TW201546284A - 動物模式及治療分子 - Google Patents

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Allan Bradley
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Abstract

本發明揭示了用於產生嵌合入類-非人類抗體與嵌合抗體鏈的方法，依此製造的抗體與抗體鏈及其包括完全人源化抗體的衍生物；包含該抗體、抗體鏈與衍生物的組成物，還有適用於該方法的細胞、非人類哺乳動物與載體。

Description

動物模式及治療分子
本發明尤其關於經改造以含有外源性DNA，例如人類免疫球蛋白基因DNA的非人類動物與細胞；彼等用於醫藥及疾病研究的用途；用於製造非人類動物與細胞的方法；以及藉由此類動物製造的抗體與抗體鏈及其衍生物。
背景
就小鼠而言的所有核苷酸座標為該等對應於就小鼠C57BL/6J株而言的NCBI m37者，譬如April 2007 ENSEMBL Release 55.37h，譬如NCBI37 July 2007(NCBI build 37)(譬如UCSC version mm9，參閱全球資訊網(www)genome.ucsc.edu與全球資訊網(www)genome.ucsc.edu/FAQ/FAQreleases.html)，除非另有指明。人類核苷酸座標為該等對應於GRCh37(譬如UCSC version hg 19，全球資訊網(www)genome.ucsc.edu/FAQ/FAQreleases.html)，Feb 2009 ENSEMBL Release 55.37者，或為該等對應於NCBI36，Ensemble release 54者，除非另有指明。大鼠核苷酸為該等對應於RGSC 3.4 Dec 2004 ENSEMBL release 55.34w者，或 Baylor College of Medicine HGSC v3.4 Nov 2004(譬如UCSC rn4，參閱全球資訊網(www)genome.ucsc.edu and全球資訊網(www)genome.ucsc.edu/FAQ/FAQreleases.html)，除非另有指明。
本案參照小鼠的實作僅為舉例，參照小鼠係欲包括參照所有非人類哺乳動物，除非揭示內容顯而易見並非如此，因小鼠係較佳作為非人類哺乳動物。
US2012/0204278與PCT/GB2013/050682的揭示內容係以參照方式併入本案。US2012/0204278與PCT/GB2013/050682揭示的所有定義係明白地且明確地於本案揭示。
本案提到的人類基因區段涵蓋生殖系人類基因區段序列或該等基因區段可包括相對生殖系人類基因區段序列的一或多個突變的重組形式兩者，舉例來說，揭示於IMGT資料庫與1000 Genomes資料庫，還有WO2013041844的等位基因(此類等位基因及其序列係明確地以參照方式併入本案)。
本案提到的所有基因區段可任擇地參照公共序列資料庫，例如IMGT或1000 Genomes資料庫，使用標準序列分析和人類生殖系基因區段序列比對來辨識。
發明概要
在一態樣中，本發明係關於一種非人類脊椎動物(譬如小鼠或大鼠)或細胞，其基因組係包含位於重鏈基因座 恒定區上游的人類VH、D與JH基因區段及/或位於輕鏈基因座恒定區上游的人類VL與JL基因區段，其中該基因區段係操作性地接附至其恒定區，俾使該脊椎動物或細胞能夠表現分別包含人類VH與VL域的免疫球蛋白重鏈及/或輕鏈，其中該重鏈基因座係包含人類01等位基因VH基因區段，該人類01等位基因VH基因區段能夠和人類D與JH基因區段重組，以製造VH域，其中該輕鏈基因座係包含人類01等位基因VL基因區段，該人類01等位基因VL基因區段能夠和人類JL基因區段重組，以製造VL域，或其中該細胞可發展成表現該重鏈及/或輕鏈的脊椎動物。
下文實施例將進一步解釋，發明人已出乎意料地展示人類01等位基因可用於製造抗原-特異性結合部位，其中該等係於非人類脊椎動物內適當地重組、展現接合與體突變並可適當地表現與單離。
在另一態樣中，本發明係關於一種非人類脊椎動物或細胞(譬如小鼠細胞或大鼠細胞)，其基因組係包含(a)位於重鏈基因座恒定區上游的人類JH2*01及/或人類JH6*01或JH6*02及/或JH3*02、一或多個人類VH基因區段與一或多個人類D基因區段及/或(b)位於輕鏈基因座恒定區上游的人類Jκ2*01及/或人類Jκ4*01與一或多個人類Vκ基因區段，其中在各基因座內的該基因區段係操作性地接附至其恒定區，俾使該脊椎動物或細胞能夠製造抗體重鏈與抗體輕鏈，或其中該細胞可發展成表現抗體重鏈與抗體輕鏈的脊椎動物，其中該重鏈係藉由人類JH2*01及/或JH6*01 或JH6*02區段及/或JH3*02和D區段及VH區段之重組所製造且該輕鏈係藉由人類Jκ2*01及/或Jκ4*01區段和Vκ區段之重組所製造。在一例中，該基因組係包含人類JH2*01。在一例中，該基因組係包含人類JH2*01與JH*01。在一例中，該基因組係包含人類JH2*01、JH6*01與JH3*02。在一例中，該基因組係包含人類JH6*01。在一例中，該基因組係包含人類JH6*01與JH3*02。在一例中，該基因組係包含人類JH3*02。在一例中，該重鏈係藉由人類JH2*01區段和D區段與VH區段之重組所製造。在一例中，該重鏈係藉由人類JH6*01區段和D區段與VH區段之重組所製造。在一例中，該重鏈係藉由人類JH6*02區段和D區段與VH區段之重組所製造。在一例中，該重鏈係藉由人類JH3*02區段和D區段與VH區段之重組所製造。
在另一態樣中，本發明係關於一種非人類脊椎動物，其基因組係包含(i)位於重鏈基因座恒定區上游的人類JH1*01、JH2*01、JH3*02、JH4*02、JH5*02及/或JH6*01或JH6*02、一或多個人類VH基因區段與一或多個人類D基因區段及/或(ii)位於輕鏈基因座恒定區上游的人類Jκ1*01、Jκ2*01、Jκ3*01、Jκ4*01及/或Jκ5*01與一或多個人類Vκ基因區段，其中在各基因座內的該基因區段係操作性地接附至其恒定區，俾使該脊椎動物或細胞能夠製造抗體重鏈與抗體輕鏈，或其中該細胞可發展成表現抗體重鏈與抗體輕鏈的脊椎動物，其中該重鏈係藉由人類JH1*01、JH2*01、JH3*02、JH4*02、JH5*02及/或JH6*01或JH6*02區段和D區 段與VH區段之重組所製造且該輕鏈係藉由人類Jκ1*01、Jκ2*01、Jκ3*01、Jκ4*01及/或Jκ5*01區段和Vκ區段之重組所製造。在一例中，該基因組係包含人類JH1*01、JH2*01、JH3*02、JH4*02、JH5*02與JH*01。在一例中，該基因組係包含人類JH1*01、JH2*01、JH3*02、JH4*02、JH5*02與JH*02。在一例中，該重鏈係藉由人類JH2*01區段和D區段與VH區段之重組所製造。在一例中，該重鏈係藉由人類JH6*01區段和D區段與VH區段之重組所製造。在一例中，該重鏈係藉由人類JH6*02區段和D區段與VH區段之重組所製造。在一例中，該重鏈係藉由人類JH3*02區段和D區段與VH區段之重組所製造。在該等重鏈例子以外或另擇地，在一例中，該輕鏈係藉由人類Jκ2*01區段和Vκ區段之重組所製造。
在一具體例中，該非人類脊椎動物更包含表7的VH基因區段之一或多者及/或D基因區段之一或多者及/或表12的一或多個Vκ基因區段。在再一具體例中，該非人類脊椎動物更包含表3的VH基因區段與D基因區段及/或表10或11的Vκ基因區段。
本案所述區段已由發明人辨識為在多樣人類種族群體之間廣泛地並高度地使用，於是廣泛地耐受一般的人類抗體生成與功效。
在再一具體例中，本發明係關於一種非人類脊椎動物或脊椎動物細胞(譬如小鼠細胞或大鼠細胞)，其基因組係包含位於重鏈基因座恒定區上游的一或多個人類VH基 因區段、一或多個人類JH基因區段與一或多個人類D基因區段以及位於輕鏈基因座恒定區上游的一或多個人類JL基因區段與一或多個人類VL基因區段，其中在各基因座內的該基因區段係操作性地接附至其恒定區，俾使該脊椎動物或細胞能夠製造抗體重鏈與抗體輕鏈，或其中該細胞可發展成表現抗體重鏈與抗體輕鏈的脊椎動物，其中該重鏈基因座的一或多個人類VH基因區段係包含一個、多個或所有人類VH基因區段或由一個、多個或所有人類VH基因區段構成，該基因區段係選自由下列構成之群組：VH3-23*04、VH7-4-1*01、VH4-4*02、VH1-3*01、VH3-13*01、VH3-7*01、VH3-20*d01與VH3-9*01。
在再一具體例中，本發明係關於一種非人類脊椎動物或脊椎動物細胞(譬如小鼠細胞或大鼠細胞)，其基因組係包含位於重鏈基因座恒定區上游的一或多個人類VH基因區段、一或多個人類JH基因區段與一或多個人類D基因區段以及位於輕鏈基因座恒定區上游的一或多個人類Jκ基因區段與一或多個人類Vκ基因區段，其中在各基因座內的該基因區段係操作性地接附至其恒定區，俾使該脊椎動物或細胞能夠製造抗體重鏈與抗體輕鏈，或其中該細胞可發展成表現抗體重鏈與抗體輕鏈的脊椎動物，其中該一或多個人類Vκ基因區段係包含一個、多個或所有人類Vκ基因區段或由一個、多個或所有人類Vκ基因區段構成，該基因區段係選自由下列構成之群組：Vκ4-1*01、Vκ2-28*01、Vκ1D-13*d01、Vκ1-12*01、Vκ1D-12*02、Vκ3-20*01、 Vκ1-17*01、Vκ1D-39*01、Vκ3-11*01、Vκ1D-16*01與Vκ1-9*d01。
在另一具體例中，本發明係關於一種非人類脊椎動物或脊椎動物細胞(譬如小鼠細胞或大鼠細胞)，其基因組係包含位於重鏈基因座恒定區上游的人類JH2*01及/或人類JH6*02、一或多個人類VH基因區段與一或多個人類D基因區段及/或位於輕鏈基因座恒定區上游的人類Jκ2*01及/或人類Jκ4*01與一或多個人類Vκ基因區段，其中在各基因座內的該基因區段係操作性地接附至其恒定區，俾使該細胞或脊椎動物能夠製造抗體重鏈與抗體輕鏈，或其中該細胞可發展成表現抗體重鏈與抗體輕鏈的脊椎動物，其中該重鏈係藉由人類JH2*01及/或JH6*02區段和D區段與VH區段之重組所製造及/或該輕鏈係藉由人類Jκ2*01及/或Jκ4*01區段和Vκ區段之重組所製造； 其中該重鏈基因座的一或多個人類VH基因區段係包含一個、多個或所有人類VH基因區段或由一個、多個或所有人類VH基因區段構成，該基因區段係選自由下列構成之群組：VH3-23*04、VH7-4-1*01、VH4-4*02、VH1-3*01、VH3-13*01、VH3-7*01與VH3-20*d01及/或 其中該一或多個人類Vκ基因區段係包含一個、多個或所有人類VH基因區段或由一個、多個或所有人類VH基因區段構成，該基因區段係選自由下列構成之群組：Vκ4-1*01、Vκ2-28*01、Vκ1D-13*d01、Vκ1-12*01、Vκ1D-12*02、Vκ3-20*01、Vκ1-17*01、Vκ1D-39*01、Vκ3-11*01、 Vκ1D-16*01與Vκ1-9*d01。
任擇地，本案所提到的人類基因區段為該基因區段的重組形式。
下文實施例將進一步解釋，發明人已出乎意料地展示根據本發明製造的重鏈及/或輕鏈可用於製造抗原-特異性結合部位，其中該等係於非人類脊椎動物內適當地重組、展現接合與體突變並可適當地表現與單離。
在另一態樣中，本發明係關於一種非人類脊椎動物(譬如小鼠或大鼠)或細胞，其基因組係包含藉由將人類Ig基因區段靶向插入一或多個內源性Ig基因座所製造的Ig基因區段匯集庫，該基因組包含位於恒定區上游的人類Vλ與Jλ基因區段，其中該人類Vλ與Jλ基因區段為選自表18的一個、多個或所有區段並已藉由插入脊椎動物或細胞的內源性輕鏈基因座提供，其中該脊椎動物係包含含有λ可變區的免疫球蛋白輕鏈(λ輕鏈)或該細胞可發展成表現該免疫球蛋白輕鏈的脊椎動物，其中該λ輕鏈係包含免疫球蛋白輕鏈，其包含表18的一個、多個或所有人類Vλ與Jλ基因區段之λ可變區重組體。
在基因轉殖非人類脊椎動物&細胞中的人類λ可變區的內源性輕鏈失活作用&高表現
下文實施例將進一步解釋，發明人已出乎意料觀察到包含人類λ可變區(至少70或80%人類Vλ)的輕鏈的極高表現位準，該輕鏈係來自藉由將人類λ基因區段靶向插入內源性非人類脊椎動物輕鏈基因座所製造的基因轉殖輕鏈基 因座。這在即使脊椎動物基因組之內存在內源性非人類脊椎動物V與J基因區段亦是可行的。再者，出乎意料的高表現位準係在人類λ基因區段的插入是位於內源性κ或λ基因座時達成。此類藉由靶向插入的高位準迄今為止尚未在本領域發表過。
發明人亦出乎意料地觀察到內源性κ鏈的表現可藉由將人類λ基因序列靶向插入內源性κ基因座來完全失活，實施例中將進一步解釋。
將人類基因區段靶向插入內源性Ig基因座是合意的，因為其啟用所插入人類Ig序列關於內源性Ig恒定區與內源性控制區的操作位置，例如增强子與其他基因座控制區，舉例來說。於是，靶向插入容許吾等利用在Ig基因區段重組、等位基因排除、親和力熟成、類別轉換、Ig表現位準及B-細胞隔室(compartment)所欲發展之一或多者當中極為重要的內源性控制。是以，靶向插入係優於本領域製造基因轉殖Ig基因座與表現的早期嘗試，其試圖倚賴將載體，例如帶著人類Ig基因區段的YACs引進非人類脊椎動物細胞。YACs係隨意嵌入該脊椎動物細胞基因組，使得很難達成靶向插入所提供的控制及納入就利用內源性控制機制而言的伴隨好處。此外，隨意插入時常導致所插入的人類Ig基因區段受到異源性控制因子及/或諸如甲基化與染色質確認的表觀染色體修飾的控制，該等任一者可能有害於合宜的Ig基因區段重組、等位基因排除、親和力熟成、類別轉換、Ig表現位準及B-細胞隔室的所欲發展。隨意插入通 常導致所引進轉殖基因的2或多個複製物，其可能導致染色體的不穩定且因此造成一除了對合宜Ig基因區段重組、等位基因排除、親和力熟成、類別轉換、Ig表現位準及B-細胞隔室所欲發展的有害效應以外一該動物的差劣繁殖性能。於是，先前技藝嘗試使用隨意插入已傾向造成差劣的B-細胞發展、相對小的B-細胞隔室與不佳的Ig表現以及隨之很難單離帶有所欲特性的抗體。 本發明因此提供下列態樣：-
人類λ可變區的表現
本案揭示之發明的每一具體例可藉由揭示於表18的特異性λ等位基因、或其任何組合來實行。在本案所提到的基因區段並無參照特定等位基因時，該等可任擇地為揭示於表1至18中任一者的特定等位基因。
1.一種非人類脊椎動物(譬如小鼠或大鼠)，其基因組係包含藉由將人類Ig基因區段靶向插入一或多個內源性Ig基因座所製造的Ig基因區段匯集庫，該基因組包含位於恒定區上游的人類Vλ與Jλ基因區段，其中該人類Vλ與Jλ基因區段已藉由插入脊椎動物的內源性輕鏈基因座提供，其中該脊椎動物表現包含λ可變區的免疫球蛋白輕鏈(λ輕鏈)，其中該λ輕鏈係包含免疫球蛋白輕鏈，其包含衍生自人類Vλ與Jλ基因區段之重組的λ可變區。
一種非人類脊椎動物(譬如小鼠或大鼠)，其基因組係包含藉由將人類Ig基因區段靶向插入一或多個內源性Ig基因座所製造的Ig基因區段匯集庫，該基因組包含位於恒 定區上游的人類Vλ與Jλ基因區段，其中該人類Vλ與Jλ基因區段已藉由插入脊椎動物的內源性輕鏈基因座提供，其中該脊椎動物表現包含λ可變區的免疫球蛋白輕鏈(λ輕鏈)，且其中該脊椎動物所表現的至少70或80%λ輕鏈可變區係衍生自人類Vλ與Jλ基因區段的重組。此係於下文實施例中證實。
舉例來說，該脊椎動物所表現的λ輕鏈的至少70、75、80、84、85、90、95、96、97、98或99%、或100%可變區係衍生自人類Vλ與Jλ基因區段的重組。此係於下文實施例中證實。
在具體例中，提供有一種非人類脊椎動物ES細胞(譬如小鼠ES細胞或大鼠ES細胞)，其基因組係包含藉由將人類Ig基因區段靶向插入一或多個內源性Ig基因座所製造的Ig基因區段匯集庫，該基因組包含位於恒定區上游的人類Vλ與Jλ基因區段，其中該人類Vλ與Jλ基因區段已藉由插入脊椎動物細胞的內源性輕鏈基因座提供，其中該細胞可發展成表現包含λ可變區之免疫球蛋白輕鏈(λ輕鏈)的脊椎動物，其中該λ輕鏈係包含免疫球蛋白輕鏈，其包含衍生自人類Vλ與Jλ基因區段之重組的λ可變區。
一種非人類脊椎動物ES細胞(譬如小鼠ES細胞或大鼠ES細胞)，其基因組係包含藉由將人類Ig基因區段靶向插入一或多個內源性Ig基因座所製造的Ig基因區段匯集庫，該基因組包含位於恒定區上游的人類Vλ與Jλ基因區段，其中該人類Vλ與Jλ基因區段已藉由插入脊椎動物細胞的內 源性輕鏈基因座提供，其中該細胞可發展成表現包含λ可變區之免疫球蛋白輕鏈(λ輕鏈)的脊椎動物，且其中該脊椎動物所表現的至少70或80%(舉例來說，至少70、75、80、84、85、90、95、96、97、98或99%、或100%)λ輕鏈可變區係衍生自人類Vλ與Jλ基因區段的重組。
在一例中，即使在該基因組包含內源性非人類脊椎動物λ可變區基因區段(譬如內源性Vλ及/或Jλ基因區段，任擇地Vλ與Jλ基因區段的完整內源性匯集庫)時，亦達成包含衍生自人類Vλ與Jλ基因區段重組之λ可變區的免疫球蛋白輕鏈的出乎意料表現。於是，在一例中，該基因組係包含內源性非人類脊椎動物λ可變區基因區段(譬如內源性Vλ及/或Jλ基因區段，任擇地Vλ與Jλ基因區段的完整內源性匯集庫)。在另一例中，此類內源性基因區段不存在於該基因組內。
2.如態樣1之脊椎動物或細胞，任擇地，其中該人類Vλ與Jλ插入係包含至少功能性人類V與J基因區段(任擇地，亦有人類Cλ)，該等基因區段包含在自Vλ2-18至Cλ7之人類λ鏈Ig基因座內。在一例中，該插入亦包含λ跨基因區段序列。該等為人類序列或彼等可為該非人類脊椎動物物種的序列(譬如當脊椎動物為小鼠時，可使用對應小鼠λ基因區段之間的序列)。
在一具體例中，該V與J基因區段為表18的等位基因。在再一具體例中，該Cλ基因區段為表18中揭示的等位基因。
3.如態樣1或2之脊椎動物或細胞，任擇地，其中該基因組的人類Vλ與Jλ基因區段插入為純合且該脊椎動物的內源性κ鏈表現係實質上或完全地失活。在一例中，少於10、5、4、3、2、1或0.5%輕鏈係由內源性κ鏈(即，κ鏈，其可變區係衍生自非人類脊椎動物V與J基因區段的重組)提供。
4.如任何前述態樣之脊椎動物或細胞，任擇地，其中該內源性基因座為內源性κ基因座。
5.如任何前述態樣之脊椎動物或細胞，任擇地，其中該內源性基因座為內源性λ基因座。
60%的所有輕鏈具有人類λV區
6.一種非人類脊椎動物(譬如小鼠或大鼠)，其基因組係包含藉由將人類Ig基因區段靶向插入一或多個內源性Ig基因座所製造的Ig基因區段匯集庫，該基因組包含(i)位於恒定區上游的人類Vλ與Jλ基因區段，其中該人類Vλ與Jλ基因區段已藉由插入脊椎動物的內源性輕鏈基因座提供及(ii)位於恒定區上游的κV基因區段，其中該脊椎動物表現包含人類λ可變區(人類λ輕鏈)的免疫球蛋白輕鏈，且其中該脊椎動物所表現的至少60%輕鏈係由該人類λ輕鏈提供。此係於下文實施例中證實。
舉例來說，該脊椎動物所表現的至少65、70、80、84、85、90、95、96、97、98或99%，或100%輕鏈係由該人類λ輕鏈提供。舉例來說，該脊椎動物所表現的至少84%輕鏈係由該人類λ輕鏈提供。舉例來說，該脊椎動物所表現 的至少95%輕鏈係由該人類λ輕鏈提供。此係於下文實施例中證實。
在一具體例中，提供有一種非人類脊椎動物ES細胞(譬如小鼠ES細胞或大鼠ES細胞)，其基因組係包含藉由將人類Ig基因區段靶向插入一或多個內源性Ig基因座所製造的Ig基因區段匯集庫，該基因組包含(i)位於恒定區上游的人類Vλ與Jλ基因區段，其中該人類Vλ與Jλ基因區段已藉由插入脊椎動物的內源性輕鏈基因座提供及(ii)位於恒定區上游的κV基因區段，其中該細胞可發展成表現包含人類λ可變區(人類λ輕鏈)之免疫球蛋白輕鏈的脊椎動物，且其中該脊椎動物所表現的至少60%輕鏈係由該人類λ輕鏈提供。
7.一種非人類脊椎動物或非人類脊椎動物細胞(譬如小鼠、大鼠、小鼠細胞或大鼠細胞)，其基因組係包含藉由將人類Ig基因區段靶向插入一或多個內源性Ig基因座所製造的Ig基因區段匯集庫，該基因組包含將人類免疫球蛋白Vλ與Jλ基因區段靶向插入位於內源性VL與JL基因區段下游的內源性非人類脊椎動物輕κ或λ鏈基因座，以表現包含人類λ可變區的輕鏈；其中該人類Vλ與Jλ插入係包含至少功能性人類V與J(以及任擇地，亦有功能性人類Cλ)基因區段，該等基因區段係包含在自Vλ2-18至Cλ7之人類λ鏈Ig基因座內。
如實施例中所證實的，該基因座的內源性輕鏈表現被失活，並且人類λ可變區表現大幅超越內源性λ可變區 表現。
“下游(downstream)”係意指在相同染色體上的基因區段的3’端。在一例中，該內源性V與J基因區段係相對於人類基因區段倒置，以及任擇地自內源性輕鏈基因座移出。在一例中，該人類基因區段係位於該κ或λ基因座的所有內源性V與J區段下游。保存內源性V-J序列與基因內序列的可能性是合意的，因為保存內建控制區及/或基因可能是脊椎動物所欲的。
任擇地，該插入亦包含λ跨基因區段序列。該等為人類序列或彼等可為該非人類脊椎動物物種的序列(譬如當脊椎動物為小鼠時，可使用對應小鼠λ基因區段之間的序列)。
VJCλ之λ鏈的表現
8.一種非人類脊椎動物或非人類脊椎動物細胞(譬如小鼠、大鼠、小鼠細胞或大鼠細胞)，其基因組係包含藉由將人類Ig基因區段靶向插入一或多個內源性Ig基因座所製造的Ig基因區段匯集庫，該基因組包含將人類免疫球蛋白Vλ、Jλ與Cλ基因靶向插入位於內源性非人類脊椎動物κ或λ恒定區上游的內源性非人類脊椎動物κ或λ輕鏈基因座，以表現人類VJC輕鏈；任擇地，其中該人類VJC插入係包含至少功能性人類V、J與C基因區段，該等基因區段係包含在自Vλ3-1至Cλ7之人類λ鏈Ig基因座內(譬如包含在自2-18至Cλ7之人類λ鏈Ig基因座內)。
在一具體例中，該V與J基因區段為表18的等位基 因。在再一具體例中，該Cλ基因區段為表18中揭示的等位基因。
如實施例中所證實的，人類λ可變區表現大幅超越內源性κ可變區表現。從內源性基因座表現內源性κ鏈可被失活。
任擇地，該插入亦包含λ跨基因區段序列。該等為人類序列或彼等可為該非人類脊椎動物物種的序列(譬如當脊椎動物為小鼠時，可使用對應小鼠λ基因區段之間的序列)。
9.一種非人類脊椎動物或非人類脊椎動物細胞(譬如小鼠、大鼠、小鼠細胞或大鼠細胞)，其基因組係包含藉由將人類Ig基因區段靶向插入一或多個內源性Ig基因座所製造的Ig基因區段匯集庫，該基因組包含將包含在自Vλ3-1至Cλ7(任擇地自Vλ2-18至Cλ7，更任擇地表18的特定等位基因)之人類λ鏈Ig基因座內的至少功能性人類Vλ與Jλ(以及任擇地人類功能性Cλ)基因區段靶向插入位於小鼠Vκ與Jκ基因區段下游的內源性非人類脊椎動物κ輕鏈基因座，以表現包含人類λ可變區的輕鏈，藉此在該插入的存在下，衍生自該小鼠Vκ與Jκ基因區段的內源性κ輕鏈表現係實質上或完全地失活。
在一例中，少於10、5、4、3、2、1或0.5%輕鏈係由內源性κ鏈(即，κ鏈，其可變區係衍生自非人類脊椎動物Vκ與Jκ基因區段)。
任擇地，該插入亦包含λ跨基因區段序列。該等 為人類序列或彼等可為該非人類脊椎動物物種的序列(譬如當脊椎動物為小鼠時，可使用對應小鼠λ基因區段之間的序列)。
10.一種非人類脊椎動物或非人類脊椎動物細胞(譬如小鼠、大鼠、小鼠細胞或大鼠細胞)，其中，在該基因組中，小鼠IgK-VJ已自小鼠Eκ增强子移離，藉此失活內源性IgK-VJ區。此係於實施例中證實。
11.如態樣10之脊椎動物或細胞，任擇地，其中該IgK-VJ已自小鼠Eκ增强子移離，其係藉由在小鼠IgK-VJ與Eκ增强子之間插入人類VL與JL基因區段；任擇地，其中該插入為任何前述態樣1-9所列示的插入或人類Vκ與Jκ基因區段的插入。
12.如任何前述態樣之脊椎動物或細胞，任擇地，其中該人類Vλ與Jλ基因區段已插入在100、75、50、40、30、20、15、10或5kb內源性非人類脊椎動物輕鏈增强子之內。在一例中，當該插入係插進內源性λ基因座內時，該增强子為λ增强子(譬如小鼠Eλ2-4、Eλ4-10或Eλ3-1)。在一例中，當該插入係插進內源性κ基因座內時，該增强子為κ增强子(譬如iEκ或3’Eκ)。
13.如任何前述態樣之脊椎動物或細胞，任擇地，其中在該基因組內提供人類Vλ與Jλ基因區段係藉由將至少10個人類Vλ基因區段和人類Jλ基因區段靶向插入該輕鏈基因座的內源性非人類脊椎動物輕鏈恒定區上游。舉例來說，該人類基因區段係藉由插入下列提供：自Vλ2-18至Vλ3-1 之至少一部分的人類Ig λ鏈基因座；或插有Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6與Jλ7的自Vλ2-18至Vλ3-1之至少一部分的人類Ig λ鏈基因座；或自Vλ2-18至Cλ7之至少一部分的人類Ig λ鏈基因座(任擇地，排除Jλ4Cλ4及/或Jλ5Cλ5)。
任擇地，至少2、3、4或5個人類Jλ被插入。在一具體例中，所插入的Jλs彼此不同。舉例來說，人類Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6與Jλ7，任擇地作為一部分的個別人類JλCλ簇被插入。
任擇地，人類輕鏈增强子，譬如Eλ被插入。舉例來說，插入人類Eλ與人類Jλ區段與內源性恒定區之間；或人類Cλ基因區段(當該等被插入時)與內源性恒定區之間。
14.如任何前述態樣之脊椎動物或細胞，任擇地，其中該λ輕鏈提供衍生自人類Vλ基因區段Vλ3-1以及任擇地Vλ2-18、Vλ3-16、V2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8與Vλ4-3之一或多者的人類λ可變區匯集庫，該等已藉由靶向插入該輕鏈基因座提供於該基因組內。
此係有益的，因為Vλ3-1是人類高度使用的λ基因區段(圖59；Ignatovich et al 1997)且因而所欲的是本發明的細胞與脊椎動物提供了包括以此基因區段為基礎的λ可變區以供針對抗原篩選，尤其用於發展人類使用的抗體治療學。
15.如任何前述態樣之脊椎動物或細胞，任擇地，其中該λ輕鏈提供衍生自人類Vλ基因區段Vλ2-14及Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3 與Vλ3-1之一或多者的人類λ可變區匯集庫，該等已藉由靶向插入該輕鏈基因座提供於該基因組內。
此係有益的，因為Vλ2-14是人類高度使用的λ基因區段且因而所欲的是本發明的細胞與脊椎動物提供了包括以此基因區段為基礎的λ可變區以供針對抗原篩選，尤其用於發展人類使用的抗體治療學。
如任何前述態樣之脊椎動物或細胞，任擇地，其中該λ輕鏈提供衍生自人類Vλ基因區段Vλ2-8及Vλ2-18、Vλ3-16、V2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3與Vλ3-1之一或多者的人類λ可變區匯集庫，該等已藉由靶向插入該輕鏈基因座提供於該基因組內。
此係有益的，因為Vλ2-8是人類高度使用的λ基因區段且因而所欲的是本發明的細胞與脊椎動物提供了包括以此基因區段為基礎的λ可變區以供針對抗原篩選，尤其用於發展人類使用的抗體治療學。
如任何前述態樣之脊椎動物或細胞，任擇地，其中該λ輕鏈提供衍生自人類Vλ基因區段Vλ3-10及Vλ2-18、Vλ3-16、V2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ2-14、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3與Vλ3-1之一或多者的人類λ可變區匯集庫，該等已藉由靶向插入該輕鏈基因座提供於該基因組內。
此係有益的，因為Vλ3-10是人類高度使用的λ基因區段且因而所欲的是本發明的細胞與脊椎動物提供了包括以此基因區段為基礎的λ可變區以供針對抗原篩選，尤其用於發展人類使用的抗體治療學。
16.如任何前述態樣之脊椎動物或細胞，任擇地，其中該人類Vλ基因區段係包含功能性Vλ，其包含在自Vλ2-18至Vλ3-1之人類λ鏈Ig基因座內。
舉例來說，該人類Vλ基因區段係包含至少人類V基因區段Vλ3-1或至少區段Vλ2-18、Vλ3-16、V2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3與Vλ3-1。
17.如任何前述態樣之脊椎動物，任擇地，其中該脊椎動物係表現較κ鏈更多的λ鏈。λ鏈係包含衍生自Vλ與Jλ基因區段重組的可變區-舉例來說，連同λ恒定區表現。K鏈係包含衍生自Vκ與Jκ基因區段重組的可變區-舉例來說，連同κ恒定區表現。
18.如任何前述態樣之脊椎動物，任擇地，其中該脊椎動物不表現內源性κ鏈。舉例來說，內源性κ鏈表現可藉由任何本案所述方式失活，例如藉由使所有或一部分內源性κVJ區倒置或藉由將標記(譬如尼奧基因(neo))或其他干擾序列插入內源性κ基因座(根據本發明，不包含人類λ基因區段的基因座)。
19.如任何前述態樣之脊椎動物，任擇地，其中該脊椎動物的κ鏈表現係實質上或完全地失活。在一例中，少於10、5、4、3、2、1或0.5%輕鏈係由κ鏈提供。
20.如任何前述態樣之脊椎動物或細胞，任擇地，其中人類Eλ增强子係插入該內源性非人類脊椎動物基因座。舉例來說，在生殖系配置中有插入人類5’ MAR與人類Eλ(以及任擇地，人類3’ MAR)。舉例來說，有插入對應於位 於人類Jλ7-Cλ7緊挨3’的人類λ內含區的序列，並包括，至少人類Eλ(以及任擇地亦有人類3’ MAR)-任擇地包括人類Eλ的至少30kb的內含區3’。
21.如任何前述態樣之脊椎動物或細胞，其中除了其他人類基因區段以外，任擇地插入至少人類JC基因區段Jλ1-Cλ1、Jλ2-Cλ2、Jλ3-Cλ3、Jλ6-Cλ6與Jλ7-Cλ7。
22.如任何前述態樣之脊椎動物或細胞，其中任擇地插入的人類基因區段係位於生殖系配置；任擇地連同人類跨基因區段序列或對應內源性非人類脊椎動物跨基因區段序列。
23.如任何前述態樣之脊椎動物或細胞，其中，任擇地，內源性非人類脊椎動物輕鏈增强子係保留於內源性基因座內；任擇地於生殖系配置內。舉例來說，當該內源性基因座為κ基因座時，內源性κ增强子被保留。任擇地在相對於內源性輕鏈恒定區的生殖系配置內，此可為iEk及/或3’Ek。此可用於幫助控制非人類脊椎動物或細胞中的輕鏈表現。
24.如任何前述態樣之脊椎動物或細胞，任擇地，其中該基因組於內源性基因座的人類λ插入為雜合。舉例來說，於內源性κ(譬如小鼠或大鼠κ)基因座的人類VJ或VJC插入為雜合。此有助於並簡化脊椎動物的育種，由於其他內源性基因座(譬如其他κ基因座)可用於提供不同的基因轉殖Ig基因座，例如包含位於內源性小鼠κ恒定區上游或人類κ恒定區上游的人類κV與J基因區段的基因轉殖κ基因座。在 此情況中，κ增强子(iEk及/或3’Ek)可保留於κ基因座內，以有助於使用內源性控制機制的脊椎動物表現。
在另一具體例中，提供有如任何前述態樣之非人類脊椎動物或細胞，其中(a)該內源性基因座為內源性λ基因座(譬如在小鼠)，該基因組於該λ基因座的插入為雜合，於是該λ基因座的一個等位基因包含上述人類Vλ與Jλ基因區段插入(任擇地連同人類Cλ基因區段插入；任擇地連同人類Eλ插入)；(b)另一個內源性λ等位基因係包含位於恒定區(譬如該非人類脊椎動物物種的κ恒定區；人類κ恒定區；該內源性λ恒定區；或人類λ恒定區)上游的複數個人類Vκ基因區段與一或多個人類Jκ基因區段；任擇地連同一或多個κ增强子(譬如該非人類脊椎動物物種的譬如iEk及/或3’Ek)；以及(c)內源性λ與κ鏈表現已被失活。
於是，沒有表現包含衍生自內源性V與J區重組的可變區的輕鏈，但有從位於該內源性λ基因座的等位基因表現人類λ與人類κ輕鏈。此係有益的，由於該設計藉由避免需要提供位於內源性λ與κ基因座兩者的基因轉殖基因座而大大有助於脊椎動物的建構與育種。該內源性κ基因座(且於是內源性κ鏈表現)可藉由倒置、刪除κ基因區段(譬如內源性V及/或J及/或C κ)及/或藉由將中斷序列，例如標記(譬如尼奧基因)插入內源性κ基因座來失活。
該人類κ區段插入內源性λ可，舉例來說，藉由插入對應包含-在生殖系配置內-所有功能性人類Vκ與Jκ的 一部分人類κ基因座序列(即，任擇地排除假基因與ORFs；見IMGT資料庫)來進行；以及任擇地亦有人類iEκ。
25.如態樣24之脊椎動物或細胞，任擇地，其中該基因組係包含該人類λ基因區段插入一個內源性非人類脊椎動物κ基因座等位基因，且其中另一個內源性κ基因座等位基因係包含人類κ免疫球蛋白V與J基因插入內源性非人類脊椎動物κ恒定區上游；任擇地，其中內源性κ輕鏈增强子係保留於一或二個κ基因座內；任擇地於生殖系配置內。
如態樣24之脊椎動物或細胞，任擇地，其中該基因組係包含該人類λ基因區段插入一個內源性非人類脊椎動物λ基因座等位基因，且其中另一個內源性λ基因座等位基因係包含人類κ免疫球蛋白V與J基因插入內源性非人類脊椎動物κ恒定區上游；任擇地，其中內源性λ輕鏈增强子係保留於一或二個λ基因座內；任擇地於生殖系配置內。
26.如請求項24之脊椎動物或細胞，任擇地，其中該基因組係包含該人類λ基因區段插入一個內源性非人類脊椎動物λ基因座等位基因，且其中另一個內源性λ基因座等位基因係包含人類κ免疫球蛋白V與J基因插入內源性非人類脊椎動物κ恒定區上游；任擇地，其中內源性λ輕鏈增强子係保留於一或二個κ基因座內；任擇地於生殖系配置內。
27.如態樣1至23中任一態樣之脊椎動物或細胞，任擇地，其中該基因組於內源性非人類脊椎動物基因座的 人類λ插入為純合。
28.如態樣1至23中任一態樣之脊椎動物或細胞，任擇地，其中該基因組於內源性非人類脊椎動物κ與λ基因座的人類λ基因區段插入為純合。
29.如態樣1至23與28中任一態樣之脊椎動物或細胞，任擇地，其中該基因組於內源性非人類脊椎動物λ基因座的人類λ基因區段插入為純合，一個內源性κ基因座等位基因係包含人類λ基因區段插入且另一個內源性κ基因座等位基因係包含在Cκ區上游插入複數個人類Vκ與Jκ基因區段，以表現包含人類κ可變區的κ輕鏈。人類κ可變區為該等衍生自人類Vκ與Jκ重組者。
30.如態樣27或28之脊椎動物或細胞，任擇地，其中於κ與λ基因座的人類λ基因區段插入為相同人類λ基因區段匯集庫的插入。
31.如態樣27或28之脊椎動物或細胞，任擇地，其中插入κ基因座的人類λ基因區段係不同於插入λ基因座的人類λ基因區段。此有益於擴展用於後續針對抗原篩選的潛力可變區匯集庫。
32.一種非人類脊椎動物或非人類脊椎動物細胞(譬如小鼠、大鼠、小鼠細胞或大鼠細胞)，其基因組係包含藉由將人類Ig基因區段靶向插入一或多個內源性Ig基因座所製造的Ig基因區段匯集庫，該基因組包含下列輕鏈基因座排列(a)L係於一個內源性κ鏈等位基因且K係於另一個內源性κ 鏈等位基因；或(b)L係於一個內源性λ鏈等位基因且K係於另一個其他內源性λ鏈等位基因；或(c)L係於兩個內源性κ鏈等位基因；(d)L係於兩個內源性λ鏈等位基因；(e)L係於一個內源性κ鏈等位基因且另一個內源性κ鏈等位基因已被失活；或(f)L係於一個內源性λ鏈等位基因且另一個內源性λ鏈等位基因已被失活；其中L代表人類λ基因區段插入，該基因區段為包含在自Vλ3-1至Cλ7之人類λ鏈Ig基因座內(譬如包含在自2-18至Cλ7之人類λ鏈Ig基因座內)的至少功能性人類Vλ與Jλ(任擇地亦有Cλ基因區段)；以及K代表人類Vκ與Jκ插入；其中在該基因組中，該人類基因區段係插入恒定區上游，以表現包含衍生自人類V與J基因區段重組之可變區的輕鏈。
33.如態樣32之脊椎動物或細胞，任擇地，其中該基因組係包含下列排列(a)以及L係於一個或兩個內源性λ鏈等位基因；或(a)以及K係於一個或兩個內源性λ鏈等位基因；或(a)以及L係於一個內源性λ鏈等位基因且K係於另一個內源性λ鏈等位基因；或 (b)以及L係於一個或兩個內源性κ鏈等位基因；或(b)以及K係於一個或兩個內源性κ鏈等位基因；或(b)以及L係於一個內源性κ鏈等位基因且K係於另一個內源性κ鏈等位基因；或(c)以及K係於一個或兩個內源性λ鏈等位基因；或(c)以及L係於一個或兩個內源性λ鏈等位基因；或(c)以及L係於一個內源性λ鏈等位基因且K係於另一個內源性λ鏈等位基因；或(c)以及兩個內源性λ鏈等位基因已被失活；或(d)以及L係位於一個或兩個內源性κ鏈等位基因；或(d)以及K係位於一個或兩個內源性κ鏈等位基因；或(d)以及L係位於一個內源性κ鏈等位基因且K係於另一個內源性κ鏈等位基因；或(d)以及兩個內源性κ鏈等位基因已被失活
34.如態樣32或33之脊椎動物或細胞，任擇地，其中內源性κ鏈表現係實質上或完全地失活。內源性κ鏈為包含衍生自內源性(非人類脊椎動物)Vκ與Jκ基因區段重組之可變區的κ輕鏈。
35.如態樣32、33或34之脊椎動物或細胞，任擇地，其中內源性λ鏈表現係實質上或完全地失活。內源性λ鏈為包含衍生自內源性(非人類脊椎動物)Vλ與Jλ基因區段重組之可變區的λ輕鏈。
36.如態樣32至35中任一態樣之脊椎動物或細胞，任擇地，其中各個L插入係於內源性λ或κ恒定區上游。
37.如態樣32至36中任一態樣之脊椎動物或細胞，任擇地，其中各個L插入λ基因座係於內源性λ恒定區上游。
38.如態樣32至36中任一態樣之脊椎動物或細胞，任擇地，其中各個L插入κ基因座係於內源性κ恒定區上游。
39.如態樣32至35中任一態樣之脊椎動物或細胞，任擇地，其中各個L插入λ基因座係於人類λ恒定區上游。
40.如態樣32至35中任一態樣之脊椎動物或細胞，任擇地，其中各個L插入κ基因座係於人類κ恒定區上游。
41.如態樣32至40中任一態樣之脊椎動物或細胞，任擇地，其中各個K插入係於內源性λ或κ恒定區上游。
42.如態樣32至41中任一態樣之脊椎動物或細胞，任擇地，其中各個K插入λ基因座係於內源性λ恒定區上游。
43.如態樣32至42中任一態樣之脊椎動物或細胞，任擇地，其中各個K插入κ基因座係於內源性κ恒定區上游。
44.如態樣32至40任一態樣之脊椎動物或細胞，任擇地，其中各個K插入λ基因座係位人類λ恒定區上游。
45.如態樣32至40與44中任一態樣之脊椎動物或細胞，任擇地，其中各個K插入κ基因座係於人類κ恒定區 上游。
46.如態樣32至45中任一態樣之脊椎動物或細胞，任擇地，其中該插入係如態樣1至9、11至16與20至31中任一態樣。
47.如態樣32至46中任一態樣之脊椎動物或細胞，任擇地，其中各個人類λ插入係如態樣1至9、11至16與20至31中任一態樣。
48.如態樣32至47中任一項之脊椎動物或細胞，任擇地，其中各個人類κ插入係如態樣1至9、11至16與20至31中任一態樣。
49.如態樣32至48中任一項之脊椎動物或細胞，任擇地，其中各個人類λ插入係包含人類Vλ與Jλ(以及任擇地，Cλ)基因區段匯集庫。
50.如態樣32至48中任一項之脊椎動物或細胞，任擇地，其中進行了第一個與第二個(以及任擇地，第三個)人類λ插入且該插入係包含人類Vλ與Jλ(以及任擇地，Cλ)基因區段的不同匯集庫。
51.如態樣32至50中任一項之脊椎動物或細胞，任擇地，其中各個人類κ插入係包含人類Vκ與Jκ(以及任擇地，Cκ)基因區段匯集庫。
52.如態樣32至50中任一項之脊椎動物或細胞，任擇地，其中進行了第一個與第二個(以及任擇地，第三個)人類κ插入且插入係包含人類Vκ與Jκ(以及任擇地，Cκ)基因區段的不同匯集庫。
53.如任何前述態樣之脊椎動物或細胞，任擇地，其中該基因組係包含含有人類VH基因區段的免疫球蛋白重鏈基因座，譬如包含人類V、D與J基因區段的本案所述重鏈基因座。
54.一種製造包含專對所欲抗原之λ可變區的抗體或輕鏈的方法，該方法包含以所欲抗原使如任何前述態樣之脊椎動物免疫化並回收該抗體或輕鏈或回收製造該抗體或輕鏈的細胞。
55.一種用於製造完全人源化抗體或抗體輕鏈的方法，該方法包含進行如態樣54之方法，以獲得包含λ鏈非人類脊椎動物恒定區的抗體或輕鏈，並以人類恒定區置換該非人類脊椎動物恒定區，任擇地藉由改造編碼該抗體或輕鏈的核酸。
56.一種如態樣54製造的人源化抗體或抗體輕鏈或其衍生物；其係任擇地用於醫藥。
57.一種如態樣54製造的人源化抗體或鏈或其衍生物用於醫藥的用途。
58.一種失活非人類脊椎動物或非人類脊椎動物細胞(譬如小鼠、大鼠、小鼠細胞或大鼠細胞)的基因組的內源性Ig-VJ區的方法，其中該方法係包含在該基因組中、內源性Ig-VJ與內源性增强子或內源性恒定區之間插入人類免疫球蛋白基因區段(譬如V與J基因區段)，以使內源性Ig-VJ移離增强子或恒定區，藉此失活內源性Ig-VJ區。
在一具體例中，該內源性Ig-VJ為重鏈基因區段， 該增强子為內源性重鏈增强子，該恒定區為內源性重鏈恒定區且該人類Ig基因區段係包含人類VH、DH與JH基因區段。
在一具體例中，該內源性Ig-VJ為λ輕鏈基因區段，該增强子為內源性λ鏈增强子，該恒定區為內源性λ鏈恒定區且該人類Ig基因區段係包含人類Vλ與Jλ基因區段。
在一具體例中，該內源性Ig-VJ為κ輕鏈基因區段，該增强子為內源性κ鏈增强子，該恒定區為內源性κ鏈恒定區且該人類Ig基因區段係包含人類Vκ與Jκ基因區段。
一種失活非人類脊椎動物或非人類脊椎動物細胞(譬如小鼠、大鼠、小鼠細胞或大鼠細胞)的基因組的內源性IgK-VJ區的方法，其中該方法係包含在該基因組中、內源性IgK-VJ與Eκ增强子之間插入人類免疫球蛋白基因區段，以使IgK-VJ移離Eκ增强子，藉此失活內源性IgK-VJ區。
59.如態樣58之方法，其中任擇地該人類基因區段係包含人類VL與JL基因區段；任擇地，其中該插入為如態樣1至9、11至16與20至31中任一態樣所列示插入或插入人類Vκ與Jκ基因區段。
60.一種在非人類脊椎動物(譬如小鼠或大鼠)表現免疫球蛋白輕鏈的方法，該輕鏈包含λ可變區(λ輕鏈)，其中該脊椎動物所表現的至少70或80%(舉例來說，至少70、75、80、84、85、90、95、96、97、98或99%)λ輕鏈可變區係衍生自人類Vλ與Jλ基因區段的重組，該方法包含在脊椎動物的基因組中提供藉由將人類Ig基因區段靶向插入一 或多個內源性Ig基因座所製造的Ig基因區段匯集庫，該基因組包含位於恒定區上游的人類Vλ與Jλ基因區段，其中該方法係包含將包含在自Vλ2-18至Cλ7人類λ鏈Ig基因座之至少功能性人類Vλ與Jλ(任擇地亦有人類Cλ)基因區段(以及任擇地，跨基因區段序列)插入脊椎動物的內源性輕鏈基因座，其中該脊椎動物所表現的至少70或80%(舉例來說，至少70、75、80、84、85、90、95、96、97、98或99%)λ輕鏈可變區係衍生自人類Vλ與Jλ基因區段的重組；該方法包含在該脊椎動物表現該輕鏈以及任擇地，單離該輕鏈的一或多者(譬如4-鏈抗體的一部分)。
在一具體例中，該方法更包含從該脊椎動物單離包含衍生自人類Vλ與Jλ基因區段重組之可變區的λ輕鏈。在一例中，該方法係包含在單離該λ輕鏈前先以抗原(譬如人類抗原)使小鼠免疫化。在一例中，該輕鏈為一部分的抗體，譬如特異性地結合該抗原的抗體。
在一具體例中，該用途更包含從該小鼠單離脾系組織(譬如脾臟)；任擇地接著從該組織單離至少一個抗原-特異性B-細胞，其中該(多個)B-細胞表現該λ輕鏈。舉例來說，該λ輕鏈係由特異地結合預定抗原(譬如人類抗原)的抗體提供。在一例中，該用途係包含在單離脾系組織或λ輕鏈前先以抗原(譬如人類抗原)使小鼠免疫化。在一例中，該用途係包含單離藉由B-細胞(或藉由以B-細胞和骨髓瘤細胞融合所製造的融合瘤)所製造的λ輕鏈。在一例中，該用途係包含從該脾系組織所單離的B-細胞製作融合瘤，其中該 融合瘤表現該λ輕鏈或其衍生物。任擇地，該用途係包含製作該單離抗體的衍生物或λ輕鏈。衍生物抗體的例子(根據本案任何態樣)為具有相較於單離抗體的一或多個突變(譬如用以改善抗原-結合親和力及/或增強或失活Fc功能)的抗體。此類突變體特異性地結合該抗原。突變或改造以製造衍生物包括，譬如突變，以製造Fc增強或失活。衍生物可為在共軛至毒性載荷或信息子或標記或其他活性部分之後的抗體。在另一例中，從本發明細胞或脊椎動物單離的嵌合抗體鏈或抗體係藉由以對應人類恒定區置換一或所有其人類恒定區修飾。舉例來說，從此類細胞或脊椎動物單離的抗體的所有恒定區係置換成人類恒定區，以製造全人抗體(即，包含人類可變區與恒定區)。此類抗體可用於投至人類病患，以減少病患的抗-抗體反應。
61.一種在非人類脊椎動物(譬如小鼠或大鼠)表現免疫球蛋白輕鏈的方法，其中該脊椎動物所表現的至少60%(舉例來說，至少65、70、80、84、85、90、95、96、97、98或99%)輕鏈係由人類λ輕鏈提供，該方法包含在該脊椎動物的基因組內提供藉由將人類Ig基因區段靶向插入一或多個內源性Ig基因座所製造的Ig基因區段匯集庫，該基因組包含(i)位於恒定區上游的人類Vλ與Jλ基因區段，其中該人類Vλ與Jλ基因區段係藉由將包含在自Vλ2-18至Cλ7之人類λ鏈Ig基因座內的至少功能性人類Vλ與Jλ(任擇地亦有人類Cλ)基因區段(以及任擇地，跨基因區段序列)插入脊椎動物的內源性輕鏈基因座提供及(ii)位於恒定區上游的κV基 因區段，其中該脊椎動物表現包含人類λ可變區(人類λ輕鏈)的免疫球蛋白輕鏈且該脊椎動物所表現的至少60%(舉例來說，大於65、70、80、84、85、90、95、96、97、98或99%)輕鏈係由該人類λ輕鏈提供；該方法包含在該脊椎動物表現該輕鏈並任擇地單離該輕鏈之一或多者(譬如4-鏈抗體的一部分)。
在一具體例中，該方法更包含從該脊椎動物單離包含衍生自人類Vλ與Jλ基因區段重組之可變區的λ輕鏈。在一例中，該方法係包含在單離該λ輕鏈前先以抗原(譬如人類抗原)使小鼠免疫化。在一例中，該輕鏈為一部分的抗體，譬如特異性地結合該抗原的抗體。
在一具體例中，該用途更包含從該小鼠單離脾系組織(譬如脾臟)；任擇地接著從該組織單離至少一個抗原-特異性B-細胞，其中該(多個)B-細胞表現該λ輕鏈。舉例來說，該λ輕鏈係由特異地結合預定抗原(譬如人類抗原)的抗體提供。在一例中，該用途係包含在單離該脾系組織或λ輕鏈前先以抗原(譬如人類抗原)使小鼠免疫化。在一例中，該用途係包含單離藉由B-細胞(或藉由以B-細胞和骨髓瘤細胞融合所製造的融合瘤)所製造的λ輕鏈。在一例中，該用途係包含由單離自該脾系組織的B-細胞製作融合瘤，其中該融合瘤表現該λ輕鏈或其衍生物。任擇地，該用途係包含製作所單離抗體或λ輕鏈的衍生物。衍生物抗體的例子(根據本案任何態樣)為具有相較於單離抗體的一或多個突變(譬如用以改善抗原-結合親和力及/或增強或失活Fc功能) 的抗體。此類突變體特異性地結合該抗原。
62.一種在非人類脊椎動物(譬如小鼠或大鼠)表現人類免疫球蛋白VJC輕鏈的方法，該方法包含在該脊椎動物的基因組中提供藉由將人類Ig基因區段靶向插入一或多個內源性Ig基因座所製造的Ig基因區段匯集庫，其中該方法係包含將包含在自Vλ3-1至Cλ7之人類λ鏈Ig基因座(譬如包含在自2-18至Cλ7之人類λ鏈Ig基因座內)之至少功能性人類Vλ、Jλ與Cλ基因區段(以及任擇地，跨基因區段序列)插入內源性非人類脊椎動物κ輕鏈基因座的內源性非人類脊椎動物κ恒定區上游，以表現人類VJC輕鏈；該方法包含在該脊椎動物表現該輕鏈以及任擇地，單離該輕鏈的一或多者(譬如4-鏈抗體的一部分)。
在一具體例中，該方法更包含從該脊椎動物單離包含衍生自人類Vλ與Jλ基因區段重組之可變區的λ輕鏈。在一例中，該方法係包含在單離該λ輕鏈前先以抗原(譬如人類抗原)使小鼠免疫化。在一例中，該輕鏈為一部分的抗體，譬如特異性地結合該抗原的抗體。
在一具體例中，該用途更包含從該小鼠單離脾系組織(譬如脾臟)；任擇地接著從該組織單離至少一個抗原-特異性B-細胞，其中該(多個)B-細胞表現該λ輕鏈。舉例來說，該λ輕鏈係由特異地結合預定抗原(譬如人類抗原)的抗體提供。在一例中，該用途係包含在單離該脾系組織或λ輕鏈前先以抗原(譬如人類抗原)使小鼠免疫化。在一例中，該用途係包含單離藉由B-細胞(或藉由以B-細胞和骨髓瘤細 胞融合所製造的融合瘤)所製造的λ輕鏈。在一例中，該用途係包含由單離自該脾系組織的B-細胞製作融合瘤，其中該融合瘤表現該λ輕鏈或其衍生物。任擇地，該用途係包含製作所單離抗體或λ輕鏈的衍生物。衍生物抗體的例子(根據本案任何態樣)為具有相較於單離抗體的一或多個突變(譬如用以改善抗原-結合親和力及/或增強或失活Fc功能)的抗體。此類突變體特異性地結合該抗原。
63.如態樣38至40中任一項之方法，任擇地，其中該脊椎動物係如其他態樣中任一態樣。
64.一種根據態樣58至63中任一態樣之方法單離的抗體輕鏈或其衍生物，或包含此類輕鏈或衍生物的抗體；其係任擇地用於醫藥。
65.一種根據態樣58至63中任一態樣之方法單離的抗體輕鏈或其衍生物(或包含此類輕鏈或衍生物的抗體)的用途，其係用於醫藥。
66.如態樣1至53中任一態樣之非人類脊椎動物(譬如小鼠或大鼠)，其係用於表現包含λ可變區的輕鏈(λ輕鏈)，其中該脊椎動物所表現的至少70或80%(舉例來說，至少70、75、80、84、85、90、95、96、97、98或99%或100%)λ輕鏈可變區係衍生自人類Vλ與Jλ基因區段的重組。
如態樣1至53中任一態樣之非人類脊椎動物(譬如小鼠或大鼠)，其係用於表現包含λ可變區的輕鏈(λ輕鏈)，其中該脊椎動物所表現的至少70或80%(舉例來說，至少70、 75、80、84、85、90、95、96、97、98或99%或100%)λ輕鏈可變區係衍生自人類Vλ與Jλ基因區段的重組。
67.如態樣1至53中任一態樣之非人類脊椎動物(譬如小鼠或大鼠)，其係用於表現輕鏈，其中該脊椎動物所表現的至少60%(舉例來說，大於65、70、80、84、85、90、95、96、97、98或99%或100%)輕鏈係由人類λ輕鏈提供。
如態樣1至53中任一態樣之的非人類脊椎動物(譬如小鼠或大鼠)，其係表現輕鏈，其中該脊椎動物所表現的至少60%(舉例來說，大於65、70、80、84、85、90、95、96、97、98或99%或100%)輕鏈係由人類λ輕鏈提供。
68.如態樣7之非人類脊椎動物(譬如小鼠或大鼠)，其係用於表現包含λ可變區的輕鏈(λ輕鏈)，其中包含人類λ可變區的λ輕鏈表現大幅超越包含內源性非人類脊椎動物λ可變區的λ輕鏈表現：以及任擇地，其係用於失活來自內源性輕鏈基因座的內源性非人類脊椎動物λ可變區的表現。
如態樣7之非人類脊椎動物(譬如小鼠或大鼠)，其係用於表現包含λ可變區的輕鏈(λ輕鏈)，其中包含人類λ可變區的λ輕鏈表現大幅超越包含內源性非人類脊椎動物λ可變區的λ輕鏈表現：以及任擇地，其係用於失活來自內源性輕鏈基因座的內源性非人類脊椎動物λ可變區的表現。
69.如態樣7、8、9或10之非人類脊椎動物(譬如小鼠或大鼠)，其係用於失活來自內源性輕鏈基因座的內源性非人類脊椎動物λ可變區的表現。
抗體鏈的百分比表現或表現位準可測定為B-細胞(譬如周邊血液淋巴細胞)中的輕鏈mRNA轉錄物位準。另擇或另外地，百分比表現係測定為脊椎動物血清或血液中的抗體輕鏈位準。另外或另擇地，該表現可藉由B細胞的FACS(螢光激活細胞分選)分析測定。舉例來說，當人類λ可變區係分別以小鼠Cκ或人類Cλ區表現時，評估細胞表面上的小鼠Cκ或人類Cλ表現。
在該等態樣中的術語“λ輕鏈”指的是包含衍生自Vλ與Jλ基因區段重組之可變區序列(於RNA或胺基酸level)的輕鏈。於是“人類λ可變區”，舉例來說，為衍生自人類Vλ與Jλ基因區段重組的可變區。該恒定區可為κ或λ恒定區，譬如人類或小鼠恒定區。
在該等態樣中的脊椎動物係為，舉例來說，純真(即，未經預定抗原免疫化，如該術語在本領域所被理解者；舉例來說，此類脊椎動物已飼養在用於R&D的動物籠舍所提供的相對無菌環境)。在另一例中，該脊椎動物已以預定抗原-譬如帶有人類表位的抗原-免疫化。
論及“功能性”人類基因區段係認知到，在人類Igλ基因座中，一些V基因區段為非功能性假基因(譬如Vλ3-17、Vλ3-15、Vλ3-13、Vλ3-7、Vλ3-6、Vλ2-5、Vλ3-4、Vλ3-2；見IMGT資料庫：於全球資訊網(www)imgt.org/IMGTrepertoire/index.php？section=LocusGenes&repertoire=locus&species=human&group=IGL。再者，Jλ4-Cλ4與Jλ5-Cλ5在人類不具功能性。在論及基因區段時，術語“功 能性”排除假基因。功能性人類Vλ基因區段的一例為群組Vλ2-18、Vλ3-16、V2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3與Vλ3-1。功能性人類Jλ基因區段的一例為群組Jλ1、Jλ2與Jλ3；或Jλ1、Jλ2與Jλ7；或Jλ2、Jλ3與Jλ7；或Jλ1、Jλ2、Jλ3與Jλ7。功能性人類Cλ基因區段的一例為群組Cλ1、Cλ2與Cλ3；或Cλ1、Cλ2與Cλ7；或Cλ2、Cλ3與Cλ7；或Cλ1、Cλ2、Cλ3與Cλ7。
在一具體例中，本發明的細胞或脊椎動物所表現的λ輕鏈連同重鏈一起形成抗體。該重鏈可從本案所述基因轉殖重鏈基因座表現。舉例來說，該細胞或脊椎動物的基因組係包含為嵌合免疫球蛋白重鏈基因座的重鏈基因座，其包含位於該非人類物種的μ恒定區上游的一或多個人類V基因區段、一或多個人類D基因區段與一或多個人類J基因區段；內源性重鏈表現已被實質上失活；以及該重鏈基因座係包含該非人類脊椎動物物種的Eμ增强子。
在脊椎動物或細胞的一具體例中，所有內源性增强子係從插有人類基因區段的內源性基因座中刪除。於是，當插入人類增强子(譬如Eλ)時，此控制基因轉殖基因座，而無其他、內源性、增强子的效應(舉例來說，κ增强子，假使該基因座為內源性κ增强子)。此於避免類似非人類脊椎動物的κ：λ表現比率時可為有益的(譬如在小鼠中引導表現至較高的λ：κ比率)。
當內源性輕鏈(譬如κ或λ)表現係如本案所述實質上失活或失活時，少於10、5、4、3、2、1或0.5%此類內 源性輕鏈被表現或可表現。在一例中，有完全的失活，故無此類輕鏈被表現或可表現。
任擇地，本發明的脊椎動物係為純真。於是，該脊椎動物未經預定抗原免疫化。
在，舉例來說，本發明的細胞為ES細胞或其他IPS幹細胞或其他多能幹細胞時，該細胞可發展成本發明的脊椎動物。舉例來說，該細胞可根據標準技術植入來自代母(foster mother)的囊胚並發展成胚胎和動物。
在一具體例中，其中人類κ基因區段被插入，各個插入係包含人類κ基因區段(i)Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ1-8與Vκ1-9(以及任擇地，Vκ5-2與Vκ4-1)；或(ii)Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ3-11、Vκ1-12、Vκ3-15、Vκ1-16、Vκ1-17、Vκ3-20(以及任擇地，Vκ2-24及/或Vκ1-13)；或(iii)Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ3-11、Vκ1-12、Vκ3-15、Vκ1-16、Vκ1-17、Vκ3-20、Vκ2-24、Vκ1-27、Vκ2-28、Vκ2-30與Vκ1-33(以及任擇地，Vκ2-29及/或Vκ2-40及/或Vκ1-39)；以及任擇地(iv)Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4與Jκ5。
在一具體例中，該人類κ插入亦包含位於該基因座的人類J基因區段下游的人類iEκ及/或人類3’Eκ。基本上專一地表現人類重鏈可變區的本發明基因轉殖小鼠 發展正常脾系與BM隔室&正常Ig表現(其中Ig係包含人類重鏈可變區)
本發明人出乎意料地觀察到在本發明基因轉殖小鼠的正常Ig亞型表現& B細胞發展，該小鼠表現帶有人類重鏈可變區的抗體且實質上無內源性重鏈與κ鏈表現。參閱下文實施例16。
發明人觀察到，出乎意料地，在人類可變區表現的存在下，內源性重鏈可變區表現的失活並不改變脾系隔室中的B-細胞(圖66)或骨髓B前身隔室(圖67)的比例且血清中的免疫球蛋白位準為正常並表現正確的Ig亞型(圖68)。該等資料證實根據本發明所插入的人類重鏈基因區段(譬如插入至少人類VH基因區段VH2-5、7-4-1、4-4、1-3、1-2、6-1，和所有人類D與JH基因區段D1-1、2-2、3-3、4-4、5-5、6-6、1-7、2-8、3-9、5-12、6-13、2-15、3-16、4-17、6-19、1-20、2-21、3-22、6-25、1-26與7-27；以及J1、J2、J3、J4、J5與J6，任擇地表7的等位基因)在來自基因轉殖重鏈基因座的VDJ基因區段重排、B-細胞受體(BCR)信號傳導與合宜的B-細胞熟成係具完全功能性。
本發明因此提供下列態樣(編號始於態樣70)：-
70.一種表現或用於表現包含人類可變區的免疫球蛋白重鏈的小鼠，其中該小鼠所表現的重鏈為基本上專一地包含人類可變區的重鏈；以及該包含人類可變區的重鏈係表現為小鼠的一部分血清IgG1、IgG2b與IgM(以及任擇地，IgG2a)抗體； 該小鼠包含免疫球蛋白重鏈基因座，其包含位於小鼠恒定區(譬如C-μ及/或C-δ及/或C-γ；例如(呈5’至3’方向)小鼠C-μ與小鼠C-δ與小鼠C-γ)上游的人類VH、DH與JH基因區段，其中(a)該小鼠能夠表現包含人類可變區的免疫球蛋白重鏈且該小鼠所表現的重鏈為基本上專一地包含人類可變區的重鏈；以及(b)該小鼠表現包含該重鏈的血清IgG1、IgG2b與IgM(以及任擇地，IgG2a)抗體。
Ig同型可，舉例來說，使用熟習此藝者將容易熟悉的同型匹配工具抗體測定(如實施例16所例示)。
在一具體例中，該小鼠係為純真。
71.如態樣70之小鼠，該小鼠係用於表現正常相對比例的血清IgG1、IgG2a、IgG2b與IgM抗體。
“正常”係意指相仿於僅表現小鼠抗體鏈-譬如基因組僅包含野生型功能性Ig重鏈與輕鏈基因座的小鼠，譬如野生型小鼠-的小鼠(譬如純真小鼠)中的表現。
72.如態樣70或71之小鼠，其中該小鼠表現正常相對比例的血清IgG1、IgG2a、IgG2b與IgM抗體。
“正常”係意指相仿於僅表現小鼠抗體鏈-譬如基因組僅包含野生型功能性Ig重鏈與輕鏈基因座的小鼠，譬如野生型小鼠-的小鼠(譬如純真小鼠)中的表現。
73.如態樣70至72中任一項之小鼠，其用於在該小鼠中表現 (i)血清IgG1，濃度約25-350μg/ml；(ii)血清IgG2a，濃度約0-200μg/ml；(iii)血清IgG2b，濃度約30-800μg/ml；以及(iv)血清IgM，濃度約50-300μg/ml；或(i)血清IgG1，濃度約10-600μg/ml；(ii)血清IgG2a，濃度約0-500μg/ml；(iii)血清IgG2b，濃度約20-700μg/ml；以及(iv)血清IgM，濃度約50-700μg/ml；該等係如下列測定：在盤上以抗-小鼠同型-特異性標記抗體捕獲Ig，接著培育(譬如於RT一小時，譬如於20℃一小時)並使用該標記定量Ig(譬如使用抗-小鼠Ig同型特異性抗體，各共軛至辣根過氧化物酶，以帶有0.1% TweenTM、1/10000溶於PBS的比率共軛，接著在黑暗中於室溫(譬如20℃)以四甲基聯苯胺(TMB)使該標記發展4-5分鐘，添加硫酸，以停止標記發展並於450nm讀取標記)。
舉例來說，如態樣70至72中任一項之小鼠，其用於在該小鼠中表現(i)血清IgG1，濃度約25-150μg/ml；(ii)血清IgG2a，濃度約0-200μg/ml；(iii)血清IgG2b，濃度約30-300μg/ml；以及(iv)血清IgM，濃度約50-200μg/ml；或(i)血清IgG1，濃度約10-200μg/ml； (ii)血清IgG2a，濃度約0-500μg/ml；(iii)血清IgG2b，濃度約20-400μg/ml；以及(iv)血清IgM，濃度約50-700μg/ml；該等係如下列測定：在盤上以抗-小鼠同型-特異性標記抗體捕獲Ig，接著培育(譬如於RT一小時，譬如於20℃一小時)並使用該標記定量Ig(譬如使用抗-小鼠Ig同型特異性抗體，各共軛至辣根過氧化物酶，以帶有0.1% TweenTM、1/10000溶於PBS的比率共軛，接著在黑暗中於室溫(譬如20℃)以四甲基聯苯胺(TMB)使該標記發展4-5分鐘，添加硫酸，以停止標記發展並於450nm讀取標記)。
如態樣70至72中任一項之小鼠，其用於在該小鼠中表現呈下列相對比例的Ig(i)血清IgG1，濃度約25-350μg/ml；(ii)血清IgG2a，濃度約0-200μg/ml；(iii)血清IgG2b，濃度約30-800μg/ml；以及(iv)血清IgM，濃度約50-300μg/ml；或(i)血清IgG1，濃度約10-600μg/ml；(ii)血清IgG2a，濃度約0-500μg/ml；(iii)血清IgG2b，濃度約20-700μg/ml；以及(iv)血清IgM，濃度約50-700μg/ml；該等係如下列測定：在盤上以抗-小鼠同型-特異性標記抗體捕獲Ig，接著培育(譬如於RT一小時，譬如於20℃一小時)並使用該標記定量Ig(譬如使用抗-小鼠Ig同型特異性抗 體，各共軛至辣根過氧化物酶，以帶有0.1% TweenTM、1/10000溶於PBS的比率共軛，接著在黑暗中於室溫(譬如20℃)以四甲基聯苯胺(TMB)使該標記發展4-5分鐘，添加硫酸，以停止標記發展並於450nm讀取標記)。
舉例來說，如態樣70至72中任一項之小鼠，其用於在該小鼠中表現呈下列相對比例的Ig(i)血清IgG1，濃度約25-150μg/ml；(ii)血清IgG2a，濃度約0-200μg/ml；(iii)血清IgG2b，濃度約30-300μg/ml；以及(iv)血清IgM，濃度約50-200μg/ml；或(i)血清IgG1，濃度約10-200μg/ml；(ii)血清IgG2a，濃度約0-500μg/ml；(iii)血清IgG2b，濃度約20-400μg/ml；以及(iv)血清IgM，濃度約50-700μg/ml；該等係如下列測定：在盤上以抗-小鼠同型-特異性標記抗體捕獲Ig，接著培育(譬如於RT一小時，譬如於20℃一小時)並使用該標記定量Ig(譬如使用抗-小鼠Ig同型特異性抗體，各共軛至辣根過氧化物酶，以帶有0.1% TweenTM、1/10000溶於PBS的比率共軛，接著在黑暗中於室溫(譬如20℃)以四甲基聯苯胺(TMB)使該標記發展4-5分鐘，添加硫酸，以停止標記發展並於450nm讀取標記)。
74.如態樣70至73中任一項之小鼠，其中該小鼠表現 (i)血清IgG1，濃度約25-350μg/ml；(ii)血清IgG2a，濃度約0-200μg/ml；(iii)血清IgG2b，濃度約30-800μg/ml；以及(iv)血清IgM，濃度約50-300μg/ml；或(i)血清IgG1，濃度約10-600μg/ml；(ii)血清IgG2a，濃度約0-500μg/ml；(iii)血清IgG2b，濃度約20-700μg/ml；以及(iv)血清IgM，濃度約50-700μg/ml；該等係如下列測定：在盤上以抗-小鼠同型-特異性標記抗體捕獲Ig，接著培育(譬如於RT一小時，譬如於20℃一小時)並使用該標記定量Ig(譬如使用抗-小鼠Ig同型特異性抗體，各共軛至辣根過氧化物酶，以帶有0.1% TweenTM、1/10000溶於PBS的比率共軛，接著在黑暗中於室溫(譬如20℃)以四甲基聯苯胺(TMB)使該標記發展4-5分鐘，添加硫酸，以停止標記發展並於450nm讀取標記)。
舉例來說，如態樣70至72中任一項之小鼠，該小鼠表現(i)血清IgG1，濃度約25-150μg/ml；(ii)血清IgG2a，濃度約0-200μg/ml；(iii)血清IgG2b，濃度約30-300μg/ml；以及(iv)血清IgM，濃度約50-200μg/ml；或(i)血清IgG1，濃度約10-200μg/ml； (ii)血清IgG2a，濃度約0-500μg/ml；(iii)血清IgG2b，濃度約20-400μg/ml；以及(iv)血清IgM，濃度約50-700μg/ml；該等係如下列測定：在盤上以抗-小鼠同型-特異性標記抗體捕獲Ig，接著培育(譬如於RT一小時，譬如於20℃一小時)並使用該標記定量Ig(譬如使用抗-小鼠Ig同型特異性抗體，各共軛至辣根過氧化物酶，以帶有0.1% TweenTM、1/10000溶於PBS的比率共軛，接著在黑暗中於室溫(譬如20℃)以四甲基聯苯胺(TMB)使該標記發展4-5分鐘，添加硫酸，以停止標記發展並於450nm讀取標記)
如態樣70至73中任一項之小鼠，，其中該小鼠表現呈下列相對比例的Ig(i)血清IgG1，濃度約25-350μg/ml；(ii)血清IgG2a，濃度約0-200μg/ml；(iii)血清IgG2b，濃度約30-800μg/ml；以及(iv)血清IgM，濃度約50-300μg/ml；或(i)血清IgG1，濃度約10-600μg/ml；(ii)血清IgG2a，濃度約0-500μg/ml；(iii)血清IgG2b，濃度約20-700μg/ml；以及(iv)血清IgM，濃度約50-700μg/ml；該等係如下列測定：在盤上以抗-小鼠同型-特異性標記抗體捕獲Ig，接著培育(譬如於RT一小時，譬如於20℃一小時)並使用該標記定量Ig(譬如使用抗-小鼠Ig同型特異性抗 體，各共軛至辣根過氧化物酶，以帶有0.1% TweenTM、1/10000溶於PBS的比率共軛，接著在黑暗中於室溫(譬如20℃)以四甲基聯苯胺(TMB)使該標記發展4-5分鐘，添加硫酸，以停止標記發展並於450nm讀取標記)。
舉例來說，如態樣70至72中任一項之小鼠，該小鼠表現呈下列相對比例的Ig(i)血清IgG1，濃度約25-150μg/ml；(ii)血清IgG2a，濃度約0-200μg/ml；(iii)血清IgG2b，濃度約30-300μg/ml；以及(iv)血清IgM，濃度約50-200μg/ml；或(i)血清IgG1，濃度約10-200μg/ml；(ii)血清IgG2a，濃度約0-500μg/ml；(iii)血清IgG2b，濃度約20-400μg/ml；以及(iv)血清IgM，濃度約50-700μg/ml；該等係如下列測定：在盤上以抗-小鼠同型-特異性標記抗體捕獲Ig，接著培育(譬如於RT一小時，譬如於20℃一小時)並使用該標記定量Ig(譬如使用抗-小鼠Ig同型特異性抗體，各共軛至辣根過氧化物酶，以帶有0.1% TweenTM、1/10000溶於PBS的比率共軛，接著在黑暗中於室溫(譬如20℃)以四甲基聯苯胺(TMB)使該標記發展4-5分鐘，添加硫酸，以停止標記發展並於450nm讀取標記)。
75.如態樣70至74中任一項之小鼠，其係用於在製造正常比例或百分比的成熟脾系B-細胞-譬如以FACS 測得-的小鼠中從脾系B-細胞表現該重鏈。
“正常”係意指相仿於僅表現小鼠抗體鏈-譬如基因組僅包含野生型功能性Ig重鏈與輕鏈基因座的小鼠，譬如野生型小鼠-的小鼠(譬如純真小鼠)中的成熟脾系B-細胞製造。
舉例來說，本發明小鼠所製造的至少40、50、60或70%總脾系B-細胞為成熟B-細胞。熟習此藝者將知道，脾系B-細胞為220+並表現相對高位準的B220。熟習此藝者將知道，成熟脾系B-細胞表現均為相對高位準的B220與IgD。再一次如本領域所習知的，在成熟脾系B-細胞中的IgM表現係相對地低。舉例來說，參閱J Exp Med.1999 Jul 5；190(1)：75-89；“B cell development in the spleen takes place in discrete steps and is determined by the quality of B cell receptor-derived signals”；Loder F et al。
任擇地，小鼠製造正常比率的T1、T2與成熟脾系B-細胞，譬如以FACS測得。舉例來說，本發明的小鼠製造約40-70%成熟脾系B-細胞、15-35%脾系T1細胞；以及5-10%脾系T2細胞(參照總脾系B220-正性(高)群體的百分比)。舉例來說，約40-60%成熟脾系B-細胞、15-30%脾系T1細胞；以及5-10%脾系T2細胞。“正常”係意指相仿於僅表現小鼠抗體鏈-譬如基因組僅包含野生型功能性Ig重鏈與輕鏈基因座的小鼠，譬如野生型小鼠-的小鼠(譬如純真小鼠)中的T1/T2/成熟脾系B-細胞製造。
76.如態樣70至75中任一項之小鼠，其中該小鼠 製造正常比例或百分比的成熟脾系B-細胞，譬如FACS所測定。
77.一種表現或用於表現包含人類可變區的免疫球蛋白重鏈的小鼠，其中該小鼠所表現的重鏈為基本上專一地包含人類可變區的重鏈並表現在製造正常比例或百分比的成熟脾系B-細胞(譬如以FACS測得)的小鼠；該小鼠包含免疫球蛋白重鏈基因座，該重鏈基因座包含位於小鼠恒定區(譬如C-μ及/或C-δ及/或C-γ；例如(呈5’至3’方向)上游的人類VH、DH與JH基因區段，以及其中該小鼠製造正常比例或百分比的成熟脾系B-細胞。
“正常”係意指相仿於僅表現小鼠抗體鏈-譬如基因組僅包含野生型功能性Ig重鏈與輕鏈基因座的小鼠，譬如野生型小鼠-的小鼠(譬如純真小鼠)中的成熟脾系B-細胞製造。
舉例來說，本發明小鼠所製造的至少40、50、60或70%總脾系B-細胞為成熟B-細胞。熟習此藝者將知道，脾系B-細胞為B220+並表現相對高位準的B220。熟習此藝者將知道，成熟脾系B-細胞表現均為相對高位準的B220與IgD。再一次如本領域所習知的，在成熟脾系B-細胞中的IgM表現係相對地低。舉例來說，參閱J Exp Med.1999 Jul 5；190(1)：75-89；“B cell development in the spleen takes place in discrete steps and is determined by the quality of B cell receptor-derived signals”；Loder F et al。
任擇地，該小鼠製造正常比率的T1、T2與成熟 脾系B-細胞，譬如以FACS測得。舉例來說，本發明小鼠製造約40-70%成熟脾系B-細胞、15-35%脾系T1細胞；以及5-10%脾系T2細胞(參照總脾系B220-正性(高)群體的百分比)。舉例來說，約40-60%成熟脾系B-細胞、15-30%脾系T1細胞；以及5-10%脾系T2細胞。“正常”係意指相仿於僅表現小鼠抗體鏈-譬如基因組僅包含野生型功能性Ig重鏈與輕鏈基因座的小鼠，譬如野生型小鼠-的小鼠(譬如純真小鼠)中的T1/T2/成熟脾系B-細胞比例。
78.如態樣70至77中任一項之小鼠，其係用於在製造正常比例或百分比的骨髓B-細胞前身細胞(譬如以FACS測得)的小鼠中表現該重鏈。
在一具體例中，該小鼠係用於在製造正常比例或百分比的骨髓前-、初與初前-B-細胞(譬如以FACS測得)的小鼠中表現重鏈。參閱J Exp Med.1991 May 1；173(5)：1213-25；“Resolution and characterization of pro-B and pre-pro-B cell stages in normal mouse bone marrow”；Hardy RR et al對前身細胞有更多探討。
“正常”係意指相仿於僅表現小鼠抗體鏈-譬如基因組僅包含野生型功能性Ig重鏈與輕鏈基因座的小鼠，譬如野生型小鼠-的小鼠(譬如純真小鼠)中的骨髓B-細胞製造。
79.如態樣70至78中任一項之小鼠，其中該小鼠製造正常比例或百分比的骨髓B-細胞前身細胞(譬如以FACS測得)。
在一具體例中，該小鼠製造正常比例或百分比的骨髓前-、初與初前-B-細胞(譬如以FACS測得)。
“正常”係意指相仿於僅表現小鼠抗體鏈-譬如基因組僅包含野生型功能性Ig重鏈與輕鏈基因座的小鼠，譬如野生型小鼠-的小鼠(譬如純真小鼠)中的骨髓B-細胞製造。
80.一種表現或用於表現包含人類可變區的免疫球蛋白重鏈的小鼠，其中該小鼠所表現的重鏈為基本上專一地包含人類可變區的重鏈並表現在製造正常比例或百分比的骨髓B-細胞前身細胞(譬如以FACS測得)的小鼠，該小鼠包含免疫球蛋白重鏈基因座，該重鏈基因座包含位於小鼠恒定區(譬如C-μ及/或C-δ及/或C-γ；例如(呈5’至3’方向)上游的人類VH、DH與JH基因區段，以及其中該小鼠製造正常比例或百分比的骨髓B-細胞前身細胞。
在一具體例中，該小鼠係用於在製造正常比例或百分比的骨髓前-、初與初前-B-細胞(譬如以FACS測得)的小鼠中表現該重鏈。
“正常”係意指相仿於僅表現小鼠抗體鏈-譬如基因組僅包含野生型功能性Ig重鏈與輕鏈基因座的小鼠，譬如野生型小鼠-的小鼠(譬如純真小鼠)中的骨髓B-細胞製造。
81.如態樣70至80中任一項之小鼠，其中至少90%重鏈為包含人類可變區的重鏈。
舉例來說，至少90、95、96、97、98、99或99.5% 或100%重鏈係包含人類可變區，即衍生自人類VH和人類D與JH基因區段重組的可變區。
82.如態樣70至81中任一項之小鼠，其中該小鼠恒定區係包含小鼠C-μ區、C-δ區與C-γ區。
在一具體例中，各個C區為內源性小鼠C-區。在一具體例中，至少該C-μ與該C-δ區為小鼠C區。此有益於利用發展脾臟與骨髓中的各式B-細胞類型與前身所涉及的內源性控制機制。
在一具體例中，該C-γ區為人類C-γ區。這在小鼠中製造類別轉換γ-型重鏈時是有利的，該小鼠中，基本上所有表現的重鏈具有人類可變區與人類恒定區。
83.如態樣70至82中任一項之小鼠，其中該人類基因區段與小鼠恒定區之間有小鼠重鏈增强子。此有益於利用內源性小鼠抗體-與B-細胞發展控制機制。
84.如態樣70至83中任一項之小鼠，其中該人類基因區段與小鼠恒定區之間有小鼠S-μ切換。
85.如態樣70至84中任一項之小鼠，其中小鼠的基因組係包含人類基因區段上游的內源性小鼠重鏈基因座V、D與J基因區段。
86.如態樣85之小鼠，其中該小鼠V、D與J基因區段係和內源性跨基因區段序列一起出現。
87.如態樣85或86之小鼠，其中該小鼠基因區段係呈倒置方向。於是，彼等係相對於小鼠基因組的野生型方向倒置。彼等於是相對於小鼠恒定區方向倒置。
88.如態樣70至87中任一項之小鼠，其中該小鼠表現包含人類可變區的輕鏈(譬如包含人類κ可變區的κ輕鏈)。於是，該人類可變區係衍生自人類VL與JL基因區段，譬如人類Vκ與人類Jκ的重組。
89.如態樣88之小鼠，該小鼠包含位於小鼠CL(譬如內源性Cκ)上游的人類Vκ與Jκ基因區段；任擇地，其中該人類Vκ與Jκ基因區段係包含Vκ2-24、Vκ3-20、Vκ1-17、Vκ1-16、Vκ3-15、Vκ1-13、Vκ1-12、Vκ3-11、Vκ1-9、Vκ1-8、Vκ1-6、Vκ1-5、Vκ5-2、Vκ4-1、Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4與Jκ5。任擇地，其中該基因區段為表12的等位基因。
90.如態樣70至89中任一項之小鼠，其中該人類VH、DH與JH基因區段係包含人類VH基因區段VH2-5、7-4-1、4-4、1-3、1-2、6-1，和所有人類D與JH基因區段D1-1、2-2、3-3、4-4、5-5、6-6、1-7、2-8、3-9、5-12、6-13、2-15、3-16、4-17、6-19、1-20、2-21、3-22、6-25、1-26與7-27；以及J1、J2、J3、J4、J5與J6。舉例來說，該人類VH、DH與JH基因區段係包含人類VH基因區段VH2-5、7-4-1、4-4、1-3、1-2、6-1，和所有人類D與JH基因區段D1-1、2-2、3-3、4-4、5-5、6-6、1-7、2-8、3-9、3-10、4-11、5-12、6-13、1-14、2-15、3-16、4-17、5-18、6-19、1-20、2-21、3-22、4-23、5-24、6-25、1-26與7-27；以及J1、J2、J3、J4、J5與J6。任擇地，其中該基因區段為表7的等位基因。
91.一種如態樣70至90中任一項之小鼠用於表現包含人類可變區的免疫球蛋白重鏈的用途，其中該小鼠 所表現的重鏈為基本上專一地包含人類可變區的重鏈；以及包含人類可變區的重鏈係表現為小鼠中的一部分血清IgG1、IgG2b與IgM(以及任擇地，IgG2a)抗體。該用途為非治療性、非診斷性及非手術性用途。
在一具體例中，該用途係包含以抗原(譬如人類抗原)使小鼠免疫化並單離特異性地結合該抗原的IgG1抗體。
在一具體例中，該用途係包含以抗原(譬如人類抗原)使小鼠免疫化並單離特異性地結合該抗原的IgG2a抗體。
在一具體例中，該用途係包含以抗原(譬如人類抗原)使小鼠免疫化並單離特異性地結合該抗原的IgG2b抗體。
任擇地，該用途係包含製作該單離抗體的衍生物。衍生物抗體的例子(根據本案任何態樣)為具有相較於單離抗體的一或多個突變(譬如用以改善抗原-結合親和力及/或增強或失活Fc功能)的抗體。此類突變體特異性地結合該抗原。
92.一種如態樣70至90中任一項之小鼠用於表現包含人類可變區的免疫球蛋白重鏈的用途，其中該小鼠所表現的重鏈為基本上專一地包含人類可變區的重鏈並表現在製造正常比例或百分比的成熟脾系B-細胞的小鼠。該用途為非治療性、非診斷性及非手術性用途。
在一具體例中，該用途更包含從該小鼠單離脾系 組織(譬如脾臟)；任擇地接著從該組織單離至少一個抗原-特異性B-細胞，其中該(多個)B-細胞表現特異地結合預定抗原的抗體。在一例中，該用途係包含在單離該脾系組織前先以抗原使小鼠免疫化。在一例中，該用途係包含單離藉由B-細胞(或藉由以B-細胞和骨髓瘤細胞融合所製造的融合瘤)製造的抗體。任擇地，該用途係包含製作該單離抗體的衍生物。衍生物抗體的例子(根據本案任何態樣)為具有相較於單離抗體的一或多個突變(譬如用以改善抗原-結合親和力及/或增強或失活Fc功能)的抗體。此類突變體特異性地結合該抗原。
93.一種如態樣70至90中任一項之小鼠用於表現包含人類可變區的免疫球蛋白重鏈的用途，其中該小鼠所表現的重鏈為基本上專一地包含人類可變區的重鏈並表現在製造正常比例或百分比的骨髓B-細胞前身細胞的小鼠。該用途為非治療性、非診斷性及非手術性用途。
94.一種如態樣70至90中任一態樣之小鼠的用途，其係用於態樣70、71、73、75與78中一或多個態樣所述目的。
Ig的表現(譬如表現百分比或表現比例或位準)可測定為B-細胞(譬如周邊血液淋巴細胞)中的抗體鏈mRNA轉錄物。另擇或另外地，百分比表現係測定為脊椎動物血清或血液中的抗體位準。另外或另擇地，該表現可藉由B細胞的FACS分析測定。
在該等態樣中，“包含人類可變區的重鏈”意指衍 生自人類VH、D與JH基因區段重組的可變區。
所表現的重鏈“基本上專一地”包含人類可變區，即，僅有相對極低或甚至無內源性小鼠重鏈可變區表現。舉例來說，至少90、95、96、97、98、99或99.5%或100%重鏈為包含人類可變區的重鏈。在一具體例中，至少90%重鏈為包含人類可變區的重鏈。百分比表現可測定為B-細胞(譬如周邊血液淋巴細胞)中的重鏈mRNA轉錄物位準。另擇或另外地，百分比表現係測定為小鼠血清或血液中的重鏈或抗體位準。另外或另擇地，該表現可藉由B細胞的FACS分析測定。
該小鼠可包含任何內源性重鏈基因座，其中出現人類V、D與J基因區段，如本案所述。在一例中，該小鼠基因組係包含小鼠重鏈基因座，其中至少人類VH基因區段VH2-5、7-4-1、4-4、1-3、1-2、6-1，和所有人類D與JH基因區段D1-1、2-2、3-3、4-4、5-5、6-6、1-7、2-8、3-9、5-12、6-13、2-15、3-16、4-17、6-19、1-20、2-21、3-22、6-25、1-26與7-27；以及J1、J2、J3、J4、J5與J6係位於小鼠恒定區上游。
在該等態樣的脊椎動物為，舉例來說，純真(即，未被預定抗原免疫化，如該術語在本領域所被理解者；舉例來說，此類脊椎動物已飼養在用於R&D的動物籠舍所提供的相對無菌環境)。在另一例中，該脊椎動物已被預定抗原-譬如帶有人類表位的抗原-免疫化。
在一具體例中，本發明小鼠所表現的該重鏈連同 輕鏈一起形成抗體(Ig)。該輕鏈可由本案所述任何基因轉殖輕鏈基因座表現。舉例來說，該小鼠的基因組係包含為嵌合免疫球蛋白重鏈基因座的重鏈基因座，其包含位於該非人類物種μ恒定區上游的一或多個人類V基因區段、一或多個人類D基因區段與一或多個人類J基因區段；內源性重鏈表現已被實質上失活；以及該重鏈基因座係包含該非人類脊椎動物物種的Eμ增强子。
在任何態樣的一具體例中，舉例來說，使用本案所述方法，內源性輕鏈(譬如κ及/或λ)表現係實質上失活或失活。在此情況中，少於10、5、4、3、2、1或0.5%此類內源性λ輕鏈被表現或可表現。另外或另擇地，少於10、5、4、3、2、1或0.5%此類內源性κ輕鏈被表現或可表現。在一例中，內源性κ及/或λ表現有完全失活，所以無此類輕鏈被表現或可表現。
在一具體例中，該小鼠基因組係包含人類κ基因區段(任擇地，表12的等位基因)(i)Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ1-8與Vκ1-9(以及任擇地，Vκ5-2與Vκ4-1)；或(ii)Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ3-11、Vκ1-12、Vκ3-15、Vκ1-16、Vκ1-17、Vκ3-20(以及任擇地，Vκ2-24及/或Vκ1-13)；或(iii)Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ3-11、Vκ1-12、Vκ3-15、Vκ1-16、Vκ1-17、Vκ3-20、Vκ2-24、Vκ1-27、Vκ2-28、Vκ2-30與Vκ1-33(以及任擇地，Vκ2-29及/或Vκ2-40及/或 Vκ1-39)；以及任擇地(iv)Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4與Jκ5。
在一具體例中，該基因組亦包含(i)至少人類VH基因區段VH2-5、7-4-1、4-4、1-3、1-2、6-1，和所有人類D與JH基因區段D1-1、2-2、3-3、4-4、5-5、6-6、1-7、2-8、3-9、5-12、6-13、2-15、3-16、4-17、6-19、1-20、2-21、3-22、6-25、1-26與7-27；以及J1、J2、J3、J4、J5與J6(任擇地，表7的等位基因)與(ii)至少人類基因區段Vκ2-24、Vκ3-20、Vκ1-17、Vκ1-16、Vκ3-15、Vκ1-13、Vκ1-12、Vκ3-11、Vκ1-9、Vκ1-8、Vκ1-6、Vκ1-5、Vκ5-2、Vκ4-1、Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4與Jκ5(任擇地，表12的等位基因)。如實施例16中所證實的，此類小鼠在重排、BCR信號傳導與B細胞熟成態樣中係具完全功能性。該小鼠所表現的大於90%抗體係包含人類重鏈可變區與人類κ輕鏈可變區。該等小鼠因此極有益於-在以此類抗原使該小鼠免疫化之後-選擇具有特異性地結合人類抗原之人類可變區的抗體。在單離此類抗體之後，熟習此藝者可使用慣用技術將小鼠恒定區置換成人類恒定區，以實現可用作投至人類之藥物候選者的全人抗體(任擇地在突變或改造以製造進一步的衍生物，譬如帶有Fc增強或失活之後或在共軛至毒性載荷或信息子或標記或其他活性部分之後)。
在一具體例中，該基因組亦包含位於基因座內的人類J基因區段下游的人類iEκ及/或人類3’Eκ。 本發明亦包括下列項目(clauses)：
項目1. 一種小鼠，其表現含有人類可變區的免疫球蛋白重鏈，其中該小鼠係包含包括免疫球蛋白重鏈基因座的基因組，該免疫球蛋白重鏈基因座包含位於小鼠恒定區上游的人類VH、DH、與JH基因區段；其中該小鼠表現免疫球蛋白重鏈，其特徵在於該小鼠所表現的至少90%免疫球蛋白重鏈係包含人類可變區；以及其中該小鼠表現包含該含有人類可變區之重鏈的血清IgG1、IgG2b、與IgM抗體。
項目2. 一種小鼠，其表現含有人類可變區的免疫球蛋白重鏈，其中該小鼠係包含包括免疫球蛋白重鏈基因座的基因組，該免疫球蛋白重鏈基因座包含位於小鼠恒定區上游的人類VH、DH、與JH基因區段；其中該小鼠表現免疫球蛋白重鏈，其特徵在於該小鼠所表現的至少90%免疫球蛋白重鏈係包含人類可變區；以及其中該小鼠製造正常比例的成熟脾系B-細胞；其中該正常比例為表現含有小鼠可變區之免疫球蛋白重鏈且不表現含有人類可變區之免疫球蛋白重鏈的小鼠所製造的成熟脾系B-細胞比例。
項目3. 一種小鼠，其表現含有人類可變區的免疫球蛋白重鏈，其中該小鼠係包含包括免疫球蛋白重鏈基因座的基因 組，該免疫球蛋白重鏈基因座係包含位於小鼠恒定區上游的人類VH、DH、與JH基因區段；其中該小鼠表現免疫球蛋白重鏈，其特徵在於該小鼠所表現的至少90%免疫球蛋白重鏈係包含人類可變區；以及其中該小鼠製造正常比例的骨髓B-細胞前身細胞；其中該正常比例為表現含有小鼠可變區之免疫球蛋白重鏈且不表現含有人類可變區之免疫球蛋白重鏈的小鼠所製造的骨髓B-細胞前身細胞比例。
項目4. 如任何前述項目之小鼠，其中在獲自該小鼠的血清樣本中，該小鼠表現正常比例的IgG1、IgG2b、與IgM；其中該正常比例係由表現含有小鼠可變區之免疫球蛋白重鏈且不表現含有人類可變區之免疫球蛋白重鏈的小鼠所製造。
項目5. 如任何前述項目之小鼠，其中該小鼠恒定區為C-μ、C-δ、及/或C-γ。
項目6. 如項目5之小鼠，其中該小鼠恒定區為至少C-μ、C-δ與C-γ。
項目7. 如任何前述項目之小鼠，其中該小鼠恒定區為內源性小鼠C-區。
項目8. 如任何前述項目之小鼠，其中該小鼠表現人類C-γ區。
項目9. 如任何前述項目之小鼠，其中該小鼠為純真小鼠。
項目10. 如項目1之小鼠，其中該小鼠表現包含含有人類可變區之重鏈的血清IgG2a。
項目11. 如任何前述項目之小鼠，其中該小鼠表現呈下列相對比例的Ig亞型(i)血清IgG1，濃度約25-350μg/ml；(ii)血清IgG2a，濃度約0-200μg/ml；(iii)血清IgG2b，濃度約30-800μg/ml；以及(iv)血清IgM，濃度約50-300μg/ml；或(i)血清IgG1，濃度約10-600μg/ml；(ii)血清IgG2a，濃度約0-500μg/ml；(iii)血清IgG2b，濃度約20-700μg/ml；以及(iv)血清IgM，濃度約50-700μg/ml；該等係藉由下列測定：在盤上捕獲免疫球蛋白，接著以各別包含標記的抗-小鼠同型-特異性抗體培育並基於各別標記位準定量各別免疫球蛋白。
項目12. 如任何前述項目之小鼠，其中該小鼠表現呈下列相對比例的Ig亞型(i)總血清IgG與IgM，濃度約200-2500μg/ml；以及(ii)血清IgM，濃度約100-800μg/ml；該等係藉由下列測定：在盤上捕獲免疫球蛋白，接著以各別包含標記的抗-小鼠同型-特異性抗體培育並基於各別標記位準定量各別免疫球蛋白。
項目13. 如任何前述項目之小鼠，其中該小鼠從 脾系B-細胞表現該免疫球蛋白重鏈且其中該小鼠在全部脾臟細胞中製造正常比例的成熟脾系B-細胞，包含成熟B-細胞、與脾系T1與T2細胞。
項目14. 如項目1-3中任一項之小鼠，其中，該小鼠所表現的至少95、96、97、98、99、或99.5%免疫球蛋白重鏈為包含人類可變區的免疫球蛋白重鏈。
項目15. 如任何前述項目之小鼠，其中小鼠免疫球蛋白重鏈增强子係位於該小鼠重鏈免疫球蛋白基因座內、在人類VH、DH、與JH基因區段與小鼠恒定區之間。
項目16. 如任何前述項目之小鼠，其中小鼠S-μ切換係位於該小鼠重鏈免疫球蛋白基因座內、在人類VH、DH、與JH基因區段與小鼠恒定區之間。
項目17. 如任何前述項目之小鼠，其中內源性小鼠免疫球蛋白重鏈V、D與J基因區段係位於該小鼠重鏈免疫球蛋白基因座，在人類VH、DH、與JH基因區段上游。
項目18. 如項目17之小鼠，其中該小鼠免疫球蛋白重鏈V、D與J基因區段係出現在帶有內源性跨基因區段序列的該小鼠重鏈免疫球蛋白基因座。
項目19. 如項目17或18之小鼠，其中該小鼠免疫球蛋白重鏈V、D與J基因區段係以相對於其天然內源性方向呈倒置的方向位於該小鼠重鏈免疫球蛋白基因座內。
項目20. 如前述項目中任一項目之小鼠，其中該小鼠表現含有人類κ可變區的輕鏈。
項目21. 如項目20之小鼠，其中該小鼠表現衍生 自Vκ和人類Jκ重組的免疫球蛋白輕鏈。
項目22. 如前述項目中任一項目之小鼠，其中該小鼠表現含有人類λ可變區的輕鏈。
項目23. 如項目22之小鼠，其中該小鼠表現衍生自Vλ和人類Jλ重組的免疫球蛋白輕鏈。
項目24. 如項目21之小鼠，其包含包括人類Vκ與Jκ基因區段的基因組，該人類Vκ與Jκ基因區段係位於該小鼠重鏈免疫球蛋白基因座、在小鼠CL上游。
項目25. 如項目24之小鼠，其中該小鼠CL為內源性Cκ。
項目26. 如項目24或25之小鼠，其中該人類Vκ與Jκ基因區段係包含Vκ2-24、Vκ3-20、Vκ1-17、Vκ1-16、Vκ3-15、Vκ1-13、Vκ1-12、Vκ3-11、Vκ1-9、Vκ1-8、Vκ1-6、Vκ1-5、Vκ5-2、Vκ4-1、Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4與Jκ5。
項目27. 如前述項目中任一項目之小鼠，其中該人類VH、DH與JH基因區段含有人類VH基因區段：VH2-5、7-4-1、4-4、1-3、1-2、6-1；人類DH基因區段：D1-1、2-2、3-3、4-4、5-5、6-6、1-7、2-8、3-9、5-12、6-13、2-15、3-16、4-17、6-19、1-20、2-21、3-22、6-25、1-26與7-27；以及人類JH基因區段：J1、J2、J3、J4、J5與J6。
項目28. 一種用於獲得一或多個含有人類可變區的免疫球蛋白重鏈的方法，該方法包含提供如任何前述項目之小鼠以及 單離一或多個免疫球蛋白重鏈。
項目29. 如項目28之方法，其中各免疫球蛋白重鏈係包括在抗體內。
項目30. 如項目29之方法，其中該重鏈及/或含有該重鏈的抗體係於單離後被修飾。
項目31. 如項目28之方法，其中以抗原使小鼠免疫化的步驟係於單離免疫球蛋白重鏈的步驟前執行。
項目31a. 如項目30之方法，其中該抗原為人類抗原。
項目32. 如項目30、31、或31a之方法，其中該免疫球蛋白重鏈係包括在特異性地結合該抗原的IgG1抗體、抗體片段、或抗體衍生物內。
項目33. 如項目30、31、或31a之方法，其中該免疫球蛋白重鏈係包括在特異性地結合該抗原的IgG2a抗體、抗體片段、或抗體衍生物內。
項目34. 如項目30、31、或31a之方法，其中該免疫球蛋白重鏈係包括在特異性地結合該抗原的IgG2b抗體、抗體片段、或抗體衍生物內。
項目35. 如項目30、31、或31a之方法，其中該免疫球蛋白重鏈係包括在特異性地結合該抗原的IgM抗體、抗體片段、或抗體衍生物內。
項目36. 在項目28至35中任一項目的方法中單離的一種抗體或免疫球蛋白重鏈，或該抗體或重鏈的抗原結合片段或衍生物。
項目37. 一種藥學組成物，該組成物包含如項目36之抗體、抗體片段、或抗體衍生物以及藥學上可接受之載劑、賦形劑、或稀釋劑。
項目38. 一種用於單離脾系組織的方法，該方法包含提供如1至27之小鼠， 從該小鼠收集脾臟或其一部分，以及從該脾臟或一部分獲得組織。
項目39. 如項目38之方法，更包含從該脾系組織單離至少一個抗原-特異性B-細胞，其中該B-細胞表現含有人類可變區的重鏈。
項目40. 如項目38或39之方法，其中以抗原使小鼠免疫化的步驟係於從該小鼠收集脾臟的步驟之前執行。
項目41. 如項目40之方法，其中該抗原為人類抗原。
項目42. 如項目40或41之方法，其中該至少一個抗原-特異性B-細胞製造包含該重鏈的IgG1、IgG2a、IgG2b或IgM抗體，其中該抗體特異性地結合該抗原。
項目43. 如項目38至42之方法，其中製造該重鏈的至少一個抗原-特異性B-細胞係和永生骨髓瘤細胞融合，以製造融合瘤細胞。
項目44. 如項目38至43之方法，更包含從該B-細胞或融合瘤細胞單離免疫球蛋白重鏈的步驟。
項目45. 在項目44之方法中單離的抗體或免疫球蛋白重鏈，或該抗體或重鏈的抗原結合片段或衍生物。
項目46. 一種藥學組成物，該組成物包含如項目45之抗體、抗體片段、或抗體衍生物以及藥學上可接受之載劑、賦形劑、或稀釋劑。
項目47. 一種用於獲得人源化抗體的方法，該方法 選擇表現含有人類可變區的免疫球蛋白重鏈的小鼠，其中該小鼠係包含包括免疫球蛋白重鏈基因座的基因組，該免疫球蛋白重鏈基因座係包含位於小鼠恒定區上游的人類VH、DH、與JH基因區段，其中該小鼠表現免疫球蛋白重鏈，其特徵在於該小鼠所表現的至少90%免疫球蛋白重鏈為含有人類可變區的免疫球蛋白重鏈，其中該小鼠表現包含該含有人類可變區之重鏈的血清IgG1、IgG2b、與IgM抗體，其中該小鼠製造正常比例的成熟脾臟B-細胞，其中該小鼠製造正常比例的骨髓B-細胞前身細胞，以及其中在獲自該小鼠的血清樣本中，該小鼠表現正常比例的IgG1、IgG2a、IgG2b、與IgM，以及其中各個該正常比例為表現含有小鼠可變區之免疫球蛋白重鏈且不表現含有人類可變區之免疫球蛋白重鏈的小鼠所製造的比例；從該小鼠收集血清；以及獲得包含來自該血清之IgG1、IgG2b、與IgM抗體的人 源化抗體池。
項目48. 如項目47之方法，該方法包含-在從該小鼠收集血清的步驟之前-以抗原使小鼠免疫化的步驟。
項目49. 如項目48之方法，更包含下列步驟以該抗原接觸該人源化抗體池；以該人源化抗體池中的人源化抗體結合該抗原；以及單離結合至該抗原的人源化抗體。
項目50. 如項目49之方法，更包含下列步驟以同型-特異性抗體接觸結合該抗原的人源化抗體，其中該同型-特異性抗體係識得IgG1、IgG2a、IgG2b、或IgM；以及單離結合至該同型-特異性抗體的人源化抗體。
項目51. 如項目48之方法，該方法包含下列步驟從該小鼠收集脾臟或其組織，從脾系組織單離B-細胞，融合該B-細胞和永生骨髓瘤細胞，以製造表現包含來自該血清之IgG抗體的人源化抗體池的融合瘤細胞，其中該抗體池係用於如項目48之方法。
項目52. 如項目47-51之方法，其中該選定小鼠係包含小鼠免疫球蛋白重鏈V、D與J基因區段，該基因區段係以相對於其天然內源性方向呈倒置的方向位於該小鼠重鏈免疫球蛋白基因座內。
項目53. 如項目47-52中任一項之方法，其中該小鼠表現呈下列相對比例的Ig亞型 (i)血清IgG1，濃度約25-350μg/ml；(ii)血清IgG2a，濃度約0-200μg/ml；(iii)血清IgG2b，濃度約30-800μg/ml；以及(iv)血清IgM，濃度約50-300μg/ml；或(i)血清IgG1，濃度約10-600μg/ml；(ii)血清IgG2a，濃度約0-500μg/ml；(iii)血清IgG2b，濃度約20-700μg/ml；以及(iv)血清IgM，濃度約50-700μg/ml；該等係藉由下列測定：在盤上捕獲免疫球蛋白，接著以各別包含標記的抗-小鼠同型-特異性抗體培育並基於各別標記位準定量各別免疫球蛋白。
項目54. 如項目47-53中任一項之方法，其中，該小鼠所表現的至少95、96、97、98、99、或99.5%免疫球蛋白重鏈為包含人類可變區的免疫球蛋白重鏈。
項目55. 如項目47-54中任一項之方法，其中小鼠免疫球蛋白重鏈增强子係位於該小鼠重鏈免疫球蛋白基因座內、在人類VH、DH、與JH基因區段與小鼠恒定區之間。
項目56. 如項目47-55中任一項之方法，其中小鼠S-μ切換係位於該小鼠重鏈免疫球蛋白基因座內、在人類VH、DH、與JH基因區段與小鼠恒定區之間。
項目57. 如項目47-56中任一項之方法，其中內源性小鼠免疫球蛋白重鏈V、D與J基因區段係位於該小鼠 重鏈免疫球蛋白基因座內、在人類VH、DH、與JH基因區段上游。
項目58. 如項目57之方法，其中該小鼠免疫球蛋白重鏈V、D與J基因區段係出現在帶有內源性跨基因區段序列的該小鼠重鏈免疫球蛋白基因座內。
項目59. 如項目57或58之方法，其中該小鼠免疫球蛋白重鏈V、D與J基因區段係以相對於其天然內源性方向呈倒置的方向位於該小鼠重鏈免疫球蛋白基因座內。
項目60. 如項目47-59中任一項之方法，其中該小鼠表現含有人類κ可變區的輕鏈。
項目61. 如項目60之方法，其中該小鼠表現含有人類Jκ的免疫球蛋白輕鏈。
項目62. 如項目47-51中任一項之方法，其中該小鼠表現含有人類λ可變區的輕鏈。
項目63. 如項目62之方法，其中該小鼠表現含有人類Jλ的免疫球蛋白輕鏈。
項目64. 如項目61之方法，該方法包含包括人類Vκ與Jκ基因區段的基因組，該人類Vκ與Jκ基因區段係位於該小鼠重鏈免疫球蛋白基因座內，在小鼠CL上游。
項目65. 如項目64之方法，其中該小鼠CL為內源性Cκ。
項目66. 如項目64或65之方法，其中該人類Vκ與Jκ基因區段係包含Vκ2-24、Vκ3-20、Vκ1-17、Vκ1-16、Vκ3-15、Vκ1-13、Vκ1-12、Vκ3-11、Vκ1-9、Vκ1-8、Vκ1-6、 Vκ1-5、Vκ5-2、Vκ4-1、Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4與Jκ5。
項目67. 如項目47-51中任一項之方法，其中該人類VH、DH與JH基因區段含有人類VH基因區段：VH2-5、7-4-1、4-4、1-3、1-2、6-1；人類DH基因區段：D1-1、2-2、3-3、4-4、5-5、6-6、1-7、2-8、3-9、5-12、6-13、2-15、3-16、4-17、6-19、1-20、2-21、3-22、6-25、1-26與7-27；以及人類JH基因區段：J1、J2、J3、J4、J5與J6。
表現κ & λ可變區的非人類脊椎動物 (i)以類似人類的比例製造K與L鏈
本發明此態樣係有益於製造不偏移至類似非人類比例的輕鏈。舉例來說，在小鼠，κ-型輕鏈到目前為止大幅超過λ-型輕鏈(在野生型小鼠，通常95% κ輕鏈：5% λ輕鏈的層級)。人類，另一方面，通常展現大約60% κ：大約40% λ。於是，λ的表現比起在小鼠發現的高了許多。所欲的將是提供可表現較高比例λ-型輕鏈的非人類脊椎動物，例如小鼠或大鼠。在該脊椎動物表現帶有人類λ可變區的輕鏈與其他帶有人類κ可變區的輕鏈時，此係有益的。為此，發明人已首次證實此類表現提升λ輕鏈的脊椎動物，於是本發明提供：-一種非人類脊椎動物(譬如小鼠或大鼠)，其基因組係包含藉由將人類Ig基因區段靶向插入一或多個內源性Ig基因座所製造的Ig基因區段匯集庫，該基因組包含藉由插入恒定區上游的脊椎動物內源性輕鏈基因座所提供的人類 Vλ與Jλ基因區段，該基因組包含藉由插入脊椎動物的內源性輕鏈基因座提供、位於恒定區上游的人類Vκ與Jκ基因區段，其中該脊椎動物表現包含κ輕鏈可變區的免疫球蛋白輕鏈與包含λ輕鏈可變區的免疫球蛋白輕鏈，其中該脊椎動物所表現的多於20%輕鏈係包含λ可變區(譬如脾系B細胞的FACS所測得)。
剩餘的輕鏈表現κ可變區。
WO03047336教示製造類似人類的κ：λ比例的想望，可是並無提供如何達成此想望的可行或可信揭示內容。
(ii)以正常B-細胞隔室製造的K與L鏈
發明人已成功地生成含有靶向插入人類V與Jλ基因區段以致使藉由正常(即，相仿於野生型脊椎動物)B-細胞隔室表現包含人類λ可變區的輕鏈的非人類脊椎動物。於是，發明人已提供此類可有益地製造此類輕鏈和良好匯集庫且比起展現包含縮減尺寸和成熟度的B-細胞隔室且確實甚至不能製造具有人類λ可變區的輕鏈的先前技術基因轉殖非人類脊椎動物更加可靠的脊椎動物。於是，本發明提供：-一種非人類脊椎動物(譬如小鼠或大鼠)，其基因組係包含藉由將人類Ig基因區段靶向插入一或多個內源性Ig基因座所製造的Ig基因區段匯集庫，該基因組包含藉由插入恒定區上游的脊椎動物內源性輕鏈基因座所提供的人類Vλ與Jλ基因區段，該基因組包含藉由插入恒定區上游的脊 椎動物內源性輕鏈基因座所提供的人類Vκ與Jκ基因區段，其中該脊椎動物表現包含κ輕鏈可變區的免疫球蛋白輕鏈與包含λ輕鏈可變區的免疫球蛋白輕鏈，以及其中該脊椎動物製造正常比例或百分比的成熟脾系B-細胞(譬如脾系B細胞之FACS所測得)。
就非人類脊椎動物(i)與(ii)而言，預期到下列具體例(除指明外，各具體例適用於(i)或(ii))：-在一具體例中，該人類Vλ與Jλ插入係包含至少功能性人類V與J基因區段，該基因區段係包含在自Vλ3-27至Cλ7之人類λ鏈Ig基因座內。
在一具體例中，該人類Vλ與Jλ插入係包含至少人類V基因區段Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3與Vλ3-1，任擇地，表18的等位基因。
在一具體例中，該人類Vλ與Jλ插入係包含一個、多個或所有人類J基因區段Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ6與Jλ7。
在一具體例中，該人類Vλ與Jλ插入係包含插入人類Jλ-Cλ簇，其中該簇係包含自Jλ1至Cλ7之J與C基因區段。
在一具體例中，該人類Vλ與Jλ插入係包含插入人類Eλ增强子。舉例來說，Eλ增强子係相對於該插入亦包含的人類Jλ7而提供於生殖系配置內。舉例來說，Eλ增强子係相對於該插入亦包含的人類Jλ-Cλ簇而提供於生殖系配置內，其中該簇係包含人類生殖系配置內的Jλ1至Cλ7。在人類生殖系配置內，Eλ增强子位於Jλ-Cλ簇的3’。
在一具體例或脊椎動物(i)或(ii)中，該人類Vλ與Jλ插入係藉由插入對應於第22號人類染色體的座標22886217至23327884的序列提供。
在一具體例或脊椎動物(ii)中，該人類Vλ與Jλ插入係藉由插入對應於第22號人類染色體的座標23064876至23327884的序列提供。
在一具體例中，該人類Vκ與Jκ插入係包含至少功能性人類V與J基因區段，該基因區段係包含在自Vκ1-33至Jκ5之人類κ鏈Ig基因座內。
在一具體例中，該人類Vκ與Jκ插入係包含至少人類V基因區段Vκ1-33、Vκ2-30、Vκ2-29、Vκ2-28、Vκ1-27、Vκ2-24、Vκ3-20、Vκ1-17、Vκ1-16、Vκ3-15、Vκ1-13、Vκ1-12、Vκ3-11、Vκ1-9、Vκ1-8、Vκ1-6、Vκ1-5、Vκ5-2與Vκ4-1，任擇地表12的等位基因。
在一具體例中，該人類Vκ與Jκ插入係包含一個、多個或所有人類J基因區段Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4與Jκ5，任擇地，表12的等位基因。
在一具體例中，該脊椎動物所表現的多於30、35、40、45或50%輕鏈係包含λ可變區。
在一具體例中，該脊椎動物所表現的自20至40、45或50%輕鏈係包含λ可變區。在一具體例中，該脊椎動物所表現的自30至40、45或50%輕鏈包含λ可變區。
在一具體例中，該κ輕鏈可變區為人類κ輕鏈可變區。
在一具體例中，該人類Vκ與Jκ基因區段係於該脊椎動物的內源性κ輕鏈基因座內、在κ恒定區上游。
在一具體例中，該人類Vλ與Jλ基因區段係於該脊椎動物的內源性κ輕鏈基因座內。
在一具體例中，該人類Vλ與Jλ基因區段係於該脊椎動物的內源性λ輕鏈基因座內。
在一具體例中，該脊椎動物表現包含人類κ可變區的輕鏈並表現包含人類λ可變區的輕鏈。在一例中，內源性(非人類脊椎動物)κ鏈表現係實質上失活或失活及/或內源性(非人類脊椎動物)λ鏈表現係實質上失活或失活。在脊椎動物為小鼠時，小鼠λ鏈表現通常極低(大約5%或更少)且在此情況中，不需要改造小鼠基因組以進一步失活內源性λ鏈表現。於是，在脊椎動物為小鼠時，內源性κ鏈表現係實質上失活或失活且小鼠λ鏈表現佔所有輕鏈表現5%或更少。
在一具體例中，該脊椎動物製造正常比例或百分比的成熟脾系B-細胞。舉例來說，此可藉由單離自該脊椎動物的脾系B細胞之FACS測定。
在一具體例中，該脊椎動物製造正常比率的T1、T2與成熟脾系B-細胞。舉例來說，此可藉由單離自該脊椎動物的脾系B細胞之FACS測定。
在一具體例中，該脊椎動物所製造的至少40、50、60或70%總脾系B-細胞為成熟B-細胞。舉例來說，此可藉由單離自該脊椎動物的脾系B細胞之FACS測定。
發明的進一步陳述
在一具體例中，本發明係關於下列：一種非人類脊椎動物(譬如小鼠或大鼠)或脊椎動物細胞，其基因組係包含位於重鏈基因座恒定區上游的人類VH、D與JH基因區段及/或位於輕鏈基因座恒定區上游的人類VL與JL基因區段，其中該基因區段係操作性地接附至其恒定區，俾使該脊椎動物或細胞能夠表現分別包含人類VH與VL域的免疫球蛋白重鏈及/或輕鏈，其中該重鏈基因座係包含人類VH基因區段，該人類VH基因區段能夠和人類D與JH基因區段重組，以製造VH域，其中該輕鏈基因座係包含人類VL基因區段，該人類VL基因區段能夠和人類JL基因區段重組，以製造VL域，或其中該細胞可發展成表現該重鏈與輕鏈可變域的脊椎動物。
一種非人類脊椎動物(譬如小鼠或大鼠)或脊椎動物細胞，其基因組係包含位於重鏈基因座恒定區上游的人類VH、D與JH基因區段，其中該基因區段係操作性地接附至其恒定區，俾使該脊椎動物或細胞能夠表現包含人類VH域的免疫球蛋白重鏈，其中該重鏈基因座係包含人類01等位基因VH基因區段，該人類01等位基因VH基因區段能夠和人類D與JH基因區段重組，以製造VH域，或其中該細胞可發展成表現該重鏈可變域的脊椎動物。
一種非人類脊椎動物(譬如小鼠或大鼠)或脊椎動物細胞，其基因組係包含位於輕鏈基因座恒定區上游的VL與JL基因區段，其中該基因區段係操作性地接附至其恒 定區，俾使該脊椎動物或細胞能夠表現包含人類VL域的免疫球蛋白輕鏈，其中該輕鏈基因座係包含人類01等位基因VL基因區段，該人類01等位基因VL基因區段能夠和人類JL基因區段重組，以製造VL域，或其中該細胞可發展成表現該輕鏈可變域的脊椎動物。
任擇地，該脊椎動物或細胞具有包含上文定義之重鏈基因座與輕鏈基因座的基因組且因此包含一重鏈基因座，其包含能夠和人類D與JH基因區段重組以製造VH域的人類01等位基因VH基因區段，以及一輕鏈基因座，其包含能夠和人類JL基因區段重組以製造VL域的人類01等位基因VL基因區段。
在一另擇具體例中，本發明係關於一種非人類脊椎動物或脊椎動物細胞(譬如小鼠細胞或大鼠細胞)，其基因組係包含位於重鏈恒定區上游的一或多個人類VH基因區段、一或多個人類JH基因區段與一或多個人類D基因區段，其中該基因區段係操作性地接附至其恒定區，俾使該細胞或脊椎動物能夠製造抗體重鏈，或其中該細胞可發展成表現抗體重鏈的脊椎動物，其中該重鏈基因座的一或多個人類VH基因區段係包含一個、多個或所有人類VH基因區段或由一個、多個或所有人類VH基因區段構成，該基因區段係選自由下列構成之群組：VH3-23*04、VH7-4-1*01、VH4-4*02、VH1-3*01、VH3-13*01、VH3-7*01、VH3-20*d01與VH3-9*01。
在本發明一具體例中，該VH基因區段係選自由 下列構成之群組：VH3-23*04、VH7-4-1*01、VH4-4*02、VH1-3*01、VH3-13*01、VH3-7*01與VH3-20*d01。
就本發明的具體例而言，該具體例-舉例來說-僅定義人類重鏈基因區段，該輕鏈基因座可包含重排或未重排的VL與JL基因區段，譬如單一重排VJ(例如單一重排Vk1-39/J)。另外或另擇地，該輕鏈基因座可被任意嵌入。在另一具體例中，該VL與JL區段係位於內源性恒定輕基因區段上游。
在再一另擇具體例中，本發明係關於一種非人類脊椎動物或脊椎動物細胞(譬如小鼠細胞或大鼠細胞)，其基因組係包含位於輕鏈基因座恒定區上游的一或多個人類Jκ基因區段與一或多個人類Vκ基因區段，其中該基因區段係操作性地接附至其恒定區，俾使該細胞或脊椎動物能夠製造抗體輕鏈，或其中該細胞可發展成表現抗體輕鏈的脊椎動物，其中該一或多個人類Vκ基因區段係包含一個、多個或所有人類Vκ基因區段或由一個、多個或所有人類Vκ基因區段構成，該基因區段係選自由下列構成之群組：Vκ4-1*01、Vκ2-28*01、Vκ1D-13*d01、Vκ1-12*01、Vκ1D-12*02、Vκ3-20*01、Vκ1-17*01、Vκ1D-39*01、Vκ3-11*01、Vκ1D-16*01與Vκ1-9*d01。
在一另擇具體例中，本發明係關於一種非人類脊椎動物(譬如小鼠或大鼠)或脊椎動物細胞，其基因組係包含位於重鏈基因座恒定區上游的人類VH、D與JH基因區段，其中該JH基因區段係包含JH1*01、JH2*01、JH3*02、JH4*02、 JH5*02及/或JH6*01或JH6*02且該基因區段係操作性地接附至其恒定區，俾使該脊椎動物或細胞能夠表現包含人類VH域的免疫球蛋白重鏈，其中該重鏈基因座係包含人類VH基因區段，該人類VH基因區段能夠和人類D與該JH基因區段之一者重組，以製造VH域，或其中該細胞可發展成表現該重鏈可變域的脊椎動物。
在較佳具體例中，該JH基因區段為JH1*01、JH2*01、JH3*02、JH4*02、JH5*02與JH*02。在另一具體例中，該JH基因區段為JH1*01、JH2*01、JH3*02、JH4*02、JH5*02與JH*01。
在一具體例中，該非人類脊椎動物更包含來自表7的VH基因區段之一或多者及/或D基因區段之一或多者。在再一具體例中，該非人類脊椎動物更包含來自表3的VH基因區段與D基因區段。
一種非人類脊椎動物(譬如小鼠或大鼠)或脊椎動物細胞，其基因組係包含位於輕鏈基因座恒定區上游的VL與JL基因區段，其中該JL基因區段係包含Jκ1*01、Jκ2*01、Jκ3*01、Jκ4*01及/或Jκ5*01且該基因區段係操作性地接附至其恒定區，俾使該脊椎動物或細胞能夠表現包含人類VL域的免疫球蛋白輕鏈，其中該輕鏈基因座係包含人類VL基因區段，該人類VL基因區段能夠和該人類JL基因區段之一者重組，以製造VL域，或其中該細胞可發展成表現該輕鏈可變域的脊椎動物。
在一具體例中，該非人類脊椎動物更包含來自表 12的一或多個或所有Vκ基因區段。在再一具體例中，該非人類脊椎動物更包含來自表10或11的Vκ基因區段。
任擇地，該脊椎動物或細胞具有包含上文定義之該重鏈基因座與該輕鏈基因座的基因組且因此包含一重鏈基因座，其包含能夠和人類D與該JH基因區段之一者重組以製造VH域的人類VH基因區段，以及一輕鏈基因座，其包含能夠和該人類JL基因區段之一者重組以製造VL域的人類VL基因區段。
可設想到的是，在本發明的所有具體例中，根據本發明之細胞或脊椎動物的基因組可不包含一個、多個或所有人類(多個)基因區段的第二個人類等位基因。
在本發明的所有具體例中，該人類JH基因區段、D基因區段與VH基因區段可位於內源性重鏈基因座的恒定區上游及/或該人類Jκ基因區段與Vκ基因區段可位於內源性輕鏈基因座的恒定區上游。
在一具體例中，該內源性輕鏈基因座為內源性κ基因座，而在另一具體例中，其為內源性λ基因座。
等位基因組合
在一具體例中，該基因區段的等位基因為d01等位基因，任擇地為揭示於表7、表12或表18的d01等位基因。
在一具體例中，脊椎動物或細胞具有更包含揭示於表7、表12或表18的02、03、04、05、10、12、18或d03等位基因的基因組。
本發明的較佳等位基因列示於下表1至18：
在另擇的表1中，該JH6等位基因可為JH6*01。
在另擇的表2中，該JH6等位基因可為JH6*01。
在另擇的表3中，該JH6等位基因可為JH6*01。
在另擇的表4中，該JH6等位基因可為JH6*01。
在另擇的表5中，該JH6等位基因可為JH6*01。
表6：IgH等位基因#6-S6等位基因
在另擇的表6中，該JH6等位基因可為JH6*01。
在另擇的表7中，該JH6等位基因可為JH6*01。
在表12的一態樣中，沒有Vκ1D-39基因區段存在於該基因組內。
為免生疑，在本案-包括在請求項中-對表12的任何參照可解讀為帶有或不帶有下列限制：在表12的一態樣中，沒有Vκ1D-39基因區段存在於該基因組。
在另擇的表12中，該Vκ2D-26等位基因為Vκ2D-26*d02。
就表18而言，在一態樣中，沒有Cλ6或Jλ6基因區段存在於該基因組內。在另一態樣中，另外或另擇地，沒有Vλ3-22及/或Vλ5-39及/或Vλ10-54基因區段。
為免生疑，在本案-包括在請求項中-對表18的任何參照可解讀為帶有或不帶有下列限制：在表18的一態樣中，不存在Cλ6或Jλ6，以及帶有或不帶有下列限制：沒有Vλ3-22及/或Vλ5-39及/或Vλ10-54基因區段。
WO2013/041844的揭示內容以參照方式併入本案。WO2013/041844中的基因區段例子係明確地併入本案，正如明確且清楚地揭示於本案作為就本發明而言的可能基因區段並可能包括在本案一或多個請求項。
本案所述之各個態樣、具體例、項目或項次(provision)可視需要在揭示於WO2013/041844及/或說明於本案的能夠表現一或多個人類基因區段的非人類脊椎動物當中或揭示於WO2013/041844及/或說明於本案的一或多個人類基因區段重組的產物的結合部位或抗體當中合併。
WO2013/041844表1-7所揭示的基因區段係明確 清楚地揭示於本案作為就本發明而言的可能基因區段並可能包括在本案一或多個請求項。序列係列示於隨著該申請案提申的序列表中。
用於本發明上下文的基因區段序列的另外例子係列示於包括在說明尾聲的序列中。
在較佳具體例中，本發明脊椎動物或細胞的基因組係包含來自表1至18中任一者的一或多個基因區段。在再較佳具體例中，本發明脊椎動物或細胞的基因組係包含來自表1至18中任一者的任何兩個基因區段的組合。在又再一較佳具體例中，本發明脊椎動物或細胞的基因組係包含來自表1至18之任一者的任何三個基因區段的組合。
在最佳具體例中，本發明脊椎動物或細胞的基因組係包含來自表1至18中任一者的任何四個基因區段的組合。較佳地，VH與JH重鏈區段係選自表7且VL與JL輕鏈區段係選自表12或表18。任擇地，D重鏈區段係選自表7。
本發明再關於一種非人類脊椎動物(譬如小鼠或大鼠)或細胞，其基因組係包含位於內源性輕鏈基因座恒定區上游的人類VL與JL基因區段，其中該脊椎動物或細胞表現包含人類可變區的免疫球蛋白輕鏈，或其中該細胞可發展成表現該輕鏈的脊椎動物，其中該免疫球蛋白輕鏈係包含輕鏈，其包含衍生自下列之重組的人類可變區：(i)人類Vκ與Jκ基因區段，該基因區段係選自由表8至12中任一者的Vκ與Jκ基因區段構成之群組或(ii)人類Vλ與Jλ基因區段，該基因區段係選自由表12至18中任一者的Vλ與Jλ基因區段構成 之群組。
在一具體例中，本發明的脊椎動物或細胞表現包含人類λ可變區輕鏈且其中此類輕鏈的至少60%、70%、80%、85%、90%或95%可變區係衍生自人類Vλ與Jλ基因區段的重組。
任擇地，該輕鏈係表現為IgG抗體，舉例來說，IgG1或IgG2b，任擇地IgG2a。
該恒定區可為κ或λ恒定區；任擇地為人類、小鼠或大鼠恒定區。該內源性輕鏈基因座可為κ或λ基因座；任擇地，其中該基因組係包含位於內源性輕鏈基因座，舉例來說，κ基因座的至少表8的V與J基因區段及/或位於內源性輕鏈基因座，舉例來說，λ或κ基因座的至少表13的V與J基因區段。
該輕鏈可包含免疫球蛋白輕鏈，其包含衍生自(ii)之重組的人類可變區，各個此類可變區係和Cλ基因區段所編碼的恒定區表現，該基因區段係選自由表18的Cλ基因區段構成之群組。
在本發明此具體例中，該脊椎動物或細胞可表現包含人類λ可變區的輕鏈且此類輕鏈的至少60%、70%或80%可變區可衍生自人類Vλ與Jλ基因區段一舉例來說，表18所列的V與J區段-的重組。
一發明亦關於一種非人類脊椎動物(譬如小鼠或大鼠)或細胞，其基因組係包含位於內源性重鏈基因座恒定區上游的人類VH、D與JH基因區段，其中該脊椎動物或細 胞表現包含人類可變區的免疫球蛋白重鏈或該細胞可發展成表現該重鏈的脊椎動物，或其中該細胞可表現包含人類可變區的免疫球蛋白重鏈，其中該免疫球蛋白重鏈係包含重鏈，其包含衍生自(iii)人類VH、D與JH基因區段重組的人類可變區，該基因區段係選自由表7的VH、D與JH基因區段構成之群組。
在一具體例中，該輕鏈係和該重鏈共同表現，以形成抗體，譬如IgG抗體。
一種非人類脊椎動物(譬如小鼠或大鼠)或細胞，其基因組係包含藉由將人類Ig基因區段靶向插入一或多個內源性Ig基因座所製造的Ig基因區段匯集庫，該基因組包含位於恒定區上游的人類Vλ與Jλ基因區段，其中該人類Vλ與Jλ基因區段已藉由插入脊椎動物的內源性輕鏈基因座或細胞提供，其中該脊椎動物係包含含有λ可變區的免疫球蛋白輕鏈(λ輕鏈)或該細胞可發展成表現該免疫球蛋白輕鏈的脊椎動物，其中該λ輕鏈係包含含有衍生自人類Vλ與Jλ基因區段重組之λ可變區的免疫球蛋白輕鏈；其中該脊椎動物所表現的至少60%，70%，80%或90% λ輕鏈可變區係衍生自人類Vλ與Jλ基因區段的重組；任擇地，其中該脊椎動物或細胞為本案揭示的任何脊椎動物或細胞。
衍生自或製自人類基因區段重組的可變域或區在本案亦稱作該基因區段的重組體。
在重及/或輕基因座內的基因區段係操作性地接附至恒定區，俾使該脊椎動物能夠製造藉由該基因區段重 組所製造的抗體重鏈或輕鏈。
在一具體例中，該細胞或非人類脊椎動物具有包含表8、或表9或表10、表11或表12或彼等任何組合的κ區段的基因組。
在一具體例中，該細胞或非人類脊椎動物具有包含表13或表14或表15或表16或表17或表18、或彼等任何組合的λ區段的基因組。
在一具體例中，該細胞或非人類脊椎動物具有包含表1或表2或表3或表4或表5或表6或表7或彼等任何組合的重鏈區段的基因組。
在一具體例中，本發明的細胞或非人類脊椎動物可表現包含衍生自下列重組(即重組體)之人類可變區的輕鏈：(i)人類Vκ與Jκ基因區段，該基因區段係選自由表8、或表9、或表10、或表11或表12、或彼等任何組合的Vκ與Jκ基因區段構成之群組。
在一具體例中，本發明的細胞或非人類脊椎動物可表現包含衍生自下列重組(即重組體)之人類可變區的輕鏈：(ii)人類Vλ與Jλ基因區段，該基因區段係選自由表13或表14或表15或表16或表17或表18，或彼等任何組合的Vλ與Jλ基因區段構成之群組。
在一具體例中，本發明的細胞或脊椎動物可表現包含衍生自人類VH、D與JH基因區段重組(即重組體)之人類可變區的重鏈，該基因區段係選自由表1或表2、或表3、或表4或表5或表6或表7、或彼等任何組合的VH、D與JH基 因區段構成之群組。 本發明更包括下列項次
項次1-本發明的脊椎動物或細胞具有包含一或多個等位基因的基因組，該等位基因係選自表7中編號為1至68之等位基因。
項次2-如項次1之脊椎動物或細胞包含來自表1的1號等位基因以及選自表7中編號為2至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次3-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的2號等位基因以及選自表7中編號為3至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次4-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的3號等位基因以及選自表7中編號為4至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次5-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的4號等位基因以及選自表7中編號為5至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次6-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的5號等位基因以及選自表7中編號為6至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次7-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的6號等位基因以及選自表7中編號為7至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次8-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其 包含來自表7的7號等位基因以及選自表7中編號為8至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次9-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的8號等位基因以及選自表7中編號為9至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次10-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的9號等位基因以及選自表7中編號為10至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次11-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的10號等位基因以及選自表7中編號為11至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次12-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的11號等位基因以及選自表7中編號為12至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次13-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的12號等位基因以及選自表7中編號為13至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次14-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的13號等位基因以及選自表7中編號為14至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次15-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的14號等位基因以及選自表7中編號為15至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次16-如任何前述項次之脊椎動物或細胞， 其包含來自表7的15號等位基因以及選自表7中編號為16至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次17-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的16號等位基因以及選自表7中編號為17至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次18-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的17號等位基因以及選自表7中編號為18至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次19-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的18號等位基因以及選自表7中編號為19至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次20-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的19號等位基因以及選自表7中編號為20至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次21-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的20號等位基因以及選自表7中編號為21至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次22-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的21號等位基因以及選自表7中編號為22至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次23-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的22號等位基因以及選自表7中編號為23至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次24-如任何前述項次之脊椎動物或細胞， 其包含來自表7的23號等位基因以及選自表7中編號為24至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次25-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的24號等位基因以及選自表7中編號為25至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次26-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的25號等位基因以及選自表7中編號為26至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次27-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的26號等位基因以及選自表7中編號為27至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次28-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的27號等位基因以及選自表7中編號為28至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次29-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的28號等位基因以及選自表7中編號為29至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次30-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的29號等位基因以及選自表7中編號為30至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次31-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的30號等位基因以及選自表7中編號為31至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次32-如任何前述項次之脊椎動物或細胞， 其包含來自表7的31號等位基因以及選自表7中編號為32至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次33-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的32號等位基因以及選自表7中編號為33至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次34-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的33號等位基因以及選自表7中編號為34至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次35-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的34號等位基因以及選自表7中編號為35至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次36-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的35號等位基因以及選自表7中編號為36至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次37-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的36號等位基因以及選自表7中編號為37至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次38-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的37號等位基因以及選自表7中編號為38至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次39-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的38號等位基因以及選自表7中編號為39至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次40-如任何前述項次之脊椎動物或細胞， 其包含來自表7的39號等位基因以及選自表7中編號為40至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次41-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的40號等位基因以及選自表7中編號為41至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次42-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的41號等位基因以及選自表7中編號為42至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次43-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的42號等位基因以及選自表7中編號為43至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次44-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的43號等位基因以及選自表7中編號為44至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次45-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的44號等位基因以及選自表7中編號為45至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次46-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的45號等位基因以及選自表7中編號為46至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次47-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的46號等位基因以及選自表7中編號為47至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次48-如任何前述項次之脊椎動物或細胞， 其包含來自表7的47號等位基因以及選自表7中編號為48至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次49-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的48號等位基因以及選自表7中編號為49至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次50-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的49號等位基因以及選自表7中編號為50至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次51-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的50號等位基因以及選自表7中編號為51至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次52-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的51號等位基因以及選自表7中編號為52至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次53-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的52號等位基因以及選自表7中編號為53至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次54-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的53號等位基因以及選自表7中編號為54至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次55-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的54號等位基因以及選自表7中編號為55至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次56-如任何前述項次之脊椎動物或細胞， 其包含來自表7的56號等位基因以及選自表7中編號為57至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次57-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的57號等位基因以及選自表7中編號為58至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次58-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的58號等位基因以及選自表7中編號為59至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次59-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的59號等位基因以及選自表7中編號為60至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次60-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的60號等位基因以及選自表7中編號為61至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次61-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的61號等位基因以及選自表7中編號為62至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次62-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的62號等位基因以及選自表7中編號為63至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次63-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的63號等位基因以及選自表7中編號為64至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次64-如任何前述項次之脊椎動物或細胞， 其包含來自表7的64號等位基因以及選自表7中編號為65至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次65-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的65號等位基因以及選自表7中編號為66至68之等位基因的一或多個等位基因。
項次66-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的66號等位基因以及選自表7中編號為67或68之等位基因的一或多個等位基因。
項次67-如任何前述項次之脊椎動物或細胞，其包含來自表7的67號等位基因以及來自表7的68號等位基因。
在一例中，如任何前述項次之脊椎動物或細胞係包含來自表7的一或多個或所有JH等位基因，譬如JH2*02及/或至少JH6*02(其可用於製造供人類治療用途的長HCDR3 V域，如實施例所示)。
於是，表7中的各個等位基因和任何其他等位基因組合係明確地揭示於本案。
揭示了關於表12與表18的等位基因的相同組合結構。因此，揭示了表7中的各個等位基因和表12或表18中的任何其他等位基因組合，揭示了表12中的各個等位基因和表12中的其他每一個等位基因的組合，並揭示了表18中的等位基因和表18中的其他每一個等位基因的組合。
在一例中，如任何前述項次之脊椎動物或細胞係包含來自表12的一或多個或所有Jκ等位基因，譬如至少 Jκ2*01及/或Jκ4*01(其可用於製造供人類治療用途的Vκ域，如實施例所示)。
在一具體例中，本發明的細胞或脊椎動物具有包含基因區段VH3-23*04、JH2*01、VK4-1*01及/或JK2*01的基因組。
在再一具體例中，本發明的細胞或脊椎動物具有包含基因區段VH3-7*01、JH6*02、VK2-28*01及/或JK4*01的基因組。
在再一具體例中，本發明的細胞或脊椎動物具有包含基因區段VH7-4-1*01、JH6*02、VK2-28*01及/或JK4*01的基因組。任擇地，該基因組更包含D3-16*02。
在再一具體例中，本發明的細胞或脊椎動物具有包含基因區段VH4-4-1*02、JH6*02、VK1D-13*01及/或JK4*01的基因組。任擇地，該基因組更包含D3-10*01。
在再一具體例中，本發明的細胞或脊椎動物具有包含基因區段VH1-3*01、JH6*02、VK1-12*01及/或JK4*01的基因組。任擇地，該基因組更包含D3-10*01。
在再一具體例中，本發明的細胞或脊椎動物具有包含基因區段VH3-13*01、JH6*02、VK1D-12*02及/或JK4*01的基因組。任擇地，該基因組更包含D3-9*01。
在再一具體例中，本發明的細胞或脊椎動物具有包含基因區段VH4-4*02、JH6*02、VK1D-13*01及/或JK4*01的基因組。任擇地，該基因組更包含D3-10*01。
在再一具體例中，本發明的細胞或脊椎動物具有 包含基因區段VH3-13*01、JH6*02、VK3-20*01及/或JK4*01的基因組。任擇地，該基因組更包含D3-10*01。
在再一具體例中，本發明的細胞或脊椎動物具有包含基因區段VH3-23*04、JH6*02、VK1-17*01及/或JK4*01的基因組。任擇地，該基因組更包含D3-22*01。
在再一具體例中，本發明的細胞或脊椎動物具有包含基因區段VH3-7*01、JH6*02、VK1D-39*01及/或JK4*01的基因組。任擇地，該基因組更包含D3-9*01。
在再一具體例中，本發明的細胞或脊椎動物具有包含基因區段VH3-13*01、JH6*02、VK1D-39*01及/或JK4*01的基因組。任擇地，該基因組更包含D3-10*01。
在再一具體例中，本發明的細胞或脊椎動物具有包含基因區段VH3-13*01、JH6*02、VK3-11*01及/或JK4*01的基因組。任擇地，該基因組更包含D3-10*01。
在再一具體例中，本發明的細胞或脊椎動物具有包含基因區段VH4-4*02、JH6*02、VK1D-16*01及/或JK4*01的基因組。任擇地，該基因組更包含D3-9*01。
在再一具體例中，本發明的細胞或脊椎動物具有包含基因區段VH3-20*d01、JH6*02、VK1-9*d01及/或JK4*01的基因組。任擇地，該基因組更包含D3-10*01。
在再一具體例中，本發明的細胞或脊椎動物具有包含人類基因區段VH3-23*04的基因組。另外或另擇地，本發明的抗體重鏈可變域係由(i)人類VH3-23*04、D與JH區段所編碼。
在再一具體例中，本發明的細胞或脊椎動物具有包含人類基因區段VH3-9*01的基因組。另外或另擇地，本發明的抗體重鏈可變域係由(i)人類VH3-9*01、D與JH區段所編碼。
在再一具體例中，本發明的細胞或脊椎動物具有包含人類基因區段Vκ1-12*02或Vκ1D-12*02的基因組。另外或另擇地，本發明的抗體輕鏈可變域係由(i)人類Vκ1-12*02或Vκ1D-12*02與Jκ區段所編碼。
在再一具體例中，本發明的細胞或脊椎動物具有包含人類基因區段Vκ2-28*01的基因組。另外或另擇地，本發明的抗體輕鏈可變域係由(i)人類Vκ2-28*01與Jκ區段所編碼。
在再一具體例中，本發明的細胞或脊椎動物具有包含人類基因區段Vκ4-1*01的基因組。另外或另擇地，本發明的抗體輕鏈可變域係由(i)人類Vκ4-1*01與Jκ區段所編碼。在再一具體例中，本發明的細胞或脊椎動物具有包含上述基因區段和JH6*01取代JH6*02之組合的基因組。
在本案揭示的所有具體例中，該重鏈V與J區可任擇地彼此並和本案揭示的D區重組，以形成重鏈可變域。此外，該輕鏈V與J區可任擇地重組，以形成輕鏈可變域。
本發明延伸至包含製自或衍生自任何基因區段上述組合之重組的人類可變域的抗體或抗原結合片段。
根據本發明之抗體或片段在實施例中顯示有益於製造高效的基因區段體內重組作用，其展現接合突變與 體突變，並製造可以良好結合動力學特異性地結合抗原之域。
本發明係包括在本發明小鼠、哺乳動物或脊椎動物-免疫化之後-體內重組一或多個D基因區段、一或多個VH基因區段和人類JH基因區段JH2*01與JH*02之一或多者所獲得或可獲得的抗體或其抗原結合片段。
在一具體例中，本發明的細胞或脊椎動物可表現包含衍生自一或多個D基因區段、一或多個JH基因區段與下列VH基因區段VH3-20*d01、VH1-24*d01與VH2-26*d01之一或多者重組之人類可變區的重鏈。
因此，本發明係包括在本發明小鼠、哺乳動物或脊椎動物-免疫化之後-體內重組一或多個D基因區段、一或多個JH基因區段和人類VH基因區段VH3-20*d01、VH1-24*d01與VH2-26*d01之一或多者所獲得或可獲得的抗體或其抗原結合片段。
在再一具體例中，本發明的細胞或脊椎動物可另外或另擇地表現包含衍生自一或多個Jκ基因區段和人類Vκ基因區段Vκ5-2*d01、Vκ1-9*d01、Vκ1D-8*d01、Vκ3D-11*d01、Vκ1D-13*d01、Vκ3D-15*d01、Vκ2D-26*d01與Vκ2D-28*d01之一或多者重組或一或多個Jλ基因區段和人類Vλ基因區段Vλ2-22*d01、Vλ2-23*d02、Vλ3-25*d03與Vλ4-60*d03之一或多者重組的人類可變區的輕鏈。
因此，本發明係包括在本發明小鼠、哺乳動物或脊椎動物-免疫化之後-體內重組一或多個Jκ基因區段和 人類Vκ基因區段Vκ5-2*d01、Vκ1-9*d01、Vκ1D-8*d01、Vκ3D-11*d01、Vκ2D-26*d01與Vκ2D-28*d01之一或多者或是一或多個Jλ基因區段和人類Vλ基因區段Vλ2-22*d01、Vλ2-23*d02、Vλ3-25*d03與Vλ4-60*d03之一或多者所獲得或可獲得的抗體或其抗原結合片段。
在本發明所有態樣中，該細胞可為融合瘤細胞、B細胞，任擇地，永生化B細胞、或胚胎幹細胞。
在一具體例中，該脊椎動物或細胞係包含恒定區，其為κ或λ恒定區；任擇地小鼠或大鼠恒定區。在一具體例中，該恒定區可為人類恒定區。
在一具體例中，本案揭示的脊椎動物或細胞係包含內源性輕鏈基因座，其為κ或λ基因座；任擇地，其中該基因組係包含表8、9或10的位於內源性輕鏈基因座的至少V與J基因區段，譬如κ基因座及/或表13或14的位於內源性輕鏈基因座的至少V與J基因區段，譬如λ或κ基因座。
在一具體例中，本案揭示的脊椎動物或細胞係包含免疫球蛋白輕鏈，其包含衍生自人類Vλ與Jλ基因區段重組的人類可變區，該基因區段係選自由表18的Vλ與Jλ基因區段構成之群組，各個此類可變區係和Cλ基因區段所編碼的恒定區表現，該基因區段係選自由表18的Cλ基因區段構成之群組。
在一具體例中，該輕鏈係包含衍生自人類Vλ與Jλ基因區段重組的人類可變區，該基因區段係選自由下列構成之群組：表18的Vλ與Jλ基因區段。
在本發明所有具體例中，該VH與VL域可任擇地形成抗原結合部位。
本發明任何態樣的細胞可為融合瘤細胞或B細胞，任擇地，永生化B細胞。該細胞亦可為ES細胞。ES細胞可為至少90、150或多於200個細胞群體的一部分。在一例中，該細胞群體係載於一或多個多孔盤(譬如96-孔盤)上並可，舉例來說，為分級群體，其中單一細胞係包含在盤的不同個別孔中。任何態樣的脊椎動物可包含在包含經過濾之空氣，任擇地包含空氣過濾器的容器內。
在一具體例中，該容器內部環境為無菌，譬如儘可能使用標準動物容器，譬如TechniplastTM小鼠屋舍(http：//www.tecniplast.it/us/product/mouse-loft.html)。在一例中，該容器具有塑膠主體，譬如半透明或透明主體。
包含該脊椎動物的容器可具有不多於四、3、2或1公尺3的體積。該容器可包含複數隻脊椎動物，譬如雄性與雌性(譬如可孕對)。
在一具體例中，本發明的脊椎動物為至少3.5周齡，譬如4周、5周、6周、7周齡。
使用所主張的基因區段-明確地指示於表1-18-提供實施例可見得的優點。
本發明再關於一種製造抗體或其抗原結合片段的方法，該方法包含以抗原使本發明的脊椎動物免疫化並回收該抗體或片段或回收製造該抗體或片段的細胞；任擇地修飾單離抗體或片段，俾使其包含人類恒定區。
本發明亦包括一種製造抗體或其抗原結合片段的方法，該方法包含從本發明的細胞單離抗體或其抗原結合片段；以及任擇地修飾單離抗體或片段，俾使其包含人類恒定區。
重組體DNA技術可用於製造編碼經修飾抗體或片段的經修飾核苷酸序列。
該方法可包含(a)從該脊椎動物單離編碼結合該抗原之抗體的B-細胞，(b)辨識或複製編碼該抗體VH域的B-細胞的核苷酸序列及/或辨識或複製編碼該抗體VL域的B-細胞的核苷酸序列；以及(c)使用該(多個)序列製造包含該VH及/或VL域的單離抗體；任擇地，其中該單離抗體係包含人類恒定區。
本發明係包括一種製造完全人源化抗體的方法，該方法包含以特異性地和該抗原反應的抗體使本案揭示的脊椎動物免疫化且隨後適宜地藉由改造編碼該抗體的核酸將該非人類脊椎動物恒定區置換成人類恒定區。
本發明亦關於一種根據本案揭示的任何方法製造的人源化抗體及依此製造的人源化抗體用於醫藥的用途。
在再一具體例中，本發明係包括單離特異性地結合標靶抗原的IgG1、IgG2b及/或IgM抗體。
本發明的單離抗體可藉由選自CHO、HEK293、 Cos或酵母(譬如畢赤酵母屬(Picchia))細胞之宿主細胞表現製造。在較佳具體例中，該抗體為CHO細胞表現所製造的抗體。
在再一具體例中，單離抗體或片段可以稀釋劑、載劑、賦形劑或藥物調配，以製造用於人類醫藥用途的藥學組成物。任擇地，該調配抗體可包裝至無菌容器，舉例來說，瓶、管、IV袋或注射器，更任擇地製造一套組，該套組係包含結合該包裝及指示使用該用於人類醫藥用途之抗體組成物的標籤或說明；任擇地，其中該標籤或指示係包含醫藥品批次編號及/或上市許可編號，更任擇地EMA或FDA上市許可編號。在一例中，單離抗體(譬如由CHO細胞製造)(i)係以稀釋劑、載劑、賦形劑或藥物調配，以製造用於人類醫藥用途的藥學組成物，(ii)該調配抗體係包裝至無菌容器，該容器結合指示使用該用於人類醫藥用途之抗體組成物的標籤或說明；其中該標籤或說明係包含醫藥品批次編號及/或上市許可編號(譬如EMA或FDA上市許可編號)。在此類例子的具體例中，該抗體特異性地結合人類PCSK9且該用途係用於治療或預防人類的高脂血症或減少膽固醇。在此類例子的具體例中，該抗體特異性地結合人類IL6Ra且該用途係用於治療或預防人類的炎性病況或類風濕關節炎。在此類例子的具體例中，該抗體特異性地結合人類IL4Ra且該用途係用於治療或預防人類的異位性疾病、異位性皮膚炎或氣喘。
本發明係關於藉由本發明方法製造的抗體或片 段，該抗體或片段係用於人類醫藥用途，以及關於藉由本發明方法製造的單離抗體或片段的用途，該用途係製造用於人類醫藥用途的醫藥品。
該醫藥品可為本案揭示的組成物或套組。
本發明係包括抗體及其抗原結合片段，該抗體及其抗原結合片段包含製自或衍生自本案揭示的基因區段任何組合之重組的人類可變域，任擇地，其中該抗體與片段係藉由在本發明的小鼠、哺乳動物或其他脊椎動物-免疫化之後-體內重組獲得或可獲得。
在一具體例中，該細胞或脊椎動物所表現的免疫球蛋白重鏈基本上專一地包含人類可變區的重鏈；以及包含人類可變區的重鏈係表現為一部分的血清IgG抗體，任擇地，IgG1、IgG2a或IgG2b、或IgM抗體。
在一具體例中，本發明的細胞或脊椎動物表現包含本案所定義重鏈的IgG抗體，任擇地，IgG1、IgG2a或IgG2b抗體、或IgM抗體，其中該抗體特異地結合標靶抗原。本發明更關於：該抗體-任擇地，藉由本發明方法所製造-包含(a)人類重鏈可變域，其衍生自人類VH、D與JH基因區段的重組，該基因區段係選自由下列構成之群組：表1-7中任一表的VH、D與JH基因區段；以及(b)人類輕鏈可變域，其衍生自人類V與J基因區段的重組，該基因區段均選自表8-18中任一表的V與J基因區段。
一種單離抗體或其抗原結合片段，任擇地，其係 藉由本發明之方法獲得或可獲得，其中該抗體或片段的可變區係包含一或多個小鼠或大鼠激活誘導的去胺酶(AID)樣型體突變及/或小鼠或大鼠末端去氧核苷酸轉移酶(TdT)樣型接合突變。
根據本發明之可變重或輕域或區可包含至多10個，包括1、2、3、4、5、6、7、8、或9個接合突變。
在再一具體例中，根據本發明之可變重或輕域或區可另外或另擇地包含至多9個，包括1、2、3、4、5、6、7、8、或8個，包括1、2、3、4、5、6或7個，體突變。
在再一具體例中，本發明係包括一種單離抗體或其抗原結合片段，任擇地，其係藉由本發明之方法獲得或可獲得，該單離抗體或其抗原結合片段結合γ受體，再任擇地，人類恒定輕鏈。在一具體例中，該Fc係包含人類γ恒定域，譬如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定域。
一種單離抗體或其抗原結合片段，任擇地，其係藉由本發明之方法獲得或可獲得，其中該抗體係包含CHO、HEK293、Cos或酵母(譬如畢赤酵母屬)細胞醣化。
本發明之抗體或片段可特異性地結合人類酶。
本發明之抗體或片段可特異性地結合人類標靶：前體蛋白轉化酶PC9、前體蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶科信素-9(kexin-9)(PCSK9)、CD126、IL-4、IL-4受體、IL-6、IL-6受體、IL-13、IL-18受體、Erbb3、細胞ASIC1、ANG2、GDF-8、血管生成素配體-2、δ樣蛋白質配體4、免疫球蛋白G1、PDGF配體、PDGF受體或NGF受體、困難梭狀芽孢桿 菌(Clostridium difficile)的毒素A或毒素B、鬆弛素、CD48、Cd20、升糖素受體、蛋白酶激活受體2、TNF樣配體1A(TL1A)、血管生成素相關-2(AR-2)、血管生成素樣蛋白質4、RANKL、血管生成素樣蛋白質3(ANGPTL3)、δ樣配體4(DLL4)、大型內皮素-1(ET-1)、活化素A、受體酪胺酸激酶，舉例來說，人類AR-1及帶有Ig與EGF同源域(TIE)或TIE-2受體的酪胺酸激酶。在一例中，該標靶為PCSK9。在一例中，該標靶為IL-6受體(譬如IL6Ra)。在一例中，該標靶為IL-4受體(譬如IL4Ra)。
本發明的較佳態樣包括：該抗體或其片段用於製造醫藥品的用途，該醫藥品係用於減緩或抑制人類IL-4Ra-中介的疾病或病症。本發明之配體、抗體或片段所治療的IL-4Ra-中介或相關病症包括，舉例來說，關節炎(包括膿毒性關節炎)、皰疹、慢性特發性蕁麻疹、硬皮病、肥厚性瘢痕、惠普爾症(Whipple's disease)、良性前列腺增生；肺部病症，例如輕度、中度或重度氣喘，炎性病症，例如炎性腸道疾病；過敏反應、川崎症(Kawasaki disease)、鐮刀細胞疾病、過敏性肉芽腫(Churg-Strauss syndrome)、葛瑞夫茲氏症(Grave's disease)、先兆子癇、斯耶格倫氏症候群(Sjogren's syndrome)、自體免疫淋巴細胞增生症候群、自體免疫溶血性貧血、巴瑞氏食道症(Barrett's esophagus)、自體免疫葡萄膜炎、以及腎病變。
本發明之配體、抗體或片段所治療的另外IL-4Ra-中介或相關病症包括，舉例來說，氣喘、COPD(譬 如慢性支氣管炎、呼吸道末梢疾病或肺氣腫)、炎性腸道疾病、纖維變性病況(譬如全身性硬化症、肺纖維變性、寄生蟲引起的肝纖維變性、囊性纖維變性)、過敏(舉例來說異位性皮膚炎、塵蟎過敏、寵物過敏或食物過敏)、避免移植排斥的移植療法、壓制遲發型超敏或接觸性超敏反應，作為過敏免疫療法佐劑或作為疫苗佐劑。
本發明又涵蓋的是該抗體或其片段用於製造預防或治療IL-4Ra-中介或相關病症之醫藥品的用途，其中該疾病或病況為炎性疾病或病況；異位性疾病或病況；呼吸疾病或病況；與IgE提升有關的疾病或病況；或與IL-4及/或IL-13活性提升有關的與疾病或病況。
本發明又涵蓋的是該抗體或其片段用於製造預防或治療IL-4Ra-中介或相關疾病或病況之醫藥品的用途，其中該疾病或病況係選自由下列構成之群組：呼吸道炎性疾病或病況、慢性阻塞性肺病、氣喘、肺炎、過敏性肺炎、肺部浸潤伴隨嗜酸細胞增多、環境肺病、肺炎、支氣管擴張、囊性纖維變性、間質性肺病、原發性肺高壓、肺血栓栓塞症、胸膜病症、縱膈腔病症、隔膜病症、換氣不足、換氣過度、睡眠呼吸暫停、急性呼吸窘迫症候群、間皮瘤、肉瘤、移植物排斥、移植物抗宿主疾病、肺癌、過敏性鼻炎、過敏、石棉肺、麴菌瘤、麴菌病、支氣管擴張、慢性支氣管炎、肺氣腫、嗜酸細胞性肺炎、特發性肺纖維變性、侵襲性肺炎球菌疾病、流感、非結核性分枝桿菌、胸腔積液、塵肺症、肺囊蟲、肺炎、肺放線菌病、肺泡蛋白沉積 症、肺炭疽、肺水腫、肺栓塞、肺部炎症、肺部組織細胞增生症X、肺高壓、肺奴卡菌症(pulmonary nocardiosis)、肺結核、肺靜脈閉塞症、類風濕肺病、結節病、以及韋格納肉芽腫病(Wegener's granulomatosis)。
本發明又涵蓋的是一種抗-IL-4Ra抗體或其片段，如本案所揭示，其係用於預防或治療本案揭示的任何疾病或病症。
本發明又涵蓋的是抗-IL-4Ra抗體或其片段用於本案所揭示疾病或病症之醫學治療方法的用途。
本發明又涵蓋的是本發明的配體、抗體或片段用於製造醫藥品的用途，該醫藥品係用於減緩或抑制人類PCSK9-中介的疾病或病症。此類疾病或病況的非設限例子可包括，舉例來說，脂質病症、高脂蛋白血症、高脂血症；血脂異常；高膽固醇血症、心臟病發作、中風、冠狀動脈心臟病、動脈粥樣硬化、周邊血管疾病、跛行、第II型糖尿病、高血壓、以及心血管疾病或病況。
本發明又涵蓋的是一種抗-PCSK9抗體或其片段，如本案所揭示，其係用於預防或治療本案揭示的任何疾病或病症。
本發明又涵蓋的是抗-PSCK9抗體或其片段用於本案所揭示疾病或病症之醫學治療方法的用途。
本發明又涵蓋的是本發明之配體、抗體或片段用於製造醫藥品的用途，該醫藥品係用於減緩或抑制人類IL-6Ra-中介的疾病或病症。
該IL-6Ra-中介的疾病或病況可為炎性疾病或病況。該IL-6Ra-中介的疾病或病況可選自由下列構成之群組：炎性腸道疾病(IBD)、克隆氏症、類風濕關節炎、銀屑病、細支氣管炎、牙齦炎、移植排斥、同種異體移植排斥、移植物抗宿主疾病(GvHD)、氣喘、成人呼吸窘迫症候群(ARDS)、膿毒性休克、潰瘍性結腸炎、斯耶格倫氏症候群、呼吸道發炎、卡爾斯曼症(Castleman’s disease)、牙周炎、異位性皮膚炎、全身性紅斑狼瘡以及冠狀動脈心臟病。
本發明又涵蓋的是一種抗-IL-6Ra抗體或其片段，如本案所揭示，其係用於預防或治療本案揭示的任何疾病或病症。
本發明又涵蓋的是抗-IL-6Ra抗體或其片段用於本案所揭示疾病或病症之醫學治療方法的用途。
在再一具體例中，本發明係關於下列態樣：
1.一種非人類脊椎動物或脊椎動物細胞(譬如小鼠或大鼠)，其基因組係包含位於內源性重鏈基因座恒定區上游的人類JH2*01及/或人類JH6*02、一或多個人類VH基因區段與一或多個人類D基因區段及/或位於內源性輕鏈基因座恒定區上游的人類Jκ2*01及/或人類Jκ4*01與一或多個人類Vκ基因區段，其中在各基因座內的該基因區段係操作性地接附至其恒定區，俾使該細胞或脊椎動物能夠製造抗體重鏈與抗體輕鏈，或其中該細胞可發展成表現抗體重鏈與抗體輕鏈的脊椎動物，其中該重鏈係藉由人類JH2*01及/或JH6*02區段和D區段與VH區段之重組所製造及/或抗體輕鏈係藉 由人類Jκ2*01及/或Jκ4*01區段和Vκ區段之重組所製造
其中該重鏈基因座的一或多個人類VH基因區段係包含一個、多個或所有人類VH基因區段或由一個、多個或所有人類VH基因區段構成，該基因區段係選自由下列構成之群組：VH3-23*04、VH7-4-1*01、VH4-4*02、VH1-3*01、VH3-13*01、VH3-7*01與VH3-20*d01
或其中該一或多個人類Vκ基因區段係包含一個、多個或所有人類VH基因區段或由一個、多個或所有人類VH基因區段構成，該基因區段係選自由下列構成之群組：Vκ4-1*01、Vκ2-28*01、Vκ1D-13*d01、Vκ1-12*01、Vκ1D-12*02、Vκ3-20*01、Vκ1-17*01、Vκ1D-39*01、Vκ3-11*01、Vκ1D-16*01與Vκ1-9*d01。
任擇地，該人類基因區段為包括相對於生殖系人類基因區段序列之一或多個突變的基因區段的重組形式。
2.如態樣1之細胞或脊椎動物，其中該基因組係包含位於內源性重鏈基因座恒定區上游的人類JH2*01及/或人類JH6*02、一或多個人類VH基因區段與一或多個人類D基因區段及或位於內源性輕鏈基因座恒定區上游的人類Jκ2*01及/或人類Jκ4*01與一或多個人類Vκ基因區段。
3.如態樣2之細胞或脊椎動物，其中該重鏈基因座的一或多個人類VH基因區段係包含一個、多個或所有人類VH基因區段或由一個、多個或所有人類VH基因區段構成，該基因區段係選自由下列構成之群組：VH3-23*04、 VH7-4-1*01、VH4-4*02、VH1-3*01、VH3-13*01、VH3-7*01與VH3-20*d01且其中該一或多個人類Vκ基因區段係包含一個、多個或所有人類VH基因區段或由一個、多個或所有人類VH基因區段構成，該基因區段係選自由下列構成之群組：Vκ4-1*01、Vκ2-28*01、Vκ1D-13*d01、Vκ1-12*01、Vκ1D-12*02、Vκ3-20*01、Vκ1-17*01、Vκ1D-39*01、Vκ3-11*01、Vκ1D-16*01與Vκ1-9*d01。
4 如態樣1-3之細胞或脊椎動物，其中該基因組係包含VH3-23*04，任擇地，其中該重鏈係藉由人類JH區段和D區段與該VH區段之重組所製造。
5 如態樣1-4之細胞或脊椎動物，其中該基因組係包含Vκ4-1*01，任擇地，其中該重鏈係藉由人類JH區段和D區段與該VH區段之重組所製造。
6 如態樣1-5之細胞或脊椎動物，其中該基因組係包含Vκ2-28*01，任擇地，其中該重鏈係藉由人類JH區段和D區段與該VH區段之重組所製造。
7 如態樣1-6之細胞或脊椎動物，其中該基因組係包含Vκ1-12*01，任擇地，其中該重鏈係藉由人類JH區段和D區段與該VH區段之重組所製造。
8 如態樣1-7之細胞或脊椎動物，其中該基因組係包含JH2*01與Jκ2*01。
9 如態樣1-8之細胞或脊椎動物，其中該基因組係包含JH6*02與Jκ4*01。
10 如態樣1-9之細胞或脊椎動物，其中該重鏈基 因座係包含VH3-23*04和JH2*01重組；或VH3-7*01和JH6*02重組。
11.如態樣1-10之細胞或脊椎動物，其中該輕鏈基因座係包含Vκ4-1*01和Jκ2*01重組；或Vκ2-28*01和Jκ4*01重組。
12.如任何前述態樣之細胞或脊椎動物，其中該基因組係包含VH3-23*04、JH2*01(任擇地和VH3-23*04重組)、Vκ4-1*01與Jκ2*01(任擇地和Vκ4-1*01重組)。
13 如任何前述態樣之細胞或脊椎動物，其中該基因組係包含VH3-7*01、JH6*02(任擇地和VH3-7*01重組)、Vκ2-28*01與Jκ4*01(任擇地和Vκ2-28*01重組)。
14 如任何前述態樣之細胞或脊椎動物，該重鏈基因座更包含來自表7的一或多個額外重鏈基因區段。
15 如任何前述態樣之細胞或脊椎動物，該重鏈基因座包含表1的所有基因區段、表2的所有基因區段、表3的所有基因區段、表4的所有基因區段、表5的所有基因區段、表6的所有基因區段或表7的所有基因區段。
16 如任何前述態樣之細胞或脊椎動物，該輕鏈基因座更包含來自表12的一或多個額外輕鏈區段。
17 如任何前述態樣之細胞或脊椎動物，該輕鏈基因座包含表8的所有基因區段、表9的所有基因區段、表10的所有基因區段、表11的所有基因區段或表12的所有基因區段。
18如任何前述態樣之細胞或脊椎動物，其中該細 胞為融合瘤或B-細胞(譬如永生化B細胞)。
19如任何前述態樣之脊椎動物或細胞，其中該小鼠所表現的免疫球蛋白重鏈基本上專一地包含人類可變區的重鏈；以及包含人類可變區的重鏈係表現為一部分的血清IgG1、IgG2b與IgM(以及任擇地，IgG2a)抗體。
20 一種製造抗體或其抗原結合片段的方法，該方法包含以抗原使態樣1至19之脊椎動物免疫化並回收該抗體或片段或回收製造該抗體或片段的細胞；任擇地修飾所製造的抗體或片段，俾使其包含人類恒定區，其中該抗體的可變域係由下列編碼人類基因區段JH2*01或JH6*02與一或多個人類VH基因區段與一或多個人類D基因區段；其中該人類VH基因區段係選自由下列構成之群組：VH3-23*04、VH7-4-1*01、VH4-4*02、VH1-3*01、VH3-13*01、VH3-7*01與VH3-20*d01,以及(b)人類基因區段Jκ2*01或Jκ4*01與一或多個人類Vκ基因區段，其中該人類Vk基因區段係選自由下列構成之群組：Vκ4-1*01、Vκ2-28*01、Vκ1D-13*d01、Vκ1-12*01、Vκ1D-12*02、Vκ3-20*01、Vκ1-17*01、Vκ1D-39*01、Vκ3-11*01、Vκ1D-16*01與Vκ1-9*d01。
21 如態樣20之方法，其中該抗原為多重次單元人類蛋白質、細菌細胞毒素或表現為人類細胞上的跨膜蛋 白質的蛋白質。
22 一種製造抗體或其抗原結合片段的方法，該方法包含從如態樣1至20中任一態樣之細胞單離抗體或其抗原結合片段；以及任擇地修飾單離抗體或片段，俾使其包含人類恒定區。
23 如態樣20之方法，更包含(a)從該脊椎動物單離編碼結合該抗原之抗體的B-細胞，(b)辨識或複製編碼該抗體VH域的B-細胞的核苷酸序列及/或辨識或複製編碼該抗體VL域的B-細胞的核苷酸序列；以及(c)使用該(多個)序列製造包含該VH及/或VL域的單離抗體或片段；任擇地，其中該單離抗體或片段係包含人類恒定區。
24 如態樣20-23中任一態樣之方法，其中該抗體或片段係藉由選自CHO、HEK293、Cos或酵母(譬如畢赤酵母屬)細胞之宿主細胞表現所製造。
25 如態樣24之方法，其中該抗體或片段係藉由CHO細胞表現所製造。
26 如態樣20-25中任一態樣之方法，該方法更包含以稀釋劑、載劑、賦形劑或藥物調配該抗體或片段，以製造用於人類醫藥用途的藥學組成物，該方法任擇地更包含將該組成物包裝至無菌容器，舉例來說，瓶、管、IV袋或注射器，更任擇地製造一套組，該套組係包含結合該包 裝及指示使用該用於人類醫藥用途之抗體組成物的標籤或說明；任擇地，其中該標籤或指示係包含醫藥品批次編號及/或上市許可編號，更任擇地，EMA或FDA上市許可編號。
27 如態樣20-26中任一態樣之方法，其中該脊椎動物係如態樣1-19中任一態樣之方法且藉由該方法製造的抗體或片段係包含(a)人類重鏈可變域，為人類JH2*01或人類JH6*02、一或多個人類VH基因區段與一或多個人類D基因區段的重組體；以及(b)人類輕鏈可變域，為人類JK2*01或人類JK4*01與一或多個人類Vκ基因區段的重組體。
28 如態樣27之方法，藉由該方法所製造的抗體或片段係包含VH3-23*04與JH2*01的人類重鏈可變域重組體以及Vκ4-1*01與Jκ2*01的人類輕鏈可變域重組體。
29 如態樣27之方法，其中藉由該方法所製造的抗體或片段係包含VH3-7*01與JH*02的人類重鏈可變域重組體以及Vκ2-28*01與Jκ4*01的人類輕鏈可變域重組體。
30 一種單離抗體或片段或套組，其藉由如態樣20-29中任一態樣的方法所製造。
31 一種單離抗體或其抗原結合片段或套組，其藉由如態樣20-29中任一態樣的方法所製造，其中該抗體係經人源化。
32 一種組成物，其包含藉由如態樣20-29之方法 所製造的抗體或片段或套組，其中該抗體或片段為唯一治療劑。
33 一種組成物，其包含藉由如態樣20-29之方法所製造的抗體或片段或套組，該組成物更包含額外的治療劑，舉例來說，抗高膽固醇血症藥物。
34 一種用於人類醫藥用途的單離抗體或片段或套組，其係藉由如態樣20-29中任一態樣之方法所製造。
35 一種藉由如態樣20-29中任一態樣之方法所製造的單離抗體或片段的用途，該用途係製造用於人類醫藥用途之醫藥品。
36 如態樣35之用途，其中該醫藥品係包含在如態樣26所列示的組成物或套組內。
37 如態樣30-34之單離抗體或片段或套組、或如態樣35-36之用途，其可特異性地結合選自下列的人類標靶：前體蛋白轉化酶PC9、前體蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶科信素-9(PCSK9)、CD126、IL-4、IL-4受體、IL-6、IL-6受體、IL-13、IL-18受體、Erbb3、細胞ASIC1、ANG2、GDF-8、血管生成素配體-2、δ樣蛋白質配體4、免疫球蛋白G1、PDGF配體、PDGF受體或NGF受體、困難梭狀芽孢桿菌的毒素A或毒素B、鬆弛素、CD48、Cd20、升糖素受體、蛋白酶激活受體2、TNF樣配體1A(TL1A)、血管生成素相關-2(AR-2)、血管生成素樣蛋白質4、RANKL、血管生成素樣蛋白質3(ANGPTL3)、δ樣配體4(DLL4)、大型內皮素-1(ET-1)、活化素A、受體酪胺酸激酶，舉例來說，人類AR-1及帶有Ig 與EGF同源域(TIE)和TIE-2受體的酪胺酸激酶。
38 如態樣30-34之單離抗體或片段或套組、或如態樣35-36之用途，其係用於治療對彼等有所需求的人類，其中該治療係包含輸送有效量之抗體或片段，該抗體或片段係特異性地結合至病毒或選自人類細胞介質、生長因子、激素、酶與血清蛋白之抗原。
39 一種宿主細胞，舉例來說，CHO、HEK293、Cos或酵母(譬如畢赤酵母屬)細胞，該宿主細胞表現藉由如態樣20-29中任一態樣之方法所製造的抗體或片段。
在上述態樣中，JH6*02可置換成JH6*01。在再一態樣中，本發明係包括下列項目：
項目
1.一種非人類脊椎動物細胞(譬如小鼠細胞或大鼠細胞)，其基因組係包含位於內源性重鏈基因座恒定區上游的人類JH2*01及/或人類JH6*02、一或多個人類VH基因區段與一或多個人類D基因區段以及位於內源性輕鏈基因座恒定區上游的人類Jκ2*01及/或人類Jκ4*01與一或多個人類Vκ基因區段，其中在各基因座內的該基因區段係操作性地接附至其恒定區，俾使該細胞能夠製造抗體重鏈與抗體輕鏈，或其中該細胞可發展成表現抗體重鏈與抗體輕鏈的脊椎動物，其中該重鏈係藉由人類JH2*01及/或JH6*02區段和D區段與VH區段之重組所製造以及該輕鏈係藉由人類Jκ2*01及/或Jκ4*01區段和Vκ區段之重組所製造。
2.一種非人類脊椎動物(譬如小鼠或大鼠)，其基 因組係包含位於內源性重鏈基因座恒定區上游的人類JH2*01及/或人類JH6*02、一或多個人類VH基因區段與一或多個人類D基因區段以及位於內源性輕鏈基因座恒定區上游的人類Jκ2*01及/或人類Jκ4*01與一或多個人類Vκ基因區段，其中在各基因座內的該基因區段係操作性地接附至其恒定區，俾使該脊椎動物能夠製造抗體重鏈與抗體輕鏈，其中該重鏈係藉由人類JH2*01及/或JH6*02區段和D區段與VH區段之重組所製造以及該抗體輕鏈係藉由人類Jκ2*01及/或Jκ4*01區段和Vκ區段之重組所製造。
3.如項目1之細胞或如項目2之脊椎動物，其中該基因組係包含JH2*01與Jκ2*01。
4.如項目1或3之細胞或如項目2或3之脊椎動物，其中該基因組係包含JH6*02與Jκ4*01。
5.如任何前述項目之細胞或脊椎動物，其中該重鏈基因座的一或多個人類VH基因區段係包含一個、多個或所有人類VH基因區段或由一個、多個或所有人類VH基因區段構成，該基因區段係選自由下列構成之群組：VH3-23*04、VH7-4-1*01、VH4-4*02、VH1-3*01、VH3-13*01、VH3-7*01與VH3-20*d01。
6.如項目5之細胞或脊椎動物，其中該重鏈基因座係包含VH3-23*04和JH2*01重組；或VH3-7*01和JH6*02重組。
7.如任何前述項目之細胞或脊椎動物，其中該一或多個人類Vκ基因區段係包含一個、多個或所有人類VH 基因區段或由一個、多個或所有人類VH基因區段構成，該基因區段係選自由下列構成之群組：Vκ4-1*01、Vκ2-28*01、Vκ1D-13*d01、Vκ1-12*01、Vκ1D-12*02、Vκ3-20*01、Vκ1-17*01、Vκ1D-39*01、Vκ3-11*01、Vκ1D-16*01與Vκ1-9*d01。
8.如項目5之細胞或脊椎動物，其中該輕鏈基因座係包含Vκ4-1*01和Jκ2*01重組；或Vκ2-28*01和Jκ4*01重組。
9.如任何前述項目之細胞或脊椎動物，其中該基因組係包含VH3-23*04、JH2*01(任擇地和VH3-23*04重組)、Vκ4-1*01與Jκ2*01(任擇地和Vκ4-1*01重組)。
10.如任何前述項目之細胞或脊椎動物，其中該基因組係包含VH3-7*01、JH6*02(任擇地和VH3-7*01重組)、Vκ2-28*01與Jκ4*01(任擇地和Vκ2-28*01重組)。
11.如任何前述項目之細胞或脊椎動物，該重鏈基因座更包含來自表7的一或多個額外的重鏈基因區段。
12.如任何前述項目之細胞或脊椎動物，該重鏈基因座包含表1的所有基因區段、表2的所有基因區段、表3的所有基因區段、表4的所有基因區段、表5的所有基因區段、表6的所有基因區段或表7的所有基因區段。
13.如任何前述項目之細胞或脊椎動物，該輕鏈基因座更包含來自表12的一或多個額外的輕鏈區段。
14.如任何前述項目之細胞或脊椎動物，該輕鏈基因座包含表8的所有基因區段、表9的所有基因區段、表 10的所有基因區段、表11的所有基因區段或表12的所有基因區段。
15.如任何前述項目之細胞或脊椎動物，其中該細胞為融合瘤或B-細胞(譬如永生化B細胞)。
16.如任何前述項目之脊椎動物或細胞，其中該小鼠所表現的免疫球蛋白重鏈基本上專一地包含人類可變區的重鏈；以及包含人類可變區的重鏈係表現為一部分的血清IgG1、IgG2b與IgM(以及任擇地，IgG2a)抗體。
17.一種製造抗體或其抗原結合片段的方法，該方法包含以抗原使如項目2至16之脊椎動物免疫化並回收該抗體或片段或回收製造該抗體或片段的細胞；任擇地修飾所製造的抗體或片段，俾使其包含人類恒定區。
18.一種製造抗體或其抗原結合片段的方法，該方法包含從如項目1與3至16中任一項目之細胞單離抗體或其抗原結合片段；以及任擇地修飾單離抗體或片段，俾使其包含人類恒定區。
19.如項目17或項目18之方法，該方法更包含(a)從該脊椎動物單離編碼結合該抗原之抗體的B-細胞，(b)辨識或複製編碼該抗體VH域的B-細胞的核苷酸序列及/或辨識或複製編碼該抗體VL域的B-細胞的核苷酸序列；以及(c)使用該(多個)序列製造包含該VH及/或VL域的單離抗體或片段；任擇地，其中該單離抗體或片段係包含人類 恒定區。
20.如項目17-19中任一項目之方法，其中該抗體或片段係藉由選自CHO、HEK293、Cos或酵母(譬如畢赤酵母屬)細胞之宿主細胞表現所製造。
21.如項目17-20中任一項目之方法，該方法更包含以稀釋劑、載劑、賦形劑或藥物調配該抗體或片段，以製造用於人類醫藥用途的藥學組成物，該方法任擇地更包含將該組成物包裝至無菌容器，舉例來說，瓶、管、IV袋或注射器，更任擇地製造一套組，該套組係包含結合該包裝及指示使用該用於人類醫藥用途之抗體組成物的標籤或說明；任擇地，其中該標籤或指示係包含醫藥品批次編號及/或上市許可編號，更任擇地，EMA或FDA上市許可編號。
22.如項目17-21中任一項目之方法，其中該脊椎動物係如項目2至16中任一項且藉由該方法所製造的抗體或片段係包含(a)人類重鏈可變域為人類JH2*01或人類JH6*02、一或多個人類VH基因區段與一或多個人類D基因區段的重組體；以及(b)人類輕鏈可變域為人類JK2*01或人類JK4*01與一或多個人類Vκ基因區段的重組體。
23.如項目22之方法，其中藉由該方法所製造的抗體或片段係包含VH3-23*04與JH2*01的人類重鏈可變域重組體以及Vκ4-1*01與Jκ2*01的人類輕鏈可變域重組體。
24.如項目22之方法，其中藉由該方法所製造的抗體或片段係包含VH3-7*01與JH*02的人類重鏈可變域重組體以及Vκ2-28*01與Jκ4*01的人類輕鏈可變域重組體。
25.一種藉由如項目17-24中任一項目之方法獲得或可獲得的單離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或片段的重鏈及/或輕鏈可變域係包含一或多個小鼠或大鼠激活誘導的去胺酶(AID)樣型體突變及/或小鼠或大鼠末端去氧核苷酸轉移酶(TdT)樣型接合突變。
26.一種藉由如項目17-24中任一項目之方法獲得或可獲得的單離抗體或其抗原結合片段，或如項目25之抗體，該等包含任擇地結合γ受體的人類重鏈Fc片段，再任擇地，人類恒定輕鏈。
27.一種藉由如項目17-24中任一項目之方法獲得或可獲得的單離抗體或其抗原結合片段，或如項目25或項目26之抗體，該等包含抗原結合部位，其能夠特異性地結合至病毒或選自人類細胞介質、生長因子、激素、酶與血清蛋白之抗原。
28.一種藉由如項目17-24中任一項目之方法獲得或可獲得的單離抗體或其抗原結合片段，或如項目25-27中任一項目之抗體，其中該抗體或片段係經醣化，任擇地包含CHO、HEK293、Cos或酵母(譬如畢赤酵母屬)細胞醣化作用。
29.一種單離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體的可變域係由下列編碼 (a)人類基因區段JH2*01或JH6*02與一或多個人類VH基因區段與一或多個人類D基因區段；以及(b)人類基因區段Jκ2*01或Jκ4*01與一或多個人類Vκ基因區段。
30.如項目29之抗體，其中該可變域係由下列人類基因區段編碼：(i)就VH域而言，JH2*01與VH3-23*04以及(ii)就VL域而言，Vκ4-1*01與Jκ2*01。
31.如項目29之抗體，其中該可變域係由下列人類基因區段編碼：(i)就VH域而言，JH6*02與VH3-7*01以及(ii)就VL域而言，Vκ2-28*01與Jκ4*01。
32.如項目25-31中任一項目之單離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體係經人源化。
33.一種組成物，其包含如項目25-32中任一項目之抗體或片段，其中該抗體或片段為唯一治療劑。
34.一種組成物，其包含如項目25-32中任一項目之抗體或片段，該組成物更包含額外的治療劑，舉例來說，抗高膽固醇血症藥物。
35.一種藉由如項目17-24中任一項目之方法所製造的單離抗體或片段或如項目25至34中任一項之單離抗體或片段，其係用於人類醫藥用途。
36.一種藉由如項目17-24中任一項目之方法所製造的單離抗體或片段或如項目25至34中任一項目之單離抗體或片段的用途，該用途係製造用於人類醫藥用途之醫藥品。
37.如項目36之用途，其中該醫藥品係包含在如項目21所列示的組成物或套組內。
38.一種醫學治療方法，該方法包含輸送有效量的如項目25-34之單離抗體或其片段至對彼等有需求的人類。
39.一種宿主細胞，舉例來說，CHO、HEK293、Cos或酵母(譬如畢赤酵母屬)細胞，該宿主細胞表現如項目25-34中任一項目所定義的抗體或片段。
在上述項目中、JH6*02可置換成JH6*01。在再一態樣中，本發明係包括下列項次：
1.一種非人類脊椎動物(譬如小鼠或大鼠)細胞，其基因組係包含位於內源性重鏈基因座恒定區上游的人類VH、D與JH基因區段以及位於內源性輕鏈基因座恒定區上游的人類VL與JL基因區段，其中該基因區段係操作性地接附至其恒定區，俾使該細胞能夠表現分別包含人類VH與VL域的免疫球蛋白重鏈與輕鏈，其中該重鏈基因座係包含人類01等位基因VH基因區段，該人類01等位基因VH基因區段能夠和人類D與JH基因區段重組，以製造VH域，其中該輕鏈基因座係包含人類01等位基因VL基因區段，該人類01等位基因VL基因區段能夠和人類JL基因區段重組，以製造VL域，或其中該細胞可發展成表現該VH與VL域的脊椎動物。
2.一種非人類脊椎動物(譬如小鼠或大鼠)，其基因組係包含位於內源性重鏈基因座恒定區上游的人類VH、 D與JH基因區段以及位於內源性輕鏈基因座恒定區上游的人類VL與JL基因區段，其中該基因區段係操作性地接附至其恒定區，俾使該脊椎動物能夠表現分別包含人類VH與VL域的免疫球蛋白重鏈與輕鏈，其中該重鏈基因座係包含人類01等位基因VH基因區段，該人類01等位基因VH基因區段能夠和人類D與JH基因區段重組，以製造VH域且其中該輕鏈基因座係包含人類01等位基因VL基因區段，該人類01等位基因VL基因區段能夠和人類JL基因區段重組，以製造VL域。
3.如項次1之細胞或如項次2之脊椎動物，其中一或兩個01等位基因為d01等位基因。
4.如任何前述項次之細胞或脊椎動物，其中該VH與VL域形成抗原結合部位。
5.如任何前述項次之細胞或脊椎動物，其中該重鏈基因座不包含該VH基因區段的第二個人類等位基因。
6.如任何前述項次之細胞或脊椎動物，其中該輕鏈基因座不包含該VL基因區段的第二個人類等位基因。
7.如任何前述項次之細胞或脊椎動物，其中該重鏈基因座係包含人類01等位基因D基因區段，該人類01等位基因D基因區段能夠和人類JH基因區段與該人類VH區段重組，以製造該VH域；任擇地，其中該重鏈基因座不包含該D基因區段的第二個人類等位基因。
8.如任何前述項次之細胞或脊椎動物，其中該重鏈基因座係包含人類02等位基因JH基因區段(譬如JH6*02)，該人類02等位基因JH基因區段能夠和人類D基因區段與該人類VH區段重組，以製造該VH域；任擇地，其中該重鏈基因座不包含該JH基因區段的第二個人類等位基因。
9.如任何前述項次之細胞或脊椎動物，其中該輕鏈基因座係包含人類01等位基因JL基因區段，該人類01等位基因JL基因區段能夠和該人類VL區段重組，以製造該VL域；任擇地，其中該輕鏈基因座不包含該JL基因區段的第二個人類等位基因。
10.如任何前述項次之細胞或脊椎動物，其中該基因組係包含VH3-23*04、JH2*01(任擇地和VH3-23*04重組)、Vκ4-1*01與Jκ2*01(任擇地和Vκ4-1*01重組)。
11.如任何前述項次之細胞或脊椎動物，其中該基因組係包含VH3-7*01、JH6*02(任擇地和VH3-7*01重組)、Vκ2-28*01與Jκ4*01(任擇地和Vκ2-28*01重組)。
12.如任何前述項次之細胞或脊椎動物，其中該輕鏈基因座係包含一個、多個或所有人類VL基因區段或由一個、多個或所有人類VL基因區段構成，該基因區段係選自由下列構成之群組：Vκ4-1*01、Vκ2-28*01、Vκ1D-13*d01、Vκ1-12*01、Vκ1D-12*02、Vκ3-20*01、Vκ1-17*01、Vκ1D-39*01、Vκ3-11*01、Vκ1D-16*01與Vκ1-9*d01。
13.如項次1至9中任一項次之細胞或脊椎動物， 其中該輕鏈基因座係包含一個、多個或所有人類VL基因區段或由一個、多個或所有人類VL基因區段構成，該基因區段係選自由Jκ4*01與Jκ2*01構成之群組。
14.如任何前述項次之細胞或脊椎動物，其中該重鏈基因座係包含一個、多個或所有人類VH基因區段或由一個、多個或所有人類VH基因區段，該基因區段係選自由下列構成之群組構成：VH3-23*04、VH7-4-1*01、VH4-4*02、VH1-3*01、VH3-13*01、VH3-7*01與VH3-20*d01。
15.如項次1至9或14中任一項次之細胞或脊椎動物，其中該輕鏈基因座係包含Jλ2*01。
16.如項次1至6中任一項次之細胞或脊椎動物，其中該VH域為人類VH、D與JH區段的重組體，其中該VH係選自由表7的一個、多個或所有01等位基因基因VH區段構成之群組及/或該VL域為下列的重組體：(i)人類Vκ與Jκ基因區段，其中該Vκ係選自由表12的一個、多個或所有01等位基因Vκ基因區段構成之群組：或(ii)人類Vλ與Jλ基因區段，該Vλ係選自由表18的一個、多個或所有01等位基因Vλ基因區段構成之群組；任擇地，其中該VH及/或VL域係表現為IgG抗體。
17.如項次1至6與16中任一項次之細胞或脊椎動物，其中該VH域為表1、表2、表3、表4、表5、表6或表7的人類VH、D與JH區段的重組體及/或該VL域為下列的重組體：(i)表8、表9、表10、表11或表12的人類Vκ與Jκ基因區段；或(ii)表13、表14、表15、表16、表17或表18的人類 Vλ與Jλ基因區段。
18.如項次2至17中任一項次之脊椎動物，其中(a)該重鏈基因座係包含選自表1、表2、表3、表4、表5、表6與表7之表格的人類VH、D與JH區段及/或(b)該輕鏈基因座係包含(i)選自表8、表9、表10、表11與表12之表格的人類Vκ與Jκ基因區段；或(ii)選自表13、表14、表15、表16、表17與表18之表格的人類Vλ與Jλ基因區段；以及其中該脊椎動物表現一或複數個VH域，其各為來自(a)所選表格之人類VH、D與JH區段的重組體及/或表現一或複數個VL域，其各為來自(b)所選表格之人類VL與JL區段的重組體；任擇地，其中此類VH域與VL域形成抗原結合部位。
19.一種非人類脊椎動物(譬如小鼠或大鼠)，其基因組係包含位於內源性重鏈基因座恒定區上游的人類VH、D與JH基因區段以及位於內源性輕鏈基因座恒定區上游的人類VL與JL基因區段，其中該基因區段係操作性地接附至其恒定區，俾使該脊椎動物能夠表現分別包含人類VH與VL域的免疫球蛋白重鏈與輕鏈，其中(a)該重鏈基因座係包含選自表1、表2、表3、表4、表5、表6與表7之表格的人類VH、D與JH區段及/或(b)該輕鏈基因座係包含(i)選自表8、表9、表10、表11與表12之表格的人類Vκ與Jκ基因區段；或(ii)選自表13、表14、表15、表16、表17與表18之表格的人類Vλ與Jλ基因區段；以及其中該脊椎動物表現一或複數個VH域，其各為來自(a)所選表格之人類VH、D與JH區段的重組體及/或表現一或複數個VL域，其各為來自(b)所選表格 之人類VL與JL區段的重組體；任擇地，其中此類VH域與VL域形成抗原結合部位。
20.如任何前述項次之細胞，其中該細胞為ES細胞、融合瘤細胞或永生化B細胞。
21.如任何前述項次之脊椎動物，其中該脊椎動物係包含在具有空氣過濾器的容器內。
22.一種由至少90個細胞組成的群體，其中該細胞係如項次1至17、19或20中任一項次。
23.如任何前述項次之細胞、脊椎動物或群體，其中該輕鏈基因座恒定區為κ或λ恒定區；任擇地為小鼠或大鼠恒定區。
24.如任何前述項次之細胞、脊椎動物或群體，其中該重鏈基因座為小鼠或大鼠恒定區(譬如包含γ恒定基因區段)。
25.如任何前述項次之細胞、脊椎動物或群體，其中該內源性輕鏈基因座為κ或λ基因座；任擇地，其中該基因組係包含位於內源性輕鏈基因座的至少表8的V與J基因區段及/或位於內源性輕鏈基因座的至少表13的V與J基因區段。
26.如項次1至9或14至23中任一項次之細胞、脊椎動物或群體，其中該輕鏈係包含免疫球蛋白輕鏈，其包含衍生自人類Vλ與Jλ基因區段重組的人類可變區，該基因區段係選自由表18的Vλ與Jλ基因區段構成之群組，任擇地各個此類可變區係和Cλ基因區段所編碼的恒定區表現，該 基因區段係選自由表18的Cλ基因區段構成之群組。
27.如任何前述項次之細胞、脊椎動物或群體，其中該脊椎動物為小鼠C57Bl/6J、129S5或129Sv株或是C57Bl/6J與129S5或129Sv株之間的雜交種。
28.如任何前述項次之細胞、脊椎動物或群體，其中該細胞或脊椎動物所表現的免疫球蛋白重鏈基本上專一地包含人類可變區的重鏈；以及包含人類可變區的重鏈係表現為一部分的血清IgG1、IgG2b與IgM(以及任擇地，IgG2a)抗體。
29.如任何前述項次之細胞、脊椎動物或群體，其中該脊椎動物表現包含人類λ可變區的輕鏈且至少60%、70%或80%此類輕鏈可變區係衍生自人類Vλ與Jλ基因區段的重組。
30.一種非人類脊椎動物(譬如小鼠或大鼠)或細胞，其基因組係包含藉由將人類Ig基因區段靶向插入一或多個內源性Ig基因座所製造的Ig基因區段匯集庫，該基因組包含位於恒定區上游的人類Vλ與Jλ基因區段，其中該人類Vλ與Jλ基因區段已藉由插入脊椎動物的內源性輕鏈基因座或細胞提供，其中該脊椎動物係包含包含λ可變區的免疫球蛋白輕鏈(λ輕鏈)或該細胞可發展成表現該免疫球蛋白輕鏈的脊椎動物，其中該λ輕鏈係包含免疫球蛋白輕鏈，其包含衍生自人類Vλ與Jλ基因區段重組的λ可變區；其中該脊椎動物所表現的至少80% λ輕鏈可變區為人類Vλ與Jλ基因區段重組體；其中該脊椎動物或細胞係如項次1至9或14至29中 任一項次。
31.一種非人類脊椎動物(譬如小鼠或大鼠)或細胞，其基因組係包含藉由將人類Ig基因區段靶向插入一或多個內源性Ig基因座所製造的Ig基因區段匯集庫，該基因組包含位於恒定區上游的人類Vλ與Jλ基因區段，其中該人類Vλ與Jλ基因區段係選自表18的一個、多個或所有區段並已藉由插入脊椎動物的內源性輕鏈基因座或細胞提供，其中該脊椎動物係包含包含λ可變區的免疫球蛋白輕鏈(λ輕鏈)或該細胞可發展成表現該免疫球蛋白輕鏈的脊椎動物，其中該λ輕鏈係包含免疫球蛋白輕鏈，其包含一或複數個人類Vλ與Jλ基因區段配對的λ可變區重組體，其中各基因區段係選自表18的人類Vλ與Jλ基因區段。
32.一種製造抗體或其抗原結合片段的方法，該方法包含以抗原使如項次2至19、21或23至31之脊椎動物免疫化並回收該抗體或片段或回收製造該抗體或片段的細胞；任擇地修飾所製造的抗體或片段，俾使其包含人類恒定區。
33.一種製造抗體或其抗原結合片段的方法，該方法包含從如項次1、3至17、19與23至31中任一項次之細胞單離抗體或其抗原結合片段；以及任擇地修飾單離抗體或片段，俾使其包含人類恒定區。
34.如項次33之方法，該方法更包含(a)從該脊椎動物單離編碼結合該抗原之抗體的B-細胞， (b)辨識或複製編碼該抗體VH域的B-細胞的核苷酸序列及/或辨識或複製編碼該抗體VL域的B-細胞的核苷酸序列；以及(c)使用該(多個)序列製造包含該VH及/或VL域的單離抗體或片段；任擇地，其中該單離抗體或片段係包含人類恒定區。
35.如項次32至34中任一項次之方法，其中該抗體或片段係藉由選自CHO、HEK293、Cos或酵母(譬如畢赤酵母屬)細胞之宿主細胞表現所製造。
36.如項次32至35中任一項次之方法，該方法更包含以稀釋劑、載劑、賦形劑或藥物調配該抗體或片段，以製造用於人類醫藥用途的藥學組成物，該方法任擇地更包含將該組成物包裝至無菌容器，舉例來說，瓶、管、IV袋或注射器，更任擇地製造一套組，該套組係包含結合該包裝及指示使用該用於人類醫藥用途之抗體組成物的標籤或說明；任擇地，其中該標籤或指示係包含醫藥品批次編號及/或上市許可編號，更任擇地，EMA或FDA上市許可編號。
37.如項次32至35中任一項次之方法，其中該脊椎動物係如任何前述項次且藉由該方法所製造的抗體或片段係包含(a)人類VH、D與JH基因區段的人類重鏈可變域重組體，該基因區段係選自由表7的VH、D與JH基因區段構成之群組；以及 (b)人類V與J基因區段的人類輕鏈可變域重組體，該基因區段係選自表12的V與J基因區段或選自表18的V與J基因區段。
38.一種藉由如項次32至35中任一項次之方法獲得或可獲得的單離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或片段的重鏈及/或輕鏈可變域係包含一或多個小鼠或大鼠激活誘導的去胺酶(AID)樣型體突變及/或小鼠或大鼠末端去氧核苷酸轉移酶(TdT)樣型接合突變。
39.一種藉由如項次32至35中任一項次之方法獲得或可獲得的單離抗體或其抗原結合片段，或如項次38之抗體，該等包含任擇地結合γ受體的人類重鏈Fc片段，再任擇地，人類恒定輕鏈。
40.一種藉由如項次32至35中任一項次之方法獲得或可獲得的單離抗體或其抗原結合片段，或如項次38或項次39之抗體，該等包含抗原結合部位，該抗原結合部位能夠特異性地結合至病毒或選自人類細胞介質、生長因子、激素、酶與血清蛋白之抗原。
41.一種藉由如項次32至35中任一項次之方法獲得或可獲得的單離抗體或其抗原結合片段，或如項次38至40中任一項次之抗體，其中該抗體或片段係經醣化，任擇地包含CHO、HEK293、Cos或酵母(譬如畢赤酵母屬)細胞醣化作用。
42.一種單離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體的可變域係由下列編碼：(i)人類VH、D與JH區段，其選 自由表7的任何基因區段構成之群組及/或(i)人類Vκ與Jκ基因區段，其選自由表12的任何Vκ與Jκ基因區段構成之群組或(ii)人類Vλ與Jλ基因區段，其選自由表18的任何Vλ與Jλ基因區段構成之群組。
43.如項次38至42中任一項次之單離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或片段特異性地結合至病毒或選自人類細胞介質、生長因子、激素、酶與血清蛋白之抗原。
44.如項次38至43中任一項次之單離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體係經人源化。
45.一種組成物，其包含如項次38至44中任一項次之抗體或片段，其中該抗體或片段為唯一治療劑。
46.一種組成物，其包含如項次38至44中任一項次之抗體或片段，該組成物更包含額外的治療劑，舉例來說，抗風濕藥物，例如疾病調整之抗風濕藥物、或抗癌藥物或抗高膽固醇血症藥物。
47.一種藉由項次32至35中任一項次之方法所製造的單離抗體或片段或如項次38至46中任一項次之單離抗體或片段，其係用於人類醫藥用途。
48.一種藉由項次32至35中任一項次之方法所製造的單離抗體或片段或如項次38至46中任一項次之單離抗體或片段的用途，該用途係製造用於人類醫藥用途之醫藥品。
49.如項次48之用途，其中該醫藥品係包含在如 項次36所列示的組成物或套組內。
50.一種醫學治療方法，該方法包含輸送有效量的如項次38至46之單離抗體或其片段至對彼等有需求的人類。
51.一種宿主細胞，舉例來說，CHO、HEK293、Cos或酵母(譬如畢赤酵母屬)細胞，該宿主細胞表現如項次38至43中任一項次所定義的抗體或片段。
在上述項次中，JH6*02可置換成JH6*01。
下列定義適用至本發明的任何配置、態樣、項目、項次、實施例或具體例。
“衍生自(Derived from)”係以該術語的普通意義使用。例示同義詞包括“製自(produced as)”、“得自(resulting from)”、“接受自(received from)”、“獲自(obtained from)”、“…的產物(aproduct of)”、“…的結果(consequence of)”、及“修飾自(modified from)”。舉例來說，重鏈的人類可變區可衍生自人類VH、D與JH基因區段的重組且此反映，舉例來說，根據本發明之基因轉殖重鏈基因座中的該等基因區段帶有任何伴隨突變(譬如接合突變)的體內重組。
可獲得B-細胞的樣本包括但不限於血液、血清、脾臟、脾系組織、骨髓、淋巴、淋巴結、胸腺、及闌尾(appendix)。抗體與免疫球蛋白鏈可獲自各前述樣本且亦獲自下列的B-細胞非設限名單：腹水、融合瘤、及細胞培養。
“複數個(Plurality)”係以該術語的普通意義使用並意指“至少一個”或“多於一個”。
術語“生殖系配置(germline configuration)”指的是生殖系基因組的配置。舉例來說，當基因區段的相對順序係相同於對應基因區段在人類生殖系基因組內的順序時，基因轉殖免疫球蛋白基因座的人類免疫球蛋白基因區段則落於生殖系配置內。舉例來說，當基因轉殖基因座為包含假設性人類免疫球蛋白基因區段A、B與C的本發明重鏈基因座時，該等將以此順序提供(基因座的5’至3’)，當人類生殖系基因組的對應基因區段係包含排列5’-A-B-C-3’時。在一例中，當人類免疫球蛋白基因座的因子(譬如，基因區段、增强子或其他調控因子)係提供於根據本發明之基因轉殖免疫球蛋白基因座時，當基因區段的相對順序係相同於對應基因區段在人類生殖系基因組內的順序且該因子之間的人類序列被包括時，人類Ig基因座因子係落於生殖系配置，該等對應於人類生殖系基因組內的對應因子之間的此類序列。於是，在假設性例子中，該基因轉殖基因座係包含呈排列5’-A-S1-B-S2-C-S3-3’的人類因子，其中A、B與C為人類免疫球蛋白基因區段及S1-S3為人類跨基因區段序列，其中該對應排列5’-A-S1-B-S2-C-S3-3’係存在於人類生殖系基因組內。舉例來說，此可藉由在本發明基因轉殖免疫球蛋白基因座提供對應於人類生殖系基因組的A至C之DNA序列的DNA插入物(或該插入物包含自A至C之DNA序列)達到。在人類生殖系基因組與免疫球蛋白基因座中的此排列係為本領域所習知(譬如參閱全球資訊網(參閱上文)的IMGT、卡巴(Kabat)及本案參照的其他抗體資源)。
術語“抗體”係包括單株抗體(包括具有免疫球蛋白Fc區的完整長度抗體)、帶有多表位特異性的抗體組成物、多重特異性抗體(譬如雙重特異性抗體、雙價抗體、及單鏈分子，還有抗體片段(譬如dAb、Fab、F(ab')2、及Fv)。術語“抗體”亦包括了包含重鏈二聚體(5’-VH-(任擇的鉸鏈區)-CH2-CH3-3’)且缺失輕鏈的H2抗體(如同天然存在的H2抗體；參閱，譬如Nature.1993 Jun 3；363(6428)：446-8；Naturally occurring antibodies devoid of light chains；Hamers-Casterman C,Atarhouch T,Muyldermans S,Robinson G,Hamers C,Songa EB,Bendahman N,Hamers R)。於是，在本發明的具體例中，從基因轉殖重鏈基因座製造的RNA係編碼缺失CH1基因區段且不包含功能性抗體輕鏈的重鏈。在一例中，從基因轉殖重鏈基因座製造的RNA編碼VH單一可變域(dAbs；域抗體)。該等可任擇地包含恒定區。
術語“免疫球蛋白”(Ig)在本案和“抗體”可交替使用。
“單離(isolated)”抗體為自其製造環境(譬如天然或重組)的組分辨識、分離及/或回收的抗體。較佳地，所單離的多肽係不和來自其製造環境的所有其他組分連結，譬如俾使該抗體被單離至FDA-可批准或許可標準。其生產環境的污染物組分-例如產自重組體轉染細胞-為通常干擾該抗體的研究、診斷或治療用途的材料，並可包括酶、激素、和其它蛋白質屬性或非蛋白質屬性的溶質。在較佳具 體例中，該多肽將被純化：(1)至大於95重量%抗體，舉例來說，以路氏方法(Lowry method)所測得，在一些具體例中，至大於99重量%；(2)至足以獲得N-端或內部胺基酸中的至少15個殘基的程度，藉由使用自旋杯序列分析儀(spinning cup sequenator)，或(3)至均質，藉由SDS-PAGE在還原或非還原條件下使用考馬斯藍(Coomassie blue)或較佳銀染色。單離抗體係包括重組體細胞內的原位抗體，因為不存在抗體的天然環境的至少一個組分。按說，然而，單離多肽或抗體將藉由至少一個純化步驟製備。
“抗體片段”係包含一部分的完整抗體，較佳為完整抗體的抗原結合及/或可變區。抗體片段的例子包括dAb、Fab、Fab'、F(ab')2與Fv片段；雙價抗體；線性抗體；單鏈抗體分子與由抗體片段形成的多重特異性抗體。
“特異性結合至”或係“特異性地用於”特定多肽、抗原、或表位的抗體是結合至該特定多肽、抗原、或表位而無實質上結合至其他多肽、抗原或表位的抗體。舉例來說，當以100μM或更少、10μM或更少、1μM或更少、100nM或更少，譬如10nM或更少、1nM或更少、500pM或更少、100pM或更少、或10pM或更少之KD和抗體結合時，結合至抗原或表位係具特異性。結合親和力(KD)可使用熟習此藝者習知的標準程序測定，譬如於ELISA結合及/或使用表面等離子體共振的親和力測定(譬如BiacoreTM或KinExATM液相親和力測量，該等可偵測低至fM親和力(Sapidyne Instruments,Idaho))。
“藥學上可接受的”指的是美國聯邦或州政府的監管機構所許可或可批准或列於美國藥典或其他用於動物，包括人類的普遍公認藥典。“藥學上可接受的載劑、賦形劑、或佐劑”指的是可和譬如本案所述任何抗體或抗體鏈之劑一起投至個體、而且不破壞其藥學活性且在以足以輸送該劑之治療份量的藥量投予時不具毒性的載劑、賦形劑、或佐劑。
圖1，部分1例示用於插入小鼠內源性輕鏈基因座的第一個與第二個BACs。顯示了在各BAC的人類DNA。圖1的部分2顯示人類λ Ig基因座DNA插至小鼠內源性κ鏈基因座的插入點。圖1的部分3顯示人類λ Ig基因座DNA插至小鼠內源性λ鏈基因座的插入點。
圖2顯示測定-相較於野生型小鼠(WT)-來自P1純合小鼠(P1/P1)的B220+脾系B細胞中的小鼠與人類Cλ表現(於是對應地小鼠與人類可變區表現)的FACS分析結果。
圖3A顯示測定-相較於野生型小鼠(WT)-來自P2純合小鼠(P2/P2)的B220+脾系B細胞中的小鼠Cκ與Cλ表現的FACS分析結果。測不到小鼠Cκ表現。
圖3B顯示測定-相較於野生型小鼠(WT)-來自P2純合小鼠(P2/P2)的B220+脾系B細胞中的人類Cλ表現(於是對應地人類可變區表現)的FACS分析結果。
圖4顯示在P2純合小鼠(P2/P2)中的人類Vλ採用 率及人類中的典型Vλ採用率(插表)。
圖5顯示在P2純合小鼠(P2/P2)中的人類Jλ採用率及人類中的典型Jλ採用率(插表)。
圖6顯示在P2純合小鼠(P2/P2)中的Vλ採用率極高。
圖7顯示來自P2純合小鼠(P2/P2)中的嵌合κ基因座的小鼠Vκ與人類Vλ基因區段採用率分佈情形。
圖8例示λ與κ基因座中的RSS排列。
圖9A顯示測定-相較於無插入人類λDNA且內源性κ鏈表現已被失活(KA/KA)的小鼠-來自內源性κ鏈表現已被失活的L2純合小鼠(L2/L2；KA/KA)的B220+脾系B細胞中的小鼠與人類Cλ表現(於是對應地小鼠與人類可變區表現)的FACS分析結果。在L2/L2；KA/KA)小鼠看到極高人類Vλ採用率，幾乎排除使用小鼠Vλ。
圖9B：脾系B-細胞隔室分析。此圖顯示來自基因轉殖L2/L2；KA/KA小鼠(L2純合子；就人類λ基因區段插入內源性λ基因座為純合；內源性κ鏈表現已被失活)的脾系B-細胞的FACS分析結果，其係相較於來自僅表現小鼠抗體的小鼠(KA/KA小鼠)的脾系B-細胞。該結果顯示本發明小鼠的脾系B-細胞隔室係為正常(即，等效於僅表現小鼠抗體鏈的小鼠的隔室)。
圖10：在骨髓與脾系隔室中的B-細胞發展與標記。
圖11A：脾系B-細胞隔室分析。此圖顯示來自表 現全為人類重鏈可變區(其中內源性重鏈表現已藉由倒置被失活)的本發明基因轉殖S1F/HA，KA/+小鼠的脾系B-細胞的FACS分析結果，其係相較於來自僅表現小鼠抗體的小鼠的脾系B-細胞。該結果顯示本發明小鼠的脾系B-細胞隔室係為正常(即，等效於僅表現小鼠抗體鏈的小鼠的隔室)。
S1F/HA，+/KA=(i)S1F-第一個內源性重鏈等位基因具有一個人類重鏈基因座DNA插入，內源性小鼠VDJ區已藉由倒置被失活並移至染色體上游；(ii)HA-第二個內源性重鏈等位基因已被失活(藉由插入內源性中斷序列)；(iii)+-第一個內源性κ等位基因為野生型κ等位基因；以及(iv)KA-第二個內源性κ等位基因已被失活(藉由插入內源性中斷序列)。此排列專一地編碼來自第一個內源性重鏈等位基因的重鏈。
圖11B：脾系B-細胞隔室分析。此圖顯示來自表現全為人類重鏈可變區(其中內源性重鏈表現已藉由倒置被失活)與人類κ鏈可變區的本發明基因轉殖S1F/HA，K2/KA小鼠的脾系B-細胞的FACS分析結果，其係相較於來自+/HA，K2/KA小鼠的脾系B-細胞。該結果顯示本發明小鼠的脾系B-細胞隔室係為正常。
S1F/HA，K2/KA=(i)K2-第一個內源性κ等位基因具有兩個κ鏈基因座DNA插入最3’端內源性Jκ與小鼠Cκ之間，提供14個人類Vκ與Jκ1-Jκ5的插入；以及(ii)KA-第二個內源性κ等位基因已被失活(藉由插入內源性中斷序列)。此排列專一地編碼包含人類可變區的重鏈及實質上來自第 一個內源性κ等位基因的κ輕鏈。
+/HA，K2/KA-此排列編碼小鼠重鏈與人類κ鏈。
圖12A：骨髓B前身隔室分析。此圖顯示來自表現全為人類重鏈可變區(其中內源性重鏈表現已藉由倒置被失活)的本發明基因轉殖S1F/HA，KA/+小鼠的骨髓(BM)B-細胞的FACS分析結果，其係相較於來自僅表現小鼠抗體的小鼠的BM B-細胞。該結果顯示本發明小鼠的BM B-細胞隔室係為正常(即，等效於僅表現小鼠抗體鏈的小鼠的隔室)。
圖12B：骨髓B前身隔室分析。此圖顯示來自表現全為人類重鏈可變區(其中內源性重鏈表現已藉由倒置被失活)與人類κ鏈可變區的本發明基因轉殖S1F/HA，K2/KA小鼠的骨髓(BM)B-細胞的FACS分析結果，其係相較於來自+/HA，K2/KA小鼠的BM B-細胞。該結果顯示本發明小鼠的BM B-細胞隔室係為正常。
圖13：顯示在各種小鼠就亞型與總Ig而言的Ig定量：S1F/HA，KA/+=(i)S1F-第一個內源性重鏈等位基因具有一個人類重鏈基因座DNA插入，內源性小鼠VDJ區已藉由倒置被失活並移至染色體上游；(ii)HA-第二個內源性重鏈等位基因已被失活(藉由插入內源性中斷序列)；(iii)KA-第一個內源性κ等位基因已被失活(藉由插入內源性中斷序列)；以及(iv)+-第二個內源性κ等位基因為野生型κ等位基因。此排列專一地編碼來自第一個內源性重鏈等位基 因的重鏈。
S1F/HA，K2/KA=(i)K2-第一個內源性κ等位基因具有兩個κ鏈基因座DNA插入最3’端內源性Jκ與小鼠Cκ之間，提供14個人類Vκ與Jκ1-Jκ5的插入；以及(ii)KA-第二個內源性κ等位基因已被失活(藉由插入內源性中斷序列)。此排列專一地編碼包含人類可變區的重鏈及實質上來自第一個內源性κ等位基因的κ輕鏈。
+/HA，K2/+-此排列編碼小鼠重鏈以及小鼠與人類κ鏈兩者。
+/HA，+/KA-此排列編碼小鼠重鏈與κ鏈。
在本圖中，“Sum Ig”是IgG與IgM同型的總和。
圖14：顯示在各種小鼠就亞型與總Ig而言的Ig定量：S1F/HA，K2/KA(n=15)與12隻小鼠，其為僅表現小鼠抗體鏈(+/HA，+/KA(n=6)與野生型小鼠(WT；n=6))。
發明詳細說明
將理解到本案所述特定具體例係為例示而展示而非限制本發明。本發明的主要特徵可運用於各式具體例，而不逸離本發明之範疇。熟習此藝者將認知-或能夠使用不超過常規研究而確定-本案所述明確程序的眾多等效例。此類等效例被視為落於本發明的範疇以內，並為專利申請範圍所涵蓋。
字詞“一(a)”或“一(an)”在連同術語“包含(comprising)”使用於請求項及/或說明書時可意指“一個 (one)”，但亦和“一或多個”、“至少一個”與“一個或多於一個”的意義一致。在請求項中使用術語“或(or)”係用於意指“及/或(and/or)”，除非清楚地表明指的是兩者擇一(alternatives only)或兩者互斥，儘管揭示內容支持指稱兩者擇一與“及/或”的定義。在本申請案通篇中，術語“約(about)”係用於表明一數值係包括就該裝置而言的固有誤差變異，運用方法測定存在於研究個體當中的該數值、或變異。
如說明書與(多個)請求項中所用，字詞“包含(comprising)”(以及包含的任何形式，例如“包含(comprise)”與“包含(comprises)”)、“具有(having)”(以及具有的任何形式，例如“具有(have)”與“具有(has)”)、“包括(including)"(以及包括的任何形式，例如“包括(includes)”與“包括(include)”)或“含有(containing)”(以及含有的任何形式，例如“含有(contains)”與“含有(contain)”)為包容性或開放性且不排除額外、未列舉的元件或方法步驟。
本案所用的術語“或彼等的組合(or combinations thereof)”指的是在該術語前面所列品項的所有排列與組合。舉例來說，"A、B、C、或彼等的組合係意圖包括下列至少一者：A、B、C、AB、AC、BC、或ABC，以及假使順序在特定背景下是重要的，則亦包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC、或CAB。繼續此例子，被明白包括的為含有一或多個品項或術語重複的組合，例如BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等等。熟習此藝者將理解到在任何組合中對於品項或術語的數量通 常沒有設限除非從上下文顯而易見並非如此。
作為抗體基因區段序列的來源，熟習此藝者亦將知曉下列可取得資料庫與資源(包括其更新)，其內容以參照方式併入本案：卡巴資料庫(The Kabat Database )(G.Jqhnson與T.T.Wu,2002；全球資訊網(www)kabatdatabase.com)。由E.A.Kabat與T.T.Wu於1966創建，卡巴資料庫發表具免疫學興趣的抗體、T-細胞受體、第I與II類主要組織相容性複合(MHC)分子、及其他蛋白質的配對序列。可搜尋界面係由SeqhuntII工具提供，並可取得序列配對、序列亞群分類、及生成變異圖的一系列利用。亦參閱Kabat,E.A.,Wu,T.T.,Perry,H.,Gottesman,K.,and Foeller,C.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,NIH Publication No.91-3242,Bethesda,MD，其以參照方式併入本案，尤其參照用於本發明的人類基因區段。
KabatMan (A.C.R.Martin,2002；全球資訊網(www)bioinf.org.uk/abs/simkab.html)。此為可對Kabat序列資料庫進行簡單查詢的網頁界面。
IMGT (International ImMunoGeneTics Information System®；M.-P.Lefranc,2002；全球資訊網(www)imgt.cines.fr)。IMGT為專精於所有脊椎動物物種的抗體、細胞受體、與MHC分子的綜合訊息系統。它提供包括核苷酸與蛋白質序列、寡核苷酸引子、基因地圖、基因多態性、特異性、和二維(2D)與三維(3D)結構的標準化資料的通用 門戶。IMGT係包括三個序列資料庫(IMGT/LIGM-DB,IMGT/MHC-DB,IMGT/PRIMERDB)、一個基因組資料庫(IMGT/GENE-DB)、一個3D結構資料庫(IMGT/3Dstructure-DB)、和一系列網路資源(“IMGT Marie-Paule page”)、以及互動工具。
V-BASE (I.M.Tomlinson,2002；全球資訊網(www)mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase)。V-BASE為從多於一千個已發表序列編制的所有人類抗體生殖系可變區序列的綜合目錄。它包括某個版本的配對軟體DNAPLOT(Hans-Helmar Althaus與Werner Müller所發展)，該軟體容許重排抗體V基因和其最近生殖系基因區段的配對。
抗體-結構與序列(Antibodies-Structure and Sequence) (A.C.R.Martin,2002；全球資訊網(www)bioinf.org.uk/abs)。此網頁整理抗體結構與序列的有用資訊。它提供對卡巴抗體序列資料、抗體的一般資訊、晶體結構的查詢界面、並連結至其他抗體相關資訊。它亦發佈存在蛋白質資料庫(Protein Databank)(PDB)的所有抗體結構的自動化摘要。尤其感興趣的是對於抗體可變區的各種編號方案的詳盡說明與比對。
AAAAA (何氏抗體解剖學驚奇圖集(A Ho’s Amazing Atlas of Antibody Anatomy)；A.Honegger,2001；World Wide Web(www)unizh.ch/~antibody)。此資源係包括用於結構分析、模擬、與建造的工具。它採用了供抗體與T-細胞-受體序列的全面結構配對的統一方案，並包括供抗 體分析與圖形呈現的Excel巨集。
WAM (網頁抗體模擬(Web Antibody Modeling)；N.Whitelegg and A.R.Rees,2001；全球資訊網(www)antibody.bath.ac.uk)。由英國巴斯大學蛋白質分析與設計中心(Centre for Protein Analysis and Design at the University of Bath,United Kingdom)主導。基於AbM組件(先前由Oxford Molecular銷售)，以使用已發表理論方法組合建構抗體Fv序列的3D模型，此站亦包括最新的抗體結構資訊。
麥克的免疫球蛋白結構/功能網頁(Mike’s Immunoglobulin Structure/Function Page) (M.R.Clark,2001；全球資訊網(www)path.cam.ac.uk/~mrc7/mikeimages.html)該等網頁提供針對免疫球蛋白結構與功能的教育性材料，並繪示為許多彩圖、模型、與動畫。可取得針對抗體人源化與克氏治療抗體人類同源性計劃(Mike Clark’s Therapeutic Antibody Human Homology Project)的額外資訊，該計劃旨於以治療抗體的可變區序列關聯臨床療效與抗-免疫球蛋白回應。
抗體資源網頁 (The Antibody Resource Page,2000；全球資訊網(www)antibodyresource.com)。此站自稱是“對抗體研究和供應商的完整指南”。提供了胺基酸定序工具、核苷酸抗體定序工具、及融合瘤/細胞-培養資料庫的連結。
人源化bY設計(Humanization bY Design) (J.Saldanha,2000；全球資訊網(www) people.cryst.bbk.ac.uk/~ubcg07s)。此資源提供抗體人源化技術的概觀。最有用的特點是多於40個已發表人源化抗體的可搜尋資料庫(藉由序列與文字)，其包括人源化構建體的設計問題、架構選擇、架構回復突變、與結合親和力的資訊。
亦參閱抗體Antibody Engineering Methods and Protocols,Ed.Benny K C Lo,Methods in Molecular Biology TM,Human Press。亦於全球資訊網(www)的blogsua.com/pdf/antibody-engineering-methods-and-protocol santibody-engineering-methods-and-protocols.pdf。
此揭示內容的任何部分可和揭示內容的任何其他部分合併閱讀，除非從上下文顯而易見並非如此。
本案揭示與主張的所有組成物及/或方法皆可在本揭示內容教示之下不需過度實驗即可進行與執行。在本發明的組成物與方法已依照較佳具體例說明的同時，對熟習此藝者顯而易見的是可對組成物及/或方法以及本案所述方法步驟或步驟順序施加變化，而無逸離本發明的概念、精神與範疇。對熟習此藝者顯而易見的所有此類相似取代與修飾被認為落於隨附請求項所定義的本發明精神、範疇與概念以內。
下列實施例被提出，以便提供熟習此藝者完整的揭示內容以及如何製作並使用本發明的說明，並非意圖限制發明人看待其發明的範疇。
實施例 實施例1： 在包含人類λ基因區段插入內源性κ基因座的基因轉殖小鼠中的高度人類λ可變區表現
進行了將來自1st IGL BAC的人類λ基因區段插入小鼠AB2.1 ES細胞的IGK基因座(Baylor College of Medicine)，以創建表示為P1等位基因(圖1)的嵌合輕鏈等位基因。所插入的人類序列係對應於第22號人類染色體序列的23217291位置至23327884位置並包含功能性λ基因區段Vλ3-1、Jλ1-Cλ1、Jλ2-Cλ2、Jλ3-Cλ3、Jλ6-Cλ6與Jλ7-Cλ7(表13的等位基因)。該插入係於第6號小鼠染色體上的70674755位置與706747756位置之間實行，其係於小鼠Cκ區與3’Eκ上游(即，在內源性輕鏈增强子的100kb以內)，如圖1所示。小鼠Vκ與Jκ基因區段係保留在嵌合基因座，緊挨著所插入人類λDNA的上游。小鼠λ基因座係保持原樣。使用標準程序從ES細胞產生就嵌合P1基因座為純合的小鼠。
製造了第二型小鼠(P2小鼠)，其中多個人類功能性Vλ基因區段係藉由依序插入BAC1人類DNA及隨後BAC2 DNA來插入人類Vλ3-1上游(5’)，以創建P2等位基因(表14的等位基因)。來自BAC2的插入人類序列係對應於第22號人類染色體序列的23064876位置至23217287位置並包含功能性λ基因區段Vλ2-18、Vλ3-16、V2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8與Vλ4-3。使用標準程序從ES細胞產生就嵌合P2基因座為純合的小鼠。
進行了來自P1與P2純合子的脾系B細胞的FACS分析，以評估在基因轉殖小鼠中的λ對κ的表現及人類λ對小鼠λ的表現。
進行了標準5’-RACE，以分析來自P2純合子的輕鏈基因座的RNA轉錄物。
輕鏈表現& FACS分析
為從脾臟獲得單一細胞懸浮液，使脾臟輕輕地通過30μm細胞濾網(strainer)。將單一細胞再次懸浮於補充有3%熱失活胎牛血清(FCS)的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中。
下列抗體係用於染色：大鼠抗-小鼠λ(mCλ)藻紅蛋白(PE)抗體(Southern Biotech)，大鼠抗-小鼠κ(mCκ)(BD Pharmingen，無性系187.1)異硫氰酸螢光素(FITC)，抗-人類λ(hCλ)(eBioscience，無性系1-155-2)藻紅蛋白(PE)，抗-B220/CD45R(eBioscience，無性系RA3-6B2)別藻藍蛋白(APC)。NB：帶有人類Cλ的輕鏈係預期具有衍生自所插入人類Vλ與人類Jλ重排的可變區。帶有小鼠Cλ的輕鏈係預期具有衍生自來自內源性λ基因座之小鼠Vλ與Jλ重排的可變區。
將5x106個細胞加至個別管中，旋轉沉澱以除去過量的流體，並再次懸浮於新鮮100μl PBS+3% FCS。對個別管加入下列抗體：就mλ與mκ的染色而言，除添加1μl B220/CD45R抗體外，添加1μl各別抗體。為偵測表現人類λ輕鏈的B細胞，以hλ抗體置換mλ抗體。細胞於黑暗中6℃培育15分鐘，接著以新鮮PBS+3%FCS洗滌數次，以移除未結 合抗體。細胞係使用得自Miltenyi Biotech的螢光激活細胞分選(FACS)分析儀來分析。
活體脾臟細胞係使用側向散射(SSC)和前向散射(FSC)來分閘。在SSC與FSC分閘群體內，使用APC螢光染料偵測B220/CD45R(小鼠B-細胞)的亞群體。將單一正性B220/CD45R群體又劃分成帶有mλ或hλ PE螢光染料連同mκ FITC螢光染料的細胞。各群體的百分比係使用分閘系統計算。
出乎意料地，來自P1純合子的脾系B細胞的FACS分析顯示測不到小鼠Cκ表現(圖2)，表示插入來自BAC1的人類λ基因座DNA中斷了內源性IGK鏈的表現
在該等小鼠中、藉由FACS分析分群的脾系B細胞的內源性Cλ的強力表現與人類Cλ的弱勢表現(小鼠Cλ：人類Cλ=65：32)暗示所插入的人類IGL序列-儘管中斷IGK活性-無法完全和內源性IGL基因競爭。
FACS分析再次出乎意料地顯示測不到P2純合子中的小鼠Cκ表現(圖3A & B)。然而，在FACS分析將所表現的B細胞分成小鼠或人類Cλ後，來自P2純合子的人類Cλ佔絕大多數(小鼠Cλ：人類Cλ=15：80，對應於15隻小鼠λ可變區：80個人類λ可變區的比率，即，相對於分群B-細胞的84%人類λ可變區-其對應於80%總B-細胞)。雖然不希望受限於任何理論，吾人建議所插入的來自2nd BAC的人類λ基因座序列提供和內源性λ基因區段重排或表現競爭的若干優點。
吾人分析P2純合子中的人類Vλ與Jλ採用率。見圖4，其顯示P2純合子中的人類Vλ採用率。觀察到的採用率係類似於見於人類者(依照J Mol Biol.1997 Apr 25；268(1)：69-77；“The creation of diversity in the human immunoglobulin V(lambda)repertoire”；Ignatovich O et al)。又，人類Jλ採用率係類似於見於人類者(圖5)。藉由定序非偏差5’-RACE(快速擴增cDNA終端)PCR仿製物分析人類Cλ轉錄物的Vλ對Vκ採用率顯示在278個仿製序列中，僅一個使用Vκ，以重排成Jλ(人類Jλ)，所有其餘(277個仿製物)皆使用人類Vλ(圖6 & 7；Vλ2-5係偵測到RNA轉錄位準，但此為假基因，通常不會取作蛋白質位準的採用率)。雖然不希望受限於任何理論，吾人建議所保留的小鼠Vκ基因區段基本上無法有效地和所插入的人類Jλ基因區段重排，因為彼等具有相同種類的RSSs(重組信號序列；參見下方解釋)並不相容於重排(圖8)。此結果亦指出可達到內源性IGK活性的失活與所插入人類λ序列的主導表現，而無需進一步修飾IGK基因座，舉例來說，內源性κ基因座基因區段的刪除或倒置並非必要，其大大地簡化了表現帶有人類λ可變區(即，藉由人類Vλ與Jλ基因區段重組所製造的可變區)之輕鏈的有用基因轉殖小鼠的產生。
討論了中介V(D)J體內重組的重組信號序列(RSSs)排列，譬如於Cell.2002 Apr；109 Suppl：S45-55；“The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination”；Bassing CH,Swat W,Alt FW(其揭示內容 以參照方式併入本案)。已識得兩類RSS因子：單螺旋RSS(12-RSS)與雙螺旋RSS(23-RSS)。在λ輕鏈基因座的天然VJ重組中，重組係於Vλ的3’雙螺旋RSS與在Jλ的5’單螺旋RSS之間發生，該RSSs為反向。在κ輕鏈基因座的天然VJ重組中，重組係於Vκ的3’單螺旋RSS與Jκ的5’雙螺旋RSS之間發生，該RSSs為反向。於是，大致上，雙螺旋RSS係以反向相容於單螺旋RSS。
於是，發明人已證實如何(i)藉由將人類λ基因區段插入κ基因座來失活內源性κ鏈表現；以及(ii)如何達到極高的人類λ可變區表現(於是提供針對標靶抗原篩選的有用輕鏈匯集庫)-即使在內源性λ與κV基因區段的存在下。於是，發明人已展示如何顯著移除(λ)或完全地移除(κ)V基因區段競爭且於是藉由插入包含在BACs 1與2內的至少功能性人類λ基因區段的內源性輕鏈表現。在本實施例中，出乎意料地達到極高位準的人類λ可變區表現(如上文所解釋的84%總λ鏈與總輕鏈)。
實施例2： 在包含人類λ基因區段插入內源性λ基因座的基因轉殖小鼠中的高度人類λ可變區表現
進行了將來自1st與2nd IGL BACs的人類λ基因區段插入小鼠AB2.1 ES細胞的λ基因座(Baylor College of Medicine)，以創建表示為L2等位基因(圖1)的λ輕鏈等位基因。所插入的人類序列係對應於第22號人類染色體序列的23064876位置至23327884位置並包含功能性λ基因區段 Vλ2-18、Vλ3-16、V2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3、Vλ3-1、Jλ1-Cλ1、Jλ2-Cλ2、Jλ3-Cλ3、Jλ6-Cλ6與Jλ7-Cλ7。該插入係於第16號小鼠染色體上的19047551位置與19047556位置之間實行，其位於小鼠Cλ區上游並於Eλ4-10與Eλ3-1之間(即，在內源性輕鏈增强子的100kb以內)，如圖1所示。小鼠Vλ與Jλ基因區段係保留在基因座內，緊挨著所插入人類λDNA的上游。小鼠κ基因座被失活以阻止κ鏈表現。使用標準程序從ES細胞產生就L2基因座為純合的小鼠。
使用類似於實施例1的方法，進行了來自L2純合子的脾系B細胞的FACS分析，以評估在基因轉殖小鼠中的λ對κ的表現及人類λ對小鼠λ的表現。
輕鏈表現&FACS分析
在IGK剔除背景(其中已保留Vκ與Jκ基因區段)下的L2純合子中的脾系B-細胞的FACS分析出乎意料地顯示-在FACS分析將B細胞分成小鼠或人類Cλ後-人類Cλ的表現佔絕大多數(小鼠Cλ：人類Cλ=5：93，對應於5隻小鼠λ可變區：93個人類λ可變區的比率，即，相對於分群B-細胞的95%人類λ可變區-其對應於93%總B-細胞)(圖9A)，證實了位於內源性IGλ基因座之內的所插入人類IGλ基因區段可和內源性IGλ基因區段重排或表現相抗衡。
於是，發明人已證實如何如何達到極高的人類λ可變區表現(於是提供針對標靶抗原篩選的輕鏈匯集庫)-即使在內源性λ與κV基因區段的存在下。於是，發明人已展 示如何顯著移除內源性λV基因區段競爭且於是藉由插入包含在BACs 1與2內的至少功能性人類λ基因區段的內源性λ輕鏈表現。在本實施例中，出乎意料地達到極高位準的人類λ可變區表現(如上文所解釋的95%總λ鏈與總輕鏈)。
該等資料指出攜帶藉由靶向插入BAC1與BAC2所提供的功能性基因區段所製造的P(實施例1)或L(實施例2)等位基因的小鼠可在成熟B細胞中發揮重排與表現的功能。該等兩類等位基因係極有益於提供製造用於治療抗體發現及作為研究工具之人類Ig λ鏈的基因轉殖小鼠。
表現人類λ可變區的本發明基因轉殖小鼠發展正常脾系隔室
在脾臟中，B細胞係以細胞表面標記IgM與IgD的位準為基準而定性為未成熟(T1與T2)和成熟(M)。T1細胞具有高IgM與低IgD。T2細胞具有中等位準的該兩者。M細胞具有低IgM但高IgD(圖10)。亦參閱J Exp Med.1999 Jul 5；190(1)：75-89；“B cell development in the spleen takes place in discrete steps and is determined by the quality of B cell receptor-derived signals”；Loder F et al。
使用類似於下方實施例3說明的方法，動物的脾系B-細胞係使用FACS來評計IgD與IgM表現。吾人比對控制組小鼠KA/KA(其中內源性κ鏈表現-而非內源性λ鏈表現-已被失活)和L2/L2；KA/KA小鼠(L2純合子)。L2純合子出乎意料地顯示相仿於控制組小鼠的脾系B-細胞隔室(圖9B)。
實施例3： 在本發明基因轉殖小鼠中評估B-細胞與Ig發展
吾人觀察到在本發明基因轉殖小鼠的正常Ig亞型表現& B-細胞發展，該小鼠表現帶有人類重鏈可變區的抗體且實質上無內源性重鏈與κ鏈表現。
使用上述ES細胞與RMCE基因操作方法，建構帶有下列Ig基因座等位基因組合的小鼠：S1F/HA，+/KA=(i)S1F-第一個內源性重鏈等位基因具有一個人類重鏈基因座DNA插入，內源性小鼠VDJ區已藉由倒置被失活並移至染色體上游(見以上說明，其中該等位基因係稱作S1inv1)；(ii)HA-第二個內源性重鏈等位基因已被失活(藉由插入內源性中斷序列)；(iii)+-第一個內源性κ等位基因為野生型κ等位基因以及(iv)KA-第二個內源性κ等位基因已被失活(藉由插入內源性中斷序列)。此排列專一地編碼來自第一個內源性重鏈等位基因的重鏈。
S1F/HA，K2/KA=(i)K2-第一個內源性κ等位基因具有兩個κ鏈基因座DNA插入最3’端內源性Jκ與小鼠Cκ之間，提供14個人類Vκ與Jκ1-Jκ5的插入；以及(ii)KA-第二內源性κ等位基因已被失活(藉由插入內源性中斷序列)。此排列專一地編碼包含人類可變區的重鏈及實質上來自第一個內源性κ等位基因的κ輕鏈。
+/HA，K2/KA-此排列編碼小鼠重鏈與人類κ鏈。
+/HA，+/KA-此排列編碼小鼠重鏈與κ鏈-該 小鼠僅製造小鼠重鏈與輕鏈。
在骨髓中，B前身群體係以其表面標記B220與CD43為基礎來定性。初前B細胞攜帶生殖系IGH與IGK/L配置且其細胞表面上具有低B220與高CD43。前B細胞開始啟動IGH基因座的VDJ重組並攜帶中等位準的B220與CD43兩者。初B細胞攜帶重排的IGH VDJ基因座並開始啟動輕鏈VJ重排，並具有高B220但低CD43。在脾臟中，B細胞係以細胞表面標記IgM與IgD的位準為基準而定性為未成熟(T1與T2)和成熟(M)。T1細胞具有高IgM與低IgD。T2細胞具有中等位準的該兩者。M細胞具有低IgM但高IgD(圖10)。亦參閱J Exp Med.1991 May 1；173(5)：1213-25；“Resolution and characterization of pro-B and pre-pro-B cell stages in normal mouse bone marrow”；Hardy RR et al與J Exp Med.1999 Jul 5；190(1)：75-89；“B cell development in the spleen takes place in discrete steps and is determined by the quality of B cell receptor-derived signals”；Loder F et al。
本發明基因轉殖小鼠發展正常脾系與BM隔室 (a)脾系隔室的分析
就各小鼠而言，為從脾臟獲得單一細胞懸浮液，使脾臟輕輕地通過30μm細胞濾網。將單一細胞再次懸浮於補充有3%熱失活胎牛血清(FCS)的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中。將5x106個細胞加至個別管中，旋轉沉澱以除去過量的流體，並再次懸浮於新鮮100μl PBS+3% FCS。對個別管加入下列抗體：抗-B220/CD45R(eBioscience，無性系RA3-6B2) 別藻藍蛋白(APC)，共軛有藻紅蛋白(PE)專對IgD受體的抗體(eBioscience，無性系11-26)與共軛有異硫氰酸螢光素(FITC)專對IgM受體的抗體(eBioscience，無性系11/41)。
就IgM與IgD的染色而言，各染色使用5x106個細胞。對含有脾臟細胞的各小瓶添加由下列構成的混合抗體：抗-IgD(PE)、抗-IgM(FITC)與抗-B220/CD45R(APC)。細胞於6℃培育15分鐘，洗滌，以移除過量的未結合抗體並使用得自Miltenyi Biotech的螢光激活細胞分選(FACS)分析儀來分析。B-細胞被分閘為T1群體之B220HIGH IgMHIGH IgDLOW(即，B220+ IgM+ IgD-)，T2群體之B220HIGH IgMHIGH IgDHIGH(B220+ IgM+ IgD+)與M群體之B220HIGH IgMLOW IgDHIGH(B220+ IgM- IgD+)。細胞百分比係使用分閘系統計算。在對數標度圖上，吾人使用分閘來識別並定義細胞群體亞群。在應用分閘之前，各螢光染料的單株抗體係用於區別正性(高強度螢光染料)與負性(測不到螢光染料強度)群體。分閘係以螢光染料強度為基礎以相同方式應用至所有樣本。單株為：IgD-PE
IgM-FITC
B220-APC
活體脾臟細胞係使用側向散射(SSC)和前向散射(FSC)來分閘。在SSC與FSC分閘群體內，使用APC螢光染料偵測B220/CD45R正性細胞(小鼠B-細胞)的亞群體。將單一正性B220/CD45R群體又劃分成帶有IgM異硫氰酸螢光素 (FITC)或IgD螢光染料連同mκ FITC螢光染料的細胞。各群體的百分比係使用分閘系統計算。本發明小鼠的脾系B-細胞隔室係為正常(即，等效於僅表現小鼠抗體鏈的小鼠的隔室)。
(b)骨髓B前身細胞分析
為從骨髓獲得各小鼠的單一細胞懸浮液，股骨和脛骨以補充有3%熱失活胎牛血清(FCS)的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)沖洗。再使細胞通過30μm細胞濾網，以移除碎骨或細胞叢。使細胞再次懸浮於補充有3%血清的冷PBS。將2x106個細胞加至個別管中，旋轉沉澱以除去過量的緩衝液，並再次懸浮於新鮮100μl PBS+3% FCS。對個別管加入下列抗體：抗-白细胞唾液酸蛋白(CD43)異硫氰酸螢光素(FITC)(eBioscience，無性系eBioR2/60)與抗-B220/CD45R(eBioscience，無性系RA3-6B2)別藻藍蛋白(APC)。細胞於黑暗中6℃培育15分鐘，接著以新鮮PBS+3%FCS洗滌數次，以移除未結合抗體。細胞係使用得自Miltenyi Biotech的螢光激活細胞分選(FACS)分析儀來分析。活體骨髓細胞係使用側向散射(SSC)和前向散射(FSC)來分閘。在對數標度圖上，吾人使用分閘來識別並定義細胞群體亞群。在應用分閘之前，各螢光染料的單株抗體係用於區別正性(高強度螢光染料)與負性(測不到螢光染料強度)群體。分閘係以螢光染料強度為基礎以相同方式應用至所有樣本。單株為：B220-APC
CD43-FITC
在活體群體內，B220/CD45R與CD43雙重群體正性細胞係辨識為初-B、前-B與初-前B細胞。本發明小鼠的脾系B-細胞隔室係為正常(即，等效於僅表現小鼠抗體鏈的小鼠的隔室)。
本發明基因轉殖小鼠發展正常的Ig表現 血清IgM與IgG的定量
先以捕獲抗體(山羊抗-小鼠Fab抗體，1μg/ml)塗覆96-孔NUNC盤並於4℃過夜。IgG盤使用抗-Fab(M4155Sigma)且IgM盤使用抗-Fab(OBT1527 AbD Serotec)。在以含有0.1% v/v Tween20的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗三次後，以含有1% w/v牛血清白蛋白(BSA)的200μl PBS於室溫(RT)阻斷該盤1小時。該盤如上述般洗三次後且隨後將50μl標準液(控制組小鼠同型抗體、IgG1(M9269 Sigma)、IgG2a(M9144Sigma)、IgG2b(M8894 sigma)、IgM(M3795 Sigma)或稀釋於帶有0.1% BSA的PBS的血清樣本加至各孔，並於RT培育1小時。如上述以100μl偵測抗體(山羊抗-小鼠同型特異性抗體-已共軛辣根過氧化物酶，1/10000，溶於PBS，帶有0.1% Tween)洗三次後，將抗-小鼠IgG1(STAR132P AbD Serotec)、抗-小鼠IgG2a(STAR133P AdD Serotec)、抗-小鼠IgG2b(STAR134P AbD Serotec)與抗-小鼠IgM(ab97230 Abcam)加至各孔並於RT培育1小時。該盤如上述般洗三次並在黑暗中於RT使用四甲基聯苯胺(TMB，Sigma)發展4-5分鐘。藉由添加每孔50μl的1M硫酸來停止發展。 以Biotek Synergy HT盤讀取器於450nm讀取該盤。
結論：
在人類IGH BAC插入之後的內源性VH-D-JH倒置導致內源性VH對所插入人類D-JH重排的失活。然而，發明人觀察到，出乎意料地，內源性重鏈表現的失活並不改變脾系隔室中的B-細胞(圖11)或骨髓B前身隔室(圖12)的比率且血清中的免疫球蛋白位準係為正常並表現正確的Ig亞型(圖13)。此係展示於表現人類重鏈可變區和小鼠輕鏈的小鼠(圖11A 12A)以及於表現人類重鏈可變區與人類輕鏈可變區兩者的小鼠(圖11B與12B)。該等資料證實了所插入的人類IGH基因區段(插入至少人類VH基因區段VH2-5、7-4-1、4-4、1-3、1-2、6-1，和所有人類D與JH基因區段D1-1、2-2、3-3、4-4、5-5、6-6、1-7、2-8、3-9、5-12、6-13、2-15、3-16、4-17、6-19、1-20、2-21、3-22、6-25、1-26與7-27；以及J1、J2、J3、J4、J5與J6)在重排、BCR信號傳導與B細胞熟成態樣中係具完全功能性。在插入人類輕鏈VJ基因區段以提供基因轉殖輕鏈時，依照用於創建K2等位基因的插入，功能性亦保留。此插入為包含下列的插入：人類基因區段Vκ2-24、Vκ3-20、Vκ1-17、Vκ1-16、Vκ3-15、Vκ1-13、Vκ1-12、Vκ3-11、Vκ1-9、Vκ1-8、Vκ1-6、Vκ1-5、Vκ5-2、Vκ4-1、Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4與Jκ5。S1F/HA；K2/KA小鼠所表現的大於90%抗體係包含人類重鏈可變區與人類κ輕鏈可變區。該等小鼠因此極有益於篩選具有特異性地結合人類抗原-在以此類抗原使小鼠免疫化後-之人類可變區 的抗體。在單離此類抗體之後，熟習此藝者可使用習用技術將小鼠恒定區置換成人類恒定區，以實現可用作投至人類之藥物候選者的全人抗體(任擇地在突變或改造以製造進一步的衍生物，譬如帶有Fc增強或失活之後或在共軛至毒性載荷或信息子或標記或其他活性部分之後)。
進行進一步實驗，以評估在表現具有人類重與輕(κ)可變區的抗體的本發明基因轉殖小鼠(S1F/HA，K2/KA小鼠；n=15)的IgG與IgM位準與相對比例。該等係和僅表現小鼠抗體鏈(+/HA，+/KA(n=6)與野生型小鼠(WT；n=6))的12隻小鼠比對。結果列於下表(表19)並展示於圖14。
可以看到本發明小鼠-其中基本上所有重鏈可變區為人類重鏈可變區-表現正常比例的IgM與IgG亞型，而且相對於IgM的總IgG亦正常。
實施例4： K的評估：在本發明基因轉殖小鼠中的λ比率&脾系B-細胞隔室
獲得包含下列基因組的小鼠。
WT/WT=野生型；KA/KA=各個內源性κ等位基因已被失活；以及內源性λ基因座保持原樣；K3F/K3F=各個內源性κ等位基因具有三個κ鏈基因座DNA插入最3’端內源性Jκ與小鼠Cκ之間，提供了插入人類V基因區段VK2-40、VK1-39、Vκ1-33、Vκ2-30、Vκ2-29、Vκ2-28、Vκ1-27、Vκ2-24、Vκ3-20、Vκ1-17、Vκ1-16、Vκ3-15、Vκ1-13、Vκ1-12、Vκ3-11、Vκ1-9、Vκ1-8、Vκ1-6、Vκ1-5、Vκ5-2與Vκ4-1以及人類J基因區段Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4與Jκ5(人類V基因區段為人類J基因區段的5’)；各個內源性κVJ已藉由倒置與移至染色體上游被失活；以及內源性λ基因座保持原樣；L2/L2=如實施例2所述(L2純合子，其中人類λ可變區DNA已插入內源性λ基因座；內源性κ基因座保持原樣)；L2/L2；KA/KA=如同L2/L2，但內源性κ等位基因已被失活(藉由插入內源性中斷序列=KA)；L3/L3；KA/KA=如同L2/L2；KA/KA，但補充有第三個人類λ可變區DNA插入內源性λ基因座內的第二個λDNA插入的5’，俾使下列人類λ基因區段插入最3’端內源性Jλ與小鼠Cλ之間：人類V基因區段Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、 Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3與Vλ3-1、人類J與C基因區段Jλ1-Cλ1、Jλ2-Cλ2、Jλ3-Cλ3、Jλ6-Cλ6與Jλ7-Cλ7(無功能性區段Jλ4-Cλ4、Jλ5-Cλ5亦被包括)，於是提供對應於第22號人類染色體座標22886217至23327884緊挨著插在第16號小鼠染色體上的19047551位置後的插入；S3F/HA；KA/KA；L3/L3=第一個內源性重鏈等位基因具有三個人類重鏈可變區DNA插入最3’端內源性JH與Eμ之間，提供人類基因區段VH2-26、VH1-24、VH3-23、VH3-21、VH3-20、VH1-18、VH3-15、VH3-13、VH3-11、VH3-9、VH1-8、VH3-7、VH2-5、VH7-4-1、VH4-4、VH1-3、VH1-2、VH6-1，D1-1、D2-2、D3-9、D3-10、D4-11、D5-12、D6-13、D1-14、D2-15、D3-16、D4-17、D5-18、D6-19、D1-20、D2-21、D3-22、D4-23、D5-24、D6-25、D1-26、D7-27、JH1、JH2、JH3、JH4、JH5與JH(順序：人類V基因區段、人類D基因區段與人類J基因區段)的插入；內源性重鏈VDJ序列已藉由倒置與移至染色體上游被失活；以及內源性λ基因座保持原樣；第二個內源性重鏈等位基因已藉由插入內源性中斷序列被失活=HA)；內源性κ等位基因已被失活(=KA/KA)；以及內源性λ等位基因已藉由插入人類λ可變區DNA修飾(=L3/L3)；P2/WT=P2等位基因(如實施例1所述的人類λ可變區DNA)於一個內源性κ基因座；其餘內源性κ基因座保持原樣；內源性λ基因座均保持原樣； P2/P2=參閱實施例14；內源性λ基因座均保持原樣；P2/K2=P2等位基因於一個內源性κ基因座；其餘內源性κ基因座具有兩個DNA插入最3’端內源性Jκ與小鼠Cκ之間，提供人類V基因區段Vκ2-24、Vκ3-20、Vκ1-17、Vκ1-16、Vκ3-15、Vκ1-13、Vκ1-12、Vκ3-11、Vκ1-9、Vκ1-8、Vκ1-6、Vκ1-5、Vκ5-2與Vκ4-1以及人類J基因區段Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4與Jκ5(人類V基因區段為人類J基因區段的5’)的插入；內源性λ基因座均保持原樣；P3/K3F=一個內源性κ基因座-具有介於下列人類λ基因區段之間的插入-係插入最3’端內源性Jκ與小鼠Cκ之間，提供人類V基因區段Vλ3-27、Vλ3-25、Vλ2-23、Vλ3-22、Vλ3-21、Vλ3-19、Vλ2-18、Vλ3-16、Vλ2-14、Vλ3-12、Vλ2-11、Vλ3-10、Vλ3-9、Vλ2-8、Vλ4-3與Vλ3-1、人類J與C基因區段Jλ1-Cλ1、Jλ2-Cλ2、Jλ3-Cλ3、Jλ6-Cλ6與Jλ7-Cλ7(無功能性區段Jλ4-Cλ4、Jλ5-Cλ5亦被包括)的插入，於是提供對應於第22號人類染色體座標22886217至23327884緊挨著插在第6號小鼠染色體70674755位置後的插入；其他內源性κ基因座具有上述K3F等位基因(所插入的人類V與J的κ基因區段)；內源性λ基因座均保持原樣；P2/P2；L2/WT=如同P2/P2，但其中一個內源性λ基因座具有L2等位基因(所插入的人類λV與J基因區段)且其他內源性λ基因座為野生型；以及P2/P2；L2/L2=為分別位於內源性κ與λ基因座的P2與L2等位基因的純合子。
進行脾系B-細胞的FACS分析(如上所述)並測定輕鏈表現的比例。吾人亦測定T1、T2與成熟(M)脾系B-細胞的比例並和野生型小鼠比對，以評估吾人是否獲得在基因轉殖小鼠中的正常脾系B-細胞隔室。結果顯示於表20與21。吾人亦評估作為脾系細胞樣本中的B-細胞比例指標的B220正性細胞比例。
結論
如L2/L2；KA/KA與L3/L3；KA/KA所證實的，將人類λ可變區DNA插入在內源性λ基因座(內源性κ剔除)展現帶有人類λ可變區之輕鏈的優勢表現(如Cλ-正鏈表現為大約93%所指出)。即便內源性小鼠λ可變區DNA仍然存在，此亦出乎意料地發生，指出所插入的人類λ可變區DNA可和內源性Igλ重排相抗衡。
再者，具有以純合L3插入存在之人類V與J基因區段的小鼠製造類似於野生型比例的B-細胞(B220正性細胞)並額外地製造正常比例或百分比的成熟脾系B-細胞(即，類似於野生型)。此不僅由L3/L3；KA/KA小鼠確認，亦在S3F/HA；KA/KA；L3/L3觀察到，其亦包含嵌合(人類-小鼠)IgH基因座。
再者，吾人觀察到具有以純合K3F插入存在之人類V與J基因區段的小鼠製造類似於野生型比例的B-細胞(B220正性細胞)並額外地製造正常比例或百分比的成熟脾系B-細胞(即，類似於野生型)。
具有以純合P2插入內源性κ基因座存在之人類V與J基因區段的小鼠顯示包含人類λ可變區之輕鏈的高度表現(如觀察到的76%比例所指)。吾人可藉由結合人類λV與J基因區段插入內源性κ與λ基因座兩者而偏移到甚至更高的整體比例(見P2/P2；L2/WT，大約94%以及P2/P2；L2/L2，大約95%)。再者，包含P2/P2；L2/L2人類V與J基因區段排列的小鼠製造正常比例或百分比的成熟脾系B-細胞(即，類 似於野生型)。
當人類λV與J基因區段插入於一個內源性κ基因座且另一個內源性κ基因座係包含人類κV與J基因區段的插入時，吾人獲得可表現包含λ可變區之輕鏈還有包含κ可變區之輕鏈的小鼠。出乎意料地觀察到吾人可提高上述包含λ可變區的輕鏈在野生型小鼠中所看到的比例，在野生型小鼠中，通常僅5%或更少輕鏈包含λ可變區。吾人觀察到P2/K2基因型為大約22%且P3/K3F基因型為大約31%的比例。以後者基因型觀察到的比例約略為在人類中所看到的比例，在人類中，通常大約60%輕鏈包含κ可變區且大約40%輕鏈包含λ可變區。亦就P2/K2與P3/K3F而言，相較於野生型小鼠，該小鼠製造正常比例的B-細胞。再者，包含P3/K3F人類V與J基因區段排列的小鼠製造正常比例或百分比的成熟脾系B-細胞(即，類似於野生型)。
實施例5：
生成包含表3所列的特異性IgH等位基因；以及表10或11所列的特異性IgL等位基因的小鼠。以標靶抗原使小鼠免疫化並單離抗原-特異性抗體。以抗體評估結合特異性、熟成(即，接合與體突變程度對上生殖系基因區段序列)與結合動力學。亦獲得對應的B-細胞且在一些情況中，製造表現選定抗體的融合瘤。
選定抗體係整理於表22。該等若干的結合動力學係如下列測定。
結合動力學測定
抗-小鼠IgG捕獲表面係使用GE Healthcare抗-小鼠IgG(BR-1008-38)藉由一級胺偶合作用創建在GLM BiosensorTM晶片上。列於表22的測試抗體係捕獲在此表面上並使個別抗原以指定濃度通過已捕獲Ab。緩衝液(即0nM抗原)的注射係用於雙重參照結合曲線，使資料配合ProteOn XPR36TM分析軟體內置的1：1模型。使用10mM甘胺酸、pH1.7執行捕獲表面的再次生成。試驗係於25℃運行並使用HBS-EP作為運行緩衝液。
標靶1：多重次單元人類蛋白質
標靶2：細菌細胞毒素
標靶3：不同的多重次單元人類蛋白質
標靶4：表現為人類細胞上的跨膜蛋白質的蛋白質
標靶1 mAb1.1
單一濃度標靶1(256nM)，抗-小鼠捕獲
(表觀親和力，由於多重次單元標靶)
標靶2 mAb2.1
標靶2，為256、64、16、4與1nM；3次實驗的結果：-
實驗1：
實驗2：
實驗3：
無法解析解離速率-指示極度緊密結合，超出可偵測極限。
標靶3 mAb3.1
標靶3，為256、64、16、4與1nM
(表觀親和力，由於多重次單元標靶)
標靶3 mAb3.2
標靶3，為256、64、16、4與1nM
(表觀親和力，由於多重次單元標靶)
標靶3 mAb3.3
標靶3，為256、64、16、4與1nM
ka kd KD
無法解析解離速率，極度緊密結合
(表觀親和力，由於多重次單元標靶)
結論是，本發明提供可在體內系統表現的帶有人類可變域之體內親和力成熟抗體，該抗體並以極佳親和力、結合與解離速率特異性地結合標靶抗原。本發明於是提供可用於人類醫藥的抗體，還有用於製造此類抗體的非人類脊椎動物、細胞(譬如B-細胞與融合瘤)。
實施例6：
用於生成實施例資料的S(重)、K(κ插入κ基因座)、L(λ插入λ基因座)與P(λ插入κ基因座)系係使用表1至18的等位基因並證實此類等位基因集可製造所顯示的出乎意料結果(譬如在小鼠中的良好B細胞隔室、高度人類λV區表現、所欲的λ：κ比率與正常的IgH同型匯集庫)。單離抗體皆以上文表1至18所列示等位基因為基礎。所有具有帶有小鼠AID與TdT樣型突變的V域。
其他具體例
從前述說明，很顯然的是可對本案所述發明進行變更與修飾，以用於不同用途與條件。此類具體例亦落於下列請求項之範疇以內。
在本案引用變數的任何定義的成分列表係包括該變數作為任何單一成分或所列成分的組合(或次組合)的定義。在本案引用具體例係包括該具體例作為任何單一具體例或結合任何其他具體例或其一部分。
在本說明書中提到的所有刊物和專利申請案係表明本發明所屬領域之技術人員的技術水平。所有刊物和專利申請案係以參照方式併入本案，猷如各別刊物和專利申請案被明確地且個別地表明以參照方式併入的相同程度。
<110> 凱美寶有限公司
<120> 動物模式及治療分子
<130> 25077.108
<140> PCT/GB2014/052971
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Claims (53)

  1. 一種非人類脊椎動物細胞(譬如小鼠細胞或大鼠細胞)，其基因組係包含位於重鏈基因座恒定區上游的一或多個人類VH基因區段、一或多個人類JH基因區段與一或多個人類D基因區段以及位於輕鏈基因座恒定區上游的一或多個人類JL基因區段與一或多個人類VL基因區段，其中在各基因座內的該基因區段係操作性地接附至其恒定區，俾使該細胞能夠製造抗體重鏈與抗體輕鏈，或其中該細胞可發展成表現抗體重鏈與抗體輕鏈的脊椎動物，其中該重鏈基因座的一或多個人類VH基因區段係包含一個、多個或所有人類VH基因區段或由一個、多個或所有人類VH基因區段構成，該基因區段係選自由下列構成之群組：VH3-23*04、VH7-4-1*01、VH4-4*02、VH1-3*01、VH3-13*01、VH3-7*01、VH3-20*d01與VH3-9*01。
  2. 一種非人類脊椎動物(譬如小鼠或大鼠)，其基因組係包含位於重鏈基因座恒定區上游的一或多個人類VH基因區段、一或多個人類JH基因區段與一或多個人類D基因區段以及位於輕鏈基因座恒定區上游的一或多個人類JL基因區段與一或多個人類VL基因區段，其中在各基因座內的該基因區段係操作性地接附至其恒定區，俾使該脊椎動物能夠製造抗體重鏈與抗體輕鏈，其中該重鏈基因座的一或多個人類VH基因區段係包含一個、多個 或所有人類VH基因區段或由一個、多個或所有人類VH基因區段構成，該基因區段係選自由下列構成之群組：VH3-23*04、VH7-4-1*01、VH4-4*02、VH1-3*01、VH3-13*01、VH3-7*01、VH3-20*d01或VH3-9*01。
  3. 如請求項1或2之細胞或脊椎動物，其中該重鏈係藉由人類JH區段和D區段及選自由下列構成群組的VH區段之重組所製造：VH3-23*04、VH7-4-1*01、VH4-4*02、VH1-3*01、VH3-13*01、VH3-7*01、VH3-20*d01與VH3-9*01。
  4. 如任何前述請求項之細胞或脊椎動物，其中該基因組係包含人類JH2*01及/或人類JH6*02且該重鏈係藉由人類JH2*01或人類JH6*02和D區段及選自由下列構成群組的VH區段之重組所製造：VH3-23*04、VH7-4-1*01、VH4-4*02、VH1-3*01、VH3-13*01、VH3-7*01、VH3-20*d01與VH3-9*01。
  5. 如任何前述請求項之脊椎動物，其中該脊椎動物係製造人類抗體重鏈可變域匯集庫，該匯集庫包含由人類VH3-23*04、VH7-4-1*01、VH4-4*02、VH1-3*01、VH3-13*01、VH3-7*01、VH3-20*d01與VH3-9*01基因區段之重組所製造的可變域。
  6. 一種非人類脊椎動物細胞(譬如小鼠細胞或大鼠細胞)，其基因組係包含位於重鏈基因座恒定區上游的一或多個人類VH基因區段、一或多個人類JH基因區段與一或多個人類D基因區段以及位於輕鏈基因座恒定區上游的 一或多個人類Jκ基因區段與一或多個人類Vκ基因區段，其中在各基因座內的該基因區段係操作性地接附至其恒定區，俾使該細胞能夠製造抗體重鏈與抗體輕鏈，或其中該細胞可發展成表現抗體重鏈與抗體輕鏈的脊椎動物，其中該一或多個人類Vκ基因區段係包含一個、多個或所有人類Vκ基因區段或由一個、多個或所有人類Vκ基因區段構成，該基因區段係選自由下列構成之群組：Vκ4-1*01、Vκ2-28*01、Vκ1D-13*d01、Vκ1-12*01、Vκ1D-12*02、Vκ3-20*01、Vκ1-17*01、Vκ1D-39*01、Vκ3-11*01、Vκ1D-16*01與Vκ1-9*d01。
  7. 一種非人類脊椎動物(譬如小鼠或大鼠)，其基因組係包含位於重鏈基因座恒定區上游的一或多個人類VH基因區段、一或多個人類JH基因區段與一或多個人類D基因區段以及位於輕鏈基因座恒定區上游的一或多個人類Jκ基因區段與一或多個人類Vκ基因區段，其中在各基因座內的該基因區段係操作性地接附至其恒定區，俾使該脊椎動物能夠製造抗體重鏈與抗體輕鏈，其中該一或多個人類Vκ基因區段係包含一個、多個或所有人類Vκ基因區段或由一個、多個或所有人類Vκ基因區段構成，該基因區段係選自由下列構成之群組：Vκ4-1*01、Vκ2-28*01、Vκ1D-13*d01、Vκ1-12*01、Vκ1D-12*02、Vκ3-20*01、Vκ1-17*01、Vκ1D-39*01、Vκ3-11*01、Vκ1D-16*01與Vκ1-9*d01。
  8. 如任何前述請求項之細胞或脊椎動物，其中該基因組係 包含人類Jκ2*01及/或人類Jκ4*01且該輕鏈係藉由人類Jκ2*01或人類Jκ4*01和Vκ區段之重組所製造。
  9. 如請求項8之細胞或脊椎動物，其中該Vκ區段係選自由下列構成的群組：Vκ4-1*01、Vκ2-28*01、Vκ1D-13*d01、Vκ1-12*01、Vκ1D-12*02、Vκ3-20*01、Vκ1-17*01、Vκ1D-39*01、Vκ3-11*01、Vκ1D-16*01與Vκ1-9*d01。
  10. 如任何前述請求項之細胞或脊椎動物，其中該輕鏈係藉由人類Jκ區段和選自由下列構成群組的Vκ區段之重組所製造：Vκ4-1*01、Vκ2-28*01、Vκ1D-13*d01、Vκ1-12*01、Vκ1D-12*02、Vκ3-20*01、Vκ1-17*01、Vκ1D-39*01、Vκ3-11*01、Vκ1D-16*01與Vκ1-9*d01。
  11. 如任何前述請求項之脊椎動物，其中該脊椎動物係製造人類抗體輕鏈可變域匯集庫，該匯集庫包含由人類Vκ4-1*01、Vκ2-28*01、Vκ1D-13*d01、Vκ1-12*01、Vκ1D-12*02、Vκ3-20*01、Vκ1-17*01、Vκ1D-39*01、Vκ3-11*01、Vκ1D-16*01與Vκ1-9*d01基因區段之重組所製造的可變域。
  12. 如任何前述請求項之細胞或脊椎動物，其中該人類Jκ基因區段與Vκ基因區段係位於內源性輕鏈基因座的恒定區上游及/或該人類JH基因區段、D基因區段與VH基因區段係位於內源性重鏈基因座的恒定區上游。
  13. 如任何前述請求項之細胞或脊椎動物，其基因組係包含位於重鏈基因座恒定區上游的人類JH2*01及/或人類JH6*02、一或多個人類VH基因區段與一或多個人類D 基因區段以及位於輕鏈基因座恒定區上游的人類Jκ2*01及/或人類Jκ4*01與一或多個人類Vκ基因區段，其中在各基因座內的該基因區段係操作性地接附至其恒定區，俾使該細胞或脊椎動物能夠製造抗體重鏈與抗體輕鏈，或其中該細胞可發展成表現抗體重鏈與抗體輕鏈的脊椎動物，其中該重鏈係藉由人類JH2*01及/或JH6*02區段和D區段與VH區段之重組所製造且該輕鏈係藉由人類Jκ2*01及/或Jκ4*01區段和Vκ區段之重組所製造。
  14. 如任何前述請求項之細胞或脊椎動物，其中該一或多個人類VH基因區段係包含人類VH3-23*04，任擇地，其中該重鏈係藉由人類JH區段和D區段與該VH區段之重組所製造。
  15. 如任何前述請求項之細胞或脊椎動物，其中該一或多個人類VH基因區段係包含人類VH3-9*01，任擇地，其中該重鏈係藉由人類JH區段和D區段與該VH區段之重組所製造。
  16. 如請求項6-12中任一項之細胞或脊椎動物，其中該一或多個人類Vκ基因區段係包含人類Vκ1D-12*02，任擇地，其中該輕鏈係藉由人類Jκ區段和該Vκ區段之重組所製造。
  17. 如請求項6-12中任一項之細胞或脊椎動物，其中該一或多個人類Vκ基因區段係包含人類Vκ1-12*01，任擇地，其中該輕鏈係藉由人類Jκ區段和該Vκ區段之重組所製 造。
  18. 如請求項6-12中任一項之細胞或脊椎動物，其中該一或多個人類Vκ基因區段係包含人類Vκ2-28*01，任擇地，其中該輕鏈係藉由人類Jκ區段和該Vκ區段之重組所製造。
  19. 如請求項6-12中任一項之細胞或脊椎動物，其中該一或多個人類Vκ基因區段包含人類Vκ4-1*01，任擇地，其中該輕鏈係藉由人類Jκ區段和該Vκ區段之重組所製造。
  20. 如任何前述請求項之細胞或脊椎動物，其中該一或多個人類JH基因區段係包含人類JH6*02，任擇地，其中該重鏈係藉由該人類JH區段和人類D與VH區段之重組所製造。
  21. 如任何前述請求項之細胞或脊椎動物，其中該一或多個人類JH基因區段係包含人類JH6*01，任擇地，其中該重鏈係藉由該人類JH區段和人類D與VH區段之重組所製造。
  22. 如任何前述請求項之細胞或脊椎動物，其中該一或多個人類JH基因區段係包含人類JH2*01，任擇地，其中該重鏈係藉由該人類JH區段和人類D與VH區段之重組所製造。
  23. 如任何前述請求項之細胞或脊椎動物，其中該一或多個人類JH基因區段係包含人類JH3*02，任擇地，其中該重鏈係藉由該人類JH區段和人類D與VH區段之重組所製造。
  24. 如請求項6-12中任一項之細胞或脊椎動物，其中該一或多個人類Jκ基因區段係包含人類Jκ2*01，任擇地，其中該輕鏈係藉由該人類Jκ區段和人類Vκ區段之重組所製造。
  25. 如請求項6-12中任一項之細胞或脊椎動物，其中該一或多個人類Jκ基因區段係包含人類Jκ4*01，任擇地，其中該輕鏈係藉由該人類Jκ區段和人類Vκ區段之重組所製造。
  26. 如任何前述請求項之細胞或脊椎動物，其中該重鏈的一或多個人類VH基因區段係包含一個、多個或所有人類VH基因區段或由一個、多個或所有人類VH基因區段構成，該基因區段係選自由下列構成之群組：VH3-23*04、VH7-4-1*01、VH4-4*02、VH1-3*01、VH3-13*01、VH3-7*01、VH3-20*d01與VH3-9*01且該一或多個人類VL基因區段係包含一個、多個或所有人類VL基因區段或由一個、多個或所有人類VL基因區段構成，該基因區段係選自由下列構成之群組：Vκ4-1*01、Vκ2-28*01、Vκ1D-13*d01、Vκ1-12*01、Vκ1D-12*02、Vκ3-20*01、Vκ1-17*01、Vκ1D-39*01、Vκ3-11*01、Vκ1D-16*01與Vκ1-9*d01。
  27. 如任何前述請求項之細胞或脊椎動物，其中該一或多個VH基因區段係選自由下列構成的群組：VH3-23*04、VH7-4-1*01、VH4-4*02、VH1-3*01、VH3-13*01、VH3-7*01與VH3-20*d01。
  28. 一種製造抗體或其抗原結合片段的方法，該方法包含以抗原使請求項2-5與7-27中任一項之脊椎動物免疫化並回收該抗體或片段或回收製造該抗體或片段的細胞；任擇地修飾所製造的抗體或片段，俾使其包含人類恒定區，其中該抗體的可變域係由下列所編碼：一或多個人類JH基因區段、一或多個人類D基因區段及選自由下列構成群組的一或多個人類VH基因區段：VH3-23*04、VH7-4-1*01、VH4-4*02、VH1-3*01、VH3-13*01、VH3-7*01、VH3-20*d01與VH3-9*01及/或一或多個人類Jκ基因區段及選自由下列構成群組的一或多個人類Vκ基因區段：Vκ4-1*01、Vκ2-28*01、Vκ1D-13*d01、Vκ1-12*01、Vκ1D-12*02、Vκ3-20*01、Vκ1-17*01、Vκ1D-39*01、Vκ3-11*01、Vκ1D-16*01與Vκ1-9*d01。
  29. 如請求項28之方法，其中該一或多個VH基因區段係選自由下列構成的群組：VH3-23*04、VH7-4-1*01、VH4-4*02、VH1-3*01、VH3-13*01、VH3-7*01與VH3-20*d01。
  30. 如請求項28或29之方法，其中該抗原為多重次單元人類蛋白質、細菌細胞毒素或表現為人類細胞上的跨膜蛋白質的蛋白質。
  31. 一種製造抗體或其抗原結合片段的方法，該方法包含從如請求項1、3-4、6與8-27之細胞單離抗體或其抗原結合 片段；以及任擇地修飾單離抗體或片段，俾使其包含人類恒定區。
  32. 如請求項28-31中任一項之方法，其中所單離抗體的重鏈或輕鏈係如同請求項14-25中任一項所列示者。
  33. 如請求項31或32之方法，該方法更包含(a)從該脊椎動物單離編碼結合該抗原之抗體的B-細胞，(b)辨識或複製編碼該抗體VH域的B-細胞的核苷酸序列及/或辨識或複製編碼該抗體VL域的B-細胞的核苷酸序列；以及(c)使用該(多個)序列製造包含該VH及/或VL域的單離抗體或片段；任擇地，其中該單離抗體或片段係包含人類恒定區。
  34. 如請求項28-33中任一項之方法，其中該抗體或片段係藉由選自CHO、HEK293、Cos或酵母(譬如畢赤酵母屬(Picchia))細胞之宿主細胞表現所製造。
  35. 如請求項34之方法，其中該抗體或片段係藉由CHO細胞表現所製造。
  36. 如請求項28-35中任一項之方法，該方法更包含以稀釋劑、載劑、賦形劑或藥物調配該抗體或片段，以製造用於人類醫藥用途的藥學組成物，該方法任擇地更包含將該組成物包裝至無菌容器，舉例來說，瓶、管、IV袋或注射器，更任擇地製造一套組，該套組係包含結合該包裝及指示使用該用於人類醫藥用途之抗體組成物的標 籤或說明；任擇地，其中該標籤或指示係包含醫藥品批次編號及/或上市許可編號，更任擇地，EMA或FDA上市許可編號。
  37. 如請求項28-36中任一項之方法，其中該脊椎動物係如請求項2-5與7-27中任一項且藉由該方法所製造的抗體或片段係包含(a)人類重鏈可變域，為VH3-23*04、VH7-4-1*01、VH4-4*02、VH1-3*01、VH3-13*01、VH3-7*01、VH3-20*d01與VH3-9*01、人類JH基因區段及人類D基因區段的重組體；及/或(b)人類輕鏈可變域，為Vκ4-1*01、Vκ2-28*01、Vκ1D-13*d01、Vκ1-12*01、Vκ1D-12*02、Vκ3-20*01、Vκ1-17*01、Vκ1D-39*01、Vκ3-11*01、Vκ1D-16*01與Vκ1-9*d01及人類Jκ基因區段的重組體。
  38. 如請求項37之方法，其中藉由該方法所製造的抗體或片段係包含JH2*01、JH6*02、JH6*01或JH3*02、D區段與該VH區段之一者的人類重鏈可變域重組體。
  39. 如請求項37之方法，其中藉由該方法所製造的抗體或片段係包含Jκ4*01或Jκ2*01和該Vκ區段之一者的人類輕鏈可變域重組體。
  40. 如請求項37之方法，其中藉由該方法所製造的抗體或片段係包含如請求項38之重鏈可變域重組體以及如請求項39之輕鏈可變域重組體。
  41. 如請求項37之方法，其中藉由該方法所製造的抗體或片 段係包含VH3-23*04與JH2*01的人類重鏈可變域重組體以及Vκ4-1*01與Jκ2*01的人類輕鏈可變域重組體。
  42. 如請求項37之方法，其中藉由該方法所製造的抗體或片段係包含VH3-7*01與JH6*02的人類重鏈可變域重組體以及Vκ2-28*01與Jκ4*01的人類輕鏈可變域重組體。
  43. 一種單離抗體或片段或套組，其係藉由如請求項28-42中任一項之方法所製造。
  44. 一種單離抗體或其抗原結合片段或套組，其係藉由如請求項28-42之方法所製造，其中該抗體係經人源化。
  45. 一種組成物，其包含藉由如請求項28-42之方法所製造的抗體或片段或套組，其中該抗體或片段為唯一治療劑。
  46. 一種組成物，其包含藉由如請求項28-42之方法所製造的抗體或片段或套組，該組成物更包含額外的治療劑，舉例來說，抗高膽固醇血症藥物。
  47. 一種藉由如請求項28-42中任一項之方法所製造的單離抗體或片段或套組，其係用於人類醫藥用途。
  48. 一種藉由如請求項28-42中任一項之方法所製造的單離抗體或片段的用途，該用途係製造用於人類醫藥用途之醫藥品。
  49. 如請求項48之用途，其中該醫藥品係包含在如請求項36或46所列示的組成物或套組內。
  50. 如請求項43-46之單離抗體或片段或套組、或如請求項47-49之用途，其可特異性地結合選自下列的人類標靶： 前體蛋白轉化酶PC9、前體蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶科信素-9(kexin-9)(PCSK9)、CD126、IL-4、IL-4受體、IL-6、IL-6受體、IL-13、IL-18受體、Erbb3、細胞ASIC1、ANG2、GDF-8、血管生成素配體-2、δ樣蛋白質配體4、免疫球蛋白G1、PDGF配體、PDGF受體或NGF受體、困難梭狀芽孢桿菌(Clostridium difficile)的毒素A或毒素B、鬆弛素、CD48、Cd20、升糖素受體、蛋白酶激活受體2、TNF樣配體1A(TL1A)、血管生成素相關-2(AR-2)、血管生成素樣蛋白質4、RANKL、血管生成素樣蛋白質3(ANGPTL3)、δ樣配體4(DLL4)、大型內皮素-1(ET-1)、活化素A、受體酪胺酸激酶，舉例來說，人類AR-1及帶有Ig與EGF同源域(TIE)和TIE-2受體的酪胺酸激酶。
  51. 如請求項43-46之單離抗體或片段或套組、或如請求項47-49之用途，該用途係用於治療對彼等有所需求的人類，其中該治療係包含輸送有效量之抗體或片段，該抗體或片段係特異性地結合至病毒或選自人類細胞介質、生長因子、激素、酶與血清蛋白之抗原。
  52. 一種宿主細胞，舉例來說，CHO、HEK293、Cos或酵母(譬如畢赤酵母屬)細胞，該宿主細胞表現藉由如請求項29-42中任一項之方法所製造的抗體或片段。
  53. 一種非人類脊椎動物(譬如小鼠或大鼠)細胞，其基因組係包含位於重鏈基因座恒定區上游的人類VH、D與JH基因區段以及位於輕鏈基因座恒定區上游的人類VL與JL基因區段，其中該基因區段係操作性地接附至其恒定 區，俾使該細胞能夠表現分別包含人類VH與VL域的免疫球蛋白重鏈與輕鏈，其中該重鏈基因座係包含人類01等位基因VH基因區段，該人類01等位基因VH基因區段能夠和人類D與JH基因區段重組，以製造VH域，其中該輕鏈基因座係包含人類01等位基因VL基因區段，該人類01等位基因VL基因區段能夠和人類JL基因區段重組，以製造VL域，或其中該細胞可發展成表現該VH與VL域的脊椎動物；其中該重鏈基因座的一或多個人類VH基因區段係包含一個、多個或所有人類VH基因區段或由一個、多個或所有人類VH基因區段構成，該基因區段係選自由下列構成之群組：VH3-23*04、VH7-4-1*01、VH4-4*02、VH1-3*01、VH3-13*01、VH3-7*01、VH3-20*d01與VH3-9*01或其中該一或多個人類Vκ基因區段係包含一個、多個或所有人類VH基因區段或由一個、多個或所有人類VH基因區段構成，該基因區段係選自由下列構成之群組：Vκ4-1*01、Vκ2-28*01、Vκ1D-13*d01、Vκ1-12*01、Vκ1D-12*02、Vκ3-20*01、Vκ1-17*01、Vκ1D-39*01、Vκ3-11*01、Vκ1D-16*01與Vκ1-9*d01。
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