CN107557367B - Ighg1基因突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了IGHG1基因突变体及其应用，具体涉及分离的核酸，分离的多肽，筛选易患系统性红斑狼疮的生物样品的系统，用于筛选易患系统性红斑狼疮的生物样品的试剂盒，以及构建药物筛选模型的方法。其中，该分离的核酸，与SEQ ID NO：1相比，具有c.1186C>T突变。通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患系统性红斑狼疮。

Description

IGHG1基因突变体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及IGHG1基因突变体及其应用，更具体地，涉及分离的核酸、分离的多肽、筛选易患系统性红斑狼疮的生物样品的系统、用于筛选易患系统性红斑狼疮的生物样品的试剂盒、构建体、重组细胞以及构建药物筛选模型的方法。

背景技术

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种常见的自身免疫性疾病，其临床表现复杂多样，患者多呈现皮肤红斑狼疮，并伴随关节炎、皮疹、肾炎等，随着病程的发展，会累及到肾脏、肺脏、心脏等众多组织器官，对患者的血液系统、神经系统和消化系统等造成不同程度的损害。系统性红斑狼疮多发于育龄女性，世界范围内的发病率约为4/10万-25/10万，在亚洲人及非洲人中发病率要显著高于欧洲及美国人，我国的发病率为70/10万-75/10万。

系统性红斑狼疮的病因和发病机制复杂，遗传因素和环境因素，如病毒感染、性激素水平、药物及食品等都与其发生密切相关。SLE在不同种族的易感性显著不同，如SLE在非洲裔和亚裔美洲人中较白人更为常见，这提示以易感基因或致病基因为基础的遗传因素在疾病的发生中起到重要作用。近年来，人们利用全基因组关联分析(genome-wideassociation study，GWAS)，鉴定出超过40个与SLE疾病相关的易感基因，如蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型22(PTPN22)，肿瘤坏死因子超家族成员4(TNFSF4)，信号转导与转录激活因子4(STAT4)等。因此，明确SLE的遗传基础，筛查与疾病的发生和发展相关的基因靶点对指导SLE的发病风险评估、疾病的诊断、个体化精准医疗及针对新靶点的药物设计开发具有重要的理论价值和临床意义。

然而，目前对系统性红斑狼疮发病的遗传学基础的研究仍有待深入。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种有效筛选系统性红斑狼疮的生物样品的手段。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列工作而完成的：

大量自身抗体的产生及免疫复合物的沉积是引起SLE临床表型的最重要因素之一。在SLE患者中可检测到大量的针对自身抗原的IgG亚型抗体，如抗核抗体，抗双链DNA抗体，抗Sm抗体等，这些抗体的产生依赖于患者体内增多的IgG+B细胞。此外，针对人的外周血中IgG+记忆B细胞的研究表明，IgG+记忆性B细胞相比于IgM+幼稚型B细胞具有更高的自身反应性和多反应性。由此，发明人认为，IgG+记忆性B细胞在SLE的发生和发展过程中扮演重要角色。考虑到系统性红斑狼疮与遗传的紧密相关性及其在我国的高发情况，发明人以IgG+记忆性B细胞为研究靶标，在可取样范围内对我国大陆人群进行了SLE易感基因筛查。

结果，确定了遗传性系统性红斑狼疮疾病的致病基因IGHG1的新的致病突变位点——rs117518546(即c.1186C>T突变)。并且，发明人通过一系列实验进一步验证了该突变能够导致系统性红斑狼疮疾病。

因而，根据本发明的第一方面，本发明提供了一种分离的核酸。根据本发明的实施例，与SEQ ID NO：1相比，所述核酸具有。在本发明中，采用本领域通用表示法表示突变。c.1186C>T突变表示cDNA第1186位核苷酸由C变成T。发明人惊奇的发现，该突变体与系统性红斑狼疮的发病密切相关，从而通过检测该突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患系统性红斑狼疮，根据本发明的实施例，该突变体的核酸进一步丰富了IGHG1基因的致病突变图谱，更深入阐明了系统性红斑狼疮的分子发病机制，为系统性红斑狼疮的早期致病基因筛查和干预治疗提供科学依据。

根据本发明的第二方面，本发明还提供了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，与SEQ ID NO：2相比，所述分离的多肽具有p.G390R突变。在本发明中，采用本领域通用表示法表示突变。p.G390R表示蛋白质水平第390位密码子由甘氨酸变为精氨酸。具体地，致病基因IGHG1上的c.1186C>T突变引起p.G396R突变。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有效地检测生物样品是否易患系统性红斑狼疮。

根据本发明的第三方面，本发明还提供了一种筛选易患系统性红斑狼疮的生物样品的系统。该系统包括：核酸提取装置，所述核酸提取装置用于提取所述生物样品中的核酸样本；核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列；以及判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于将所述核酸的序列与SEQ ID NO：1相比，是否具有c.1186C>T突变，判断所述生物样品是否易患系统性红斑狼疮。发明人惊奇地发现，利用该系统可以对系统性红斑狼疮进行基因层面的检测，有助于更准确的筛选易患系统性红斑狼疮的生物样品。

根据本发明的第四方面，本发明还提供了一种用于筛选易患系统性红斑狼疮的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒含有：适于检测IGHG1基因突变体的试剂，其中与SEQ ID NO：1相比，所述IGHG1基因突变体具有c.1186C>T突变。由此，利用该试剂盒，可以对IGHG1基因突变体进行高精度的检测，从而对系统性红斑狼疮进行基因层面的检测，有助于更准确的筛选易患系统性红斑狼疮的生物样品。

根据本发明的第五方面，本发明还提供了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包含前述的分离的核酸。由此，利用本发明的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用于筛选治疗系统性红斑狼疮的药物。

根据本发明的第六方面，本发明还提供了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该重组细胞是通过表达前述的构建体转化受体细胞而获得的。根据本发明的一些实施例，利用本发明的重组细胞，能够有效地筛选治疗系统性红斑狼疮的药物。

根据本发明的第七方面，本发明还提供了一种构建药物筛选模型的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：使动物的至少一部分细胞表达前述的多肽。根据本发明的一些实施例，利用本发明的动物模型，能够有效地筛选治疗系统性红斑狼疮的药物。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明实施例的筛选易患系统性红斑狼疮的生物样品的系统及其组成部分的示意图，其中，

图1A为根据本发明实施例的筛选易患系统性红斑狼疮的生物样品的系统的示意图，

图1B为根据本发明实施例的核酸提取装置的示意图，

图1C为根据本发明实施例的核酸序列确定装置的示意图；

图2显示了实施例3中，基于CRISPR/Cas9基因编辑系统的IgG1 G390R突变体小鼠构建流程示意图；

图3显示了实施例3中，诱导自身免疫的小鼠血清中抗dsDNA，抗SmD自身抗体的动态变化检测结果；

图4显示了实施例3中，诱导自身免疫的小鼠中血清中抗核抗体的检测结果；

图5显示了实施例3中，诱导自身免疫的小鼠肾切片免疫荧光染色的检测结果；

图6显示了实施例4中，野生型和G390R突变体小鼠的活化B细胞中的钙信号的检测结果；

图7显示了实施例4中，野生型和G390R突变体小鼠的活化的B细胞免疫突触中Grb2的招募情况的检测结果。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

IGHG1突变体

根据本发明的第一方面，本发明提供了一种分离的核酸。根据本发明的实施例，与SEQ ID NO：1相比，所述核酸具有c.1186C>T突变。

在本文中所使用的表达方式“编码IGHG1突变体的核酸”，是指与编码IGHG1突变体的基因相对应的核酸物质，即核酸的类型不受特别限制，可以是任何包含与IGHG1突变体的编码基因相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。根据本发明的一些具体示例，所述核酸为DNA。

对于本发明说明书和权利要求书中所提及的核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如，提及SEQ ID NO：1，实际包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。

本申请中的基因序列包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。例如提及IGHG1基因的cDNA序列，实际也包括相应的RNA序列。

该编码IGHG1突变体的核酸，是本申请的发明人基于对IGHG1基因进行Taq探针的大样本量鉴定确定的系统性红斑狼疮的致病基因IGHG1的新的致病突变。该致病突变位点在现有技术中并未被提到，更没有任何关于该突变参与系统性红斑狼疮疾病发生、发展，导致系统性红斑狼疮疾病的报道。

其中，需要说明的是，本文中所采用的术语“致病突变”是指该突变是疾病(SLE)的危险易感突变，该基因突变能够引起相应的疾病表型，但并不只限定该突变单独导致疾病发生的情形。

其中，野生型IGHG1基因的cDNA的序列如下所示：

GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCAGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGAGCTGCAACTGGAGGAGAGCTGTGCGGAGGCGCAGGACGGGGAGCTGGACGGGCTGTGGACGACCATCACCATCTTCATCACACTCTTCCTGTTAAGCGTGTGCTACAGTGCCACCGTCACCTTCTTCAAGGTGAAGTGGATCTTCTCCTCGGTGGTGGACCTGAAGCAGACCATCATCCCCGACTACAGGAACATGATC

GACAGGGGGCCTAG(SEQ IDNO：1)。

本发明的发生c.1186C>T突变的IGHG1基因突变体，在上述野生型序列的加框示出处由碱基C突变为T。

其中，本发明的c.1186C>T突变(在本文中有时也简称为“rs117518546”)是编码膜联IgG重链的IGHG1基因上的单核苷酸多态性位点(SNP)，该位点的单核苷酸改变将导致膜联IgG重链胞内区保守的甘氨酸变为精氨酸。并且，发明人通过大规模的验证发现，该位点在亚洲人群尤其是我国具有很高的携带率。

发明人惊奇的发现，该突变体与系统性红斑狼疮的发病密切相关，从而通过检测该突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患系统性红斑狼疮，根据本发明的实施例，该突变体的核酸进一步丰富了IGHG1基因的致病突变图谱，并且更深入地阐明了系统性红斑狼疮的分子发病机制，为系统性红斑狼疮的早期致病基因筛查和干预治疗提供科学依据。

根据本发明的第二方面，本发明还提供了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，与SEQ ID NO：2相比，所述分离的多肽具有p.G390R突变。具体地，致病基因IGHG1上的c.1186C>T突变引起相应的蛋白IgG1的蛋白质水平的p.G390R突变。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有效地检测生物样品是否易患系统性红斑狼疮。

根据本发明的一些具体示例，所述多肽由前面所述的分离的核酸编码。

其中，野生型的IGHG1基因的cDNA编码的多肽——野生型IgG1的氨基酸序列如下：ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPELQLEESCAEAQDGELDGLWTTITIFITLFLLSVCYSATVTFFKVKWIFSSVVDLKQTIIPDYRNMI

QGA*(SEQ ID NO：2)。

发生p.G390R突变的IgG1突变体在上述野生型序列的加框示出处由氨基酸G突变为R。

通过比对发现，与SEQ ID NO：1相比，本发明的IGHG1基因突变体的cDNA具有c.1186C>T突变，进而，其编码产物与野生型的IgG1多肽的氨基酸序列相比，具有p.G390R突变。综上，存在c.1186C>T突变可引起系统性红斑狼疮。

筛选易患系统性红斑狼疮的生物样品的系统和试剂盒

根据本发明的第三方面，本发明提供了一种筛选易患系统性红斑狼疮的生物样品的系统。参照图1A，该系统包括：

核酸提取装置100，所述核酸提取装置100用于提取所述生物样品中的核酸样本。根据本发明的一些具体示例，所述核酸提取装置100进一步包括：RNA提取单元101，所述RNA提取单元101用于从生物样品中提取RNA样本；以及逆转录单元102，所述逆转录单元102与所述RNA提取单元101相连，用于对所述RNA样本进行逆转录反应，以便获得cDNA样本，所述cDNA样本构成所述核酸样本。

核酸序列确定装置200，所述核酸序列确定装置200与所述核酸提取装置100相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列。根据发明的具体示例，所述核酸序列确定装置进一步包括：文库构建单元201，所述文库构建单元201用于针对所述核酸样本，构建所述核酸的文库；以及测序单元202，所述测序单元202与所述文库构建单元201相连，通过对所述文库进行测序，以便确定所述核酸的序列。其中，所述文库构建单元201进一步包括：PCR扩增模块，所述PCR扩增模块中设置有针对IGHG1基因c.1186C>T突变位点的特异性引物，以便利用所述特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增。

根据本发明的实施例，所述特异性引物的核酸序列如下所示：

TCACACTGTACCCTGCTACC(SEQ ID NO：3)；

AGCTCTTTCTGGAGTTGATA(SEQ ID NO：4)。

根据本发明的一些具体示例，所述测序单元包括选自HISEQ2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种。

判断装置300，所述判断装置300与所述核酸序列确定装置200相连，以便基于将所述核酸的序列与SEQ ID NO：1相比，是否具有c.1186C>T突变，判断所述生物样品是否易患系统性红斑狼疮。

发明人惊奇地发现，利用该系统可以对系统性红斑狼疮进行基因层面的检测，有助于更准确的筛选易患系统性红斑狼疮的生物样品。

根据本发明的第四方面，本发明提供了一种用于筛选易患系统性红斑狼疮的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒含有：适于检测IGHG1基因突变体的试剂，其中与SEQ ID NO：1相比，所述IGHG1基因突变体具有c.1186C>T突变。由此，利用该试剂盒，可以对IGHG1基因突变体进行高精度的检测，从而对系统性红斑狼疮进行基因层面的检测，有助于更准确的筛选易患系统性红斑狼疮的生物样品。

在发明中，所使用的术语“适于检测IGHG1基因突变体的试剂”应做广义理解，即可以是检测IGHG1突变体的编码基因的试剂，也可以是检测IGHG1蛋白突变体的试剂，例如可以采用识别特异性位点的抗体。根据本发明的一些具体示例，所述试剂为针对IGHG1基因c.1186C>T突变位点的核酸探针或者特异性引物。由此，能够特异性的检测IGHG1基因突变体。

根据本发明的一些实施例，所述核酸探针为Taqman探针，其核酸序列如下所示：

上游引物序列：GGACACCCCGCAGAGG(SEQ ID NO：5)；

下游引物序列：GGACCTGAAGCAGACCATCATC(SEQ ID NO：6)；

探针1序列：CAGGAACATGATCGGACAG(SEQ ID NO：7)；

探针2序列：CAGGAACATGATCAGACAG(SEQ ID NO：8)。由此，对IGHG1基因突变体检测的特异性好，准确性高。

根据本发明的一些具体示例，所述特异性引物的核酸序列如下所示：

上游引物：TCACACTGTACCCTGCTACC(SEQ ID NO：3)；

下游引物：AGCTCTTTCTGGAGTTGATA(SEQ ID NO：4)。

由此，对IGHG1基因突变体检测的特异性好，准确性高。

构建体和重组细胞

根据本发明的第五方面，本发明提供了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包含前述的分离的核酸。由此，利用本发明的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用于筛选治疗系统性红斑狼疮的药物。

在本发明中所使用的术语“构建体”是指这样的一种遗传载体，其包含特定核酸序列，并且能够将目的核酸序列转入宿主细胞中，以获得重组细胞。根据本发明的实施例，构建体的形式不受特别限制。根据本发明的实施例，其可以为质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒(Cosmid)、病毒的至少一种，优选质粒。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。在本发明中所使用的术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别限制。对于用于构建重组细胞的构建体，优选所述核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定，并且易于操作。

根据本发明的第六方面，本发明还提供了一种重组细胞，根据本发明的实施例，所述重组细胞是通过表达前述的构建体转化受体细胞而获得的。根据本发明的一些实施例，利用本发明的重组细胞，能够有效地筛选治疗系统性红斑狼疮的药物。

构建药物筛选模型的方法

根据本发明的第七方面，本发明还提供了一种构建药物筛选模型的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：使动物的至少一部分细胞表达前述的多肽。根据本发明的实施例，所述动物为小鼠、猪、狗、灵长类动物。根据本发明的一些实施例，利用本发明的动物模型，能够有效地筛选治疗系统性红斑狼疮的药物。

其中，需要说明的是，本发明构建药物筛选模型的方法不受特别的限制，只要使动物的至少一部分细胞表达前述的突变体基因或蛋白即可。具体地，可以采用分子生物学技术，对受体细胞进行精确的目标基因定点突变——使IGHG1基因发生c.1186C>T突变，以便获得患有系统性红斑狼疮的动物，该动物可以作为模型用于筛选治疗该疾病的药物。例如，可以通过无标记转基因技术，定点整合技术，基因组编辑技术等方法实现目标基因的定点突变，获得本发明的编码IGHG1突变体的基因，进而构建IGHG1突变体基因的同源重组载体，将该同源重组载体通过一定的方式(如显微注射)导入同源的胚胎干细胞中，使突变的外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中，从而IGHG1突变体基因在重组细胞中得以表达。再将重组细胞植入假孕母体，使其发育成嵌合体动物。然后，利用嵌合体之间的交配，产生纯合体动物，嵌合体动物和纯化体动物均可用作药物筛选模型，能够有效地用于筛选治疗系统性红斑狼疮的药物。

此外，根据本发明的实施例，本发明至少具有以下有益效果：

(1)本发明发现了IGHG1基因的新的突变位点，对该突变位点的检测可以用于系统性红斑狼疮患者的辅助诊断，并且可进一步应用于系统性红斑狼疮患者的分子诊断。因此，本发明的检测突变IGHG1基因或蛋白的方法可以可用于早期筛查系统性红斑狼疮致病突变携带者，进而在携带者发病之前进行早期干预治疗。该技术具有快速、准确、高效、简便、早期诊断率高等优点。

(2)本发明可以对系统性红斑狼疮的发病机理提供重要线索，对系统性红斑狼疮的诊断治疗具有十分重要的意义。

(3)在本发明的基础上，可以提供该新的致病突变在制备用于体外检测并评估待测个体患SLE风险的检测装置或模型中的应用。

(4)在本发明的基础上，能够提供一种预测待测SLE患者个体的病程发展的方法。具体流程包括：a.获取SLE患者和健康人对照的外周血基因组DNA样本；b.利用Taqman探针法对SLE患者和健康人对照样本进行基因分型；c.采用卡方检验或二元logistic回归进行数据分析，得出该SNP位点与SLE易感性相关性结果及SLE患者临床表型严重程度的相关性结果。

(5)在本发明的基础上，能够以检测人基因组中rs117518546多态性或基因型作为筛查、鉴定、预测系统性红斑狼疮疾病易感或疾病进展的手段；或者将检测人基因组中rs117518546的多态性或基因型的物质用于制备筛查或预测系统性红斑狼疮患者产品、检测系统性红斑狼疮患者易感性产品、检测、鉴定或辅助鉴定与系统性红斑狼疮相关的单核苷酸多态性的产品。其中，上述检测人基因组中rs117518546的多态性或基因型的物质，包括但不限于扩增包含rs117518546位点在内的基因组DNA片段的PCR引物对和成套探针。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Illumina公司。

实施例1确定SLE疾病致病基因和致病突变

确定系统性红斑狼疮患者家系的致病基因，具体如下：

发明人总结了现有文献报道的关于膜联IgG参与调控B细胞活化的研究结果：

1、具有自身反应性的B细胞在人的外周血IgG+记忆性B细胞群中显著增加；

2、IgG+记忆性B细胞对具有各种不同特征抗原刺激的活化阈值显著降低；

3、IgG+记忆性B细胞能以不依赖T细胞帮助的方式活化；

4、活化的IgG+记忆性B细胞能够快速增殖并分化为抗体分泌浆细胞；

5、IgG+记忆性B细胞对针对B细胞特异性清除的治疗手段具有较强的耐药性，并且自身免疫病人在治疗后存留的IgG+记忆性B细胞的数目与疾病的复发具有显著的相关性；

6、膜联IgG胞内区对IgG+记忆性B细胞快速增强的活化、增殖及分化充分且必要。

进而，猜想膜联IgG的胞内区可能参与自身免疫疾病发生、发展过程中自身反应性B细胞的活化调控。

于是，发明人认为，通过对自身免疫病系统性红斑狼疮(SLE)病人基因组DNA中IGHG1基因中编码膜联IgG1胞内区的区段(6号外显子)进行测序来发现该区段在自身免疫病人和正常人之前的异同，进而寻找致病突变。

发明人首先完成了对113位SLE病人基因组DNA该区段的测序分析，发现SLE病人中的膜联IgG1胞内区存在一个单核苷酸多态性位点SNP rs117518546，该SNP位点单一核苷酸的改变导致膜联IgG1蛋白编码396位点由甘氨酸变为精氨酸(即c.1186C>T突变，导致p.G390R突变)。

进一步，发明人利用Sanger测序方法，对IGHG1基因的rs117518546突变位点(c.1186C>T)进行了验证。具体地，分别对113位患者的家系成员以及100个家系外正常人的IGHG1基因进行检测，针对上述新的突变位点所在序列设计引物(针对IGHG1基因c.1186C>T突变位点的特异性引物)，然后通过PCR扩增、产物纯化和测序的方法获得上述突变的有关序列，根据确定序列测定结果属于突变型还是野生型，验证突变与SLE疾病之间的相关性。结果显示，IGHG1基因的c.1186C>T突变确实与SLE疾病相关，是SLE疾病的致病突变。

其中，所述特异性引物的核酸序列如下所示：

TCACACTGTACCCTGCTACC(SEQ ID NO：3)；

AGCTCTTTCTGGAGTTGATA(SEQ ID NO：4)。

更重要的是，发明人还发现在测序分析获得的在SLE病人中该SNP位点的次等位基因频率(MAF)与1000Genomes数据库中提供的正常人的MAF显著不同，SLE病人的MAF为0.3142，1000Genomes数据库中为0.1286。

因此，发明人推测该SNP位点可能与SLE自身免疫疾病的进展有关。为了验证这一猜想，发明人进一步设计了针对该SNP位点的Taqman探针，进行性别、年龄匹配的正常人对照和SLE病人的大样本量的rs117518546位点的基因型鉴定。

实施例2：rs117518546的检测及其与系统性红斑狼疮发病风险以及SLE病程发展的相关性研究

1、病例及对照样本入选标准

SLE病例的入选诊断标准：SLE患者来源于北京大学人民医院风湿免疫科的住院患者。所有患者均符合1997年美国风湿病学会系统性红斑狼疮修正分类标准(the1997revised classification criteria of the American College of Rheumatologyfor SLE)。

对照组入选标准：既往无SLE或其他自身免疫疾病病史；年龄分布及性别比例与病例组无显著区别。

病例组和对照组均为中国大陆人，且无血缘关系。

研究人群包括251例SLE患者以及279例健康正常人，基本特征见表1；检测的SNP位点rs117518546基本信息见表2。

表1 病例组和对照组基本特征

表2 人IGHG1基因rs117518546单核苷酸多态性位点基本信息

2、具体实验方案

抽取上述病例组和对照组的研究对象的血液，提取全基因组DNA，利用Taqman探针对IGHG1基因上的rs117518546位点(14q32.3区域)进行基因分型。

Taqman探针法进行基因分型实验的具体操作如下：

仪器：ABI 7300实时荧光定量PCR仪

试剂：2×TaqMan GT master mix(Life technology)；40×TaqMan SNP探针(rs117518546)；去离子水；

Taqman探针序列：

上游引物序列：GGACACCCCGCAGAGG(SEQ ID NO：5)；

下游引物序列：GGACCTGAAGCAGACCATCATC(SEQ ID NO：6)；

探针1序列：CAGGAACATGATCGGACAG(SEQ ID NO：7)；

探针2序列：CAGGAACATGATCAGACAG(SEQ ID NO：8)；

探针1染料：VIC；

探针2染料：FAM。

实验方法：将患者或对照个体基因组DNA样本(50-100ng/微升)2微升、2×TaqManGT master mix 4微升、40×TaqMan SNP探针0.2微升、去离子水1.8微升混合均匀，每个患者或对照共计10微升反应体系。每孔一人反应体系，分别加入96孔PCR板，在ABI 7300实时荧光定量PCR仪进行反应。95℃变性30秒，60℃退火1分钟，重复40个循环。反应结束后，使用7500System SDS software进行基因型分型，确定以上患者是否属于携带rs117518546位点上危险等位基因T的纯合子(TT)的个体，或是属于携带rs117518546位点野生型等位基因C的纯合子CC以及rs117518546位点杂合子CT的个体。

3、数据分析

获得病例组及对照组所有个体的rs117518546位点的基因分型数据后，进行被测个体年龄和性别的校正，对该SNP位点与SLE疾病的发生发展进行关联分析：

首先，使用卡方检验分析该SNP位点是否与SLE疾病的发生具有相关性，明确该SNP位点的次等位基因是否为SLE疾病的危险等位基因；

其次，应用二元logistic回归分析，评估被测个体该SNP位点的基因型(CC，CT，TT)与SLE发病风险的关联；

最后，对携带rs117518546位点危险等位基因T的纯合子(TT)的个体，携带野生型等位基因C的纯合子CC的个体以及杂合子CT的个体，计算被测个体针对各SLE疾病临床指标发病的相对危险度(Odds ratio,OR)以及95％的置信区间(95％CI)。这些临床指标包括：关节炎、心包炎、浆膜炎、蛋白尿、贫血、雷诺氏现象、抗r-RNP自身抗体、抗SSA自身抗体、抗SSB自身抗体、抗Sm自身抗体、系统性红斑狼疮活动指数(SLEDAI>9)等。

4、数据及结果

本发明涉及的人IGHG1基因单核苷酸多态性位点rs117518546及其两翼序列：

AGAGGGTGGCCCTAGGCCCCCTGTC[A/C/T]GATCATGTTCCTGTAGTCGGGGATG。

统计分析结果表明：

a.rs117518546位点与SLE发病相关(p＝0.002)，携带rs117518546位点T等位基因的个体，其罹患SLE的风险提高1.535倍(表3)；

b.个体携带危险等位基因T的数量与SLE发病风险显著相关，相比于携带rs117518546位点野生型等位基因C的纯合子的个体，携带危险等位基因T的纯合子和杂合子个体，其SLE发病风险提高1.504倍(表3)；

表3人IGHG1基因单核苷酸多态性位点rs117518546与SLE之间的相关性分析

c.被测个体针对各SLE疾病临床指标发病的相对危险度(Odds ratio,OR)以及95％的置信区间(95％CI)分析结果显示：个体携带危险等位基因T的数量与SLE疾病的严重程度显著相关，相比于携带rs117518546位点野生型等位基因C的纯合子的个体，携带危险等位基因T的纯合子和杂合子个体，关节炎、心包炎、浆膜炎、肺损害、蛋白尿、抗r-RNP自身抗体的相对风险分别提高1.704，2.304，2.146，3.599，1.673，1.879倍，取系统性红斑狼疮活动指数SLEDAI大于9患者为病例组，SLE发病的相对风险提高到2.075倍(表4)。

表4 人IGHG1基因单核苷酸多态性位点rs117518546与SLE疾病严重程度之间的关联

该结果充分证明人IGHG1基因单核苷酸多态性位点rs117518546与系统性红斑狼疮的发生发展显著相关，通过对个体进行rs117518546位点基因分型鉴定将有利于SLE疾病的患病风险评估，同时SLE患者中危险等位基因T的携带数量可作为SLE疾病预后的重要参考。

对比例1：rs117518546与类风湿性关节炎发病风险的相关性研究

1、RA病例及对照样本入选标准

RA病例的入选诊断标准：中国大陆人，RA患者均符合1987年美国风湿病学会(ACR)制定的RA分类标准。

对照组入选标准：中国大陆人，与RA病例无血缘关系，既往无RA或其他自身免疫疾病病史。

研究对象包括283例RA患者以及610例健康人对照。

2、rs117518546位点与类风湿性关节炎发病风险的关联分析

参照实施例2中的鉴定步骤对类风湿性关节炎患者及其对照进行rs117518546位点的基因分型分析，结果如表5。

表5 人IGHG1基因单核苷酸多态性位点rs117518546与RA之间的相关性分析

采用与实施例1中相同的关联分析方法，结果表明等位基因T不是RA的危险等位基因，rs117518546位点与类风湿性关节炎无显著相关性。

实施例3：人rs117518546多态性对应的小鼠IgG1 G390R突变对小鼠自身免疫表型的影响检测

1、IgG1 G390R突变体小鼠的构建

利用CRISPR/Cas9系统在C57BL/6小鼠背景上构建IgG1 G390R突变体小鼠。从美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)数据库获取目标基因的基因组全序列信息(包括外显子、内含子和编码区)，确定目标突变位点G390R所在的区域，利用开源获取sgRNA在线设计工具(http://crispr.mit.edu/)，进行sgRNA的设计，选取距目标突变位点前后100bp范围以内且评分较高的sgRNA靶向序列，构建pSpCas9-2a-GFP载体。

设计并选用的两条sgRNA靶向序列分别为：

CATGATTGGGCAAGCACCCT(SEQ ID NO：9)；

GTGGGGTATAGGTCACCAC(SEQ ID NO：10)。

从基因组中选取目标突变位点上、下游各800bp的序列作为Cas9介导的同源重组修复突变的原始模板，以原始模板为基础，对目标位点进行GGG到AGG单核苷酸突变(氨基酸序列为G390R突变)，同时，对sgRNA的前间区序列邻近基序(Protospacer adjacent motif，PAM)位点进行氨基酸的同义点突变，突变后的序列作为CRISPR/Cas9基因点突变的重组模板(如图2)。以构建好的含sgRNA的pSpCas9-2a-GFP载体作为模板，利用设计的5’端含T7启动子的引物对sgRNA区域进行PCR扩增，并以纯化的PCR产物作为体外转录的模板。分别使用mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit和MEGAshortscript High Yield Transcription Kit(Thermo Scientific)进行Cas9和sgRNA的体外转录，利用MEGAclear kit(ThermoScientific)进行RNA的纯化。操作流程严格按照试剂盒提供的具体步骤进行。

以原核注射的方式进行受精卵注射。

注射体系如下：

10ng/μl Cas9 RNA，3ng/μl sgRNA1，3ng/μl sgRNA2，10ng/μl含IgG1 G390R突变位点的同源重组模板。

原核注射及注射后的胚胎移植由清华大学实验动物中心完成，取出生2周的新生小鼠进行基因型鉴定，通过与野生型C57BL/6小鼠交配及后代杂合子交配，获得IgG1 G390R突变体纯合子小鼠。

2、检测IgG1 G390R突变对诱导SLE模型中小鼠自身免疫表型的影响

从6周龄纯合子bm12小鼠中分离脾脏细胞，通过尾静脉注射bm12小鼠的脾细胞诱导小鼠发生类SLE自身免疫表型，包括产生大量抗双链DNA(dsDNA)自身抗体，抗核抗体(ANA)及免疫复合物在肾小球中沉积。从诱导后第1周开始利用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测诱导的小鼠血清中的抗dsDNA抗体的产生，利用基于Hep-2细胞的免疫荧光染色检测抗核抗体的产生，在诱导后第6周，利用冷冻切片及免疫荧光检测肾小球中沉积的免疫复合物。

3、自身免疫表型数据分析

对ELISA实验测得的野生型和IgG1 G390R突变体小鼠血清中抗dsDNA的量进行对比分析；统计免疫荧光染色实验中Hep-2染色的平均荧光强度，对比野生型和突变体的平均荧光强度差异，进而反映抗体抗体在诱导的两种基因型小鼠中的量的差异。类似地，统计分析肾小球切片中以肾小球为单位的免疫荧光强度及肾小球面积并进行对比。

4、数据与结果

经bm12小鼠脾细胞诱导的野生型和IgG1 G390R突变体小鼠血清中抗dsDNA及抗SmD的自身抗体的动态变化如图3所示。

a.IgG1 G390R突变体小鼠血清中的抗dsDNA和抗SmD的自身抗体显著高于野生型对照小鼠；

b.突变体增强的自身抗体分泌在IgG1亚型上表现尤为明显，其他抗体亚型只在某个时间点略高于野生型对照或基本与野生型对照一致。

上述诱导模型中第3周血清中的抗核抗体检测免疫荧光结果如图4所示。

IgG1 G390R突变体小鼠血清中的抗核抗体的Hep-2免疫荧光染色平均荧光强度显著高于野生型小鼠。

上述诱导模型第6周肾小球中免疫复合物沉积的免疫荧光检测结果如图5所示。

IgG1 G390R突变体小鼠经诱导后，肾小球明显增大，肾小球中沉积的IgG1抗体的平均荧光强度显著高于野生型小鼠。

以上结果充分表明，对应于人IGHG1 rs117518546多态性的小鼠IgG1 G390R突变显著促进了诱导SLE小鼠模型中小鼠自身免疫表型发生，从而佐证rs117518546多态性与人的系统性红斑狼疮自身免疫疾病的密切相关性。

实施例4 G390R突变对B细胞活化的影响

为了验证G390R突变对B细胞活化的影响，发明人从野生型和G390R突变体小鼠(实施例3制备获得的)中分离获取原代B细胞，利用流式细胞术检测比较了二者在B细胞活化过程中钙信号的调动情况。结果显示，G390R突变能显著增强IgG1+B细胞活化的钙信号(图6)。

进一步，利用高分辨率全内反射荧光显微成像，发明人发现G390R突变能显著增加Grb2在活化的IgG1+B细胞免疫突触中的招募和聚集(图7)，说明本发明的新的致病突变提升了磷酸化膜联IgG胞内区-Grb2-Btk信号通路的活化强度。

上述结果都表明，G390R突变显著增强了IgG1+B细胞对抗原刺激的响应。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京大学人民医院

清华大学

<120> IGHG1基因突变及其应用

<130> PIDC3173125

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1200

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 野生型IGHG1基因

<400> 1

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

ggcacagcag ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca 960

cagaagagcc tctccctgtc tccggagctg caactggagg agagctgtgc ggaggcgcag 1020

gacggggagc tggacgggct gtggacgacc atcaccatct tcatcacact cttcctgtta 1080

agcgtgtgct acagtgccac cgtcaccttc ttcaaggtga agtggatctt ctcctcggtg 1140

gtggacctga agcagaccat catccccgac tacaggaaca tgatcggaca gggggcctag 1200

<210> 2

<211> 399

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 野生型IgG1

<400> 2

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Glu Leu Gln Leu Glu Glu Ser Cys

325 330 335

Ala Glu Ala Gln Asp Gly Glu Leu Asp Gly Leu Trp Thr Thr Ile Thr

340 345 350

Ile Phe Ile Thr Leu Phe Leu Leu Ser Val Cys Tyr Ser Ala Thr Val

355 360 365

Thr Phe Phe Lys Val Lys Trp Ile Phe Ser Ser Val Val Asp Leu Lys

370 375 380

Gln Thr Ile Ile Pro Asp Tyr Arg Asn Met Ile Gly Gln Gly Ala

385 390 395

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 针对IGHG1基因c.1186C>T突变位点的特异性引物

<400> 3

tcacactgta ccctgctacc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 针对IGHG1基因c.1186C>T突变位点的特异性引物

<400> 4

agctctttct ggagttgata 20

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Taqman探针上游引物

<400> 5

ggacaccccg cagagg 16

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Taqman探针下游引物

<400> 6

ggacctgaag cagaccatca tc 22

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Taqman探针探针1

<400> 7

caggaacatg atcggacag 19

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Taqman探针探针2

<400> 8

caggaacatg atcagacag 19

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> sgRNA靶向序列

<400> 9

catgattggg caagcaccct 20

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> sgRNA靶向序列

<400> 10

gtggggtata ggtcaccac 19

Claims (3)

1.适于检测IGHG1基因突变体的试剂在制备用于筛选易患系统性红斑狼疮的生物样品的试剂盒中的用途，其中与SEQ ID NO：1相比，所述IGHG1基因突变体具有c.1186C>T突变。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂为针对IGHG1基因c.1186C>T突变位点的核酸探针或者特异性引物。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述核酸探针为Taqman探针，所述核酸探针序列和所述特异性引物序列如下所示：

上游引物序列：GGACACCCCGCAGAGG(SEQ ID NO：5)；

下游引物序列：GGACCTGAAGCAGACCATCATC(SEQ ID NO：6)；

探针1序列：CAGGAACATGATCGGACAG(SEQ ID NO：7)；

探针2序列：CAGGAACATGATCAGACAG(SEQ ID NO：8)。

Images