CN103261230A

CN103261230A - 抗pcsk9抗体及使用方法

Info

Publication number: CN103261230A
Application number: CN2011800598912A
Authority: CN
Inventors: 吴岩; 塞西莉亚·秋; 丹尼尔·柯克霍弗; 安德鲁·彼得森; 加内什·科卢马姆; 莫妮卡·康贝尔特兰; 保罗·莫兰; 李蔚
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2010-12-22
Filing date: 2011-12-21
Publication date: 2013-08-21
Also published as: ZA201304153B; AU2011348232A1; CA2820953A1; EP2655419A1; KR20130118925A; TW201307391A; CR20130336A; SG191219A1; EA201390929A1; US20120195910A1; MX2013007168A; WO2012088313A1; ECSP13012786A; BR112013015687A2; CO6721041A2; AR084456A1; JP2014511106A; MA34818B1

Abstract

本发明提供抗PCSK9抗体及其使用方法。

Description

抗PCSK9抗体及使用方法

相关申请

本申请要求于2011年4月21日提交的美国临时申请序号61/477,788，和于2010年12月22日提交的61/426,343的利益。上述申请的所有教导通过引用结合于此。

序列表

本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式经由EFS-Web提交，并且通过引用完整地结合于此。所述于2011年12月12日生成的ASCII拷贝被命名为P4539RWO.txt并且大小为28,948字节。

发明领域

本发明涉及抗PCSK9抗体及其使用方法。

发明背景

前蛋白转化酶枯草溶菌素/kexin型9(Proprotein convertasesubtilisin/kexin type9)(PCSK9)是哺乳动物前蛋白转化酶枯草溶菌素家族的成员。PCSK9通过控制在血流中循环的低密度脂蛋白(LDL)颗粒的水平在胆固醇代谢中起关键作用。升高的PCSK9水平已经显示降低肝中LDL-受体水平，导致血浆中高水平的LDL-胆固醇，并且导致增加的对冠状动脉疾病的易感性。(Peterson等，J Lipid Res.49(7)：1595-9(2008))。因此，高度有利的是制备抑制或拮抗PCSK9的活性和PCSK9在不同治疗条件下所起的相应作用的基于治疗的PCSK9的拮抗剂。

发明概述

本发明部分基于多种针对PCSK9的抗体。PCSK9呈现为重要和有利的治疗靶标，并且本发明提供作为用于靶向与PCSK9的表达和/或活性相关的病理学状态的治疗和诊断剂的抗体。因此，本发明提供与PCSK9相关的方法、组合物、试剂盒和制品。

在某些实施方案中，提供结合PCSK9或其片段的抗体或抗体片段，其中所述抗体包含可变结构域，所述可变结构域包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自由以下各项组成的组的高变区(HVR)序列：

(i)HVR-H1，所述HVR-H1包含GFTFX₁X₂X₃X₄IH(SEQ ID NO：28)，其中X₁是S或T；X₂是G、R或S；X₃是H、T或Y；X₄是A或T；

(ii)HVR-H2，所述HVR-H2包含RISPANGNTNYADSVKG(SEQ IDNO：4)；

(iii)HVR-H3，所述HVR-H3包含WIGSRELYIMDY(SEQ ID NO：5)；

(iv)HVR-L1，所述HVR-L1包含RASQDVSX₁AVA(SEQ ID NO：29)，其中X₁是S或T；

(v)HVR-L2，所述HVR-L2包含SASX₁LYS(SEQ ID NO：30)，其中X₁是F或S；和

(vi)HVR-L3，所述HVR-L3包含QQSYX₁X₂X₃X₄T(SEQ ID NO：31)，其中X₁是P、R或T；X₂是A、I、S或T；X₃是L、P或Q；X₄是A、H、P或S。

在某些实施方案中，提供结合PCSK9或其片段的抗体或抗体片段，其中所述抗体包含可变结构域，所述可变结构域包含以下六种HVR序列：

(ii)HVR-H2，所述HVR-H2包含RISPANGNTNYADSVKG(SEQ IDNO：4)；

(iii)HVR-H3，所述HVR-H3包含WIGSRELYIMDY(SEQ ID NO：5)；

在某些实施方案中，提供结合PCSK9或其片段的抗体或抗体片段，其中所述抗体包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3，(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO：4，和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO：5。在某些实施方案中，所述抗体还包含(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：26；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14。

在某些实施方案中，提供结合PCSK9或其片段的抗体或抗体片段，其中所述抗体包含(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ IDNO：6或SEQ ID NO：7；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ IDNO：8或SEQ ID NO：26；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14。在某些实施方案中，所述抗体还包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3，(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO：4，和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO：5.

在一个实施方案中，提供结合PCSK9或其片段的抗体或抗体片段，其中所述抗体包含：

(1)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列SEQ ID NO：1；

(2)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO：4；

(3)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO：5；

(4)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO：6；

(5)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO：26；和

(6)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO：9。

(1)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列SEQ ID NO：1；

(2)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO：4；

(3)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO：5；

(4)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO：7；

(5)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO：8；和

(6)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO：10。

在另一个实施方案中，提供结合PCSK9或其片段的抗体或抗体片段，其中所述抗体包含：

(1)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列SEQ ID NO：1；

(2)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO：4；

(3)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO：5；

(4)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO：7；

(5)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO：8；和

(6)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO：11。

(1)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列SEQ ID NO：2；

(2)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO：4；

(3)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO：5；

(4)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO：7；

(5)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO：8；和

(6)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO：12。

(1)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列SEQ ID NO：3；

(2)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO：4；

(3)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO：5；

(4)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO：7；

(5)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO：8；和

(6)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO：13。

(1)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列SEQ ID NO：1；

(2)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO：4；

(3)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO：5；

(4)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO：7；

(5)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO：8；和

(6)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO：14。

在某些实施方案中，提供结合PCSK9或其片段的抗体或抗体片段，其中所述抗体包含(a)VH序列，所述VH序列与氨基酸序列SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：27具有至少95％序列同一性；或(b)VL序列，所述VL序列与氨基酸序列SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22或SEQ IDNO：23具有至少95％序列同一性。

在某些实施方案中，提供结合PCSK9或其片段的抗体或抗体片段，其中所述抗体包含SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQID NO：27的VH序列。在某些实施方案中，所述抗体还包含SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22或SEQID NO：23的VL序列。

在一个实施方案中，提供结合PCSK9或其片段的抗体或抗体片段，其中所述抗体包含SEQ ID NO：15的VH序列和SEQ ID NO：18的VL序列。在另一个实施方案中，提供结合PCSK9或其片段的抗体或抗体片段，其中所述抗体包含SEQ ID NO：15的VH序列和SEQ ID NO：19的VL序列。在另一个实施方案中，提供结合PCSK9或其片段的抗体或抗体片段，其中所述抗体包含SEQ ID NO：27的VH序列和SEQ ID NO：20的VL序列。在另一个实施方案中，提供结合PCSK9或其片段的抗体或抗体片段，其中所述抗体包含SEQ ID NO：16的VH序列和SEQ ID NO：21的VL序列。在另一个实施方案中，提供结合PCSK9或其片段的抗体或抗体片段，其中所述抗体包含SEQ ID NO：17的VH序列和SEQ ID NO：22的VL序列。在另一个实施方案中，提供结合PCSK9或其片段的抗体或抗体片段，其中所述抗体包含SEQ ID NO：27的VH序列和SEQ ID NO：23的VL序列。

在某些实施方案中，提供结合PCSK9或其片段的抗体或抗体片段，其中所述抗体结合PCSK9的片段内的表位。在某些实施方案中，提供结合PCSK9或其片段的抗体或抗体片段，其中所述抗体结合包含人PCSK9氨基酸序列SEQ ID NO：24的氨基酸376至379的PCSK9的片段内的表位。在某些实施方案中，根据本发明的抗体的功能和/或结构表位包括人PCSK9的残基D238。在某些实施方案中，根据本发明的抗体的功能和/或结构表位包括人PCSK9的残基A239。在某些实施方案中，根据本发明的抗体的功能和/或结构表位包括人PCSK9的残基D238和A239。在某些实施方案中，根据本发明的抗体的功能和/或结构表位包括人PCSK9的残基E366。在某些实施方案中，根据本发明的抗体的功能和/或结构表位包括人PCSK9的残基D367。在某些实施方案中，根据本发明的抗体的功能和/或结构表位包括人PCSK9的残基E366和D367。在某些实施方案中，根据本发明的抗体的功能和/或结构表位包括人PCSK9的残基H391。在某些实施方案中，根据本发明的抗体的功能和/或结构表位包括人PCSK9的残基E366、D367和H391。根据另一个实施方案，根据本发明的抗体的功能和/或结构表位包括人PCSK9的残基A239和H391。在某些实施方案中，功能和/或结构表位包括人PCSK9的残基A239，A341，E366、D367和H391中的一个或多个。在某些实施方案中，功能和/或结构表位包括邻近人PCSK9的A239，A341，E366、D367和H391的残基中的一个或多个。在某些实施方案中，根据本发明的抗体的功能和/或结构表位包含(i)至少一个选自由以下各项组成的组的残基：人PCSK9的R194和E195，(ii)至少一个选自由以下各项组成的组的残基：人PCSK9的D238和A239，(iii)至少一个选自由以下各项组成的组的残基：人PCSK9的A341和Q342，和(iv)至少一个选自由以下各项组成的组的残基：人PCSK9的E366、D367、I369、S376、T377、C378、F379、S381和H391。在某些实施方案中，功能和/或结构表位包含以下残基中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个或全部：人PCSK9的R194，E195，D238，A239，A341，Q342，E366、D367、I369、S376、T377、C378、F379、S381和H391。

在某些实施方案中，抗PCSK9抗体是单克隆抗体。在某些实施方案中，抗PCSK9抗体是人源化的。在某些实施方案中，抗PCSK9抗体是人抗体。在某些实施方案中，至少部分的抗PCSK9抗体的框架序列是人共有框架序列。在一个实施方案中，抗体是选自以下的抗体片段：Fab，Fab’-SH，Fv，scFv或(Fab’)₂片段。

在一方面中，提供编码任何以上抗PCSK9抗体的核酸。在一个实施方案中，提供包含所述核酸的载体。在一个实施方案中，载体是表达载体。在一个实施方案中，提供包含所述载体的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的。在另一个实施方案中，宿主细胞是哺乳动物的。在另一个实施方案中，宿主细胞是原核的。在一个实施方案中，提供制备抗PCSK9抗体的方法，其中所述方法包含在适于表达编码所述抗体的核酸的条件下培养所述宿主细胞，以及分离所述抗体。在某个实施方案中，所述方法还包括从宿主细胞回收抗PCSK9抗体。在某些实施方案中，提供包含本文所述的任何抗PCSK9抗体的组合物。在一个实施方案中，所述组合物还包含药用载体。

在一方面中，本发明涉及在受试者中抑制PCSK9与LDL-受体(LDLR)结合的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何抗PCSK9抗体。在另一方面中，本发明涉及降低受试者的胆固醇水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何抗PCSK9抗体。在一个实施方案中，胆固醇是LDL-胆固醇。在另一方面中，本发明涉及降低受试者的LDL-胆固醇水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何抗PCSK9抗体。在某些实施方案中，本发明涉及降低受试者的血清LDL-胆固醇水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任一种抗PCSK9抗体。在另一方面中，本发明涉及治疗受试者的与升高的LDL-胆固醇水平相关的病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任一种抗PCSK9抗体。

在一方面中，本发明涉及治疗胆固醇相关疾病的方法。预期的胆固醇相关疾病的示例性和非限制性列表提供在本文中的“组合物和方法”下。在某些实施方案中，胆固醇相关疾病是高胆固醇血症(hypercholesterolemia)。在某些实施方案中，本发明涉及治疗高胆固醇血症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任一种抗PCSK9抗体。在某些实施方案中，本发明涉及预防和/或治疗动脉粥样硬化(atherosclerosis)和/或心血管疾病的方法。在某些实施方案中，本发明涉及降低个体中复发的心血管事件的风险的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的本文所述的任一种抗PCSK9抗体。

在一方面中，本发明涉及治疗可以通过消除、抑制或降低PCSK9活性而被改善、减缓、抑制或预防的任何疾病或病症的方法。在某些实施方案中，可以通过使用他汀类(statins)治疗或预防的疾病或病症也可以使用本文所述的任一种抗PCSK9抗体来治疗。在某些实施方案中，可以受益于防止胆固醇合成或提高的LDLR表达的疾病或病症也可以使用本文所述的任一种抗PCSK9抗体来治疗。

在某些实施方案中，本文所述的方法还包括向所述受试者施用有效量的第二药物，其中所述抗PCSK9抗体是第一药物。在一个实施方案中，第二药物提升水LDLR蛋白的水平。在另一个实施方案中，第二药物降低LDL-胆固醇的水平。在另一个实施方案中，第二药物包含抑制素(statin)。在另一个实施方案中，抑制素选自由以下各项组成的组：阿托伐他汀(atorvastatin)，氟伐他汀(fluvastatin)，洛伐他汀(lovastatin)，美伐他汀(mevastatin)，匹伐他汀(pitavastatin)，普伐他汀(pravastatin)，罗舒伐他汀(rosuvastatin)，辛伐他汀(simvastatin)，及其任意组合。在另一个实施方案中，第二药物提升HDL-胆固醇的水平。在某些实施方案中，受试者或个体是人。

在一方面中，本发明涉及检测怀疑含有PCSK9蛋白的样品中PCSK9蛋白的方法，所述方法包括(a)将样品与本文所述的抗PCSK9抗体接触；和(b)检测抗PCSK9抗体和PCSK9蛋白间的复合物的形成。在一个实施方案中，抗PCSK9抗体是被可检测地标记的。

本文所述的任何实施方案或其任何组合适用于本文所述的发明的任何和所有抗PCSK9抗体、方法和用途。

附图简述

图1显示抗PCSK9抗体的重链HVR序列，H1(SEQ ID NO1，1，1-3和1，分别地，以出现的次序)，H2(都被公开为SEQ ID NO：4)，和H3(都被公开为SEQ ID NO：5)，和轻链HVR序列，L1(SEQ ID NO：6，7，7，7，7和7，分别地，以出现的次序)，L2(SEQ ID NO：26，8，8，8，8和8，分别地，以出现的次序)和L3(SEQ ID NO：9-14，分别地，以出现的次序)。

图2A-B显示抗PCSK9抗体的以下氨基酸序列：(A)重链可变结构域(SEQ ID NO：15，15，27，16-17和27，分别地，以出现的次序)和(B)轻链可变结构域(SEQ ID NO：18-23，分别地，以出现的次序)。位置按照Kabat被编号并且高变区被加框。

图3A-D显示抗PCSK9抗体(IgG)对(A)人PCSK9，(B)鼠PCSK9，(C)食蟹猴(cyno)PCSK9和大鼠PCSK9，以及(D)恒河猴(rhesus)PCSK9的解离常数。

图4.在竞争结合ELISA中抗PCSK9抗体抑制PCSK9与LDLR的结合。空白(无抗体；空心方框)和对照抗体(空心圆)以虚线显示。抗PCSK9抗体以实线显示。抗PCSK9抗体的IC₅₀值显示在表中。

图5.将不同浓度的抗PCSK9抗体与15μg/ml PCSK9温育并加入到HepG2细胞达4小时。处理细胞以用于表面LDLR的FACS分析。数据指示抗PCSK9抗体有效地防止LDLR减量调节。阳性对照是未用PCSK9处理的细胞。

图6.使用抗LDLR抗体的蛋白印迹显示30μg的PCSK9处理1小时显著地减量调节小鼠肝中的LDLR水平。

图7.使用抗LDLR抗体的蛋白印迹显示所有五种抗PCSK9抗体防止小鼠肝中的LDLR减量调节。底部的免疫印迹是每个治疗组4个肝(每个肝10μg蛋白)的组合(pool)。

图8显示单次静脉内注射后在C57JBL/6小鼠血清中的抗PCSK9抗体浓度。显示的是用药组0.5mg/kg；5mg/kg；和20mg/kg(n＝3)的平均浓度。

图9显示单次静脉内注射5mg/kg抗PCSK9抗体后C57JBL/6 WT和PCSK9^-/-小鼠血清中的抗PCSK9抗体浓度的比较。显示了每个用药组的平均浓度(n＝3)。

图10显示单次静脉内注射后个体食蟹猴的血清中的抗PCSK9抗体浓度。包括三个用药组：5mg/kg；20mg/kg；和60mg/kg。

图11显示单次静脉内注射后食蟹猴血清中的抗PCSK9抗体浓度。显示的是用药组5mg/kg，20mg/kg和60mg/kg(n＝3)的平均浓度。

图12显示用单剂量(10mg/kg体重)的对照(Crtl)或抗PCSK9抗体处理的小鼠的血清中的总胆固醇水平。在图中所示的不同日期测量胆固醇水平。

图13显示在来自用单剂量(10mg/kg体重)的对照或抗PCSK9抗体处理的小鼠的血清中的总胆固醇水平。

发明实施方案详述

本文描述或引用的技术和方法一般被很好的理解，并且通常为本领域技术人员使用常规方法所采用，如，例如在以下文献中所述的被广泛使用的方法：Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)第3版(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY(分子生物学中的最新实验方法)(F.M.Ausubel等编辑，(2003))；系列METHODS IN ENZYMOLOGY(Academic Press，Inc.)：PCR2：APRACTICAL APPROACH(PCR 2：实用方法)(M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor编辑(1995))，Harlow和Lane编辑(1988)ANTIBODIES，A LABORATORY MANUAL(抗体，实验室手册)，和ANIMAL CELLCULTURE(动物细胞培养)(R.I.Freshney编辑(1987))；OligonucleotideSynthesis(寡核苷酸合成)(M.J.Gait编辑1984)；Methods in MolecularBiology(分子生物学中的方法)，Humana Press；Cell Biology：A LaboratoryNotebook(细胞生物学：实验室手册)(J.E.Cellis编辑1998)Academic Press；Animal Cell Culture(动物细胞培养)(R.I.Freshney)编辑，1987)；Introductionto Cell and Tissue Culture(细胞和组织培养导言)(J.P.Mather和P.E.Roberts，1998)Plenum Press；Cell和Tissue Culture：Laboratory Procedures(细胞和组织培养：实验室方法)(A.Doyle，J.B.Griffiths和D.G.Newell编辑，1993-8)J.Wiley和Sons；Handbook of Experimental Immunology(实验免疫学手册)(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑)；Gene Transfer Vectors for MammalianCells(用于哺乳动物细胞的基因转移载体)(J.M.Miller和M.P.Calos编辑，1987)；PCR：The Polymerase Chain Reaction(PCR：聚合酶链反应)，(Mullis等编辑，1994)；Current Protocols in Immunology(免疫学最新方法)(J.E.Coligan等编辑，1991)；Short Protocols in Molecular Biology(分子生物学中的小方法)(Wiley和Sons，1999)；Immunobiology(免疫生物学)(C.A.Janeway和P.Travers，1997)；Antibodies(抗体)(P.Finch，1997)；Antibodies：APractical Approach(抗体：实用方法)(D.Catty编辑，IRL Press，1988-1989)；Monoclonal Antibodies：A Practical Approach(单克隆抗体：实用方法)(P.Shepherd和C.Dean编辑，Oxford University Press，2000)；UsingAntibodies：A Laboratory Manual(使用抗体：实验室手册)(E.Harlow和D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999)；The Antibodies(抗体)(M.Zanetti和J.D.Capra编辑，Harwood Academic Publishers，1995)；以及Cancer：Principles和Practice of Oncology(癌症：肿瘤学的原理和实践)(V.T.DeVita等编辑，J.B.Lippincott Company，1993)。

I.定义

除非另外限定，本文所用的技术和科学术语具有与本发明所属的技术领域中的普通技术人员所通常理解的相同的含义。Singleton等，Dictionaryof Microbiology(微生物学词典)和Molecular Biology(分子生物学)第2版，J.Wiley&Sons(New York，N.Y.1994)，以及March，Advanced OrganicChemistry Reactions，Mechanisms and Structure(高等有机化学反应，机制和结构)第4版，John Wiley&Sons(New York，N.Y.1992)，对于本申请中所用的许多术语，为本领域技术人员提供了一般指导。本文引用的所有文献(包括专利申请和出版物)通过引用完整地结合。

为了解释本说明书，将使用以下定义，并且只要适当，以单数形式使用的术语也可以包括复数，并且反之亦然。要理解，本文所用的术语仅是为了描述具体的实施方案，并且不意欲是限制性的。在以下所述的任何定义与通过引用结合于本文中的任何文献冲突的情况中，以以下所述的定义为准。

在本说明书和权利要求中，免疫球蛋白重链中残基的编号是如在Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白质的序列)，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991)中的EU索引(EU index)的编号，上述文献通过引用结合于本文中。“如在Kabat中的EU索引”是指人IgG₁ EU抗体的残基编号。

用于本文目的的“接纳体人构架”是包含衍生自人免疫球蛋白构架或如下所定义的人共有构架的轻链可变结构域(VL)构架或重链可变结构域(VH)构架的氨基酸序列的构架。“衍生自”人免疫球蛋白构架或人共有构架的接纳体人构架可以包含其相同的氨基酸序列，或其可以包含氨基酸序列的变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目为10以下，9以下，8以下，7以下，6以下，5以下，4以下，3以下，或2以下。在一些实施方案中，VL接纳体人构架的序列与VL人免疫球蛋白构架序列或人共有构架序列相同。

“亲和力”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于本文时，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间1∶1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)来表述。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的那些。用于测量结合亲合力的具体说明性和示例性实施方案描述于以下。

“亲和力成熟的”抗体指这样的抗体，在该抗体的一个或多个高变区(HVR)中具有一处或多处改变，导致该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有提高。

术语“抗PCSK9抗体”、“抗PCSK9”、“PCSK9抗体”或“结合PCSK9的抗体”是指这样的抗体，所述抗体能够以足够的亲合力结合PCSK9抗体以致所述抗体可以用作靶向PCSK9中的诊断剂和/或治疗剂。在一个实施方案中，抗PCSK9抗体与不相关的、非PCSK9蛋白结合的程度低于所述抗体与PCSK9结合的约10％，如例如通过放射性免疫测定(RIA)测量的。在某些实施方案中，结合PCSK9的抗体的解离常数(Kd)≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如10^-8M以下，例如10^-8M至10^-13M，例如10^-9M至10^-13M)。在某些实施方案中，抗PCSK9抗体结合在来自不同物种的PCSK9中保守的PCSK9表位。

语″抗体″在本文中以最广义使用，并且包括不同抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例，双特异性抗体)，和抗体片段，只要它们显示所需的抗原结合活性。

″抗体片段″是指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的部分，所述部分结合完整抗体结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv，Fab，Fab′，Fab’-SH，F(ab′)₂；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，各自具有单一抗原结合位点，和残留的“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab’)₂片段，其具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原。

与参照抗体“结合相同表位的抗体”是指这样的抗体，其在竞争测定中阻断50％以上的所述参照抗体与其抗原的结合，反之，参照抗体在竞争测定中阻断50％以上的该抗体与其抗原的结合。本文中提供一个示例性竞争测定。在某些实施方案中，基于与PCSK9结合的抗PCSK9抗体Fab片段的晶体结构来确定表位。

术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，其中一部分重链和/或轻链来源于特定来源或物种，而剩余的重链和/或轻链来源于不同来源或物种。

抗体的“类别”是指其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。有五个主要类别的抗体：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，并且这些中的数个可以进一步被划分为亚类(同种型)，例如，IgG₁，IgG₂，IgG₃，IgG₄，IgA₁和IgA₂。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α，δ，ε，γ和μ。

术语“细胞毒性剂”用在本发明中指抑制或防止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括但不限于：放射性同位素(例如，At²¹¹，I¹³¹，I¹²⁵，Y⁹⁰，Re¹⁸⁶，Re¹⁸⁸，Sm¹⁵³，Bi²¹²，P³²，pb²¹²和Lu的放射性同位素)；化疗剂或药物(例如，甲氨蝶呤(methotrexate)，阿霉素(adriamicin)，长春花生物碱(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)，长春碱(vinblastine)，依托泊苷(etoposide))，多柔比星(doxorubicin)，美法仑(melphalan)，丝裂霉素(mitomycin)C，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段如核酸水解酶；抗生素；毒素如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物起源的酶促活性毒素，包括其片段和/或变体；和下面公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。

术语“双抗体(diabodies)”指具有两个抗原结合位点的抗体片段，所述片段在相同的多肽链(VH-VL)中包含与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用太短所以不能在相同链上的两个结构域之间配对的接头，迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对从而产生两个抗原结合位点。双抗体可以是二价的或双特异性的。双抗体更充分地描述于例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等，Nat.Med.9：129-134(2003)；和Hollinger等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90：6444-6448(1993)中。三抗体和四抗体同样描述于Hudson等，Nat.Med.9：129-134(2003)中。

“效应子功能”指那些可归于抗体Fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。

试剂例如药物制剂的″有效量″是指在需要的剂量和时间阶段有效获得所需的治疗或预防结果的量。

“Fab”片段包括重链可变结构域和轻链可变结构域，并且还包括轻链的恒定结构域以及重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab’片段因在重链CH1结构域的羧基末端增加了一些残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而与Fab片段不同。Fab’-SH是本文中对其中恒定结构域的半胱氨酸残基携带一个游离硫醇基的Fab’的称谓。F(ab’)₂抗体片段最初是作为成对Fab’片段生成的，在Fab’片段之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。

术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，所述区域包含至少一部分的恒定区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在某些实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或Pro230延伸至重链的羰基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或者可以不存在。除非另外说明，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，其也被称为EU索引，如在Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(免疫学感兴趣的蛋白质的序列)，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991中所述。

″构架″或″F R″是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1，FR2，FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常出现在VH(或VL)的以下序列中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

术语“全长抗体”、“完整的抗体”和“完整抗体”在本文被可交换地用于指结构与天然抗体结构基本相似或具有包含如本文所定义的Fc区的重链的抗体。

“Fv”是包含完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方案中，双链Fv种类由一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域以紧密的，非共价缔合的二聚体组成。在单链Fv(scFv)种类中，一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域可以通过柔性肽接头共价连接从而使轻链和重链可以以类似于双链Fv种类的“二聚体”结构缔合。在这种构型中，每个可变结构域的三个HVRs相互作用从而限定在VH-VL二聚体的表面上的抗原结合位点。总而言之，六个HVRs将抗原结合特异性赋予抗体。然而，即使是单个可变结构域(或只包含对抗原特异的三个HVRs的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和性低于完整结合位点。

术语″宿主细胞″、″宿主细胞系″和″宿主细胞培养物″被可交换地使用并且是指其中引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括″转化体″和″转化的细胞″，其包括初级转化的细胞和来源于其的后代，而不考虑传代的数目。后代在核酸含量上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本文中包括与在最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变体后代。

“人抗体”指具有这样的氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于这样抗体的氨基酸序列，所述抗体由人或人细胞生成或来源于非人来源，其利用人抗体库或其它人抗体编码序列。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。

“人共有构架”是指这样的构架，即在选择人免疫球蛋白VL或VH构架序列中，其代表最常出现的氨基酸残基。一般而言，对人免疫球蛋白VL或VH序列的选择是从可变结构域序列的亚型中选择。一般而言，该序列的亚型是如Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白质的序列)，第五版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD(1991)，1-3卷中的亚型。在一个实施方案中，对于VL，该亚型是如Kabat等(见上文)中的亚型κI。在一个实施方案中，对于VH，该亚型是如Kabat等(见上文)中的亚型III。

“人源化”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的那些。人源化抗体任选可以包含至少一部分的来源于人抗体的抗体恒定区。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经进行了人源化的抗体。

术语“高胆固醇血症”当用于本文中时是指其中胆固醇水平升高到理想水平以上的病症。在某些实施方案中，LDL-胆固醇水平升高到理想水平以上。在某些实施方案中，血清LDL-胆固醇水平升高到理想水平以上。

术语“高变区”或“HVR”当在本文中使用时，是指抗体可变结构域的每个区域，其序列高可变和/或形成结构上限定的环(“高变环”)。通常，天然四链抗体包含六个HVR；三个在VH(H1，H2，H3)中，三个在VL(L1，L2，L3)中。HVR通常包含来自高变环和/或“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高序列可变性和/或涉及抗原识别。示例性高变环发生在氨基酸残基26-32(L1)，50-52(L2)，91-96(L3)，26-32(H1)，53-55(H2)，和96-101(H3)。(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。示例性CDR(CDR-L1，CDR-L2，CDR-L3，CDR-H1，CDR-H2，和CDR-H3)发生在氨基酸残基L1的24-34，L2的50-56，L3的89-97，H1的31-35B，H2的50-65，和H3的95-102。(Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白质的序列)，5th Ed.PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))。除了VH中的CDR1，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”或“SDR”，其是与抗原接触的残基。SDR包含在被称为缩短的(abbreviated)-CDR或a-CDR的CDR区域中。示例性a-CDR(a-CDR-L1，a-CDR-L2，a-CDR-L3，a-CDR-H1，a-CDR-H2，和a-CDR-H3)发生在氨基酸残基L1的31-34，L2的50-55，L3的89-96，H1的31-35B，H2的50-58，和H3的95-102。(见Almagro和Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008))。除非另外说明，可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat等(见上文)编号。

“免疫缀合物”是与一个或多个异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)缀合的抗体。

“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，家养动物(例如，牛，羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔，以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。

″分离的″抗体是这样的抗体，其已经与其天然环境的组分分离。在一些实施方案中，将抗体纯化至超过95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)确定的。对于用于评估抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman等，J.Chromatogr.B848：79-87(2007)。

″分离的″核酸是指这样的核酸分子，其已经与其天然环境的组分分离。分离的核酸包括包含在通常包含该核酸分子的细胞中的核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或在不同于其天然染色体位置的染色体位置处。

“分离的编码抗PCSK9抗体的核酸”是指一个或多个核酸分子，其编码抗体重和轻链(或其片段)，包括在单一载体或分开的载体中的这样的核酸分子，以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置处的这样的核酸分子。

术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，即除了可能的变体抗体(该变体抗体例如含有天然存在的突变或在产生单克隆抗体制剂的过程中出现，此类变体通常少量存在)外，构成群体的个体抗体是相同的和/或结合相同的表位。相比于通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂，单克隆抗体制剂中的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来产生抗体。例如，将根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括但不限于杂交瘤法，重组DNA法，噬菌体展示法，和利用包含所有或部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，这样的方法和用于制备单克隆抗体的其他示例性方法描述于本文中。

“裸抗体”是指没有缀合异源部分(如细胞毒性部分)或放射性标记的抗体。裸抗体可以存在于药物制剂中。

″天然抗体″是指天然存在的具有变化的结构的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，其由两个相同的轻链和两个相同的重链组成，所述链通过二硫键结合。从N末端至C末端，每个重链具有可变区(VH)，其也被称为可变重结构域或重链可变结构域，其后是三个恒定结构域(CH1，CH2和CH3)。类似地，从N末端到C末端，每个轻链具有可变区(VL)，其也被称为可变轻结构域或轻链可变结构域，其后是恒定轻(CL)结构域。基于其恒定结构域的氨基酸序列，抗体的轻链可以被分配给被称为kappa(κ)和lambda(λ)的两个类型中的一个。

术语“包装说明书”用于指通常包括在治疗产品的商品包装中的使用说明，其包含关于适应征、用法、剂量、给药、组合疗法、禁忌症的信息和/或关于使用这样的治疗产品的警告。

相对于参比多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在将所述序列进行比对(并在必要时导入空位)以获取最大百分比序列同一性，且不将任何保守置换视为序列同一性的部分之后，候选序列中的氨基酸残基与参比多肽序列中的氨基酸残基相同的百分数。可使用本领域各种方法进行序列比对以便测定百分比氨基酸序列同一性，例如，使用公众可得到的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定测量比对的适宜参数，包括对所比较的序列全长获得最大比对所需的任何算法。然而，为此目的，％氨基酸序列同一性值使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生。ALIGN-2序列比较计算机程序的作者是Genentech，Inc，并且源代码已经随用户文档提交至美国版权局(Washington D.C.，20559)，其美国版权注册登记号为TXU510087。公众可通过Genentech，Inc.(South San Francisco，California)得到ALIGN-2程序，或者可以从源代码编译。ALIGN-2程序应当为在UNIX操作系统、包括数字UNIXV4.0D上使用而进行编译。ALIGN-2程序设定了所有序列比对参数并且不变。

在ALIGN-2应用于氨基酸序列比较的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者这样说：给定氨基酸序列A具有或含有相对于、与或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性)如下计算：

100乘以X/Y比值

其中X是用序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。可以理解，当氨基酸序列A与氨基酸序列B的长度不相等时，A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另外具体说明，在本文用的所有％氨基酸序列同一性的值都是用ALIGN-2计算机程序如前段所描述的那样得到的。

术语“药物制剂”或“药物组合物”指这样的制剂，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。

“药用载体”是指药物制剂中不同于活性成分的成分，其对受试者是无毒的。药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

除非另外说明，术语“前蛋白转化酶枯草溶菌素/kexin型9(Proproteinconvertase subtilisin/kexin type 9)(PCSK9)”、“PCSK9”或“NARC-1”当用于本文中时是指指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠))的任何天然PCSK9，除非另有说明。该术语涵盖“全长”未加工的PCSK9以及由细胞内加工产生的任何形式的PCSK9或其任何片段。该术语还包括天然存在的PCSK9的变体，例如，剪接变体或等位变体。

术语“PCSK9活性”或PCSK9的“生物学活性”当用于本文中时包括PCSK9的任何生物学作用。在某些实施方案中，PCSK9活性包括PCSK9与底物或受体相互作用或结合的能力。在某些实施方案中，PCSK9的生物学活性是PCSK9与LDL-受体(LDLR)结合的能力。在某些实施方案中，PCSK9结合并催化涉及LDLR的反应。在某些实施方案中，PCSK9活性包括PCSK9降低或减少LDLR的利用度的能力。在某些实施方案中，PCSK9的生物学活性包括PCSK9提高受试者的LDL的量的能力。在某些实施方案中，PCSK9的生物学活性包括PCSK9降低受试者的可以用于与LDL结合的LDLR的量的能力。在某些实施方案中，PCSK9的生物学活性包括PCSK9降低可以用于与LDL结合的LDLR的量的能力。在某些实施方案中，PCSK9的生物学活性包括由PCSK9信号传导(signaling)所致的任何生物学活性。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域以单多肽链存在。一般地，所述scFv多肽在VH和VL结构域之间还包含多肽接头，所述接头使scFv形成对于抗原结合需要的结构。关于scFv的综述参见例如Pluckthün于The Pharmacology of MonoclonalAntibodies(单克隆抗体药理学)，卷113，Rosenburg和Moore编辑，(Springer-Verlag，New York，1994)，pp.269-315中。

用于本文时，“治疗(treatment)”(及其语法变化如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)指在尝试改变待治疗的个体的天然进程中的临床干预，并且可以为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的理想效果包括但不限于防止疾病发生或复发，缓和症状，消除疾病的任何直接或间接病理学后果，减少疾病进展速率，改善或减轻疾病状态，和症状缓解或改善的预后。在一些实施方案中，将本发明的抗体用于延缓疾病的发生或减缓疾病的进展。

术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链(VH和VL，分别地)的可变结构域通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见，例如，Kindt等Kuby Immunology，6^th ed.，W.H.Freemanand Co.91页(2007))。单个VH或VL结构域可以足以给予抗原结合特异性。此外，可以使用来自与特定抗原结合的抗体的VH或VL结构域来分离结合所述抗原的抗体，以分别筛选互补VL或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano等，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等，Nature352：624-628(1991)。

术语″载体″当在本文中使用时是指能够增殖与其相连的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。一些载体能够指导与其可操作相连的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为″表达载体″。

II.组合物和方法

在一方面中，本发明部分基于利用抗PCSK9抗体获得的实验结果。所得的结果指示利用抗PCSK9抗体阻断PCSK9的生物学活性导致防止LDLR减少。此外，结果证实施用抗PCSK9抗体降低受试者的总LDL-胆固醇水平。因此，如本文所述的本发明的PCSK9抗体提供重要的治疗和诊断剂，所述治疗和诊断剂用于靶向与PCSK9相关的病理学状况，例如胆固醇相关疾病。

在某些实施方案中，“胆固醇相关疾病”包括以下中的任一种或多种：高胆固醇血症、心脏病、代谢综合征(metabolic syndrome)、糖尿病、冠状动脉心脏病(coronary heart disease)、卒中(stroke)、心血管疾病(cardiovascular diseases)、阿尔茨海默病(Alzheimers disease)和一般性的异常脂血症(dyslipidemia)(其显示为例如提高的总血清胆固醇、提高的LDL、提高的甘油三酯、提高的VLDL和/或低的HDL)。可以使用抗PCSK9抗体(单独地或与一种或多种其他药剂组合地)治疗的原发性和继发性异常脂血症的一些非限制性实例包括代谢综合征、糖尿病(diabetes mellitus)、家族性混合性高脂血症(familial combined hyperlipidemia)、家族性高甘油三酯血症(familial hypertriglyceridemia)、家族性高胆固醇血症(familialhypercholesterolemias)，包括杂合性高胆固醇血症(heterozygoushypercholesterolemia)、纯合性高胆固醇血症(homozygoushypercholesterolemia)、家族性缺陷性载脂蛋白(familial defectiveapoplipoprotein)B-100；多基因性高胆固醇血症(polygenichypercholesterolemia)；残粒移去障碍病(remnant removal disease)、肝脂肪酶缺失(hepatic lipase deficiency)；继发于以下任何的异常脂血症：饮食不慎(dietary indiscretion)、甲状腺机能障碍(hypothyroidism)、药物(包括雌激素和孕酮疗法、β阻断剂和噻嗪类利尿剂(thiazide diuretics))；肾病综合征(nephrotic syndrome)、慢性肾衰竭(chronic renal failure)、库欣综合征(Cushing′s syndrome)、原发性胆汁性肝硬变(primary biliary cirrhosis)、糖原沉积病(glycogen storage diseases)、肝细胞瘤(hepatoma)、胆汁淤积(cholestasis)、肢端肥大症(acromegaly)、胰岛素瘤(insulinoma)、单纯性生长素缺乏症(isolated growth hormone deficiency)和酒精所致高甘油三酯血症(alcohol-induced hypertriglyceridemia)。本文所述的抗PCSK9抗体可以用于预防或治疗动脉粥样硬化疾病，如例如，冠状动脉心脏病、冠脉疾病、周围动脉疾病(peripheral arterial disease)、卒中(缺血性(ischaemic)和出血性(hemorrhagic))、心绞痛(angina pectoris)或脑血管疾病和急性冠脉综合征(acute coronary syndrome)、心肌梗死(myocardial infarction)。在某些实施方案中，本文所述的抗PCSK9抗体可以用于降低以下的风险：非致死性心脏病发作(nonfatal heart attacks)、致死性和非致死性卒中、某些类型的心脏手术、心力衰竭的住院治疗、患有心脏病的患者的胸痛、和/或心血管事件，其由于确定的心脏病导致，如在前的心脏病发作、在前的心脏手术、和/或有阻塞的动脉的证据的胸痛。在某些实施方案中，本文所述的抗PCSK9抗体和方法可以用于降低复发的心血管事件的风险。

A.示例性抗PCSK9抗体

在一方面中，本发明提供结合PCSK9的分离的抗体。在某些实施方案中，抗PCSK9抗体调节PCSK9活性。

在一方面中，本发明提供抗PCSK9抗体，其包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO：4；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO：5；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：26；和(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14。

在一方面中，本发明提供抗PCSK9抗体，所述抗PCSK9抗体包含六个包括以下的HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO：4；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQID NO：5；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO：6或SEQID NO：7；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO：8或SEQID NO：26；和(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ IDNO：14。

在一方面中，本发明提供抗体，所述抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO：4；和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO：5。在一个实施方案中，抗体包含HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO：5。在另一个实施方案中，抗体包含HVR-H3和HVR-L3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO：5，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14。在另一个实施方案中，抗体包含：HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO：5；HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14；和HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO：4。在另一个实施方案中，抗体包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO：4；和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQ IDNO：5。

在另一方面中，本发明提供抗体，所述抗体包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：26；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14。在一个实施方案中，抗体包含(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO：8或SEQ IDNO：26；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ IDNO：14。

在另一方面中，本发明的抗体包含(a)VH结构域，所述VH结构域包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH HVR序列：(i)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：3，(ii)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO：4，和(iii)HVR-H3，所述HVR-H3包含选自SEQ ID NO：5的氨基酸序列；和(b)VL结构域，所述VL结构域包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL HVR序列：(i)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7，(ii)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：26，和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14。

在另一方面中，本发明提供抗体，所述抗体包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列SEQ ID NO：1；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO：4；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO：5；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO：6；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO：26；和(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO：9。在另一方面中，本发明提供抗体，所述抗体包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列SEQ IDNO：1；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO：4；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO：5；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO：7；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO：8；和(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO：10。在另一方面中，本发明提供抗体，所述抗体包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列SEQ ID NO：1；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO：4；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO：5；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO：7；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO：8；和(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO：11。在另一方面中，本发明提供抗体，所述抗体包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列SEQ ID NO：2；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列SEQ IDNO：4；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO：5；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO：7；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO：8；和(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO：12。在另一方面中，本发明提供抗体，所述抗体包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列SEQ ID NO：3；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO：4；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO：5；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO：7；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO：8；和(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ IDNO：13。在另一方面中，本发明提供抗体，所述抗体包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列SEQ ID NO：1；(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO：4；(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO：5；(d)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ IDNO：7；(e)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO：8；和(f)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO：14。

在某些实施方案中，抗PCSK9抗体是人源化的。在一个实施方案中，抗PCSK9抗体包含如在任意以上实施方案中的HVR，并且还包含接纳体人框架，例如，人免疫球蛋白框架或人共有框架。

在另一方面中，抗PCSK9抗体包含重链可变结构域(VH)序列，所述序列与氨基酸序列SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQID NO：27具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列包含置换(例如，保守性置换)、插入或缺失，但是包含所述序列的抗PCSK9抗体保持结合PCSK9的能力。在某些实施方案中，在SEQ IDNO：15，SEQ ID NO：16，SEQ NO：17或SEQ ID NO：27中，总计1至10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换、插入或缺失发生在HVR外的区域(即，在FR中)。任选地，抗PCSK9抗体包含SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：27中的VH序列，包括所述序列的翻译后修饰。在一个特别的实施方案中，VH包含一个、两个或三个选自以下的HVR：(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3，(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO：4，和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO：5。

在另一方面中，提供抗PCSK9抗体，其中所述抗体包含轻链可变结构域(VL)，所述轻链可变结构域(VL)与氨基酸序列SEQ ID NO：18、SEQID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列包含置换(例如，保守性置换)、插入或缺失，但是包含所述序列的抗PCSK9抗体保持结合PCSK9的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22或SEQ IDNO：23中，总计1至10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换，插入或缺失发生在HVR外的区域(即，在FR中)。任选地，抗PCSK9抗体包含SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQID NO：21、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23中的VL序列，包括所述序列的翻译后修饰。在一个特别的实施方案中，VL包含一个、两个或三个选自以下的HVR：(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：26；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含氨基酸序列SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14。

在另一方面中，提供抗PCSK9抗体，其中所述抗体包含如在任何以上提供的实施方案中的VH，和如在任何以上提供的实施方案中的VL。在一个实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：18中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗体分别包含分别在SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：19中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗体分别包含分别在SEQID NO：27和SEQ ID NO：20中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：21中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：22中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。在一个实施方案中，抗体包含分别在SEQ IDNO：27和SEQ ID NO：23中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。

在某些实施方案中，可以通过组合丙氨酸扫描(combinatorial alaninescanning)来定位功能表位。在该方法中，组合丙氨酸扫描策略可以用于鉴别与抗PCSK9抗体的相互作用所需的PCSK9蛋白中的氨基酸。在某些实施方案中，表位是结构性的(conformational)并且与PCSK9结合的抗PCSK9抗体Fab片段的晶体结构可以用于鉴定表位。在一方面中，本发明提供抗体，所述抗体结合与任何本文提供的抗PCSK9抗体相同的表位。例如，在某些实施方案中，提供这样的抗体，所述抗体结合与包含SEQ ID NO：15的VH序列和SEQ ID NO：19的VL序列的抗PCSK9抗体相同的表位。在某些实施方案中，提供这样的抗体，所述抗体结合与包含SEQ ID NO：27的VH序列和SEQ ID NO：20的VL序列的抗PCSK9抗体相同的表位。在某些实施方案中，提供这样的抗体，所述抗体结合与包含SEQ ID NO：16的VH序列和SEQ ID NO：21的VL序列的抗PCSK9抗体相同的表位。在某些实施方案中，提供这样的抗体，所述抗体结合与包含SEQ ID NO：17的VH序列和SEQ ID NO：22的VL序列的抗PCSK9抗体相同的表位。在某些实施方案中，提供这样的抗体，所述抗体结合与包含SEQ ID NO：27的VH序列和SEQ ID NO：23的VL序列的抗PCSK9抗体相同的表位。

在一方面中，本发明提供抗PCSK9抗体或其抗原结合片段，所述抗PCSK9抗体或其抗原结合片段与任一种本文所述的抗体竞争地结合人PCSK9。在某些实施方案中，竞争性结合可以使用ELISA测定来确定。例如，在某些实施方案中，提供这样的抗体，所述抗体与包含SEQ ID NO：15的VH序列和SEQ ID NO：19的VL序列的抗PCSK9抗体竞争地结合PCSK9。在某些实施方案中，提供这样的抗体，所述抗体与包含SEQ IDNO：27的VH序列和SEQ ID NO：20的VL序列的抗PCSK9抗体竞争地结合PCSK9。在某些实施方案中，提供这样的抗体，所述抗体与包含SEQ IDNO：16的VH序列和SEQ ID NO：21的VL序列的抗PCSK9抗体竞争地结合PCSK9。在某些实施方案中，提供这样的抗体，所述抗体与包含SEQ IDNO：17的VH序列和SEQ ID NO：22的VL序列的抗PCSK9抗体竞争地结合PCSK9。在某些实施方案中，提供这样的抗体，所述抗体与包含SEQ IDNO：27的VH序列和SEQ ID NO：23的VL序列的抗PCSK9抗体竞争地结合PCSK9。

在某些实施方案中，提供这样的抗体，所述抗体结合如本文所述的PCSK9的片段内的表位。在某些实施方案中，提供这样的抗体，所述抗体结合在包含SEQ ID NO：24的人PCSK9氨基酸序列的氨基酸376至379的PCSK9的片段内的表位。在某些实施方案中，根据本发明的抗体的功能和/或结构表位包括人PCSK9的残基D238。在某些实施方案中，根据本发明的抗体的功能和/或结构表位包括人PCSK9的残基A239。在某些实施方案中，根据本发明的抗体的功能和/或结构表位包括人PCSK9的残基D238和A239。在某些实施方案中，根据本发明的抗体的功能和/或结构表位包括人PCSK9的残基E366。在某些实施方案中，根据本发明的抗体的功能和/或结构表位包括人PCSK9的残基D367。在某些实施方案中，根据本发明的抗体的功能和/或结构表位包括人PCSK9的残基E366和D367。在某些实施方案中，根据本发明的抗体的功能和/或结构表位包括人PCSK9的残基H391。在某些实施方案中，根据本发明的抗体的功能和/或结构表位包括人PCSK9的残基E366、D367和H391。根据另一个实施方案，根据本发明的抗体的功能和/或结构表位包括人PCSK9的残基A239和H391。在某些实施方案中，功能和/或结构表位包括人PCSK9的残基A239，A341，E366、D367和H391中的一个或多个。在某些实施方案中，功能和/或结构表位包括邻近人PCSK9的A239，A341，E366、D367和H391的残基中的一个或多个。在某些实施方案中，根据本发明的抗体的功能和/或结构表位包含(i)至少一个选自由以下各项组成的组的残基：人PCSK9的R194和E195，(ii)至少一个选自由以下各项组成的组的残基：人PCSK9的D238和A239，(iii)至少一个选自由以下各项组成的组的残基：人PCSK9的A341和Q342，和(iv)至少一个选自由以下各项组成的组的残基：人PCSK9的E366、D367、I369、S376、T377、C378、F379、S381和H391。在某些实施方案中，功能和/或结构表位包含以下残基中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个或全部：人PCSK9的R194，E195，D238，A239，A341，Q342，E366、D367、I369、S376、T377、C378、F379、S381和H391。

在本发明的另一个方面中，根据任何以上实施方案的抗PCSK9抗体是单克隆抗体，包括嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一个实施方案中，抗PCSK9抗体是抗体片段，例如，Fv，Fab，Fab’，scFv，双抗体或F(ab’)₂片段。在另一个实施方案中，抗体是全长抗体，例如，完整IgG₁抗体或如本文所定义的其他抗体类别或同种型。

在另一方面中，根据任何以上实施方案的抗PCSK9抗体可以结合如在以下部分1-7中所述的任何特征(单独地或组合地)：

1.抗体亲合力

在某些实施方案中，本文提供的抗体具有的解离常数(Kd)≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如10^-8M以下，例如10^-8M至10^-13M，例如，10^-9M至10^-13M)。

在一个实施方案中，Kd通过用目的抗体的Fab形式及其抗原进行的放射性标记的抗原结合测定法(RIA)测量，如由以下测定所述的。Fab对抗原的溶液结合亲合力通过在存在未标记抗原的滴定系列的情况下，用最小浓度的(¹²⁵I)-标记的抗原平衡Fab，接着用抗-Fab抗体-包被的板捕获结合的抗原来测量(参见，例如，Chen等，J.Mol.Biol.293：865-881(1999))。为了确定测定的条件，将

多孔板(Thermo Scientific)用5μg/ml的在50mM碳酸钠(pH9.6)中的捕获抗-Fab抗体(Cappel Labs)包被过夜，并随后用PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白在室温(约23℃)封闭2-5小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[¹²⁵I]-抗原与目的Fab的系列稀释物混合(与在Presta等，癌症研究(Cancer Res).57：4593-4599(1997)中的抗-VEGF抗体，Fab-12的评估一致)。接着，将目的Fab温育过夜；然而温育可以持续更长的阶段(例如65小时)从而确保达到平衡。随后，将混合物转移到捕获板中以在室温进行温育(例如1小时)。接着，去除溶液，并将所述板用在PBS中的0.1％聚山梨醇酯20

洗涤8次。当所述板已经干燥时，加入150μl/孔的闪烁剂(MICROSCINT-20^TM；Packard)，并将所述板在TOPCOUNT^TMγ计数器(Packard)上计数10分钟。选择提供少于或等于20％的最大结合的每种Fab的浓度用在竞争性结合测定中。

根据另一个实施方案，Kd是通过表面等离子共振测定法使用

或

仪器(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)在25℃使用固定化抗原CM5芯片在～10个应答单位(RU)测量的。简而言之，依照供应商的说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，BIACORE Inc.)。用10mM乙酸钠pH4.8将抗原稀释至5μg/ml(～0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注入至获得约10个应答单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，在25℃以约25μl/分钟的流速注入在含0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20^TM)表面活性剂的PBS(PBST)中的两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型Evaluation Software version3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(k_on)和解离速率(k_off)。平衡解离常数(Kd)以比率k_off/k_on计算。参见例如Chen等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)293：865-881(1999)。如果根据上文表面等离子共振测定法，结合速率超过10⁶M^-1s^-1，那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINCO^TM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯(stirred cuvette)的测量，在存在浓度渐增的抗原的条件下，测量PBS，pH7.2中的20nM抗-抗原抗体(Fab形式)在25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的升高或降低。

2.抗体片段

在某些实施方案中，本文提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)₂，Fv，和scFv片段，以及以下描述的其他片段。对于特定抗体片段的综述，请参见Hudson等Nat.Med.9：129-134(2003)。对于scFv片段的综述，请参见，例如，Pluckthün，ThePharmacology of Monoclonal Antibodies(单克隆抗体的药理学)，卷113，Rosenburg和Moore编辑，(Springer-Verlag，New York)，269-315页(1994)；还请参见WO 93/16185；和美国专利号5,571,894和5,587,458。对于包含拯救受体(salvage receptor)结合表位残基和具有提高的体内半衰期的Fab和F(ab′)₂片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。

双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见，例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等，Nat.Med.9：129-134(2003)；和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也描述于Hudson等，Nat.Med.9：129-134(2003)中。

单一结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单一结构域抗体是人单一结构域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，MA；参见，例如，美国专利号6,248,516 B1)。

抗体片段可以通过不同技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文所述。

3.嵌合和人源化抗体

在某些实施方案中，本文中所提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体于例如美国专利第4,816,567号；及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984)中描述。在一个实例中，嵌合抗体包含非人类可变区(例如源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或例如猴的非人类灵长类动物的可变区)及人类恒定区。在另一实例中，嵌合抗体是种类或亚类已经自亲本抗体的种类或亚类发生变化的“种类转变”抗体。嵌合抗体包括其抗原结合片段。

在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，非人类抗体经人源化以降低对人类的免疫原性，同时保持亲本非人类抗体的特异性及亲和力。一般而言，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVRs，例如CDRs(或其部分)源自非人类抗体，且FRs(或其部分)是源自人类抗体序列。人源化抗体任选地也将包含人类恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基经来自非人类抗体(例如HVR残基所源自的抗体)的相应残基置换，例如以恢复或提高抗体特异性或亲和力。

人源化抗体及其制备方法于例如Almagro和Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008)中评述，且进一步于例如Riechmann等人，Nature(自然)332：323-329(1988)；Queen等人，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA86：10029-10033(1989)；美国专利第5,821,337号、第7,527,791号、第6,982,321号和第7,087,409号；Kashmiri等人，Methods(方法)36：25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)移植)Padlan，Mol.Immunol.(分子免疫学)28：489-498(1991)(描述“表面重整”)；Dall′Acqua等人，Methods 36：43-60(2005)(描述“FR重组(shuffling)”)；及Osbourn等人，Methods(方法)36：61-68(2005)和Klimka等人，Br.J.Cancer(英国癌症杂志)，83：252-260(2000)(描述FR重组(shuffling)的“导向选择”方法)中描述。

可用于人源化的人类构架区包括，但不限于，使用“最佳拟合”法选择的构架区(参见例如Sims等人，J.Immunol.(免疫学杂志)151：2296(1993))；源自特定亚群的轻链或重链可变区的人类抗体共同序列的构架区(参见例如Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；及Presta等人，J.Immunol.(免疫学杂志），151：2623(1993))；人类成熟(体细胞突变)构架区或人类生殖系构架区(参见例如Almagro及Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008))；及源自筛选FR文库的构架区(参见例如Baca等人，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)272：10678-10684(1997)及Rosok等人，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)271：22611-22618(1996))。

4.人抗体

在某些实施方案中，本文中所提供的抗体是人抗体。可使用本领域中已知的各种技术来制备人抗体。人抗体一般描述于van Dijk和van deWinkel，Curr.Opin.Pharmacol.(当前药学观点)5：368-74(2001)以及Lonberg，Curr.Opin.Immunol.(当前免疫学观点)20：450-459(2008)。

可通过向已经经过修饰因而对于抗原攻击刺激产生完整人抗体或具有人类可变区的完整抗体的转基因动物施用免疫原，来制备人抗体。这些动物通常含有全部或一部分人类免疫球蛋白基因座，其替代了内源免疫球蛋白基因座，或存在于染色体外或随机整合于动物染色体内。在这些转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座一般已经失活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg，Nat.Biotech.(自然生物技术)23：1117-1125(2005)。也参见例如描述XENOMOUSE^TM技术的美国专利第6,075,181号及第6,150,584号；描述

技术的美国专利第5,770,429号；描述K-M

技术的美国专利第7,041,870号，及描述

技术的美国专利申请公开号US 2007/0061900。这些动物产生的完整抗体的人类可变区可进一步修饰，例如通过与不同人类恒定区组合。

人抗体也可通过基于杂交瘤的方法制得。用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤及小鼠-人融合骨髓瘤细胞系已经描述。(参见例如Kozbor J.Immunol.(免疫学杂志)，133：3001(1984)；Brodeur等人，MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications(单克隆抗体产生技术及应用)，第51-63页(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)；并且Boerner等人，J.Immunol.(免疫学杂志)，147：86(1991)。)通过人类B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也在Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci..USA，103：3557-3562(2006)中描述。其他方法包括例如美国专利第7,189,826号(描述由杂交瘤细胞系产生单克隆人类IgM抗体)及Ni，Xiandai Mianyixue，26(4)：265-268(2006)(描述人-人杂交瘤)中所述的那些方法。人杂交瘤技术(Trioma技术)也于Vollmers和Brandlein，Histology and Histopathology(组织学和组织病理学)，20(3)：927-937(2005)，及Vollmers和Brandlein，Methods andFindings in Experimental and Clinical Pharmacology(实验和临床药学方法和发现)，27(3)：185-91(2005)中描述。

也可通过分离选自源自人噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列产生人抗体。随后可将这些可变结构域序列与所需人恒定结构域组合。下文描述自抗体文库选择人抗体的技术。

5.源自文库的抗体

可通过在组合文库中筛选具有所需活性的抗体来分离本发明抗体。举例来说，本领域中已知多种用于产生噬菌体展示文库并且在这些文库中筛选具有所需结合特征的抗体的方法。这些方法于例如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology(分子生物学方法)178：1-37(O′Brien等人编，人Press，Totowa，NJ，2001)中评述，并且进一步于例如McCafferty等人，Nature(自然)348：552-554；Clackso等人，Nature(自然)352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)222：581-597(1992)；Marks及Bradbury，Methods in Molecular Biology(分子生物学方法)248：161-175(Lo编，人Press，Totowa，NJ，2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)338(2)：299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(34)：12467-12472(2004)；并且Lee等人，J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志)284(1-2)：119-132(2004)中描述。

在某些噬菌体展示方法中，VH及VL基因库(repertoire)是通过聚合酶链式反应(PCR)分别克隆并且随机重组于噬菌体文库中，随后可如Winter等人，Ann.Rev.Immunol.(免疫学年度综述)，12：433-455(1994)中所述在其中筛选抗原结合噬菌体。噬菌体通常呈现单链Fv(scFv)片段或Fab片段形式的抗体片段。来自免疫来源的文库无需构建杂交瘤即可提供免疫原的高亲和力抗体。或者，天然库可经克隆(例如自人)以在无任何免疫的情况下提供针对多种非自体抗原以及自体抗原的抗体单一来源，如Griffiths等人，EMBO J，12：725-734(1993)所述。最后，也可以通过从干细胞克隆未重排的V基因区段，并且使用含有随机序列的PCR引物来编码高变性CDR3区，并且实现体外重排来合成制得天然文库，如Hoogenboom及Winter，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，227：381-388(1992)所述。描述人抗体噬菌体文库的专利公开物包括例如：美国专利第5,750,373号，及美国专利公开第2005/0079574号、第2005/0119455号、第2005/0266000号、第2007/0117126号、第2007/0160598号、第2007/0237764号、第2007/0292936号和第2009/0002360号。

从人抗体文库分离的抗体或抗体片段被视为本文的人抗体或人抗体片段。

6.多特异性抗体

在某些实施方案中，本文中所提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，一种结合特异性是针对PCSK9而另一种是针对任何其他抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可结合至PCSK9的两个不同表位。双特异性抗体也可用于将细胞毒性剂定位于表达PCSK9的细胞。双特异性抗体可制成全长抗体或抗体片段形式。

制造多特异性抗体的技术包括，但不限于，具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein及Cuello，Nature(自然)305：537(1983)；WO 93/08829；及Traunecker等人，EMBO J.10：3655(1991))，及“凸起-入-孔洞(knob-in-hole)”工程改造(参见例如美国专利第5,731,168号)。也可通过以下方法制得多特异性抗体：工程改造用于制备抗体Fc-异二聚体的静电导引作用(WO2009/089004A1)；将两种或两种以上抗体或片段交联(参见例如美国专利第4,676,980号，及Brennan等人Science(科学)，229：81(1985))；使用亮氨酸拉链来产生双特异性抗体(参见例如Kostelny等人，J.Immunol.(免疫学杂志)，148(5)：1547-1553(1992))；使用“双抗体”技术来制得双特异性抗体片段(参见例如Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993))；及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber等人，J.Immunol.(免疫学杂志)，152：5368(1994))；及如例如Tutt等人，J.Immunol.(免疫学杂志)147：60(1991)中所述制备三特异性抗体。

本文中也包括具有三个或三个以上功能性抗原结合位点的经工程改造抗体，包括“章鱼抗体(Octopus antibodies)”(参见例如US2006/0025576Al)。

本文中的抗体或片段也包括包含结合至PCSK9以及另一不同抗原的抗原结合位点的“双重作用FAb或“DAF”(例如参见US2008/0069820)。

7.抗体变体

在某些实施方案中，涵盖本文中所提供抗体的氨基酸序列变体。举例来说，可能需要其来提高抗体的结合亲和力和/或其他生物特性。可通过在编码抗体的核苷酸序列中引入适当修饰或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。这些修饰包括例如抗体氨基酸序列内的残基缺失和/或插入其中和/或对其进行置换。可进行缺失、插入和置换的任何组合以获得最终构建体，其限制条件是最终构建体具有所需特征，例如抗原结合。

a)置换、插入和缺失变体

在某些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体。用于置换性诱变的相关位点包括HVRs和FRs。保守性置换显示在表1中在“保守性置换”的标题下。更多实质性变化于表1中的“示例性置换”的标题下提供且如下文关于氨基酸侧链种类进一步描述。可将氨基酸置换引入相关抗体中并筛选具有所需活性，例如保持/提高的抗原结合、降低的免疫原性、或提高的ADCC或CDC的产物。

表1

可根据常见侧链特性将氨基酸分组：

(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

(3)酸性：Asp、Glu；

(4)碱性：His、Lys、Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；

(6)芳香性：Trp、Tyr、Phe。

非保守性置换将需要将一种这些种类中的成员换成另一种类。

一种类型的置换变体涉及置换亲本抗体(例如人源化抗体或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般而言，选择用于进一步研究的所得变体的某些生物学特性相对于亲本抗体改变(例如提高)(例如亲和力增加、免疫原性降低)和/或将实质上保持亲本抗体的某些生物学特性。示例性置换变体是亲和力成熟抗体，其可例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术，例如本文中所述的那些，方便地产生。简言之，一个或多个HVR残基被突变，且变异抗体呈现于噬菌体上，并针对特定生物活性(例如结合亲和力)对其进行筛选。

可在HVR中进行改变(例如置换)，例如以提高抗体亲和力。这些改变可于HVR“热点”也即由在体细胞成熟过程中经历高频率突变的密码子编码的残基中进行(参见例如Chowdhury，Methods Mol.Biol.(分子生物学方法)207：179-196(2008))；并且/或于SDRs(a-CDRs)，其中测试所得变异VH或VL的结合亲和力。通过构建并且自第二文库重新选择而获得的亲和力成熟已于例如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology(分子生物学方法)178：1-37(O′Brien等人编人Press，Totowa，NJ，(2001))中描述。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如易错PCR(error-prone PCR)、链重组(shuffling)或寡核苷酸定向诱变)中任一种将多样性引入经选择以供成熟的可变基因中。随后产生第二文库。随后筛选该文库以鉴别具有所需亲和力的任何抗体变体。另一引入多样性的方法涉及HVR定向方法，其中随机选择数个HVR残基(例如每次4-6个残基)。可例如使用丙氨酸扫描诱变或模型化特定地鉴别抗原结合中所涉及的HVR残基。特定地，通常靶向CDR-H3及CDR-L3。

在某些实施方案中，置换、插入或缺失可在一个或多个HVR内进行，只要这些改变不实质上降低抗体结合抗原的能力即可。举例来说，可在HVR中进行不实质上降低结合亲和力的保守性改变(例如如本文中所提供的保守性置换)。这些改变可在HVR“热点”或SDR外部。在上文提供的变异VH及VL序列的某些实施方案中，各HVR未经改变，或含有不超过一个、两个或三个氨基酸置换。

适用于鉴别可靶向以供诱变的抗体的残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”如Cunningham及Wells(1989)Science(科学)，244：1081-1085所述。在此方法中，残基或靶残基的群(例如诸如Arg、Asp、His、Lys和Glu的带电残基)经鉴别且由中性或带负电氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)置换以确定是否影响抗体与抗原的相互作用。可在对初始置换显示功能敏感性的氨基酸位置处引入其他置换。备选地或另外地，抗原-抗体复合物的晶体结构用于鉴别抗体与抗原之间的接触点。这些接触残基及邻近残基可以作为置换候选物被靶向或消除。可以筛选变体以确定其是否含有所需特性。

氨基酸序列插入物包括长度在一个残基至含有一百个或一百个以上残基的多肽范围内的氨基端和/或羧基端融合体，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入物。末端插入物的实例包括具有N端甲硫胺酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N端或C端与酶(例如对于ADEPT而言)或增加抗体的血清半衰期的多肽的融合体。

b)糖基化变体

在某些实施方案中，本文中所提供的抗体经改变以增加或降低抗体经糖基化的程度。对抗体的糖基化位点的添加或缺失可通过改变氨基酸序列以便产生或移除一或多个糖基化位点而方便地实现。

若抗体包含Fc区，则与其连接的糖类可以被改变。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含一般通过N-连接与Fc区CH2结构域的Asn297连接的分支链双触角寡糖。参见例如Wright等人，TIBTECH 15：26-32(1997)。寡糖可包括多种糖类，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及与双触角寡糖结构的“主干”中的GlcNAc连接的岩藻糖。在一些实施方案中，可对本发明抗体中的寡糖进行修饰以产生具有某些改良特性的抗体变体。

在一实施方案中，提供具有缺乏与Fc区连接(直接或间接)的岩藻糖的糖结构的抗体变体。举例来说，该抗体中岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。通过相对于根据MALDI-TOF质谱法所测量的所有与Asn297连接的糖结构(例如复合型、杂合型及高甘露糖型结构)的总和，计算糖链内Asn297处岩藻糖的平均量来测定岩藻糖的量，例如如WO 2008/077546中所述。Asn297是指位于Fc区中约位置297处(Fc区残基的Eu编号)的天冬酰胺残基；然而，由于抗体中的微小序列变化，Asn297也可能位于位置297上游或下游约±3个氨基酸处，也即介于位置294与300之间。这些岩藻糖基化变体可具有提高的ADCC功能。参见例如美国专利公开号US 2003/0157108(Presta，L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd)。与“去岩藻糖基”或“岩藻糖缺乏”抗体变体有关的公开文本的实例包括US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO 2005/053742；WO 2002/031140；Okazaki等人，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.(生物技术和生物工程)87：614(2004)。能够产生脱除岩藻糖基的抗体的细胞系的实例包括蛋白质岩藻糖基化缺乏的Lec13 CHO细胞(Ripka等人Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美国专利申请号US 2003/0157108Al，Presta，L；及WO 2004/056312Al，Adams等人，尤其实施例11)；及基因敲除细胞系，例如α-1，6-岩藻糖基转移酶基因、FUT8、基因敲除CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.(生物技术和生物工程)87：614(2004)；Kanda，Y.等人，Biotechnol.Bioeng.(生物技术和生物工程)，94(4)：680-688(2006)；及WO2 003/085107)。

进一步提供具有平分型寡糖(bisected oligosaccharide)的抗体变体，例如其中与抗体的Fc区连接的双触角寡糖经GlcNAc平分。这些抗体变体可具有降低的岩藻糖基化和/或提高的ADCC功能。这些抗体变体的实例例如于WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利第6,602,684号(Umana等人)；及US 2005/0123546(Umana等人)中描述。也提供在与Fc区连接的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这些抗体变体可具有提高的CDC功能。这些抗体变体于例如WO 1997/30087(Patel等人)；WO1998/58964(Raju，S.)；及WO 1999/22764(Raju，S.)中描述。

c)Fc区域变体

在某些实施方案中，可在本文中所提供抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，以此产生Fc区变体，以便增强例如抗体治疗涉及异常血管发生和/或血管通透性或渗漏的疾病或病症的有效性。Fc区变体可包含在一或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如置换)的人Fc区序列(例如人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。

在某些实施方案中，本发明涵盖具有一些但非所有效应子功能的抗体变体，这使其成为某些应用的理想候选物，在所述应用中抗体的活体内半衰期是重要的，但某些效应子功能(例如补体及ADCC)是不必要或有害的。可进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认CDC和/或ADCC活性的降低/衰竭。举例来说，可进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保持FcRn结合能力。介导ADCC的初级细胞、NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII及FcγRIII。FcR在造血细胞上的表达于Ravetch及Kinet，Annu.Rev.Immunol.(免疫学年度综述)9：457-492(1991)的第464页上的表3中总结。评定相关分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例于美国专利5,500,362(参见例如Hellstrom，I.等人，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 83：7059-7063(1986))及Hellstrom，I等人，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 82：1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann，M.等人，J.Exp.Med.(实验医学杂志)166：1351-1361(1987))中描述。或者，可采用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTI^TM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology，Inc.Mountain View，CA)及CytoTox

非放射性细胞毒性测定(Promega，Madison，WI))。适用于这些测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)及自然杀伤(NK)细胞。备选地或另外地，相关分子的ADCC活性可于体内评定，例如在例如Clynes等人，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)中所揭示的动物模型中评定。也可进行Clq结合测定以证明抗体无法结合Clq且因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879及WO2005/100402中的Clq及C3c结合ELISA。为评定补体活化，可进行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志)202：163(1996)；Cragg，M.S.等人，Blood(血液)101：1045-1052(2003)；及Cragg，M.S.及M.J.Glennie，Blood 103：2738-2743(2004))。也可使用本领域中已知的方法进行FcRn结合及活体内清除/半衰期测定(参见例如Petkova，S.B.等人，Int’l.Immunol.(国际免疫学)18(12)：1759-1769(2006))。

效应子功能降低的抗体包括Fc区残基238、265、269、270、297、327及329中一个或多个置换的那些抗体(美国专利6,737,056)。这些Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327的两个或两个以上位置处具有置换的Fc突变体，包括残基265和297置换为丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。

描述某些与FcRs的结合提高或减少的抗体变体。(参见例如美国专利号6,737,056；WO 2004/056312，及Shields等人，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)9(2)：6591-6604(2001))。

在某些实施方案中，抗体变体包含具有一个或多个提高ADCC的氨基酸置换的Fc区，例如在Fc区的位置298、333和/或334(残基的EU编号)处置换。

在一些实施方案中，在Fc区中进行改变，其导致Clq结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)改变(也即，通过提高或降低)，例如如美国专利第6,194,551号、WO 99/51642和Idusogie等人，J.Immunol.(免疫学杂志)164：4178-4184(2000)中所述。

US2005/0014934A1(Hinto等人)中描述具有增加的半衰期及提高的与新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体，其中FcRn负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等人J.Immunol.(免疫学杂志)117：587(1976)及Kim等人，J.Immunol.(免疫学杂志)24：249(1994))。那些抗体包含具有一或多个置换的Fc区，所述置换提高Fc区与FcRn的结合。这些Fc变体包括在Fc区残基238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434中的一或多者处具有置换(例如置换Fc区残基434)的那些Fc变体(美国专利第7,371,826号)。

关于Fc区变体的其他实例，也参见Duncan及Winter，Nature(自然)322：738-40(1988)；美国专利第5,648,260号；美国专利第5,624,821号；及WO 94/29351。

d)经半胱氨酸工程改造的抗体变体

在某些实施方案中，可能需要产生经半胱氨酸工程改造的抗体，例如“硫代MAb”，其中抗体的一或多个残基经半胱氨酸残基置换。在特定实施方案中，经置换的残基出现在抗体的可接近位点处。通过用半胱氨酸置换那些残基，反应性硫醇基团通过定位于抗体的可接近位点处且可用于将抗体结合至其他部分，例如药物部分或接头-药物部分，以产生如本文中进一步描述的免疫缀合物。在某些实施方案中，任一或多个以下残基可经半胱氨酸置换：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；及重链Fc区的S400(EU编号)。可如例如美国专利第7,521,541号中所述，产生经半胱氨酸工程改造的抗体。

e)抗体衍生物

在某些实施方案中，本文中所提供的抗体可进一步经修饰为含有本领域中已知且轻易获得的其他非蛋白质部分。适合抗体衍生作用的部分包括，但不限于，水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括，但不限于，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二

烷、聚-1，3，6-三

烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。聚乙二醇丙醛因其在水中的稳定性可能具有制造优势。聚合物可具有任何分子量，且可有分支或无分支。与抗体连接的聚合物的数目可以变化，且若连接一种以上聚合物，则其可以是相同或不同分子。一般而言，用于衍生作用的聚合物数目和/或类型可以基于包括，但不限于，以下的考虑因素来确定：要提高的抗体的特定特性或功能、抗体衍生物是否将用于指定条件下的疗法等。

在另一实施方案中，提供抗体与可通过暴露于辐射来选择性加热的非蛋白质部分的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质部分是碳纳米管(Kam等人，Proc.Natl.Acad Sci.USA(美国科学院学报)102：11600-11605(2005))。该辐射可具有任何波长，且包括但不限于，不损伤普通细胞但能将非蛋白质部分加热至可杀死抗体-非蛋白质部分附近的细胞的温度的波长。

B.重组方法和组合物

本文所述的抗PCSK9抗体可以使用例如在美国专利号4,816,567中描述的重组方法和组合物产生。在一个实施方案中，提供了编码本文描述的抗PCSK9抗体的分离的核酸。此类核酸可编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含其VH的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。在又一个实施方案中，提供了包含此类核酸的一个或多个载体(例如表达载体)。在又一个实施方案中，提供了包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含(例如，用下述各项转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列，或(2)包含核酸的第一载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列，和包含核酸的第二载体，所述核酸编码包含抗体的VH的氨基酸序列。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0，NS0，Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了制备抗PCSK9抗体的方法，其中所述方法包括，在适合抗体表达的条件下，培养包含编码所述抗体的核酸的宿主细胞，如上文所提供的，和任选地从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述抗体。

为了重组产生抗PCSK9抗体，分离编码抗体(例如上文所描述的抗体)的核酸，并插入一个或多个载体，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类核酸易于使用常规规程分离和测序(例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针进行)。

用于克隆或表达编码抗体的载体的适当宿主细胞包括本文描述的原核或真核细胞。例如，抗体可在细菌中产生，特别当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，见，例如，美国专利号5,648,237，5,789,199和5,840,523。(还见Charlton，分子生物学中的方法(Methods in Molecular Biology)，卷248(B.K.C.Lo，编辑，HumanaPress，Totowa，NJ，2003)，第245-254页，描述抗体片段在大肠杆菌中的表达)。在表达后，抗体可以从可溶级分中的细菌细胞糊状物分离，并且可以进一步纯化。

除了原核生物以外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是关于编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主，包括真菌和酵母菌株，其糖基化途径已经进行“人源化”，导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见Gerngross，Nat.Biotech.(自然生物技术)22：1409-1414(2004)，和Li等，Nat.Biotech.(自然生物技术)24：210-215(2006)。

适于表达糖基化抗体的宿主细胞也衍生自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株，其可与昆虫细胞联合使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。

还可利用植物细胞培养物作为宿主。见，例如，美国专利号5,959,177，6,040,498，6,420,548，7,125,978和6,417,429(其描述了在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIES^TM技术)。

也可以将脊椎动物细胞用作宿主。例如，可以使用被改造以适合于悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用哺乳动物宿主细胞系的其它实例是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293细胞，如例如Graham等，遗传病毒学杂志(J.Gen Virol.)36：59(1977)中所描述的)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞，如例如在Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980)中描述的)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；布法罗大鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如例如Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982)中所描述的；MRC5细胞；并且FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)77：4216(1980))；并且骨髓瘤细胞系如Y0，NS0和Sp2/0。关于适合产生抗体的某些哺乳动物宿主细胞系的综述见例如Yazaki和Wu，在分子生物学中的方法(Methods in Molecular Biology)，卷248(B.K.C.Lo，ed.，Humana Press，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。

C.测定

本文中提供的抗PCSK9抗体可以对其物理/化学特性和/或生物活性，通过本领域中已知的不同测定来识别、筛选或表征。

1.结合测定和其他测定

在一方面中，测试本发明的抗PCSK9抗体的PCSK9结合活性，例如，通过已知方法如ELISA、蛋白印迹法等。可以使用多种类型的竞争性结合测定以确定抗PCSK9抗体是否彼此竞争，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)，固相直接或间接酶免疫测定(EIA)，夹心竞争测定(参见，例如，Stahli等，1983，Methods in Enzymology9：242-253)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见，例如，Kirkland等，1986，J.Immunol.137：3614-3619)固相直接标记测定，固相直接标记夹心测定(参见，例如，Harlow和Lane，1988，Antibodies，Laboratory Manual(抗体，实验室手册)，Cold Spring HarborPress)；使用I-125标记的固相直接标记RIA(参见，例如，Morel等，1988，Molec.Immunol.25：7-15)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见，例如，Cheung等，1990，Virology 176：546-552)；和直接标记RIA(Moldenhauer等，1990，Scand.J.Immunol.32：77-82)。典型地，这样的测定涉及使用与载有任何这些的固体表面或细胞结合的纯化的抗原：未标记的测试抗原结合蛋白和标记的参考抗原结合蛋白。通过确定在存在测试抗原结合蛋白的情况下与固体表面或细胞结合的标记的量来测量竞争性抑制。通常，测试抗原结合蛋白过量存在。通过竞争测定鉴定的抗原结合蛋白(竞争性抗原结合蛋白)包括结合与参考抗原结合蛋白相同的表位的抗原结合蛋白和结合与参考抗原结合蛋白结合的表位足够接近以致发生空间位阻的邻近表位的抗原结合蛋白。关于确定竞争性结合的方法的其他细节提供在本文的实施例中。通常，当竞争性抗原结合蛋白以过量存在时，它将抑制(例如，降低)参考抗原结合蛋白与共同抗原的特异性结合达至少40-45％，45-50％，50-55％，55-60％，60-65％，65-70％，70-75％或75％以上。在某些实施方案中，所述结合被抑制达至少80-85％，85-90％，90-95％，95-97％或97％以上。

在本发明的一方面中，竞争测定可以被用于鉴定与抗PCSK9抗体508.20.04，508.20.06，508.20.28，508.20.33或508.20.84竞争结合PCSK9的抗体。在某些实施方案中，这样的竞争性抗体结合与抗PCSK9抗体508.20.04，508.20.06，508.20.28，508.20.33和/或508.20.84结合的表位相同的表位(例如，线性或构象表位)。用于定位与抗体结合的表位的详细的示例性方法提供在Methods in Molecular Biology(分子生物学中的方法)vol.66(Humana Press，Totowa，NJ)中的Morris(1996)“Epitope MappingProtocols(表位定位实验方法)”中。

在示例性竞争测定中，在溶液中温育固定的PCSK9，所述溶液包含与PCSK9结合的第一标记抗体(例如，抗PCSK9抗体508.20.04，508.20.06，508.20.28，508.20.33或508.20.84)和被测试其与所述第一抗体竞争结合PCSK9的能力的第二未标记抗体。所述第二抗体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，在这样的溶液中温育固定的PCSK9，所述溶液包含第一标记抗体但是不包含第二未标记抗体。在允许所述第一抗体与PCSK9结合的条件下温育后，除去过量的未结合的抗体，并且测量与固定的PCSK9结合的标记的量。如果相对于对照样品在测试样品中与固定的PCSK9结合的标记的量显著降低，则说明所述第二抗体与所述第一抗体竞争结合PCSK9。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual(抗体：实验室手册)ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)。

2.活性测定

在一方面中，提供用于鉴别具有生物学活性的抗PCSK9抗体的测定。抗PCSK9抗体的生物学活性可以包括，例如，阻断、拮抗、抑制、干扰、调节和/或降低PCSK9的一种或多种生物学活性。还提供在体内和/或体外具有这样的生物学活性的抗体。

在某些实施方案中，抗PCSK9抗体结合人PCSK9并防止与LDLR的相互作用。在某些实施方案中，抗PCSK9抗体特异性结合人PCSK9和/或基本上抑制人PCSK9与LDLR的结合达至少约20％-40％，40-60％，60-80％，80-85％以上(例如，通过在体外竞争性结合测定中测量结合)。在某些实施方案中，本发明提供分离的抗PCSK9抗体，其特异性地结合PCSK9，并且当在体外使用本文中公开的HepG2细胞中的LDLR减量调节测定测量时，拮抗PCSK9介导的对LDLR水平的作用。

D.免疫缀合物

本发明也提供包含本文中的抗PCSK9抗体与一或多种细胞毒性剂，例如化疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如蛋白质毒素、细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素，或其片段))或放射性同位素缀合的免疫缀合物。

在一实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与一种或多种药物缀合，所述药物包括，但不限于，美坦生类化合物(参见美国专利第5,208,020号、第5,416,064号及欧洲专利EP 0 425 235 B1)；奥利司他汀(auristatin)，如单甲基奥利司他汀药物(monomethylauristatin)部分DE及DF(MMAE及MMAF)(参见美国专利第5,635,483号及第5,780,588号，及第7,498,298号)；多拉司他汀(dolastatin)；加利车霉素(calicheamicin)或其衍生物(参见美国专利第5,712,374号、第5,714,586号、第5,739,116号、第5,767,285号、第5,770,701号、第5,770,710号、第5,773,001号及第5,877,296号；Hinman等人，Cancer Res.(癌症研究)53：3336-3342(1993)；及Lode等人，Cancer Res.(癌症研究)58：2925-2928(1998))；蒽环类抗生素(anthracycline)如道诺霉素(daunomycin)或多柔比星(参见Kratz等人Current Med.Chem.13：477-523(2006)；Jeffrey等人，Bioorganic&Med.Chem.Letters16：358-362(2006)；Torgov等人，Bioconj.Chem.16：717-721(2005)；Nagy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院学报)97：829-834(2000)；Dubowchik等人，Bioorg.&Med.Chem.Letters12：1529-1532(2002)；King等人，J.Med.Chem.45：4336-4343(2002)；及美国专利第6,630,579号)；甲氨喋呤(methotrexate)；长春地辛(vindesine)；紫杉烷(taxane)如多西他赛(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)、拉洛紫杉醇(larotaxel)、特赛紫杉醇(tesetaxel)及奥他紫杉醇(ortataxel)；单端孢霉烯族化合物(trichothecene)；及CC1065。

在另一实施方案中，免疫缀合物包含如本文中所述的抗体与酶促活性毒素或其片段缀合，酶促活性毒素或其片段包括，但不限于，白喉(diphtheria)A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白(dianthin protein)、美洲商陆(Phytolacaamericana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢霉烯族化合物(trichothecenes)。

在另一实施方案中，免疫缀合物包含如本文中所述的抗体与放射性原子缀合形成放射性缀合物。多种放射性同位素可用于制备放射性缀合物。实例包括At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、Pb²¹²及Lu的放射性同位素。当使用放射性缀合物进行检测时，其可包含用于闪烁摄影研究的放射性原子，例如tc99m或I123或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)的自旋标记物，如碘-123及碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。

抗体与细胞毒性剂的缀合物可使用多种双功能蛋白质偶合剂制得，例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚氨甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸二甲基己二亚酰胺化物)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)己二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。举例来说，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如Vitetta等人，Science(科学)238：1098(1987)中所述来制备。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于使放射性核苷酸与抗体结合的示例性螯合剂。参见WO 94/11026。接头可以是促进细胞毒性药物在细胞中释放的“可裂解接头”。举例来说，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感性接头、光不稳定接头、二甲基接头或含二硫化物的接头(Chari等人，Cancer Res.(癌症研究)52：127-131(1992)；美国专利第5,208,020号)。

本文中的免疫缀合物或ADCs明确涵盖，但不限于，用交联剂试剂制备的这些缀合物，该等交联剂试剂包括，但不限于：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、硫代-EMCS、硫代-GMBS、硫代-KMUS、硫代-MBS、硫代-SIAB、硫代-SMCC及硫代-SMPB及SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，交联剂试剂可商购获得(例如购自Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL.，U.S.A)。

E.用于诊断和检测的方法和组合物

在某些实施方案中，本文中提供的任何抗PCSK9抗体可以用于检测PCSK9在生物样品中的存在。术语“检测”用于本文中时，包括定量或定性检测。在某些实施方案中，生物样品是血、血清或生物来源的其他液体样品。在某些实施方案中，生物样品包含细胞或组织。

在一个实施方案中，提供用于诊断或检测方法的抗PCSK9抗体。在另一个方面中，提供检测PCSK9在生物样品中的存在的方法。在某些实施方案中，方法包含检测PCSK9蛋白在生物样品中的存在。在某些实施方案中，PCSK9是人PCSK9。在某些实施方案中，所述方法包括将生物样品与如本文所述的抗PCSK9抗体在允许抗PCSK9抗体与PCSK9结合的条件下接触，并检测在抗PCSK9抗体和PCSK9之间是否形成复合物。该方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，抗PCSK9抗体被用于选择适合利用抗PCSK9抗体的治疗的受试者，例如其中PCSK9或LDL-胆固醇是用于选择患者的生物标记物。

可以使用本发明的抗体诊断的示例性疾病包括胆固醇相关疾病(其包括“血清胆固醇相关疾病”)，其包括以下的任何一种或多种：高胆固醇血症、心脏病、代谢综合征、糖尿病、冠状动脉心脏病、卒中、心血管疾病、阿尔茨海默病和一般性的异常脂血症(其显示为例如提高的总血清胆固醇、提高的LDL、提高的甘油三酯、提高的极低密度脂蛋白(VLDL)和/或低的HDL)。在一方面中，本发明提供治疗或预防个体中的高胆固醇血症和/或至少一种以下症状的方法：异常脂血症、动脉粥样硬化、心血管疾病(CVD)或冠状动脉心脏病，所述方法包括向所述个体施用有效量的抗PCSK9抗体。在某些实施方案中，本发明提供有效量的抗PCSK9抗体用于治疗或预防受试者中的高胆固醇血症和/或至少一种以下症状：异常脂血症、动脉粥样硬化、CVD或冠状动脉心脏病。本发明还提供有效量的拮抗胞外或循环PCSK9的抗PCSK9抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防个体的高胆固醇血症和/或至少一种以下症状：异常脂血症、动脉粥样硬化、CVD或冠状动脉心脏病。

在某些实施方案中，提供标记的抗PCSK9抗体。标记包括但不限于，被直接检测的标记或部分(如荧光标记，发色团标记，电子致密标记，化学发光标记，和放射性标记)，以及被间接检测的部分，如酶或配体，例如，通过酶促反应或分子相互作用。示例性标记包括但不限于，放射性同位素³²P，¹⁴C，¹²⁵I，³H，和¹³¹I，荧光团如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹酰(dansyl)，伞形酮(umbelliferone)，荧光素酶(luceriferase)，例如，萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶(美国专利号4,737,456)，荧光素(luciferin)，2，3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HR)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶解酶，糖类氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，加上利用过氧化氢氧化染料前体的酶如HR，乳过氧化物酶，或微过氧化物酶(microperoxidase)，生物素/亲和素，自旋标记，噬菌体标记，稳定的自由基，等等。

F.药物制剂

本发明还包括包含抗PCSK9抗体的组合物(包括药物制剂)和包含编码抗PCSK9抗体的序列的多核苷酸。在某些实施方案中，组合物包含一种或多种结合PCSK9的抗体或一种或多种包含编码一种或多种结合PCSK9的抗体的序列的多核苷酸。这些组合物还可以包含合适的载体，如本领域中已知的药用赋形剂，包括缓冲剂。

如本文所述的抗PCSK9抗体的药物制剂通过将具有所需纯度的所述抗体与一种或多种任选的药用载体(Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.编(1980))混合来制备，以冻干制剂或水溶液的形式。药用载体通常在所用剂量及浓度对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐及其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸及甲硫氨酸；防腐剂(如氯化十八烷基二甲基苄铵、氯化六羟季铵、氯苄烷铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐平衡离子，如钠；金属复合体(例如Zn-蛋白质复合体)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性药用载体还包括药物间质分散剂，如可溶性中性-活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rHuPH20

BaxterInternational，Inc.)。某些示例性sHASEGPs及使用方法，包括rHuPH20，描述于美国专利公开号2005/0260186及2006/0104968中。在一方面中，sHASEGP与一种或多种其他葡糖胺聚糖酶例如软骨素酶组合。

示例性的冻干抗体制剂描述于美国专利号6,267,958。水性抗体制剂包括美国专利号6,171,586和WO2006/044908中所述的那些，后一种制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲剂。

本文的制剂还可以包含超过一种活性成分，所述活性成分是被治疗的特定适应证所需的，优选具有不会不利地影响彼此的互补活性的那些活性成分。例如，理想的是还提供抑制素。所述活性成分以对于目的用途有效的量合适地组合存在。

可以将活性成分截留于例如通过凝聚技术或通过界面聚合所制备的微囊，例如，分别是羟甲基纤维素或明胶微囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊中、胶状药物传递系统(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米颗粒及纳米胶囊)中或粗滴乳状液中。这些技术披露于Remington′sPharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.编(1980)中。

可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质呈成形物品，例如薄膜或微囊形式。

欲用于体内施用的制剂通常是无菌的。无菌可以例如借助通过无菌过滤膜的过滤而轻易地实现。

G.治疗方法和组合物

任何本文提供的抗PCSK9抗体可以用于治疗方法。

在一方面中，提供用作药物的抗PCSK9抗体。在另一方面中，提供用于治疗与胆固醇相关疾病相关联的病症的抗PCSK9抗体。在某些实施方案中，提供用于治疗与升高的LDL-胆固醇水平相关联的病症的抗PCSK9抗体。在某些实施方案中，提供用于治疗方法中的抗PCSK9抗体。在某些实施方案中，本发明提供抗PCSK9抗体，所述抗PCSK9抗体用于治疗具有与升高的LDL-胆固醇水平相关联的病症的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的抗PCSK9抗体。在某些实施方案中，本文所述的方法和用途还包括向所述个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如，抑制素。在某些实施方案中，本发明提供抗PCSK9抗体，所述抗PCSK9抗体用于降低受试者的LDL-胆固醇水平。在另外的实施方案中，本发明提供抗PCSK9抗体，所述抗PCSK9抗体用于降低受试者的血清LDL-胆固醇水平。在某些实施方案中，本发明提供抗PCSK9抗体，所述抗PCSK9抗体用于增加受试者的LDLR的利用度。在某些实施方案中，本发明提供抗PCSK9抗体，所述抗PCSK9抗体用于抑制受试者中的PCSK9与LDLR的结合。在某些实施方案中，本发明提供抗PCSK9抗体，所述抗PCSK9抗体用于降低个体的LDL-胆固醇水平的方法，所述方法包括向所述个体施用有效的抗PCSK9抗体以降低LDL-胆固醇水平。在某些实施方案中，本发明提供抗PCSK9抗体，所述抗PCSK9抗体用于降低个体的血清LDL-胆固醇水平的方法，所述方法包括向所述个体施用有效的抗PCSK9抗体以降低血清LDL-胆固醇水平。在某些实施方案中，本发明提供抗PCSK9抗体，所述抗PCSK9抗体用于增加个体的LDLR的利用度的方法，所述方法包括向所述个体施用有效的抗PCSK9抗体以提高LDLR的利用度。在某些实施方案中，本发明提供抗PCSK9抗体，所述抗PCSK9抗体用于抑制个体中的PCSK9与LDLR的结合的方法，所述方法包括向所述个体施用有效的抗PCSK9抗体以抑制PCSK9与LDLR的结合。根据任何以上实施方案的“个体”优选是人。

在其他方面中，本发明提供抗PCSK9抗体在生产或制备药物中的用途。在一个实施方案中，所述药物用于治疗胆固醇相关疾病。在某些实施方案中，胆固醇相关疾病是高胆固醇血症。在另一个实施方案中，所述药物用于治疗高胆固醇血症的方法，所述方法包括向具有高胆固醇血症的个体施用有效量的所述药物。

在某些实施方案中，被治疗的疾病是可以通过消除、抑制或降低PCSK9的活性而被改善、减缓、抑制或预防的任何疾病或病症。在某些实施方案中，通常通过使用他汀类可解决的(可治疗或可预防的)疾病或病症也可以被治疗。在某些实施方案中，可以受益于阻止胆固醇合成或提高的LDLR表达的疾病或病症也可以通过本发明的抗PCSK9抗体治疗。在某些实施方案中，可通过本发明的抗PCSK9抗体和治疗方法治疗的个体包括适用LDL单采血液成分术(apheresis)的个体，具有PCSK9活化突变的个体(获得功能突变，″GOF″)，具有杂合家族性高胆固醇血症(heFH)的个体，具有原发性高胆固醇血症、不耐受抑制素或是抑制素不受控的个体，和处于发生高胆固醇血症的风险、可以被预防性治疗的个体。其他适应征包括与继发性病因如II型糖尿病相关联的异常脂血症，胆汁淤积性肝病(cholestatic liver diseases)(原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis))，肾病综合征，甲状腺机能障碍，肥胖，和预防和治疗动脉粥样硬化和心血管疾病。

在某些实施方案中，本文所述的方法和用途还包括向所述个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如，抑制素。在某些实施方案中，所述另外的治疗剂用于预防和/或治疗动脉粥样硬化和/或心血管疾病。在某个实施方案中，所述另外的治疗剂用于降低复发的心血管事件的风险的方法。在某些实施方案中，所述另外的治疗剂用于提高受试者的HDL-胆固醇水平。

在另一方面中，本发明提供药物制剂，所述药物制剂包含任何本文提供的抗PCSK9抗体，例如，用于任何以上的治疗方法。在一个实施方案中，所述药物制剂包含任何本文提供的抗PCSK9抗体和药用载体。在另一个实施方案中，所述药物制剂包含任何本文提供的抗PCSK9抗体和至少一种另外的治疗剂，例如，抑制素。

在治疗中，本发明的抗体可以单独使用或与其他试剂组合使用。例如，本发明的抗体可以与至少一种另外的治疗剂一起共同给药。在某些实施方案中，这样的另外的治疗剂提升LDLR的水平。在某些实施方案中，另外的治疗剂是降低LDL-胆固醇的药物如抑制素，例如，阿托伐他汀，氟伐他汀，洛伐他汀，美伐他汀，匹伐他汀，普伐他汀，罗舒伐他汀，辛伐他汀或其任意组合，例如，

或

在某些实施方案中，另外的治疗剂是提高HDL-胆固醇的药物。

这样的以上所述的组合疗法包括组合给药(其中两种以上治疗剂被包含在相同或分开的制剂中)，和分别给药，其中，本发明的抗PCSK9抗体的给药可以发生在另外的治疗剂和/或佐剂的给药前、同时和/或之后。

本发明的抗体(以及任何另外的治疗剂)可以通过任何合适的方法给药，包括肠胃外给药，肺内给药和鼻内给药，并且，如果局部治疗需要，病变内给药。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给药。在一定程度上根据用药是短期或长期性而定，可通过任何适合途径，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射用药。本文中涵盖各种用药时程，包括，但不限于，单次给药或在多个时间点多次给药、推注给药及脉冲输注。

本发明的抗体将以与良好医疗实践相一致的方式配制、给药和施用。在该背景下考虑的因素包括待治疗的具体病症、待治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状态、病症的原因、递送试剂的位点、施药方法、施药时间安排、和医疗从业者已知的其他因素。所述抗体不需要，但任选地，与目前用于预防或治疗待讨论病症的一种或多种试剂一起配制。所述其他试剂的有效量取决于制剂中存在的抗体的量、病症或治疗的类型、和以上讨论的其他因素。这些一般以相同剂量，并使用如本文中所述的施药途径，或以本文中所述的剂量的约1-99％，或以通过经验/临床确定合适的任意剂量和任何途径来使用。

为了预防或治疗疾病，本发明的抗体的合适剂量(当单独或与一种或多种其他另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重性和进程、所述抗体是以预防目的施用还是以治疗目的施用、以前的治疗、患者的临床病史和对所述抗体的应答，和主治医师的判断力。所述抗体以一次治疗或经过一系列治疗合适地施用于患者。根据疾病的类型和严重性，约1μg/kg-15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体可以是用于向患者施用的最初候选剂量，无论，例如，通过一次或多次分别施药，或通过连续输注。一个典型的每日剂量可以在约1μg/kg-100mg/kg或更多的范围内，其取决于上文提及的因素。为了重复施用数日或更长，根据病症，通常将持续治疗直至出现疾病症状的理想抑制。所述抗体的一个示范性剂量应该在约0.05mg/kg-约10mg/kg范围内。因此，约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)的一个或多个剂量可以施用于患者。这样的剂量可以间隔地，例如每周或每三周施用(例如以使得患者接受约2-约20或例如约6剂量的所述抗体)。可以施用最初较高的负荷剂量，随后是一个或多个较低的剂量。

在某些实施方案中，使用无变化的固定(flat-fixed)用药方案来将抗PCSK9抗体施用于个体。取决于疾病的类型和严重性，示例性的无变化的固定剂量可以为10至1000mg的抗PCSK9抗体。抗体的一个示例性剂量为约10mg至约600mg。抗体的另一个示例性剂量为约100mg至约600mg。在某些实施方案中，150mg、300mg或600mg的抗PCSK9抗体被给药于个体。然而，其它治疗方案可以是有用的。该疗法的进展可以容易地通过常规方法和测定来监测。

要理解，任何以上制剂或治疗方法可以使用本发明的免疫缀合物进行以代替抗PCSK9抗体或作为抗PCSK9抗体的补充。

H.制品

在本发明的另一方面中，提供一种制品，所述制品包含可用于治疗、预防和/或诊断上述病症的材料。该制品包括容器和在容器上或与容器一起的标签或包装说明书(package insert)。适合的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器、IV溶液包等。所述容器可以由各种材料诸如玻璃或塑料制成。容器装有组合物，所述组合物是单独地或与可有效用于治疗、预防和/或诊断所述病症的另一种组合物结合，对于所述疾患的治疗有效的组合物，并且可以具有无菌的存取口(例如，所述容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中至少一种活性试剂是本发明的抗PCSK9抗体。标签或包装说明书标明该组合物是用于治疗特定的病症。此外，所述制品可以包含(a)其中包含组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗PCSK9抗体；和(b)其中包含组合物的第二容器，其中所述组合物包含另一种细胞毒性剂或其他的治疗剂。在某些实施方案中，第二容器包含第二治疗剂，其中所述第二治疗剂是“抑制素”类的降胆固醇药。在某些实施方案中，抑制素是和/或包含阿托伐他汀(例如，

或Torvast)，氟伐他汀(例如，

洛伐他汀(例如，ALTOCOR^TM或

美伐他汀(匹伐他汀(例如，

或

普伐他汀(例如，

罗舒伐他汀(例如，

辛伐他汀(例如，或其任意组合，例如

或

本发明的该实施方案中的制品还可以包括包装说明书，所述包装说明书指明所述组合物可以用于治疗特定病症。备选地，或另外地，所述制品还可以包括第二(或第三)容器，所述第二(或第三)容器包含药用缓冲剂，如抑菌注射用水(BWFI)，磷酸盐缓冲盐水，Ringer溶液和葡萄糖溶液。从商业和用户立场，它还可以包括所需的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、滤膜、针头和注射器。

要理解，任何以上制品可以包括本发明的免疫缀合物以代替抗PCSK9抗体或作为抗PCSK9抗体的补充。

III.实施例

以下是本发明的方法和组合物的实施例。要理解，根据以上提供的一般性描述，可以实施多种其他实施方案。

实施例1：抗PCSK9抗体的产生

残基编号是根据Kabat(Kabat等，Sequences of proteins ofimmunological interest(免疫学感兴趣的蛋白的序列)，5th Ed.，Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))进行。

文库分选和筛选以鉴定抗PCSK9抗体

将内部生产的生物素化的人PCSK9用作用于文库分选的抗原。针对处于溶液相的生物素化的PCSK9进行五轮噬菌体文库分选。对于第一轮的分选，将20μg/mL生物素化的PCSK9添加到用噬菌体封闭缓冲液PBST(磷酸盐缓冲盐水(PBS)和1％(w/v)牛血清清蛋白(BSA)和0.05％(v/v)Tween20)预封闭的抗体噬菌体文库VH(参见，例如，Lee等，J.Immunol.Meth.284：119-132，2004)和VH/VL(参见Liang等，JMB.366：815-829，2007)，并且在室温过夜温育。第二天，向每个文库中加入120μl预吸收PBST/BSA的

MyOne^TM Streptavidin T1(Invitrogen，Carlsbad，CA)，并且在室温温育1小时。然后用PBT(含有0.05％ Tween20的PBS)将小珠洗涤三次，并用1mL 50mM HCl和500mM NaCl洗脱结合的噬菌体30分钟，并用400μL的1M Tris碱(pH7.5)中和。回收的噬菌体在大肠杆菌(E.coli)XL-1Blue细胞中扩增。在随后的选择轮次期间，抗体噬菌体与生物素化的PCSK9的温育减少至2-3小时，并且在neutravidin包被的(货号89890，10μg/ml，Fisher Scientific，Waltham，MA)或链霉亲和素包被的(货号21125，10μg/ml，Fisher Scientific，Waltham，MA)Nunc96孔Maxisorp免疫平板上捕获与噬菌体结合的抗原。逐渐提高平板洗涤的严格性。

在5轮淘选后，观察到显著的富集。各从VH和VH/VL文库分选中挑取96个克隆以确定它们是否特异性地结合人PCSK9。对这些克隆的可变区进行PCR测序以鉴定独特序列克隆。选择以超过背景至少5x结合人PCSK9的独特噬菌体抗体，并且使其转型为全长IgGs以用于在体外细胞测定中进行评估。

通过以下方法使目的克隆转型为IgG：分别将个体克隆的VL和VH区克隆到LPG3和LPG4载体中，并且在哺乳动物CHO细胞中瞬时表达，并且利用蛋白质A柱进行纯化。

构建文库用于使来源于VH文库的克隆的亲和力提高

在所有CDR-L3位置含有终止密码子(TAA)并且在M13噬菌体的表面上展示单价Fab的噬菌粒pW0703(来源于噬菌粒pV0350-2b(Lee等，J.Mol.Biol.340，1073-1093(2004))充当用于从VH文库嫁接目的克隆的重链可变结构域(VH)以用于亲合力成熟的文库模板。硬性随机化和软性随机化的策略均用于亲和力成熟。对于硬性(hard)随机化，使用设计为模拟天然人抗体的氨基酸，对一个具有三个轻链CDR的选定位置的轻链文库进行随机化，并且所设计的DNA简并性如在Lee等(J.Mol.Biol.340，1073-1093(2004))中所述。对于软性(soft)随机化，靶向CDR-L3的位置91-96，CDR-H1的30-33、35，CDR-H2的50、52、53-54、56和58，CDR-H3的95-100、100A和100C处的残基；并且选择CDR环的三个不同组合，H1/L3、H2/L3和H3/L3，用于随机化。为获得软性随机化条件(其在选定位置引入约50％的突变率)，利用有利于野生型核苷酸的碱基的70-10-10-10混合物合成诱变的DNA(Gallop等，Journal of MedicinalChemistry 37：1233-1251(1994))。

产生亲和力提高的噬菌体分选策略

对于亲和力提高选择，以增加的严格性对噬菌体文库进行五轮溶液分选。对于第一轮的溶液分选，将在1％BSA和0.05％Tween20中的3O.D./ml的噬菌体输入与在100μl含有1％Superblock(Pierce Biotechnology)和0.05％ Tween20的缓冲液中的100nM生物素化的PCSK9(浓度是基于亲本克隆噬菌体IC50值)在室温温育2小时。用1％Superblock将混合物进一步稀释10X，并且将100μl/孔施用到neutravidin包被的孔(10μg/ml)中，在室温30分钟并伴以轻微振荡。用PBS-0.05％ Tween20将所述孔洗涤十次。为了确定背景结合，在neutravidin包被的平板上捕获含有噬菌体的对照。用150μl/孔50mM HCl、500mM KCl洗脱结合的噬菌体30分钟，并且随后通过50μl/孔的1M Tris pH8中和，滴定，并且繁殖以用于次轮。以增加的选择严格性再进行四轮溶液分选。前两轮通过将生物素化的靶标蛋白质浓度从100nM降至1nM进行结合速率(on-rate)选择，后两轮是通过在室温加入过量的未生物素化的靶标蛋白质(300-1000倍以上)以竞争掉较弱的结合者来进行解离速率(off-rate)选择。

高通量亲和力筛选ELISA(单点竞争)

从第五轮筛选中挑取菌落。将克隆在37℃在150μl/孔的含有50μg/ml羧苄青霉素和1E10/ml KO7的2YT培养基中在96孔板(Falcon)中过夜培养。从同一个平板，挑取XL-1感染的亲本噬菌体的菌落作为对照。将96孔Nunc Maxisorp平板用100μl/孔的neutravidin(10μg/ml)在PBS中在4℃过夜。将所述平板用150μl在PBS中的1％BSA和0.05％Tween20封闭1小时。

用35μl含有或不含15nM PCSK9的ELISA(酶偶联免疫吸附测定)缓冲液(含0.5％BSA，0.05％ Tween20的PBS)稀释35μl的噬菌体上清液，并且在室温在F平板(NUNC)中温育1小时。然后将35μl的3μg/ml生物素化的PCSK9加入每孔中，并且在室温温育15分钟。将95μl的混合物一起(side by side)转移至neutravidin包被的平板。将所述平板温和振动15分钟以允许捕获与生物素化的PCSK9结合的噬菌体至平板。将平板用PBS-0.05％ Tween20洗涤十次。通过加入辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗-M13抗体于ELISA缓冲液中(1∶2500)并在室温温育30分钟来量化结合。将所述平板用PBS-0.05％Tween20洗涤十次。接下来，将100μl/孔的1∶1比率的3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)过氧化物酶底物和过氧化物酶溶液B(H₂O₂)(Kirkegaard-Perry Laboratories(Gaithersburg，MD))添加到所述孔中，并且在室温温育5分钟。通过向每孔加入100μl0.1M磷酸(H₃PO₄)并允许在室温温育5分钟来终止反应。使用标准ELISA平板读数器在450nm测定每孔中黄色的OD(光密度)。通过以下公式计算OD下降(％)：

OD_450nm下降(％)＝[(含有竞争者的孔的OD_450nm)/(不含竞争者的孔的OD_450nm)]*100。

与亲本噬菌体的孔(100％)的OD_450nm下降(％)相比，挑取具有的OD_450nm下降(％)低于50％的克隆用于序列分析。选择独特克隆用于噬菌体制备以通过与亲本克隆的比较确定针对PCSK9的结合亲合力(噬菌体IC₅₀)。然后将亲合力提高最大的克隆转型为人IgG1用于抗体产生以及进一步的BIAcore结合动力学分析和其他体外或体内测定。参见图1和2。

实施例2：通过BIAcore表征抗PCSK9抗体

抗PCSK9抗体的结合亲合力通过表面等离子共振(SPR)使用BIAcore^TM-3000仪器来测量。抗PCSK9人抗体由包被在CM5生物传感器芯片上从而获得约200个应答单位(RU)的小鼠抗人Fc抗体(货号BR-1008-39，GE Healthcare，Piscataway，NJ)来捕获。对于动力学测量，在25℃以30μl/min的流速注射在PBT缓冲液(含0.05％ Tween 20的PBS)中的人、鼠、恒河猴和食蟹猴PCSK9(Genentech，South San Francisco，CA)的两倍连续稀释液(500nM至0.245nM)。使用简单一对一Langmuir结合模型(BIAcore Evaluation Software3.2版本)计算结合速率(k_on)和解离速率(k_off)。平衡解离常数(K_D)被计算作比率k_off/k_on。见图3。

实施例3：LDLR-PCSK9结合测定

进行竞争结合ELISA以研究抗PCSK9抗体在阻断人PCSK9与LDLR结合方面的活性。简言之，将1μg/mL的可溶人LDLR胞外结构域(R&DSystems，Minneapolis，MN)在4℃过夜包别在384孔MaxiSorp板

NUNC^TM International，Rochester，NY)上。然后向所述板中加入0.25μg/mL的与不同浓度的抗PCSK9抗体和对照抗体预混的生物素化的人PCSK9，并且在室温温育2小时。通过加入链霉亲和素-HRP(GEHealthcare)和底物3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMBE-1000，Moss，Inc.，Pasadena，MD)来检测PCSK9与包被的LDLR的结合。结合结果(OD)对抗体浓度作图，并且使用KaleidaGraph软件产生IC₅₀值。见图4。

实施例4：在HepG2细胞上抗体防止LDLR减量调节

以1x10⁵将HepG2细胞接种到48孔板中。次日，将培养基换成10％无脂蛋白血清(LPDS，Frederick，Maryland)。次日，将15μg/ml PCSK9+/-抗PCSK9抗体加入到细胞中，在37℃达4小时。用PBS清洗细胞并使用2.5mM EDTA进行分离。将细胞与1∶20抗LDLR(Progen Biotechnik，Heidelberg，Germany)温育15分钟，用PBS洗涤并与1∶200来自Invitrogen(Carlsbad，CA)的山羊抗小鼠AlexaFluor488温育15分钟。将细胞洗涤并重悬在PBS加10μg/ml碘化丙啶中。然后利用双波长激光流式细胞仪(FACScan，Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)分析样品。数据显示所有本文所述的抗PCSK9抗体阻止LDLR的减量调节。见图5。

实施例5：小鼠肝中的LDLR减量调节

通过静脉内给药用3、30或60μg的PCSK9处理正常C57/BL6小鼠(Charles River，Wilmington，MA)。使用来自Calbiochem(Gibbstown，NJ)的ProteoExtract天然膜蛋白提取试剂盒(ProteoExtract Native MembraneProtein Extraction Kit)根据制造商的说明，在PCSK9静脉内给药后15分钟、1小时或4小时收获来自每只小鼠的肝脏并提取蛋白。作为对照，将5只小鼠仅用载体处理，并且汇集8μg的各肝溶胞产物用于分析。通过SDS-PAGE在8％tris-gly凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)上分析溶胞产物。使用iBlot(Invitrogen)将蛋白转移至硝酸纤维膜。将所述膜用5％脱脂奶封闭1小时，然后与1∶500抗LDLR(Abcam，Cambridge，MA)在5％脱脂奶中在4℃过夜温育。次日，将所述膜用TBS-T洗涤三次，与1∶5000抗兔HRP(GE Healthcare，Piscataway，NJ)温育1小时，并用TBS-T洗涤三次。使用ECL-Plus(GE Healthcare)并暴露于XAR胶片(Kodak，Rochester，NY)来使蛋白可视。在过夜曝光后，将所述膜用TBS-T洗涤，与1∶500抗运铁蛋白受体抗体(Invitrogen)温育1小时，用TBS-T洗涤，与1∶5000抗小鼠HRP(GE Healthcare)温育1小时，用TBS-T洗涤并用ECL-Plus进行可视化。使用抗LDLR抗体的蛋白印迹显示用30μg的PCSK9处理1小时显著地减量调节小鼠肝中的LDLR水平。见图6。

实施例6：抗体防止肝LDLR减量调节

用赋形剂或5mg/kg抗PCSK9抗体注射正常的C57/BL6(Charles River)小鼠，24小时后用30μg PCSK9处理1小时。使用ProteoExtract天然膜蛋白提取试剂盒(Calbiochem)根据制造商的说明收获来自每只小鼠的肝脏。通过SDS-PAGE在8％bis-tris凝胶上分析溶胞产物。使用iBlot(Invitrogen)将蛋白转移至硝酸纤维膜。将所述膜用5％脱脂奶封闭1小时，然后与1∶500抗LDLR(Abcam)在5％脱脂奶中在4℃过夜温育。次日，将所述膜用TBS-T洗涤三次，与1∶5000抗兔HRP(GE Healthcare)温育1小时，并用TBS-T洗涤三次。使用ECL-Plus(GE Healthcare)并暴露于XAR胶片(Kodak)来使蛋白可视。使用抗LDLR抗体的蛋白印迹显示所有五种抗PCSK9抗体(508.20.84，508.20.33，508.20.04，508.20.28，508.20.06)者防止小鼠肝中的LDLR减量调节。见图7。

实施例7：抗PCSK9抗体的药物动力学

使用抗人IgG Fc ELISA来测定在小鼠PK研究样品中的抗PCSK9抗体浓度。简言之，将驴抗人IgG Fc(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)用于包被测定平板，并将山羊抗人IgG Fc HRP缀合物(JacksonImmunoResearch，West Grove，PA)用作检测抗体。该测定能够测量在小鼠血清基质中多达10％的抗PCSK9抗体，测定范围为0.31-20ng/mL。见图8和9。

通过抗PCSK9抗体ELISA使用重组人PCSK9(Genentech，Inc.SouthSan Francisco，CA)作为捕获抗体而山羊抗人IgG(H+L)HRP作为检测抗体来测定食蟹猴PK研究样品中的血清抗PCSK9抗体浓度。该测定能够测量在食蟹猴血清基质中多达2％的抗PCSK9抗体，并且测定范围为0.313-50ng/mL。参见图10和11。

实施例8：抗体降低小鼠中的血清胆固醇水平

八周龄雄性C57BL/6J小鼠商购自Jackson Laboratory。将小鼠保持在室内(on housing)在保藏室中达一周之后开始实验。在麻醉下对所有小鼠进行预放血并使用INFINITY^TM Cholesterol Reagent(Fisher Diagnostics，Middletown，VA)测定小鼠的总胆固醇水平。将小鼠随机分成6个不同的具有相同水平的平均胆固醇水平的组。所有小鼠接受单剂量10mg/kg体重的对照抗体或抗PCSK9抗体。在第3天、第7天、第10天和第15天对小鼠进行放血，并使用INFINITY^TM胆固醇试剂(INFINITY^TM CholesterolReagent)(Fisher Diagnostics，Middletown，VA)测定血清总胆固醇水平。

当施用10mg/kg的单剂量时，所有五种抗PCSK9抗体(508.20.04，508.20.06，508.20.28，508.20.33，508.20.84)都显示总胆固醇水平的下降。在第3天和多至第10天，当与接受对照抗体的小鼠比较时，抗PCSK9抗体的给药导致总胆固醇水平的显著下降。见图12。

实施例9：抑制素效力的增强

该实验证明：与单独的抗PCSK9抗体治疗或单独的抑制素治疗相比，抗PCSK9抗体和抑制素的组合导致总胆固醇水平更大的下降。见例如，图13。八周龄雄性C57BL/6J小鼠购自Jackson Laboratory。将小鼠分成2个不同的组。无抑制素小鼠接受对照饮食，而抑制素组在抗体施用前接受饮食中的0.2％洛伐他汀2周(Bioserve，Frenchtown，NJ)。对所有小鼠进行预放血，并且基于相等的平均胆固醇水平对小鼠进行随机化。在第3天对小鼠进行放血，并且使用INFINITY^TM胆固醇试剂(Fisher Diagnostics，Middletown，VA)测定总胆固醇水平。

抗PCSK9抗体显示显著的降胆固醇效果。与无抑制素组相比，单独的抑制素治疗导致总胆固醇水平的适度下降。与单独的抗PCSK9相比，抑制素加抗PCSK9抗体的组合导致总胆固醇水平的额外下降。见图13。

实施例10：与抗PCSK9抗体的Fab片段结合的PCSK9的X射线晶体结构

蛋白纯化和结晶

将来自10L大肠杆菌(E.coli)表达的210g冷冻的细胞糊在1L裂解缓冲液(PBS/25mM EDTA/1mM PMSF)中解冻。通过Tissuemizer(30秒)使细胞破裂，并将所得的浆液两次通过微流体化机。通过离心沉淀不溶的物质。将澄清的细胞裂解液(一次250mL)以5mL/min加样到Protein G柱(货号17-0618-05，GE Healthcare)上。然后用100mL的裂解缓冲液对所述柱进行洗涤，之后用150mL的洗脱缓冲液(0.58％乙酸)洗脱结合的抗PCSK9抗体的Fab片段。在洗脱期间收集25mL级分。在SDS PAGE分析后，汇集含有抗PCSK9抗体的Fab片段的级分。

用50ml缓冲液(Buffer)A(20mM MES pH5.5)平衡5mL预装的SPHP柱(GE Healthcare，货号17-1152-01)。以3mL/min将来自前一步的汇集的级分加样到柱上。用缓冲液(Buffer)A将该柱洗涤至基线。使用20柱体积的缓冲液B(20mM MES pH5.5，1M NaCl)使用从0％至100％缓冲液B的梯度洗脱结合的Fab片段。在洗脱期间收集2mL级分。汇集含有所述蛋白的级分(使用SDS-PAGE确定)，并且浓缩至5mL，之后加样到已经用分选缓冲液(sizing buffer)(20mM Hepes7.2，150mM NaCl)预平衡的320mLS75凝胶过滤住上。以1.5mL/min连续运行分选缓冲液220分钟，同时收集2mL级分。使用SDS-PAGE分析峰级分(A280)。

使用标准分子生物学技术，将含有组氨酸(His)₈C端标签的人PCSK9(Genbank EF692496)互补脱氧核糖核酸(cDNA)(SEQ ID NO：32)插入到带有巨细胞病毒(CMV)启动子的哺乳动物表达载体(pRK5)中。通过瞬时转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞来表达蛋白，并且利用在镍-氮基三乙酸-琼脂糖柱(Qiagen)上的亲和层析以及之后在Sephacryl S-200柱(GE Healthcare)上的凝胶过滤从条件培养基中进行纯化。纯化的蛋白的正确的质量通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)证实，并且氨基酸序列的准确性通过N端测序确认。

将纯化的抗PCSK9抗体的Fab片段和6.9mg的PCSK9蛋白混合，其中Fab片段是2倍摩尔过量，并在4℃温育1小时，之后浓缩至5mL。然后将浓缩的混合物上样到用分选缓冲液预平衡的Superdex 200尺寸排阻柱(货号17-1071-01，GE Healthcare)上。以1.5mL/min连续运行分选缓冲液220分钟，同时收集2mL级分。汇集含有PCSK9和抗PCSK9抗体的Fab片段两者(SDS-PAGE)的峰级分(A280)，并浓缩至20mg/mL。然后将浓缩的复合物用于进行结晶尝试。由蛋白和池液(reservoir)(池液含有1.3M磷酸钾/钠，pH7)之间1∶1混合物，使用坐滴，形成最初的晶体。通过改变悬滴中蛋白：池液比来优化晶体。用补充以25％甘油的母液处理选择的晶体，并保存在液氮中。

PCSK9：抗PCSK9抗体的Fab片段复合物的结构测定

在同步加速器束线SSRL7-1收集扩展至约

分辨率的衍射数据，并进行积分，并在空间群I222中换算(scaled)。通过分子置换的方法，使用之前报道的PCSK9的结构(Hampton等，PNAS 104：14609-9(2007)，pdb登记号2QTW)和之前报道的抗体Fv片段的结构(Eigenbrot等，JMol Biol229：969-95(1993)，pdb登记号1FVC)获得近似相位。在部分置换已经改善相位后，使用之前报道的同源结构(Eigenbrot等，同上，pdb登记号1FVD)的部分，将抗PCSK9抗体的Fab片段的恒定区作为刚体放置。最后精修的结构的晶体学R-值为25&30％。数据收集和修正统计数据显示在以下表1中。

表1.

精修

^a Rsym＝∑||I-|<I>‖/∑|<I>|，其中I是单次观察的强度，而<I>是对称等效观察的平均强度。

^b括号中是针对最高分辨率壳层。

^c R＝∑|Fo-Fc|/∑|Fo|，其中Fo和Fc分别是观察的和计算的结构因子振幅。R_FREE被计算为不包括在精修中的反射的R。

从X射线结构确定PCSK9上的表位

使用分子分析程序PyMOL，使用

标准。在抗PCSK9抗体的Fab片段的任何部分的

内的PCSK9残基被确定为表位。基于该分析，表位包含以下残基中的一个或多个：人PCSK9的R194、E195、D238、A239、A341、Q342、E366、D367、I369、S376、T377、C378、F379、S381和H391。

虽然为了清楚的理解，已经借助于附图和实例详细描述了上述发明，但是描述和实例不应当解释为限制本发明的范围。本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容通过引用完整地清楚结合。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.结合PCSK9的抗PCSK9抗体或抗体片段，其包含可变结构域，所述可变结构域包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自由以下各项组成的组的高变区(HVR)序列：

(ii)HVR-H2，所述HVR-H2包含RISPANGNTNYADSVKG(SEQ IDNO：4)；

(iii)HVR-H3，所述HVR-H3包含WIGSRELYIMDY(SEQ ID NO：5)；

2.结合PCSK9的抗PCSK9抗体或抗体片段，其包含可变结构域，所述可变结构域包含以下六种HVR序列：

(ii)HVR-H2，所述HVR-H2包含RISPANGNTNYADSVKG(SEQ IDNO：4)；

(iii)HVR-H3，所述HVR-H3包含WIGSRELYIMDY(SEQ ID NO：5)；

3.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸序列，(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列。

4.权利要求3的抗体，所述抗体还包含(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：26的氨基酸序列；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14的氨基酸序列。

5.权利要求1的抗体，所述抗体包含(a)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的氨基酸序列；(b)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：26的氨基酸序列；和(c)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14的氨基酸序列。

6.权利要求5的抗体，所述抗体还包含(a)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸序列，(b)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，和(c)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列。

7.权利要求1或2的抗PCSK9抗体，其中所述抗体包含：

(1)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列；

(2)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列；

(3)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列；

(4)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列；

(5)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列；和

(6)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。

8.权利要求1或2的抗PCSK9抗体，其中所述抗体包含：

(1)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列；

(2)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列；

(3)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列；

(4)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列；

(5)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列；和

(6)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列。

9.权利要求1或2的抗PCSK9抗体，其中所述抗体包含：

(1)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列；

(2)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列；

(3)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列；

(4)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列；

(5)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列；和

(6)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列。

10.权利要求1或2的抗PCSK9抗体，其中所述抗体包含：

(1)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列；

(2)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列；

(3)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列；

(4)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列；

(5)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列；和

(6)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列。

11.权利要求1或2的抗PCSK9抗体，其中所述抗体包含：

(1)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列；

(2)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列；

(3)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列；

(4)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列；

(5)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列；和

(6)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。

12.权利要求1或2的抗PCSK9抗体，所述抗体包含(a)VH序列，所述VH序列与SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ IDNO：27的氨基酸序列具有至少95％序列同一性；或(b)VL序列，所述VL序列与SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。

13.权利要求12的抗PCSK9抗体，所述抗体包含SEQ ID NO：15、SEQID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：27的VH序列。

14.权利要求12的抗PCSK9抗体，所述抗体包含SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22或SEQ IDNO：23的VL序列。

15.权利要求12的抗PCSK9抗体，所述抗体包含SEQ ID NO：15的VH序列和SEQ ID NO：19的VL序列。

16.权利要求12的抗PCSK9抗体，所述抗体包含SEQ ID NO：27的VH序列和SEQ ID NO：20的VL序列。

17.权利要求12的抗PCSK9抗体，所述抗体包含SEQ ID NO：16的VH序列和SEQ ID NO：21的VL序列。

18.权利要求12的抗PCSK9抗体，所述抗体包含SEQ ID NO：17的VH序列和SEQ ID NO：22的VL序列。

19.权利要求12的抗PCSK9抗体，所述抗体包含SEQ ID NO：27的VH序列和SEQ ID NO：23的VL序列。

20.抗PCSK9抗体，所述抗PCSK9抗体包含(a)VH序列，所述VH序列与SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：27的氨基酸序列具有至少99％序列同一性；或(b)VL序列，所述VL序列与SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：22或SEQ ID NO：23的氨基酸序列具有至少99％序列同一性。

21.权利要求20的抗PCSK9抗体，所述抗PCSK9抗体包含(a)VH序列，所述VH序列与SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQID NO：27的氨基酸序列具有至少99％序列同一性；和(b)VL序列，所述VL序列与SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23的氨基酸序列具有至少99％序列同一性。

22.权利要求21的抗PCSK9抗体，所述抗PCSK9抗体包含与SEQ IDNO：15的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的VH序列和与SEQ IDNO：19的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的VL序列。

23.权利要求21的抗PCSK9抗体，所述抗PCSK9抗体包含与SEQ IDNO：27的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的VH序列和与SEQ IDNO：20的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的VL序列。

24.权利要求21的抗PCSK9抗体，所述抗PCSK9抗体包含与SEQ IDNO：16的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的VH序列和与SEQ IDNO：21的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的VL序列。

25.权利要求21的抗PCSK9抗体，所述抗PCSK9抗体包含与SEQ IDNO：17的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的VH序列和与SEQ IDNO：22的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的VL序列。

26.权利要求21的抗PCSK9抗体，所述抗PCSK9抗体包含与SEQ IDNO：27的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的VH序列和与SEQ IDNO：23的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的VL序列。

27.权利要求21-26中任一项的抗PCSK9抗体，所述抗PCSK9抗体包含SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：27的VH序列。

28.权利要求21-27中任一项的抗PCSK9抗体，所述抗PCSK9抗体包含SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23的VL序列。

29.权利要求1至28中任一项的抗PCSK9抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。

30.权利要求1至28中任一项的抗PCSK9抗体，其中所述抗体是人源化的。

31.权利要求1至28中任一项的抗PCSK9抗体，其中所述抗体是人抗体。

32.权利要求1至28中任一项的抗PCSK9抗体，其中所述抗体是选自Fab、Fab’-SH、Fv、scFv或(Fab’)2片段的抗体片段。

33.权利要求1至28中任一项的抗PCSK9抗体，其中框架序列的至少一部分是人共有框架序列。

34.分离的核酸，其编码权利要求1至28中任一项的抗PCSK9抗体。

35.包含权利要求34的核酸的载体。

36.权利要求35的载体，其中所述载体是表达载体。

37.包含权利要求35或36的载体的宿主细胞。

38.权利要求37的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核的。

39.权利要求37的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核的。

40.制备抗PCSK9抗体的方法，所述方法包括在适于表达编码权利要求1至28中任一项的抗PCSK9抗体的核酸的条件下培养权利要求37的宿主细胞。

41.权利要求40的方法，所述方法还包括从所述宿主细胞回收所述抗PCSK9抗体。

42.药物组合物，其包含权利要求1至28中任一项的抗PCSK9抗体和药用载体。

43.降低受试者的LDL-胆固醇水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1至28中任一项的抗PCSK9抗体。

44.治疗受试者的胆固醇相关疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1至28中任一项的抗PCSK9抗体。

45.治疗受试者的高胆固醇血症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1至28中任一项的抗PCSK9抗体。

46.权利要求43、44或45的方法，所述方法还包括向所述受试者施用有效量的第二药物，其中所述抗PCSK9抗体是第一药物。

47.权利要求46的方法，其中所述第二药物提高LDLR的水平。

48.权利要求46的方法，其中所述第二药物降低LDL-胆固醇的水平。

49.权利要求46的方法，其中所述第二药物包括抑制素。

50.权利要求49的方法，其中所述抑制素选自由以下各项组成的组：阿托伐他汀，氟伐他汀，洛伐他汀，美伐他汀，匹伐他汀，普伐他汀，罗舒伐他汀，辛伐他汀，及其任意组合。

51.权利要求46的方法，其中所述第二药物提高HDL-胆固醇的水平。

52.抑制受试者中PCSK9与LDLR结合的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1至28中任一项的抗PCSK9抗体。

53.检测样品中PCSK9蛋白的方法，所述方法包括

(a)将所述样品与权利要求1-28中任一项的抗体接触；和

(b)检测所述抗PCSK9抗体和所述PCSK9蛋白之间复合物的形成。

54.结合PCSK9的抗PCSK9抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段结合PCSK9的表位，所述PCSK9的表位包含：

(i)至少一个选自由以下各项组成的组的残基：人PCSK9的R194和E195，

(ii)至少一个选自由以下各项组成的组的残基：人PCSK9的D238和A239，

(iii)至少一个选自由以下各项组成的组的残基：人PCSK9的A341和Q342，和

(iv)至少一个选自由以下各项组成的组的残基：人PCSK9的E366、D367、I369、S376、T377、C378、F379、S381和H391。

55.权利要求54的抗体，其中所述PCSK9的表位包含E366、D367或H391中的一个或多个。

56.权利要求55的抗体，其中PCSK9的表位包含E366、D367和H391。

Claims

(ii)HVR-H2，所述HVR-H2包含RISPANGNTNYADSVKG(SEQ IDNO：4)；

(iii)HVR-H3，所述HVR-H3包含WIGSRELYIMDY(SEQ ID NO：5)；

(ii)HVR-H2，所述HVR-H2包含RISPANGNTNYADSVKG(SEQ IDNO：4)；

(iii)HVR-H3，所述HVR-H3包含WIGSRELYIMDY(SEQ ID NO：5)；

7.权利要求1或2的抗PCSK9抗体，其中所述抗体包含：

(1)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列；

(2)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列；

(3)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列；

(4)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列；

(5)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列；和

(6)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。

8.权利要求1或2的抗PCSK9抗体，其中所述抗体包含：

(1)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列；

(2)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列；

(3)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列；

(4)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列；

(5)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列；和

(6)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列。

9.权利要求1或2的抗PCSK9抗体，其中所述抗体包含：

(1)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列；

(2)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列；

(3)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列；

(4)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列；

(5)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列；和

(6)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列。

10.权利要求1或2的抗PCSK9抗体，其中所述抗体包含：

(1)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列；

(2)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列；

(3)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列；

(4)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列；

(5)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列；和

(6)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列。

11.权利要求1或2的抗PCSK9抗体，其中所述抗体包含：

(1)HVR-H1，所述HVR-H1包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列；

(2)HVR-H2，所述HVR-H2包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列；

(3)HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列；

(4)HVR-L1，所述HVR-L1包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列；

(5)HVR-L2，所述HVR-L2包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列；和

(6)HVR-L3，所述HVR-L3包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。

15.权利要求1或2的抗PCSK9抗体，所述抗体包含SEQ ID NO：15的VH序列和SEQ ID NO：19的VL序列。

16.权利要求1或2的抗PCSK9抗体，所述抗体包含SEQ ID NO：27的VH序列和SEQ ID NO：20的VL序列。

17.权利要求1或2的抗PCSK9抗体，所述抗体包含SEQ ID NO：16的VH序列和SEQ ID NO：21的VL序列。

18.权利要求1或2的抗PCSK9抗体，所述抗体包含SEQ ID NO：17的VH序列和SEQ ID NO：22的VL序列。

19.权利要求1或2的抗PCSK9抗体，所述抗体包含SEQ ID NO：27的VH序列和SEQ ID NO：23的VL序列。

20.权利要求1至19中任一项的抗PCSK9抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。

21.权利要求1至19中任一项的抗PCSK9抗体，其中所述抗体是人源化的。

22.权利要求1至19中任一项的抗PCSK9抗体，其中所述抗体是人抗体。

23.权利要求1至19中任一项的抗PCSK9抗体，其中所述抗体是选自Fab、Fab’-SH、Fv、scFv或(Fab’)₂片段的抗体片段。

24.权利要求1至19中任一项的抗PCSK9抗体，其中框架序列的至少一部分是人共有框架序列。

25.分离的核酸，其编码权利要求1至19中任一项的抗PCSK9抗体。

26.包含权利要求25的核酸的载体。

27.权利要求26的载体，其中所述载体是表达载体。

28.包含权利要求26或27的载体的宿主细胞。

29.权利要求28的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核的。

30.权利要求28的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核的。

31.制备抗PCSK9抗体的方法，所述方法包括在适于表达编码权利要求1至19中任一项的抗PCSK9抗体的核酸的条件下培养权利要求28的宿主细胞。

32.权利要求31的方法，所述方法还包括从所述宿主细胞回收所述抗PCSK9抗体。

33.药物组合物，其包含权利要求1至19中任一项的抗PCSK9抗体和药用载体。

34.降低受试者的LDL-胆固醇水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1至19中任一项的抗PCSK9抗体。

35.治疗受试者的胆固醇相关疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1至19中任一项的抗PCSK9抗体。

36.治疗受试者的高胆固醇血症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1至19中任一项的抗PCSK9抗体。

37.权利要求34、35或36的方法，所述方法还包括向所述受试者施用有效量的第二药物，其中所述抗PCSK9抗体是第一药物。

38.权利要求37的方法，其中所述第二药物提高LDLR的水平。

39.权利要求37的方法，其中所述第二药物降低LDL-胆固醇的水平。

40.权利要求37的方法，其中所述第二药物包括抑制素。

41.权利要求40的方法，其中所述抑制素选自由以下各项组成的组：阿托伐他汀，氟伐他汀，洛伐他汀，美伐他汀，匹伐他汀，普伐他汀，罗舒伐他汀，辛伐他汀，及其任意组合。

42.权利要求37的方法，其中所述第二药物提高HDL-胆固醇的水平。

43.抑制受试者中PCSK9与LDLR结合的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1至19中任一项的抗PCSK9抗体。

44.检测样品中PCSK9蛋白的方法，所述方法包括

(a)将所述样品与权利要求1-19中任一项的抗体接触；和

(b)检测所述抗PCSK9抗体和所述PCSK9蛋白之间复合物的形成。

45.结合PCSK9的抗PCSK9抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段结合PCSK9的表位，所述PCSK9的表位包含：

46.权利要求45的抗体，其中所述PCSK9的表位包含E366、D367或H391中的一个或多个。

47.权利要求46的抗体，其中PCSK9的表位包含E366、D367和H391。