CN105001336A - Pcsk9拮抗剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及单克隆技术领域，具体涉及一种PCSK9拮抗剂。本发明进一步提供一种获得这些抗体的方法以及使用这些抗体以减少低密度脂蛋白(LDL)-胆固醇量及/或供治疗及/或预防心血管疾病(其包括治疗高胆固醇血症)的治疗方法。

Description

PCSK9拮抗剂

技术领域

本发明涉及单克隆技术领域，具体涉及一种PCSK9拮抗剂。 

背景技术

蛋白原转化酶枯草溶菌素-可新9型(proprotein convertase subtilisin-kexin type9)(下文称为“PCSK9”)，又名神经凋亡调节转化酶1(“NARC-1”)，是一种蛋白酶K样枯草杆菌酶，经鉴定为分泌型枯草杆菌酶家族的第9个成员；(Seidah等，2003PNAS100：928-933)。编码PCSK9的基因定位在人染色体1p33-p34.3；Seidah等，见上文。PCSK9在能够增殖和分化的细胞中表达，包括例如肝细胞、肾间质细胞、回肠(intestinal ileum)和结肠上皮以及胚胎端脑神经元(Seidah等，2003PNAS100：928-933)。 

PCSK9在肝细胞和神经元细胞的分化中发挥作用(Seidah等，2003PNAS100：928-933)，在胚胎肝脏中高表达，并且与胆固醇体内平衡强烈相关。最近的研究似乎暗示了其在胆固醇生物合成或摄取中的特定作用。在饲喂胆固醇的大鼠的研究中，Maxwell等发现，PCSK9以类似于牵涉胆固醇生物合成的三个其他基因的方式被下调(Maxwell等，2003J.Lipid Res.44：2109-2119)。有趣的是，和牵涉胆固醇代谢的其它基因一样，PCSK9的表达也受甾醇调控元件-结合蛋白(“SREBP”)的调控(Maxwell等，2003J.Lipid Res.44：2109-2119)。后来研究证明此类调控在参与脂蛋白代谢的其它基因中非常典型(Dubuc等，2004Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.24：1454-1459)。PCSK9的表达被他汀类(statins)上调，这是由于这些药物的降胆固醇效应。此外，PCSK9启动子有两个涉及胆固醇调控的保守性位点、甾醇调控元件和Sp1位点；见上文。PCSK9的腺病毒表达已显示可导致循环LDL显著的时间依赖性增加(Benjannet等，2004J.Biol.Chem.279：48865-48875)。此外，删除PCSK9基因的小鼠肝LDL受体水平增加，LDL从血浆中清除更快；Rashid等，2005Proc.Natl.Acad.Sci.USA102：5374-5379。最近据报道，将用PCSK9瞬时转染的HepG2细胞的培养基转移到未转染的HepG2细胞时，减少细胞表面LDLR的数量和LDL的内化；参见Cameron等，2006Human Mol.Genet.15：1551-1558。结论是PCSK9或者经PCSK9作用的因子被分泌并能够降解转染的和未转染的细胞中的LDLR。更近来，据证实，加到HepG2细胞培养基中的纯化PCSK9具有以剂量和时间依赖性方式减少细胞表面LDLR数目的作用(Lagace等，2006J.Clin.Invest.116：2995-3005)。 

PCSK9基因中的很多突变已确定与以下病症相关：常染色体显性高胆固醇血症(“ADH”)、以血浆中低密度脂蛋白(“LDL”)颗粒显著升高为特征的遗传性代谢紊乱(可 导致早发性心血管衰竭)；（Abifadel等，2003Nature Genetics34：154-156；Timms等，2004Hum.Genet.114：349-353；Leren，2004Clin.Genet.65：419-422）。后来Abifadel等发表的对S127R突变的研究报道，携带这种突变的患者血浆中总胆固醇和apoB100较高，原因是(1)含有apoB100的脂蛋白例如低密度脂蛋白(“LDL”)、极低密度脂蛋白(“VLDL”)和中密度脂蛋白(“IDL”)的过量产生，和(2)所述脂蛋白清除或转化的相关减少。 

综合起来，上述研究证实了PCSK9在调控LDL产生中起作用的事实。PCSK9的表达或上调与增加的LDL胆固醇的血浆水平有关，PCSK9表达的抑制或缺乏与LDL胆固醇血浆水平低有关。值得注目的是，与PCSK9序列变化相关的较低水平的LDL胆固醇可提供针对冠心病的保护（Cohen，2006N.Engl.J.Med.354：1264-1272）。临床试验已证明LDL胆固醇含量减少与冠状动脉(coronary)事件率直接相关（Law等，2003BMJ326：1423-1427）。此外，最近已证明，血浆LDL胆固醇含量终生中度减少与冠状动脉事件的发生率大幅减少显著相关；甚至在非脂质相关心血管风险因子高度盛行(prevalence)的群体中也是如此。因此，对LDL胆固醇含量进行管理控制大有裨益。 

因此，制备抑制或拮抗PCSK9活性和PCSK9在各种治疗状况下所发挥的相应作用的、基于治疗的PCSK9拮抗剂非常重要。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供PCSK9拮抗剂、药物组合物及其用途。 

本发明涉及PCSK9拮抗剂，特别是人PCSK9拮抗剂。PCSK9的蛋白特异性拮抗剂(或本文称为“PCSK9特异性拮抗剂″)是有效抑制PCSK9功能的PCSK9蛋白特异性结合分子或蛋白，它们在治疗与PCSK9功能相关或受PCSK9功能影响的病症中非常重要，所述病症包括但不限于高胆固醇血症、冠心病、代谢综合征、急性冠状动脉综合征和相关病症。PCSK9特异性拮抗剂的特征在于，对PCSK9的选择性识别和结合。PCSK9特异性拮抗剂不显示对除PCSK9之外的物质的显著结合，除了在那些特殊情况下：使拮抗剂补充带有另外的、与PCSK9特异性结合部分不同的特异性。在具体实施方式中，PCSK9特异性拮抗剂与人PCSK9结合的KD为1.2X10-6或更少。在具体实施方式中，PCSK9特异性拮抗剂与人PCSK9结合的KD为1X10-7或更少。在另外的实施方式中，PCSK9特异性拮抗剂与人PCSK9结合的KD为1X10-8或更少。在其它实施方式中，PCSK9特异性拮抗剂与人PCSK9结合的KD为5X10-9或更少，或1X10-9或更少。其他实施方式中，PCSK9特异性拮抗剂与人PCSK9结合的KD为1X10-10或更少，1X10-11或更少，或1X10-12或更少。在具体实施方式中，PCSK9特异性拮抗剂不以上述水平结合其它蛋白。 

PCSK9特异性拮抗剂有效抵抗对细胞LDL摄取的PCSK9依赖性抑制。已屡次证明， PCSK9特异性拮抗剂对PCSK9对LDL摄取的影响呈剂量依赖性抑制。因此，PCSK9特异性拮抗剂对降低血浆LDL胆固醇水平非常重要。所述拮抗剂还可在检测和定量PCSK9中用于各种诊断目的。 

在具体实施方式中，本发明包括PCSK9特异性拮抗剂，以及，在具体实施方式中，本发明包括抗体分子，所述抗体分子包含公开的重链和/或轻链可变区、具有一个或多个保守性氨基酸取代的等同物和它们的同源物(homologs)。具体实施方式包括分离的PCSK9特异性拮抗剂，所述拮抗剂含有公开的CDR结构域或重链和/或轻链CDR结构域的组(sets)以及它们的以具有一个或多个保守性氨基酸取代为特征的等同物。本领域技术人员将理解，可将保留了拮抗PCSK9能力的PCSK9特异性拮抗剂片段插入各种构架(frameworks)中，参见例如美国专利6,818,418以及其中的参考文献，它们讨论了可用于展示抗体环的各种支架(scaffolds)，所述抗体环之前基于抗原结合来选择。另选方案中，可使用重组方法掺入编码VL和VH的基因，例如使用可使VL和VH成为单一蛋白链(或者称为单链Fvs(“ScFVs”))的合成接头，在该单一蛋白链中VL和VH区域配对形成单价分子；参见例如，Bird等，1988，Science242：423-426，以及Huston等，1988Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879-5883。 

PCSK9特异性拮抗剂和片段可以是各种非基于抗体的支架的形式，包括但不限于高亲和性多聚体(avimers)(Avidia)；DARPins(MolecularPartners)；Adnectins(Adnexus)，Anticalins(Pieris)和Affibodies(Affibody)。科学文献中对用于蛋白结合的可选支架的使用进行了很多评价，参见例如Binz&Plückthun，2005Curr.Opin.Biotech.16：1-11。因此，具有PCSK9选择性的、可抵抗对细胞LDL摄取的PCSK9依赖性抑制、非基于抗体的支架或拮抗剂分子构成了本发明的重要实施方式。 

另一方面，本发明提供编码公开的PCSK9特异性拮抗剂的核酸。在具体方面，本发明提供编码PCSK9特异性拮抗剂的核酸，在具体实施方式中提供了编码本文公开的抗体分子的核酸，所述抗体分子包含本文公开的重链可变区和轻链可变区以及它们的选择组分，尤其是公开的各自的CDR3区域。另一方面，本发明提供包含所述核酸的载体。另一方面，本发明提供包含编码公开的PCSK9特异性拮抗剂(在特定实施方式中是所述公开的抗体分子和它们的组分)的核酸的分离的细胞。另一方面，本发明提供包含本发明多肽或载体的分离的细胞。 

另一方面，本发明提供制备选择性结合PCSK9的PCSK9特异性拮抗剂的方法，所述PCSK9特异性拮抗剂包括抗体、抗原结合片段、衍生物、嵌合分子、上述任何物质与另一种多肽的融合物、或能够特异性结合PCSK9的可选结构/组成(compositions)。该方法包括在允许PCSK9特异性拮抗剂表达和/或装配(assembly)的条件下培养细胞并从细胞中分离所述拮抗剂，所述细胞包含编码PCSK9特异性拮抗剂的核酸，或包含编码它们的一个或多个组分的独立的核酸，其中当所述核酸表达时，合起来(collectively)产生所述拮抗剂。 

本领域技术人员还可用标准的重组DNA技术获得本文公开的PCSK9特异性拮抗剂。 

另一方面，本发明提供拮抗PCSK9活性或功能、或PCSK9的已注意到的作用(notedeffect)的方法，该方法包括使表达PCSK9(或用PCSK9处理)的感兴趣的细胞、细胞群体或组织样品与本文公开的PCSK9特异性拮抗剂在允许所述拮抗剂结合PCSK9的条件下接触。 

本发明的具体实施方式包括这样的方法：其中所述细胞是人细胞。根据本发明的拮抗剂有效抑制PCSK9功能。发现本文公开的PCSK9特异性拮抗剂剂量依赖性抑制PCSK9对LDL摄取的影响。 

另一方面，本发明提供在对象中拮抗PCSK9活性的方法，所述对象表现与PCSK9活性相关的病症或其中对特定对象而言PCSK9起作用(functioning)是禁忌(contraindicated)的病症，所述方法包括给予所述对象治疗有效量的本发明PCSK9特异性拮抗剂。在选择实施方式中，所述病症可以是高胆固醇血症、冠心病、代谢综合征、急性冠状动脉综合征或相关病症。另一方面，本发明提供药物组合物或其它组合物，其包含本发明PCSK9特异性拮抗剂和药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂、稳定剂、缓冲剂或设计用来便于将所需量的拮抗剂给予治疗个体的另选物质(alternative)。 

本发明还涉及在细胞样品中鉴定PCSK9拮抗剂的方法，其包括向细胞样品提供纯化的PCSK9和标记的LDL颗粒；向该细胞样品提供怀疑是PCSK9拮抗剂的分子；培养该细胞样品一段时间，所述时间足以允许细胞摄取LDL颗粒；通过除去上清液来分离细胞样品中的细胞；减少(reducing)标记的LDL颗粒的非特异性结合；裂解细胞；定量细胞裂解物中保留的标记物的量；以及鉴定导致定量的标记物的量相比于单独给予PCSK9时观察到的标记物的量有所增加的那些候选拮抗剂。导致定量的标记物的量增加的候选拮抗剂是PCSK9拮抗剂。已证明该方法是用于鉴定PCSK9特异性拮抗剂的有效手段，因此形成了本发明的重要方面。 

下表提供了本发明中所讨论的序列的概览 

附图说明

图1说明抗体表达载体pV73; 

图2说明外极性(Exopolar)PCSK9突变体的效力如何与血浆LDL-胆固醇相关; 

图3抗体分子F16-15剂量依赖性抑制PCSK9对LDL摄取的影响； 

图4抗体分子F16-15的IC-50的计算 

图51CX1G08显示对细胞LDL摄取的PCSK9依赖性抑制； 

图6F16-15当被注射至小鼠时对血清胆固醇的作用； 

图7F16-15当被注射至小鼠时对血清胆固醇的时间进程试验。 

具体实施方式

本发明涉及PCSK9拮抗剂，特别是人PCSK9拮抗剂。根据本发明的PCSK9的蛋白特 异性拮抗剂(或“PCSK9特异性拮抗剂″)有效抑制PCSK9的功能，从而在治疗与PCSK9功能相关/受PCSK9功能影响的病症中非常重要，所述病症包括但不限于高胆固醇血症、冠心病、代谢综合征、急性冠状动脉综合征和相关病症。本文提及PCSK9功能或PCSK9活性时指需要PCSK9、或被PCSK9加剧或增强的任何活性/功能。本文已证明，PCSK9特异性拮抗剂抵抗对细胞LDL摄取的PCSK9依赖性抑制特别有效。已屡次证明，公开的拮抗剂对PCSK9对LDL摄取的影响呈剂量依赖性抑制。 

因此，本文公开的PCSK9特异性拮抗剂是用于降低血浆LDL胆固醇水平的理想分子。PCSK9特异性拮抗剂应用于具有商业或家庭兽医(domestic veterinary)重要性的任何灵长类动物、哺乳动物或脊椎动物。PCSK9特异性拮抗剂还可应用于具有LDL受体的任何细胞群体或组织。检测LDL摄取并从而检测对LDL摄取的各种影响的方法描述于文献中；参见例如，Barak&Webb，1981J.Cell Biol.90：595-604，和Stephan&Yurachek，1993J.Lipid Res.34：325330。此外，测定血浆中的LDL胆固醇的方法充分描述于文献中；参见例如，McNamara等，2006Clinica Chimica Acta369：158-167。 

PSCK9特异性拮抗剂还在检测和定量PCSK9中应用于各种诊断目的。 

本文定义的PCSK9特异性拮抗剂选择性识别并特异性结合PCSK9。本文所用术语“选择性”或“特异性”指这样的事实：所述公开的拮抗剂不显示对除PSCK9之外的物质的显著结合，除了在那些特殊情况下：其中补充拮抗剂使其具有另外的、与PCSK9特异性结合部分不同的特异性(例如，双特异性或双官能分子，其中所述分子设计用于结合或行使两种功能，其中至少一种是特异性结合PCSK9)。PCSK9特异性拮抗剂与人PCSK9结合的KD为1X10^-7或更少。在具体实施方式中，PCSK9特异性拮抗剂与人PCSK9结合的KD为1X10^-8或更少。在其它实施方式中，PCSK9特异性拮抗剂与人PCSK9结合的KD为5X10^-9或更少，或1X10^-9或更少。其他实施方式中，PCSK9特异性拮抗剂与人PCSK9结合的KD为1X10^-10或更少，1X10^-11或更少，或1X10^-12或更少。在具体实施方式中，PCSK9特异性拮抗剂不以上述水平结合其它蛋白。KD指获得自Kd(具体结合分子-靶蛋白相互作用的解离速率)与Ka(具体结合分子-靶蛋白相互作用的结合速率)之比(或Kd/Ka，以摩尔浓度(M)表示)的解离常数。可使用本领域充分建立的方法测定KD值。测定结合分子的KD的优选方法是通过使用表面等离子共振，例如生物传感器系统，如Biacore TM(GE Healthcare Life Sciences)系统。 

本发明的PCSK9特异性拮抗剂可以是对PCSK9蛋白有特异性的任何结合分子，包括但不限于下文定义的抗体分子、任何PCSK9特异性结合结构、任何特异性结合PCSK9的多肽或核酸结构和掺入各种蛋白支架的上述任何物质；包括但不限于各种非基于抗体的支架以及能够提供选择性结合PCSK9的各种结构，包括但不限于小的模块化免疫药物(modularimmunopharmaceuticals)(或“SMIP”；参见，Haan&Maggos，2004年1月6日， Biocentury)；免疫蛋白(参见例如，Chak等，1996Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：6437-6442)；细胞色素b562(参见Ku和Schultz，1995Proc.Natl.Acad.Sci.USA92：6552-6556)；肽α2p8(参见Barthe等，2000Protein Sci.9：942-955)；高亲和力多聚体(avimers)(Avidia；参见Silverman等，2005Nat.Biotechnol.23：1556-1561)；DARPins(MolecularPartners；参见Binz等，2003J.Mol.Biol.332：489-503；Forrer等，2003FEBS Lett.539：2-6)；Tetranectins(参见，Kastrup等，1998Acta.Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.54：757-766)；Adnectins(Adnexus；参见，Xu等，2002Chem.Biol.9：933-942)；Anticalins(Pieris；参见Vogt&Skerra，2004Chemobiochem.5：191-199；Beste等，1999Proc.Natl.Acad.Sci.USA96：1898-1903；Lamla&Erdmann，2003J.Mol.Biol.329：381-388；andLamla&Erdmann，2004Protein Expr.Purif.33：39-47)；A-结构域蛋白(参见North&Blacklow，1999Biochemistry38：3926-3935)；脂质运载蛋白(Lipocalins)(参见Schlehuber&Skerra，2005Drug Discov.Today10：23-33)；重复基序蛋白，例如Ankyrin重复蛋白(参见Sedgwick&Smerdon，1999Trends Biochem.Sci.24：311-316；Mosavi等，2002Proc.Natl.Acad.Sci.USA99：16029-16034；and Binz等，2004Nat.Biotechnol.22：575-582)；昆虫防御素A(参见Zhao等，2004Peptides25：629-635)；Kunitz结构域(参见Roberts等，1992Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：2429-2433；Roberts等，1992Gene121：9-15；Dennis&Lazarus，1994J.Biol.Chem.269：22129-22136；Dennis&Lazarus，1994J.Biol.Chem.269：22137-22144)；PDZ-结构域(Domains)(参见Schneider等，1999Nat.Biotechnol.17：170-175)；蝎毒素，例如卡律蝎毒素(Charybdotoxin)(参见Vita等，1998Biopolymers47：93-100)；笫10纤维结合蛋白III型结构域(或10Fn3；参见Koide等，1998J.Mol.Biol.284：1141-1151，和Xu等，2002Chem.Biol.9：933-942)；CTLA-4(胞外结构域；参见Nuttall等，1999Proteins36：217-227；Irving等，2001J.Immunol.Methods248：31-45)；打结素(Knottins)(参见Souriau等，2005Biochemistry44：7143-7155和Lehtio等，2000Proteins41：316-322)；新抑癌蛋白(Neocarzinostatin)(参见Heyd等2003Biochemistry42：5674-5683)；碳水化合物结合模块4-2(CBM4-2；参见Cicortas等，2004Protein Eng.Des.Sel.17：213-221)；淀粉酶抑肽(Tendamistat)(参见McConnell&Hoess，1995J.Mol.Biol.250：460-470，和Li等，2003Protein Eng.16：65-72)；T细胞受体(参见Holler等，2000Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：5387-5392；Shusta等，2000Nat.Biotechnol.18：754-759；Li等，2005Nat.Biotechnol.23：349-354)；Affbodies(Affibody；参见Nord等，1995Protein Eng.8：601-608；Nord等，1997Nat.Biotechnol.15：772-777；Gunneriusson等，1999Protein Eng.12：873-878)；以及文献中认可的其他选择性结合蛋白或支架；参见例如，Binz&Plückthun，2005Curr.Opin.Biotech.16：1-11；Gill&Damle，2006Curr.Opin.Biotechnol.17：1-6；Hosse等，2006Protein Science15：14-27；Binz等，2005Nat.Biotechnol.23：1257-1268；Hey等，2005Trends in Biotechnol.23：514-522；Binz&Pl ückthun，2005Curr.Opin.Biotech.16：459-469；Nygren&Skerra，2004J.Immunolog.Methods290：3-28；Nygren&Uhlen，1997Curr.Opin.Struct.Biol.7：463-469。抗体及抗原结合片段的使用在文献中有充分定义。科学文献中对用于蛋白结合的可选支架的使用进行了充分评价，参见例如参见，例如Binz&Plückthun，2005Curr.Opin.Biotech.16：1-11；Gill&Damle，2006Curr.Opin.Biotechnol.17：1-6；Hosse等，2006Protein Science15：14-27；Binz等，2005Nat.Biotechnol.23：1257-1268；Hey等，2005Trends in Biotechnol.23：514-522；Binz&Plückthun，2005Curr.Opin.Biotech.16：459-469；Nygren&Skerra，2004J.Immunolog.Methods290：3-28；Nygren&Uhlen，1997Curr.Opin.Struct.Biol.7：463-469。因此，具有对PCSK9选择性的、抵抗PCSK9依赖性细胞LDL摄取抑制的、非基于抗体的支架或拮抗剂分子构成了本发明的重要实施方式。适体(aptamers)(能够选择性结合靶分子的核酸或肽分子)是一个具体的例子。它们可选自随机序列文库或从天然来源例如核糖开关(riboswitches)中鉴定。肽适体、核酸适体(例如，结构核酸，包括基于DNA和RNA的结构)和核酸诱饵(decoys)可有效地选择性结合并抑制感兴趣的蛋白；参见，例如Hoppe-Seyler&Butz，2000j.Mol.Med.78：426-430；Bock等，1992Nature355：564-566；Bunka&Stockley，2006Nat.Rev.Microbiol.4：588-596；Martell等，2002Molec.Ther.6：30-34；Jayasena，1999Clin.Chem.45：1628-1650。可用合适的技术来实现各种PCSK9特异性拮抗剂的表达和选择，所述技术包括但不限于噬菌体展示(参见，例如国际申请号WO92/01047；Kay等，1996，肽和蛋白的噬菌体展示：实验室手册(Phage Display of Peptides andProteins：A Laboratory Manual)，圣地亚哥：学术出版社(Academic Press))、酵母展示、细菌展示、T7展示和核糖体展示(参见例如Lowe&Jermutus，2004Curt.Pharm.Biotech.517-527)。 

如本文所述的“抗体分子”或“抗体”指选择性结合于PCSK9的免疫球蛋白衍生结构，包括但不限于全长或完整的抗体、抗原结合片段(实际上(physically)或概念上(conceptually)衍生自抗体结构的片段)、任何上述物质的衍生物、嵌合分子、任何上述物质与另一种多肽的融合物、或为了选择性结合/抑制PCSK9功能的目的而掺入任何上述物质的任何可选结构/组成。“完整”抗体或“全长”抗体指包含两条重链(H)和两条轻链(L)的蛋白，所述重链和轻链通过二硫键相互连接，所述蛋白包含：(1)就重链而言，包含可变区(本文缩写为“VH”)和含有三个结构域CH1、CH2、CH3的重链恒定区；和(2)就轻链而言，包含轻链可变区(本文缩写为″VL″)和含有一个结构域CL的轻链恒定区。 

本文所用术语“分离的”描述一种特性，该特性涉及公开的PCSK9特异性拮抗剂、核酸或其他物质，使它们与其在自然界中被发现的形式不同。这种差异可以是例如，它们与自然界中发现的形式的纯度不同，或它们与自然界中发现的形式的结构不同或形成与自然界中发现的形式不同的结构的一部分。未在自然界中发现的结构，例如包括重组人免疫球蛋白结构，包括但不限于具有优化的CDR的重组人免疫球蛋白结构。未在自然界中发现的结构的 其他例子是基本不含其他细胞物质的PCSK9特异性拮抗剂或核酸。分离的PCSK9特异性拮抗剂通常不含具有不同蛋白特异性(即，对PCSK9之外的蛋白具有亲和性)的其他蛋白-特异性拮抗剂。 

抗体片段(更具体地说抗原结合片段)是具有抗体可变区或其片段(包含一个或多个公开的CDR3结构域，重链和/或轻链)的分子，其赋予对PCSK9特别是人PCSK9的选择性结合。含有此类抗体可变区的抗体片段包括但不限于以下抗体分子：Fab、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、双特异性抗体分子(包含连接至第二功能部分的本文公开的PCSK9特异性抗体或抗原结合片段的抗体分子，所述第二功能部分具有不同于该抗体的结合特异性，包括不限于另一种肽或蛋白，例如抗体或受体配体)、双特异性单链Fv二聚体、分离的CDR3、小体、“scab”、dAb片段、双链抗体(diabody)、三链抗体(triabody)、四链抗体(tetrabody)、小体、基于蛋白支架的人工抗体，包括但不限于纤维结合蛋白III型多肽抗体(参见例如美国专利6,703,199和国际申请No.WO02/32925和WO00/34784)或细胞色素B(参见例如Nygren等，1997Curr.Opinion Struct.Biol.7：463-469)。抗体部分或结合片段可以是天然的，或部分地或完全地合成制备的。可通过本领域技术人员所知的各种方法制备此类抗体部分，所述方法包括但不限于常规技术，例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化。 

在一个具体方面，本发明提供拮抗PCSK9功能的分离的PCSK9特异性拮抗剂。具体实施方式中，所述PCSK9特异性拮抗剂抑制PCSK9对细胞LDL摄取的拮抗作用。公开的PCSK9特异性拮抗剂有效拮抗PCSK9对LDL摄取的抑制，因此构成用于降低血浆LDL胆固醇水平的理想分子；参见例如Cohen等，2005Nat.Genet.37：161-165(其中等位基因PCSK9无义突变的杂合子个体中观察到血浆LDL胆固醇水平的显著降低)；Rashid等，2005Proc.Natl.Acad.Sci.USA102：5374-5379(其中证实PCSK9-敲除小鼠肝细胞中的LDLR数目增加，血浆LDL清除加快并且血浆胆固醇水平显著降低)；Cohen等，2006N.Engl.J.Med.354：1264-1272(其中，PCSK9功能缺失突变的杂合子人显示出明显减少发展动脉粥样硬化性心脏病的长期风险)。 

通过重复实验，本发明的PCSK9特异性拮抗剂(即抗体分子F0016-3-18)剂量依赖性抑制PCSK9对LDL摄取的影响。因此，在具体实施方式中，本发明包括PCSK9特异性拮抗剂，在更具体的实施方式中，本发明包括抗体分子，所述抗体分子内包含重链和/或轻链可变区，以及它们的等同物(特征是具有一个或多个保守性氨基酸取代)或同源物。具体实施方式包括分离的PCSK9特异性拮抗剂，其含有本文公开的CDR结构域或本文公开的重链和/或轻链CDR结构域的组，或它们的等同物(以具有一个或多个保守性氨基酸取代为特征)。本文所用术语“结构域”或“区域”简单地指抗体分子的各部分，其中将存在(reside)或者当前存在有争论(at issue)的序列或片段。 

在具体实施方式中，本发明提供分离的PCSK9特异性拮抗剂，更具体的实施方式中为 抗体分子，所述抗体分子包含如SEQID NO：7所述的重链可变区；它的等同物(以具有一个或多个保守性氨基酸取代为特征)；以及它们的同源物。公开的拮抗剂能抑制对细胞LDL摄取的PCSK9依赖性抑制。在具体实施方式中，本发明提供本文公开的拮抗剂的同源物，其特征在于与本文公开的拮抗剂至少90％同源；所述拮抗剂抑制对细胞LDL摄取的PCSK9依赖性抑制。 

在具体实施方式中，本发明提供分离的PCSK9特异性拮抗剂，更具体的实施方式中为抗体分子，所述抗体分子包含如SEQID NO：8所述的轻链可变区；它的等同物(以具有一个或多个保守性氨基酸取代为特征)；以及它们的同源物。公开的拮抗剂能抑制对细胞LDL摄取的PCSK9依赖性抑制。在具体实施方式中，本发明提供本文公开的拮抗剂的同源物，其特征在于与本文公开的拮抗剂至少90％同源；所述拮抗剂抑制对细胞LDL摄取的PCSK9依赖性抑制。 

在具体实施方式中，本发明提供分离的PCSK9特异性拮抗剂，更具体的实施方式中为抗体分子，所述抗体分子包含：(i)包含SEQ ID NO：7的重链可变区和包含SEQ IDNO：8的轻链可变区；或前述抗体分子的等同物(其特征在于在规定序列中具有一个或多个保守性氨基酸取代)。具体实施方式是所述拮抗剂抑制对细胞LDL摄取的PCSK9依赖性抑制。 

具体实施方式中，本发明提供分离的PCSK9特异性拮抗剂，更具体的实施方式中为抗体分子，所述抗体分子包含如SEQ ID NO：3的重链可变区CDR3序列和SEQ ID NO：6所述的可变轻链CDR3序列；以及它们的保守性修饰；抑制对细胞LDL摄取的PCSK9依赖性抑制的具体实施方式。 

具体实施方式提供分离的PCSK9特异性拮抗剂，更具体的实施方式中，提供抗体分子，所述抗体分子包含的SEQ ID NO：9的抗体重链和序列10所述的抗体轻链；和它们的等同物(其特征在于在任何一个或多个CDR序列中具有一个或多个保守性氨基酸取代)；抑制对细胞LDL摄取的PCSK9依赖性抑制的具体实施方式。 

本领域技术人员将理解，保守性氨基酸取代是用一个可带来类似或更好的(对预期的目的而言)功能特性和/或化学特性的氨基酸残基来取代氨基酸残基的置换。例如，保守性氨基酸取代常常是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代。本领域中已定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。 

这些家族包括具有以下侧链的氨基酸：碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。此类修饰不是用来显著降低或改变PCSK9特异性拮抗剂的结合或功能性抑制特征，虽然它们可能改善这些特性。 进行取代的目的不重要，可包括但绝不限于，用能够更好地维持或增强分子结构、分子的电荷或疏水性、或分子的大小的残基替代某一残基。例如，可希望用一种具有同样极性或电荷的残基取代一种不太理想的残基。可用本领域已知的标准技术(例如定位诱变和PCR介导的诱变)来引入此类修饰。本领域技术人员实现保守性氨基酸取代的一种具体方式是丙氨酸扫描诱变，描述于例如，MacLennan等，1998Acta Physiol.Scand.Suppl.643：55-67，和Sasaki等，1998Adv.Biophys.35：1-24中。然后用本领域可利用的或本文所述的功能性试验测试经改变的拮抗剂是否保留了功能或具有更好的功能。本文中将具有以下特征的PCSK9特异性拮抗剂称为本文公开的拮抗剂的“功能性等同物”并构成本发明的具体实施方式：具有一个或多个上述保守性氨基酸取代，保留了选择性结合于人PCSK9的能力，并且相对于不具有上述氨基酸变化的分子，拮抗PCSK9功能的水平相同或更佳。 

另一方面，本发明提供分离的PCSK9特异性拮抗剂，更具体的实施方式中提供抗体分子，其包含重链和/或轻链可变区，所述重链和/或轻链可变区包含与本文公开的抗体的相应氨基酸序列同源的氨基酸序列，其中所述抗体分子抑制对细胞LDL摄取的PCSK9依赖性抑制。具体实施方式是拮抗剂，其包含重链和/或轻链可变区，所述重链和/或轻链可变区分别与本文公开的重链和/或轻链可变区至少90％同源。提到“至少90％同源”包括至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、99和100％同源的序列。 

通常制备具有与本文所述的拮抗剂的氨基酸序列同源的氨基酸序列的PCSK9特异性拮抗剂来改善所述拮抗剂的一种或多种特性而不改变其对PCSK9的特异性。获得此类序列的一种方法(并非本领域技术人员可用的唯一方法)是使编码PCSK9特异性拮抗剂或其特异性决定区域的序列突变，表达包含这些突变序列的拮抗剂，使用可利用的功能性试验(包括本文所述的那些试验)来测试这些编码的拮抗剂是否保留了功能。可以通过定位诱变或随机诱变来突变。然而，本领域技术人员将理解，其他诱变方法可以容易地实现相同的效果。例如，某些方法中，用基于氨基酸的化学特性或者结构特性的非随机靶向保守取代或者用蛋白结构方面的考虑来限制突变体谱(spectrum)。在亲和力成熟实验中，单个经选择的分子(经随机或非随机选择)中可发现几个此类突变。对于亲和力成熟，还有各种基于结构的方法，描述于例如美国专利7,117,096、PCT公开号：WO02/084277和WO03/099999。 

如本文所用，两个氨基酸序列之间的百分比同源性等于两个序列之间的百分比同一性(identity)。两个序列之间的序列百分比同一性是序列共享的相同位置的数目的函数(即，％同源性＝相同位置的数目/位置总数目X100)，其中考虑缺口(gap)的数目和每一缺口的长度，需要将其引入用于两个序列的最优对比。可用本领域通常所知的方法进行序列比较和确定序列间的百分比同一性，可用数学算法实现这种序列比较和百分比同一性的确定。例如，可用Meyers和Miller，1988Comput.Appl.Biosci.4：11-17的算法(已整合入ALIGN程序(版本2.0))来确定氨基酸序列之间和/或核苷酸序列之间的百分比同一性。此外，可用从Accelrys 在线获得的GCG软件包中的GAP程序(使用其缺省参数)来确定氨基酸序列之间或核苷酸序列之间的百分比同一性。 

一方面中，本发明提供针对人PCSK9的分离的PCSK9特异性抗体分子，该抗体分子具有至少一个轻链可变结构域和至少一个重链可变结构域(分别是VL和VH)。 

对蛋白特异性分子进行操作以产生具有相似或更佳特异性的其他结合分子在本__领域技术人员的技能范围内。可例如使用重组DNA技术来实现这种操作。其中一个具体例子包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或一个或多个CDR的DNA适当地引入不同的免疫球蛋白的可变区、恒定区或恒定区加构架区。此类分子形成本发明的重要方面。可将本文具体公开的序列插入其中的具体免疫球蛋白或者本文具体公开的序列可形成其重要部分的具体免疫球蛋白包括但不限于以下抗体分子(形成本发明的具体实施方式)：Fab(具有可变轻链(VL)、可变重链(VH)、恒定轻链(CL)和恒定重链1(CH1)结构域的单价片段)、F(ab’)2(包含由二硫桥键(disulfide bridge)连接或者在绞链区连接的两个Fab片段的二价片段)、Fd(VH和CH1结构域)、Fv(VL和VH结构域)、scFv(单链Fv，其中VL和VH通过接头(例如肽接头)连接，参见例如Bird等，1988Science242：423-426，Huston等，1988PNAS USA85：5879-5883)、双特异性抗体分子(含有本文公开的PCSK9特异性抗体或抗原结合片段的抗体分子，所述PCSK9特异性抗体或抗原结合片段与具有与该抗体不同的结合特异性的第二功能性部分相连，所述笫二功能性部分包括但不限于另一种肽或者蛋白(例如抗体或受体配体))、双特异性单链Fv二聚体(参见例如PCT/US92/09965)、分离的CDR3、小体(单链-CH3融合物，自装配成约80kDa的二价二聚体)、‘scAb’(含有VH和VL以及CL或CH1的抗体片段)、dAb片段(VH结构域，参见例如Ward等，1989Nature341： 

544-546，和McCafferty等，1990Nature348：552-554；或VL结构域，Holt等，2003Trends in Biotechnology21：484-489)、双链抗体(参见例如Holliger等，1993PNAS USA90：6444-6448和国际申请号WO94/13804)、三链抗体、四链抗体、小体(连接于CH3的scFv；参见例如Hu等，1996Cancer Res.56：3055-3061)、IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgD、IgA、IgE或它们的任何衍生物，以及基于蛋白支架的人造抗体，其包括但不限于纤连蛋白III型多肽抗体(参见例如美国专利6,703,199和国际申请号WO02/32925)或细胞色素B(参见例如Koide等，1998J.Molec.Biol.284：1141-1151，和Nygren等，1997Current Opinion in Structural Biology7：463-469)。某些抗体分子(包括但不限于Fv、scFv、双链抗体分子或结构域抗体(Domantis))可通过引入二硫桥键线性化(line)VH和VL结构域来使其稳定。参见例如Reiter等，1996Nature Biotech.14：1239-1245。可以用常规技术(参见例如Holliger&Winter，1993Current Opinion Biotechnol.4：446-449，其中的具体方法包括化学制备或用杂合杂交瘤制备)和其他技术产生双特异性抗体，所述其它技术包括但不限于BiTETM技术(带有肽接头的、具有不同特异性的抗原结合区域的分子)和孔中圆丘(knobs-into-holes)工程 (参见例如Ridgeway等，1996Protein Eng.9：616-621)。可在大肠杆菌中生产双特异性双链抗体，本领域技术人员将理解，可用噬菌体展示技术在合适的文库中选择这些分子及其他PCSK9特异性拮抗剂(参见，例如国际申请号WO94/13804)。 

可从任何种系(germ-line)或重排的人可变结构域中获得可变结构域，在该可变 

结构域中插入感兴趣的CDR。也可合成制备可变结构域。可用重组DNA技术将CDR区域引入各个可变结构域。可实现上述引入的一种方式描述于Marks等，1992Bio/Technology10：779-783中。可变重链结构域可与可变轻链结构域配对以提供抗原结合位点。此外，可用独立的区域(例如，单独的可变重链结构域)结合抗原。本领域技术人员还意识到，可用重组方法通过合成接头连接Fv片段的两个结构域VL和VH(它们可能由分开的基因编码)，所述合成接头可使VL和VH成为单一蛋白链，在该单一蛋白链中VL和VH区域配对形成单价分子(scFvs)。具体实施方式提供位于种系构架区中的CDR。本文的具体实施方式提供选自SEQ ID NO：3的重链CDR，它们插入VH3替代有关的CDR。本文的具体实施方式提供选自SEQ ID NO：6的轻链CDR，它们插入VH3替代有关的CDR。 

具体实施方式提供本文定义的抗体分子，其包含含有选自以下的序列的轻链区 

域：8。另外的实施方式提供抗体分子，其包含本文所述的轻链区域和含有选自SEQ ID NO：7的序列的重链区域： 

本发明涵盖人抗体分子、人源化抗体分子、去免疫化(deimmunized)抗体分子、嵌合抗体分子和灵长化(primatized)抗体分子。本发明还涵盖由镶饰(veneering)工艺制备的抗体分子；参见例如Mark等，1994实验药理学手册(Handbook of Experimental Pharmacology)，第113卷：单克隆抗体的药理学(The pharmacology of monoclonal Antibodies)Springer-Verlag，pp.105-134。提及″人″时所说的本文公开的抗体分子具体指具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和/或恒定区的抗体分子，其中所述序列可以但不是必须被修饰/改变以具有不是由人种系免疫球蛋白序列编码的某些氨基酸取代或残基。可通过包括但不限于随机的或位点特异性体外诱变的方法或通过体内体细胞突变来引入此类突变。文献中讨论的突变技术的具体例子公开于Gram等，1992PNAS USA89：3576-3580；Barbas等，1994PNAS USA91：3809-3813，和Schier等，1996J.Mol.Biol.263：551-567。这些只是具体的例子并不代表唯一可用的技术。科学文献中有很多本领域技术人员可以使用并可以充分理解的突变技术。提及“人源化”所说的本文公开的抗体分子具体指其中衍生自另一种哺乳动物种类(例如小鼠)的CDR序列嫁接(grafted)到人构架序列上的抗体分子。提及“灵长化”时所说的本文公开的抗体分子指其中的非灵长类动物的CDR序列插入灵长类动物构架序列中的抗体分子。参见，例如WO93/02108和WO99/55369。 

本发明的具体抗体是单克隆抗体，具体实施方式中，本发明的具体抗体是以下抗体形式的一种：IgD、IgA、IgE、IgM、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或任何前述抗体形式的任何衍生 物。在这方面，术语“其衍生物”或“衍生物”具体包括：(i)在一个或两个可变区(即VH和/或VL)具有修饰的抗体和抗体分子；(ii)在VH和/或VL的恒定区进行了操作的抗体和抗体分子；和(iii)抗体和抗体分子，它们含有另外的、正常情况下并非免疫球蛋白分子的一部分的化学部分(例如，聚乙二醇化)。 

可变区的操作可以在VH和/或VL CDR区域中的一个或多个内。可使用定位诱变、随机诱变或产生序列或分子多样性的其它方法来产生突变体，然后用现有的体外或体内试验(包括本文所述的那些)来测试这些突变体的感兴趣的具体功能性质。 

本发明的抗体还包括那些抗体：其中已对VH和/或VL中的构架残基进行了修饰以改善感兴趣抗体的一种或多种特性。通常，进行此类构架修饰来减少抗体的免疫原性。例如，一种方法是对相应的种系序列进行一个或多个构架残基的“向后突变(backmutate)”。 

更具体地说，已经受体细胞突变的抗体可含有与衍生该抗体的种系序列不同的构架残基。可通过比较抗体构架序列与衍生该抗体的种系序列来鉴定此类残基。此类“向后突变”抗体也有意涵盖在本发明中。另一种类型的构架修饰包括使构架区或甚至一个或多个CDR区域中的一个或多个残基突变，以除去T细胞表位，从而降低抗体的潜在免疫原性。这种方法也称为“去免疫化”，在Carr等的美国专利公开号20030153043中有更详细的描述。 

除在构架区或CDR区内进行修饰之外，或者另外可选的，可将本发明抗体工程化(engineered)，以在Fc区(当该区存在时)中包含修饰，通常用来改变抗体的一种或多种功能特性，例如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。 

产生包括多种抗体同种型的“杂合子”或“组合的”IgG形式以引入(honein)所需的效应子功能性这一概念已有广泛描述；参见，例如Tao等，1991J.Exp.Med.173： 

1025-1028。本发明的具体实施方式涵盖在Fc区具有具体操作的抗体分子，已发现该操作导致对一部分抗体上的FcγR受体或Clq的结合降低。因此，本发明涵盖根据本说明书所述的抗体，所述抗体不引起(或以较小程度引起)抗体依赖性细胞毒性(“ADCC”)、补体介导的细胞毒性(“CMC”)，或形成免疫复合物，同时保留正常的药代动力学(“PK”)特性。 

另一方面中，本发明提供编码公开的PCSK9特异性拮抗剂的分离核酸。所述核酸可存在于完整细胞、细胞裂解物中，或以部分纯化或基本纯化的形式存在。当使用例如标准技术将核酸从其它细胞组分或其它污染物(例如其它细胞核酸或蛋白)中纯化出来时，称该核酸是“分离的”或“被基本纯化的(rendered substantially pure)”，所述标准技术非限制性包括碱/SDS处理、CsCl条带、柱色谱法、琼脂糖凝胶电泳及本领域已知的其他合适方法，该核酸可包括DNA(包括cDNA在内)和/或RNA。可用标准的分子生物学技术获得本发明的核酸。对于杂交瘤(例如，从带有人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体而言，可通过标准的PCR扩增或cDNA克隆技术获得杂交瘤所产生的抗体的轻链和重链的编码cDNA。对于从免疫球蛋白基因文库中(例如，利用噬菌体展示技术)获得的抗体而言，可从 文库中回收(recover)编码抗体的核酸。 

本发明涵盖编码本文公开的可变重链和/或轻链及它们的所选组分(特别是公开的各自的CDR3区)的分离的核酸。在本文的具体实施方式中，在抗体构架区内提供CDR。 

不限于一下形式：F(ab’)2、Fab、Fv、scFv、双特异性抗体分子(含有本文公开的PCSK9特异性抗体或抗原结合片段，所述PCSK9特异性抗体或抗原结合片段与具有和该抗体不同结合特异性的第二功能性部分相连，所述第二功能性部分包括但不限于另一种肽或者蛋白例如抗体或受体配体)、双特异性单链Fv二聚体、小体、dAb片段、双链抗体、三链抗体或四链抗体、小体、IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgD、IgA、IgE、或它们的任何衍生物。 

另一方面，本发明提供包含本发明多肽的分离的细胞。 

另一方面，本发明提供制备本发明的PCSK9特异性拮抗剂的方法，其包括：在允许表达PCSK9特异性拮抗剂或表达并装配所述重链和/或轻链成为PCSK9特异性拮抗剂的条件下培养细胞，所述细胞包含编码对人PCSK9有特异性的PCSK9特异性拮抗剂或所需的PCSK9特异性拮抗剂的重链和/或轻链的核酸；以及从所述细胞分离所述PCSK9特异性拮抗剂。产生具体的所需重链和/或轻链序列的一个例子是首先使用PCR扩增(和修饰)种系重链和/或轻链可变序列。本领域技术人员可容易地获得人重链和/或轻链可变区的种系序列，参见例如“Vbase”人种系序列数据库，和Kabat，E.A.等，1991Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美国健康和公共事业部(Department of Health and Human Services)，NIH出版号91-3242；Tomlinson，I.M.等，1992“The Repertoire of Human Germline VHSequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with DifferentHypervariable Loops”J.Mol.Biol.227：776-798；和Cox，J.P.L.等，1994“A Directory of Human Germ-line Vκ Segments Reveals a Strong Bias intheir Usage”Eur.J.Immunol.24：827-836。可用标准方法，例如PCR介导的诱变(其中突变被掺入到PCR引物中)或定位诱变来实施种系序列的诱变。如果需要全长抗体，则用于人重链恒定区基因的序列是可获得的；参见例如Kabat.E.A.等，1991Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美国健康和公共事业部，NIH出版号91-3242。可通过例如标准的PCR扩增来获得含有这些区域的片段。或者，本领域技术人员可利用已编码重链和/或轻链恒定区的载体。 

存在可利用技术来重组产生保留原始抗体的特异性的其它抗体分子。这方面的具 

体例子是，将编码免疫球蛋白可变区或CDR的DNA引入另一种抗体分子的恒定区、或恒定区和构架区；参见例如EP-184,187、GB2188638和EP-239400。抗体分子(包括嵌合抗体)的克隆和表达描述在文献中；参见例如EP0120694和EP0125023。 

基于拮抗剂的药学上可接受的组合物可以是液体或固体形式。可采用可用于制备液体或固体剂型的任何技术。此类技术在本领域技术人员的能力范围内。可通过任何可利用方法(包 括但不限于冻干、喷雾干燥或用超临界流体技术干燥)，来制备固体剂型。用于口服的固体剂型可以是能够使患者在规定的时间段内获得规定数量的拮抗剂的任何形式。口服配方制剂可以采取很多固体制剂形式，包括但不限于片剂、胶囊或散剂。或者固体剂型可以是冻干的并在给药前溶解于溶液中，用于单剂或多剂给药。拮抗剂组合物通常应配制在生物学上相应(biologically relevant)的pH范围内，可经过缓冲以在存储期间维持适当的pH范围。液体和固体剂型通常都要求在较低温度下(例如2-8℃)下存储，以使稳定性保持较长的时间。配制的(formulated)拮抗剂组合物(特别是液体制剂)可含有抑菌剂以防止存储期间发生蛋白水解或使蛋白水解最小化，所述抑菌剂包括但不限于有效浓度(例如≤1％w/v)的苄醇、苯酚、间甲酚、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和/或对羟基苯甲酸丙酯。抑菌剂可能对一些患者是禁忌的。因此，可在含有或不含这种组分的溶液中重建冻干的制剂。另外的组分可加到缓冲的液体或固体拮抗剂制剂中，所述另外的组分包括但不限于糖作为防冻剂(包括但不限于多羟基碳氢化合物，如山梨糖醇、甘露糖醇、甘油，以及卫矛醇和/或二糖如蔗糖、乳糖、麦芽糖或海藻糖)，以及在有些情况下包括有关的盐(包括但不限于NaCl、KCl或LiCl)。此类拮抗剂制剂，特别是计划要长期储存的液体制剂，依靠总同渗浓度(total osmolarity)的有效范围(useful range)来促进在例如2-8℃或更高温度下的长期稳定性，同时还使制剂用于胃肠外注射。适当时，可包含防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其它添加剂。制剂可含有二阶阳离子(包括但不限于MgCl2、CaCl2和MnCl2)；和/或非离子表面活性剂(包括但不限于聚山梨酯-80(Tween80TM)、聚山梨酯-60(Tween60TM)、聚山梨酯-40(Tween40TM)和聚山梨酯-20(Tween20TM)；聚氧乙烯烷基醚，包括但不限于Brij58TM、Brij35TM；及其他例如Triton X-100TM、TritonX-114TM、NP40TM、Span85和普卢兰尼克(Pluronic)系列的非离子表面活性剂(例如Pluronic121))。此类组分的任何组合形成本发明的具体实施方式。 

液体形式的药物组合物可包含液体载体，例如水、石油(petroleum)、动物油、植物油、矿物油或合成油。液体形式还可包含生理盐水、右旋糖或其它糖类溶液或二醇例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。 

优选地，药物组合物的形式是胃肠外可接受的水溶液，其无热原，具有合适的pH、 

张力和稳定性。药物组合物可配制成用于在等渗载体中稀释之后给药，所述等渗载体例如为氯化钠注射液、林格氏(Ringer’s)注射液或乳酸盐(Lactated)林格氏注射液。 

拮抗剂治疗的剂量给药(dosing)在本领域技术人员的能力范围内，参见例如Lederman等，1991Int.J.Cancer47：659-664；Bagshawe等，1991Antibody，Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals4：915-922，并基于很多因素而变化，所述因素包括但不限于所用的具体PCSK9特异性拮抗剂、治疗的患者、患者状况、治疗的面积、给药途径和所需的治疗。具有一般技能的医师或兽医能够容易地确定拮抗剂的治疗有效量并开具处方。剂量范围可以是主体体重的约0.01-100mg/kg，更通常为0.05-25mg/kg。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、 1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg体重范围内。出于说明而非限制的目的，在具体实施方式中，可使用5mg-2.0g的剂量全身递送拮抗剂。实现最精确地使拮抗剂浓度在产生效力但无毒性的范围内，需要有基于药物对于靶位点的可用性的动力学的给药方案。这涉及考虑PCSK9特异性拮抗剂的分布、平衡和消除。本文所述的拮抗剂可以合适的剂量单独使用。或者，与其他物质共同给药或顺序给药可能是合意的。有可能提供供本发明PCSK9特异性拮抗剂和可选治疗方案联用的治疗剂量方案。例如，PCSK9特异性拮抗剂可与其它降胆固醇药(包括但不限于胆固醇吸收抑制剂(例如ZetiaTM)和胆固醇合成抑制剂(例如ZocorTM和VytorinTM))联用或并用。能够治疗的个体(对象)包括灵长类动物，人和非人，并包括具有商业或家庭兽医(domestic veterinary)重要性的任何非人哺乳动物或脊椎动物。 

可通过本领域公知的任何给药途径将PCSK9特异性拮抗剂给予个体，所述给药途径包括但不限于口服、注射给药(具体实施方式包括静脉内、皮下、腹膜内或肌肉注射)、吸入给药、鼻内给药或局部给药，单独给药或与有助于治疗个体的其他药剂联合给药。应根据本领域技术人员公知的多种考虑来确定给药途径，所述考虑包括但不限于治疗所需的生理化学特征。可以每日、每周、每两周或每月为基础，或以能够在规定的时间向个体递送合适量的PCSK9特异性拮抗剂从而实现并维持所需治疗的任何其他方案来提供治疗。可单剂量给予制剂或者分次(at separate times)给予多剂。 

具体实施方式中，治疗的病症选自：高胆固醇血症、冠心病、代谢综合征、急性冠状动脉综合征和相关病症。PCSK9特异性拮抗剂在制备药物中的用途形成本发明的重要实施方式，所述药物用于治疗PSCK9相关病症或者能够受益于PCSK9拮抗剂的病症，包括上述那些病症。 

实施例1 

构建pcsk9的Fab 

表达和纯化来自于独特的PCSK9ELISA-阳性克隆的FAB 

来自ELISA阳性克隆的Fab(F16-15)以及EsB(阴性对照)Fab通过IPTG诱导在大肠杆菌TG1F-细胞中表达。裂解培养物，通过固定化金属离子亲和层析(IMAC)纯化组氨酸标记的Fab，通过离心渗滤将蛋白交换到25mM HEPES pH7.3/150mMNaCl中。在Caliper Lab-Chip90和常规的SDS-PAGE上电泳分析蛋白，用Bradford蛋白测定法定量。系列稀释的纯化的Fab蛋白用ELISA再测定，以证实纯化的Fab的活性。如上所述进行阳性和阴性对照。用如下所述的外极(EXOPOLAR)(胆固醇摄取)试验分析纯化的Fab制剂。 

实施例2 

外极试验：外源PCSK9对细胞LDL摄取的影响 

第1天，将30,000细胞/孔接种在polyD-赖氨酸涂覆的96孔板中。第2天，将培养基更换为不含血清的DMEM培养基。第3天，除去培养基，用OptiMEM洗涤细胞。将纯化的PCSK9加入到含有LPDS和dI-LDL的100μl DMEM培养基中。37℃孵育板6.5小时。在含有2mg/ml BSA的TBS中迅速洗涤细胞；然后在TBS-BSA中洗涤2分钟；然后用TBS(但快速)洗涤两次。在100μl RIPA缓冲液中裂解细胞。然后用Ex520、Em580nm检测板中的荧光。用BCA蛋白测定法检测各孔中的总细胞蛋白，并将荧光单位(fluorescence units) 

归一化至总蛋白。 

外极试验有效鉴定对LDL摄取的各种效果；参见图2，图2说明了在外极试验中PCSK9突变体的效力如何与血浆LDL-胆固醇相关。数据如下表所示： 

表1 

突变	获得/丧失	LDL-C（mg/dL）	EC-50（nM）外极
				S127R	获得	289	12
D374Y	获得	411	2.5
				野生型		160	55

结果：抗体分子F16-15剂量依赖性抑制PCSK9对LDL摄取的影响；可再现性地观察到这种效果。加入细胞中的PCSK9的量是约320nM。抗体分子包含：F16-15对LDL摄取的PSCK9依赖性影响的剂量依赖性抑制。图3有两个对照：(i)仅有细胞的对照，显示细胞LDL摄取的基线水平，和(ii)细胞+PCSK9(25/ml)对照，显示LDL摄取的PCSK9依赖性损失水平。在图表中所示PCSK9固定浓度(25/ml)和Fab递增浓度下进行包括Fab和PCSK9的滴定试验。图3显示IC-50的计算。1CX1G08显示对细胞LDL摄取的PCSK9依赖性抑制具有53％的抑制，而3CX4B08显示61％的抑制。 

图4说明了3BX5C01和3CX2A06对LDL摄取的PSCK9依赖性影响的剂量依赖性抑制。 

图4有两个对照：(i)仅有细胞的对照，显示细胞LDL摄取的基线水平，和(ii)细胞+PCSK9(25/ml)对照，显示LDL摄取的PCSK9依赖性损失水平。在图表中所示PCSK9固定浓度(25/ml)和Fab递增浓度下进行包括Fab和PCSK9的滴定试验。图4显示IC-50的计算。3BX5C01显示对细胞LDL摄取的PCSK9依赖性抑制具有25％的抑制，而3CX2A06显示23％的抑制。图5A-5B说明了3CX3D02对LDL摄取的PSCK9依赖性影响的剂量依赖性抑制。图5B有两个对照：(i)仅有细胞的对照，显示细胞LDL摄取的基线水平，(ii)细胞+PCSK9(25/ml)对照，显示LDL摄取的PCSK9依赖性损失水平。在图表中所示PCSK9固定浓度(25/ml)和F16-15递增浓度下进行包括Fab和PCSK9的滴定试验。图5A显示IC-50的计算。3CX3D02显示对细胞LDL摄取的PCSK9依赖性抑制具有23％的抑制。 

实施例3 

用表面等离子共振(“SPR”)评估抗体与hPCSK9相互作用的动力学 

用BiacoreTM(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，瑞典)3000系统进行SPR检测。传感器芯片CM5和用于固定的胺偶联试剂盒购自BiacoreTM。 

用Biacore3000控制软件Wizard中的氨基偶联方法将抗体F16-15偶联到CM5芯片的FC2通道上。HBS-EP作为工作缓冲液，3.3mg/mL的抗体F16-15用pH4.26，10mM NaAC稀释至终浓度为11μg/mL。芯片表面用0.2M EDC和50mM NHS1:1混合以10μL/min的流速进样7分钟，然后注射抗体溶液，以pH8.5,1M ethanolamine进样7分钟，封闭活化的芯片表面。抗体F16-15的最终偶联量为8916.1RU。 

hPCSK9抗原用HBS-EP缓冲液按一定比例进行稀释为0、1.18、1.68、2.4、3.4、4.9、7.0和10nM；抗体与抗原的相互作用分别用Biacore3000控制软件中的结合分析Wizard进行动力学实验。所有抗原进样时，流速为20μL/min，进样2min，等待2.5min，解离3min，然后用HBS-EP缓冲液以30μL/min的流速进行再生。得到的数据根据Biacore3000分析软件中的1∶1Langmuir结合模型进行拟合，得到确切的动力学常数。 

表3说明了检测到的本文公开的抗PCSK9抗体F16-15的动力学参数： 

表3 

抗体	抗原	Ka（1/Ms）	Kd（1/s）	KD（nM）
					F16-15	Hpcsk9	9.19e5	1.89e-3	2.05

PCSK9特异性抗体作为活体内PCSK9拮抗剂的效果 

PCSK9拮抗剂抗体降低小鼠血清胆固醇 

要决定PCSK9拮抗剂单克隆抗体是否能藉由抑制细胞外PCSK9的功能而影响活体内胆固醇水平，测试F16-15于活体外针对小鼠PCSK9及当被注射至小鼠时对血清胆固醇的作用。7周龄C57bl/6公鼠被饲养于12小时光/暗循环下，第-7天采血以收集约70μl的血清。拮抗剂PCSK9抗体F16-15及对照同种型吻合单克隆抗体于第0、1、2及3天经腹腔内注射至7周龄C57bl/6公鼠。小鼠于第4天不禁食牺牲，收集血清样本。所有冷冻血清样本测量总胆固醇、三酸甘油脂、高密度脂蛋白(HDL)胆固醇及LDL胆固醇。图6显示F16-15降低48％的血清胆固醇，然而对照抗体不具任何显著效果。如预期的，F16-15治疗动物的肝脏LDLR量相较于对照抗体治疗者降低(图6)。 

c.拮抗剂PCSK9单克隆抗体对小鼠血清胆固醇具有延长效果 

进行时间进程试验以决定PCSK9拮抗剂抗体于小鼠的胆固醇降低效果的起始时间及作用期间。单克隆抗体F16-15或盐水对照各以10mg/kg或3ml/kg经静脉注射至48只6周龄C57bl/6小鼠。各治疗组中8只小鼠于注射后第1、2、4、7、14及21天牺牲。单次注射F16-15产生快速且延长的血清胆固醇降低效果。注射后24小时可见血清胆固醇降低25％。见图7。血清胆固醇最大下降在第7天时间点观察到。在第21天时，胆固醇下降不再具有统计显著性。B部分显示HDL胆固醇。LDL胆固醇非常低。 

本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。 

Claims (10)

1.分离的人PCSK9特异性拮抗剂，其拮抗人PCSK9对细胞LDL摄取的抑制，其中所述人PCSK9特异性拮抗剂是抗体或其抗原结合片段，并且其中所述抗体，其中重链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列分别如SEQ ID NO：1、2和3所示；并且轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列分别如SEQ ID NO：4、5和6所示。

2.如权利要求1所述的人PCSK9特异性拮抗剂，其中所述抗体的重链可变区含如SEQ IDNO：7所示和/或所述抗体的轻链可变区含如SEQ ID NO：8所示。

3.如权利要求1所述的人PCSK9特异性拮抗剂，其中所述抗体的重链如SEQ ID NO：9所示和/或所述抗体的轻链如SEQ ID NO：10所示。

4.组合物，其包含权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂和药学上可接受的载体。

5.权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂在制备用于拮抗PCSK9功能的药物中的用途。

6.权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂在制备药物中的用途，所述药物用于改善由PCSK9功能引起和/或加剧的紊乱、病症或疾病。

7.编码权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂的重链可变区和轻链可变区的分离的核酸。

8.体外或原位的分离的宿主细胞或宿主细胞群体，其包含权利要求7所述的核酸。

9.体外或原位的分离的宿主细胞或宿主细胞群体，其包含权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂。

10.权利要求1所述的PCSK9特异性拮抗剂的制备方法，其包括：

(a)在适于产生PCSK9特异性拮抗剂的条件下培养权利要求8所述的细胞或细胞群体；和

(b)分离所产生的PCSK9特异性拮抗剂。