。
- 個体が家族性高コレステロール血症を有する、請求項28に記載の方法。
- 総コレステロールをLDL−Cと共に低下させる、請求項28に記載の方法。
- 個体がトリグリセリド血症を有する、請求項28に記載の方法。
- 個体が機能獲得型PCSK9遺伝子突然変異を有する、請求項28に記載の方法。
- 個体が薬剤誘導性脂質異常症を有する、請求項28に記載の方法。
- LDL−Cを低下させることにおいて有効な治療有効量の第2の薬剤を個体に投与することをさらに含む、請求項28に記載の方法。
- 第2の薬剤がスタチンである、請求項37に記載の方法。
- スタチンが、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチンおよびシンバスタチンからなる群から選択される、請求項38に記載の方法。
- 第2の薬剤が、フィブラート、ナイアシンおよびそのアナログ、コレステロール吸収阻害剤、胆汁酸封鎖剤、甲状腺ホルモン模倣物、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質(MTP)阻害剤、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(DGAT)阻害剤、PCSK9を標的とする阻害性核酸およびapoB100を標的とする阻害性核酸からなる群から選択される、請求項37に記載の方法。
- 抗体および第2の薬剤を混合物として共投与する、請求項37に記載の方法。
- 抗体および第2の薬剤を別々に共投与する、請求項37に記載の方法。
- 抗体を静脈内に投与する、請求項28に記載の方法。
- 抗体を皮下に投与する、請求項28に記載の方法。
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