CN103945689B - 免疫球蛋白基因多样性的操纵及多抗体治疗剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了能表达包含人可变区序列的抗体的改良的非人脊椎动物和非脊椎动物细胞。本发明涉及从非人脊椎动物和细胞中提供长HCDR3。本发明还涉及提供免疫球蛋白重链和轻链基因座中新的V、D和J配对。本发明提供了新的、偏向的抗体多样性及潜在扩展的多样性。本发明还提供了新的和潜在扩展的多样性或者关于抗体共有的可变基因使用的偏向的多样性，可用于治疗和/或预防某些疾病或病症，如感染性疾病。本发明还提供了使用这种脊椎动物产生抗体的方法，以及抗体本身、其治疗组合物及应用。

Description

免疫球蛋白基因多样性的操纵及多抗体治疗剂
发明领域
本发明涉及提供具有长HCDR3长度的抗体。本发明还涉及提供在免疫球蛋白重链和轻链基因座中新的V、D和J配对。本发明提供了新的、偏向的(biased)抗体多样性和潜在扩展的多样性。本发明还提供了新的和潜在扩展的多样性或者偏向于抗体共有的可变基因使用的多样性，可用于治疗和/或预防某些疾病或病症，如感染性疾病。偏向抗体所有成分的这种能力还提供了简化生产抗体混合物如可用于治疗和/或预防感染性疾病的多克隆抗体治疗剂的方法，其中需要靶向多个病原体抗原的多克隆方法。为此，本发明还提供了双特异性抗体，其能结合一个以上的抗原(例如由相同病原体表达的多个感染性抗原)，因此提供了多克隆抗体混合物不可能有的优势(如生产、用量和施用优势)。
本发明提供了脊椎动物和细胞，如转基因小鼠或大鼠或者转基因小鼠或大鼠细胞。此外，本发明涉及使用脊椎动物分离抗体或者编码抗体的核苷酸序列的方法。本发明还提供了抗体、核苷酸序列、药物组合物及应用。
发明背景
现有技术提供了包含转基因免疫球蛋白基因座的非人脊椎动物(例如小鼠和大鼠)和细胞，这种基因座包含人可变(V)、多样性(D)和/或连接(J)区段，及任选存在的人恒定区。或者，在转基因基因座中提供了宿主脊椎动物的内源性恒定区(例如小鼠或大鼠恒定区)。构建这种转基因脊椎动物及使用其在抗原免疫之后产生抗体及其核酸的方法为本领域已知，见例如US7501552(Medarex)、US5939598(Abgenix)、US6130364(Abgenix)、WO02/066630(Regeneron)、WO2011004192(Genome Research Limited)、WO2009076464、WO2009143472和WO2010039900(Ablexis)所述，所述文献并入本文作参考。本领域中的这种转基因基因座包括不同量的人V(D)J库集(repertoire)。
现有的转基因免疫球蛋白基因座趋于基于单一人DNA来源。携带这种转基因基因座的非人脊椎动物中人抗体可变区的潜在多样性因此受到所用的库集的限制。
希望在转基因免疫球蛋白基因座及携带其的非人脊椎动物中以及在免疫这些动物之后产生的抗体中提供人可变区的新的及潜在扩展的库集和多样性。
发明概述
本发明人通过构建转基因非人脊椎动物、免疫、抗体重链收集及深度生物信息学分析，已经揭示了怎样合理设计VH结构域、重链及具有长HCDR3的抗体。这些可用于针对(addressing)抗原(如感染性疾病病原体抗原，受体和酶裂缝)，其中较长的CDR更好地针对靶位。
本发明人还认识到以新的方式提供V、D和J基因区段的组合以在免疫球蛋白基因座中提供在天然或在本领域现有基因座中未发现的合成的基因区段组合的可能性。本发明人认识到在转基因免疫球蛋白基因座及携带其的非人脊椎动物以及在免疫这些动物之后产生的抗体中提供人可变区的新的和潜在扩展的库集和多样性的重要性。一方面，本发明人认识到希望偏向于新的库集以产生具有改良的亲和性和/或生物物理学特性的抗体，和/或其中通过这种库集产生的表位特异性的范围是新的，为抗体提供迄今为止通过现有转基因免疫球蛋白基因座难处理或者难以针对的表位。例如，本发明人设想了特异性应用以偏向新的库集产生可用于治疗和/或预防感染性疾病的抗体。
为此，本发明的第一种配置是提供非人脊椎动物(任选小鼠或大鼠)或者脊椎动物细胞，其基因组包含：
(a)免疫球蛋白重链基因座，其包含位于恒定区上游的一或多个人V基因区段、一或多个人D基因区段及一或多个人J基因区段；任选其中重链基因座处于下文描述的本发明的任一配置中；及
(b)免疫球蛋白轻链基因座，其包含：
(i)位于恒定区上游的一或多个人VH基因区段和一或多个人J基因区段(任选重排的VHJLCL或VHJλCL，其中CL是Cλ或Cκ)；或者
(ii)位于恒定区上游的一或多个人VL基因区段、一或多个人D基因区段及一或多个人JH基因区段(任选重排的VLDJHCL或VλDJHCL，其中CL是Cλ或Cκ)；或者
(iii)位于恒定区上游的一或多个人VL基因区段以及一或多个人JL基因区段，所述人VL基因区段选自如下一组中：VλII基因家族成员、VλVII4A、VλII2.1、VλVII4A、Vλ1基因家族成员、Vλ3基因家族成员、IGLV1S2、Vλ3-cML70、lalh2、lalvl、la3h3、Kv325、VκI基因家族成员、κI-15A(KL012)、VκII家族成员、VκIII家族成员、VκI基因家族成员、κI-15A(KL012)、VκIIA2(任选A2a等位基因)、VκA27(Humkv325)及与其至少80％相同的基因区段；
其中所述重链基因座中的基因区段与其恒定区可操纵地连接，所述轻链基因座中的基因区段与其恒定区可操纵地连接，由此在免疫时，小鼠能产生包含通过重链基因座的重组产生的重链和通过轻链基因座的重组产生的轻链的抗体。
一方面，
在(b)(i)中，所述轻链基因座的V基因区段库集包含或者由一或多个VH基因区段组成，所述VH基因区段选自如下一组中：VHIII基因家族成员(任选VHIIIa或VHIIIb家族成员)、VHIV基因家族成员、VHIII9.1(VH3-15)、VHIII VH26(VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)、VH H11、VH1GRR、ha3h2、VHI-ha1c1、VHIII-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hv1051、71-2、Hv1f10、VH4.11、71-4、VH251、VH1-69及与其至少80％相同的基因区段；或者
在(b)(iii)中，轻链基因座V基因区段库集由一种VL基因区段类型(任选及一或多种其突变体)组成，其中VL基因区段选自所述一组VL基因区段。
在本发明的第二种配置中，提供了：
非人脊椎动物(任选小鼠或大鼠)或者脊椎动物细胞，其基因组包含：
(a)免疫球蛋白重链基因座，其包含位于恒定区上游的一或多个人V基因区段、一或多个人D基因区段及一或多个人J基因区段；及
(b)(i)未重排的免疫球蛋白轻链基因座，其包含位于恒定区上游的一或多个人VH基因区段和一或多个人J基因区段，其中每个人VH基因区段是与用于产生编码来自抗体表达细胞的人抗体重链可变区的重排的VDJ的人VH基因区段(或其突变体)相同的人基因区段，其中所述抗体结合感染性疾病病原体抗原(任选所述抗体的可变区与来自患有、易感于或恢复自由携带或分泌所述抗原的生物体引起或介导的疾病或病症的人类个体或者来自携带所述生物体的人类个体的抗体相同)；或者
(ii)免疫球蛋白轻链基因座，其包含位于恒定区上游的重排的VJ区或者VDJ区，其中所述重组区的核苷酸序列与通过人J基因区段及任选存在的人D基因区段与人VH基因区段的重组产生的核苷酸序列相同，所述人VH基因区段与用于产生编码来自抗体表达细胞的人抗体重链可变区的重排的VDJ的人VH基因区段(或其突变体)相同，其中所述抗体结合感染性疾病病原体抗原(任选所述抗体的可变区与来自患有、易感于或者恢复自由携带或分泌所述抗原的生物体引起或介导的疾病或病症的人类个体或者来自携带所述生物体的人类个体的抗体相同)；
(c)其中所述重链基因座中的基因区段与其恒定区可操纵地连接，所述轻链基因座中的基因区段或VJ或VDJ与其恒定区可操纵地连接，由此在免疫时，小鼠能产生包含通过所述重链基因座的重组产生的重链和衍生自所述轻链基因座的轻链的抗体；
(d)任选地，当应用(b)(i)时，所述轻链基因座中每个所述VH基因区段选自如下一组中：VHIII基因家族成员(任选VHIIIa或VHIIIb家族成员)、VHIV基因家族成员、VHIII9.1(VH3-15)、VHIII VH26(VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)、VH H11、VH1GRR、ha3h2、VHI-ha1c1、VHIII-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hv1051、71-2、Hv1f10、VH4.11、71-4、VH251、VH1-69及与其至少80％相同的基因区段；
(e)任选地，当应用(b)(ii)时，重组区的核苷酸序列与通过人J基因区段及任选存在的人D基因区段与人VH基因区段重组产生的核苷酸序列相同，所述人VH基因区段选自如下一组中：VHIII基因家族成员(任选VHIIIa或VHIIIb家族成员)、VHIV基因家族成员、VHIII9.1(VH3-15)、VHIII VH26(VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)、VH H11、VH1GRR、ha3h2、VHI-ha1c1、VHIII-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hv1051、71-2、Hv1f10、VH4.11、71-4、VH251、VH1-69及与其至少80％相同的基因区段。
一方面，所述轻链基因座的V基因区段库集包含或者由一个人VH基因区段、任选种系VH及其一或多种多态性变体组成，例如每个多态性变体与种系VH核苷酸序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个位置不同。一方面，所述轻链基因座的V基因区段库集包含或者由人VH1-69基因区段、任选种系VH1-69及其一或多种多态性变体组成，例如每个多态性变体与种系VH1-69核苷酸序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个位置不同。下文提供了构建包含VH1-69及多态性变体的免疫球蛋白基因座的实例。通过使用特定基因区段(例如通常在人体中对抗感染或者其它病症产生的人抗体中发现的一个基因区段)及其一或多种多态性变体，可以提供基因的库集且仍使抗体基因库集偏向于与疾病(例如感染性疾病，如细菌或病毒性疾病，如流感)相关的基因区段。这提供了有用的基因库，从中最后产生并分离先导抗体(leadantibody)以治疗/预防所述研究的疾病。在一个实例中，所述多态性变体是在人类或人群中见到的天然变体。技术人员将获知人抗体基因序列的来源，如IMGT(www.imgt.org)、GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)及1000基因组数据库(www.1000genomes.org)。关于数据库操作的生物信息学工具也易于获得且为技术人员已知，例如从1000GenomesProject/EBI(www.1000genomes.org)中公开获得。
另一方面，所述脊椎动物或细胞的基因组对于轻链基因座(b)(i)或(ii)是纯合的，任选其中：
-所述轻链基因座的V基因区段库集由一或多个人VH基因区段组成，所述VH基因区段选自如下一组中：VHIII基因家族成员(任选VHIIIa或VHIIIb家族成员)、VHIV基因家族成员、VHIII9.1(VH3-15)、VHIII VH26(VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)、VHH11、VH1GRR、ha3h2、VHI-ha1c1、VHIII-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hv1051、71-2、Hv1f10、VH4.11、71-4、VH251、VH1-69及与其至少80％相同的基因区段；或者
-所述轻链基因座的重组的VJ或VDJ库集由与通过人VH基因区段与人J基因区段及任选存在的人D基因区段重组产生的一或多个核苷酸序列相同的序列组成，所述人VH基因区段选自如下一组中：VHIII基因家族成员(任选VHIIIa或VHIIIb家族成员)、VHIV基因家族成员、VHIII9.1(VH3-15)、VHIII VH26(VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)、VHH11、VH1GRR、ha3h2、VHI-ha1c1、VHIII-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hv1051、71-2、Hv1f10、VH4.11、71-4、VH251、VH1-69及与其至少80％相同的基因区段。
另一方面，所述脊椎动物或细胞的每个免疫球蛋白轻链基因座是如(b)(i)所述，包含仅一个人VH基因区段，所述人VH基因区段选自如下一组中：VHIII基因家族成员(任选VHIIIa或VHIIIb家族成员)、VHIV基因家族成员、VHIII9.1(VH3-15)、VHIII VH26(VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)、VH H11、VH1GRR、ha3h2、VHI-ha1c1、VHIII-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hv1051、71-2、Hv1f10、VH4.11、71-4、VH251、VH1-69及与其至少80％相同的基因区段，任选其中所述脊椎动物或细胞的基因组对于所述轻链是纯合的，由此所有轻链基因座均包含相同的单个人VH基因区段。
本发明提供了分离结合预定抗原的抗体的第一种方法，所述方法包括：
(a)提供根据任何前述配置或方面的脊椎动物(任选小鼠或大鼠)；
(b)用所述抗原免疫所述脊椎动物(任选其中所述抗原是感染性疾病病原体的抗原)；
(c)从所述脊椎动物中取出B淋巴细胞，选择表达结合所述抗原的抗体的一或多个B淋巴细胞；
(d)任选使所述选择的B淋巴细胞或其后代永生化，任选通过从中产生杂交瘤进行；及
(e)分离由所述B淋巴细胞表达的抗体(例如，以及IgG型抗体)。
本发明提供的第二种方法包括进行第一种方法以及从所述B淋巴细胞中分离编码结合所述抗原的所述抗体的核酸的步骤；任选用编码人或人源化重链恒定区的核苷酸序列交换所述抗体的重链恒定区核苷酸序列及任选亲和性成熟所述抗体的可变区；及任选将所述核酸插入表达载体及任选宿主中。
本发明一方面提供了产生多克隆抗体混合物的方法，所述方法包括进行第一种方法，通过用抗原分别免疫第一和第二脊椎动物(任选第一和第二小鼠或者第一和第二大鼠)及组合分离自每个脊椎动物的抗-抗原抗体(或者所述抗体的突变体或衍生物)以产生多克隆抗体混合物；任选其中单独或组合((i)和(ii)；或者(i)和(iii))应用如下步骤：
(i)用相同抗原或不同抗原免疫所述脊椎动物(任选其中不同抗原由相同病原性生物体(或其家族成员)表达)；
(ii)在免疫之前，所述脊椎动物的轻链基因座含有相同的VH基因库集(任选单个VH基因)及任选存在的相同的J库集；任选哺乳动物的轻链基因座在免疫之前是相同的；
(iii)在免疫之前，所述脊椎动物的轻链基因座含有相同的重排的VJ或VDJ库集(任选单个VJ或VDJ)；任选所述脊椎动物轻链基因座在免疫之前是相同的。
本发明一方面提供了产生多克隆抗体混合物的方法，所述方法包括进行第一种方法，通过用第一和第二抗原免疫一或多个脊椎动物(任选小鼠或大鼠)，组合分离自每个脊椎动物的抗-抗原抗体(或者所述抗体的突变体或衍生物)以产生多克隆抗体混合物；任选其中单独或组合((i)和(ii)；或者(i)和(iii))应用如下步骤：
(i)所述抗原由相同病原性生物体(或其家族成员)表达；
(ii)在免疫之前，脊椎动物的轻链基因座含有相同的VH基因库集(任选单个VH基因)及任选存在的相同的J库集；任选哺乳动物的轻链基因座在免疫之前是相同的；
(iii)在免疫之前，脊椎动物的轻链基因座含有相同的重排的VJ或VDJ库集(任选单个VJ或VDJ)；任选脊椎动物的轻链基因座在免疫之前是相同的。
本发明一方面提供了产生能表达多克隆抗体混合物的宿主细胞的方法，所述方法包括：在第二种方法中，
(a)用第一和第二抗原免疫一或多个脊椎动物(任选小鼠或大鼠)(任选其中不同抗原由相同病原性生物体(或者其家族成员)表达)；
(b)从所述脊椎动物的B淋巴细胞中分离编码第一种和第二种抗-抗原抗体的核酸；
(c)确定第一种抗体的重链和轻链可变区的核苷酸序列；
(d)确定第二种抗体的重链可变区及任选确定轻链可变区的核苷酸序列；
(e)将每种抗体的重链可变区编码序列插入重链表达载体中；任选其中每个重链的恒定区编码序列被交换为编码人或人源化恒定区的核苷酸序列；
(f)将第一种抗体的轻链可变区编码序列插入轻链表达载体中；任选其中第一种抗体的轻链恒定区编码序列被交换为编码人或人源化恒定区的核苷酸序列；
(g)任选将第二种抗体的轻链可变区编码序列插入轻链表达载体中；任选其中第二种抗体的轻链恒定区编码序列被交换为编码人或人源化恒定区的核苷酸序列；及
(h)将每个表达载体导入宿主细胞中并在所述宿主细胞的混合物中共表达抗体链以产生抗体，每个抗体均包含所述重链可变区和轻链之一或二者；任选其中表达载体一起导入相同宿主细胞中(例如CHO或HEK293细胞)，由此所述细胞能表达抗体轻链与重链，由此所述细胞或多个宿主细胞表达抗体，每个抗体均包含所述重链可变区和轻链之一或二者；
(i)任选地，
在免疫之前，脊椎动物的轻链基因座含有相同的VH基因库集(任选单个VH基因区段)及任选存在的相同的J库集(任选单个J基因区段)；任选脊椎动物的轻链基因座在免疫之前是相同的；或者
在免疫之前，脊椎动物的轻链基因座含有相同的重排的VJ或VDJ库集(任选单个VJ或VDJ)；任选脊椎动物的轻链基因座在免疫之前是相同的。
本发明还提供了产生单克隆或多克隆抗体混合物的方法，任选用于医药学中，任选用于治疗和/或预防感染性疾病，其中任选每个抗体均结合感染性疾病病原体的抗原，优选相同抗原。本发明还提供了分离的单克隆或多克隆抗体或其突变体或衍生物抗体在生产治疗和/或预防感染性疾病的药物中的应用，任选其中感染性疾病是由细菌或病毒病原体引起的疾病。
本发明进一步提供了通过本发明的方法可获得或者获得的分离的抗体(例如IgG型抗体)或其突变体或衍生物抗体，其中(i)所述分离的抗体包含所述第一种抗体的重链可变区的两个拷贝，与所述第一种抗体的轻链可变区的两个拷贝配对；或者(ii)所述分离的抗体包含所述第二种抗体的重链可变区的两个拷贝，与所述第一种抗体的轻链可变区的两个拷贝配对；或者(iii)所述分离的抗体是双特异性抗体，其包含所述第一种抗体的重链可变区的一个拷贝，与所述第一种抗体的轻链可变区的一个拷贝配对，及所述抗体的重链可变区的一个拷贝，与所述第一种抗体的轻链可变区的一个拷贝配对，任选其中所述双特异性抗体结合由相同病原性生物体(或其家族成员)表达的所述第一和第二抗原；任选用于医药学中，任选用于治疗和/或预防感染性疾病。
一方面，本发明提供了编码本发明抗体的核苷酸序列，任选其中所述核苷酸序列是载体的一部分。
一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的抗体及稀释剂、赋形剂或载体。
在本发明的第三种配置中，提供了：
非人脊椎动物(任选小鼠或大鼠)或者脊椎动物细胞，其基因组包含：
(a)免疫球蛋白重链基因座，其包含：
(i)位于恒定区上游的一或多个人VL基因区段、一或多个人D基因区段及一或多个人J基因区段(任选重排的VLDJHCH或VλDJHCH)；或
(ii)位于恒定区上游的一或多个人VH基因区段、一或多个人D基因区段及一或多个人JH基因区段，其中所述人VH基因区段选自如下一组中：VHIII基因家族成员(任选VHIIIa或VHIIIb家族成员)、VHIV基因家族成员、VHIII9.1(VH3-15)、VHIII VH26(VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)、VH H11、VH1GRR、ha3h2、VHI-ha1c1、VHIII-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hv1051、71-2、Hv1f10、VH4.11、71-4、VH251、VH1-69及与其至少80％相同的基因区段；及
(b)免疫球蛋白轻链基因座，其包含位于恒定区上游的一或多个人V基因区段及一或多个人J基因区段，任选其中轻链基因座如本发明第一种配置中的(b)(i)或(b)(ii)所述；
其中所述重链基因座中的基因区段与其恒定区可操纵地连接，所述轻链基因座中的基因区段与其恒定区可操纵地连接，由此在免疫时小鼠能产生包含通过所述重链基因座的重组产生的重链和通过所述轻链基因座的重组产生的轻链的抗体。
在本发明的第四种配置中，提供了：
非人脊椎动物(任选小鼠或大鼠)或者脊椎动物细胞，其基因组包含：
(a)(i)未重排的免疫球蛋白重链基因座，其包含位于恒定区上游的一或多个人VL基因区段、一或多个人D基因区段及一或多个JH基因区段，其中每个人VL基因区段是与用于产生编码来自抗体表达细胞的人抗体轻链可变区的重排的VJ的人VL基因区段(或其突变体)相同的人基因区段，其中所述抗体结合感染性疾病病原体的抗原(任选所述抗体的可变区与来自患有、易感于或者恢复自由携带或分泌所述抗原的生物体引起或介导的疾病或病症的人类个体或者来自携带所述生物体的人类个体的抗体相同)；或者
(ii)免疫球蛋白重链基因座，其包含位于恒定区上游的重排的VJ区或VDJ区，其中重组区的核苷酸序列与通过人J基因区段及任选存在的人D基因区段与人VL基因区段重组产生的核苷酸序列相同，所述人VL基因区段与用于产生编码来自抗体表达细胞的人抗体的轻链可变区的重排的VJ的人VL基因区段(或其突变体)相同，其中所述抗体结合感染性疾病病原体的抗原(任选所述抗体的可变区与来自患有、易感于或者恢复自由携带或分泌所述抗原的生物体引起或介导的疾病或病症的人类个体或者来自携带所述生物体的人类个体的抗体相同)；
(b)免疫球蛋白轻链基因座，其包含位于恒定区上游的一或多个人V基因区段及一或多个人J基因区段；及
(c)其中轻链基因座中的基因区段与其恒定区可操纵地连接，及重链基因座中的基因区段或VJ或VDJ与其恒定区可操纵地连接，由此在免疫时小鼠能产生包含通过所述轻链基因座的重组产生的轻链及衍生自所述重链基因座的重链的抗体；
(d)任选地，当应用(a)(i)时，重链基因座中每个所述VL基因区段选自如下一组中的VL基因区段：VλII基因家族成员、VλVII4A、VλII2.1、VλVII4A、Vλ1基因家族成员、Vλ3基因家族成员、IGLV1S2、Vλ3-cML70、lalh2、lalvl、la3h3、Kv325、VκI基因家族成员、κI-15A(KL012)、VκII家族成员、VκIII家族成员、VκI基因家族成员、κI-15A(KL012)、VκII A2(任选A2a等位基因)、VκA27(Humkv325)及与其至少80％相同的基因区段；
(e)任选地，当应用(a)(ii)时，重组区的核苷酸序列与通过人J基因区段及任选存在的人D基因区段与人VL基因区段重组产生的核苷酸序列相同，所述人VL基因区段选自如下一组中的VL基因区段：VλII基因家族成员、VλVII4A、VλII2.1、VλVII4A、Vλ1基因家族成员、Vλ3基因家族成员、IGLV1S2、Vλ3-cML70、lalh2、lalvl、la3h3、Kv325、VκI基因家族成员、κI-15A(KL012)、VκII家族成员、VκIII家族成员、VκI基因家族成员、κI-15A(KL012)、VκIIA2(任选A2a等位基因)、VκA27(Humkv325)及与其至少80％相同的基因区段。
在本发明的第四种配置的一方面，所述脊椎动物或细胞的基因组对于重链基因座(a)(i)或(ii)是纯合的；任选其中：
-所述重链基因座的V基因区段库集由一或多个人VL基因区段组成，所述人VL基因区段选自如下一组中的VL基因区段：VλII基因家族成员、VλVII4A、VλII2.1、VλVII4A、Vλ1基因家族成员、Vλ3基因家族成员、IGLV1S2、Vλ3-cML70、lalh2、lalvl、la3h3、Kv325、VκI基因家族成员、κI-15A(KL012)、VκII家族成员、VκIII家族成员、VκI基因家族成员、κI-15A(KL012)、VκII A2(任选A2a等位基因)、VκA27(Humkv325)及与其至少80％相同的基因区段；或者
-所述重链基因座的重组的VJ或VDJ库集由与通过人VL基因区段与人J基因区段及任选存在的人D基因区段重组产生的一或多个核苷酸序列相同的序列组成，所述人VL基因区段选自如下一组中的VL基因区段：VλII基因家族成员、VλVII4A、VλII2.1、VλVII4A、Vλ1基因家族成员、Vλ3基因家族成员、IGLV1S2、Vλ3-cML70、lalh2、lalvl、la3h3、Kv325、VκI基因家族成员、κI-15A(KL012)、VκII家族成员、VκIII家族成员、VκI基因家族成员、κI-15A(KL012)、VκII A2(任选A2a等位基因)、VκA27(Humkv325)及与其至少80％相同的基因区段。
本发明提供了一种单克隆或多克隆抗体组合物，通过用抗原免疫前述任何配置或方面所述的至少一种脊椎动物(例如小鼠或大鼠)而制备，任选其中所述抗原是感染性疾病病原体抗原，任选其中相同抗原用于免疫所有脊椎动物；任选其中所述抗体是IgG型。
本发明还提供了分离的嵌合抗体以治疗和/或预防感染性疾病或病症，所述抗体包含非人脊椎动物(任选小鼠或大鼠)重链恒定区及结合感染性疾病病原体抗原的人可变区，其中所述抗体在包括用所述抗原免疫本发明的非人脊椎动物的方法中可获得或获得。
本发明还提供了分离的人抗体以治疗和/或预防感染性疾病或病症，所述抗体包含人重链恒定区及结合感染性疾病病原体抗原的人可变区，其中所述抗体在包括在转基因非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)中在体内亲和性成熟抗体可变区的方法中可获得或获得，当所述可变区与所述脊椎动物重链恒定区(例如小鼠或大鼠重链恒定区)可操纵地连接时，通过(a)用所述抗原免疫本发明的脊椎动物，(b)分离编码本发明的嵌合抗体的核酸，(c)用编码人重链恒定区的核苷酸序列置换编码非人脊椎动物重链恒定区的核酸的核苷酸序列，产生编码人抗体的核酸，(d)在体外表达人抗体(任选从携带所述人核酸的CHO或HEK293细胞中表达)及(e)分离所述人抗体(任选进一步亲和性成熟所述抗体和/或产生其衍生物)。
本发明一方面提供了第一种和第二种人抗体的混合物，每个抗体均能结合感染性疾病病原体抗原(任选其中第一种抗体结合第一抗原，第二种抗体结合第二抗原，所述抗原来自相同病原体；或者其中所述抗原是相同的)。在一个实施方案中，使用共同轻链，其能简化抗体混合物的生产。因此在混合物中提供了第一种抗体的轻链氨基酸序列，其与第二种抗体的轻链氨基酸序列相同，或者具有直至15个氨基酸改变。
本发明进一步提供了宿主细胞，其包含编码3或更多个第一种和第二种抗体重链和轻链的一或多个表达载体。
在本发明的第五种配置中，提供了：
合成的免疫球蛋白基因座，其包含一或多个可变和J基因区段(及任选存在的一或多个D基因区段)，与恒定区5’端可操纵地连接，其中所述基因座包含5’至3’V(D)J排列，选自可以用如下一或多种排列(5’至3’)构建的免疫球蛋白基因座：
(a)[V(重链，λ或κ)]-[两转角(two-turn)RSS]-[一转角(one-turn)RSS]-[D]-[JH]，其中所述RSS是相反方向；
(b)[VH]-[D]-[两转角RSS]-[一转角RSS]-[Jλ]，其中所述RSS是相反方向；
(c)[VH]-[D]-[一转角RSS]-[两转角RSS]-[Jκ]，其中所述RSS是相反方向；
(d)[VH或Vκ]-[两转角RSS]-[一转角RSS]-[Jλ]，其中所述RSS是相反方向；
(e)[Vκ]-[一转角RSS]-[两转角RSS]-[JH或Jλ],其中所述RSS是相反方向；
(f)[V(重链，λ或κ)]-[一转角RSS]-[两转角RSS]-[D]-[JH]，其中所述RSS是相反方向；
(g)[VH]-[D]-[一转角RSS]-[两转角RSS]-[Jλ]，其中所述RSS是相反方向；
(h)[VH]-[D]-[两转角RSS]-[一转角RSS]-[Jκ]，其中所述RSS是相反方向；
(i)[VH或Vκ]-[一转角RSS]-[两转角RSS]-[Jλ]，其中所述RSS是相反方向；
(j)[Vκ]-[两转角RSS]-[一转角RSS]-[JH或Jλ]，其中所述RSS是相反方向。
在本发明的第六种配置中还提供了产生VH结构域、重链和具有长HCDR3长度的抗体的方式。在此，本发明提供了：
非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或者非人脊椎动物细胞(例如小鼠细胞或大鼠细胞)，其基因组包含人免疫球蛋白D基因区段库集，其偏向于人D2和/或D3家族或者偏向于一、多个或所有人D基因区段，所述人D基因区段选自D1-26、D2-2、D3-9、D3-10、D3-22、D4-17、D6-13和D6-19。
非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎动物细胞(例如小鼠细胞或大鼠细胞)，任选根据前述权利要求所述，其基因组包含人免疫球蛋白VH基因区段库集，其偏向于选自如下一组中的一个、多个或所有基因区段：VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH5-51、VH1-69、VH2-5、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH4-4、VH6-1和VH7-4-1。
非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎动物细胞(例如小鼠细胞或大鼠细胞)，其基因组包含人免疫球蛋白JH基因区段库集，其偏向于人JH6。
单克隆或多克隆抗体组合物或者产生这种组合物的抗体生产细胞群，其中所述组合物或细胞群是通过用抗原免疫前述任何权利要求所述至少一种脊椎动物而制备的，其中所述抗体具有人重链可变区，当与相应人种系V、D和J序列相比时其包含非人脊椎动物AID-模式体细胞超变(例如小鼠或大鼠AID-模式突变)和/或当与相应人种系V、D和J序列相比时其包含非人(例如小鼠或大鼠)末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)-模式连接突变(junctionalmutation)；其中所述组合物包含至少一种抗原特异性抗体，其具有长度为至少20个氨基酸的HCDR3(根据IMGT)。
包含一或多个重链的抗体重链库集(例如由抗体提供)，其可变结构域HCDR3的长度为至少20个氨基酸(根据IMGT)，衍生自人VH、D和JH的重组，其中所述VH选自：
VH1-2*02、VH1-3*01、VH1-8*01、VH1-18*01、VH2-5*10、VH3-7*01、VH3-9*01、VH3-11*01、VH3-13*01、VH3-21*03、VH3-23*04、VH4-4*02、VH6-1*01和VH7-4-1*01，以及
所述D选自：
D2-2*02、D3-9*01、D3-10*01和D3-22*01，或者
D2-2*02、D3-9*01和D3-10*01，或者
D3-9*01和D3-10*01，或者
D1-26、D2-2、D3-9、D3-10、D3-22、D4-17、D6-13和D6-19，或者
D1-26*01、D2-2*02、D3-9*01、D3-10*01、D3-22*01、D4-17*01、D6-13*01和D6-19*01，或者
D2-2、D3-9、D3-10、D3-22、D4-17、D6-13和D6-19，或者D2-2*02、D3-9*01、D3-10*01、D3-22*01、D4-17*01、D6-13*01和D6-19*01，或者
D1-26、D2-2、D3-10和D6-19，或者
D2-2、D3-9和D3-10；并且
任选JH是JH6(例如JH6*02)；
其中
(a)所述重链可变结构域已经在非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)中在体内产生；和/或
(b)所述重链可变结构域当与相应人种系V、D和J序列相比时包含非人脊椎动物AID-模式体细胞超变(例如小鼠或大鼠AID-模式突变)和/或当与相应人种系V、D和J序列相比时包含非人(例如小鼠或大鼠)末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)-模式连接突变。
附图简述
图1-3：例证了产生重组工程BAC载体以将V基因区段加入小鼠基因组中的方案示意图；
图4：例证了使用相继重组酶介导的盒交换(sRMCE)将V基因区段加入小鼠基因组中的方案示意图；
图5(4部分)：仅示出可变(V)编码区的13个IGHV1-69等位基因的比对。与VH1-69等位基因*01不同的核苷酸在适当位置标示，而相同的核苷酸用破折号标示。在核苷酸改变导致氨基酸不同的情况中，编码的氨基酸在相应三联体上示出。方框区相应于CDR1、CDR2和CDR3；
图6：RSS结构及重组示意图。
发明详述
人V、D和J基因区段的来源是细菌人工染色体(RPCI-11BAC)，得自Roswell ParkCancer Institute(RPCI)/Invitrogen。见http://bacpac.chori.org/hmale11.htm，其描述了如下的BAC：
RPCI-11人男性BAC文库
RPCI-11人男性BAC文库(Osoegawa et al.,2001)使用由Kazutoyo Osoegawa开发的改良的克隆技术构建(Osoegawa et al.,1998)。所述文库由Kazutoyo Osoegawa产生。构建由National Human Genome Research Institute(NHGRI,NIH)(#1R01RG01165-03)提供资金。这个文库根据新的NHGRI/DOE"Guidance on Human Subjects in Large-Scale DNASequencing产生。
“男性血液通过双盲选择方案获得。男性血液DNA分离自一个随机选择的供体(在10个男性供体中)”。
·Osoegawa K,Mammoser AG,Wu C,Frengen E,Zeng C,Catanese JJ,de JongPJ；Genome Res.2001Mar；11(3):483-96；"A bacterial artificial chromosome libraryfor sequencing the complete human genome"；
·Osoegawa,K.,Woon,P.Y.,Zhao,B.,Frengen,E.,Tateno,M.,Catanese,J.J,andde Jong,P.J.(1998)；"An Improved Approach for Construction of BacterialArtificial Chromosome Libraries"；Genomics52,1-8.
作为抗体基因区段序列的来源，技术人员也意识到如下可利用的数据库和资源(包括其更新材料)：
1.1.Kabat数据库(G.Johnson and T.T.Wu,2002；http:// www.kabatdatabase.com)。由E.A.Kabat和T.T.Wu在1966年产生，Kabat数据库公开了抗体、T-细胞受体、主要组织相容性复合体(MHC)I类和II类分子及其它免疫学感兴趣的蛋白质的排列对比的序列。可搜索的界面由SeqhuntII工具提供，可获得关于序列排列对比、序列子群分类及产生变异性作图(variability plot)的效用范围。也见Kabat,E.A.,Wu,T.T.,Perry,H.,Gottesman,K.,and Foeller,C.(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th ed.,NIH Publication No.91-3242，Bethesda,MD所述，该文献并入本文作参考，特别是参考人基因区段用于本发明。
1.2.KabatMan(A.C.R.Martin,2002；http://www.bioinf.org.uk/abs/ simkab.html)。这是产生简单查询Kabat序列数据库的网页。
1.3.IMGT,the International ImMunoGeneTics InformationM.-P.Lefranc,2002；http://imgt.cines.fr)。IMGT是一个整合的信息系统，其专攻所有脊椎动物物种的抗体、T细胞受体和MHC分子。其提供了标准化数据的一个公共端口，包括核苷酸和蛋白质序列、寡核苷酸引物、基因作图、遗传多态性、特异性及二维(2D)和三维(3D)结构。IMGT包括三个序列数据库(IMGT/LIGM-DB、IMGT/MHC-DB、IMGT/PRIMERDB)，一个基因组数据库(IMGT/GENE-DB)，一个3D结构数据库(IMGT/3D结构-DB)，及一系列网站资源("IMGTMarie-Paule page")和交互工具。
1.4V-BASE(I.M.Tomlinson,2002；http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase)。V-BASE是从1000个以上的公开序列中汇编的所有人抗体种系可变区序列的综合目录。其包括排列软件DNAPLOT(由Hans-Helmar Althaus和Werner Muller开发)，其使得可以将重排的抗体V基因分配给其最接近种系基因区段。
1.5.Antibodies—Structure and Sequence(A.C.R.Martin,2002；http:// www.bioinf.org.uk/abs)。这个网页概括了关于抗体结构和序列的有用信息。其提供了Kabat抗体序列数据的查询界面，关于抗体的一般信息，、晶体结构及与其它抗体相关信息的链接。其还指示Protein Databank(PDB)中保藏的所有抗体结构的自动化摘要。特别感兴趣的是其全面描述和对比了抗体可变区的各种编号方案。
1.6.AAAAA—AHo's Amazing Atlas of Antibody Anatomy(A.Honegger,2001；http://www.unizh.ch/～antibody)。这个资源包括结构分析、建模及工程化的工具。其采用一致的方案综合抗体和T细胞受体序列的结构排列，包括抗体分析和图示的Excelmacros。
1.7.WAM—Web Antibody Modeling(N.Whitelegg and A.R.Rees,2001；http:// antibody.bath.ac.uk)。由the Centre for Protein Analysis and Design at theUniversity of Bath,United Kingdom主持。基于AbM程序包(先前由Oxford Molecular销售)构建抗体Fv序列的3D模型，组合使用确立的理论方法，这个网站还包括最新的抗体结构信息。
1.8.Mike's Immunoglobulin Structure/Function Page(M.R.Clark,2001；http://www.path.cam.ac.uk/～mrc7/mikeimages.html)。这些网页提供了关于免疫球蛋白结构和功能的教育材料，通过许多彩色图片、模型和动画例证。可获得关于抗体人源化和Mike Clark's Therapeutic Antibody Human Homology Project的另外信息，其关注于使临床效力和抗免疫球蛋白应答与治疗性抗体的可变区序列相关联。
1.9.The Antibody Resource Page(The Antibody Resource Page,2000；http://www.antibodyresource.com)。这个网站描述了其自身作为“抗体研究和供应的完全指导”。与氨基酸测序工具、核苷酸抗体测序工具链接，提供了杂交瘤/细胞培养数据库。
1.9.Humanization bY Design(J.Saldanha,2000；http:// people.cryst.bbk.ac.uk/～ubcg07s)。这个资源提供了关于抗体人源化技术的综述。最有用的特征是超过40个公开的人源化抗体的可搜索数据库(通过序列和文本)，包括关于人源化构建体的设计问题、构架选择、构架回复突变及结合亲和性的信息。
也见Antibody Engineering Methods and Protocols,Ed.Benny K C Lo,Methods in Molecular BiologyTM,Human Press所述。见http://www.blogsua.com/pdf/ antibody-engineering-methods-and-protocolsantibody-engineering-methods-and- protocols.pdf。
在本说明书中的一个实施方案中，“种系”是指规范的种系基因区段序列。
本发明涉及提供在免疫球蛋白重链和轻链基因座中的新的V、D和J配对。提供了新的、偏向的抗体多样性及潜在扩展的多样性。本发明的一方面在体内在抗体V(D)J重组期间利用相容的重组信号序列(RSS)的天然配对，本发明的这个方面提供了使用RSS相容性观测结果的V、D和J基因区段的新的合成组合。
本发明另一方面基于在针对感染性疾病病原体产生的天然发生的人抗体中V、D和J的使用偏向的观测。本发明可用于在转基因非人动物中操纵抗体基因多样性，由此提供新的及潜在扩展的多样性或者偏向于抗体共同的可变基因使用的多样性，可用于治疗和/或预防某些疾病或病症，如感染性疾病。这个偏向抗体库集的能力还提供了简化抗体混合物生产的方法，如在希望靶向多个病原体抗原的多克隆方法中可用于治疗和/或预防感染性疾病的多克隆抗体治疗剂。为此，本发明还提供了双特异性抗体，其能结合一种以上的抗原(例如由相同病原体表达的多个感染性抗原)，因此提供了使用多克隆抗体混合物不可能的优势(如生产、给药剂量和施用优势)。
本发明提供了脊椎动物和细胞，如转基因小鼠或大鼠或者转基因小鼠或大鼠细胞。此外，本发明涉及使用所述脊椎动物分离抗体或编码抗体的核苷酸序列的方法。本发明还提供了抗体、核苷酸序列、药物组合物及应用。
为此，本发明在第一种配置中提供了：
非人脊椎动物(任选小鼠或大鼠)或者脊椎动物细胞，其基因组包含：
(a)免疫球蛋白重链基因座，其包含位于恒定区上游的一或多个人V基因区段(任选多个VH)、一或多个人D基因区段及一或多个人J基因区段；任选其中重链基因座如下述第二种配置中的(a)所述；及
(b)免疫球蛋白轻链基因座，其包含：
(i)位于恒定区上游的一或多个人VH基因区段和一或多个人J基因区段(任选重排的VHJLCL或VHJλCL，其中CL是Cλ或Cκ)；或者
(ii)位于恒定区上游的一或多个人VL基因区段、一或多个人D基因区段及一或多个人JH基因区段(任选重排的VLDJHCL或VλDJHCL，其中CL是Cλ或Cκ)；或者
(iii)位于恒定区上游的一或多个人VL基因区段及一或多个人JL基因区段，所述VL基因区段选自如下一组中：VλII基因家族成员、VλVII4A、VλII2.1、VλVII4A、Vλ1基因家族成员、Vλ3基因家族成员、IGLV1S2、Vλ3-cML70、lalh2、lalvl、la3h3、Kv325、VκI基因家族成员、κI-15A(KL012)、VκII家族成员、VκIII家族成员、VκI基因家族成员、κI-15A(KL012)、VκIIA2(任选A2a等位基因)、VκA27(Humkv325)及与其至少80％相同的基因区段；任选一或多个VL基因区段选自下文的列表A1、A2、A1.1、A1.2、A2.1、A2.2、A2.3或A2.4。
其中所述重链基因座中基因区段与其恒定区可操纵地连接，所述轻链基因座中基因区段与其恒定区可操纵地连接，由此在免疫时小鼠能产生包含通过所述重链基因座的重组产生的重链及通过所述轻链基因座的重组产生的轻链的抗体。
本发明的这个配置因此在转基因非人脊椎动物如小鼠或大鼠中提供了新的、合成的抗体和基因库集的可能性。这种新的库集是需要的，因为其提供了新抗体库的可能性，从中在用预定抗原免疫脊椎动物之后可以选择先导抗体。这因此提供了可以从中分离具有希望特性的抗体的库，例如对于特异性靶抗原结合具有相对高亲和性的抗体。希望的是可以从免疫的脊椎动物中直接分离高亲和性抗体，因为这样可以提供可潜在用作治疗和/或预防性药物的抗体前导，而不需要进一步大量的亲和性成熟(例如通过体外抗体展示如核糖体展示或者噬菌体展示)。可以根据需要对抗体的效应子部分进行修饰(例如恒定区的人源化)，而不需要操纵可变区的序列。或者，或此外，抗体的库可以允许选择具有希望的生物物理学特性和/或表位特异性的先导抗体。后者对于发现针对如下表位的先导抗体是重要的，所述表位是先前未产生治疗性和/或预防性抗体的表位或者难以由携带转基因免疫球蛋白基因座的先前非人脊椎动物产生的抗体基因多样性产生的抗体达到的，例如基于由RPCI-11BAC所示的单个人基因座的那些。
本发明的细胞(根据本发明任何方面或配置)是例如B细胞、杂交瘤或干细胞，任选胚胎干细胞或者造血干细胞。一方面，所述ES细胞衍生自小鼠C57BL/6N、C57BL/6J、129S5或129Sv品系。一方面，所述非人脊椎动物是啮齿类动物，优选小鼠，及本发明的细胞是啮齿类动物细胞或ES细胞，适当的是小鼠ES细胞。本发明的ES细胞可用于产生动物，使用本领域熟知的技术进行，包括将ES细胞注射进胚泡中，随后将嵌合的胚泡植入雌性动物中以产生可以繁殖的后代，针对具有需要插入的纯合重组体进行选择。一方面，本发明涉及包含ES细胞衍生的组织及宿主胚胎衍生的组织的转基因动物。一方面，本发明涉及遗传改变的后代动物，包括具有对于VDJ和/或VJ区是纯合重组体的动物。
携带如(b)(i)和(ii)所述一或多个轻链基因座的脊椎动物提供了新的及潜在扩展的抗体和基因库集，通过采用合成的非天然发生的免疫球蛋白基因区段(V、D、J、C)组合而成。在这方面，本发明人意识到提供混合重链基因区段与轻链基因座那些基因区段的抗体和基因库集的需求和可能性。这基于本发明人的观测结果：首先，自然提示具有VH-VH或VL-VL配对(与更经典的VH-VL配对相反)的功能性抗体的可能性。例如，参见骆驼科(Camelidae)的重链抗体，其产生具有配对的VH结构域及缺乏轻链VL结构域的抗体(例如见Nature.1993Jun3；363(6428):446-8；Naturally occurring antibodies devoid oflight chains；Hamers-Casterman C,Atarhouch T,Muyldermans S,Robinson G,HamersC,Songa EB,Bendahman N,Hamers R)。这些抗体发挥特异性结合抗原的功能，这种抗体在这种骆驼科动物(例如美洲骆驼，骆驼，羊驼)的血液中发现。具有VH配对的这种抗体也可以是合成产生的，以提供治疗性和预防性药物(见例如WO1994004678、WO2004041862、WO2004041863所述)。转基因小鼠也可以产生这种重链抗体，以及所述抗体的体内产生使得小鼠的免疫系统可以选择VH-VH配对，有时选择其中已经在体内由小鼠导入突变的这种配对以适应配对(WO2010109165A2)。因此，本发明人认识到采用体内抗体产生系统(而不是体外系统如抗体的噬菌体或核糖体展示)可以适应于本发明设想的合成的免疫球蛋白基因区段组合。
本发明人的第二个观测结果在于天然发生的免疫球蛋白基因座的结构，特别是介导体内V(D)J重组的重组信号序列(RSS)的排列(见例如Cell.2002Apr；109Suppl:S45-55.The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination；BassingCH,Swat W,Alt FW，所述文献并入本文作参考)。如图6所例证，已经鉴别了两种类型的RSS元件：一转角RSS(12-RSS)和两转角RSS(23-RSS)。自然地，λ轻链基因座中的VJ重组，如果在位于Vλ的3’端的两转角RSS与位于Jλ的5’端的一转角RSS之间发生重组，RSS是相反方向。自然地，在κ轻链基因座中的VJ重组，如果在位于Vκ的3’端的一转角RSS与位于Jκ的5’端的两转角RSS之间发生重组，RSS是相反方向。自然地，在重链基因座中的VD重组，如果在位于VH的3’端的两转角RSS与位于D的5’端的一转角RSS之间发生重组，RSS是相反方向。自然地，在重链基因座中的DJ重组，如果在位于D的3’端的一转角RSS与位于JH的5’端的两转角RSS之间发生重组，RSS是相反方向。因此，通常两转角RSS与相反方向的一转角RSS相容。本发明人认识到可以使用这个观测结果构建转基因免疫球蛋白基因座，由此当以相反方向提供两转角RSS与一转角RSS时，5’基因区段可以与3’基因区段重组(例如V与J；或者V与D)，每个RSS邻近各自的一个基因区段。因此，本发明人认识到，在一个实施方案中，免疫球蛋白基因座可以用一或多个如下排列方式构建(5’至3’)：
(k)[V(重链，λ或κ)]-[两转角RSS]-[一转角RSS]-[D]-[JH]，其中所述RSS是相反方向；
(l)[VH]-[D]-[两转角RSS]-[一转角RSS]-[Jλ]，其中所述RSS是相反方向；
(m)[VH]-[D]-[一转角RSS]-[两转角RSS]-[Jκ]，其中所述RSS是相反方向；
(n)[VH或Vκ]-[两转角RSS]-[一转角RSS]-[Jλ]，其中所述RSS是相反方向；
(o)[Vκ]-[一转角RSS]-[两转角RSS]-[JH或Jλ]，其中所述RSS是相反方向；
(p)[V(重链，λ或κ)]-[一转角RSS]-[两转角RSS]-[D]-[JH]，其中所述RSS是相反方向；
(q)[VH]-[D]-[一转角RSS]-[两转角RSS]-[Jλ]，其中所述RSS是相反方向；
(r)[VH]-[D]-[两转角RSS]-[一转角RSS]-[Jκ]，其中所述RSS是相反方向；
(s)[VH或Vκ]-[一转角RSS]-[两转角RSS]-[Jλ]，其中所述RSS是相反方向；
(t)[Vκ]-[两转角RSS]-[一转角RSS]-[JH或Jλ]，其中所述RSS是相反方向。
技术人员将认识到可以使用标准分子生物学技术提供包含RSS与V、D或J的合成组合的载体用于本发明的这个方面中，由此所述载体可用于构建转基因免疫球蛋白基因座(例如使用本领域已知的同源重组和/或重组酶介导的盒交换，例如见US7501552(Medarex)、US5939598(Abgenix)、US6130364(Abgenix)、W002/066630(Regeneron)、W02011004192(Genome Research Limited)、W02009076464、W02009143472和W02010039900(Ablexis)所述，所述文献在此并入本文作参考。例如，可以使用标准重组工程技术在大肠杆菌中产生RSS与基因区段的这种合成组合以构建携带所述合成组合的BAC载体，之后使用同源重组或RMCE(例如使用cre/lox位点特异性重组)插入胚胎干细胞中。关于重组工程的详细描述可见于www.genebridges.com及在EP1034260和EP1204740中所述，所述文献在此并入本文作参考。
在(b)(i)的一个实施方案中，所有轻链基因座V基因区段均是人VH基因区段(任选具有一或多个人Vλ基因区段)。
在(b)(i)的一个实施方案中，所述恒定区是小鼠、大鼠或者人CL，如Cλ。在一个实施方案中，J和恒定区均由一或多个人JλCλ提供。
尽管通常对任何抗原和疾病均有效，但是携带(b)(iii)的一或多个轻链基因座的脊椎动物是有益的，特别用于产生针对感染性疾病病原体的抗体前导。在这方面，本发明人认识到提供抗体和基因库集的需要性和可能性，其偏向于通常见于人对感染性疾病病原体的天然抗体反应中的免疫球蛋白基因区段。本发明人认识到希望的是提供脊椎动物、细胞、方法等用于基于对抗原如感染性疾病病原体的抗原的天然人免疫应答产生治疗性和/或预防性抗体。在这个方面，所述文献观测通常使用免疫球蛋白基因区段在人体中产生抗感染性应答(表1)。
表1：在针对感染性疾病病原体的人抗体应答中免疫球蛋白基因使用
参考文献:
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***
在一个实施方案中，在(b)(i)中，轻链基因座的J基因区段是Jλ基因区段，任选轻链基因座的恒定区是λ恒定区；或者在(b)(ii)中，VL是Vλ，及任选轻链基因座的恒定区是λ恒定区。或者，所述恒定区是Cκ。
在一个实施方案中，在(b)(i)中，轻链基因座的V基因区段库集包含或者由一或多个VH基因区段组成，所述VH基因区段选自如下一组中：VHIII基因家族成员(任选VHIIIa或VHIIIb家族成员)、VHIV基因家族成员、VHIII9.1(VH3-15)、VHIII VH26(VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)、VH H11、VH1GRR、ha3h2、VHI-ha1c1、VHIII-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hv1051、71-2、Hv1f10、VH4.11、71-4、VH251、VH1-69及与其至少80％相同的基因区段。这些基因区段是有用的，因为其在体内扩展在对抗原如感染性疾病病原体的抗原的天然人体免疫应答中发现的VH基因区段库集。例如当用感染性疾病病原体抗原免疫脊椎动物时，这可用于产生和分离抗体以治疗和/或预防由所述病原体介导的疾病或病症。在一个实例中，在(b)(i)中，轻链基因座的V基因区段库集包含或者仅由VH基因区段组成，所述VH基因区段选自如下一组中：VHIII基因家族成员(任选VHIIIa或VHIIIb家族成员)、VHIV基因家族成员、VHIII9.1(VH3-15)、VHIIIVH26(VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)、VHH11、VH1GRR、ha3h2、VHI-ha1c1、VHIII-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hv1051、71-2、Hv1f10、VH4.11、71-4、VH251、VH1-69及与其至少80％相同的基因区段。这可用于使脊椎动物的免疫应答(及因此所得的先导抗体)偏向于预定基因区段，例如已知常用于针对抗原的天然人体免疫应答中的基因区段，所述抗原如感染性疾病病原体的抗原。例如，VH1-69通常用于在人体中产生针对流感病毒的抗体(见表1)；因此在本发明的实施方案(b)(i)中可以使单个VH区段限于VH1-69。
在一个实施方案中，在(b)(iii)中，轻链基因座V基因区段库集由仅一种(任选仅两种、三种或四种)VL基因区段类型(任选及一或多个其突变体)组成，其中VL基因区段选自所述一组VL基因区段。这可用于使脊椎动物的免疫应答(及因此所得的先导抗体)偏向于预定基因区段，例如已知常用于针对抗原的天然人体免疫应答中的基因区段，所述抗原如感染性疾病病原体的抗原。
在一个实施方案中，在(a)中所述恒定区是重链内源性非人脊椎动物(任选宿主小鼠或大鼠)恒定区和/或在(b)中所述恒定区是轻链内源性非人脊椎动物(任选宿主小鼠或大鼠)恒定区。
在本发明任何配置的一个实施方案中，所述基因组被修饰为阻止或降低完全内源抗体的表达。为此的合适技术例如可见于PCT/GB2010/051122、US7501552、US6673986、US6130364、WO2009/076464、EP1399559和US6586251，所述文献在此并入本文作参考。在一个实施方案中，非人脊椎动物的内源重链免疫球蛋白基因座的VDJ区及任选内源轻链免疫球蛋白基因座(λ和/或κ基因座)的VJ区已经被失活。例如，所有或部分非人脊椎动物VDJ区通过在哺乳动物的内源重链免疫球蛋白基因座中倒位而失活，任选倒位的区域移动至内源Ig基因座的上游或下游(见例如WO2011004192，所述文献在此并入本文作参考)。例如，所有或部分非人脊椎动物VJ区通过在哺乳动物的内源κ链免疫球蛋白基因座中倒位而被失活，任选倒位的区域移动至内源Ig基因座的上游或下游。例如，所有或部分非人脊椎动物VJ区通过在哺乳动物的内源λ链免疫球蛋白基因座中倒位而被失活，任选倒位的区域移动至内源Ig基因座的上游或下游。在一个实施方案中，内源重链基因座以内源κ和λ基因座之一或二者的方式被失活。
此外或或者，脊椎动物已经在阻止成熟宿主B和T淋巴细胞产生的遗传背景中产生，任选RAG-1-缺陷的和/或RAG-2缺陷的背景。见US5859301所述产生RAG-1缺陷动物的技术。
因此，在本发明任何配置或方面的一个实施方案中，内源重链和轻链表达已经被失活。
在本发明的第二种配置中，提供了：
非人脊椎动物(任选小鼠或大鼠)或脊椎动物细胞，其基因组包含：
(a)免疫球蛋白重链基因座，其包含位于恒定区上游的一或多个人V基因区段(例如多个VH)、一或多个人D基因区段及一或多个人J基因区段；及
(b)(i)未重排的免疫球蛋白轻链基因座，其包含位于恒定区上游的一或多个人VH基因区段及一或多个人J基因区段，其中每个人VH基因区段是与用于产生编码来自抗体表达细胞的人抗体的重链可变区的重排的VDJ的人VH基因区段(例如种系VH基因区段；例如选自如下列表A1、A2、A1.1、A1.2、A2.1、A2.2、A2.3或A2.4的基因区段)(或其突变体，例如与所述人基因区段相比具有至多15或10个核苷酸改变)相同的人基因区段，其中所述抗体结合感染性疾病病原体的抗原(任选所述抗体的可变区与来自患有、易感于或者恢复自由携带或分泌所述抗原的生物体引起或介导的疾病或病症的人类个体或者来自携带所述生物体的人类个体的抗体相同)；或者
(ii)免疫球蛋白轻链基因座，其包含位于恒定区上游的重排的VJ区或VDJ区，其中重组区的核苷酸序列与通过人J基因区段及任选存在的人D基因区段与人VH基因区段重组产生的核苷酸序列相同，所述人VH基因区段与用于产生编码来自抗体表达细胞的人抗体的重链可变区的重排的VDJ的人VH基因区段(例如种系VH基因区段，例如选自如下列表A1、A2、A1.1、A1.2、A2.1、A2.2、A2.3或A2.4的基因区段)(或者其突变体，例如与所述人基因区段相比具有至多15或10个核苷酸改变)相同，其中所述抗体结合感染性疾病病原体的抗原(任选所述抗体的可变区与来自患有、易感于或者恢复自由携带或分泌所述抗原的生物体引起或介导的疾病或病症的人类个体或者来自携带所述生物体的人类个体的抗体相同)；
(c)其中重链基因座中基因区段与其恒定区可操纵地连接，及轻链基因座中的基因区段或VJ或VDJ与其恒定区可操纵地连接，由此在免疫时，小鼠能产生包含通过所述重链基因座的重组产生的重链和衍生自所述轻链基因座的轻链的抗体；
(d)任选地，当应用(b)(i)时，轻链基因座中每个所述VH基因区段选自如下一组中：VHIII基因家族成员(任选VHIIIa或VHIIIb家族成员)、VHIV基因家族成员、VHIII9.1(VH3-15)、VHIII VH26(VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)、VH H11、VH1GRR、ha3h2、VHI-ha1c1、VHIII-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hv1051、71-2、Hv1f10、VH4.11、71-4、VH251、VH1-69及与其至少80％相同的基因区段；任选每个VH基因区段选自如下列表A1、A2、A1.1、A1.2、A2.1、A2.2、A2.3或A2.4。
(e)任选当应用(b)(ii)时，重组区的核苷酸序列与通过人J基因区段及任选存在的人D基因区段与人VH基因区段重组产生的核苷酸序列相同，所述人VH基因区段选自如下一组中：VHIII基因家族成员(任选VHIIIa或VHIIIb家族成员)、VHIV基因家族成员、VHIII9.1(VH3-15)、VHIII VH26(VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)、VH H11、VH1GRR、ha3h2、VHI-ha1c1、VHIII-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hv1051、71-2、Hv1f10、VH4.11、71-4、VH251、VH1-69及与其至少80％相同的基因区段；任选每个VH基因区段选自如下列表A1、A2、A1.1、A1.2、A2.1、A2.2、A2.3或A2.4。
在一个实施方案中，所述抗原是由细菌或病毒感染性疾病病原体例如表1中所列任何病原体表达的抗原。例如，所述抗原是选自表1所列抗原的抗原。
在本发明任何方面、配置或实施方案的一个实施方案中，“携带所述生物体的人类个体”是对所述病原体具有天然抗性及产生结合所述病原体或其表达的抗原的抗体的患者。
在本发明第二种配置的一个实施方案中，轻链基因座的J基因区段是Jλ基因区段，及任选轻链基因座的恒定区是λ恒定区。或者，所述恒定区是Cκ。
在本发明第二种配置的一个实施方案中，轻链基因座的V基因区段库集包含或者由一或多个VH基因区段组成，所述VH基因区段选自如下一组中：VHIII基因家族成员(任选VHIIIa或VHIIIb家族成员)、VHIV基因家族成员、VHIII9.1(VH3-15)、VHIII VH26(VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)、VH H11、VH1GRR、ha3h2、VHI-ha1c1、VHIII-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hv1051、71-2、Hv1f10、VH4.11、71-4、VH251、VH1-69及与其至少80％相同的基因区段。这些基因区段是有用的，因为其在体内扩展在对抗原如感染性疾病病原体的抗原的天然人免疫应答中发现的VH基因区段的库集。例如当用感染性疾病病原体的抗原免疫脊椎动物时，这可用于产生和分离抗体以治疗和/或预防由所述病原体介导的疾病或病症。在一个实例中，在(b)(i)中，轻链基因座的V基因区段库集包含或者仅由VH基因区段组成，所述VH基因区段选自如下一组中：VHIII基因家族成员(任选VHIIIa或VHIIIb家族成员)、VHIV基因家族成员、VHIII9.1(VH3-15)、VHIII VH26(VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)、VH H11、VH1GRR、ha3h2、VHI-ha1c1、VHIII-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hv1051、71-2、Hv1f10、VH4.11、71-4、VH251、VH1-69及与其至少80％相同的基因区段。这可用于使脊椎动物的免疫应答(及因此所得先导抗体)偏向于预定基因区段，例如已知常用于对抗原如感染性疾病病原体的抗原的天然人免疫应答中的基因区段。例如，VH1-69常用于在人体中产生抗流感病毒的抗体(见表1)；因此在本发明的实施方案(b)(i)中可以使单个VH基因区段限于VH1-69。
在本发明第二种配置的一个实施方案中，在(a)中，所述恒定区是重链内源性非人脊椎动物(任选宿主小鼠或大鼠)恒定区。
在本发明第二种配置的一个实施方案中，在(b)中，所述恒定区是轻链内源性非人脊椎动物(任选宿主小鼠或大鼠)恒定区。
在本发明第二种配置的一个实施方案中，所述脊椎动物或细胞的基因组对于轻链基因座(b)(i)或(ii)是纯合的；任选其中：
-所述轻链基因座的V基因区段库集由一或多个人VH基因区段组成，所述VH基因区段选自如下一组中：VHIII基因家族成员(任选VHIIIa或VHIIIb家族成员)、VHIV基因家族成员、VHIII9.1(VH3-15)、VHIII VH26(VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)、VHH11、VH1GRR、ha3h2、VHI-ha1c1、VHIII-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hv1051、71-2、Hv1f10、VH4.11、71-4、VH251、VH1-69及与其至少80％相同的基因区段；或者
-所述轻链基因座的重组VJ或VDJ库集由与通过人VH基因区段与人J基因区段及任选存在的人D基因区段重组产生的一或多个核苷酸序列相同的序列组成，所述VH基因区段选自下组中：VHIII基因家族成员(任选VHIIIa或VHIIIb家族成员)、VHIV基因家族成员、VHIII9.1(VH3-15)、VHIII VH26(VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)、VH H11、VH1GRR、ha3h2、VHI-ha1c1、VHIII-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hv1051、71-2、Hv1f10、VH4.11、71-4、VH251、VH1-69及与其至少80％相同的基因区段。在一个实施方案中，所有轻链基因座V基因区段均来自这组。
在本发明第二种配置的一个实施方案中，内源重链和轻链表达已经被失活，其中根据第二种配置的轻链基因座是所述脊椎动物或细胞基因组中唯一功能性轻链基因座。
在本发明第二种配置的一个实施方案中，所述脊椎动物或细胞的每个免疫球蛋白轻链基因座如(b)(i)所述，包含仅一个的人VH基因区段，所述VH基因区段选自如下一组中：VHIII基因家族成员(任选VHIIIa或VHIIIb家族成员)、VHIV基因家族成员、VHIII9.1(VH3-15)、VHIII VH26(VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)、VH H11、VH1GRR、ha3h2、VHI-ha1c1、VHIII-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hv1051、71-2、Hv1f10、VH4.11、71-4、VH251、VH1-69及与其至少80％相同的基因区段，任选其中脊椎动物或细胞的基因组对于所述轻链是纯合的，由此所有轻链基因座均包含相同的单个人VH基因区段。在这个实施方案中(及通常在本发明的其它实施方案、配置和方面中)，限定重链和/或轻链基因座体系结构可用于偏向或控制抗体及基因库集，例如以反映如上述人免疫应答。规定单个轻链或重链可变区(及任选D和/或J)基因区段(或者仅此其密切相关的突变体)-或者在下文实施方案中限定单个重排的V(D)J区或单个重链或轻链，对于简化治疗性/预防性抗体的表达和生产是有利的，因为这限制了在下游生产期间产生的抗体物种的数目。一个共同重链或轻链有利地使得可以在同一表达介质中共表达多个(例如两个、三个或更多个)不同抗体，例如从同一宿主细胞中表达。见例如EP1523496(Merus BV)和WO2011097603(Regeneron Pharmaceuticals,Inc)。
在本发明第二种配置的一个实施方案中，所述脊椎动物或细胞的每个免疫球蛋白轻链基因座如(b)(ii)所述，包含仅一个的重排的VJ或VDJ区，任选其中脊椎动物或细胞的基因组对于所述轻链是纯合的，由此所有轻链基因座均包含相同的单个重排的VJ或VDJ区。
在本发明第二种配置的一个实施方案中，每个免疫球蛋白轻链基因座进一步包含VH基因区段或重排区，其分别是所述选择的人VH基因区段或重排区的突变体(例如与所述VH基因区段具有至多15或10个核苷酸改变)，任选其中脊椎动物或细胞的基因组对于所述轻链突变体VH基因区段或重排区是纯合的。
在本发明第二种配置的一个实施方案中，每个免疫球蛋白轻链基因座均包含选自所述组的仅两个或三个人VH基因区段，任选其中脊椎动物或细胞的基因组对于所述两或三个轻链人VH基因区段是纯合的。
在本发明第二种配置的一个实施方案中，每个免疫球蛋白轻链基因座均包含仅两个或三个所述重排的VJ或VDJ区，任选其中所述脊椎动物或细胞的基因组对于所述两个或三个轻链重排的VJ或VDJ区是纯合的。
本发明提供了通过免疫根据本发明任何配置、方面或实施方案的至少一种脊椎动物(例如小鼠或大鼠)制备的单克隆或多克隆抗体组合物，任选其中所述抗原是感染性疾病病原体的抗原(例如细菌或病毒病原体抗原或者表1中列出的抗原)，任选其中使用相同抗原免疫所有脊椎动物；任选其中所述抗体是IgG型的(如IgG1)。
本发明提供了分离结合预定抗原(例如细菌或病毒病原体抗原或表1中列出的抗原)的抗体的第一种方法，所述方法包括：
(a)提供根据本发明任何配置、方面或实施方案的脊椎动物(任选小鼠或大鼠)；
(b)用所述抗原(任选其中所述抗原是感染性疾病病原体抗原)免疫(使用标准初免-加强方法)所述脊椎动物；
(c)从所述脊椎动物中取B淋巴细胞并选择表达结合所述抗原的抗体的一或多个B淋巴细胞；
(d)任选使所述选择的B淋巴细胞或其后代永生化，任选通过从中产生杂交瘤进行永生化；及
(e)分离由所述B淋巴细胞表达的抗体(例如，以及IgG型抗体)。
在本发明第一种方法的第一个实施方案中，所述方法包括从所述B淋巴细胞中分离编码结合所述抗原的所述抗体的核酸的步骤；任选用编码人或人源化重链恒定区的核苷酸序列交换抗体的重链恒定区核苷酸序列及任选亲和性成熟所述抗体的可变区；及任选将所述核酸插入表达载体及任选宿主中。技术人员了解使用标准分子生物学技术进行这项操作。例如见Harlow,E.&Lane,D.1998,5th edition,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Lab.Press,Plainview,NY；及Pasqualini and Arap,Proceedingsof the National Academy of Sciences(2004)101:257-259关于标准免疫。抗体的可变区与人恒定区的连接可以通过本领域易于利用的技术实现，如使用本领域技术人员熟知的常规重组DNA和RNA技术进行。见例如Sambrook,J and Russell,D.(2001,3'd edition)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Lab.Press,Plainview,NY)所述。
在本发明第一种方法的一个实施方案中，所述方法包括进一步产生所述抗体的突变体或衍生物。
本发明提供了产生多克隆抗体混合物的方法，所述方法包括进行本发明的第一种方法，通过用抗原单独免疫第一和第二脊椎动物(任选第一和第二小鼠或者第一和第二大鼠)并组合分离自每个脊椎动物的抗-抗原抗体(或者所述抗体的突变体或衍生物)以产生多克隆抗体混合物；任选其中单独或组合((i)和(ii)；或者(i)和(iii))应用如下步骤：
(i)将脊椎动物用相同抗原或不同抗原免疫(任选其中所述不同抗原由相同病原性生物体(或者由所述生物体的家族成员或不同品系)表达)；
(ii)在免疫之前，脊椎动物的轻链基因座含有相同的VH基因库集(任选单个VH基因)及任选存在的相同的J库集；任选哺乳动物的轻链基因座在免疫之前是相同的；
(iii)在免疫之前，脊椎动物的轻链基因座含有相同的重排的VJ或VDJ库集(任选单个VJ或VDJ)；任选脊椎动物的轻链基因座在免疫之前是相同的。
本发明提供了产生多克隆抗体混合物的方法，所述方法包括进行本发明的第一种方法，通过用第一和第二抗原免疫一或多个脊椎动物(任选小鼠或大鼠)并组合分离自每个脊椎动物的抗-抗原抗体(或者所述抗体的突变体或衍生物)以产生多克隆抗体混合物；任选其中单独或组合((i)和(ii)；或者(i)和(iii))应用如下步骤：
(i)所述抗原由相同病原性生物体(或者由所述生物体的家族成员或者不同品系表达)表达；
(ii)在免疫之前，脊椎动物的轻链基因座含有相同的VH基因库集(任选单个VH基因)及任选存在的相同的J库集；任选哺乳动物的轻链基因座在免疫之前是相同的；
(iii)在免疫之前，脊椎动物的轻链基因座含有相同的重排的VJ或VDJ库集(任选单个VJ或VDJ)；任选脊椎动物的轻链基因座在免疫之前是相同的。
本发明提供了第二种方法：
本发明提供了产生能表达多克隆抗体混合物的宿主细胞(例如中国仓鼠卵巢(CHO)或HEK293细胞)的方法，所述方法在本发明第一种方法的第一个实施方案的方法中包括：
(a)用第一和第二抗原免疫一或多个脊椎动物(任选小鼠或大鼠)(任选其中不同抗原由相同病原性生物体(或其家族成员)表达)；
(b)从所述脊椎动物的B淋巴细胞分离编码第一种和第二种抗-抗原抗体的核酸；
(c)确定第一种抗体的重链和轻链可变区的核苷酸序列(任选全部重链和/或轻链序列)；
(d)确定第二种抗体的重链可变区及任选确定轻链可变区的核苷酸序列；
(e)将每个抗体的重链可变区编码序列插入重链表达载体中；任选其中每个重链的恒定区编码序列交换为编码人或人源化恒定区的核苷酸序列；
(f)将第一种抗体的轻链可变区编码序列插入轻链表达载体中；任选其中第一种抗体轻链的恒定区编码序列交换为编码人或人源化恒定区的核苷酸序列；
(g)任选将第二种抗体的轻链可变区编码序列插入轻链表达载体中，任选其中第二种抗体的轻链恒定区编码序列交换为编码人或人源化恒定区的核苷酸序列；及
(h)将每个表达载体导入宿主细胞中并在所述宿主细胞混合物中共表达抗体链以产生抗体，每个抗体均包含所述重链可变区及轻链之一或二者；任选其中表达载体被一起导入相同宿主细胞中(例如CHO或HEK293细胞)以便所述细胞能表达抗体轻链和重链，由此所述细胞或多个宿主细胞表达抗体(例如两个、三个、四个或更多个不同抗体)，每个均包含所述重链可变区及轻链之一或二者；
(i)任选地，
在免疫之前，脊椎动物的轻链基因座含有相同的VH基因库集(任选单个VH基因区段)及任选存在的相同的J库集(任选单个J基因区段)；任选脊椎动物的轻链基因座在免疫之前是相同的；或者
在免疫之前，脊椎动物的轻链基因座含有相同的重排的VJ或VDJ库集(任选单个VJ或VDJ)；任选脊椎动物的轻链基因座在免疫之前是相同的；
(j)任选地：
通过表达所述抗体的单克隆抗体或多克隆混合物产生单克隆或多克隆抗体混合物；任选随后分离包含第一种和/或第二种抗体的重链可变区的抗体。
本发明还提供如此产生的单克隆或多克隆抗体混合物或者其衍生物抗体或混合物，例如其中一或多个恒定区已经被改变(例如由不同的恒定区如人恒定区置换；或者突变为增强或除去Fc效应子功能)(任选全部重链和/或轻链序列)。
在本发明的任何方法中，任选用于免疫的每种脊椎动物如下提供：
(a)从人血液或组织(例如B淋巴细胞(PBL)，周围血单个核细胞(PBMC)，骨髓，脾，扁桃体或淋巴结)样品中分离表达结合预定抗原的抗体的B淋巴细胞(例如由感染性疾病病原体表达的抗原；任选其中所述血清或组织来自患有、易感于或者恢复自由携带或分泌所述抗原的生物体引起或介导的疾病或病症的人类个体或者来自携带所述生物体的人类个体)；
(b)确定哪个人种系VH基因区段在人体中重组以产生所述B淋巴细胞的编码所述抗体重链可变区的核苷酸序列；
(c)构建转基因脊椎动物，其中所述人种系VH基因区段提供在根据本发明第一种或第二种配置的其轻链基因座中；及
(d)提供所述转基因脊椎动物以在本发明的第一种方法中进行免疫。
术语“人血液”在此包括减去一或多个非B淋巴细胞群的人血液产品，条件是所述产物保留抗体生产细胞，如PBL。
在本发明第一种方法的一个实施方案中，用于免疫的每个脊椎动物如下提供：
(a)从人血液或组织(例如B淋巴细胞，PBMC，骨髓，脾，扁桃体或淋巴结)样品中分离表达结合预定抗原的抗体的B淋巴细胞(例如由感染性疾病病原体表达的抗原；任选其中所述血清或组织来自患有、易感于或者恢复自由携带或分泌所述抗原的生物体引起或介导的疾病或病症的人类个体或者来自携带所述生物体的人类个体)；
(b)确定所述B淋巴细胞的编码所述抗体的重排的VDJ或VJ区的核苷酸序列；
(c)构建转基因脊椎动物，其中所述重排的VDJ或VJ区提供于根据本发明第一种或第二种配置的其轻链基因座中；及
(d)提供所述转基因脊椎动物以在本发明第一种方法中免疫。
共同轻链抗体&双特异性(例如针对感染性疾病的两个病原体)
本发明提供了通过本发明第二种方法(包括步骤(j))可获得或者获得的分离的抗体(例如IgG型，如IgG1-型抗体)或者其突变体或衍生物抗体，其中(i)分离的抗体包含所述第一种抗体的重链可变区的两个拷贝，与所述第一种抗体的轻链可变区的两个拷贝配对；或者(ii)分离的抗体包含所述第二种抗体的重链可变区的两个拷贝，与所述第一种抗体的轻链可变区的两个拷贝配对；或者(iii)分离的抗体是双特异性抗体，其包含所述第一种抗体的重链可变区的一个拷贝，与所述第一抗体的轻链可变区的拷贝配对，及所述抗体的重链可变区的一个拷贝与所述第一种抗体的轻链可变区的拷贝配对，任选其中所述双特异性抗体结合权利要求24所述第一和第二抗原；任选用于医药学中，任选用于治疗和/或预防感染性疾病。
在本发明的一个方面中，提供了单克隆或多克隆抗体混合物(例如IgG型抗体)或者其突变体或衍生物抗体，其中所述单克隆抗体或混合物如本发明任何配置、方面、实施方案或实例所述，任选用于医药学中，任选用于治疗和/或预防感染性疾病，其中任选每个抗体均结合感染性疾病病原体的抗原，优选相同抗原。
在本发明的一个方面中，提供了根据本发明的任何配置、方面、实施方案或实例所述的分离的单克隆或多克隆抗体或其突变体或衍生物抗体在生产用于治疗和/或预防感染性疾病的药物中的应用，任选其中感染性疾病是由细菌或病毒病原体引起的疾病。
突变体抗体的一个实例是与通过本发明第二种方法(包括步骤(j))可获得或获得的分离的抗体(例如IgG型如IgG1-型抗体)相比在其可变区中携带至多15或10个氨基酸突变的抗体。衍生物的实例是已经被修饰为恒定区由不同恒定区如人恒定区置换；或者突变为增强或去除Fc效应子功能。
感染性疾病的实例是由细菌或病毒病原体例如表1中列出的病原体引起或介导的疾病。抗原的实例是表1中列出的那些。
例如，感染性疾病选自由选自如下一组的病原体引起的一组疾病：流感嗜血杆菌，大肠杆菌，脑膜炎奈瑟氏菌，疱疹病毒科病毒，巨细胞病毒(CMV)，HIV和流感病毒。
本发明进一步提供了编码根据本发明的任何配置、方面、实施方案或实例的抗体的核苷酸序列，任选其中所述核苷酸序列是载体的一部分。
本发明进一步提供了药物组合物，其包含根据本发明的任何配置、方面、实施方案或实例的一或多个抗体及稀释剂、赋形剂或载体。
在本发明的第三种配置中，提供了：
非人脊椎动物(任选小鼠或大鼠)或脊椎动物细胞，其基因组包含：
(a)免疫球蛋白重链基因座，其包含：
(i)位于恒定区上游的一或多个人VL基因区段、一或多个人D基因区段及一或多个人J基因区段(任选重排的VLDJHCH或VλDJHCH)；或者
(ii)位于恒定区上游的一或多个人VH基因区段、一或多个人D基因区段及一或多个人JH基因区段，所述人VH基因区段选自如下一组中：VHIII基因家族成员(任选VHIIIa或VHIIIb家族成员)、VHIV基因家族成员、VHIII9.1(VH3-15)、VHIII VH26(VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)、VH H11、VH1GRR、ha3h2、VHI-ha1c1、VHIII-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hv1051、71-2、Hv1f10、VH4.11、71-4、VH251、VH1-69及至少80％相同的基因区段；任选每个VH基因区段(及任选每个D)选自如下列表A1、A2、A1.1、A1.2、A2.1、A2.2、A2.3或A2.4；及
(b)免疫球蛋白轻链基因座，其包含位于恒定区上游的一或多个人V基因区段(例如多个VL)及一或多个人J基因区段，任选其中轻链基因座如本发明第一种配置的(b)(i)或(b)(ii)所述；
其中所述重链基因座中的基因区段与其恒定区可操纵地连接，所述轻链基因座中的基因区段与其恒定区可操纵地连接，以便在免疫时小鼠能产生包含通过所述重链基因座的重组产生的重链和通过所述轻链基因座的重组产生的轻链的抗体。
在一个实例中，在(a)(i)中，所有重链基因座V基因区段均是人VL基因区段。
在本发明第三种配置的一个实施方案中，轻链基因座的V基因区段库集包含或者由一或多个VL基因区段组成，所述VL基因区段选自如下一组中：VλII基因家族成员、VλVII4A、VλII2.1、VλVII4A、Vλ1基因家族成员、Vλ3基因家族成员、IGLV1S2、Vλ3-cML70、lalh2、lalvl、la3h3、Kv325、VκI基因家族成员、κI-15A(KL012)、VκII家族成员、VκIII家族成员、VκI基因家族成员、κI-15A(KL012)、VκIIA2(任选A2a等位基因)、VκA27(Humkv325)及与其至少80％相同的基因区段；任选每个VL基因区段选自如下列表A1、A2、A1.1、A1.2、A2.1、A2.2、A2.3或A2.4；和/或其中或在(a)(ii)中，重链基因座V基因区段库集由仅一种(或两种、三种或四种)VH基因区段类型(任选及其一或多种突变体)组成，其中VH基因区段选自所述一组VH基因区段。这可用于使脊椎动物的免疫应答(及因此所得先导抗体)偏向于预定的基因区段，例如已知常用于对抗原如感染性疾病病原体的抗原的天然人免疫应答中的基因区段。
在本发明第三种配置的一个实施方案中，在(a)中所述恒定区是重链内源性非人脊椎动物(任选宿主小鼠或大鼠)恒定区和/或在(b)中所述恒定区是轻链内源性非人脊椎动物(任选宿主小鼠或大鼠)恒定区。
在本发明第三种配置的一个实施方案中，内源性重链和轻链表达已经被失活。
本发明的第四种配置提供了：
非人脊椎动物(任选小鼠或大鼠)或者脊椎动物细胞，其基因组包含：
(a)(i)未重排的免疫球蛋白重链基因座，其包含位于恒定区上游的一或多个人VL基因区段、一或多个人D基因区段及一或多个JH基因区段，其中每个人VL基因区段是与用于产生编码来自抗体表达细胞的人抗体的轻链可变区的重排的VJ的人VL基因区段(例如种系VL基因区段，如选自如下列表A1、A2、A1.1、A1.2、A2.1、A2.2、A2.3或A2.4的VL基因区段)相同的人基因区段(或其突变体，例如与所述人基因区段相比具有至多15或10个核苷酸改变)，其中所述抗体结合感染性疾病病原体的抗原(任选所述抗体的可变区与来自患有、易感于或者恢复自由携带或分泌所述抗原的生物体引起或介导的疾病或病症的人类个体或者来自携带所述生物体的人类个体的抗体相同)；或者
(ii)免疫球蛋白重链基因座，其包含位于恒定区上游的重排的VJ区或VDJ区，其中重组区的核苷酸序列与通过人J基因区段及任选存在的人D基因区段与用于产生编码来自抗体表达细胞的人抗体的轻链可变区的重排的VJ的人VL基因区段(或其突变体，例如与所述人基因区段相比具有至多15或10个核苷酸改变)相同的人基因区段(例如种系VL基因区段；例如选自如下列表A1、A2、A1.1、A1.2、A2.1、A2.2、A2.3或A2.4的VL基因区段)重组产生的核苷酸序列相同，其中所述抗体结合感染性疾病病原体的抗原(任选所述抗体的可变区与来自患有、易感于或者恢复自由携带或分泌所述抗原的生物体引起或介导的疾病或病症的人类个体或者来自携带所述生物体的人类个体的抗体相同)；
(b)免疫球蛋白轻链基因座，其包含位于恒定区上游的一或多个人V基因区段(例如多个V)及一或多个人J基因区段；及
(c)其中轻链基因座中的基因区段与其恒定区可操纵地连接，及重链基因座中的基因区段或VJ或VDJ与其恒定区可操纵地连接，由此在免疫时小鼠能产生包含通过重组轻链基因座产生的轻链和衍生自重链基因座的重链的抗体；
(d)任选地，当应用(a)(i)时，重链基因座中的每个所述VL基因区段选自由如下组成的一组中的VL基因区段：VλII基因家族成员、VλVII4A、VλII2.1、VλVII4A、Vλ1基因家族成员、Vλ3基因家族成员、IGLV1S2、Vλ3-cML70、lalh2、lalvl、la3h3、Kv325、VKI基因家族成员、kI-15A(KL012)、VκII家族成员、VκIII家族成员、VκI基因家族成员、κI-15A(KL012)、VκIIA2(任选A2a等位基因)、VκA27(Humkv325)及与其至少80％相同的基因区段；任选每个VL基因区段选自如下列表A1、A2、A1.1、A1.2、A2.1、A2.2、A2.3或A2.4；
(e)任选地，当应用(a)(ii)时，重组区的核苷酸序列与通过人J基因区段及任选存在的人D基因区段与人VL基因区段重组产生的核苷酸序列相同，所述人VL基因区段选自如下一组中：VλII基因家族成员、VλVII4A、VλII2.1、VλVII4A、Vλ1基因家族成员、Vλ3基因家族成员、IGLV1S2、Vλ3-cML70、lalh2、lalvl、la3h3、Kv325、VKI基因家族成员、κI-15A(KL012)、VκII家族成员、VκIII家族成员、VκI基因家族成员、κI-15A(KL012)、VκIIA2(任选A2a等位基因)、VκA27(Humkv325)及与其至少80％相同的基因区段。
所述VL基因区段组可用于使脊椎动物的免疫应答(及因此所得先导抗体)偏向于预定基因区段如已知常用于对抗原如感染性疾病病原体抗原的天然人免疫应答的基因区段。
在本发明第四种配置的一个实施方案中，重链基因座的VL基因区段是Vλ基因区段。
在本发明第四种配置的一个实施方案中，在(a)中，所述恒定区是重链内源性非人脊椎动物(任选宿主小鼠或大鼠)恒定区。
在本发明第四种配置的一个实施方案中，在(b)中，所述恒定区是轻链内源性非人脊椎动物(任选宿主小鼠或大鼠)恒定区。
在本发明第四种配置的一个实施方案中，所述脊椎动物或细胞的基因组对于重链基因座(a)(i)或(ii)是纯合的，任选其中：
-重链基因座的V基因区段库集由一或多个(或仅由)人VL基因区段组成，所述VL基因区段选自如下一组中的VL基因区段：VλII基因家族成员、VλVII4A、VλII2.1、VλVII4A、Vλ1基因家族成员、Vλ3基因家族成员、IGLV1S2、Vλ3-cML70、lalh2、lalvl、la3h3、Kv325、VκI基因家族成员、κI-15A(KL012)、VκII家族成员、VκIII家族成员、VκI基因家族成员、κI-15A(KL012)、VκII A2(任选A2a等位基因)、VκA27(Humkv325)及与其至少80％相同的基因区段；或者
-重链基因座的重组VJ或VDJ库集由与通过重组人VL基因区段与人J基因区段及任选存在的人D基因区段产生的一或多个核苷酸序列相同的序列组成，所述人VL基因区段选自如下一组中的VL基因区段：VλII基因家族成员、VλVII4A、VλII2.1、VλVII4A、Vλ1基因家族成员、Vλ3基因家族成员、IGLV1S2、Vλ3-cML70、lalh2、lalvl、la3h3、Kv325、VκI基因家族成员、κI-15A(KL012)、VκII家族成员、VκIII家族成员、VκI基因家族成员、κI-15A(KL012)、VκII A2(任选A2a等位基因)、VκA27(Humkv325)及与其至少80％相同的基因区段。
在本发明第四种配置的一个实施方案中，内源性重链和轻链表达已经被失活，其中根据本发明第四种配置的重链基因座是脊椎动物或细胞基因组中唯一的功能性重链基因座。
在本发明第四种配置的一个实施方案中，所述脊椎动物或细胞的每个免疫球蛋白重链基因座如(a)(i)所述，包含仅一个人VL基因区段，所述VL基因区段选自如下一组中的VL基因区段：VλII基因家族成员、VλVII4A、VλII2.1、VλVII4A、Vλ1基因家族成员、Vλ3基因家族成员、IGLV1S2、Vλ3-cML70、lalh2、lalvl、la3h3、Kv325、VκI基因家族成员、κI-15A(KL012)、VκII家族成员、VκIII家族成员、VκI基因家族成员、κI-15A(KL012)、VκIIA2(任选A2a等位基因)、VκA27(Humkv325)及与其至少80％相同的基因区段，任选其中脊椎动物或细胞的基因组对于所述重链是纯合的，由此所有重链基因座均包含相同的单个人VL基因区段。
在本发明第四种配置的一个实施方案中，所述脊椎动物或细胞的每个免疫球蛋白重链基因座如(a)(ii)所述，包含仅一个重排的VJ或VDJ区，任选其中脊椎动物或细胞的基因组对于所述重链是纯合的，由此所有重链均包含相同的单个重排的VJ或VDJ区。
在本发明第四种配置的一个实施方案中，每个免疫球蛋白重链基因座进一步包含VL基因区段或者重排区，其分别是所述选择的人VL基因区段或重排区的突变体，任选其中所述脊椎动物或细胞的基因组对于所述轻链突变体VL基因区段或重排区是纯合的。
在本发明所有配置、方面、实例和实施方案中，其中提及的“突变体”包括与参考序列(例如参考VH、VL、VJ或VDJ)相同、但是具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸或氨基酸改变的突变体序列。
在本发明第四种配置的一个实施方案中，每个免疫球蛋白重链基因座包含选自所述组的仅两个或三个人VL基因区段，任选其中脊椎动物或细胞的基因组对于所述两个或三个重链人VL基因区段是纯合的。
在本发明第四种配置的一个实施方案中，每个免疫球蛋白重链基因座包含仅两个或三个所述重排的VJ或VDJ区，任选其中脊椎动物或细胞的基因组对于所述两个或三个重链重排的VJ或VDJ区是纯合的。
本发明提供了通过用抗原免疫本发明第三或第四个实施方案所述的至少一种脊椎动物(例如小鼠或大鼠)而制备的单克隆或多克隆抗体组合物，任选其中所述抗原是感染性疾病病原体抗原，任选其中使用相同抗原免疫所有脊椎动物；任选其中所述抗体是IgG型的。
本发明提供了第三种方法：分离结合预定抗原的抗体(如IgG型如IgG1)的方法，所述方法包括：
(a)提供根据本发明第三或第四个实施方案的脊椎动物(任选小鼠或大鼠)；
(b)用所述抗原(任选其中所述抗原是感染性疾病病原体抗原)免疫(例如使用标准初免-加强)所述脊椎动物；
(c)从所述脊椎动物中取B淋巴细胞并选择表达结合所述抗原的抗体的一或多个B淋巴细胞；
(d)任选使所述选择的B淋巴细胞或其后代永生化，任选通过从中产生杂交瘤进行；及
(e)分离由B淋巴细胞表达的抗体(例如，以及IgG型抗体)；
(f)任选地，本发明第三种方法包括从所述B淋巴细胞中分离编码结合所述抗原的所述抗体的核酸的步骤；任选用编码人或人源化重链恒定区的核苷酸序列交换所述抗体的重链恒定区核苷酸序列及任选亲和性成熟所述抗体可变区，及任选将所述核酸插入表达载体及任选宿主中。
任选地，本发明第三种方法进一步包括产生所述抗体的突变体或衍生物。
本发明提供了第四种方法：产生多克隆抗体混合物的方法，所述方法包括进行所述第三种方法，通过用抗原(例如本文揭示的任何抗原)单独免疫第一和第二脊椎动物(任选第一和第二小鼠或者第一和第二大鼠)并组合分离自每个脊椎动物的抗-抗原抗体(或者所述抗体的突变体或衍生物)以产生多克隆抗体混合物；任选其中单独或组合((i)和(ii)；或者(i)和(iii))应用如下步骤：
(i)将所述脊椎动物用相同抗原或不同抗原免疫(任选其中不同抗原由相同病原性生物体(或者其不同的家族成员或者不同品系的生物体)表达)；
(ii)在免疫之前，所述脊椎动物的重链基因座含有相同的VL基因库集(任选单个VL基因)及任选存在的相同的D和/或J库集；任选哺乳动物的重链基因座在免疫之前是相同的；
(iii)在免疫之前，脊椎动物的重链基因座含有相同的重排的VJ或VDJ库集(任选单个VJ或VDJ)；任选脊椎动物的重链基因座在免疫之前是相同的。
本发明提供了第五种方法：产生多克隆抗体混合物的方法，所述方法包括进行所述第三种方法，通过用第一和第二抗原免疫一或多个脊椎动物(任选小鼠或大鼠)并组合分离自每个脊椎动物的抗-抗原抗体(或者所述抗体的突变体或衍生物)以产生多克隆抗体混合物；任选其中单独或组合((i)和(ii)；或者(i)和(iii))进行如下步骤：
(i)所述抗原由相同病原性生物体(或其不同的家族成员或者不同品系的生物体)表达；
(ii)在免疫之前，脊椎动物的重链基因座含有相同的VL基因库集(任选单个VL基因)及任选存在的相同的D和/或J库集；任选哺乳动物的重链基因座在免疫之前是相同的；
(iii)在免疫之前，脊椎动物的重链基因座含有相同的重排的VJ或VDJ库集(任选单个VJ或VDJ)；任选脊椎动物的重链基因座在免疫之前是相同的。
本发明提供了第六种方法：产生能表达多克隆抗体混合物的宿主细胞的方法，所述方法包括在第三种方法中进行步骤(f)：
(a)用第一和第二抗原免疫一或多个脊椎动物(任选小鼠或大鼠)(任选其中不同抗原由相同病原性生物体(或其家族成员)表达)；
(b)从所述脊椎动物的B淋巴细胞分离编码第一种和第二种抗-抗原抗体的核酸；
(c)确定第一种抗体的重链和轻链可变区的核苷酸序列(任选全部重链和/或轻链序列)；
(d)确定第二种抗体的轻链可变区及任选确定重链可变区的核苷酸序列；
(e)将每个抗体的轻链可变区编码序列插入轻链表达载体中；任选其中每个轻链的恒定区编码序列被交换为编码人或人源化恒定区的核苷酸序列；
(f)将第一种抗体的重链可变区编码序列插入重链表达载体中；任选其中第一种抗体的重链恒定区编码序列被交换为编码人或人源化恒定区的核苷酸序列；
(g)任选地，将第二种抗体的重链可变区编码序列插入重链表达载体中；任选其中第二种抗体的重链恒定区编码序列被交换为编码人或人源化恒定区的核苷酸序列；及
(h)将每个表达载体导入宿主细胞中并在所述宿主细胞混合物中共表达抗体链以产生抗体，每个抗体包含所述轻链可变区和重链之一或二者；任选其中表达载体一起被导入相同宿主细胞中(例如CHO或HEK293细胞)以便所述细胞能表达抗体轻链及重链，由此所述细胞或多个宿主细胞表达抗体(例如两个、三个或四个不同抗体)，每个均包含所述轻链可变区和重链之一或二者；
(i)任选地：
在免疫之前，脊椎动物的重链基因座含有相同的VL基因库集(任选单个VL基因区段)及任选存在的相同的D和/或J库集(任选单个D和J基因区段)；任选脊椎动物的重链基因座在免疫之前是相同的；或者
在免疫之前，脊椎动物的重链基因座含有相同的重排的VJ或VDJ库集(任选单个VJ或VDJ)；任选脊椎动物的重链基因座在免疫之前是相同的。
本发明还提供了如此产生的单克隆或多克隆抗体混合物或者其衍生物抗体或混合物，例如其中一或多个恒定区已经被改变(例如由不同的恒定区如人恒定区置换，或者突变为增强或消除Fc效应子功能)。
本发明提供了第七种方法：产生单克隆抗体或多克隆抗体混合物的方法，所述方法包括进行第六种方法及表达所述抗体的单克隆抗体或多克隆混合物；任选随后分离包含第一种和/或第二种抗体的轻链可变区的抗体。
任选地，用于免疫的每个脊椎动物如下提供：
(a)从人血液或组织(例如B淋巴细胞、PBMC、骨髓、脾、扁桃体或淋巴结)样品中分离表达结合预定抗原的抗体的B淋巴细胞(例如由感染性疾病病原体表达的抗原；任选其中所述血清或组织来自患有、易感于或者恢复自由携带或分泌所述抗原的生物体引起或介导的疾病或病症的人类个体或者来自携带所述生物体的人类个体)；
(b)确定哪个人种系VL基因区段在人体中重组以产生编码所述抗体轻链可变区的所述B淋巴细胞的核苷酸序列；
(c)构建转基因脊椎动物，其中所述人种系VL基因区段提供于根据本发明第三或第四种配置的其重链基因座中；及
(d)提供所述转基因脊椎动物以在本发明的第四种、第五种或第六种方法中免疫。
在另一个实施方案中，用于免疫的每个脊椎动物如下提供：
(a)从人血液或组织(例如B淋巴细胞、PBMC、骨髓、脾、扁桃体或淋巴结)样品中分离表达结合预定抗原的抗体的B淋巴细胞(例如由感染性疾病病原体表达的抗原；任选其中所述血清或组织来自患有、易感于或者恢复自由携带或分泌所述抗原的生物体引起或介导的疾病或病症的人类个体或者来自携带所述生物体的人类个体)；
(b)确定编码所述抗体的重排的VDJ或VJ区的所述B淋巴细胞的核苷酸序列；
(c)构建转基因脊椎动物，其中所述重排的VDJ或VJ区提供于根据本发明第三或第四种配置的其重链基因座中；及
(d)提供所述转基因脊椎动物以在本发明的第四种、第五种或第六种方法中免疫。
共同重链抗体&双特异性(例如针对感染性疾病的两个病原体抗原)
本发明提供了通过本发明第七种方法可获得或者获得的分离的抗体(例如IgG型抗体)或者其突变体或衍生物，其中(i)所述分离的抗体包含所述第一种抗体的重链可变区的两个拷贝，与所述第一种抗体的轻链可变区的两个拷贝配对；或者(ii)所述分离的抗体包含所述第二种抗体的重链可变区的两个拷贝，与所述第一种抗体的轻链可变区的两个拷贝配对；或者(iii)所述分离的抗体是双特异性抗体，其包含所述第一种抗体的重链可变区的一个拷贝，与所述第一种抗体的轻链可变区的拷贝配对，及所述抗体的重链可变区的一个拷贝，与所述第一种抗体的轻链可变区的拷贝配对，任选其中双特异性抗体结合上述第一及第二抗原；任选用于医药学中，任选用于治疗和/或预防感染性疾病。
本发明提供了单克隆或多克隆抗体混合物(例如IgG型抗体)，其中所述单克隆抗体或混合物包含或由通过本发明的第四种、第五种、第六种或第七种方法产生的抗体或者其突变体或衍生物抗体组成，任选用于医药学中，任选用于治疗和/或预防感染性疾病，其中任选每个抗体均结合感染性疾病病原体的抗原，优选相同抗原。
如下实施方案涉及通过本发明的任何前述配置或方法获得或可获得的抗体、宿主细胞、核酸及组合物以及这些元件的应用：
本发明提供分离的嵌合抗体用以治疗和/或预防感染性疾病或病症，所述抗体包含非人脊椎动物(任选小鼠或大鼠)重链恒定区和结合感染性疾病病原体的抗原的人可变区，其中所述抗体在包括用所述抗原免疫根据本发明第一种至第七种方法中任一种方法的脊椎动物的方法中可获得或获得。所述抗原例如是如上述任何抗原。所述疾病或病症例如是上述任何疾病或病症。
本发明提供了分离的人抗体以治疗和/或预防感染性疾病或病症，所述抗体包含人重链恒定区和结合感染性疾病病原体抗原的人可变区，其中所述抗体，在当所述可变区与所述脊椎动物的重链恒定区(例如小鼠或大鼠重链恒定区)可操纵地连接时，在转基因非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)中在包括体内亲和性成熟抗体可变区的方法中可获得或获得，通过(a)用所述抗原免疫本发明任何配置的脊椎动物，(b)分离编码如上述嵌合抗体的核酸，(c)用编码人重链恒定区的核苷酸序列置换编码非人脊椎动物重链恒定区的核酸的核苷酸序列以产生编码人抗体的核酸；(d)在体外表达所述人抗体(任选从携带所述人核酸的CHO或HEK293细胞表达)及(e)分离所述人抗体(任选进一步亲和性成熟所述抗体和/或产生其衍生物)。本发明提供了第一种和第二种这种人抗体(任选还有第三种及任选第四种抗体)的混合物，每种抗体均能结合感染性疾病病原体的抗原(任选其中第一种抗体结合第一抗原，第二种抗体结合第二抗原，所述抗原来自相同病原体；或者其中所述抗原是相同的)。任选地，第一种抗体的轻链氨基酸序列与第二种抗体的轻链氨基酸序列是相同的，或者具有至多15个氨基酸改变。这种共同(或密切相关的)链的优势在上文阐述，并包括相对便于生产。
所述抗原例如是上述任何抗原。所述疾病或病症是例如上述任何疾病或病症。所述病原体是例如上述任何病原体。
本发明提供了包含结合预定抗原(例如由细菌或病毒病原体表达的抗原)的人可变结构域的抗体，其中所述可变结构域序列由重排的VDJ和VJ区编码，每个VDJ和/或VJ均是通过在体内重排人重链和轻链可变区基因区段(V和J及任选存在的D区段)产生的杂交区；任选其中所述抗体包含人恒定区。
本发明提供一种产生治疗和/或预防感染性疾病或病症的分离的人抗体的方法，所述抗体包含人重链恒定区及结合感染性疾病病原体抗原的人可变区，其中所述方法包括当所述可变区与所述脊椎动物的重链恒定区(例如小鼠或大鼠重链恒定区)可操纵地连接时，在转基因非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)中在体内亲和性成熟抗体可变区，通过(a)用所述抗原免疫本发明任何配置的脊椎动物；(b)分离编码如上述嵌合抗体的核酸；(c)用编码人重链恒定区的核苷酸序列置换编码非人脊椎动物重链恒定区的核酸的核苷酸序列以产生编码人抗体的核酸；(d)在体外表达所述人抗体(任选从携带所述人核酸的CHO或HEK293细胞中表达)及(e)分离所述人抗体(任选进一步亲和性成熟所述抗体和/或产生其衍生物)。所述抗原例如是如上述任何抗原。所述疾病或病症例如是如上述任何疾病或病症。所述病原体是例如上述任何病原体。
本发明提供了如上述任何分离的单克隆或多克隆抗体或混合物在生产治疗和/或预防感染性疾病的药物中的应用，任选其中感染性疾病是由细菌或病毒病原体引起的疾病。所述疾病或病症是例如上述任何疾病或病症。所述病原体是例如上述任何病原体。例如，所述感染性疾病选自由选自如下病原体引起的疾病：流感嗜血杆菌，大肠杆菌，脑膜炎奈瑟氏菌，疱疹病毒科病毒，巨细胞病毒(CMV)，HIV和流感病毒。
本发明提供了编码根据本发明任何配置、方面、实例或实施方案的抗体的重链和轻链或者至少其可变区的第一个和第二个核苷酸序列(例如DNA、RNA、mRNA、cDNA)，任选其中每个核苷酸序列是载体的一部分。
本发明提供了包含编码上述第一种和第二种抗体的重链及上述第一种抗体的轻链(及任选第二种抗体的轻链)的一或多个表达载体的宿主。而且，参考上述关于具有共同抗体链对于生产抗体混合物的优势的讨论。
本发明提供了一种药物组合物，其包含根据本发明任何配置、方面、实例或实施方案的一或多个抗体及稀释剂、赋形剂或载体；任选其中所述组合物提供于与IV针头或注射器连接的容器中或者于IV包中。技术人员已知适于药物应用的标准稀释剂、赋形剂和载体。
在本说明书中个，在提及“至少80％相同”时，是指涵盖如下可选的相同性：至少85％、90、95、96、97、98或99％相同，文中涵盖的一或多个这些相同性在权利要求书中可代替“至少80％相同”。
定制V(D)J掺入免疫球蛋白基因座以生产抗感染性疾病的抗体
在上述各个配置、方面、实施方案和实例中，本发明提供了技术人员以定制或偏向所述库集的方式选择免疫球蛋白基因区段的可能性用于产生治疗和/或预防感染性疾病的抗体。本发明人已经将下组的用于本发明中的基因区段根据所得抗体的希望应用而加以归类。
列表A:
针对结合由病原体表达的抗原的抗体的免疫球蛋白基因区段
(a)VL基因区段，选自：VλII基因家族成员、VλVII4A、VλII2.1、VλVII4A、Vλ1基因家族成员、Vλ3基因家族成员、IGLV1S2、Vλ3-cML70、lalh2、lalvl、la3h3、Kv325、VκI基因家族成员、κI-15A(KL012)、VκII家族成员、VκIII家族成员、VκI基因家族成员、κI-15A(KL012)、VκIIA2(任选A2a等位基因)、VκA27(Humkv325)及与其至少80％相同的基因区段。
(b)Vλ基因区段，选自：VλII基因家族成员、VλVII4A、VλII2.1、VλVII4A、Vλ1基因家族成员、Vλ3基因家族成员、IGLV1S2、Vλ3-cML70、lalh2、lalvl、la3h3及与其至少80％相同的基因区段。
(c)Vκ基因区段，选自：Kv325、VκI基因家族成员、κI-15A(KL012)、VκII家族成员、VκIII家族成员、VκI基因家族成员、κI-15A(KL012)、VκIIA2(任选A2a等位基因)、VκA27(Humkv325)及与其至少80％相同的基因区段。
(d)VH基因区段，选自：VHIII基因家族成员(任选VHIIIa或VHIIIb家族成员)、VHIV基因家族成员、VHIII9.1(VH3-15)、VHIII VH26(VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)、VH H11、VH1GRR、ha3h2、VHI-ha1c1、VHIII-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hv1051、71-2、Hv1f10、VH4.11、71-4、VH251、VH1-69及与其至少80％相同的基因区段。
(e)Jλ基因区段，选自Jλ2、Jλ3及与其至少80％相同的基因区段。
(f)D基因区段，选自Dk1、Dxp'1、Dn4r、D2r及与其至少80％相同的基因区段。
列表A1:
针对结合由细菌病原体表达的抗原的抗体的免疫球蛋白基因区段
(a)Vλ基因区段，选自VλII基因家族成员、VλVII4A、VλII2.1、VλVII4A及与其至少80％相同的基因区段。
(b)Vκ基因区段，选自：VκI基因家族成员、κI-15A(KL012)、VκII家族成员、VκIII家族成员、VκI基因家族成员、κI-15A(KL012)、VκII A2(任选A2a等位基因)、VκA27(Humkv325)及与其至少80％相同的基因区段。
(c)VH基因区段，选自：VH3基因家族成员(任选VHIIIa或VHIIIb家族成员)、VHIII9.1(VH3-15)、VHIII VH26(VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、
LSG12.1、DP77(V3-21)、VH H11及与其至少80％相同的基因区段。
(d)Jλ基因区段，选自Jλ2、Jλ3及与其至少80％相同的基因区段。
(e)JH基因区段，选自JH2、JH3、JH4及与其至少80％相同的基因区段。
列表A1.1:
针对结合由流感嗜血杆菌表达的抗原的抗体的免疫球蛋白基因区段
(a)Vλ基因区段，选自VλII基因家族成员、VλVII4A、VλII2.1、VλVII4A及与其至少80％相同的基因区段。
(b)Vκ基因区段，选自VκII家族成员、VκIII家族成员、VκI基因家族成员、κI-15A(KL012)、VκII A2(任选A2a等位基因)、VκA27(Humkv325)及与其至少80％相同的基因区段。
(c)VH基因区段，选自VH3基因家族成员(任选VHIIIb家族成员)、VHIII9.1(VH3-15)、VHIII VH26(VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)及与其至少80％相同的基因区段。
(d)Jλ基因区段，选自Jλ2、Jλ3及与其至少80％相同的基因区段。
列表A1.2:
针对结合由大肠杆菌或脑膜炎奈瑟氏菌表达的抗原的抗体的免疫球蛋白基因区 段
(a)VH基因区段，选自VH3基因家族成员(任选VHIIIa或VHIIIb成员)、VHIII9.1(VH3-15)、VH H11、VHIII VH26(VH3-23)、与其至少80％相同的基因区段，例如VHIII9.1+JH3；或者VH H11+JH4；或者VHIII VH26+JH2。
(b)Vκ基因区段，选自VκI基因家族成员、κI-15A(KL012)及与其至少80％相同的基因区段。
(c)Vλ基因区段，选自VλII基因家族成员、VλII2.1及与其至少80％相同的基因区段。
(d)JH基因区段，选自JH2、JH3、JH4及与其至少80％相同的基因区段。
A2:
结合由病毒病原体表达的抗原的抗体的免疫球蛋白基因区段
(a)VH基因区段，选自VHIII基因家族成员、VHIV基因家族成员、VHIII-VH26(VH3-23)、VH1GRR、ha3h2、VHI-ha1c1、VHIII-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hv1051、71-2、Hv1f10、VH4.11、71-4、VH251、VH1-69及与其至少80％相同的基因区段。
(b)Vλ基因区段，其选自Vλ1基因家族成员、Vλ3基因家族成员、IGLV1S2、Vλ3-cML70、lalh2、lalvl、la3h3及与其至少80％相同的基因区段。
(c)Vk基因区段，选自Kv325及与其至少80％相同的基因区段。
(d)JH基因区段，选自JH3、JH5、JH6及与其至少80％相同的基因区段。
(e)D基因区段，选自Dk1、Dxp'1、Dn4r、D2r及与其至少80％相同的基因区段。
(f)Jλ基因区段，选自Jλ2、Jλ3及与其至少80％相同的基因区段。
A2.1：
结合由疱疹病毒家族(例如VZV或HSV)表达的抗原的抗体的免疫球蛋白基因区段
(a)VH基因区段，选自VHIII基因家族成员、VHIV基因家族成员、VHIII-VH26(VH3-23)、VH1GRR、ha3h2、VHI-ha1c1、VHIII-VH2-1、VH4.18、ha4h3、及与其至少80％相同的基因区段。
(b)Vλ基因区段，选自Vλ1基因家族成员、Vλ3基因家族成员、IGLV1S2、Vλ3-cML70、lalh2、lalvl、la3h3及与其至少80％相同的基因区段。
(c)JH基因区段，选自JH3、JH5、JH6及与其至少80％相同的基因区段。
(d)D基因区段，选自Dk1、Dxp'1、Dn4r、D2r及与其至少80％相同的基因区段。
(e)Jλ基因区段，选自Jλ2、Jλ3及与其至少80％相同的基因区段。
A2.2:
结合由CMV表达的抗原的抗体的免疫球蛋白基因区段
(a)VH基因区段，选自Hv1051及与其至少80％相同的基因区段。
(b)Vκ基因区段，选自Kv325及与其至少80％相同的基因区段。
A2.3:
结合由HIV表达的抗原的抗体的免疫球蛋白基因区段
(a)VH基因区段，选自71-2、Hv1f10、VH4.11、71-4、VH251、VH1-69及与其至少80％相同的基因区段。
A2.4:
结合由流感病毒表达的抗原的抗体的免疫球蛋白基因区段
(a)VH基因区段，选自VH1-69及与其至少80％相同的基因区段。
因此，
在希望产生抗体或抗体混合物以治疗和/或预防感染性疾病时，可以从列表A1中选择用于本发明任何配置、方面、方法、实例或实施方案中的一或多个V、D和/或一或多个或所有J基因区段。因此，例如在本发明第一种配置的(a)中，所列出的重链V基因区段选自列表A中的VH基因区段，任选具有该目录中的D。
在希望产生抗体或抗体混合物以治疗和/或预防由细菌病原体引起或介导的感染性疾病时，用于本发明的任何配置、方面、方法、实例或实施方案中的一或多个或所有V、D和/或J基因区段可选自列表A1。
在希望产生抗体或抗体混合物以治疗和/或预防由病毒病原体引起或介导的感染性疾病时，用于本发明的任何配置、方面、方法、实例或实施方案中的一或多个或所有V、D和/或J基因区段可选自列表A2。
在希望产生抗体或抗体混合物以治疗和/或预防由流感嗜血杆菌引起或介导的感染性疾病时，用于本发明的任何配置、方面、方法、实例或实施方案中的一或多个或所有V、D和/或J基因区段可选自列表A1.1。
在希望产生抗体或抗体混合物以治疗和/或预防由大肠杆菌或脑膜炎奈瑟氏菌引起或介导的感染性疾病时，用于本发明的任何配置、方面、方法、实例或实施方案中的一或多个或所有V、D和/或J基因区段可选自列表A1.2。
在希望产生抗体或抗体混合物以治疗和/或预防由疱疹病毒家族(如VZV或HSV)引起或介导的感染性疾病时，用于本发明的任何配置、方面、方法、实例或实施方案中的一或多个或所有V、D和/或J基因区段可选自列表A2.1。
在希望产生抗体或抗体混合物以治疗和/或预防由CMV引起或介导的感染性疾病时，用于本发明的任何配置、方面、方法、实例或实施方案中的一或多个或所有V、D和/或J基因区段可选自列表A2.2。
在希望产生抗体或抗体混合物以治疗和/或预防由HIV引起或介导的感染性疾病时，用于本发明的任何配置、方面、方法、实例或实施方案中的一或多个或所有V、D和/或J基因区段可选自列表A2.3。
在希望产生抗体或抗体混合物以治疗和/或预防由流感病毒引起或介导的感染性疾病时，用于本发明的任何配置、方面、方法、实例或实施方案中的一或多个或所有V、D和/或J基因区段可选自列表A2.4。
任选本发明基因座中的每个VH区段均选自列表A1、A2、A1.1、A1.2、A2.1、A2.2、A2.3或A2.4。
任选本发明基因座中每个VL区段均选自列表A1、A2、A1.1、A1.2、A2.1、A2.2、A2.3或A2.4。
任选本发明基因座中每个D区段均选自列表A1、A2、A1.1、A1.2、A2.1、A2.2、A2.3或A2.4。
任选本发明基因座中每个JL区段均选自列表A1、A2、A1.1、A1.2、A2.1、A2.2、A2.3或A2.4。
对病原体及其它抗原的长HCDR3结合位点及定制基因区段
本发明的这个方面涉及脊椎动物、细胞、方法及具有相对较长HCDR3结合位点的抗体的开发。本发明还提供了其中基因组和抗体在其基因区段使用方面是定制的实施方案，以针对感染性疾病病原体抗原或者用较长HCDR3有利针对的其它抗原以结合或中和。抗体可以在脊椎动物中通过用非病原体靶抗原如携带在裂缝中的需要长CDR以接触的表位的抗原或者来自引起或涉及有害的人体疾病或病症的病原体的抗原免疫而产生。例如是细菌或病毒病原体，靶抗原可以是细菌细胞表面抗原或者病毒表面暴露的抗原(例如包被蛋白)。此外或或者，抗原可以是从病原性细菌或病毒中释出(例如分泌)的抗原。本发明不限于针对病原体抗原，但是也可用于针对其中长CDR3有益于结合的情况中的其它抗原(例如酶活性位点或受体裂缝)。
具有长HCDR3(根据IMGT命名法具有至少20个氨基酸)的抗体已经示出有效中和各种病原体，包括HIV、流感病毒、疟疾和非洲锥体虫。还可以提及的是天然发生的骆驼(例如美洲鸵或骆驼)仅重链抗体，其携带长HCDR3以达到相对不能接近的表位(见例如EP0937140)。长HCDR3可形成独特的稳定亚结构域，具有扩展的环结构，高于抗体表面以赋予良好特异性。在一些情况中，长HCDR3自身对于表位结合和中和是足够的(Liu,L et al；Journal of Virology.2011.85:8467-8476，在此并入本文作参考)。长HCDR3的独特结构使其可以结合位于病原体表面上不能接近的结构或广泛的糖基化内的关联(cognate)表位。在人周围血中，有大约3.5％的幼稚B抗体或者1.9％的记忆B IgG抗体含有长度超过24个氨基酸的HCDR3(Briney,BS et al，参见下文所述)(Briney,BS et al的图1)。使用分析表明这些抗体优先使用人VH1-69、D2-2、D3-3、D2-15和JH6区段(Briney,BS et al的图2-5)。所有HCDR3长度抗体中有大约20％使用JH6。然而，在具有超过24个氨基酸的HCDR3的这些抗体中，有70％使用JH6(Briney,BS et al的图2)。人VH5-51也常用于抗-HIV抗体(见Gorny etal,PLoS One.2011；6(12):e27780.Epub2011Dec2。
由VH5-51/VLλ基因编码的人抗-V3HIV-1单克隆抗体限定了保守抗原性结构，所述文献并入本文作参考)。
补充这些观测结果，本发明人发现(见实施例)其它选择的人重链可变区基因区段(V、D、J)在转基因非人脊椎动物中重组，产生长HCDR3(至少20个氨基酸)。
因此，如在实施例中进一步阐述，本发明人在ES细胞中构建了转基因IgH基因座，其中所述基因座有意地包含选择的人重链可变区基因区段(V、D、J)，其重组产生长HCDR3(至少20个氨基酸)。从所述ES细胞中，本发明人产生转基因非人脊椎动物(首次用于实验的及用各种不同靶抗原类型-疾病病原体和人抗原性物种免疫的)，分离基于选择的基因区段的抗体及重链序列以及表达这些抗体的B细胞并且产生表达基于选择的基因区段的抗原特异性抗体的杂交瘤。
本领域需要遗传修饰的非人动物，优选其产生具有长HCDR3的人抗体，以及在所述抗体可针对更易于由长HCDR3针对的靶表位的情况中，可以自这种动物中选择的抗体。长CDRH3也可以用于贯穿(penetrating)高度聚糖覆盖的表位位点(例如病毒表位或者任何糖蛋白靶，例如见Nature.2011Dec14；480(7377):324-5.doi:10.1038/480324a；Vaccinology:"A sweet cleft in HIV's armour",Sattentau QJ，所述文献在此并入本文作参考)，以及所述靶抗原可包含这种靶表位。
本发明提供了脊椎动物，其可人工模拟那些天然发生的人长HCDR3抗体并且可以提供抗体、重链和可变结构域库集，从中可以选择具有长HCDR3(具有长度为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个氨基酸(根据IMGT)的HCDR3)的抗体、重链或可变结构域。本发明提供了位于脊椎动物基因座包含的重链基因座中非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠，例如内源性小鼠或大鼠)恒定区上游的人VH、D和J基因库集的组合。这使得人基因区段在内源性或其它非脊椎动物恒定区中重组、成熟和选择，提高了良好大小的抗体、重链和可变结构域库集的开发，从中选择长HCDR3-型结合位点。因此，在本发明的任何配置的实例中，人基因区段提供在位于非人脊椎动物(例如内源性)恒定区上游的重链基因座中。相似地，本发明的任何抗体均包含人可变结构域及非人脊椎动物(例如内源性)结构域。后者在选择和分离之后可以由人恒定结构域置换。
例如，期望如下本发明的抗体(例如在本发明这个方面的脊椎动物中通过本文揭示的方法产生的)或者如此产生的抗体的拷贝或衍生物：
分离的、合成的或重组抗体，其包含具有长度为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个氨基酸(根据IMGT)的HCDR3的人重链可变结构域，重链可变结构域衍生自选自本文所述VH组的人VH基因区段与人D基因区段和人JH基因区段(任选JH6)的重组，其中所述抗体结合靶抗原；其中当与相应人种系V、D和J序列相比时所述重链可变结构域具有非人脊椎动物AID-模式体细胞超变(例如小鼠或大鼠AID-模式突变)和/或当与相应人种系V、D和J序列相比时具有非人(例如小鼠或大鼠)末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)-模式连接突变。在一个实例中，本发明的抗体具有长度为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸(根据IMGT)的HCDR3。在一个实例中，所述抗原是引起或者参与人感染性疾病或病症的病原体抗原，例如表1中列出的病原体。在一个实例中，所述抗体特异性结合抗原的活性位点或裂缝(例如酶活性位点或受体裂缝)。这可以例如使用技术人员已知的抗体(或者重链或VH结构域)与相关抗原的复合物的标准X-线晶体学确定。
可以提供小鼠AID-模式体细胞超变和/或小鼠dTd-模式突变，例如其中VH结构域是在包含小鼠AID和/或小鼠TdT(例如内源性AID或TdT)的小鼠中产生。见Annu.Rev.Biochem.2007.76:1-22；Javier M.Di Noia and Michael S.Neuberger,"Molecular Mechanisms of Antibody Somatic Hypermutation"(特别是图1及在小鼠中对AID热点的相关讨论)；及Curr Opin Immunol.1995Apr；7(2):248-54,"Somatichypermutation",Neuberger MS and Milstein C(特别是在小鼠中关于热点的讨论)，所述文献在此并入本文作参考。这种小鼠可以使用相应小鼠ES细胞技术产生。
在一个实例中，所述抗体特异性结合HIV抗原。已知一些天然发生的人抗体中和HIV，具有相当长的HCDR3(20个氨基酸或更多个氨基酸，根据IMGT；见Breden et al,PLoSOne.2011Mar30；6(3):e16857；"Comparison of antibody repertoires produced byHIV-1infection,other chronic and acute infections,and systemic autoimmunedisease"(并入本文作参考)-VH1-69优选用于长HCDR3)。也见PLoS One.2012；7(5):e36750.Epub2012May9；"Human peripheral blood antibodies with long HCDR3s areestablished primarily at original recombination using a limited subset ofgermline genes"；Briney BS e al(并入本文作参考)。因此，希望提供本发明的抗体，其具有相似长度的HCDR3长度。在一个实例中，提供本发明的抗体治疗和/或预防人体中HIV感染例如慢性HIV感染。本发明还提供了治疗和/或预防人体中HIV感染例如慢性HIV感染的方法，所述方法包括给予药物可接受剂量的本发明抗体。所述剂量可以分成一或多个给予等份，例如在一段时间内根据医学确定的方案给予，这些为技术人员所能确定。
在一个实例中，所述抗体特异性结合流感嗜血杆菌b型多糖。在一个实例中，提供本发明的抗体治疗和/或预防人体中流感嗜血杆菌感染例如慢性流感嗜血杆菌感染。本发明还提供了治疗和/或预防人体中流感嗜血杆菌感染如慢性流感嗜血杆菌感染的方法，所述方法包括给予药物可接受剂量的本发明抗体。所述剂量可以分成一或多个给予等份，例如在一段时间内根据医学确定的方案给予，这些为技术人员所能确定。
在一个实例中，所述抗体特异性结合轮状病毒抗原(例如蛋白6或7)。在一个实例中，提供本发明的抗体治疗和/或预防人体中轮状病毒感染例如慢性轮状病毒感染。本发明还提供了治疗和/或预防人体中轮状病毒感染如慢性轮状病毒感染的方法，所述方法包括给予药物可接受剂量的本发明抗体。所述剂量可以分成一或多个给予等份，例如在一段时间内根据医学确定的方案给予，这些为技术人员所能确定。
在一个实例中，所述抗体特异性结合巨细胞病毒抗原(例如巨细胞病毒gB抗原)。在一个实例中，提供本发明的抗体治疗和/或预防人体中巨细胞病毒感染如慢性巨细胞病毒感染。本发明还提供了治疗和/或预防人体中巨细胞病毒感染如慢性巨细胞病毒感染的方法，所述方法包括给予药物可接受剂量的本发明抗体。所述剂量可以分成一或多个给予等份，例如在一段时间内根据医学确定的方案给予，这些为技术人员所能确定。
本发明还提供了表达这种抗体的脊椎动物或细胞；因此本发明提供了非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎动物细胞(例如小鼠细胞或大鼠细胞)，其基因组包含人免疫球蛋白VH基因区段库集，其偏向于选自本文所述VH组的一个、多个或所有人VH基因区段。
本发明还提供了分离结合HIV抗原、流感嗜血杆菌b型多糖、巨细胞病毒抗原或者轮状病毒抗原的抗体的方法，所述方法包括：
(a)提供本发明的人VH偏向的脊椎动物；
(b)用所述HIV抗原、流感嗜血杆菌b型多糖、巨细胞病毒抗原或轮状病毒抗原免疫所述脊椎动物；
(c)从所述脊椎动物取B淋巴细胞，选择表达结合所述抗原的抗体的一或多个B淋巴细胞；
(d)任选使所述选择的B淋巴细胞或其后代永生化，任选通过从中产生杂交瘤而进行；及
(e)分离由所述B淋巴细胞表达的抗体(例如，以及IgG型抗体)，其中所述抗体具有长度为20个或更多个氨基酸的HCDR3。
任选地，所述方法进一步包括从所述B淋巴细胞分离编码结合所述抗原的所述抗体的核酸的步骤；任选用编码人或人源化重链恒定区的核苷酸序列交换所述抗体的重链恒定区核苷酸序列及任选亲和性成熟所述抗体的可变区；及任选将所述核酸插入表达载体及任选宿主中。
任选地，所述方法进一步包括制备通过所述方法产生的抗体的拷贝、突变体或衍生物(例如人源化形式)。
本发明的这个方面还提供了：
包含抗-HIV抗体的药物组合物，用以治疗和/或预防人体中(例如在婴儿中)HIV。
包含抗-流感嗜血杆菌b型多糖抗体的药物组合物，用于治疗和/或预防人体中(例如在婴儿中)流感嗜血杆菌。
包含抗-轮状病毒抗体的药物组合物，用于治疗和/或预防人体中(例如在婴儿中)轮状病毒。
包含抗-巨细胞病毒抗体的药物组合物，用于治疗和/或预防人体中(例如在婴儿中)巨细胞病毒。
本发明还提供了产生这种抗体的方法(例如上述(i)及下列任一实施方案)，通过用靶抗原免疫本发明的脊椎动物及从所述脊椎动物分离抗体而进行，任选也产生所述抗体的拷贝或衍生物。在进一步的步骤中，从所述脊椎动物分离能表达所述抗体的B细胞。在进一步的步骤中，从所述脊椎动物分离编码所述抗体(或其VH结构域)的核酸(例如从分离自所述脊椎动物的B细胞中PCR克隆的核酸)。
在一个实例中，本发明的抗体是中和抗体。在一个实例中，本发明的抗体具有长度为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个氨基酸的HCDR3(根据IMGT)。在一个实例中，本发明的抗体具有长度为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸的HCDR3(根据IMGT)。在一个实例中，本发明的抗体分离自非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)，例如本发明的脊椎动物；或者所述抗体是其拷贝或衍生物(例如人源化形式)。在一个实例中，本发明的抗体具有非人脊椎动物恒定区(例如小鼠或大鼠恒定区)；这些可以使用标准重组DNA技术用人恒定区置换，因此本发明还提供了人形式的上述抗体，其中所述人抗体包含人可变区和恒定区，其中所述可变区结合所述抗原。在一个实例中，本发明的抗体具有λ-型人轻链可变结构域。在另一实例中，本发明的抗体具有κ-型人轻链可变结构域。
抗体竞争可以通过例如标准的ELISA或表面等离子共振(SPR；例如通过竞争性BiacoreTM或Proteon)技术确定。
本发明还提供了如下实施方案(以编号条款列举)：
D偏向(bias)
1.非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎动物细胞(例如小鼠细胞或大鼠细胞)，其基因组包含人免疫球蛋白D基因区段库集，其偏向于人D2和/或D3家族或者偏向于选自D1-26、D2-2、D3-9、D3-10、D3-22、D4-17、D6-13和D6-19的一个、多个或者所有人D基因区段。
例如，所述库集仅由选自D2和/或D3家族的人D基因区段组成。
任选地，所述库集偏向于一或多个人D2-2、D2-15、D3-3、D3-9、D3-10和D3-22，或者所述库集由一个、多个或者所有这些D基因区段组成。这些基因区段产生长HCDR3长度(例如见表2及本文引用的参考文献)。
例如，所述库集偏向于一或多个人D2-2*02、D3-9*01、D3-10*01和D3-22*01，或者所述库集由一个、多个或所有这些D基因区段组成。
例如，所述库集偏向于一或多个人D2-2*02、D3-9*01和D3-10*01，或者所述库集由一个、多个或所有这些D基因区段组成。
例如，所述库集偏向于D3-9*01和D3-10*01，或者由一个、多个或所有这些D基因区段组成。
任选地，所述库集由一个、多个或所有人D1-26、D2-2、D3-9、D3-10、D3-22、D4-17、D6-13和D6-19组成。这些基因区段产生长HCDR3长度(例如见表2)。
任选地，所述库集偏向于一或多个人D1-26*01、D2-2*02、D3-9*01、D3-10*01、D3-22*01、D4-17*01、D6-13*01和D6-19*01，或者所述库集由一个、多个或所有这些D基因区段组成。
任选地，库集偏向于一或多个人D2-2、D3-9、D3-10、D3-22、D4-17、D6-13和D6-19，或者所述库集由一个、多个或所有这些D基因区段组成。任选地，所述库集偏向于一或多个人D2-2*02、D3-9*01、D3-10*01、D3-22*01、D4-17*01、D6-13*01和D6-19*01，或者所述库集由一个、多个或所有这些D基因区段组成。这些基因区段在首次用于实验的库集中产生长HCDR3长度(例如见表2)。
任选地，所述库集偏向于一或多个人D1-26、D2-2、D3-10和D6-19，或者所述库集由一个、多个或所有这些D基因区段组成。任选地，所述库集偏向于一或多个人D1-26*01、D2-2*02、D3-10*01和D6-19*01，或者所述库集由一个、多个或所有这些D基因区段组成。这些基因区段在免疫的库集中产生长HCDR3长度(例如见表2)。
任选地，所述库集偏向于一或多个人D2-2、D3-9和D3-10，或者所述库集由一个、多个或所有这些D基因区段组成。任选地，所述库集偏向于一或多个人D2-2*02、D3-9*01和D3-10*01，或者所述库集由一个、多个或所有这些D基因区段组成。这些基因区段在抗原特异性库集中产生长HCDR3长度(例如见表2)。
IMGT命名法用于所有基因区段。
在本说明书中，Genbank是指Genbank版本号185.0或191.0；1000Genomes数据库是Phase1,release v3,16th March2012；Ensembl数据库是集合的GRCh37.p8(10/04/2012)；IMGT数据库可在www.imgt.org获得。本文明确提及的所有VH基因区段的序列以其整体在本文揭示(可能包括在条款中组合条款所述的本发明的任何方面)，这种序列是在IMGT和1000Genomes数据库中的那些序列。
在一个实施方案中，所述基因组包含IgH基因座，其包含靶向插入的所述人D基因区段。在一个实例中，IgH基因座包含(5’至3’方向)一或多个人VH基因区段、所述D基因区段库集、一或多个人JH基因区段及恒定区(例如其中恒定区是人恒定区或者非人(例如内源性如小鼠或大鼠)恒定区)。
在另一个实施方案中，所述基因组包含随机插入其中的所述人D基因区段。这可以例如通过YACS将人DNA荷载(borne)掺入ES细胞的基因组中而实现(随后任选根据标准方法从中产生非人脊椎动物)。
任选地，所述人D基因区段库集进一步包含不超过5个额外的人D基因区段，例如所述库集包括1、2、3、4或5个额外的人D基因区段。
2.条款1的脊椎动物或细胞，其中所述D基因区段库集由或者基本由选自D1-26、D2-2、D3-9、D3-10、D3-22、D4-17、D6-13和D6-19的1个、2个或者3个人基因区段组成。
3.条款1或2的脊椎动物或细胞，其中所述基因组包含未重排的免疫球蛋白重链基因座，其包含(5’至3’方向)人VH、D和JH基因区段，及条款1所述人D基因区段与所述VH基因区段由不超过4个其它D基因区段(例如无D基因区段)间隔开。
这提供了偏向，其中近端D基因区段(那些更3’端的，即更接近恒定区)与远端那些区段(即5’端或更远离恒定区)相比可能是更频繁使用的。
4.前述任何条款的脊椎动物或细胞，其中所述基因组包含未重排的免疫球蛋白重链基因座，其包含所述人D基因区段，及在所述基因座中所述人D基因区段之间无其它D基因区段。
这是偏向D基因区段库集的另一种方式。因此，希望的D以串联形式提供，目的在于促进重组使用。
5.前述任何条款的脊椎动物或细胞，其中所述基因组包含选自D1-26、D2-2、D2-15、D3-3、D3-9、D3-10、D3-22、D4-17、D6-13和D6-19的人D基因区段的三个或更多个拷贝。
例如，所述基因组包含选自D1-26、D2-2、D3-9、D3-10、D3-22、D4-17、D6-13和D6-19的人D基因区段的三个或更多个拷贝。
这是偏向D基因区段的库集的另一方式。
6.条款5的脊椎动物或细胞，其中所述基因组包含选自D1-26、D2-2、D2-15、D3-3、D3-9、D3-10、D3-22、D4-17、D6-13和D6-19的第一个和第二个人D基因区段，其中第一个D基因区段以三或更多个拷贝存在，及其中第二个D基因区段以三或更多个拷贝存在。
例如，第一个和第二个基因区段选自D1-26、D2-2、D3-9、D3-10、D3-22、D4-17、D6-13和D6-19。
可进行本文描述的各种基因区段偏向技术，使用常规DNA操纵技术，构建本发明的转基因脊椎动物或细胞，所述技术(例如重组工程和重组DNA技术)为技术人员已知。例如，可以使用这些技术构建BAC，其中提供希望的人基因区段组合，这些BAC可导入ES细胞以将所述人基因区段掺入其基因组(例如通过靶向插入Ig基因座中)。ES细胞可用于根据标准方法产生转基因脊椎动物，细胞(例如B细胞)可以分离自其中基因组如本发明所述的这些脊椎动物。
在一个实施方案中，偏向的D基因区段选自变体的IMGT数据库或者1000Genomes数据库。
7.前述任何条款的脊椎动物或细胞，其中D基因区段选自D2-2*02、D3-9*01、D3-10*01和D3-22*01，或者选自D1-26*01、D2-2*02、D3-9*01、D3-10*01、D3-22*01、D4-17*01、D6-13*01和D6-19*01。
VH偏向
8.非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎动物细胞(例如小鼠细胞或大鼠细胞)，任选根据前述任何条款，其基因组包含人免疫球蛋白VH基因区段库集，其偏向于选自如下一组中的一个、多个或所有基因区段：VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH5-51、VH1-69、VH2-5、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH4-4、VH6-1和VH7-4-1。
这些基因区段产生长HCDR3长度(见表2及本文引用的参考文献)。
例如，VH库集偏向于一个、多个或所有VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH2-5、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH4-4、VH6-1和VH7-4-1。这些基因区段产生长HCDR3长度(见表2)，或者所述库集由一个、多个或所有这些VH基因区段组成。例如，所述VH库集偏向于一个、多个或所有VH1-2*02、VH1-3*01、VH1-8*01、VH1-18*01、VH2-5*10、VH3-7*01、VH3-9*01、VH3-11*01、VH3-13*01、VH3-21*03、VH3-23*04、VH4-4*02、VH6-1*01和VH7-4-1*01，或者所述库集由一个、多个或所有这些VH基因区段组成。
例如，所述VH库集偏向于一个、多个或所有VH1-2*02、VH1-8*01、VH1-18*01、VH1-3*01、VH2-5*10、VH3-7*01、VH3-9*01、VH3-13*01、VH3-21*03、VH3-23*04、VH4-4*02、VH6-1*01和VH7-4-1*01，或者所述库集由一个、多个或所有这些VH基因区段组成。这些基因区段在首次用于实验的库集中产生长HCDR3长度(见表2)。
例如，所述VH库集偏向于一个、多个或所有VH4-4*02、VH3-11*01和VH3-7*01，或者所述库集由一个、多个或所有这些VH基因区段组成。这些基因区段在免疫的库集中产生长HCDR3长度(见表2)。
例如，所述VH库集偏向于一个、多个或所有VH1-3*01、VH1-8*01、VH3-7*01、VH3-9*01、VH3-11*01和VH4-4*02，或者所述库集由一个、多个或所有这些VH基因区段组成。这些基因区段在抗原特异性库集中产生长HCDR3长度(见表2)。
任选地，人VH基因区段库集进一步包含不超过5个额外的人VH基因区段，例如所述库集包括1、2、3、4或5个额外的人VH基因区段。
在一个实施方案中，所述基因组包含IgH基因座，其包含靶向插入的所述人VH基因区段。在一个实例中，所述IgH基因座包含(5’至3’方向)所述VH基因区段、一或多个人D基因区段、一或多个人JH基因区段及恒定区(例如其中所述恒定区是人恒定区或者非人(例如内源性如小鼠或大鼠)恒定区)。
在另一个实施方案中，所述基因组包含随机插入其中的所述人VH基因区段。这可以通过例如通过YACS将人DNA荷载掺入ES细胞的基因组中而实现(随后任选通过标准方法从中产生非人脊椎动物)。
9.条款8的脊椎动物或细胞，其中所述VH基因区段库集基本上由选自如下一组中的一个、两个或三个人基因区段组成：VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH5-51、VH1-69、VH2-5、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH4-4、VH6-1和VH7-4-1。
例如，所述VH基因区段库集基本上由选自如下一组的一个、两个或三个人基因区段组成：VH1-2*02、VH1-3*01、VH1-8*01、VH1-18*01、VH2-5*10、VH3-7*01、VH3-9*01、VH3-11*01、VH3-13*01、VH3-21*03、VH3-23*04、VH4-4*02、VH6-1*01和VH7-4-1*01。
10.条款8或9的脊椎动物或细胞，其中所述基因组包含未重排的免疫球蛋白重链基因座，其包含(5’至3’方向)人VH、D和JH基因区段，所述人VH基因区段与D基因区段由不超过4个其它VH基因区段(例如无VH基因区段)间隔开。
这提供了偏向，其中近端VH基因区段(更3’端的那些区段，即更接近恒定区)与远端那些区段(即5’端或者进一步远离恒定区)相比更可能频繁使用。
11.条款8-10任一项的脊椎动物或细胞，其中所述基因组包含未重排的免疫球蛋白重链基因座，其包含所述人VH基因区段，及在所述基因座中所述人VH基因区段之间无其它VH基因区段。
这是偏向VH基因区段的库集的另一方式。
12.条款8-11任一项的脊椎动物或细胞，其中所述基因组包含选自如下一组的人VH基因区段的三个或更多个拷贝：VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH5-51、VH1-69、VH2-5、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH4-4、VH6-1和VH7-4-1。
例如，所述基因组包含选自如下一组的人VH基因区段的三个或更多个拷贝：VH1-2*02、VH1-3*01、VH1-8*01、VH1-18*01、VH2-5*10、VH3-7*01、VH3-9*01、VH3-11*01、VH3-13*01、VH3-21*03、VH3-23*04、VH4-4*02、VH6-1*01和VH7-4-1*01。
这是偏向VH基因区段的库集的另一方式。
13.条款12的脊椎动物或细胞，其中所述基因组包含选自VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH5-51、VH1-69、VH2-5、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH4-4、VH6-1和VH7-4-1的第一个和第二个人VH基因区段，当第一个VH基因区段以三个或更多个拷贝存在时，及其中第二个VH基因区段以三个或更多个拷贝存在。
例如，所述基因组包含选自如下一组的第一个和第二个人VH基因区段：VH1-2*02、VH1-3*01、VH1-8*01、VH1-18*01、VH2-5*10、VH3-7*01、VH3-9*01、VH3-11*01、VH3-13*01、VH3-21*03、VH3-23*04、VH4-4*02、VH6-1*01和VH7-4-1*01，当第一个VH基因区段以三个或更多个拷贝存在时，其中第二个VH基因区段以三个或更多个拷贝存在。
在一个实施方案中，所有或者基本所有的VH基因区段均以三个或更多个拷贝存在。
可以进行本文描述的各种基因区段偏向技术，使用常规DNA操纵技术构建本发明的转基因脊椎动物或细胞，所述技术(例如重组工程和重组DNA技术)为技术人员已知。例如，BAC可以使用这些技术构建，其中提供希望的人基因区段组合，这些BAC可以导入ES细胞中以将人基因区段掺入其基因组中(例如通过靶向插入Ig基因座中)。所述ES细胞可用于根据标准方法产生转基因脊椎动物，细胞(例如B细胞)可分离自其中所述基因组如本发明所述的这些动物。
在一个实施方案中，偏向的D基因区段选自变体的IMGT数据库或者1000Genomes数据库。
14.条款8-13任一项的脊椎动物或细胞，其中VH基因区段选自如下一组中：VH1-2*02、VH1-3*01、VH1-8*01、VH1-18*01、VH2-5*10、VH3-7*01、VH3-9*01、VH3-11*01、VH3-13*01、VH3-21*03、VH3-23*04、VH4-4*02、VH6-1*01和VH7-4-1*01。
在一个实施方案中，所述基因组包含人免疫球蛋白VH基因区段库集，其偏向于VH1-69。
在一个实施方案中，所述人免疫球蛋白VH基因区段库集基本上由一或多个人VH1-69基因区段组成。
所述基因区段提供在一或多个免疫球蛋白基因座中。例如，所述基因区段库集(D和/或VH)提供在这两个IgH基因座中(即在纯合状态)。
15.条款8-16任一项的脊椎动物或细胞，其包含具有选自上述组中的VH基因区段的两或更多个拷贝的免疫球蛋白重链基因座。
因此，至少一个所述拷贝与在人体中与人恒定区的种系距离相比更接近该基因座的恒定区。目的是通过偏向在同一基因座上提供多于一个拷贝。至少一个拷贝也更靠近(更近端于)恒定区及J-C内含子(其包含调节元件如Emu增强子区)，这可有利于所述基因区段的使用，因此有助于希望的偏向。
任选地，所述基因组对于所述重链基因座是纯合的。
任选地，基因区段的两或更多个拷贝是相同的(例如所有VH1-69*01，使用IMGT命名法)。在另一实施例中，拷贝是彼此的变体，例如天然发生的人变体。或者，合成的变体可以与或不与天然发生的变体一起使用。
在本发明的任何实施方案中，所述脊椎动物是首次用于实验的或者用靶抗原免疫的。
16.任何条款的脊椎动物或细胞，其中所述基因组包含由一或多个人JH6基因区段组成的人JH基因区段库集。
这偏向JH库集以产生长HCDR3，因为这是最长的天然发生的人JH基因区段类型，通常见于具有长HCDR3的天然发生的人抗体中。
例如，所述库集包含两个或更多个不同的JH6变体。在一个实例中，所述库集包含两个或更多个JH6*02变体(IMGT命名法)。
17.前述任何条款的脊椎动物和细胞，其中所述基因组包含人免疫球蛋白JH基因区段库集，其偏向于JH6，任选JH6*02。
18.条款17的脊椎动物或细胞，其中所述JH基因区段库集由或者基本上由三个或更多个人JH6基因区段组成。
19.前述任何条款的脊椎动物或细胞，其中每个所述人基因区段的序列均是人种系基因区段序列。
20.前述任何条款的脊椎动物或细胞，其中一个、多个或所有选择的基因区段在基因组中作为两个或更多个拷贝存在，所述拷贝是彼此的变体。
因此所述基因组的一个、多个或所有人V、D和JH基因区段以两或更多个变体形式存在，如天然发生的人变体，例如见于1000Genomes数据库和/或IMGT数据库中的变体。在另一实例中，一或多个变体可以是合成变体。
21.前述任何条款的脊椎动物或细胞，其中所述人基因区段是由纯合的免疫球蛋白重链基因座提供。
在一个实例中，无其它(非人)活性重链VH、D或JH基因区段存在于基因组的重链基因座中。此外，在一个实例中，无活性非人轻链VL或JL基因区段存在于基因组中。
这可用于保证内源性(非人)可变区表达被失活。因此，由所述脊椎动物或细胞产生的所有重链将具有人可变区，其可用于产生给予人体的药物。
22.非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎动物细胞(例如小鼠细胞或大鼠细胞)，其基因组包含人免疫球蛋白VH基因区段库集、一或多个人D基因区段及一或多个人JH基因区段，其中所述VH库集不包含选自如下一组的一个、多个或所有VH基因区段：VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH5-51、VH1-69、VH2-5、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH4-4、VH6-1和VH7-4-1。
23.非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎动物细胞(例如小鼠细胞或大鼠细胞)，其基因组包含人免疫球蛋白D基因区段库集、一或多个人VH基因区段及一或多个人JH基因区段，其中所述D库集不包含选自如下一组的一个、多个或所有D基因区段：D1-26、D2-2、D3-9、D3-10、D3-22、D4-17、D6-13和D6-19。
例如本领域已经观测到某些人基因使用可以控制对感染性疾病病原体抗原或者其它抗原的免疫应答。虽然这可产生许多特异性抗体，典型地这些抗体不是中和抗体，及因此免疫应答相对无效。这可以例如在抗原是由病原体表达的诱捕抗原的情况中发生。本发明的其中特异性基因区段被省略的实施方案可用于避免某些人基因区段如从基因组中省略那些基因区段的优势支配。以此方式，所述基因组人基因区段库集被偏向远离优势支配，这使得剩余的人基因区段序列空间的更好使用和取样，从而提供产生在天然状态未正常产生的抗体的机会。抗原特异性抗体可以选自具有这种基因组的脊椎动物和细胞。在一些实例中，这可产生中和抗体。
有利地是包括多个不同的人VH基因区段，组成人VH基因区段库集。这提供了重排的人可变区的良好多样性，从中选择先导抗体。例如可以包括其他的人VH基因区段的完整的功能性库集。为此，在一个实例中，所述人VH基因区段库集包含多个人VH基因区段，例如至少7、10、15、20、15、30、35、40或45个不同的人VH基因区段。这可以例如使用携带包含VH基因区段的未重排的人可变区DNA的序列的BAC通过同源重组实现和/或使用sRMCE将来自系列BAC的一些这种DNA序列插入位于非人脊椎动物ES细胞(例如小鼠或大鼠ES细胞)的基因组中恒定区上游的内源性重链基因座中，随后从这种细胞产生一或多个后代脊椎动物(及任选繁殖为重链基因座纯合性)。在一个实施方案中，插入人DNA，其包括位于上游和下游的第一人VH(例如VH1-69和/或VH1-2)及侧翼VH基因区段。在第二种ES细胞基因组操纵中，第一VH自基因组中缺失，例如使用本领域已知的标准同源重组技术进行。以此方式，在野生型人种系基因组中通常位于缺失的基因区段的上游和/或下游的一或多个VH基因区段被保留，以便其可以用于有助于随后的重排的人V区库集，用于选择先导抗体。在另一实例中，使用已经省略(例如通过在大肠杆菌中使用BAC的重组工程缺失这种序列，如本领域已知)第一VH的DNA序列进行人DNA的初始插入。可以使用相似技术(及合适的BAC)省略人D和/或J基因区段。
因此，在一个实施方案中，通常在野生型种系人基因组中省略的人VH基因区段(或者根据其它实施方案省略的D或J)的上游和/或下游的VH基因区段包含在本发明的脊椎动物或细胞中。例如，本发明中基因组的人VH基因区段库集不包含VH1-69，但是包含选自VH2-10、VH3-72、VH3-73和VH3-74的一个、两个、三个或四个人VH基因区段。这些是紧邻位于野生型人种系重链基因座中VH1-69的上游的基因区段(见IMGT)。例如，另外或或者，本发明基因组中人VH基因区段库集不包含VH1-69，但是包含选自VH3-66、VH3-64、VH4-61、VH4-59、VH1-58、VH3-53、VH3-49、VH3-48、VH1-46和VH1-45的一个、两个、三个、四个或更多个(或所有)人VH基因区段。这些是在野生型人种系重链基因座中VH1-69紧邻上游的基因区段(见IMGT)。此外或或者，本发明基因组中人VH基因区段库集不包含VH1-69，但是包含选自VH2-5、7-41、4-4、1-3、1-2和6-1的一个、两个、三个、四个或更多个(或者所有)人VH基因区段。此外或或者，本发明基因组中人VH基因区段库集不包含VH1-69，但是包含选自VH2-5、7-41、4-4、1-3、1-2、6-1、3-7、1-8、3-9、3-11和3-13的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个(或者所有)人VH基因区段。此外或或者，本发明基因组中人VH基因区段库集不包含VH1-69，但是包含选自VH2-5、7-41、4-4、1-2、6-1、3-7、1-8、3-9、3-11、3-13、3-15、1-18、3-20、3-21、3-23、1-24和2-26的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或更多个(或者所有)人VH基因区段。此外或或者，本发明基因组中人VH基因区段库集不包含VH1-69，但是包含VH6-1(其常用于人免疫应答，在野生型人种系重链基因座中VH6-1最接近恒定区)和/或VH3-23(其常用于人免疫应答)。在实施方案中(例如产生VH、重链或抗体以治疗和/或预防人体中感染性疾病如HIV感染)，H1-2在基因组或基因座中被省略。在这种情况中，在野生型种系人IgH基因座(例如见IMGT)中VH1-2的紧邻5’和3’端的一个、两个、三个或所有人VH基因区段包含在所述基因组中，如由位于人D和JH基因区段和恒定区上游的相同IgH基因座包含。
24.条款22或23的脊椎动物或细胞，其中所述基因组包含人JH基因区段库集，其不包含JH6。
JH偏向
25.非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎动物细胞(例如小鼠细胞或大鼠细胞)，其基因组包含人免疫球蛋白JH基因区段库集，其偏向于人JH6。
在一个实例中，所述库集偏向于人JH6*02(IMGT命名法)。
因此，本发明人基于如下选择人JH6*02：
(i)含有YYG和YYGXDX基序，其在几个脊椎动物物种中是保守的；
(ii)提供比其它人JH6变体少一个TAC密码子(使终止密码子危险的AID热点)及选择代替保持YYG和YYGXDX基序的密码子；
(iii)在HCDR3/FW4连接中避免GGCA AID热点；及
(iv)JH6*02变体在人中共同出现(及因此保守和可接受性)。
26.条款25的脊椎动物或细胞，其中所述基因组包含未重排的免疫球蛋白重链基因座，其包含多个人JH6基因区段；任选其中所述基因组对于所述基因座是纯合的。
在一个实例中，所述多个包括或者由多个JH6*02基因区段组成。
27.条款26的脊椎动物或细胞，其中所述重链基因座包含(5’至3’顺序)人VH、D和JH基因区段，所述JH6基因区段与D基因区段由不超过两个其它JH基因区段间隔开。
28.条款25、26或27的脊椎动物或细胞，其中在所述基因座中所述人JH6基因区段之间无其它JH基因区段。
29.非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎动物细胞(例如小鼠细胞或大鼠细胞)，其基因组包含人免疫球蛋白JH基因区段库集，其由一或多个人JH6基因区段组成。
在一个实例中，所有基因区段均是JH6*02基因区段。
30.条款25-29任一项的脊椎动物或细胞，其中所有所述基因区段均是人种系基因区段。
31.条款25-30任一项的脊椎动物或细胞，其包含不同的变体JH6基因区段。
在一个实例中，所述变体均是天然发生的(例如呈现在IMGT或1000Genome数据库中)。在另一实例中，一或多个变体是合成的。
32.条款25-31任一项的脊椎动物或细胞，其中所述基因区段是由纯合的免疫球蛋白重链基因座提供。
在一个实施方案中，偏向的JH基因区段选自变体的IMGT数据库或者1000Genomes数据库。
33.单克隆或多克隆抗体组合物或者产生这种组合物的抗体生产细胞群，其中所述组合物或细胞群是通过用抗原免疫任何前述条款的至少一种脊椎动物而制备的，其中所述抗体具有人重链可变区，当与相应人种系V、D和J序列相比时其包含非人脊椎动物AID-模式体细胞超变(例如小鼠或大鼠AID-模式突变)和/或当与相应人种系V、D和J序列相比时其包含非人(例如小鼠或大鼠)末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)-模式连接突变；其中所述组合物包含至少一种抗原特异性抗体，其具有长度为至少20个氨基酸的HCDR3(根据IMGT)。
正如本领域技术人员所显而易见，AID和TdT突变可以使用生物信息学分析确定，以发现相应于指定可变结构域序列的最接近匹配的人种系基因区段，排列序列并确定差异。AID具有已知的突变热点(例如见Annu.Rev.Biochem.2007.76:1-22；Javier M.Di Noiaand Michael S.Neuberger,"Molecular Mechanisms of Antibody SomaticHypermutation"(特别是图1及在小鼠中相关于AID热点的相关论述)；及Curr OpinImmunol.1995Apr；7(2):248-54,"Somatic hypermutation",Neuberger MS and MilsteinC(特别是在小鼠中关于热点的论述)，所述文献在此并入本文作参考)。通过进行标准生物信息学分析，可以确定TdT突变(例如提供连接突变和多样性)，这些为技术人员所熟知。
相应的人种系V、D和J序列可根据例如IMGT数据库或1000Genomes数据库。
例如，HCDR3长度为至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或者30个氨基酸。
例如，HCDR3长度为20-23或者24-30个氨基酸，例如28-30个氨基酸。
例如，所述细胞是B细胞(例如永生化B细胞)或者杂交瘤。
任选地，本发明任何方面的抗体均包含人轻链可变区。例如，当与相应人种系V、D和J序列相比时人轻链可变区具有非人脊椎动物AID模式体细胞超变(例如小鼠或大鼠AID-模式突变)和/或当与相应人种系V、D和J序列相比时其包含非人(例如小鼠或大鼠)末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)-模式连接突变。
34.特异性结合抗原的分离的抗体，所述抗体包含人重链可变区和非人恒定区，其中可变区衍生自(i)选自条款8中列举的组中的人VH基因区段与(ii)选自条款1中列举的组中的人D基因区段及与人JH基因区段(任选JH6)在非人脊椎动物中的重组；其中所述抗体具有长度为至少20个氨基酸的HCDR3(根据IMGT)；当与相应人种系V、D和J序列相比时其包含非人脊椎动物AID-模式体细胞超变(例如小鼠或大鼠AID-模式突变)和/或当与相应人种系V、D和J序列相比时其包含非人(例如小鼠或大鼠)末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)-模式连接突变。
例如，所述VH选自如下一组中：VH1-2*02、VH1-3*01、VH1-8*01、VH1-18*01、VH2-5*10、VH3-7*01、VH3-9*01、VH3-11*01、VH3-13*01、VH3-21*03、VH3-23*04、VH4-4*02、VH6-1*01和VH7-4-1*01，和/或
D选自如下一组中：
D2-2*02、D3-9*01、D3-10*01和D3-22*01，或者
D2-2*02、D3-9*01和D3-10*01，或者
D3-9*01和D3-10*01，或者
D1-26、D2-2、D3-9、D3-10、D3-22、D4-17、D6-13和D6-19，或者
D1-26*01、D2-2*02、D3-9*01、D3-10*01、D3-22*01、D4-17*01、D6-13*01和D6-19*01，或者
D2-2、D3-9、D3-10、D3-22、D4-17、D6-13和D6-19，或者D2-2*02、D3-9*01、D3-10*01、D3-22*01、D4-17*01、D6-13*01和D6-19*01，或者
D1-26、D2-2、D3-10和D6-19，或者
D2-2、D3-9和D3-10。
35.条款34的抗体，其中所述抗体从根据条款1-32任一项的脊椎动物中可获得或者获得。
在一个实施方案中，所述抗体得自所述脊椎动物，或者是这种抗体的拷贝。
36.分离结合预定抗原的抗体的方法，所述方法包括：
(a)提供条款1-32任一项的脊椎动物(任选小鼠或大鼠)；
(b)用所述抗原免疫所述脊椎动物；
(c)从所述脊椎动物取B淋巴细胞，选择表达结合所述抗原的抗体的一或多个B淋巴细胞；
(d)任选使所述选择的B淋巴细胞或者其后代永生化，任选通过从中产生杂交瘤而永生化；及
(e)分离由所述B淋巴细胞表达的抗体(例如，以及IgG型抗体)。
37.条款36的方法，其中在步骤(e)中，所述抗体具有长度为至少20个氨基酸的HCDR3(根据IMGT)。
所述长度可以是20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸(根据IMGT)，例如20-23个氨基酸(在实施例中产生)。
38.条款36或37的方法，包括从所述B淋巴细胞分离编码结合所述抗原的所述抗体的核酸的步骤；任选地用编码人或人源化重链恒定区的核苷酸序列交换所述抗体的重链恒定区核苷酸序列及任选亲和性成熟所述抗体的可变区；以及任选将所述核酸插入表达载体及任选宿主中。
39.条款36、37或38的方法，进一步包括准备通过所述方法产生的抗体的拷贝、突变体或衍生物(例如人源化形式)。
人源化可以制备恒定区是人的。
40.条款33-39任一项的抗体组合物、细胞群、抗体或方法，其中所述抗原是感染性疾病病原体的抗原，任选其中所述病原体是病毒或细菌。
41.条款40的抗体组合物、细胞群、抗体或方法，其中所述病原体选自流感嗜血杆菌、大肠杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、疱疹病毒科病毒、巨细胞病毒(CMV)、HIV和流感病毒。
42.条款33-41任一项的抗体组合物、细胞群、抗体或方法，其中所述抗原是HIVgp120抗原或者HIV gp41抗原。
43.条款33-40任一项的抗体组合物、细胞群、抗体或方法，其中所述抗原包含活性位点或裂缝，其中所述抗体具有特异性结合所述抗原的活性位点或裂缝的长度为至少20个氨基酸的HCDR3。
44.包含条款33-35及40-43任一项的抗体或抗体组合物或者由条款36-38任一项的方法产生的抗体的药物组合物，用以治疗和/或预防人感染性疾病(例如其中所述感染性疾病是由选自如下一组中的病原体所致：流感嗜血杆菌，大肠杆菌，脑膜炎奈瑟氏菌，疱疹病毒科病毒，巨细胞病毒(CMV)，HIV和流感病毒)。
45.抗体重链的库集(例如由抗体提供)，其包含一或多个重链，其可变结构域HCDR3的长度为至少20个氨基酸(根据IMGT)及衍生自人VH、D和JH的重组，其中
VH选自如下一组中：
VH1-2*02、VH1-3*01、VH1-8*01、VH1-18*01、VH2-5*10、VH3-7*01、VH3-9*01、VH3-11*01、VH3-13*01、VH3-21*03、VH3-23*04、VH4-4*02、VH6-1*01和VH7-4-1*01，及
D选自如下一组中：
D2-2*02、D3-9*01、D3-10*01和D3-22*01，或者
D2-2*02、D3-9*01和D3-10*01，或者
D3-9*01和D3-10*01，或者
D1-26、D2-2、D3-9、D3-10、D3-22、D4-17、D6-13和D6-19，或者
D1-26*01、D2-2*02、D3-9*01、D3-10*01、D3-22*01、D4-17*01、D6-13*01和D6-19*01，或者
D2-2、D3-9、D3-10、D3-22、D4-17、D6-13和D6-19，或者D2-2*02、D3-9*01、D3-10*01、D3-22*01、D4-17*01、D6-13*01和D6-19*01，或者
D1-26、D2-2、D3-10和D6-19，或者
D2-2、D3-9和D3-10；
任选地JH是JH6(例如JH6*02)；
其中
(a)重链可变结构域已经在非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)中在体内产生；和/或
(b)重链可变结构域当与相应人种系V、D和J序列相比时包含非人脊椎动物AID-模式体细胞超变和/或当与相应人种系V、D和J序列相比时包含非人(例如小鼠或大鼠)末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)-模式连接突变。
在一个实例中，重链(或者所有重链库集)包含非人脊椎动物恒定区(例如小鼠或大鼠恒定区)。例如，所述恒定区是γ-类型恒定区(例如γ-1、γ-2或者γ-4型)。
在一个实例中，所述库集是首次用于实验的库集。这在本文实施例章节中示出。
在一个实例中，所述库集是免疫的库集。这在本文的实施例章节中示出。
在一个实例中，所述库集是抗原特异性库集(例如由多个杂交瘤提供)。这在本文的实施例章节中示出。
所述库集可以由B细胞提供(例如永生化的B细胞)。
所述库集可以由杂交瘤提供。
在一个实例中，载体由宿主细胞携带(例如CHO或HEK293细胞或酵母细胞)。
HCDR3的长度可以是20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸(根据IMGT)，例如20-23个氨基酸(在实施例中产生)。
在一个实例中，在(a)中的脊椎动物是如本发明所述的脊椎动物。
46.编码条款45的重链库集的核酸集合。
在一个实例中，所述核酸在各自的载体中提供(例如表达载体，如大肠杆菌或CHO或HEK293载体)。
47.获得抗原特异性重链(例如由抗体提供)的方法，所述方法包括将条款45的库集暴露于预定抗原，选择特异性结合所述抗原的一或多个重链，其中分离一或多个重链，其具有长度为至少20个氨基酸的HCDR3。
任选地，当重链具有非人恒定区时，其被交换为人恒定区，这是本领域常规技术。因此，本发明提供了如此产生的人抗体重链(例如组合人轻链以产生人抗体，其可用于人的治疗H和/或预防应用，例如治疗和/或预防人患者中感染性疾病)。
在本发明任何方面的脊椎动物或细胞的实例中，所述基因组包含免疫球蛋白轻链基因座，其包含位于恒定区(例如人或小鼠λ或κ恒定区)上游的一或多个人V基因区段和一或多个人J基因区段。
对于重链的重排和表达，所述基因座包含控制元件，如技术人员已知的在J基因区段与恒定区之间的Eμ与Sμ。在一个实例中，小鼠Eμ和Sμ包含在JH库集与恒定区之间的重链基因座中(即5’至3’顺序，所述基因座包含JH基因区段、Eμ和Sμ及恒定区)。在一个实例中，Eμ和Sμ是小鼠129-衍生的基因组的Eμ和Sμ(例如129Sv-衍生的基因组，如129Sv/EV(如129S7Sv/Ev(如来自可得自Baylor College of Medicine,Texas,USA的AB2.1或AB2.2细胞)或者129S6Sv/Ev)))；在另一实例中，Eμ和Sμ是小鼠C57BL/6衍生的基因组的Eμ和Sμ。在这方面，所述基因座可以在选自AB2.1、AB2.2、VGF1、CJ7和FH14的细胞基因组的IgH基因座中构建。VGF1细胞在Auerbach W,Dunmore JH,Fairchild-Huntress V,et al；Establishment and chimera analysis of129/SvEv-and C57BL/6-derived mouseembryonic stem cell lines.Biotechniques2000；29:1024-8,30,32中确立和描述，所述文献在此并入本文作参考。
此外或或者，所述恒定区(或者至少Cμ；或者Cμ及其γ恒定区)是在上述段落中描述的基因组的恒定区(或者Cμ；或者Cμ及其γ恒定区)。
人DNA序列或基因区段的合适来源为技术人员熟知。例如，可以从准许的人供体中收集DNA样品(例如在本文实施例中的脸颊擦拭样品)，从中可以获得合适的DNA序列用于构建本发明的基因座。人DNA的其它来源可商购，如本领域技术人员已知。或者，技术人员通过参考本文所述人Ig基因区段序列的一或多个数据库能构建基因区段序列。
在一个实例中，所述基因组包含如下全部或一些人VH基因区段：
IGHV6-1
IGHV3-7
IGHV1-8
IGHV3-9
IGHV3-11
IGHV3-13
IGHV1-18
IGHV3-30
IGHV4-31
IGHV4-39
IGHV4-59
任选还有(i)和/或(ii)
(i)
IGHV1-2
IGHV2-5及
IGHV3-21
(ii)
IGHV1-2
IGHV2-5
IGHV3-21
IGHV1-24
例如，所述基因组包含如下全部或一些人VH基因区段变体：
IGHV6-1*01
IGHV3-7*01
IGHV1-8*01
IGHV3-9*01
IGHV3-11*01
IGHV3-13*01
IGHV1-18*01
IGHV3-30*18
IGHV4-31*03
IGHV4-39*01及
IGHV4-59*01；
任选还有(iii)或(iv)
(ii)
IGHV1-2*04
IGHV2-5*10及
IGHV3-21*03
(iv)
IGHV1-2*02
IGHV2-5*01
IGHV3-21*01及
IGHV1-24*01
例如，所述基因组包含如下全部或一些人JH基因区段变体：
IGHJ2*01
IGHJ3*02
IGHJ4*02
IGHJ5*02及
IGHJ6*02
例如，所述基因组包含如下全部或一些人D基因区段：
IGHD1-1
IGHD2-2
IGHD3-9
IGHD3-10
IGHD5-12
IGHD6-13
IGHD1-14
IGHD2-15
IGHD3-16
IGHD4-17
IGHD6-19
IGHD2-21
IGHD5-24
IGHD1-26及
IGHD7-27
及任选还有(v)或(vi)
(v)
IGHD3-3
(vi)
IGHD3-3
IGHD4-4
IGHD5-5
IGHD6-6
IGHD1-7
IGHD2-8及
IGHD2-8
应理解本文描述的特定实施方案只是举例说明本发明而无限制本发明之意。本发明的主要特征在不偏离本发明范围的条件下可用于各个实施方案中。技术人员使用不超过常规的研究能够意识到或者能确定本文描述的特定程序的各种等价物。这种等价物被认为在本发明范围内并由权利要求书涵盖。本说明书中提及的所有出版物和专利申请均表示本发明所属领域技术人员的技术水平。所有出版物和专利申请在此均并入本文作参考，就像每个出版物或专利申请特殊及逐个指出并入参考。当与权利要求书和/或说明书中的术语“包含”结合使用时，“一个”可以意味着“一个”，但是也符合“一或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的意思。权利要求书中术语“或者”的使用是指“和/或”，除非明确表明是指仅择一或者选择是互相排斥的，尽管说明书支持仅择一和“和/或”的定义。在本申请中，术语“大约”是指数值包括装置、确定数值所采用的方法的固有误差变化，或者在研究对象中存在的变化。
如本说明书和权利要求书所用，术语“包含”、“具有”、“包括”或者“含有”是包括性的或开放式的，不排除额外的未叙述的元件或方法步骤。
本文所用术语“或其组合”是指该术语前列出的项目的所有排列和组合。例如，“A,B,C或其组合意在包括至少如下之一：A,B,C,AB,AC,BC,或ABC，如果在特定上下文中顺序是重要的，也包括BA,CA,CB,CBA,BCA,ACB,BAC或CAB。继续使用这个例子，明确包括的是含有一或多个项目或术语的重复的组合，如BB,AAA,MB,BBC,AAABCCCC,CBBAAA,CABABB等。技术人员理解，除非根据上下文很明显，典型地对任何组合中的项目或条款数目无限制。
除非根据上下文很明显，本发明的任何部分均可以组合任何其它部分一起阅读。
根据本文教导，本文揭示的和权利要求请求保护的所有组合物和/或方法均可以不用过度实验而产生和执行。虽然本发明的组合物和方法已经在优选的实施方案中描述，但是本领域技术人员显然了解在不偏离本发明的观点、精神和范围的条件下可以对所述组合物和/或方法及所述方法中的步骤或步骤顺序进行变化。技术人员显而易见的所有这种相似的替代和修改均被认为在所附权利要求书限定的本发明的精神、范围和观点内。
本发明在如下非限制性实施例中更详尽描述(实施例1-3是假想实施例)。实施例4是实际进行的实施例。
实施例
实施例1
“重组工程的BAC载体用于将多态性V区加入小鼠基因组中”
图1-3描述了重组工程方法(参见上文)，其可用于将多态性V基因区导入基因组DNA中。在一个实施方案中，通过标准技术将来自人重链区的基因组片段插入细菌人工染色体(BAC)载体中。优选地，这种BAC的大小范围可以是20-kb至200-kb或更多，通过标准技术包括商购文库的序列搜索可以分离自BAC文库，或者通过与含有BAC的细菌菌落杂交以鉴别具有感兴趣BAC的那些。
选择具有一些VH基因区段的BAC；在图1中，这些一般被鉴别为例如VH[a]至VH[z]。本领域技术人员易于鉴别合适的基因组片段，例如来自人VH5-78至VH1-68的大约120-kb片段，其包括5个内源性活性VH基因区段和7个VH假基因。使用重组工程技术，内源性VH基因区段可以由多态性VH或VL基因区段置换。在这个实施例中，需要两个步骤。第一个步骤用阳性-阴性选择操纵子置换内源性VH基因区段的V-区编码外显子，在这个实施例中，所述操纵子是编码氨苄青霉素抗性基因(Amp)和链霉素敏化核糖体蛋白(rpsL)的操纵子。在不存在rpsL基因情况下通过对链霉素抗性选择某些细菌菌株。将与在内源性VH基因外显子侧翼的序列同源的短DNA序列置于rpsL-Amp操纵子的5’和3’端。在存在合适的重组因子的条件下，根据标准的重组工程技术(见上述)，在操纵子片段与BAC之间的重组将导致内源性VH基因外显子由通过氨苄青霉素抗性选择的操纵子置换(图1a)。第二个步骤使用相同的同源序列以用希望的多态性VH基因区段置换插入的操纵子。在这个实施例中，插入人VH1-69基因(图1b和1c)。特别地，使用VH1-69的*02等位基因[参见IMGT和图5]。在细菌中选择成功整合的多态性VH基因区段，其由于缺失操纵子、特别是rpsL部分而变得对链霉素抗性。
在这个实施例中，所描述的两步骤方法对于每个内源性VH基因区段或者对于多个希望用多态性V基因区段置换的内源基因区段可以重复进行(图1d)。
显然，以此方式可以插入任何多态性V基因区段，任何内源性V基因区段包括假基因均可作为靶。使用这种技术可以用作为BAC插入体的合适的基因组片段置换每个重链和两个轻链基因座中的V基因区段。
图2描述了产生编码多态性V基因区段的基因组片段的另一方法。在这个实施例中，将多态性V基因区段插入没有其它基因、控制元件或其它功能的基因组DNA区域中。可以基于序列分析以及克隆进BAC的或者在现有BAC文库中鉴别的相应DNA片段选择这种“沙漠(desert)”区域。使用这种基因组片段开始，重组工程技术可用于将多态性V基因区段以间隔例如10-kb插入。在这个实施例中，150-kb基因组片段可容纳插入多达15个多态性V基因区段。所述区段的插入是两步方法。第一个重组工程步骤是在特定位点插入rpsL-Amp操纵子。使用与特定位点同源的序列位于所述操纵子的侧翼。这些是通过重组工程系统将所述元件特定插入BAC基因组片段中，通过氨苄青霉素抗性选择阳性事件(图2a)。第二个步骤使用相同序列同源性通过相似的重组工程步骤用多态性V基因区段置换所述基因组片段中的操纵子(图2b)。在这个实施例中，多态性VH基因区段的外显子和启动子元件均被插入，导致rpsL-Amp操纵子的置换及因此对链霉素的抗性(图2c)。
将多态性V基因区段插入基因组片段中特定位点的两步骤技术可以重复多次，使得BAC基因组片段具有一些多态性基因区段，包括其启动子元件。显然，图1和2中示出的实施例可以组合，其中可使用插入技术以将额外的多态性V基因区段加入如图1所示BAC基因组片段中。可以选择将这些额外的区段加入IG基因组片段中，因为一旦插入非人哺乳动物基因组中，这种片段更适合正确的IG基因表达。已知基因组片段可具有如增强子等元件或者有助于某些染色质构象的元件，这二者在野生型基因表达中均是重要的。
图3描述了产生具有多态性V基因区段的基因组片段的另一方法。这个方法依赖于使用重组工程使短(大约50-150个碱基，优选100个碱基)单链DNA片段与同源序列重组的效率(Nat Rev Genet.2001Oct；2(10):769-79；Recombineering:a powerful new tool formouse functional genomics；Copeland NG,Jenkins NA,Court DL)。重组工程中使用的重组酶优先结合并使用这种短单链DNA片段作为底物以起始同源重组。所述效率可以是高如10-2，即在得自重组工程的大约100个随机挑选(未选择)的克隆中可发现一个阳性事件。这个实施例中的阳性事件发生在导入单链片段中的一或多个单核苷酸改变被转移至含有V基因区段及围绕基因组DNA的BAC插入体中时，所述一或多个核苷酸改变发生在BAC上的同源序列中。
多态性V基因区段与内源性VH基因区段的不同可以是例如仅1或2个、或者至多10或15个核苷酸改变。这种核苷酸多态性的实例在图5中示出。涵盖多态性核苷酸改变的短单链区可以使用标准技术化学合成。所得单链DNA片段被导入细菌中，通过重组工程技术，大约100个BAC片段中有1个将具有通过单链片段的同源掺入而掺入了多态性核苷酸(图3a)。具有希望的核苷酸改变的BAC可以通过标准的聚合酶链反应(PCR)扩增和测序筛选例如几百个个体克隆而鉴别。在所述实施例中，两个核苷酸改变将使VH1-69*01基因区段转变为VH1-69*02基因区段(图3b)。
显然这种方法对于单个BAC基因组片段上包含的多个内源性V基因区段可以重复进行。此外，通过插入现有V基因区段之间的区域，图2中描述的技术可用于加入额外的多态性V基因区段。正如本领域技术人员所显而易见，这些技术的组合可用于产生多态性和内源性人V基因区段二者的多种变化。显然，可以组合具有工程化的多态性V基因区段和内源性人V基因区段的一些不同的基因组片段以产生更多变化。
实施例2
“使用修饰的BAC的SRMCE将多态性V-区加入基因组”
使用实施例1描述的方法产生的具有多态性V基因区段的修饰的BAC可用于改变非人哺乳动物的基因组。这些改变可获得一个包括人V基因区段的完整的IG基因座，其中正常的免疫球蛋白区重组导致VDJ或VJ组合。产生这种动物的一个实例是使用如图4所示策略通改变例如小鼠胚胎干(ES)细胞的基因组而进行。
将具有多态性V基因区段的修饰的BAC整合进基因组中的一项技术是顺序重组酶介导的盒交换(sequential recombinase mediated cassette exchange，SRMCE)。这项技术在WO2011004192(Genome Research Limited)中描述，所述文献在此以其全部内容并入本文作参考。
SRMCE提供了具有插入在特定位置的“着陆垫(landing pad)”的修饰的基因座。这种插入可以通过同源重组从头开始或者作为先前BAC插入的结果。在这个实施例中，所述着陆垫插入在最3’端的J基因区段与Cμ基因区段之间的小鼠IGH基因座中，通过SRMCE技术的先前BAC插入导致加入5个人V基因区段和2个V区假基因。所述着陆垫具有如图4所示元件，使得可以选择第二个靶向BAC片段的正确插入。这种插入的特异性通过在容许lox位点之间的cre重组酶介导的交换提供。lox位点仅与相容lox位点重组。在这个实施例中，loxP位点仅与loxP重组，lox2272仅与lox2272重组。这提供了插入BAC片段的方向性，如图4b和4c所示。
具有正确插入的ES细胞克隆通过嘌呤霉素抗性选自不具有插入或者具有非生产性插入的一个克隆集合。对嘌呤霉素的抗性得自活性启动子元件、PGK与puroTK编码区的并置。正确的插入通过标准技术证实，包括连接点的PCR、中间元件的PCR、Southern印迹、比较基因组杂交(CGH)、测序等。在所述实施例中，正确的lox2272-lox2272和loxP-loxP重组也导致两个完整系列piggyBac元件，其在插入之前不存在。完整的piggyBac元件由一系列反向重复组成，其在图中以PB5和PB3标示。适当方向的piggyBac元件系列是piggyBac转座酶的底物，其可以催化元件之间的重组，导致间插序列以及这两个元件的缺失。在piggyBac转座之后剩余的DNA是完整的并且没有piggyBac元件的任何剩余。在所述实施例中，具有成功piggyBac转座的ES细胞克隆通过活性puroTK元件的丧失而选择，所述元件导致细胞对药物FIAU的抗性(图4c和4d)。
这个实施例中SRMCE方法的终产物是具有一些多态性V基因区段的IGH基因座，其沿着在5’侧小鼠基因组序列与3’侧小鼠IGH恒定区基因区段之间一系列内源性未修饰的VH基因区段插入。所述多态性V基因区段被定位，由此其可参与与B细胞成熟产生VDJ基因区段相关的重组事件。然后这些基因区段可以被转录及剪接至小鼠恒定区。这些转录物的翻译将产生由多态性V基因区段、人DH基因区段、人JH基因区段及小鼠恒定区重链基因区段编码的抗体重链。
如本领域技术人员所熟知，ES细胞克隆可用于产生遗传修饰的小鼠品系，通过将所述细胞注射进小鼠胚泡胚胎中，将注射的胚胎转移至合适的接受体并繁殖产生的嵌合后代进行。修饰的基因座可以通过繁殖而增殖，根据遗传杂交而产生杂合或纯合基因座。
从这个实施例提供的IGH基因座的结构及通过B细胞受体(BCR)和抗体基因重排中包含的机制中可以看出，将获得多态性V基因区段与各种DH和JH基因区段的大量不同组合，这些可有助于在遗传修饰的动物的B细胞群中功能性抗体基因的大量库集。在这个实施例中，掺入一些不同的人VH1-69多态性以提供超人VH多样性。已知这个特殊的VH基因区段在结合感染性疾病病原体(例如流感病毒)的抗体中是普遍的，因此这个实施例的具有遗传修饰的小鼠的抗体库集预期产生具有有利于结合感染性疾病病原体的那些抗体的偏向的抗体。换句话说，所述库集具有更大的抗体子集，其具有对于病原体抗原的优异亲和性。举例的这种病原体包括流感病毒、丙型肝炎病毒(HCV)及人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)(也见上表所示)。
实施例3
“13个VH1-69等位基因的比对”
通过掺入额外的V基因区段多态性建造更多样的抗体库集需要V基因区段的多态性等位基因的可用性。这种等位基因的一个来源包括序列数据库。在这个实施例中，提供了VH1-69基因区段的13个明确的等位基因。这些等位基因序列和对比得自“ImmunoGeneTics”IMGT Information System(www.imgt.com)数据库。图5是等位基因*02至*13与*01等位基因的比对图示。VH1-69*01核苷酸和氨基酸序列在该图上方提供。在其余的等位基因与*01等位基因序列是相同的情况中，在序列的下面加插破折号。核苷酸差异沿着适当的等位基因标示，如果序列改变导致蛋白质编码改变，氨基酸改变在三联体上方标示。
图5示出与*01等位基因对比中每个等位基因的1-4个氨基酸改变。所有氨基酸改变均发生在编码互补决定区(CDR)的重链蛋白部分。这些区域负责抗原特异性及抗体与抗原的亲和性。显然在抗体的库集中提供额外的多态性CDR将提高存在对不同抗原具有优异结合特性的抗体的可能性。在一些报道中，已经观测到重链的VH1-69-编码的可变区通常见于结合流感病毒、HCV和HIV-1抗原的抗体中(见上表)。因此，使用实施例1和2的方法将这个实施例的多态性V基因区段掺入转基因动物模型中可能导致在所述转基因动物中抗体库集中具有更多的结合与这些及其它病原体相关抗原的抗体。如本领域所已知，更大的库集增加发现与希望的抗原以高亲和性和特异性结合的单克隆抗体的可能性，使用例如杂交瘤技术进行。
因此本发明在这些实施例中描述了一种转基因小鼠模型，其可以用病原体或其它抗原免疫。来自这种免疫的小鼠的血浆B细胞可用于产生杂交瘤文库，对其进行筛选以产生结合病原体抗原的抗体。鉴于在所述转基因小鼠的IGH基因座中加入多态性VH1-69基因区段，这个文库在发现这种抗体方面优于来自传统转基因小鼠的文库。
这些实施例不限制可以选择的人多态性V基因区段或者用于将其导入动物模型中的方法。所述方法可用于构建具有免疫球蛋白D和/或J区段的转基因基因座。所述V、D、J区段可来自多个人类来源(任选一个以上的人类种族群体)。
实施例4：
“基于人JH6*02的转基因小鼠，B细胞，杂交瘤，抗体及重链”
本发明人对功能性人基因区段库集(从VH2-26至JH6，见关于人IgH基因座结构的IMGT数据库；http://www.imgt.org/IMGTrepertoire/index.php？section＝LocusGenes& repertoire＝locus&species＝human&group＝IGK)进行了分区(sectored)，产生了两个不同的转基因重链等位基因(以S2F和S3F表示)及相应小鼠。转基因等位基因在小鼠中表达，在RNA转录水平评估重链库集。使用生物信息学方法进行深度序列分析以评估V、D和JH基因使用，包括在具有长度为至少20个氨基酸的HCDR3的可变结构域序列中进行分析。内源性小鼠可变区基因区段通过倒位而失活(如WO2011004192中所述方法，这个文献在此并入本文作参考)。
人供体DNA样品的测序：鉴别保守的JH6*02变体
通过颊拭子获得来自9个无记名同意的人供体的DNA样品。
根据QIAamp DNA Mini Kit(Cat.No.51304,Qiagen)方案对样品进行处理及提取DNA样品。
设定PCR反应以扩增JH6区并对PCR产物测序(PCR寡聚物序列：正向5'-AGGCCAGCAGAGGGTTCCATG-3'(SEQ ID NO:444)，反向5'-GGCTCCCAGATCCTCAAGGCAC-3'(SEQID NO:445))。
通过与来自IMGT注释数据库(http://www.imgt.org/)的JH6参考序列对比进行序列分析，这样鉴别了所有9个供体基因组均含有人JH6*02变体，这个变体在9个供体中的7个供体中是纯合状态。本发明人还查阅了可从Ensembl人基因组数据库的Jim Watson andCraig Venter[http://www.ensembl.org/]中公开获得的基因组序列。这些也含有人JH6*02变体。本发明人确认人JH6*02在人体中是一个共有保守变体，因此是根据本发明构建转基因IgH基因座的良好候选物。
鉴别合适的人DNA序列BAC
从Ensemble(http://www.ensembl.org/index.html)或UCSC(http:// genome.ucsc.edu/)人数据库中基于搜索基因名称(IGH)或位置(染色体14:106026574-107346185)鉴别一系列人细菌人工染色体(BAC)克隆。选择7个人RP11BAC克隆，RP11-1065N8BAC携带人JH6*02。总之，鉴别如下BAC作为人IgH基因座DNA的来源：RP11-1065N8、RP11-659B19、RP11-141I7、RP-112H5、RP11-101G24、RP11-12F16和RP11-47P23。
使用相似方法，选择不同的BAC克隆(例如不同的RP11克隆ID或者RP11的不同来源)或者遗传工程化的BAC以插入小鼠IGH基因座中，提供转基因小鼠中不同系列的人库集。
构建转基因IgH基因座
将来自第一个IGH BAC(RP11-1065N8)的人重链基因区段插入小鼠AB2.1ES细胞(Baylor College of Medicine)的IGH基因座中以产生标示为S1等位基因的重链等位基因。插入的人序列相应于人染色体14的从位置106494908至位置106328951的序列，包含功能性重链基因区段VH2-5、VH7-4-1、VH4-4、VH1-3、VH1-2、VH6-1、D1-1、D2-2、D3-9、D3-10、D4-11、D5-12、D6-13、D1-14、D2-15、D3-16、D4-17、D5-18、D6-19、D1-20、D2-21、D3-22、D4-23、D5-24、D6-25、D1-26、D7-27、JH1、JH2、JH3、JH4、JH5及JH6(5’至3’顺序)，其中选择JH6作为人JH6*02变体。所述插入在小鼠染色体12的位置114666435与114666436之间产生，其在小鼠Cμ区的上游。小鼠VH、D和JH基因区段保留在基因座中，紧邻插入的人重链DNA(5’端)的上游。
通过顺序插入来自第二个BAC(BAC2)的人DNA，构建第二个等位基因S2，其中更多的人功能性VH基因区段插入在S1等位基因中插入的最5’VH的上游(5’)。来自BAC2的插入的人序列相应于人染色体14从位置106601551至106494909的序列，包含功能性重链基因区段VH3-13、VH3-11、VH3-9、VH1-8、VH3-7。小鼠VH、D和JH基因区段保留在基因座中，紧邻插入的人重链DNA(5’)的上游。在随后的步骤中，将这些基因区段倒转以失活，从而产生其中仅人重链可变区基因区段是活性的S2F小鼠。
通过顺序插入来自第三个BAC(BAC3)的人DNA，构建第三个等位基因S3，其中更多的人功能性VH基因区段插入在S2等位基因中插入的最5’VH的上游(5’)。插入的序列相应于人染色体14的位置106759988至106609301的序列，包含功能性重链基因区段VH2-26、VH1-24、VH3-23、VH3-21、VH3-20、VH1-18和VH3-15。小鼠VH、D和JH基因区段保留在基因座中，紧邻插入的人重链DNA(5’)的上游。在随后的步骤中，将这些基因区段倒转以失活，从而产生其中仅人重链可变区基因区段是活性的S3F小鼠。
使用标准程序，从ES细胞中产生携带插入内源性重链基因座中的S2F或S3F的小鼠。小鼠中其它内源性重链基因座通过将包含neoR的失活序列插入小鼠JH-Cμ内含子中而失活(产生HA等位基因)。
特别地，包括如下等位基因：
VH1-2*02，VH1-3*01，VH1-8*01，VH1-18*01，VH2-5*10，VH3-7*01，VH3-9*01，VH3-11*01，VH3-13*01，VH3-21*03，VH3-23*04，VH4-4*02，VH6-1*01和VH7-4-1*01
D1-26*01，D2-2*02，D3-9*01，D3-10*01，D3-22*01，D4-17*01，D6-13*01和D6-19*01。
免疫程序
将S2F或S3F基因型的转基因小鼠通过ip途径在完全弗氏佐剂(Sigma F5881)中用商购的或者自产的抗原1(OVA(Sigma A7641)、抗原2(人感染性疾病病原体抗原)和抗原3(人抗原)的20-40μg重组蛋白和10μg/动物CpG(CpG oligo；Invivogen,San Diego,California,USA)初始免疫，然后以大约两周间隔用在不完全弗氏佐剂(Sigma F5506)中的大约半量抗原和10μg/动物CpG进行加强两次。最后的加强在2周后iv给予，不用任何佐剂，包含在PBS中的5-10μg蛋白。
杂交瘤融合程序
在最终加强之后3天取出脾，将脾细胞用CpG(25μm终浓度)处理并保持直至第二天。然后将细胞与SP0/2Ag14骨髓瘤细胞(HPA Cultures Cat No85072401)融合，使用BTXECM2001电融合仪器进行。将融合的细胞放置恢复20分钟，然后种植在T75培养瓶中直至第二天清晨。然后将细胞旋转并通过系列稀释铺板于96孔培养平板上，放置大约10天，之后进行筛选。在此期间更换培养基1-3次。
筛选
使用Europium cryptate标记的抗小鼠IgG(Cisbio anti-mouse Ig EuropiumCryptate)和生物素标记的靶抗原及商购的链霉抗生物素缀合的供体(Cisbio；链霉抗生物素缀合的D2)或者通过IgG-特异性384孔ELISA，使用均相时间分辨荧光测定(htrf)筛选上述杂交瘤孔的培养上清。通过htrf鉴别的阳性孔放大到24孔平板中或者使用IgG-特异性检测ELISA方法立即反筛选。通过初次ELISA筛选鉴别的阳性细胞立即扩增至24孔平板。一旦培养物扩增至24孔阶段并达到铺满，将上清重新用htrf或IgG-特异性ELISA检测以证实与靶抗原结合。然后也通过表面等离子共振分析这种证实的培养物上清，使用BioRadProteOn XPR36仪器。为此，将在杂交瘤培养物中表达的抗体捕获在生物传感器GLM芯片(BioRad176-512)上，其具有与所述生物传感器芯片表面共价偶联的抗小鼠IgG(GEHealthcare BR-1008-38))。然后所述抗原用作分析物并穿经捕获的杂交瘤抗体表面。对于抗原2和抗原3，典型使用的浓度为256nM、64nM、16nM、4nM和1nM，对于抗原1，典型使用的浓度为1028nM、256nM、64nM、16nM和4nM，结合曲线是两倍参考，使用0nM注射(即仅缓冲液)。动力学和整体亲和性使用BioRad ProteOn XPR36分析软件本身的1:1模型确定。
具有证实的结合活性的任何克隆用于制备总RNA及随后的PCR以恢复重链可变区序列。进行标准5’-RACE以分析来自S2F和S3F小鼠中转基因重链基因座的RNA转录物。此外，对由所述小鼠产生的几乎2000个序列进行深度序列分析。
生物信息学分析
进行分析的序列得自两种不同方法：
·第一种是得自从脾中提取的RNA：首先使用基于小鼠IGH基因座的Cmu区的寡聚物作为PCR模板合成cDNA链。使用这个寡聚物及oligo dT-锚引物进行PCR。然后将PCR产物克隆进pDrive载体(Qiagen)并测序。
·第二种是得自通过电融合产生的杂交瘤：使用标准Trizol方法从感兴趣的杂交瘤系提取总RNA，在-80℃冷冻以长期贮存。使用标准Superscript III逆转录酶和结合所有小鼠IgG同种型的重链的基因特异性反向引物及进行轻链扩增的小鼠κ恒定区引物，从100ng总RNA产生cDNA。然后将2-3μl的cDNA在PCR反应中用作模板，使用Pfu DNA聚合酶及与人免疫球蛋白可变结构域的前导序列退火的一组简并正向引物，以及一种小鼠pan-IgG反向引物。将PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，提取大约350-450个碱基对的条带并纯化。然后对DNA进行测序。
来自第一种方法的序列可以是来自首次用于实验小鼠的IgM或者来自免疫小鼠的IgG。来自第二种方法的样品均来自免疫小鼠的IgG，并特异于免疫抗原。分析了几乎2000个序列。
序列作为一对正向和反向读取获得。将这些序列首先修整以从读取末端除去低质量的碱基调用(从两端修整直至19个核苷酸的窗口的平均质量得分为25或更高)。将所述读取与反向读取的反向互补组合一起，根据正向读取排列。所述排列得分是匹配5，错配-4，缺口开放罚分10及缺口延伸罚分1。然后通过排列和对比碱基逐步产生共有序列。当存在分歧时，使用具有测序最高质量值的碱基。
然后使用BLAST+(Basic Local Alignment Search Tool)(Camacho C.,Coulouris G.,Avagyan V.,Ma N.,Papadopoulos J.,Bealer K.,&Madden T.L.(2008)"BLAST+:architecture and applications."BMC Bioinformatics10:421http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20003500)程序“blastn”发现每个序列中使用的种系J和V区段。字长为30用于V匹配，15用于J匹配。从用于产生Kymouse的BAC的NGS测序中构建搜索数据库。
如果序列的V和J区段均匹配，则将这两个区段之间的序列与小鼠中的种系D区段数据库对比，使用“blastn”，字长为4及选项“blastn-short”和“ungapped”。如果可能，这用于赋值D区段。CDR3通过搜索V区段中保守的“TATTACTGT”序列及J区段中的“CTGGGG”而鉴别。如果未发现这些基序，则允许至多4个错配。使用CDR3的IMGT定义，由此CDR3长度从V中TGT之后至J中TGG之前计算。排除具有异读框连接(不具有长度可被3除尽的CDR3核苷酸长度的那些)或含有终止密码子(TAA，TAG或TGA)的序列。
然后来自这种赋值的匹配V、J和D区段的名称以及CDR3长度做表以进行下游分析。从首次用于实验至免疫的小鼠中使用的IGHJ6*02比率增加，以及在具有长HCDR3(定义为由20个或更多个氨基酸组成)的序列亚群中富集。
这个结果示出通过免疫选择JH6*02基因区段，因为JH6*02使用的比例在免疫之后增加。JH6*02也用于具有长HCDR3长度的大多数抗体中，这是HCDR3长度由长抗体特异性结合的靶位所需的。
此外，分析表明某些VH和D基因区段通常产生长HCDR3(在所有首次用于实验的、免疫的及抗原特异性的重链库集中)。见表2所示。
表2A:来自首次用于实验库集的长HCDR3
表2B:来自免疫的库集的长HCDR3

Claims (25)

1.产生针对感染性疾病病原体抗原的抗体的方法，该方法包括：
(i)用所述抗原免疫小鼠或大鼠，其中所述小鼠或大鼠的基因组包含：
(a)免疫球蛋白重链基因座，其包含位于重链内源性宿主小鼠或大鼠恒定区上游的一或多个人VH基因区段、一或多个人D基因区段及一或多个人JH基因区段；及
(b)免疫球蛋白轻链基因座，其包含：位于恒定区上游的一或多个人VL基因区段及一或多个人JL基因区段，所述一或多个人VL基因区段选自如下一组中：VλII基因家族成员、Vλ-VII 4A、Vλ-II 2.1、Vλ-VII 4A、Vλ-l基因家族成员、Vλ-3基因家族成员、IGLVIS2、Vλ3-cML70、lalh2、lalvl、la3h3、κv325、VκI基因家族成员、κI-15A、VκII家族成员、VκIII家族成员、VκII A2、VκA27、及与其至少80％相同的基因区段；
其中重链基因座中的人基因区段与其恒定区可操纵地连接，轻链基因座中的人基因区段与其恒定区可操纵地连接，
其中在免疫时，小鼠或大鼠能产生包含由所述重链基因座重排产生的重链和由所述轻链基因座重排产生的轻链的抗体；
(ii)从所述小鼠或大鼠取出B淋巴细胞并选择表达结合所述抗原的抗体的一或多个B淋巴细胞；以及
(iii)分离由所述B淋巴细胞表达的抗体。
2.权利要求1的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
3.权利要求1的方法，其中所述抗体是多克隆抗体。
4.权利要求1的方法，包括从所述B淋巴细胞分离编码结合所述抗原的所述抗体的核酸的步骤。
5.权利要求4的方法，包括用编码人或人源化重链恒定区的核苷酸序列交换所述抗体的重链恒定区核苷酸序列。
6.权利要求4或5的方法，包括亲和性成熟所述抗体的可变区。
7.权利要求4或5的方法，包括将所述核酸插入表达载体中。
8.权利要求4或5的方法，包括将所述核酸插入表达载体及宿主细胞中。
9.权利要求1的方法，进一步包括产生通过权利要求1的方法产生的抗体的突变体或衍生物。
10.产生多克隆抗体混合物的方法，所述方法包括进行权利要求1的方法，通过用抗原免疫第一和第二小鼠或第一和第二大鼠并组合分离自每个小鼠或大鼠的抗-抗原抗体以产生多克隆抗体混合物，其中用相同抗原或不同抗原免疫所述小鼠或大鼠。
11.权利要求10的方法，其中，在免疫之前，所述小鼠或大鼠的轻链基因座含有相同的VH基因库集。
12.权利要求10的方法，其中，在免疫之前，所述小鼠或大鼠的轻链基因座含有相同的重排的VJ或VDJ库集。
13.权利要求11或12的方法，其中所述小鼠或大鼠的轻链基因座在免疫之前是相同的。
14.产生能表达多克隆抗体混合物的宿主细胞的方法，所述方法包括，在权利要求4的方法中：
(a)用第一和第二抗原免疫一或多个小鼠或大鼠；
(b)从所述小鼠或大鼠B淋巴细胞分离编码第一种和第二种抗-抗原抗体的核酸；
(c)确定第一种抗体的重链和轻链可变区的核苷酸序列；
(d)确定第二种抗体的重链可变区及任选确定轻链可变区的核苷酸序列；
(e)将每个抗体的重链可变区编码序列插入重链表达载体中；
(f)将第一种抗体的轻链可变区编码序列插入轻链表达载体中；及
(h)将每个表达载体导入宿主细胞中并在所述宿主细胞的混合物中共表达抗体链以产生抗体，每个抗体均包含所述重链可变区和轻链之一或二者。
15.权利要求14的方法，其中不同抗原由相同病原体生物体或其家族成员表达。
16.权利要求14的方法，其中每个重链的恒定区编码序列交换为编码人或人源化恒定区的核苷酸序列。
17.权利要求14的方法，其中第一种抗体的轻链的恒定区编码序列交换为编码人或人源化恒定区的核苷酸序列。
18.权利要求14的方法，包括将第二种抗体的轻链可变区编码序列插入轻链表达载体中。
19.权利要求14的方法，其中第二种抗体的轻链的恒定区编码序列交换为编码人或人源化恒定区的核苷酸序列。
20.权利要求14的方法，其中所述表达载体一起导入相同宿主细胞中，以便细胞能表达抗体轻链和重链，由此所述细胞或多个宿主细胞表达抗体，每个抗体均包含所述重链可变区和轻链之一或二者。
21.权利要求20的方法，其中所述宿主细胞是CHO或HEK293细胞。
22.权利要求14的方法，其中，在免疫之前，所述小鼠或大鼠的轻链基因座含有相同的VH基因库集；或者
在免疫之前，所述小鼠或大鼠的轻链基因座含有相同的重排的VJ或VDJ库集。
23.权利要求22的方法，其中所述小鼠或大鼠的轻链基因座在免疫之前是相同的。
24.产生单克隆或多克隆抗体混合物的方法，所述方法包括进行权利要求14至23任一项的方法及表达单克隆抗体或所述抗体的多克隆混合物。
25.权利要求24的方法，随后分离包含第一种和/或第二种抗体的重链可变区的抗体。
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