CN105801701B

CN105801701B - 一种pcsk9抗体的重链和轻链可变区及其应用

Info

Publication number: CN105801701B
Application number: CN201610191117.1A
Authority: CN
Inventors: 崔健; 姜薇
Original assignee: Hebei Renbo Technology Co Ltd
Current assignee: Caoxian Hengzhe Handicraft Co ltd
Priority date: 2016-03-31
Filing date: 2016-03-31
Publication date: 2019-03-29
Anticipated expiration: 2036-03-31
Also published as: CN105801701A

Abstract

本发明公开一种PCSK9抗体的重链和轻链的可变区及其应用，抗体轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过酶联免疫实验证实所述抗体能够与PCSK9特异性结合。本发明所述的抗体能够有效检测PCSK9，对其检测的灵敏度达0.13ng/ml。本发明所述的抗体能够用于制备检测PCSK9的试剂盒和治疗心血管等相关疾病的药物。

Description

一种PCSK9抗体的重链和轻链可变区及其应用

技术领域

本发明涉及一种单克隆抗体，特别涉及一种PCSK9的单克隆抗体的重链和轻链可变区，以及利用所述基因构建其他基因工程抗体的应用。

背景技术

枯草溶菌素转化酶9(proprotein convertase subtilisin/kexin 9，PCSK9)是一种脂质代谢调节蛋白，在肝脏、肾脏等组织中表达，可通过促进低密度脂蛋白受体(lowdensity lipoprotein receptor，LDLR)的降解，调节肝脏脂质代谢，影响血浆低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平。人类PCSK9基因位于染色体lp 32.3，长约22kb，由信号肽、前结构域、催化结构域和羧基末端结构域组成。大量研究显示，PCSK9的两类主要突变，功能获得型和功能缺失型可分别导致高胆固醇血症和低胆固醇血症。因此，研究PCSK9对心血管相关疾病的防治具有重要的意义。

单克隆抗体通常用杂交瘤技术获得，基本原理是小鼠受到外界抗原刺激后可诱发免疫反应，B淋巴细胞产生相应的抗体，肿瘤细胞在体外培养的条件下可以无限传代，把小鼠骨髓瘤细胞与经免疫过的小鼠脾细胞融合起来，融合后的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性，既可以分泌特定的抗体，还具备无限增殖的能力。单克隆抗体具有特异性高、纯度高、效价高、理化性状均一、重复性强、成本低并可大量生产等优点，可以用来制备特异性的治疗药物和试剂检测。

鉴于可以通过检测PCSK9的表达量来进行心血管疾病的防治，因此本发明人发明了PCSK9单克隆抗体，该抗体可以检测PCSK9的表达水平，进而诊断各种与PCSK9相关的心血管疾病。

发明内容

本发明公开了一种抗PCSK9的单克隆抗体，所述单克隆抗体包括轻链和重链，其氨基酸可变区序列分别如序列表中SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示。

本发明所述的单克隆抗体的轻链蛋白质分子可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，分别如序列表中SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5所示。所述单克隆抗体的重链蛋白质分子可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8所示。

本发明通过以下技术方案来实现：

1.构建PCSK9单克隆抗体杂交瘤细胞株

首先，原核表达PCSK9蛋白，免疫Balb/c小鼠，从免疫成功小鼠无菌取其脾细胞作为抗原致敏的B淋巴细胞，按照常规方法与骨髓瘤细胞株SP2/0进行融合。用间接ELISA法筛选阳性细胞克隆再反复亚克隆，直到所有杂交瘤细胞培养上清检测为100％阳性。

2.杂交瘤细胞抗体轻、重链基因的钓取

提取单克隆抗体细胞的RNA，经RT-PCR，用特异性引物钓取抗体的轻重链基因。常规法连接入载体，转化感受态细菌，培养后挑取单个菌落，提取质粒，鉴定后进行DNA测序分析。

3.单克隆抗体可变区氨基酸序列和互补决定区氨基酸序列的分析

用www.expasy.org在线软件将单克隆抗体的轻、重链可变区核苷酸序列翻译为其编码的氨基酸序列。根据Kabat数据库确定单克隆抗体轻链可变区序列中的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示；重链可变区序列中的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如序列表中SEQID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示；

本发明的单克隆抗体基于上述已克隆到的PCSK9结合性单克隆抗体轻、重链可变区基因，可构建和表达多种小分子基因工程抗体，如单链抗体、嵌合抗体、全长抗体等；基于上述基因所编码的多肽或蛋白质，可以交联上多种生物活性分子，制备用于PCSK9表达水平检测、诊断和治疗PCSK9异常表达所导致疾病的诊断或治疗药物。

本发明基于PCSK9单克隆抗体构建了用于检测PCSK9的ELISA试剂盒，所述的ELISA试剂盒包括：PCSK9抗体、HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体、辣根过氧化物酶底物缓冲液、蛋白标准品PCSK9(100ug/ml，0.1ml)、阴性对照样品BSA。

本发明还对单克隆抗体PCSK9的灵敏性进行了检测，结果显示本发明的试剂盒能够灵敏地检测样品中PCSK9的含量，其灵敏度能够达到0.13ng/ml。

对本发明的抗体或抗体片段对应的氨基酸或核苷酸序列进行浅显的或微小的修改也在本发明的保护范围内，包括(但绝不限于)把一个氨基酸残基替换成另外一个具有类似特征的氨基酸。

本发明所述的抗体、抗体片段或抗体突变体的表达，可通过标准的分子生物学技术，将获得编码部分或全长轻链和重链的DNA，克隆到不同的表达载体中，使该基因有效地连接于转录和翻译控制序列。选择和使用与表达宿主细胞相容的表达载体和表达调控序列。该抗体轻链基因和抗体重链基因可以插入到不同的载体，或者更通常地，这两种基因都被插入到同一个表达载体中。通过标准方法(例如，连接抗体基因片段和载体上的互补性限制位点，或者，如果不存在限制位点，进行平端连接)将该抗体基因插入到表达载体中。

本文所述的该抗体的轻链和重链可变区可用于产生任何抗体同类型的全长抗体基因，其通过以这样的方式将它们插入到已经编码期望的同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体，使得VH片段有效连接到载体中的重链恒定(CH)片段，VL片段有效连接到载体中的轻链恒定(CL)片段。此外或可选地，该重组表达载体可以编码促进宿主细胞分泌抗体链的信号肽。该抗体链基因可以被克隆到载体中，使得信号肽符合读码框地连接抗体链基因的氨基端。该信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即源自非免疫球蛋白的信号肽)。

本发明的抗PCSK9抗体分子可通过重组技术生产在原核细胞中表达。

本发明的抗PCSK9抗体分子可通过重组技术生产在真核细胞中表达。作为表达宿主的哺乳动物细胞为本领域所熟知，包括许多可从美国菌种典藏中心(ATCC)获得的永生细胞系。

附图说明

图1人PCSK9抗体灵敏度检测。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的内容。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅用于帮助理解本发明，而不应视为对本发明的具体限制。

实施例1PCSK9单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建

1.1动物免疫

以PCSK9蛋白抗原免疫5周龄的雌性健康Balb/c小鼠，100μg/只，首次免疫，100μg抗原与等体积的福氏完全佐剂混合，腹腔注射，3周后用等量抗原与不完全佐剂混合后腹腔免疫，5周第3次免疫，不加佐剂。3次免疫后，7d采血并测血清中抗体的效价，选择血清呈阳性的Balb/c小鼠用于融合，融合前3d，用不加佐剂的抗原腹腔加强免疫注射，注射剂量为50μg/只。

1.2收集B淋巴细胞

追加免疫后3-5d，小鼠摘眼球取血，处死，离心后获得血清作阳性对照；无菌状态下取小鼠脾脏，置灭菌平皿中，分离脾细胞，计数，备用。

1.3小鼠骨髓瘤细胞的制备

融合前一周，复苏小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0至OPTI-MEM培养基(含10％的胎牛血清)，置于37℃、5％CO₂培养箱中扩大培养；融合前2-3d，细胞应处于对数生长期。融合前，将对数生长期小鼠骨髓瘤细胞收集到离心管中，计数，取5.0×10⁷骨髓瘤细胞，离心，弃上清，用无血清培养基洗涤2次备用。

1.4细胞融合

融合前将50％PEG置37℃、5％CO₂细胞培养箱中调整温度，将等同于小鼠1/2脾脏的脾细胞与骨髓瘤细胞混合，移至一个50mL离心管中，补加30mL不完全培养基，在转速1200rpm的条件下离心10min，弃去上清液，轻轻弹击管底，使细胞团松散，一边均匀地转动离心管，一边加入1mL预温的PEG融合剂，边加边转动离心管，从加入到加完的时间控制在2min，然后在10min内加入20ml的无血清培养基，边加边摇匀。把经PEG融合的细胞1000rpm离心4min，除去上清液，加150ml的HAT选择培养基重悬，将融合细胞接种至无菌96孔板150μl/孔，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养4d，每孔补加100μl选择培养基。

1.5杂交瘤细胞的筛选和克隆

细胞在HAT培养基中培养，未融合的骨髓瘤细胞和未融合的淋巴细胞逐渐死亡；融合的杂交瘤细胞能在HAT培养基中存活和增殖。融合后10d，从每孔中吸50μl上清，加到包被有融合PCSK9-GST蛋白的96孔ELISA板(用1％的BSA封闭)，室温孵育1.5h；洗2次。稀释辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)标记的山羊抗小鼠1∶2000，每孔加50μl，室温孵育1.5h；洗涤4次。每孔加入100μl HRP底物(H₂O₂+TMB)，室温孵育0.5h，每孔加入100μl 2MH₂SO₄，测吸光度。对于阳性克隆，按上述方法检测其对GST标签蛋白的反应性，只有与融合PCSK9-GST融合蛋白结合而与GST不结合的抗体克隆才被保留，继续下面的实验。

收集阳性孔细胞，重悬于HT选择培养基中，采用有限稀释法稀释细胞，并种植于96孔细胞培养板中，5d后观察，对确定只有一个细胞克隆生长的孔，作ELISA进行鉴定。对阳性孔细胞进行有限稀释，经过3-4次单细胞分离培养，直至获得稳定的杂交瘤细胞克隆。大量培养杂交瘤细胞，收集含有抗体的培养上清，用protein G亲和层析柱进行纯化，并透析到PBS中，测浓度，-20℃冻存备用。

实施例2单克隆抗体轻、重链可变区基因的克隆

取对数生长期的杂交瘤细胞，用Trizol抽提总RNA，oligo(dT)20为引物，逆转录成cDNA。然后利用特异性引物PCR分别扩增其重、轻链可变区基因。PCR产物经电泳纯化后，通过TA克隆插入pMD-18T载体，测序、进行序列分析。

(1)总RNA抽提：参照Trizol抽提总RNA说明书操作，结果显示本发明提取的总RNA没有降解，可用于下一步实验。

(2)cDNA合成：以抽提的总RNA为模板，oligo(dT)20为引物，逆转录合成cDNA.

反应体系及反应条件如下：

42℃孵育50min，然后70℃孵育15min灭活逆转录酶。

PCR扩增单克隆抗体重、轻链可变区基因VH和VL，反应体系如下：

扩增条件：94℃预变性5min，然后94℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸1min，共30个循环。

(3)PCR产物回收、纯化、酶切、连接、转化

PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳后，割胶回收目的条带，按照说明书用回收试剂盒回收，并将纯化的DNA片段在水溶液里，将回收的PCR产物插入载体中，筛选重组阳性克隆，并进行测序。

通过上述步骤构建了含有人PCSK9抗体轻、重链基因的载体，经测序分析、序列比对为小鼠PCSK9蛋白轻、重链基因，其对应的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2。

根据Kabat数据库确定单克隆抗体轻链可变区序列中的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示；重链可变区序列中的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示。

实施例3检测PCSK9的ELISA试剂盒的组装

检测PCSK9的ELISA试剂盒包括：PCSK9单克隆抗体、HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体、辣根过氧化物酶底物缓冲液、蛋白标准品PCSK9(100ug/ml，0.1ml)、阴性对照样品BSA、洗液(PBS+0.05％Tween20)。

检测PCSK9的ELISA试剂盒的使用方法如下：

(1)按合适的稀释度(1∶2～1∶10)稀释正常人或患者的血浆，包被到高亲和力ELISA板中，4℃过夜后用含0.2％吐温的PBS缓冲液洗涤5次；

(2)加入抗人PCSK9的抗体，37℃孵育1h，用含0.2％吐温的PBS缓冲液洗涤5次；

(3)加入羊抗小鼠HRP标记的抗体，37℃孵育0.5h，用含0.2％吐温的PBS缓冲液洗涤5次；

(4)加入TMB显色，2N硫酸终止后检测OD450的值。

(5)结果判定：当待测样品的OD值大于空白孔OD值的2倍的视为阳性，待测样品中PCSK9的具体浓度根据标准品制作的标准曲线确定。

实施例4检测PCSK9的ELISA试剂盒的特异性及灵敏度测定

按照实施例4所述的方法，检测PCSK9的抗体的特异性：

(1)包被：用PH＝9.6碳酸盐缓冲液稀释BSA、PCSK9标准品、酶联免疫板，包被的蛋白浓度为1ug/ml，4℃过夜；用PBST洗板4次后甩干；

(2)加入PCSK9的抗体，37℃孵育1h，用含0.2％吐温的PBS缓冲液洗涤5次；

(3)加入羊抗小鼠HRP标记的抗体，37度孵育0.5h，用含0.2％吐温的PBS缓冲液洗涤5次；

(4)加入TMB显色，2N硫酸终止后检测OD450的值。

结果表明，本发明所获得的抗体只特异性的与PCSK9相结合，与其它无关抗原不结合。

用含有1％BSA的PBS倍比稀释PCSK9(2000、400、80、16、3.2、0.64、0.13、0.03、0.01、0.00)ng/ml，ELISA检测方法如实施例4所述，设定样品的OD值大于空白孔OD值的2倍的视为阳性，检测结果如表2和图1所示：

表2不同浓度PCSK9的吸光值

上述实验结果显示：当PCSK9的浓度大于0.13ng/ml时，能够被本检测体系测出。

Claims

1.一种PCSK9单克隆抗体或其片段，所述抗体包括轻链CDR1-3和重链CDR1-3，所述片段也包括轻链CDR1-3和重链CDR1-3，其特征在于，所述轻链CDR1-3的氨基酸序列为：

CDR1：如序列表中SEQ ID NO：3所示；

CDR2：如序列表中SEQ ID NO：4所示；

CDR3：如序列表中SEQ ID NO：5所示；

所述重链CDR1-3的氨基酸序列为：

CDR1：如序列表中SEQ ID NO：6所示；

CDR2：如序列表中SEQ ID NO：7所示；

CDR3：如序列表中SEQ ID NO：8所示。

2.如权利要求1所述的单克隆抗体或其片段，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO：1所示，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

3.一种DNA分子，编码权利要求1-2任意一项所述的单克隆抗体或其片段。

4.权利要求1-2任意一项所述的单克隆抗体或其片段的制备方法，其特征在于，通过重组技术生产在原核细胞或真核细胞中表达。

5.权利要求1-2任意一项所述的单克隆抗体或其片段在制备治疗因PCSK9表达异常导致的疾病的药物中的应用。